多价重组禽疱疹病毒和用于免疫禽类的疫苗
阅读：703发布：2021-02-24
专利汇可以提供多价重组禽疱疹病毒和用于免疫禽类的疫苗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种重组禽类疱疹病毒，其包含至少两个重组核苷酸序列，各重组核苷酸序列编码不同的 抗原 肽，其中所述至少两个重组核苷酸序列插入到病毒基因组的不同的非编码区中，所述非编码区选自位于UL44与UL45之间的区、位于UL45与UL46之间的区、位于US10与SORF3之间的区、位于SORF3与US2之间的区。，下面是多价重组禽疱疹病毒和用于免疫禽类的疫苗专利的具体信息内容。
1.一种重组禽类疱疹病毒，其包含至少两个重组核酸序列，各重组核苷酸序列编码不同的抗原肽，其中所述至少两个重组核苷酸序列插入到病毒基因组的不同非编码区，该非编码区选自位于UL44与UL45之间的区、位于UL45与UL46之间的区、位于US10与SORF3之间的区和位于SORF3与US2之间的区。
2.根据权利要求1所述的重组禽类疱疹病毒，其中在用所述病毒感染鸡胚胎成纤维(CEF)细胞时，在至少10次传代后，所述至少两个重组核苷酸序列在鸡胚胎成纤维(CEF)中表达。
3.根据权利要求1或2所述的重组禽类疱疹病毒，其中该重组核苷酸序列编码来自禽类病原体的抗原肽。
4.根据前述权利要求中任一项所述的重组禽类疱疹病毒，其中该重组核苷酸序列编码选自以下的抗原肽：禽1型副粘病毒的抗原肽，优选新城疫病毒(NDV)的F蛋白或其片段，禽肾病病毒的抗原肽，优选传染性粘液囊病病毒(IBDV)的VP2蛋白或其片段，禽传染性喉气管炎病毒(ILTV)的抗原肽，优选gB蛋白或其片段，鸡败血支原体的抗原肽，优选40K蛋白或其片段，和禽流感病毒的抗原肽，优选表面蛋白血凝素(HA)或其片段。
5.根据前述权利要求中任一项所述的重组禽类疱疹病毒，包含插入到位于UL44与UL45之间的非编码区中的编码第一抗原肽的第一重组核苷酸序列，和插入到位于UL45与UL46、US10与SORF3或SORF3与US2之间的非编码区中的编码第二抗原肽的第二重组核苷酸序列。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的重组禽类疱疹病毒，包含插入到位于UL45与UL46之间的非编码区中的编码第一抗原肽的第一重组核苷酸序列，和插入到位于US10与SORF3之间或SORF3与US2之间的非编码区中的编码第二抗原肽的第二重组核苷酸序列。
7.根据前述权利要求中任一项所述的重组禽类疱疹病毒，其中在位于UL45与UL46之间的区中插入的重组核苷酸序列具有与UL46相同的转录方向，与UL45的转录方向相反。
8.根据前述权利要求中任一项所述的重组禽类疱疹病毒，其中各重组核苷酸序列在不同的启动子的控制下。
9.根据权利要求6所述的重组禽类疱疹病毒，其中控制该重组核苷酸序列的启动子选自鸡β-肌动蛋白(Bac)启动子、Pec启动子、小鼠巨细胞病毒(Mcmv)即刻早期(ie)1启动子、人类巨细胞病毒(Hcmv)启动子、猿猴病毒(SV)40启动子和劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子或其保留启动子活性的任何片段。
10.根据前述权利要求中任一项所述的重组禽类疱疹病毒，其中所述重组核苷酸序列之一包含Pec启动子。
11.根据前述权利要求中任一项所述的重组禽类疱疹病毒，其中所述病毒包含两个重组核苷酸序列，所述重组核苷酸序列之一插入到位于UL45与UL46之间的病毒基因组的非编码区中，并且所述重组核苷酸序列之一包含Pec启动子。
12.根据前述权利要求中任一项所述的重组禽类疱疹病毒，其包括在Pec启动子的控制下编码第一抗原肽的在UL45与UL46之间插入的重组核苷酸序列，和优选在RSV或SV40或Mcmv ie1启动子的控制下编码第二抗原肽的在UL44与UL45之间插入的重组核苷酸序列。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的重组禽类疱疹病毒，其包含优选在Pec启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的在UL45与UL46之间插入的重组核苷酸序列，以及优选在RSV或SV40或Mcmv ie1启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的在UL44与UL45之间插入的重组核苷酸序列。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的重组禽类疱疹病毒，其包含优选在Bac启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的在UL45与UL46之间插入的重组核苷酸序列，以及优选在Mcmv ie1启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的在UL44与UL45之间插入的重组核苷酸序列。
15.根据权利要求1至9中任一项所述的重组禽类疱疹病毒，其包含优选在Pec启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的在UL45与UL46之间插入的重组核苷酸序列，以及优选在Mcmv ie1启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的在SORF3与US2之间插入的重组核苷酸序列。
16.根据权利要求1至9中任一项所述的重组禽类疱疹病毒，其包含优选在Pec启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的在UL45与UL46之间插入的重组核苷酸序列，以及优选在Bac启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的在SORF3与US2之间插入的重组核苷酸序列。
17.根据权利要求1至9中任一项所述的重组禽类疱疹病毒，其包含优选在Bac启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的在UL45与UL46之间插入的重组核苷酸序列，以及优选在Pec启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的在SORF3与US2之间插入的重组核苷酸序列。
18.根据权利要求1至9中任一项所述的重组禽类疱疹病毒，其包含优选在Bac启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的在UL45与UL46之间插入的重组核苷酸序列，以及优选在Mcmv ie1启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的在SORF3与US2之间插入的重组核苷酸序列。
19.根据前述权利要求中任一项所述的重组禽类疱疹病毒，其为重组火鸡疱疹病毒(rHVT)。
20.包含有效免疫量的前述权利要求任一项的重组禽类疱疹病毒的多价疫苗。
21.根据权利要求1至18中任一项所述的重组禽类疱疹病毒，用于免疫禽类，如家禽，对抗病原体。
22.同时针对至少两种病原体接种禽类的方法，包括向所述禽类施用权利要求19的多价疫苗。
23.通过用有效量的权利要求1至18任一项所定义的重组禽类疱疹病毒免疫禽类并在将该鸟类放血后回收抗血清来获得的针对禽类疱疹病毒的抗血清。
24.用于免疫禽类的接种试剂盒，其包含以下组件：
a.有效量的权利要求19的疫苗，以及
b.用于将所述组分施用于所述物种的装置。
多价重组禽疱疹病毒和用于免疫禽类的疫苗
发明领域
[0001] 本发明通常涉及疫苗制剂领域。本发明具体涉及其中已经插入至少两个外源基因的多价重组疱疹病毒，以及它们用于同时诱导针对多种禽类疾病的保护性免疫的用途。
[0002] 发明背景
[0004] 表达病原体蛋白的病毒载体通常用作针对目标病原体的家禽疫苗。包括此类病毒载体的疫苗在受感染细胞中诱导外源病原体蛋白的表达，并由此诱发相应的T细胞免疫。
[0005] 众所周知的是，所有疱疹病毒，包括火鸡疱疹病毒(HVT)和马立克氏病病毒(MDV)可以以潜在或持续性感染的状态永久存活在受感染动物体内。因此，开发了其中已整合衍生自病原体的外源基因的重组疱疹病毒，用作提高免疫动物的免疫力持续时间的病毒载体疫苗。
[0006] HVT的基因组结构、其作为对抗MDV的疫苗的广泛使用以及其在鸡中持久保留的能力，使得该病毒成为制造重组家禽疫苗的有吸引力的载体。
[0007] 使用混入编码外源抗原的基因的重组疱疹病毒，已经开发了疫苗制剂以实现有效的禽类接种疫苗。通过插入的外源DNA序列，此类疫苗制剂能够针对MDV(载体)和另一种禽类疾病进行接种。
[0008] 尽管此类疫苗制剂能够有效地针对多种致命疾病对禽类进行接种，当向鸟类注入两种或多种各自携带不同的外源抗原基因的重组疱疹病毒时，会发生病原体之间的竞争和免疫抑制。
[0009] 因此，将着重研究同时针对不同疾病免疫的多价重组疱疹病毒(即携带至少两种不同的抗原基因)。但是，迄今为止，表达多种外源基因的重组HVTs(rHVTs)已证明是不稳定的，并且在培养细胞中反复传代的过程中所有或部分该外源基因被删除。因此，此类不稳定的多价病毒载体不能用作有效的疫苗。
[0010] 因此，需要稳定的多价重组病毒载体，能够在受感染的细胞中共同表达外源基因。
发明内容
[0011] 由申请人进行的工作获得了令人惊讶的发现——在疱疹病毒基因组中的一组特定插入位点可用于稳定地插入和表达两种或多种抗原基因，由此提供用于禽类接种的有效的多价病毒载体。更特别地，申请人已经发现，几种插入位点可用于同时结合不同的抗原基因，提供稳定的多价重组病毒载体。
[0012] 因此，本发明涉及一种重组禽类疱疹病毒，其包含至少两个重组核酸序列，各重组核苷酸序列在禽类细胞中编码和表达抗原肽，其中所述至少两个重组核苷酸序列插入到病毒基因组的不同非编码区，该非编码区选自位于UL44与UL45之间的区、位于UL45与UL46之间的区、位于US10与SORF3之间的区和位于SORF3与US2之间的区。
[0013] 在一个优选实施方案中，在位于UL45与UL46之间的区中插入一个重组核苷酸序列，并在位于UL44与UL45之间的区、位于US10与SORF3之间的区或位于SORF3与US2之间的区中插入一个重组核苷酸序列。如本申请中所示，此类重组禽类疱疹病毒构建体在受感染的禽类细胞中提供了两种相应抗原肽的特别稳定与有效的表达。
[0015] 根据本发明，该重组核苷酸序列有利地在特定启动子的控制下。该启动子优选选自鸡β-肌动蛋白(Bac)启动子、Pec启动子、小鼠巨细胞病毒(Mcmv)即刻早期(ie)1启动子、人类巨细胞病毒(Hcmv)启动子、猿猴病毒(SV)40启动子和劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子或其保留启动子活性的任何片段。优选地，各重组核苷酸序列在不同的启动子的控制下。
[0016] 根据本发明，该外源基因有利地选自禽1型副粘病毒的抗原肽，优选新城疫病毒(NDV)的F蛋白，禽肾病病毒的抗原肽，优选传染性粘液囊病病毒(IBDV)的VP2蛋白，禽传染性喉气管炎病毒(ILTV)的抗原肽，优选gB蛋白，鸡败血支原体的抗原肽，优选40K蛋白，和禽流感病毒的抗原肽，优选表面蛋白血凝素(HA)。
[0017] 在一个优选实施方案中，该重组禽类疱疹病毒包含插入到位于UL44与UL45之间的非编码区中的编码第一抗原肽的第一重组核苷酸序列，和插入到位于UL45与UL46、US10与SORF3或SORF3与US2之间的非编码区中的编码第二抗原肽的第二重组核苷酸序列。
[0018] 在另一优选实施方案中，该重组禽类疱疹病毒包含插入到位于UL45与UL46之间的非编码区中的编码第一抗原肽的第一重组核苷酸序列，和插入到位于US10与SORF3之间或SORF3与US2之间的非编码区中的编码第二抗原肽的第二重组核苷酸序列。
[0019] 在进一步优选的实施方案中，该重组禽类疱疹病毒包含插入到位于US10与SORF3之间的非编码区中的编码第一抗原肽的第一重组核苷酸序列，和插入到位于SORF3与US2之间的非编码区中的编码第二抗原肽的第二重组核苷酸序列。
[0020] 本发明的另一目的涉及用于免疫禽类如家禽多价疫苗，其包含有效免疫量的本发明的重组禽类疱疹病毒。这种疫苗可用于免疫禽类，如家禽。
[0021] 本发明的再一个目的涉及通过用有效量的本发明的重组禽类疱疹病毒免疫禽类并在将该鸟类放血后回收抗血清来获得的针对禽类疱疹病毒的抗血清。
[0022] 本发明还涉及免疫禽类的方法，包括向所属禽类施用有效免疫量的本发明的疫苗。
[0025] 图1例示了该HVT基因组的示意图。标记了Unique Long(UL)44、UL45与UL46的位置和Unique Short(US)10、SORF3与US2的位置。可以在UL44与UL45之间和/或UL45与UL46之间和/或US10与SORF3之间和/或SORF3与US2之间的PCR产生的SfiI位点处插入该重组核苷酸序列。
[0026] 图2A和图2B例示了本发明的特定实施方案的整合不同簇的核苷酸序列与启动子的HVT基因组的示意图。
[0027] 图3显示了共同表达NDV-F和IBDV-VP2(rHVT/ND/IBD受感染细胞)的用本发明的实施方案的二价重组HVTs(FW129和FW141)感染的CEFs的免疫荧光染色。蛋白VP2表达通过抗-VP2Mab(R63)和Alexa Flour 546检测。蛋白F表达通过抗-F#35兔血清和Alexa Flour 488检测。结果表明，被FW129或FW141感染的细胞既表达插入的NDV-F蛋白，也表达插入的IBDV-VP2蛋白。
[0028] 图4A和图4B显示了被本发明的rHVTs感染的CEF细胞中VP2蛋白和/或F蛋白表达的免疫印迹分析。如图4A中所示，仅仅在具有rHVT/ND/IBD感染细胞的泳道中观察到了60千道尔顿的蛋白条带，这是F蛋白的预期尺寸( )。在rHVT/44-45BacVP2(FW123)的泳道中不存在条带。如图4B中所示，在各rHVT/ND/IBD(→)的泳道中在38千道尔顿(kd)处观察到VP2蛋白。相反，在rHVT/45-46PecF(FW029)的泳道中不存在条带。38千道尔顿是成熟的VP2蛋白(A.A.Azad等人,1987,Virol.161:145-152，K.J.,Fahey等人,1985J.Gen.Virol.66:1479-1488)。本发明的二价rHVTs既表达NDV-F，又表达IBDV-VP2。
[0029] 图5A至图5D显示了纯化的FW129(rHVT/45-46pecF/44-45Rsv VP2)的基因组结构检查的Southern印迹分析结果，表明本发明的二价重组HVT/ND/IBD具有预期的基因组结构。更精确来说，Southern印迹法的结果显示：
[0030] -在来自各二价重组HVT FW129的DNA中，一个2077-bp片段杂交到VP2探针上(图5A的列1、2和3)。相反，在p45/46Pec F中未检测到条带(图5A)。
[0031] -在来自各二价重组HVT FW129的DNA中，一个2744-bp片段杂交到F探针上(图5C的列1、2和3)。在p45/46SfiI中未检测到条带。
[0032] -在来自各二价重组HVT FW129的DNA中，2077-bp和1228-bp片段杂交到IS44/45探针上(图5B的列1、2和3)。对于分子标记ramda HindIII消化液未检测到条带(图5B的列M)。
[0033] -在来自各二价重组HVT FW129的DNA中，2744-bp和770-bp片段杂交到IS45/46探针上(图5D的列1、2和3)。
[0034] 图6A和图6B显示了用于连续传代中重组HVT FW129的稳定性检查的免疫印迹分析结果，表明在15次传代后F蛋白和VP2蛋白在用本发明的rHVT FW129感染的CEF中稳定表达。
[0035] 图7A至图7D显示了用于在15次传代后重组HVTs的稳定性检查的Southern印迹分析结果。(图7A)Southern印迹法的结果显示，2077-bp片段在来自FW129的DNA中杂交到VP2探针。2334-bp片段在来自FW130的DNA中杂交到VP2探针。相反，在p45/46Pec F中未检测到条带。(图7C)Southern印迹法的结果显示，2744-bp片段在来自二价重组HVT FW129与FW130的DNA中均杂交到F探针。在p45/46SfiI中未检测到条带。(图7B)Southern印迹法的结果显示，2077-bp和1228-bp片段在来自FW129的DNA中杂交到IS44/45探针，并且2334-bp和1022-bp片段在来自FW130的DNA中杂交到IS44/45探针。1350-bp片段在p45/46PecF中杂交到IS44/45探针，其在IS44/45位点处不含基因。(图7D)Southern印迹法的结果显示，2744-bp和770-bp片段在来自二价重组HVT FW129与FW130的DNA中均杂交到IS45/46探针。采用44/45探针和45/46探针的Southern印迹显示VP2基因或F基因分别在FW129和FW130中稳定保持在插入位点44/45或45/46处。这些结果表明在15次传代后，在用本发明的rHVT FW129感染的CEF中稳定地表达F蛋白与VP2蛋白。
[0036] 图8A和图8B显示了与获自用单价重组HVTs(分别为FW029和FW023)接种过的鸡的滴度相比，获自用二价重组HVTs(FW122、FW137、FW129、FW130、FW135)接种过的鸡的抗-NDV滴度(图8A)和抗-IBDV滴度(图8B)的对比结果。
[0037] 发明详述
[0038] 本发明通常涉及多价重组疱疹病毒，以及它们用于同时针对至少两种疾病免疫禽类的用途。根据本发明，在rHV基因组中的特定插入位点中插入外源DNA序列，从而提供适用于疫苗组合物或方法的稳定且有效的构建体。
[0039] 参照下列定义将更好地理解本公开：
[0040] 定义
[0041] 在本发明的上下文中，与序列相关的术语“重建”或“重组”表示并非天然存在和/或已经采用重组DNA技术(也称为基因克隆或分子克隆)改造过的序列、核酸或单元。
[0042] 与疱疹病毒相关的术语“重组”指的是其基因组已经通过插入至少一种异源核酸修饰过的疱疹病毒，所述异源核酸是并非在疱疹病毒基因组中天然发现或在所述基因组中天然发现但以不同形式或在不同位置发现的核酸(例如DNA)。要理解的是，重组疱疹病毒可以通过多种方法制造，一旦制得，可以在不使用其它重组DNA技术的情况下复制。因此“重组疱疹病毒”的结构根据DNA插入来描述。
[0043] 在本说明书中，术语“核酸”、“核酸序列”和“核苷酸序列”可互换使用并且指的是具有确定序列的核酸分子，其可以是脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。该核苷酸序列可以首先通过例如重组、酶促和/或化学技术来制备，随后在宿主细胞中或在体外系统中复制。核苷酸序列优选包含编码肽的开放阅读框(open reading frame)。该核苷酸序列可以含有额外的序列，如转录终止子、信号肽、IRES、内含子等等。优选地，重组核酸中的开放阅读框不含有内含子。
[0044] 本文中使用的术语“非编码区”指的是不具有ORF和不确定要通过翻译表达的F蛋白的氨基酸序列的核苷酸区，或其中ORF不涉及任何转录、翻译或蛋白表达的核苷酸区。
[0045] 术语“禽类”意在涵盖所有类型的禽类，如鸟纲中的鸟类，即有羽毛、有翅膀、有两足、温血和产卵的脊椎动物。在本发明的上下文中，禽或禽类更特别是指具有经济利益和/或农业利益的鸟类，如家禽(如鸡和火鸡)、水禽家禽(如鸭和鹅)以及观赏鸟类(如天鹅和鹦鹉)。
[0046] 本文中使用的术语“疫苗”指的是用于引发、刺激或放大生物体中免疫应答的试剂。
[0047] 病毒
[0048] 用于本发明的病毒是通常属于禽疱疹病毒属的那些病毒。
[0049] 例如，用于本发明的禽疱疹病毒包括但不限于火鸡疱疹病毒(HVT)、血清型2型马立克氏病病毒，优选血清型2型马立克氏病病毒的SB1菌株1，或血清型1型马立克氏病病毒，优选血清型1型马立克氏病病毒的CVI988/Rispens菌株。本发明的优选疱疹病毒衍生自对目标禽类是非致病性的血清型或菌株。
[0050] 多价重组禽疱疹病毒
[0051] 本发明的一个目的涉及适于针对至少两种疾病免疫禽类的重组禽疱疹病毒，具有改善的传代稳定性。发明人已经确定了特定插入位点，其组合提供了改善的对外源抗原基因的稳定性。
[0052] 本发明的一个目的因此涉及一种重组禽类疱疹病毒，其包含至少两个重组核酸序列，各重组核苷酸序列编码不同的抗原肽，其中所述至少两个重组核苷酸序列插入到病毒基因组的不同非编码区，所述非编码区选自位于UL44与UL45之间的区、位于UL45与UL46之间的区、位于US10与SORF3之间的区和位于SORF3与US2之间的区。
[0053] 举例的非编码区的位置在本领域是已知的，并可以在例如Kingham等人的“The genome of herpesvirus of turkeys:comparative analysis with Marek’s disease viruses”——Journal of General Virology(2001)82,1123-1135中找到。
[0054] 例如，通过参考FC126完整基因组(GenBank：AF291866.1)，位于UL44与UL45之间的区对应于HVT基因组的核苷酸94243-94683，位于UL45与UL46之间的区对应于HVT基因组的核苷酸95323-95443，位于US10与SORF3之间的区对应于HVT基因组的核苷酸138688-138825，并且位于SORF3与US2之间的区对应于HVT基因组的核苷酸139867-140064。
[0055] 用于插入到疱疹病毒基因组中的相关核酸相对于该疱疹病毒可以是同源或异源的。该核酸通常编码来自病原体的抗原，并可以衍生自或获自能够造成禽类感染的任何病原性微生物。通常，克隆的核酸衍生自造成对家禽行业产生经济影响的疾病的病原体。造成禽类感染的病原体的实例包括病毒、细菌、真菌、原生动物等。
[0056] 用于插入到病毒基因组中的同源或异源核苷酸序列因此可以是编码鸟病原体的抗原肽的任何序列。本发明的核酸序列可以衍生自任何来源，例如病毒、原核、真核或合成的。通常，该核苷酸序列编码病原体的免疫原性肽，并优选代表所述病原体的表面蛋白、分泌性蛋白或结构蛋白，或其片段。
[0057] 该核苷酸序列可以编码例如衍生自以下病毒的抗原肽：禽流感病毒、禽1型副粘病毒——也称为新城疫病毒(NDV)、禽偏肺病毒、马立克氏病病毒、禽肾病病毒——也称为传染性粘液囊病病毒(IBDV)、禽传染性喉气管炎病毒(ILVT)、传染性支气管炎病毒(IBV)、大肠杆菌、沙门氏菌属、出血败血性巴斯德氏菌、鸭瘟莫拉氏菌、鼻腔鸟杆菌、鸡败血支原体、关节液支原体、感染禽类或球虫的支原体微生物。
[0058] 优选地，插入到病毒基因组中的核苷酸序列选自NDV的F蛋白、IBDV的VP2蛋白、ILTV的gB蛋白、鸡败血支原体的40K蛋白和禽流感病毒的表面蛋白血凝素(HA)。
[0059] 抗原肽的各种组合可能极受关注，这取决于几个因素，如禽类、饲养国、饲养条件等。
[0060] 例如，在一个实施方案中，将编码NDV的F蛋白的核苷酸序列和编码IBDV的VP2蛋白的核苷酸序列混入到本发明的多价重组禽类疱疹病毒的基因组中。
[0061] 根据一种特定的实施方案，可以将三种或多种核苷酸序列插入到该病毒基因组中。
[0062] 本发明的重组疱疹病毒可以表达来自相同病原体的两种或多种抗原。
[0063] 编码相关抗原的同源或异源核苷酸序列可以可操作地连接到启动子上，并进一步插入到病毒基因组中。所用的启动子可以是合成的或天然的、内源的或异源的启动子。
[0064] 该启动子没有限制，只要其可以有效地在被rHVT感染的鸟类细胞中发挥作用。因此启动子的选择扩展到能够在rHVT感染的禽类细胞中引导基因转录的任何真核、原核或病毒启动子。
[0065] 优选地，该启动子选自鸡β-肌动蛋白(Bac)启动子、Pec启动子、小鼠巨细胞病毒(Mcmv)ie1启动子、人类巨细胞病毒(Hcmv)启动子、猿猴病毒(SV)40启动子和劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子，或其保留启动子活性的任何片段。
[0066] 鸡Bac启动子的核酸序列显示在SEQ ID NO:1中，Pec启动子的序列显示在SEQ ID NO:2中，Mcmv ie1启动子的序列显示在SEQ ID NO:3中，Hcmv启动子的序列显示在SEQ ID NO:4中，SV40启动子的序列显示在SEQ ID NO:5中，并且RSV启动子的序列显示在SEQ ID NO:6中。
[0067] 应当指出，编码功能性启动子的此类序列的变体是本领域技术人员已知的和/或可以由本领域技术人员设计/测试以便用于本发明。
[0068] 在优选的本发明的重组疱疹病毒中，该核酸的至少一种包含Pec或Bac启动子以驱动该抗原肽的表达。
[0069] 多价构建
[0070] 基因克隆和质粒构建是本领域普通技术人员公知的，并且基本上可以通过标准分子生物学技术实施(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Woodbury,N.Y.2001)。
[0071] 为了构建本发明的多价重组疱疹病毒，最初，该疱疹病毒在合适的宿主细胞中传播，并随后获得基因组DNA。适当地选择传播病毒的宿主和条件。作为宿主细胞，来源于鸡的细胞是优选的，并可以使用CEF(鸡胚成纤维细胞)、鸡肾细胞等等。它们可以在大约37℃下在诸如Eagle's MEM,Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1:1混合物)培养基的培养基中培养3至4天。
[0073] 通常，该重组病毒可以通过病毒基因组与构建体之间的同源重组来制备，所述构建体(例如质粒)包含待插入的核酸，被核苷酸由插入位点侧翼插入以实现重组。
[0074] 具有插入位点序列的质粒
[0075] 根据本发明在病毒基因组的非编码区之一中插入外源基因的一种可能性可以是首先将含有目标非编码区的序列克隆到质粒或其它合适的载体中。根据本发明，此类序列选自位于UL44与UL45之间的区的序列、位于UL45与UL46之间的区的序列/位于US10与SORF3之间的区的序列和位于SORF3与US2之间的区的序列。
[0076] 质粒的实例包括pBR322、pBR325、pBR327、pBR328、pUC18、pUC19、pUC7、pUC8和pUC9，噬菌体的实例包含λ噬菌体和M13噬菌体，粘粒的实例包括pHC79。
[0077] 根据常规克隆方法将非编码区序列整合到质粒中。插入区序列优选具有足够的长度，使得在插入核酸时，侧翼插入核酸的序列具有适当的长度以允许与病毒基因组进行体内同源重组。优选地，该侧翼序列应具有至少大约50个核苷酸的长度。
[0078] 为了将一个或多个外源序列插入到非编码区中，可以在非编码区的特定位点处进行突变以制造新的限制性内切酶的切割位点。进行突变的方法可以是常规方法，可以使用本领域技术人员通常使用的方法，如体外诱变和PCR。因此，在PCR法中，在PCR引物中进行突变，如1至2个核苷酸的缺失、取代或添加，随后将引物用于产生突变。
[0079] 进一步含有目标外源核苷酸序列的质粒
[0080] 用于插入到病毒中的核苷酸与启动子序列进一步插入到质粒中的病毒基因组的插入区中。
[0081] 更精确地说，将该核苷酸与启动子序列引入到在质粒中亚克隆的含有插入区序列的基因组疱疹病毒DNA片段中。
[0082] 如果需要的话，可以制备质粒，其含有两个或多个外源核酸序列，例如衍生自相同或不同的病原体，所述序列两侧为本文中所述的插入区序列。
[0083] 在插入位点中包含外源核苷酸序列的病毒基因组
[0084] 如上获得的其中至少一个核苷酸序列已经插入到非编码区中的质粒可以使用电穿孔、磷酸钙、基于lipofectin的方法等等引入到HVT-感染的细胞或HVT基因组-转染细胞中。当待引入的质粒量为0.1至1000μg时通过，细胞中通过HVT-DNA与质粒的同源区之间的重组生成重组病毒的效率变高。
[0085] 制造多价重组疱疹病毒
[0086] 本发明的多价可以通过在同一细胞培养物中共转染如上所述含有其中整合外源核苷酸序列的插入位点序列的质粒和如上所述含有不含外源核苷酸序列的相同插入位点和其中整合不同的外源核苷酸序列的第二插入位点的重组疱疹病毒来获得。这种共转染导致质粒DNA重组到病毒基因组中。
[0087] 否则，本发明的多价可以通过在同一细胞培养物中共转染两种质粒(所述两种质粒各含有其中整合了不同的外源核苷酸序列的不同插入位点序列)和如上所述含有不含外源核苷酸序列的相同插入位点的疱疹病毒来获得。该共转染导致两种质粒DNA重组到病毒基因组中。
[0088] 可以使用已知的筛选技术对所得多价重组病毒进行基因型或表型上的筛选，例如通过杂交、检测与该重组核酸序列一起共整合的基因所编码的酶活性、或免疫学检测由该重组疱疹病毒表达的抗原肽。筛选的重组疱疹病毒可以在细胞培养物中大规模培养，随后可以收集含有肽的重组疱疹病毒。
[0089] 优选的多价构建
[0090] 本发明的一个目的是提供存在至少两个外源核苷酸序列的多价重组疱疹病毒，所述至少两个外源核苷酸序列各自以合适的方式在特定的插入位点中插入以便在禽类细胞中编码和表达相应的抗原肽。
[0091] 在基于目标插入位点与优选重组核苷酸序列以及任选的优选启动子的组合的多种可能的实施方案中，申请人惊讶地发现特定组合呈现出高稳定性水平，使其能够用于制备改善的多价疫苗。
[0092] 基于这一发现，本发明的目的是提供具有高稳定性水平的特定多价重组禽疱疹病毒。
[0093] 本发明的优选的多价重组禽疱疹病毒包含两个重组核苷酸序列，各重组核苷酸序列编码不同的抗原肽，并插入到病毒基因组的不同的非编码区中，所述非编码区选自位于UL44与UL45之间的区、位于UL45与UL46之间的区、位于US10与SORF3之间的区和位于SORF3与US2之间的区。
[0094] 本发明的优选的抗原肽选自NDV的F蛋白、IBDV的VP2蛋白、ILTV的gB蛋白、鸡败血支原体的40K蛋白和禽流感病毒的表面蛋白HA。
[0095] 有利地，与在UL44和UL45之间的插入位点中插入的核苷酸序列一起使用的启动子选自Pec启动子、Mcmv ie1启动子、Hcmv启动子、SV40启动子和RSV启动子，或其保留启动子活性的任何片段。事实上，申请人已经惊讶地发现，在UL44和UL45之间插入的Bac启动子不能稳定地表达外源基因。但是，在UL45与UL46之间的区中插入的Bac启动子却允许稳定的表达。
[0096] 根据第一实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在UL45与UL46之间插入的优选在Pec启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在UL44与UL45之间插入的优选在SV40启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW130)。
[0097] 根据第二实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在UL45与UL46之间的插入位点中的优选在Pec启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在UL44与UL45之间的插入位点中的优选在RSV启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW129)。
[0098] 根据第三实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在UL45与UL46之间的插入位点中的优选在Pec启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在UL44与UL45之间的插入位点中的优选在Mcmv ie1启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW141)。
[0099] 根据第四实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在UL45与UL46之间的插入位点中的优选在Pec启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在SORF3与US2之间的插入位点中的优选在Mcmv ie1启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW144)。
[0100] 根据第五实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在UL45与UL46之间的插入位点中的优选在Pec启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在SORF3与US2之间的插入位点中的优选在Bac启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW146)。
[0101] 根据第六实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在UL44与UL45之间的插入位点中的优选在Pec启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在UL45与UL46之间的插入位点中的优选在Mcmv ie1启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW143)。
[0102] 根据第七实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在UL44与UL45之间的插入位点中的优选在Mcmv ie1启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在UL45与UL46之间的插入位点中的优选在Bac启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW142)。
[0103] 根据第八实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在SORF3与US2之间的插入位点中的优选在Pec启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在UL45与UL46之间的插入位点中的优选在Bac启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW147)。
[0104] 根据第九实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在UL45与UL46之间的插入位点中的优选在Bac启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在SORF3与US2之间的插入位点中的优选在Mcmv ie1启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW145)。
[0105] 根据第十实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在UL45与UL46之间的插入位点中的优选在Bac启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在SORF3与US2之间的插入位点中的优选在SV40启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW149)。
[0106] 根据第十一实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在UL45与UL46之间的插入位点中的优选在SV40启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在SORF3与US2之间的插入位点中的优选在Bac启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW148)。
[0107] 根据第十二实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在UL45与UL46之间的插入位点中的优选在Pec启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在US10与SORF3之间的插入位点中的优选在Mcmv ie1启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW153)。
[0108] 根据第十三实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在UL45与UL46之间的插入位点中的优选在Pec启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在US10与SORF3之间的插入位点中的优选在Bac启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW154)。
[0109] 根据第十四实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在UL45与UL46之间的插入位点中的优选在Bac启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在US10与SORF3之间的插入位点中的优选在Mcmv ie1启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW155)。
[0110] 根据第十五实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在UL45与UL46之间的插入位点中的优选在Bac启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在US10与SORF3之间的插入位点中的优选在Pec启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW156)。
[0111] 根据第十六实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在US10与SORF3之间的插入位点中的优选在Pec启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在SORF3与US2之间的插入位点中的优选在Mcmv ie1启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW157)。
[0112] 根据第十七实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在US10与SORF3之间的插入位点中的优选在Mcmv ie1启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在SORF3与US2之间的插入位点中的优选在Bac启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW158)。
[0113] 根据第十八实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在US10与SORF3之间的插入位点中的优选在Bac启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在SORF3与US2之间的插入位点中的优选在Mcmv ie1启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW159)。
[0114] 根据第十九实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在US10与SORF3之间的插入位点中的优选在Mcmv ie1启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在SORF3与US2之间的插入位点中的优选在Pec启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW160)。
[0115] 根据第二十实施方案，该重组禽类疱疹病毒包含在UL45与UL46之间的插入位点中的优选在Mcmv ie1启动子的控制下编码IBDV的VP2蛋白或其片段的重组核苷酸序列，和在US10与SORF3之间的插入位点中的优选在Pec启动子的控制下编码NDV的F蛋白或其片段的重组核苷酸序列(FW161)。
[0116] 细胞培养物
[0117] 所得本发明的重组病毒可以在细胞培养物中繁殖，在该细胞培养物中所述重组病毒可以繁殖和生长。在实现病毒的所需生长后，可以使用刮棒或使用胰蛋白酶使细胞从孔中脱离，并可以通过离心将受感染的细胞与上清液分离。
[0118] 在本发明的优选实施方案中，可以使用CEF、含胚卵、鸡肾细胞等等作为重组疱疹病毒繁殖的宿主细胞。本发明的多价重组病毒可以在培养基，如Eagle's MEM,Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1:1混合物)培养基中在大约37℃下培养3至4天。将由此获得的受感染细胞悬浮在含有10％的二甲亚砜(DMSO)的培养基中并在液氮下冷冻保存。
[0119] 有利地，本发明的重组多价疱疹病毒呈现经传代后的高稳定性水平，这对应于甚至在10次或更多次传代后在禽类细胞中该重组核苷酸序列的共表达。在本发明的上下文中，“传代”或“细胞传代”指的是细胞在适于它们生长并保持其存活的条件下培养直到它们为90％至100％铺满。传代步骤包括将先前的铺满培养物的少量细胞转移到新的培养基中。含有少量细胞的先前的铺满培养物的等分试样在大体积的新鲜介质中稀释。在贴壁培养的情况下，可以首先使细胞分离，例如通过使用胰蛋白酶和EDTA的混合物，或任何合适的酶，随后使用少量分离细胞用于接种新的培养基。
[0120] 根据本发明的优选实施方案，用本发明的重组禽疱疹病毒转染的CEF细胞在至少10次传代后仍共表达相应的抗原肽。换句话说，用本发明的重组禽疱疹病毒转染的CEF细胞的10次或更多次传代后，更特别为15次传代后获得的CEF细胞仍含有用于初始细胞转染的重组禽类疱疹病毒的外源核苷酸序列并表达至少两种相应的抗原肽。在本发明的上下文中，如果生产水平大于初次传代的生产水平的80％，优选大于85％，则认为所述传代的细胞仍表达该抗原肽。
[0121] 多价疫苗组合物
[0122] 本发明还涉及用于免疫禽类如家禽的多价疫苗，其包含有效免疫量的本发明的多价重组禽类疱疹病毒。
[0123] 优选地，本发明的疫苗能够引起或刺激或放大针对至少两种病原体的免疫力，所述病原体选自禽1型副粘病毒、禽肾病病毒、禽传染性喉气管炎病毒、鸡败血支原体和禽流感病毒。
[0124] 本发明的疫苗在可用于制药的载体中包含免疫有效量的上述多价重组疱疹病毒。
[0125] 本发明的多价重组疱疹病毒可以优选用作活疫苗，虽然其它替代方案如灭活疫苗或减毒疫苗也完全在本领域技术人员的技术范围内。
[0126] 根据本发明的疫苗可以进一步包含合适的溶剂，如水性缓冲液或磷酸盐缓冲液。优选地，该疫苗还包含添加剂。本发明的添加剂可以获自任意多个来源，包括各种衍生自动物的蛋白(例如激素、细胞因子、共刺激因子)和衍生自病毒和其它来源的新型核酸(例如双链RNA、CpG)等等，这些添加剂以足以提高免疫响应的量与疫苗一起给药。此外，前述物质的任意数量的组合可以提供免疫增强效果，因此可以构成本发明的免疫增强剂。
[0127] 本发明的疫苗可以进一步与一种或多种其它添加剂一起配制，以维持等渗性、生理pH值和稳定性，例如缓冲液如生理盐水(0.85％)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、柠檬酸盐缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、Tris缓冲的盐水等等，或抗生素如新霉素或链霉素等等。
[0128] 给药途径可以是任何给药途径，包括经口、眼(例如通过滴眼液)、使用气溶胶的眼-鼻给药、鼻内、泄殖腔、饲料中、水中、或通过喷雾、卵内、局部或通过注射(例如静脉内、皮下、肌肉内、眼眶内、眼内、真皮内和/或腹膜内)接种。本领域技术人员将容易调配疫苗组合物的制剂以适于各种类型的给药途径。
[0129] 每种疫苗剂量可以含有足以在禽类中引发保护性免疫应答的合适剂量。此类剂量的优化在本领域是公知的。每剂的抗原量可以通过已知方法使用抗原/抗体反应，例如通过ELISA法来确定。
[0130] 本发明的疫苗可以根据接种方案以单次剂量或以重复剂量给药。
[0131] 本发明的疫苗的另一优点在于在接种3周后可以赋予鸟类最高80％的针对目标禽类病原体的防护。
[0132] 本发明进一步涉及如上所述的疫苗用于免疫禽类如家禽的用途，并涉及通过施用免疫有效量的本发明的疫苗免疫禽类的方法。该疫苗可以有利地皮内、皮下、肌肉内、经口、卵内给药，通过粘膜给药或通过眼-鼻给药。
[0133] 本发明进一步涉及用于免疫禽类的接种试剂盒，其包含有效量的上述多价疫苗和用于将所述组分施用于所述物种的装置。例如，此类试剂盒可以包含装有本发明的多价疫苗的注射装置，以及用于皮内、皮下、肌肉内、或卵内注射的说明书。或者，该试剂盒包含装有本发明的多价疫苗的喷雾/气溶胶或滴眼液装置，以及用于眼-鼻给药、口腔或粘膜给药的说明书。
[0134] 将参照下列试验和实施例更详细地解释本发明，但是并不意味着本发明受这些试验与实施例的限制。实施例
[0135] 在试验中，使用了几种重组疱疹病毒(单价或本发明的多价)，命名如下(HVT/第一插入位点-第一外源基因/第二插入位点-第二外源基因)：
[0136] FW122：HVT/45-46Hcmv VP2Bac F
[0137] FW123：HVT/44-45Bac VP2,
[0138] FW125：HVT/45-46Bac F/44-45Hcmv VP2
[0139] FW129：HVT/45-46PecF/44-45Rsv VP2
[0140] FW130：HVT/45-46PecF/44-45SV40VP2
[0141] FW135：HVT/45-46sv40F/44-45Bac VP2
[0142] FW137：HVT/45-46Pec F sv40VP2
[0143] FW141：HVT/45-46PecF/44-45Mcmv ie1VP2
[0144] FW142：HVT/45-46Bac VP2/44-45Mcmv ie1F
[0145] FW144：HVT/45-46Pec F/87-88Mcmv ie1VP2
[0146] FW145：HVT/45-46Bac VP2/87-88Mcmv ie1F
[0147] FW023：HVT/45-46Bac VP2
[0148] FW029：HVT/45-46Pec F
[0149] 试验1：构建同源性载体
[0150] 基本上通过标准分子生物学技术进行质粒构建(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.3rd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.2001)。DNA限制性片段在琼脂糖凝胶上进行电泳并用质粒加Midi试剂盒(QIAGEN,Cat#12945)纯化。
[0151] 构建p44/45d46Sfi
[0152] 根 据 MDV 血 清 型 1 的 gC同 源(gCh) 基 因 信 息 (Coussens 等 人 ,J.Virol.62:2373-2379,1988)及其相邻BamHI-B片段(日本未审专利公开号H6-292583)，通过PCR制备了具有在两个ORFs——UL44h与UL45h之间的SfiI位点的DNA片段并克隆到pUC18中。首先，根据Lee等人的方法(J.Gen.Virol.,51:245-253,1980)由用HVT FC126菌株感染的CEF细胞制备HVT DNA。使用获得的HVT DNA作为模板，用两对引物进行PCR。
[0153] 第一对是SEQ NO:7(5’-CCCCGAATTCATGGAAGAAATTTCC-3’)和SEQ NO:8(5’-CGCGGGCCAATAAGGCCAACATCGGGACGTACATC-3’)。
[0154] 第二对是SEQ NO:9(5’-GCGCGGCCTTATTGGCCTTAAATACCGCGTTTGGAG-3’)和SEQ NO:10(5’-CCCCAAGCTTTCAAGTGATACTGCGTGA-3’)。
[0155] 使用获得的两种PCR产物的混合物作为模板，用SEQ NO.7和SEQ NO.10进行另一次PCR以产生具有在两个ORFs——UL44h与UL45h之间的SfiI位点的片段。
[0156] 所得片段随后用EcoRI和HindIII消化并连接(ligated)到已经用EcoRI和HindIII消化的pUC18中。获得的质粒命名为p44/45Sfi。
[0157] 为了构建其中两个基因分别在UL44/45与UL45/46处插入的二价重组HVT，从p44/45Sfi中删除UL46基因。用EcoRI和SfiI消化的p45/46Sfi(US 7569365)与dSfiI-EcoRI连接体连接，获得质粒p44/45d46。用SphI和PstI切割的p44/45Sfi与用相同的酶切割的p44/45d46连接，获得质粒p44/45d46Sfi。
[0158] 构建pHVT87-88
[0159] 根据Lee等人的方法(J.Gen.Virol.,51:245-253,1980)由用HVT FC126菌株感染的CEF细胞制备HVT DNA。使用获得的HVT DNA作为模板，用两对引物进行PCR。各引物基于Genbank X68653.1的信息设计。通过PCR制备具有在两个ORFs——US2(HVT088)和SORF3(HVT087)之间的SfiI位点的DNA片段并克隆到pUC18中。
[0160] 第一对是SEQ NO.11(5’-GGGAATTCGAAGAGCCCCCGCGGACGCATG-3’)和SEQ NO.12(5’-CCGCTAGCGGCCGCAAGTTCCTTCACCATGACCAG-3’)。
[0161] 第二对是SEQ NO.13(5’-GCGGCCGCTAGCGGCCTTATTGGCCGTAGCATAAAGACGCAGG-3’)和SEQ NO.14(5’-CCAAGCTTCTAGTACATATATATACATGAC-3’)。
[0162] 第一所得片段用EcoRI和NheI消化。第二所得片段用NheI和HindIII消化。切割的片段整合到用EcoRI和HindIII切割的pUC18中，得到质粒pHVT 87-88。
[0163] 构建pHVT86-87
[0164] 根据Lee等人的方法(J.Gen.Virol.,51:245-253,1980)由用HVT FC126菌株感染的CEF细胞制备HVT DNA。使用获得的HVT DNA作为模板，用两对引物进行PCR。各引物基于Genbank X68653.1的信息设计。通过PCR制备具有在两个ORFs——US10(HVT086)和SORF3(HVT087)之间的SfiI位点的DNA片段并克隆到pUC18中。
[0165] 第一对是SEQ NO.15(5’-GGGGGAATTCATTATCCCATCTAACAGTTATATACG-3’)和SEQ NO.16(5’-GCCGCTAGCGGCCGCCTTTATTAACAACCTTAC-3’)。
[0166] 第二对是SEQ NO.17(5’-GCGGCCGCTAGCGGCCTTATTGGCCGTTTATTCTATGTAAGAC-3’)和SEQ NO.18(5’-CCCAAGCTTAAGTTCCTTCACCATG-3’)。
[0167] 第一所得片段用EcoRI和NheI消化。第二所得片段用NheI和HindIII消化。切割的片段整合到用EcoRI和HindIII切割的pUC18中，得到质粒pHVT 86-87。
[0168] 构建同源载体
[0169] 化学合成的Mcmv ie1启动子
[0170] 根据Koszinowski,U.H.报道的Gene Bank L06816.1中的41884191-4731bp的信息合成Mcmv ie1启动子(SEQ NO.19)。设计合成Mcmv ie1启动子，在其前部添加BglI-PstI位点并在末端添加XbaI-NotI位点。
[0171]
[0172] 构建p44/45Mcmv ie1VP2SPA
[0173] SfiI-切割的p44-45d46Sfi通过使用Alkaline Phosphatase Shewanella sp.S1B1重组(PAP)(Funakoshi#DE110)去磷酸化。该片段与BglI-cleaved p45/46BacVP2连接，获得质粒p44/45d46BacVP2。该合成Mcmv ie1启动子(BglI/XbaI)与用EcoRV和XbaI切割的p44/45d46BacVP2以及用EcoRV和BglI切割的p44/45d46Bac VP2连接，获得p44/45d46Mcmv ie1VP2。合成的短聚腺苷酸信号(SPA:SEQ NO.20CTGCAGGCGGCCGCTCTAGAGTCGACAATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCCAATAAGGCC)整合到用SalI和SfiI切割的p44/45d46Mcmv ie1VP2中，获得同源质粒p44/45d46Mcmv ie1 VP2SPA。
[0174] 试验2：在用各转移载体转染的CEF中纯化重组HVT
[0175] 如Morgan等人所述那样制备HVT野生型FC126菌株 (wt-HVT)的病毒DNA(Avian Diseases,34:345-351,1990)。以类似方法制备FW029(rHVT/45-46PecF)和FW023(rHVT/45-46BacVP2)的病毒DNA。第一双rHVT图案是用制备的wt-HVT DNA和p45/46sv40VP2PecF(例如FW137)转染CEF细胞。第二图案是用制备的FW029DNA和p44/45Mcmv ie1VP2(例如FW141)转染CEF细胞。第三图案是用制备的FW023DNA和p44/45Mcmv ie1F(例如FW142)转染CEF细胞。第四图案是用制备的FW029DNA and pHVT87-88Bac VP(例如FW144)转染CEF。第五图案是用制备的FW023和pHVT87-88Pec F(例如FW145)转染CEF。这些所得重组病毒通过用抗-NDV-F抗体和抗-IBDV-VP2抗体染色斑块来斑块纯化的。
[0176] 简而言之，将107个原代CEF细胞悬浮在100微升MEF-1(Lonza LNJVD-1004)中并通过电穿孔用1微克同源载体，例如p44/45Mcmv ie1F和pHVT Bac VP2，以及2微克HVT DNA，例如FC126、FW029和FW023共同转染。电穿孔在Nucleofector II上进行。转染细胞稀释在20毫升Leibovitz’s L-15(GIBCO BRL,Cat.#41300-39),McCoy’s 5A Medium(GIBCO BRL,Cat.#21500-061)(1:1)和4％牛血清(称为溶液LM(+)介质)，以每孔100微升铺于96孔板上。
[0177] 在37℃下在5％CO2中培养，直到噬斑变得可见，通过胰蛋白酶消化将细胞刮下，稀释在新鲜制备的次代CEF细胞中，同样转移到两个96孔板上并培育3天以显现噬斑。两块板之一随后用作为一抗的抗-VP2单克隆抗体R63(ATCC#:HB-9490)染色。在检测含有染色重组噬斑的孔之后，回收另一板的相应孔的细胞，稀释在新鲜的次代CEF细胞中并同样转移到两个96孔板上以完成第一轮纯化。重复纯化程序，直到每一获得的噬斑被单克隆抗体R63阳性染色。此后，通过抗-NDV-F抗体3-1G/5(Morrison,T.G.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:1020-1024,1987)或抗F兔血清染色候选的双rHVT。最后，通过双IFA染色证实每一候选rHVT的噬斑的蛋白表达。用冷丙酮-甲醇(2:1)固定被各rHVT感染的CEF，用PBS洗涤，与抗体混合物(1:1000稀释的抗F兔血清#35和抗-VP2小鼠Mab R63)在37℃下反应60分钟。在用PBS洗涤3次后，细胞与荧光抗体混合物(由Invitrogen提供的1:1000稀释的Alexa Fluor488抗兔和Alexa Fluor546抗小鼠)在37℃下反应60分钟。在用PBS洗涤3次后，通过荧光显微镜以400倍放大倍数观察它们。
[0178] 蛋白VP2表达通过抗-VP2Mab(R63)和Alexa Flour 546来检测。蛋白F表达通过抗-F#35兔血清和Alexa Flour 488来检测。所有噬斑均表达F和VP2时，我们断定纯化完成。图3显示了双IFA的一些实例。
[0179] 纯化的重组HVT称为rHVT/ND/IBD。
[0180] 下表1 显示 了获 自 不同rHVT/ND/IBD的 VP2和蛋 白F的 表达。 菌 株FW023(HVT/45-46Bac VP2)对应于用作VP2表达对照物的单价重组疱疹病毒，FW029(HVT/45-46PecF)对应于用作蛋白F表达对照物的单价重组疱疹病毒。
[0181] 表1.通过rHVT/ND/IBD表达插入的NDV-F和IBDV-VP2基因(荧光检测)[0182]
[0183]
[0184] +：检测到；+w；弱检测到；-：未检测到
[0185] 试验3：在用二价重组HVTs感染的CEF中两种蛋白的共表达5
[0186] 2毫升含有2×10 个CEF细胞用重组HVTs感染，并在37℃下在5％CO2中培育3天。
[0187] 随后培养物在300G下离心3分钟，沉淀的细胞重新悬浮在100微升中。Laemmli缓冲液(100微升)加入到该细胞悬浮液中。所得混合物随后煮沸5分钟并将其5微升施以10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳的蛋白从SDS-GEL凝胶转移至PVDF膜(Immobilon-P,Millipore)，其在室温下在PBS中在1％w/v的脱脂奶粉中封闭(blocked)一小时。
[0188] 对于F检测(图4A)，处理过的膜随后与抗F兔抗血清#35以500倍稀释在室温下反应一小时，用PBS洗涤三次，用生物素化抗兔山羊抗血清培育一小时。
[0189] 对于VP2检测(图4B)，处理过的膜随后与抗-VP2Mab R63以500倍稀释在室温下反应一小时，用PBS洗涤三次，用生物素化抗小鼠山羊抗血清培育一小时。
[0190] 在用PBS洗涤三次后，该膜用抗生物素蛋白-碱性磷酸酶复合物培育一小时，用PBS洗涤三次并用TBS(Tris缓冲的盐水)洗涤一次，并与BCIP-NBT(碱性磷酸酶的底物)反应。如图4A中所示，仅在具有rHVT/ND/IBD感染细胞的泳道中观察到60千道尔顿(kDa)的蛋白条带，这是F蛋白的预期尺寸(→)。在rHVT/44-45BacVP2(FW123)的泳道中没有条带。
[0191] 图3B显示了在各rHVT/ND/IBD的泳道( )中在38千道尔顿(kd)处观察到了VP2蛋白。相反，在rHVT/PecF(FW029)的泳道中没有条带(图1B)。该38-kd是成熟VP2蛋白(A.A.Azad等人,1987,Virol.161:145-152；K.J.,Fahey等人,1985J.Gen.Virol.66:1479-1488)。
[0192] 本发明的二价重组HVTs表达NDV-F和IBDV VP2。
[0193] 试验4：验证基因组结构
[0194] Southern印迹分析
[0195] 纯化的rHVT/ND/IBD在一个25平方厘米烧瓶的CEF细胞上繁殖以获得融合斑块。细胞通过刮擦从盘中回收，转移到Falcon管中并在300G下施以离心5分钟。收获的细胞用PBS洗涤，重新悬浮在0.6毫升的PBS与0.4毫升的裂解缓冲液(1.25％TritonX-100，
250mM 2-ME和50mM EDTA在PBS中)中并通过涡流裂解3分钟。裂解物随后在室温下在
600G下离心5分钟，将上清液转移到15毫升Falcon管中。通过在20,400G下离心20分钟来收集病毒。所得颗粒随后悬浮在0.33毫升的核酸酶溶液(12.5mM Tris-Cl(pH7.5)，1微克/毫升DNase I和1微克/毫升RNase A)中，在37℃下培育30分钟，并通过用83微升SDS-蛋白酶溶液(50mM EDTA，5％SDS，0.5毫克/毫升蛋白酶K和28.5毫摩尔2-巯基乙醇)在55℃下培育30分钟来进行破坏。获得的混合物用酚-氯仿处理两次，并向水相中加入NaCl至0.2M的最终浓度。病毒DNA通过加入2.5体积的冰冷乙醇来沉淀，用70％的乙醇洗涤并在4℃下在20,400G下施以离心20分钟。在空气干燥后，颗粒溶解在TE缓冲液(10mM Tris-Cl(pH8.0)，1mM EDTA)中。
250mM 2-ME和50mM EDTA在PBS中)中并通过涡流裂解3分钟。裂解物随后在室温下在
600G下离心5分钟，将上清液转移到15毫升Falcon管中。通过在20,400G下离心20分钟来收集病毒。所得颗粒随后悬浮在0.33毫升的核酸酶溶液(12.5mM Tris-Cl(pH7.5)，1微克/毫升DNase I和1微克/毫升RNase A)中，在37℃下培育30分钟，并通过用83微升SDS-蛋白酶溶液(50mM EDTA，5％SDS，0.5毫克/毫升蛋白酶K和28.5毫摩尔2-巯基乙醇)在55℃下培育30分钟来进行破坏。获得的混合物用酚-氯仿处理两次，并向水相中加入NaCl至0.2M的最终浓度。病毒DNA通过加入2.5体积的冰冷乙醇来沉淀，用70％的乙醇洗涤并在4℃下在20,400G下施以离心20分钟。在空气干燥后，颗粒溶解在TE缓冲液(10mM Tris-Cl(pH8.0)，1mM EDTA)中。
[0196] TE缓冲液中的病毒DNA用XhoI、SphI和SmaI消化，并施以0.8％琼脂糖凝胶电泳。单个凝胶上的电泳的DNA片段同时转移到两个尼龙膜(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,6.35,Sambrook,J.和Russell,D.W.Cold Spring Harbor Laboratory)。在通过烘烤固定DNA后，用DIG-标记的探针、“VP2探针”或“IS44/45探针”杂交固定的DNA，所述探针用PCR DIG Probe Synthesis Kit(ROCHE DIAGNOSTICS,Cat.#1636090)制备。此外，TE缓冲液中的病毒DNA用XhoI和SphI消化，并通过与上述相同程序用DIG-标记的探针、“F探针”和“IS45/46探针”杂交。VP2探针用VP2STC-F(SEQ ID NO.21)和VP2STC-R(SEQ ID NO.22)作为引物并用p45/46bacVP2-STC作为模板来制备。F探针用F-F(SEQ ID NO.23)和F-R(SEQ ID NO.24)作为引物并用p45/46PecF作为模板来制备。IS45/46探针用45/46-F(SEQ ID NO.25)和45/46-R(SEQ ID NO.26)作为引物并用pNZ45/46Sfi作为模板来制备。IS44/45探针用44/45-F(SEQ ID NO.27)和44/45-R(SEQ ID NO.28)作为引物并用pNZ44/45d46Sfi作为模板来制备。
[0197] VP2STC-F(SEQ ID NO.21)5’-CACCGTCCTCAGCTTACCCACATC-3’
[0198] VP2STC-R(SEQ ID NO.22)5’-ACGACGGATCCTGTTGCCACTCT-3’
[0199] NDV-F-F(SEQ ID NO.23)5’-CTAGCAGTGGCAGTTGGGAAGAT-3’
[0200] NDV-F-R(SEQ ID NO.24)5’-GTTAAGGCAGGGGAAGTGATTTGT-3’
[0201] 45/46-F(SEQ ID NO.25)5’-GGGGAAGTCTTCCGGTTAAGGGAC-3’
[0202] 45/46-R(SEQ ID NO.26)5’-GGTGCAATTCGTAAGACCGATGGG-3’
[0203] 44/45-F(SEQ ID NO.27)5’-GTACTATAGAATGTGTTCC-3’
[0204] 44/45-R(SEQ ID NO.28)5’-GTATCCAACGCCTCAAGATC-3’
[0205] Southern印迹分析结果(图5A-5D)显示了在来自FW129的DNA中2077-bp片段杂交到VP2探针上。相反，p45/46Pec F中未检测到条带。
[0206] 此外，在来自各二价重组HVT的DNA中，2744-bp片段杂交到F探针上。在p45/46SfiI中未检测到条带。
[0207] 在来自FW129的DNA中，2077-bp和1228-bp片段杂交到IS44/45探针上。在p45/46PecF中，1350-bp片段杂交到IS44/45探针上，在IS44/45位点处没有插入基因。
[0208] 在来自各二价重组HVT的DNA中，2744-bp和770-bp片段杂交到IS45/46探针上。图5A-5D显示了获得的二价重组HVT/ND/IBD聚友预期的基因组结构。
[0209] 试验5：重组HVTs在传代中的稳定性
[0210] Western印迹分析
[0211] 二价重组HVTs在鸡胚胎成纤维(CEF)细胞上连续传代(最多15次)。随后将细胞裂解物应用于Western印迹分析。在第一面板中(图6A)，该印迹与抗F兔血清(#35)反应，在第二面板中(图6B)，该印迹与抗-VP2Mab(R63)反应。Mock：未感染的CEF[0212] M：Precision Plus Protein Standards Bio Rad#161-0374
[0213] 在15次传代后，F和VP2在用二价重组HVT感染的CEF中稳定表达。但是，在15次传代后FW137未表达F和VP2抗原的信号，说明在单一位点具有两个基因的重组HVT不稳定。
[0214] Southern印迹分析
[0215] M：分子标记物ramda HindIII消化液
[0216] TP-24：转移质粒p44-45d46SV40VP2
[0217] TP-25：转移质粒p44-45d46RsvVP2
[0218] 如试验4中所述，各rHVT/ND/IBD在CEF细胞中传代15次并施以Southern印迹分析。结果与试验4中获得的那些相同，表明重组病毒即使在15次传代后仍是稳定的。
[0219] Southern印迹法的结果显示(图7A)2077-bp片段在来自FW129的DNA中杂交到VP2探针。2334-bp片段在来自FW130的DNA中杂交到VP2探针。相反，在p45/46Pec F中未检测到条带。
[0220] 图7C显示，2744-bp片段在来自各二价重组HVT的DNA中均杂交到F探针。在p45/46SfiI中未检测到条带。
[0221] 图7B显示，2077-bp和1228-bp片段在来自FW129的DNA中杂交到IS44/45探针，并且2334-bp和1022-bp片段在来自FW130的DNA中杂交到IS44/45探针。1350-bp片段在p45/46PecF中杂交到IS44/45探针，其在IS44/45位点处不含基因。
[0222] 图7D显示2744-bp和770-bp片段在来自各二价重组HVT的DNA中均杂交到IS45/46探针。
[0223] 采用44/45探针和45/46探针的Southern印迹显示VP2基因或F基因分别在FW129和FW130中稳定保持在插入位点44/45或45/46处。
[0224] 试验6：用二价重组HVTs接种过的鸡的抗-NDV和IBDV ELISA滴度
[0225] 使用20Gauge注射器将3,000PFU/200微升/鸟的各rHVT/ND/IBD皮下接种到十一日龄SPF鸡的背部(LineM,Japan Biological Laboratories)。接种后三周起，收集接种鸡的血清。通过商业ELISA试剂盒，羊传染性法氏囊病抗体检测试剂盒(IDEXX Laboratory,Inc.)滴定抗-IBDV抗体。抗-NDV抗体滴度通过商业ELISA试剂盒(IDEXX，用于诊断鸡新城疫的ELISA试剂盒)测量。抗-IBDV抗体通过商业ELISA试剂盒，羊传染性法氏囊病抗体检测试剂盒(IDEXX Laboratory,Inc.)滴定。阴性对照组的鸡不施用任何疫苗。
[0226] 图8A显示了抗-NDV滴度的变化。图8B显示了抗-IBDV滴度的变化。
[0227] 施用两个位点的二价重组HVT稳定地诱导抗-NDV和抗-IBDV滴度。
[0228] 试验7：SPF鸡中rHVT/ND/IBD对抗NDV的功效
[0229] 使用作为鸡新城疫疫苗的药效试验来评价rHVT/ND/IBD(FW130、FW135、FW137、FW129)作为ND疫苗的药效。
[0230] 使用20Gauge注射器将3,000PFU/200微升/鸟的各rHVT/ND皮下接种到十一日龄SPF鸡的背部(LineM,Japan Biological Laboratories)。接种后三周起，收集接种鸡的血清，抗-NDV抗体滴度通过商业ELISA试剂盒(IDEXX，诊断鸡新城疫的ELISA试剂盒)测定。
[0231] 阳性对照组的鸡在14日龄用商业NDV活疫苗根据场上建议进行接种。阴性对照组的鸡不施用任何疫苗。
[0232] 在第43日龄(接种后42天)，所有七个组的鸡通过肌肉内注射至股区用103EID50的NDV-TexasGB(美国的标准激惹菌株)激惹。每天观察激惹的鸡以检查死亡率，并检测任何鸡新城疫的症状。
[0233] 表2.采用剧毒NDV的rHVT/ND/IBD-接种的SPF鸡的激惹试验
[0234]
[0235] 如表2中所示，用本发明的rHVT/ND/IBD接种的鸡没有表现出任何鳞状症状，ELISA滴度在激惹的当天显著升高。如预期那样，用FW137(其中两个重组核苷酸序列插入同一插入位点)或FW135(其中Bac启动子插入UL44与UL45之间)接种的鸡显示出临床症状，并且ELISA滴度弱。
[0236] 试验8：SPF鸡中rHVT/ND/IBD对抗IBDV的功效
[0237] 通过激惹IBDV STC评价FW129和FW141(HVT/45-46PecF/44-45Mcmv ie1VP2)作为IBD疫苗的功效。
[0238] 首先，在第18天将2,000pfu的rHVT/ND/IBD接种到SPF具胚的鸡蛋中或皮下接种到一日龄SPF鸡的背部。在三周大时，接种的鸡用每只鸡103.5EID50的IBDV STC口服激惹。一周后，所有鸡称重并剖检以回收法氏囊，观察法氏囊是否存在传染性法氏囊病引起的任何病变。
[0239] 通过如下两个标准评价保护。(1)囊对躯体的重量比(B/B指数)在统计上并未不同于未接种、的未激惹的鸡。(2)没有检测到法氏囊的畸形，如浮肿、出血、淡黄色渗液、变色、萎缩或胶状渗出液。结果总结在表3中。
[0240] 表3.采用剧毒IBDV的rHVT/ND/IBD接种SPF鸡的激惹试验
[0241]
[0242] 所有接种鸡的超过80％受到保护，对抗IBDV STC菌株的激惹，表明rHVT/ND/IBD可以诱导鸡体内的保护性免疫力对抗剧毒的IBDV。
[0243] 试验9：在第8周在MDA+鸡中的IBDV激惹试验
[0244] 组：
[0245] G1：NINC(未接种，未激惹)
[0246] G2：NICC(未接种，激惹)
[0247] G3：FW141
[0248] G4：FW144
[0249] G5：FW 023(阳性对照物)
[0250] 小鸡
[0251] MDA+鸡(层)，各组中16至17只鸡/组。
[0252] 将3,000pfu的疫苗接种到16至17只一日龄MDA+鸡的背部。在八周大时，接种的鸡用每只鸡103EID50的IBDV STC口服激惹。一周后，所有鸡称重并剖检以回收法氏囊，观察法氏囊是否存在传染性法氏囊病引起的任何病变。
[0253] 通过如下两个标准评价保护。(1)囊对躯体的重量比(B/B指数)在统计上并未不同于未接种、的未激惹的鸡。(2)没有检测到法氏囊的畸形，如浮肿、出血、淡黄色渗液、变色、萎缩或胶状渗出液。结果总结在下表中。
[0254]
[0255] 这些结果表明，该多价本发明的疫苗引起了在其内针对IBDV的有效保护。
[0256] 试验10：在第8周在MDA+鸡中的NDV激惹试验
[0257] 组
[0258] G1：激惹对照物
[0259] G2：FW141
[0260] G3：FW144
[0261] G4：FW145
[0262] G5：FW 029(阳性对照物)
[0263] 小鸡
[0264] MDA+鸡(层)，各组中17只鸡/组。
[0265] 将3,000pfu的疫苗皮下接种到17只一日龄MDA+鸡的背部。在八周大时，接种的鸡用肌内注射至股区的每只鸡103EID50的NDV-TexasGB(美国标准激惹菌株)激惹。每天观察激惹的鸡以检查死亡率，并检测任何鸡新城疫的症状。结果显示在下面。
[0266]免疫的 激惹的 死亡 症状* ％保护
激惹对照物 17 13 13 0 0.0
FW141 17 15 1 0 93.3
FW144 17 15 3 1 73.3
FW145 17 13 0 0 100.0
FW029 17 16 3 0 81.3
激惹对照物 17 13 13 0 0.0
FW141 17 15 1 0 93.3
FW144 17 15 3 1 73.3
FW145 17 13 0 0 100.0
FW029 17 16 3 0 81.3
[0267] *某些未死亡的NDV症状
[0268] 这些结果表明，本发明的多价疫苗引起在体内针对NDV和IBDV的有效保护。该保护强且稳定。
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