一、技术领域：

本发明为食品质量与安全的免疫学快速检测技术，具体是一种羊乳及其乳 制品中掺入牛乳成分的快速免疫检测方法。

二、技术背景：

1.国内羊乳生产的现状与掺假检验技术的需要

与牛乳相，羊乳及其制品比由于其更易消化，具有特殊的风味，对一些牛 乳过敏者的不良反应较少，是人类重要的特色营养食品。而中国奶羊养殖规模 一般较小，多为高多分散的农户散养，同时受到季节波动性影响致使羊乳的价 格比牛奶高，在羊乳中掺入牛乳的现象时有发生[1]，这种掺假不仅在液态羊乳和 羊乳粉等终产品中，更多地会出现在原料乳的收购过程，所以为了保护羊乳加 工生产者和消费者的利益，急需建立一种适宜于现场快速检测羊乳掺入牛乳的 方法，以确保羊乳制品的质量和安全。我国羊乳的生产加工与流通领域的快速 检测主要应用于以下三方面：

①我国奶羊养殖的特点是高度分散，且很容易受到季节波动的影响，羊乳 原料乳的收购主要针对小规模的千家万户，急需一种适应这种生产状况的原料 乳检验方法；

②羊乳粉原料主要面向国内的羊乳制品生产者及出口贸易，对羊乳粉的要 求高，如出口东南亚的羊乳粉贸易对其中牛乳成分的可检出率必须不大于5％的 苛刻要求，也对检测的灵敏度和方便快速有较高的要求；

③个体消费者从市场购买羊乳制品更需要一种快速检验方法。

综上所述，国内急需一种不需要特殊的仪器设备的快速检验方法。

2.羊乳中掺入牛乳检验方法研究现状

羊乳中掺入牛乳不同于一般的乳品掺假检验(常见的一类是掺入危及人体 健康的有害物质，如为了提高掺水比重的尿素，防止牛乳中细菌超标的甲醛、 硼酸等有害防腐剂；另一类是掺入无害的价廉物质，包括水、米汤和面汤、豆 浆、蔗糖、食盐等，为了应付脂肪指标加入植物油，加入淀粉和糊精提高固形 物，以及廉价的明胶、大豆蛋白粉和乳清粉等以提高蛋白质，其目的在于以低 值成分充高值成分)，这种针对羊乳中的乳源性掺假检验，由于羊乳与牛乳的化 学同源性更强，一般的理化性质差别小，仅通过简单的密度、电导、色度、滋 味等，一般的化学分析(总固形物、脂肪通用的蛋白质)测定是难以区分的， 这种需要区别乳源性的对方法的区别检验要求高。

国外对检测羊乳中掺入牛乳成分的方法的研究综合起来可分为非免疫学方 法和免疫学两大类：

①非免疫学方法：

国内外近年用于羊乳的乳源性掺假的非免疫学方法包括色谱技术(高效液 相色谱技术等)，电泳技术(聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电点聚焦以及毛细管电泳 等)，PCR技术。气相色谱、各种电泳(SDS-PADE、IEF、CF)和PCR技术等，其 结果虽然准确可靠，但对仪器技术的依耐性强，试剂种类多，实验费用高，实 验需要的时间费时长，不适合现场分析检测。

色谱技术，常用的包括气象和液相色谱技术。气相色谱法是以牛乳与羊乳 中所含脂肪酸含量的不同为依据进行检测分析的。液相色谱主要应用高效液相 色谱技术(HPLC)、反相色谱技术、离子交换色谱技术，通过将乳中脂肪、蛋白 质等成分高效分离进行检测比较，这种类方法都需要比较专业化的大型仪器， 既耗时又费力，而且只能检测羊乳中是否含有牛乳成分，较难准确定量。

电泳技术，电泳分析是将蛋白质至于一定的电场中，利用不同蛋白质的电 荷和分子量所决定的电迁移率不同进行高效分离，实现对乳品多种蛋白质组分 同时定性定量分析，多数实验室采用凝胶电泳(SDS-PAGE)，费时费力，实验重 复性较差，研究最热的是毛细管电泳(CE)，可以实现自动化速度高效分析，但 是需要昂贵的大型仪器，仅海关和质检部门使用，电泳方法对仪器设备和操作 技术有较高要求，不适应现场快速检测需要。

PCR技术，以DNA为基础的聚合酶链式反应(PCR)方法成功地应用于乳品掺 假检测中。它是以牛特异性基因-线粒体12S rRNA基因中的223bp片段为靶基 因进行检测的。PCR方法有较强的专一性更强。但是，PCR所需的专业技术较强， 所需试剂昂贵。但是现在发展的用于此方面的PCR技术[17]只能用于鉴别，而不 能够检测出其中牛乳的具体掺入量。

②免疫学方法：

免疫学方法是能够实现这一要求的分析检验方法。传统的琼脂扩散试验、 火箭免疫电泳、红细胞凝集抑制试验和免疫印迹法]虽然从方法的精确灵敏度反 面能满足，但是这些方法存在的缺点明显，一是需要的实验时间较长，二是要 求很高的抗血清浓度。

酶联免疫吸附方法(ELISA)在乳品鉴定掺假方面具有很大的应用潜力。它 与其他现代分析方法不同之处在于其高科技建立于试剂而不是设备，无需高昂 的设备或者专业的操作人员，就能实现明确、可靠的成分探索分析。

Rodriguez，E.，Martin，R等(1990)用牛乳清蛋白(BWP)作为抗原免疫 兔，抗血清经过亲和色谱纯化用生物素标记后建立ELISA检测方法。Beer等 (1995)利用牛乳中的β-乳球蛋白作为抗原免疫鸡，将获得的鸡抗血清纯化后 得到鸡抗牛β-乳球蛋白抗体，同时将羊抗鸡碱性磷酸酶结合物作为竞争物建立 间接竞争型ELISA检测方法。Richter，W和Krause，I等(1997)用牛乳中的 γ-酪蛋白作为抗原免疫注射兔和鸡得到抗血清，将抗血清通过以牛酪蛋白作为 配基的亲和色谱柱纯化获得抗牛β-CN的特异性多克隆抗体建立间接竞争型 ELISA检测方法。

Martin，R等(1995-2005)用牛乳中的β-CN为抗原，通过杂交瘤技术制备 了单克隆抗体，并且结合酶标兔抗鼠抗体建立了间接ELISA方法。Hurley等 (2004)用牛乳中的IgG为抗原制备单克隆抗体建立了间接竞争和夹心IgG ELISA方法检测羊乳中掺入的牛乳含量。单克隆抗体具有非常高的专一性，方法 检测最低限度为百分之一以下，但是单克隆抗体研发技术路线复杂，成本高， 针对原料乳收购等底端市场在国内还难以应用，国外针对羊乳掺假检验不同于 中国，主要是针对山羊乳中掺入绵羊乳(以羊奶酪制品为多)，目前国内缺乏一 种有效简捷的方法来定量检测羊乳及其乳制品中掺入的牛乳成分。

三、发明内容：

本发明的目的是要提供一种羊乳及其乳制品中掺入牛乳的快速免疫学检测 方法，以克服现有技术存在的技术路线复杂、不易于操作、成本高且需时长的 问题。

本发明的设计路线是以牛乳的一种代表性酪蛋白作为抗原产生哺乳动物血 清抗体，将抗体采用特殊的选择性处理，再将待测羊乳(疑是掺假样品)进行 脱脂处理，应用制备的抗体建立了适合现场快速检测的检测羊乳中掺入牛乳含 量的ELISA方法。

本发明所提供的技术方案是：

一种羊乳及其制品中掺入牛乳的免疫学检测方法，其特征在于：包括下述 步骤

(1)选择牛乳酪蛋白的特异稳定组分为抗原免疫哺乳动物产生抗体：

(2)处理兔血清抗体，制备得到检测用高特异性抗体：将免疫血清抗体 稀释于PBST缓冲液中(抗体浓度2.0mg/ml)，然后与羊乳β-酪蛋白混合(按 1.0mg/ml冻干蛋白加入，置37℃培养2小时，再于4℃下过夜，目的是免疫吸 收消除多克隆血清抗体与羊乳中存在的交叉抗原的非特异反应(交叉反应)，从 而得到特异性高的检测用抗体；

(3)用免疫学检测方法进行检测。

上述步骤(1)的具体步骤包括：

①选择牛乳中含量高，组成稳定的β-酪蛋白作为抗原：牛β-酪蛋白的制 备是将干酪素5g溶于100ml pH12.0的3.3mol/L的尿素中，调节pH4.6， 3000r/min离心10分钟得到沉淀和上清液。向上清液加水使尿素浓度稀释至 0.5mol/L，再一次离心得到沉淀，后者得到β-酪蛋白，β-酪蛋白作为抗原用 于免疫及抗体检测的标准；

②兔抗牛β-酪蛋白多克隆抗体的制备：用牛β-酪蛋白免疫新西兰白兔。 以2mg/只为免疫剂量，初次注射用弗式完全佐剂混合，充分乳化后于背部皮下 多点注射，10天后，与等量弗式不全佐剂充分乳化后，进行第一次加强免疫。 以后间隔7天再加强三次，到第35天效价达到最高1∶104以上并维持一周后， 对兔进行颈脉放血，室温放置1小时后，800×g离心分离并收集血清，存放于 -20℃冰箱备用。血清的纯化采用饱和硫酸铵分级沉淀法，依次以50％、40％、 33％的饱和硫酸铵纯化一次；

上述步骤(2)中羊乳β-酪蛋白的制备方法是将干酪素5g溶于100ml pH12.0 的3.3mol/L的尿素中，调节pH4.6，3000r/min离心10分钟得到沉淀和上清液。 向上清液加水使尿素浓度稀释至0.5mol/L，再一次离心得到沉淀，后者得到β- 酪蛋白。

上述步骤(3)中的检测方法是应用得到的特异抗体应用间接ELISA定量 检测羊乳及其乳制品中掺入的牛乳成分，

上述步骤(3)中检测应用时最适抗原包被浓度，抗体最佳工作浓度可根据 棋盘滴定法来确定，样品的最佳包被浓度为1∶128，免疫吸收后的抗体稀释为 1∶40，酶标二抗稀释度为1∶1000。

上述步骤(3)中用包被缓冲液将待测样品适当稀释包被酶标板，100μl/ 孔，4℃过夜，用PBST洗板3次，加入100μl 1％明胶封闭1小时，洗板；加 入免疫吸收后的兔抗牛β-酪蛋白多抗100μl/孔，37℃孵育2小时。洗板5次 后，将残留的异种抗原以及为吸附的抗体除去；加100μl/孔体积比为1∶1000 稀释的酶标羊抗兔IgG，37℃孵育1小时，洗板；加入HRP的底物缓冲液(TMB+ H2O2)100μl/孔，室温下避光孵育20分钟后，用浓度为2mol/L的硫酸终止反应， 50μl/孔；酶联检测仪上450nm处读取吸光度(A450nm)。

上述步骤(3)中在定量时，使用标准的阴性(脱脂纯山羊乳)和阳性(羊 乳中掺入一定量牛乳)样品作控制，阳性样品采用脱脂羊乳中掺入牛乳的不同 梯度含量(V/V)为：0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10％，以此浓度梯度样品制作标准 曲线，或作为目视比色标准样品；抗原抗体反应结合后使用酶标二抗在进行间 接的显色测定，定量测定可以采用酶标仪在450nm波长下测定吸光值，也可在 现场采用与相应的系列阳性标准显色的酶标板直接目视比色判断。

上述步骤(3)中的检测方法是竞争性ELISA检测方法。

上述方法的具体步骤包括：

①对抗体的纯化：将本发明方法处理兔血清抗体采用凝胶过滤 (SephadexG-100)纯化，制得的纯化抗体用于竞争法检测；

②抗原的酶标：将纯化的牛β-酪蛋白使用辣根过氧化物酶(HRP)酶标 (采用过碘酸钠氧化法，透析后再用SephadexG-100凝胶过滤纯化)，冷冻干燥；

③建立竞争ELISA用于羊乳中掺入的牛乳成分的快速检测：

A、用以上纯化的抗体包被酶标板(浓度由棋盘法确定)；

B、设测定管和对照管

测定管加待测羊乳样品和一定量的酶标抗原，温育使二者与固相抗体竞争结 合；对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合；分别充分洗涤，除去未 结合的成分；

C、加底物显色，分别测定两管的光密度(OD)值，根据对照管与测定管OD 值之比，计算标本中待测抗原含量。

与现有技术相比，本发明的优点是：

1、检测效果好：本发明特异性与灵敏度高，检测时间短，该法检测羊乳中 所掺入牛乳含量的最低限为1-2％(V/V)。

2、成本低：本发明中提供的试剂价格低廉，实验操作方便，不需特殊的仪 器设备，适合现场快速检测需要，可以满足有关研究单位，质检部门批量检测 相关乳品质量的需要。

3、适用范围广：可用于新鲜的羊乳原料、羊乳粉及液态灭菌羊乳(复原羊 乳)等羊乳产品中掺入牛乳的快速检测。

四、说明书附图：

图1羊乳及其乳制品中掺入牛乳成分的免疫学检测流程；

图2新西兰白兔免疫后抗体效价变化(↓表示加强免疫时)。

五：具体实施方式：

下面将通过具体实施例对本发明做详细的说明。

一种羊乳及其制品中掺入牛乳的免疫学检测方法，包括下述步骤：

(1)选择牛乳酪蛋白的特异稳定组分为抗原免疫哺乳动物产生抗体；

①选择牛乳中含量高，组成稳定的β-酪蛋白作为抗原。

牛β-酪蛋白的制备：将干酪素5g溶于100ml pH12.0的3.3mol/L的尿素 中，调节pH4.6，3000r/min离心10分钟得到沉淀和上清液。向上清液加水使 尿素浓度稀释至0.5mol/L，再一次离心得到沉淀，后者得到β-酪蛋白。

β-酪蛋白作为抗原用于免疫及抗体检测的标准。

②兔抗牛β-酪蛋白多克隆抗体的制备。

用牛β-酪蛋白免疫新西兰白兔。以2mg/只为免疫剂量，初次注射用弗式 完全佐剂混合，充分乳化后于背部皮下多点注射。10天后，与等量弗式不全佐 剂充分乳化后，进行第一次加强免疫。以后间隔7天再加强三次，到第35天效 价达到最高1∶104以上并维持一周后，对兔进行颈脉放血。室温放置1小时后， 800×g离心分离并收集血清，存放于-20℃冰箱备用；血清的纯化采用饱和硫 酸铵分级沉淀法，依次以50％、40％、33％的饱和硫酸铵纯化一次。

选用牛乳β-酪蛋白作为抗原制备动物多克隆抗体是本发明重要部分，由 于酪蛋白是乳中含最量高的蛋白质，约占总乳蛋白质的80％~85％，而牛乳中的 β-酪蛋白又是酪蛋白中含量最稳定的一种，同时牛乳β-酪蛋白具有良好的免 疫原性，从其免疫血清抗体的效价变化曲线已明确显示。(参见图2)

(2)处理兔血清抗体，制备得到检测用高特异性抗体。

将免疫血清抗体稀释于PBST缓冲液中(抗体浓度2.0mg/ml)，然后与羊乳 β-酪蛋白混合(按1.0mg/ml冻干蛋白加入，羊乳β-酪蛋白的制备与1.①牛 β-酪蛋白的制备方法相同)，置37℃培养2小时，再于4℃下过夜，目的是免 疫吸收消除多克隆血清抗体与羊乳中存在的交叉抗原的非特异反应(交叉反 应)，从而得到特异性高的检测用抗体。

这一步是本发明的核心内容，通过用羊乳中存在的共同抗原对多克隆抗体 的充分反应(羊乳β-酪蛋白冻干粉混合)，如此可将与羊乳酪蛋白产生交叉反 应的抗体封堵(blocking)，从而去除非专一的抗体而得到种源专一性的抗体， 该方法可称为抗体的区分特异化技术(Rending)，不需要通过复杂的(亲和层 析的方法)纯化消除抗体的交叉反应，本实验方法操作简单，反应混和液不需 专门的纯化分离步骤(在其后的间接ELISA洗涤步骤可将残留的羊乳抗原以及 交叉反应后的产物除去，不影响检测反应)。

通过本步骤操作可以大大提高多克隆抗体免疫反应的专一性(实验结果见 表，可以提高检测方法的灵敏度实现，而血清多克隆抗体的制备方便，成本低 廉，使用能满足要求，这是本发明最大的特点)。

表1原抗体与牛乳、羊乳酪蛋白的间接ELISA结果

表2抗体经免疫吸附后与牛乳、羊乳酪蛋白的间接ELISA结果

(3)用免疫学检测方法进行检测：下面提供了两种方法

第一种方法：建立间接酶联免疫吸附(间接ELISA)测定方法，即直接使 用处理的抗体应用间接ELISA检测

应用得到的特异抗体应用间接ELISA定量检测羊乳及其乳制品中掺入的 牛乳成分，其操作程序见图1，具体步骤是：用包被缓冲液将待测样品适当稀 释包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜。用PBST洗板3次。加入100μl 1％明胶 封闭1小时，洗板；加入免疫吸收后的兔抗牛β-酪蛋白多抗100μl/孔，37℃ 孵育2小时。洗板5次后，将残留的异种抗原以及为吸附的抗体除去；加100 μl/孔体积比为1∶1000稀释的酶标羊抗兔IgG，37℃孵育1小时，洗板；加入 HRP的底物缓冲液(TMB+H2O2)100μl/孔，室温下避光孵育20分钟后，用浓度 为2mol/L的硫酸终止反应，50μl/孔；酶联检测仪上450nm处读取吸光度 (A450nm)。

本发明检测应用时最适抗原包被浓度，抗体最佳工作浓度可根据棋盘滴定 法来确定。样品的最佳包被浓度为1∶128，免疫吸收后的抗体稀释为1∶40， 酶标二抗稀释度为1∶1000。

本发明在定量时，使用标准的阴性(脱脂纯山羊乳)和阳性(羊乳中掺入 一定量牛乳)样品作控制，阳性样品采用脱脂羊乳中掺入牛乳的不同梯度含量 (V/V)为：0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10％，以此浓度梯度样品制作标准曲线，或 作为目视比色标准样品。该法的检测羊乳中所掺入牛乳含量的最低限为1-2％ (V/V)。

抗原抗体反应结合后使用酶标二抗在进行间接的显色测定，定量测定可以 采用酶标仪在450nm波长下测定吸光值，也可在现场采用与相应的系列阳性标 准显色的酶标板直接目视比色判断。

实施例1：免疫学检测原料羊乳中掺入的牛乳成分

①样品准备

将待检羊乳离心13000×g，10分钟后过滤得到脱脂乳。

同时用羊乳中掺入牛乳不同含量(V/V)(0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10％梯度) 样品作为制作标准曲线的样品。

②样品及标准曲线样品包被酶标板

样品及标准曲线样品按1∶128稀释包被酶标板。

用PBST洗板3次；加入100μl 1％明胶封闭1小时，洗板。

③免疫反应

向酶标板加入免疫吸收后的兔抗牛β-酪蛋白多抗100μl/孔，37℃孵育2 小时。洗板5次后；

④加二抗检测

加100μl/孔体积比为1∶1000稀释的酶标羊抗兔IgG，37℃孵育1小时， 洗板；

⑤酶显色反应

加入HRP的底物缓冲液(TMB+H2O2)100μl/孔，室温下避光孵育20分钟后， 用浓度为2mol/L的硫酸终止反应，50μl/孔；

⑥结果检测与计算

酶联检测仪上450nm处读取吸光度(A450nm)。

绘制标准曲线，由标准曲线换算出待测样品中掺入的牛乳含量。

利用建立的间接ELISA对样品进行检测，原料羊乳中掺入的牛乳成分最低 检测限度为1％~2％。

实施例2：免疫学检测羊乳粉中掺入的牛乳成分

①样品准备

将羊乳粉按比例(1∶6)加水充分溶解制得复原乳，再按以上的液态原料 乳制样。

②～⑤步骤操作同实施例一的②～⑤。

⑥结果检测与计算

采用实例1相同的测定。

计算时乘上羊乳粉溶解时的稀释倍数即可。

实施例3：免疫学检测复原羊乳中掺入的牛乳成分

①样品准备

商品供应的巴氏灭菌羊乳(62℃，30分钟)以及高温灭菌(121℃，20 分钟)羊乳，直接取样，处理实例1相同的样品处理方。

以不同0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10％梯度含量(V/V)将牛乳掺入复原羊乳 中作为样品。

②～⑥同实施例1的②～⑥步骤。

第二种方法：对处理的抗体酶标建立竞争法快速检测方法

①对抗体的纯化：将本发明方法处理兔血清抗体采用凝胶过滤 (SephadexG-100)纯化，制得的纯化抗体用于竞争法检测。

②抗原的酶标：将纯化的牛β-酪蛋白使用辣根过氧化物酶(HRP)酶标(采用 过碘酸钠氧化法，透析后再用SephadexG-100凝胶过滤纯化)，冷冻干燥；

③建立竞争ELISA用于羊乳中掺入的牛乳成分的快速检测

a用以上纯化的抗体包被酶标板(浓度由棋盘法确定)；

b设测定管和对照管

测定管加待测羊乳样品和一定量的酶标抗原，温育使二者与固相抗体竞争 结合。

对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合。

分别充分洗涤，除去未结合的成分；

c加底物显色，分别测定两管的光密度(OD)值，根据对照管与测定管OD值 之比，计算标本中待测抗原含量。结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负 相关。同实例一，制作相应的用羊乳中掺入牛乳不同含量(V/V) (0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10％梯度)样品作为制作标准曲线的样品。