治疗癌症的方法
阅读：896发布：2020-05-13
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1.一种治疗受试者中具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平的癌症的方法，其中与VEGF水平相比更高的FGF2水平指示所述癌症对成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子的治疗响应性，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。
2.一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括：对所述受试者施用治疗有效量的成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子，
其中在施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子之前，所述癌症的至少一部分细胞已经确定具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平，且
其中癌症中与VEGF水平相比更高的FGF2水平指示所述癌症对FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子的治疗响应性。
3.一种鉴定可受益于成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子的治疗的受试者的方法，所述方法包括测定自所述受试者获得的样品中的FGF2和VEGF水平，其中所述样品中与VEGF水平相比更高的FGF2水平指示所述受试者可受益于成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子的治疗。
4.前述权利要求任一项的方法，其中所述FGF2水平为FGF2mRNA水平。
5.前述权利要求任一项的方法，其中所述VEGF水平为VEGF mRNA水平。
6.权利要求4或权利要求5的方法，其中通过定量RT-PCR来测定所述mRNA水平。
7.权利要求1至3任一项的方法，其中所述FGF2水平为FGF2蛋白质水平。
8.权利要求1至3和7任一项的方法，其中所述VEGF水平为VEGF蛋白质水平。
9.权利要求7或权利要求8的方法，其中通过免疫组织化学来测定所述蛋白质水平。
10.前述权利要求任一项的方法，其中FGF2水平对VEGF水平的比率为大于1。
11.前述权利要求任一项的方法，其中所述癌症响应作为单药疗法的FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。
12.前述权利要求任一项的方法，其中作为单药疗法对所述受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。
13.前述权利要求任一项的方法，其中所述癌症选自肾癌(诸如肾细胞癌)、肝癌(诸如肝细胞癌)、肺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、头和颈癌、成胶质细胞瘤、间皮瘤、和前列腺癌。
14.一种治疗受试者中具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平的癌症的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和治疗有效量的至少一种抗血管发生剂。
15.一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括：对所述受试者施用治疗有效量的成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂，
其中在施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂之前，所述癌症的至少一部分细胞已经确定具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平。
16.一种鉴定可受益于成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂的治疗的受试者的方法，所述方法包括测定自所述受试者获得的样品中的FGF2和VEGF水平，其中所述样品中与VEGF水平相比更低的FGF2水平指示所述受试者可受益于成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂的治疗。
17.权利要求14至16任一项的方法，其中所述FGF2水平为FGF2mRNA水平。
18.权利要求14至17任一项的方法，其中所述VEGF水平为VEGF mRNA水平。
19.权利要求17至18任一项的方法，其中通过定量RT-PCR来测定所述mRNA水平。
20.权利要求14至16任一项的方法，其中所述FGF2水平为FGF2蛋白质水平。
21.权利要求14至16和20任一项的方法，其中所述VEGF水平为VEGF蛋白质水平。
22.权利要求20或权利要求21的方法，其中通过免疫组织化学来测定所述蛋白质水平。
23.权利要求14至22任一项的方法，其中FGF2水平对VEGF水平的比率为小于1。
24.权利要求14至23任一项的方法，其中所述抗血管发生剂为VEGF拮抗剂。
25.权利要求24的方法，其中所述VEGF拮抗剂选自帕唑帕尼(pazopanib)、贝
伐珠单抗(bevacizumab)、阿西替尼(axitinib)、阿柏西普(aflibercept)、索拉非尼(sorafenib)、或舒尼替尼(sunitinib)。
26.一种降低实体癌中的血管密度的方法，所述方法包括对具有所述实体癌的受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。
27.权利要求26的方法，其中所述实体癌具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平。
28.权利要求27的方法，其中所述FGF2水平为FGF2mRNA水平。
29.权利要求27或权利要求28的方法，其中所述VEGF水平为VEGF mRNA水平。
30.权利要求28或权利要求29的方法，其中通过定量RT-PCR来测定所述mRNA水平。
31.权利要求27的方法，其中所述FGF2水平为FGF2蛋白质水平。
32.权利要求27或权利要求31的方法，其中所述VEGF水平为VEGF蛋白质水平。
33.权利要求31或权利要求32的方法，其中通过免疫组织化学来测定所述蛋白质水平。
34.权利要求27至33任一项的方法，其中FGF2水平对VEGF水平的比率为大于1。
35.权利要求14至34任一项的方法，其中所述癌症选自肾癌(诸如肾细胞癌)、肝癌(诸如肝细胞癌)、肺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、头和颈癌、成胶质细胞瘤、间皮瘤、和前列腺癌。
36.一种治疗间皮瘤的方法，所述方法包括对具有间皮瘤的受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种选自帕利他赛(paclitaxel)、卡铂(carboplatin)、多西他赛(docetaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、和顺铂(cisplatin)的治疗剂。
37.权利要求36的方法，其中所述方法包括施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子、帕利他赛和卡铂。
38.权利要求36的方法，其中所述方法包括施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和多西他赛。
39.权利要求36的方法，其中所述方法包括施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子、培美曲塞、和顺铂。
40.权利要求36至39任一项的方法，其中FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种治疗剂的施用降低所述间皮瘤中的血管密度。
41.权利要求36至40任一项的方法，其中所述间皮瘤具有与参照样品或细胞中的FGF2水平相比更高的FGF2水平。
42.权利要求36至41任一项的方法，其中所述间皮瘤具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平。
43.权利要求41或权利要求42的方法，其中所述FGF2水平为FGF2mRNA水平。
44.权利要求42或权利要求43的方法，其中所述VEGF水平为VEGF mRNA水平。
45.权利要求43或权利要求44的方法，其中通过定量RT-PCR来测定所述mRNA水平。
46.权利要求41或权利要求42的方法，其中所述FGF2水平为FGF2蛋白质水平。
47.权利要求42或权利要求46的方法，其中所述VEGF水平为VEGF蛋白质水平。
48.权利要求46或权利要求47的方法，其中通过免疫组织化学来测定所述蛋白质水平。
49.权利要求42至48任一项的方法，其中FGF2水平对VEGF水平的比率为大于1。
50.前述权利要求任一项的方法，其中所述受试者先前已经用至少一种选自帕唑帕尼、贝伐珠单抗、阿西替尼、阿柏西普、索拉非尼、和舒尼替尼的治疗剂治疗过。
51.权利要求50的方法，其中所述受试者具有VEGF抗性癌症或帕唑帕尼抗性癌症。
52.前述权利要求任一项的方法，其中所述方法包括施用FGFR1 ECD。
53.权利要求52的方法，其中所述FGFR1 ECD包含选自SEQ ID NO:1至4的氨基酸序列。
54.权利要求1至52任一项的方法，其中所述方法包括施用FGFR1 ECD融合分子。
55.权利要求54的方法，其中所述FGFR1 ECD融合分子包含FGFR1 ECD和融合伴侣，且其中所述融合伴侣为Fc。
56.权利要求55的方法，其中所述FGFR1 ECD融合分子包含选自SEQ ID NO:5和6的序列。
治疗癌症的方法
[0001] 发明背景
[0002] 可溶性形式的成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)已经显示在体外和在体内抑制肿瘤细胞生长。参见例如美国专利No.7,678,890。在一些情况中，抗癌疗法的功效取决于所靶向的癌症的遗传组成。
[0003] 发明概述
[0004] 在一些实施方案中，提供治疗受试者中具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平的癌症的方法。在一些实施方案中，与VEGF水平相比更高的FGF2水平指示所述癌症对成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子的治疗响应性。在一些实施方案中，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。在另一个实施方案中，提供FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子，其用于治疗受试者中的癌症的方法，特征在于所述癌症具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平。在又一个实施方案中，提供FGFR1 ECD或FDFR1 ECD融合分子在制造用于治疗受试者中的癌症的方法的药物中的用途，特征在于所述癌症具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平。在一些实施方案中，一种方法包括对所述受试者施用治疗有效量的FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和治疗有效量的至少一种抗血管发生剂。在一些实施方案中，所述抗血管发生剂为VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，所述VEGF拮抗剂选自帕唑帕尼(pazopanib)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、阿西替尼(axitinib)、阿柏西普(aflibercept)、索拉非尼(sorafenib)、或舒尼替尼(sunitinib)。
[0005] 在一些实施方案中，提供治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子。在一些实施方案中，一种方法包括对所述受试者施用治疗有效量的FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和治疗有效量的至少一种抗血管发生剂。在一些实施方案中，在施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子之前，所述癌症的至少一部分细胞已经确定具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平。在一些实施方案中，癌症样品中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的细胞已经确定具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平。在一些实施方案中，癌症中与VEGF水平相比更高的FGF2水平指示所述癌症对FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子的治疗响应性。
[0006] 在一些实施方案中，提供鉴定可受益于成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子的治疗的受试者的方法。在一些实施方案中，所述方法包括测定自所述受试者获得的样品中的FGF2和VEGF水平，其中所述样品中与VEGF水平相比更高的FGF2水平指示所述受试者可受益于成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子的治疗。
[0007] 在一些实施方案中，提供预测具有癌症的受试者对成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子的响应性的方法。在一些实施方案中，所述方法包括测定自所述受试者获得的样品中的FGF2和VEGF水平，其中所述样品中与VEGF水平相比更高的FGF2水平指示所述癌症预测响应成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子。
[0008] 在一些实施方案中，所述FGF2水平为FGF2 mRNA水平。在一些实施方案中，所述VEGF水平为VEGF mRNA水平。在一些实施方案中，通过定量RT-PCR来测定所述mRNA水平。在一些实施方案中，通过选自定量RT-PCR、微阵列、数字PCT、RNA-Seq、RNA酶保护测定法(RPA)、Northern印迹、和原位杂交(ISH)的方法来测定所述mRNA水平。
[0009] 在一些实施方案中，所述FGF2水平为FGF2蛋白质水平。在一些实施方案中，所述VEGF水平为VEGF蛋白质水平。在一些实施方案中，通过免疫组织化学来测定所述蛋白质水平。在一些实施方案中，通过选自免疫组织化学、ELISA、质谱术、反相蛋白质阵列(RPPA)、抗体阵列、纳米免疫测定法、Western印迹、和毛细管蛋白质分析测定法的方法来测定所述蛋白质水平。
[0010] 在一些实施方案中，FGF2水平对VEGF水平的比率为大于1。在一些实施方案中，FGF2水平对VEGF水平的比率为大于1.1。在一些实施方案中，FGF2水平对VEGF水平的比率为大于1.2。在一些实施方案中，FGF2水平对VEGF水平的比率为大于1.3。在一些实施方案中，FGF2水平对VEGF水平的比率为大于1.4。在一些实施方案中，FGF2水平对VEGF水平的比率为大于1.5。
[0011] 在一些实施方案中，所述癌症响应作为单药疗法的FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。在一些实施方案中，作为单药疗法对所述受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。
[0012] 在一些实施方案中，所述癌症选自肾癌(诸如肾细胞癌)、肝癌(诸如肝细胞癌)、肺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、头和颈癌、成胶质细胞瘤、间皮瘤、和前列腺癌。在一些实施方案中、所述癌症为胃肠基质肿瘤。
[0013] 在一些实施方案中，提供治疗受试者中具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括对具有所述癌症的受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂。在一些实施方案中，一种方法包括对所述受试者施用治疗有效量的FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和治疗有效量的至少一种抗血管发生剂。在一些实施方案中，所述抗血管发生剂为VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，所述VEGF拮抗剂选自帕唑帕尼、贝伐珠单抗、阿西替尼、阿柏西普、索拉非尼、或舒尼替尼。
[0014] 在一些实施方案中，提供治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子和治疗有效量的至少一种抗血管发生剂。在一些实施方案中，在施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂之前，所述癌症的至少一部分细胞已经确定具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平。在一些实施方案中，癌症样品中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的细胞已经确定具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平。在一些实施方案中，提供治疗具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平的癌症的方法，所述方法包括对具有所述癌症的受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂。
[0015] 在一些实施方案中，提供鉴定可受益于成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂的治疗的受试者的方法。在一些实施方案中，所述方法包括测定自所述受试者获得的样品中的FGF2和VEGF水平，其中所述样品中与VEGF水平相比更低的FGF2水平指示所述受试者可受益于成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂的治疗。
[0016] 在一些实施方案中，提供预测具有癌症的受试者对成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂的响应性的方法。
在一些实施方案中，所述方法包括测定自所述受试者获得的样品中的FGF2和VEGF水平，其中所述样品中与VEGF水平相比更低的FGF2水平指示所述癌症预测响应成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂的治疗。
在一些实施方案中，所述方法包括测定自所述受试者获得的样品中的FGF2和VEGF水平，其中所述样品中与VEGF水平相比更低的FGF2水平指示所述癌症预测响应成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂的治疗。
[0017] 在一些实施方案中，所述FGF2水平为FGF2 mRNA水平。在一些实施方案中，所述VEGF水平为VEGF mRNA水平。在一些实施方案中，通过定量RT-PCR来测定所述mRNA水平。在一些实施方案中，通过选自定量RT-PCR、微阵列、数字PCT、RNA-Seq、RNA酶保护测定法(RPA)、Northern印迹、和原位杂交(ISH)的方法来测定所述mRNA水平。
[0018] 在一些实施方案中，所述FGF2水平为FGF2蛋白质水平。在一些实施方案中，所述VEGF水平为VEGF蛋白质水平。在一些实施方案中，通过免疫组织化学来测定所述蛋白质水平。在一些实施方案中，通过选自免疫组织化学、ELISA、质谱术、反相蛋白质阵列(RPPA)、抗体阵列、纳米免疫测定法、Western印迹、和毛细管蛋白质分析测定法的方法来测定所述蛋白质水平。
[0019] 在一些实施方案中，FGF2水平对VEGF水平的比率为小于1。在一些实施方案中，FGF2水平对VEGF水平的比率为小于0.9。在一些实施方案中，FGF2水平对VEGF水平的比率为小于0.8。在一些实施方案中，FGF2水平对VEGF水平的比率为小于0.7。在一些实施方案中，FGF2水平对VEGF水平的比率为小于0.6。
[0020] 在一些实施方案中，所述癌症选自肾癌(诸如肾细胞癌)、肝癌(诸如肝细胞癌)、肺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、头和颈癌、成胶质细胞瘤、间皮瘤、和前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症为胃肠基质肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症选自肾癌(诸如肾细胞癌)、肝癌(诸如肝细胞癌)、和间皮瘤。在一些实施方案中，所述癌症为肾细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症为肝细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症为间皮瘤。
[0021] 在一些实施方案中，提供治疗肾细胞癌(RCC)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括对具有RCC的受试者施用成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子和VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，所述方法包括对具有RCC的受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和选自阿西替尼、帕唑帕尼、和索拉非尼的VEGF拮抗剂。
[0022] 在一些实施方案中，提供治疗癌症的方法，所述方法包括对具有癌症的受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子，其中所述受试者先前已经用至少一种选自帕唑帕尼、贝伐珠单抗、阿西替尼、阿柏西普、索拉非尼、和舒尼替尼的治疗剂治疗过。在一些实施方案中，所述受试者先前已经用帕唑帕尼治疗过。在一些实施方案中，所述受试者的癌症已经在帕唑帕尼治疗期间或之后变成帕唑帕尼抗性。在一些实施方案中，提供治疗帕唑帕尼抗性癌症的方法，所述方法包括对具有帕唑帕尼抗性癌症的受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。在一些实施方案中，所述方法包括施用帕唑帕尼和FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。
[0023] 在一些实施方案中，提供治疗癌症的方法，所述方法包括对具有癌症的受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和阿西替尼，其中所述受试者先前已经用至少一种选自帕唑帕尼、贝伐珠单抗、阿西替尼、阿柏西普、索拉非尼、和舒尼替尼的治疗剂治疗过。在一些此类实施方案中，至少一种治疗剂选自帕唑帕尼、阿西替尼、和索拉非尼。在一些此类实施方案中，至少一种治疗剂为帕唑帕尼。在一些实施方案中，所述癌症选自肾癌(诸如肾细胞癌)、肝癌(诸如肝细胞癌)、成胶质细胞瘤、和间皮瘤。
[0024] 在一些实施方案中，提供治疗VEGF抗性癌症的方法。在一些实施方案中，方法包括对具有VEGF抗性癌症的受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。在一些实施方案中，VEGF抗性癌症为具有高的FGF2表达和/或大于1的FGF2/VEGF比率的癌症。在一些实施方案中，所述VEGF抗性癌症选自肾癌(诸如肾细胞癌)、肝癌(诸如肝细胞癌)、成胶质细胞瘤、和间皮瘤。
[0025] 在一些实施方案中，提供降低实体癌中的血管密度的方法。在一些实施方案中，提供降低实体癌中的血管密度的方法，其中所述癌症具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平。在一些实施方案中，提供降低VEGF抗性实体癌中的血管密度的方法。在一些实施方案中，一种降低实体癌中的血管密度的方法包括对具有癌症的受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。在一些实施方案中，测量整个肿瘤样品中的血管密度。在一些实施方案中，所述癌症选自肾癌(诸如肾细胞癌)、肝癌(诸如肝细胞癌)、肺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、头和颈癌、成胶质细胞瘤、间皮瘤、和前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症选自肾癌(诸如肾细胞癌)、肝癌(诸如肝细胞癌)、成胶质细胞瘤、和间皮瘤。在一些实施方案中，所述癌症为肾细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症为肝细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症为间皮瘤。
[0026] 在一些实施方案中，提供治疗间皮瘤的方法，所述方法包括对具有间皮瘤的受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种选自帕利他赛(paclitaxel)、卡铂(carboplatin)、多西他赛(docetaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、和顺铂(cisplatin)的治疗剂。在一些实施方案中，所述方法包括施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子、帕利他赛和卡铂。在一些实施方案中，所述方法包括施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和多西他赛。在一些实施方案中，所述方法包括施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子、培美曲塞、和顺铂。在一些实施方案中，FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种治疗剂的施用降低间皮瘤中的血管密度。在一些实施方案中，所述间皮瘤具有高FGF2水平。在一些实施方案中，所述间皮瘤具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平。在一些实施方案中，FGF2水平对VEGF水平的比率为大于1。
[0027] 在本文所述任何方法中，所述方法可包括施用FGFR1 ECD。在一些实施方案中，所述FGFR1 ECD包含选自SEQ ID NO:1至4的氨基酸序列。
[0028] 在本文所述任何方法中，所述方法可包括施用FGFR1 ECD融合分子。在一些实施方案中，所述FGFR1 ECD融合分子包含FGFR1 ECD和融合伴侣，且其中所述融合伴侣为Fc。在一些实施方案中，所述FGFR1 ECD融合分子包含选自SEQ ID NO:5和6的序列。
[0029] 在一个实施方案中，本发明提供治疗有效量的FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子用于治疗受试者中的癌症的用途，其中所述癌症具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平，其中与VEGF水平相比更高的FGF2水平指示所述癌症对成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子的治疗响应性。
[0030] 在另一个实施方案中，本发明提供治疗有效量的成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子用于治疗受试者中的癌症的用途，其中在施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子之前，所述癌症的至少一部分细胞已经确定具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平，且其中癌症中与VEGF水平相比更高的FGF2水平指示所述癌症对FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子的治疗响应性。
[0031] 在另一个实施方案中，本发明提供成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子在制造用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途，其中所述癌症具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平，其中与VEGF水平相比更高的FGF2水平指示所述癌症对成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子的治疗响应性。
[0032] 在另一个实施方案中，本发明提供成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子在制造用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途，其中在施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子之前，所述癌症的至少一部分细胞已经确定具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平，且其中癌症中与VEGF水平相比更高的FGF2水平指示所述癌症对FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子的治疗响应性。
[0033] 在一个实施方案中，本发明提供治疗有效量的FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和治疗有效量的至少一种抗血管发生剂用于治疗受试者中的癌症的用途，其中所述癌症具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平，其中与VEGF水平相比更低的FGF2水平指示所述癌症对FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂的治疗响应性。
[0034] 在另一个实施方案中，本发明提供治疗有效量的成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂用于治疗受试者中的癌症的用途，其中在施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂之前，所述癌症的至少一部分细胞已经确定具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平，且其中癌症中与VEGF水平相比更低的FGF2水平指示所述癌症对FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂的治疗响应性。
[0035] 在另一个实施方案中，本发明提供成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子和抗血管发生剂在制造用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途，其中所述癌症具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平，其中与VEGF水平相比更低的FGF2水平指示所述癌症对成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子和抗血管发生剂的治疗响应性。
[0036] 在另一个实施方案中，本发明提供成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子和抗血管发生剂在制造用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途，其中在施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和抗血管发生剂之前，所述癌症的至少一部分细胞已经确定具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平，且其中癌症中与VEGF水平相比更低的FGF2水平指示所述癌症对FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和抗血管发生剂的治疗响应性。
[0037] 在本发明的一个实施方案中，提供FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合蛋白，其用于降低实体癌中的血管密度的方法。在这个实施方案的一个方面，所述实体癌具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平。
[0038] 在本发明的一个实施方案中，提供FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合蛋白在制造药物中的用途，所述药物用于降低实体癌中的血管密度的方法。在这个实施方案的一个方面，所述实体癌具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平。
[0039] 在本发明的又一个实施方案中，提供FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种选自帕利他赛、卡铂、多西他赛、培美曲塞和顺铂的治疗剂，其用于治疗间皮瘤。在这个实施方案的一个方面，所述治疗涉及使用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子、帕利他赛和卡铂。在这个实施方案的一个方面，所述治疗涉及使用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和多西他赛。在这个实施方案的一个方面，所述治疗涉及使用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子、培美曲塞、和顺铂。在任何这些方面，FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种治疗剂的施用降低所述间皮瘤中的血管密度。
[0040] 在本发明的又一个实施方案中，提供FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种选自帕利他赛、卡铂、多西他赛、培美曲塞和顺铂的治疗剂在制造用于治疗间皮瘤的药物中的用途。在这个实施方案的一个方面，所述药物包含FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子、帕利他赛和卡铂。在这个实施方案的一个方面，所述药物包含FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和多西他赛。在这个实施方案的一个方面，所述药物包含FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子、培美曲塞、和顺铂。在任何这些方面，所述药物的施用降低所述间皮瘤中的血管密度。
[0041] 在这些实施方案的任何方面，所述FGF2水平或VEGF水平可以是mRNA水平。在这个方面的一个特征中，可以通过定量RT-PCR来测定所述mRNA水平。
[0042] 而且，在这些实施方案的任何方面，所述FGF2水平或VEGF水平可以是蛋白质水平。在这个方面的一个特征中，可以通过免疫组织化学来测定所述蛋白质水平。
[0043] 在这些实施方案的任何方面，所述抗血管发生剂为VEGF拮抗剂。在这个方面的又一个特征中，所述VEGF拮抗剂选自帕唑帕尼、贝伐珠单抗、阿西替尼、阿柏西普、索拉非尼、或舒尼替尼。
[0044] 在这些实施方案的任何方面，所述癌症选自肾癌(诸如肾细胞癌)、肝癌(诸如肝细胞癌)、肺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、头和颈癌、成胶质细胞瘤、和前列腺癌。
[0045] 在这些实施方案的任何方面，癌症治疗中使用的组合物或癌症治疗中使用的药物包含FGFR1 ECD。在这个方面的一个特征中，所述FGFR1 ECD包含选自SEQ ID NO:1至4的氨基酸序列。
[0046] 在这些实施方案的任何方面，癌症治疗中使用的组合物或癌症治疗中使用的药物包含FGFR1 ECD融合分子。在这个方面的一个特征中，所述FGFR1 ECD融合分子包含FGFR1 ECD和融合伴侣，且其中所述融合伴侣为Fc。在这个方面的又一个特征中，所述FGFR1 ECD融合分子包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列。
[0047] 在这些一些实施方案中的任何方面，“至少一部分细胞”为癌症样品中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的细胞。
[0048] 在一些实施方案中，FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子的量在约0.5mg/kg体重至约30mg/kg体重的范围中，诸如在约8至约16mg/kg体重的范围中，使用1.42mL/mg*cm的消光系数计算。见表1。在一些实施方案中，FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子的治疗有效量为一剂约8mg/kg体重。在一些实施方案中，FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子的治疗有效量为一剂约16mg/kg体重。在一些实施方案中，FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子的治疗有效量为一剂约20mg/kg体重。在一些实施方案中，可以一周两次、每周、隔周、以介于每周和隔周之间的频率、每三周、每四周、或每月来施用剂量。
[0049] 在某些实施方案中，所述癌症为前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、脑癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、头和颈癌、喉癌、肝癌、肾癌(renal cancer,kidney cancer)、成胶质细胞瘤、或胰腺癌。在某些实施方案中，所述癌症为乳腺癌、食道癌、肾癌、头和颈癌、或肺癌。在某些实施方案中，所述癌症为肺癌。在一些实施方案中，所述肺癌为非小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述肺癌为小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述肺癌为鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症为头和颈癌。在一些实施方案中，所述头和颈癌为头和颈鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症选自肾癌(诸如肾细胞癌)、肝癌(诸如肝细胞癌)、和间皮瘤。在一些实施方案中，所述癌症为肾细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症为肝细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症为间皮瘤。
[0050] 本文所述任何实施方案或其任意组合适用于本文所述发明的任何和所有方法。
[0052] 图1A-C显示如实施例2中所述，植入有ACHN细胞且用FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)、FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)和帕唑帕尼、或清蛋白处理的小鼠在多个时间点的均值肿瘤体积。
[0053] 图2A-C显示如实施例3中所述，植入有786-0细胞且用FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)、帕唑帕尼、FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)和帕唑帕尼、或清蛋白处理的小鼠在多个时间点的均值肿瘤体积。
[0054] 图3A-C显示如实施例4中所述，植入有A498细胞且用FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)、帕唑帕尼、FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)和帕唑帕尼、或清蛋白处理的小鼠在多个时间点的均值肿瘤体积。
[0055] 图4A-B显示如实施例5中所述，植入有Caki-2细胞且用FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)、帕唑帕尼、FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)和帕唑帕尼、或清蛋白处理的小鼠在多个时间点的均值肿瘤体积。
[0056] 图5A-C显示如实施例6中所述，植入有SK-Hep-1细胞且用FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)、帕唑帕尼、FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)和帕唑帕尼、或清蛋白处理的小鼠在多个时间点的均值肿瘤体积。
[0057] 图6A-C显示如实施例7中所述，植入有(A)HepG2细胞、(B)Huh7细胞、和(C)Hep3B细胞且用FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)或清蛋白或媒介处理的小鼠在多个时间点的均值肿瘤体积。
[0058] 图7A-C显示如实施例8中所述，植入有SK-Hep-1细胞且用FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)、索拉非尼、FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)和索拉非尼、或清蛋白处理的小鼠(A)在多个时间点的均值肿瘤体积、和(B)最终肿瘤体积、和(C)最终肿瘤重量。
[0059] 图8A-B显示如实施例9中所述，在FGFR1-ECD.339-Fc响应者和非响应者异种移植物中的(A)FGF2 mRNA(针对GUSB标准化)和(B)FGF2蛋白质表达(针对总蛋白质标准化)。
[0060] 图9A-B显示如实施例9中所述，在FGFR1-ECD.339-Fc响应者和非响应者异种移植物中的(A)VEGFA mRNA(针对GUSB标准化)和(B)VEGFA蛋白质表达(针对总蛋白质标准化)。
[0061] 图10显示如实施例11中所述，植入有NCI-H226细胞且用FGFR1-ECD.339-Fc处理的小鼠在多个时间点的均值肿瘤体积。
[0062] 图11显示如实施例11中所述，植入有MSTO-211H细胞且用FGFR1-ECD.339-Fc处理的小鼠在多个时间点的均值肿瘤体积。
[0063] 图12A-C显示如实施例11中所述，植入有NCI-H226细胞且用FGFR1-ECD.339-Fc处理的小鼠中通过免疫组织化学测定的血管面积。
[0064] 图13A-B显示如实施例12中所述，植入有HLF细胞且用FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)、索拉非尼、FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)和索拉非尼、或清蛋白处理的小鼠(A)在多个时间点的均值肿瘤体积，和(B)最终肿瘤体积。
[0065] 图14A-B显示如实施例4中所述，(A)植入有A498细胞且用单独的帕唑帕尼或第89天开始用帕唑帕尼和FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)处理的小鼠相对于用帕唑帕尼处理的A498异种移植物模型小鼠在第89天时的肿瘤大小的百分比肿瘤大小；和(B)第110天时的百分比肿瘤大小。
[0066] 发明详述
[0067] 本文中使用的节标题只用于组织目的，而不要解释为限制描述的主题。
[0068] 定义
[0069] 除非另外定义，关于本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。而且，除非上下文另外要求，单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
[0070] 关于重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化(例如电穿孔、脂转染)、酶促反应、和纯化技术使用的某些技术在本领域中是已知的。许多此类技术和规程描述于例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))等等。另外，用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、和投递及患者治疗的某些技术在本领域中也是已知的。
[0071] 在本申请中，除非另外说明，“或”的使用意指“和/或”。在多项从属权利要求的上下文下，“或”的使用仅以择一方式回引超过一项前述独立或从属权利要求。还有，除非另外具体说明，诸如“元件”或“成分”的术语涵盖包含一个单元的元件和成分及包含超过一个子单元的元件和成分。
[0072] 如本文中使用的，所有数值都是近似值，且可以由于测量误差和有效数字四舍五入而变化。在某些测量的数量前使用“约”包括样品杂质、测量误差、人为误差、和统计变化以及有效数字四舍五入所致的变化。
[0073] 除非另外指明，如依照本公开文本使用的，下述术语应理解为具有下述含义：
[0074] 术语“核酸分子”和“多核苷酸”可互换使用，且指核苷酸的聚合物。此类核苷酸聚合物可含有天然和/或非天然核苷酸，且包括但不限于DNA、RNA、和PNA。“核酸序列”指构成核酸分子或多核苷酸的线性核苷酸序列。
[0075] 术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物且不限于最小长度。此类氨基酸残基聚合物可含有天然或非天然氨基酸残基，且包括但不限于肽、寡肽、氨基酸残基二聚体、三聚体、和多聚体。此定义涵盖全长蛋白质和其片段二者。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化、等等。此外，出于本发明的目的，“多肽”指包括对天然序列的修饰的蛋白质，所述修饰诸如删除、添加、和替代(性质上一般是保守的)，只要蛋白质维持期望活性。这些修饰可以是有意的，如经由定点突变，或可以是意外的，诸如经由生成蛋白质的宿主的突变或PCR扩增所致的错误。当多肽“由”特定的氨基酸序列“组成”时，它仍可以含有翻译后修饰，诸如糖基化和唾液酸化。
[0076] 术语“FGFR1胞外域”(“FGFR1 ECD”)包括全长FGFR1 ECD、FGFR1 ECD片段、和FGFR1 ECD变体。如本文中使用的，术语“FGFR1 ECD”指缺少胞内域和跨膜域且具有或不具有信号肽的FGFR1多肽。在一些实施方案中，FGFR1 ECD为具有选自SEQ ID NO:1和2的氨基酸序列的人全长FGFR1 ECD。如本文中使用的，术语“全长FGFR1 ECD”指延伸至胞外域最后一个氨基酸且可包括或不包括N端信号肽的FGFR1 ECD。如本文中定义的，全长FGFR1 ECD的最后一个氨基酸位于第353位。因此，人全长FGFR1 ECD可由与SEQ ID NO.:2(成熟形式)或SEQ ID NO.:1(具有信号肽)对应的氨基酸序列组成。如本文中使用的，术语“FGFR1 ECD片段”指自全长ECD的N端和/或C端删除一个或多个残基且保留结合FGF-2的能力的FGFR1 ECD。FGFR1 ECD片段可包括或不包括N端信号肽。在一些实施方案中，FGFR1 ECD片段为具有与SEQ ID NO.:4(成熟形式)或SEQ ID NO.:3(具有信号肽)对应的氨基酸序列的人FGFR1 ECD片段。
[0077] 如本文中使用的，术语“FGFR1 ECD变体”指含有氨基酸添加、删除、和替代且仍能够结合FGF-2的FGFR1 ECD。此类变体可与亲本FGFR1 ECD至少90％、92％、95％、97％、98％、或99％同一。两种多肽的同一性百分比可通过相似性得分来测量，所述相似性得分通过以用于测定相似性的默认设置使用Bestfit程序比较两种多肽的氨基酸序列测定。
Bestfit使用Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)的局部同源性算法来找出两种序列之间的最佳相似性区段。在一些实施方案中，FGFR1 ECD变体与序列SEQ ID NO:4至少95％同一。
Bestfit使用Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)的局部同源性算法来找出两种序列之间的最佳相似性区段。在一些实施方案中，FGFR1 ECD变体与序列SEQ ID NO:4至少95％同一。
[0078] 所具有的氨基酸序列与FGFR1 ECD多肽的参照氨基酸序列至少例如95％同一的多肽为如下多肽，其中该多肽的氨基酸序列与参照序列同一，只是该多肽序列在参照多肽的每100个氨基酸中可包括至多五处氨基酸改变。换言之，为了获得所具有的氨基酸序列与参照氨基酸序列至少95％同一的多肽，参照序列中至多5％的氨基酸残基可删除或用另一种氨基酸替代，或可在参照序列中插入多个氨基酸(参照序列中的氨基酸残基总数的至多5％)。参照序列的这些改变可发生在参照氨基酸序列的N端或C端位置或那些末端位置之间的任何地方，个别地散布在参照序列中的各残基之间，或以一个或多个连续组散布在参照序列内。
[0079] 实际上，通常可以使用已知的计算机程序(诸如Bestfit程序)来测定任何特定多肽是否与例如由序列表中列出的核酸序列编码的氨基酸序列或多肽序列至少70％、80％、90％、或95％同一。当使用Bestfit或其它序列比对程序来测定特定序列是否与依照本发明的参照序列例如95％同一时，参数当然设定成在参照氨基酸序列的全长上计算同一性百分比且允许参照序列中氨基酸残基总数的至多5％存在同源性缺口。
[0080] 如本文中使用的，术语“hFGFR1-ECD.353”和“hFGFR1.353”可互换使用，指与SEQ ID NO:1(具有信号肽)或SEQ ID NO:2(无信号肽；成熟形式)对应的全长人FGFR1 ECD。
[0081] 如本文中使用的，术语“hFGFR1-ECD.339”和“hFGFR1.339”可互换使用，指与SEQ ID NO:3(具有信号肽)或SEQ ID NO:4(无信号肽；成熟形式)对应的人FGFR1 ECD。
[0082] 其它hFGFR1 ECD描述于例如美国专利No.7,678,890，通过援引将其完整收入本文用于任何目的。
[0083] 术语“FGFR1 ECD融合分子”指包含FGFR1 ECD和一个或多个“融合伴侣”的分子。在一些实施方案中，FGFR1 ECD和融合伴侣共价连接(“融合”)。如果融合伴侣也是多肽(“融合伴侣多肽”)，那么FGFR1 ECD和融合伴侣多肽可以是连续氨基酸序列的一部分，且融合伴侣多肽可连接至FGFR1 ECD的N端或C端。在此类状况中，FGFR1 ECD和融合伴侣多肽可自编码FGFR1 ECD和融合伴侣多肽二者的编码序列翻译成一条多肽(“FGFR1 ECD融合蛋白”)。在一些实施方案中，FGFR1 ECD和融合伴侣经由其它手段(诸如例如除肽键以外的化学连接)共价连接。可以使用使多肽与其它分子(例如融合伴侣)共价连接的多种已知方法。在其它实施方案中，FGFR1 ECD和融合伴侣可经由由至少一个氨基酸或化学模块构成的“接头”融合。
[0084] 在一些实施方案中，FGFR1 ECD多肽和融合伴侣是非共价连接的。在一些此类实施方案中，它们可以例如使用结合对来连接。例示性结合对包括但不限于生物素和亲合素或链霉亲合素、抗体和其抗原、等。
[0085] 例示性融合伴侣包括但不限于免疫球蛋白Fc域、清蛋白、和聚乙二醇。一些例示性Fc域的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:8至10。在一些实施方案中，与Fc融合的FGFR1 ECD称作“hFGFR1 ECD-Fc”。在一些实施方案中，Fc域选自IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc、和IgG4 Fc。
[0086] 如本文中使用的，术语“hFGFR1-ECD.339-Fc”、“hFGFR1.339-Fc”、和“FP-1039”可互换使用，指选自SEQ ID NO:6(无信号肽，成熟形式)和SEQ ID NO:5(具有信号肽)的氨基酸序列。可用hFGFR1-ECD.339-Fc治疗的非限制性例示性癌症包括但不限于肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、头和颈癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肉瘤、小细胞肺癌、卵巢癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、成神经细胞瘤(脑癌)、横纹肌肉瘤、维尔姆斯氏肿瘤(Wilms'tumor)、急性成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、膀胱癌、睾丸癌、淋巴瘤、生殖细胞肿瘤、结肠和直肠癌症、胃肠癌、胃肠基质肿瘤、甲状腺癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、间皮瘤、恶性胸膜间皮瘤、血癌/淋巴癌、恶性腹膜间皮瘤、食道癌、肾细胞癌、多形性成胶质细胞瘤、和肝癌。
[0087] 术语“信号肽”指推动自哺乳动物细胞分泌多肽的位于多肽N端的氨基酸残基序列。信号肽可在多肽自哺乳动物细胞输出时切割，形成成熟蛋白质。信号肽可以是天然的或合成的，且它们可以与它们附着的蛋白质异源或同源。例示性信号肽包括但不限于FGFR1信号肽，诸如例如氨基酸序列SEQ ID NO:7。例示性信号肽还包括来自异源蛋白质的信号肽。“信号序列”指编码信号肽的多核苷酸序列。在一些实施方案中，FGFR1 ECD缺少信号肽。在一些实施方案中，FGFR1 ECD包括至少一个信号肽，该信号肽可以是天然FGFR1信号肽或异源信号肽。
[0088] 术语“载体”用来描述如下多核苷酸，该多核苷酸可经工程化改造而含有克隆的多核苷酸或可在宿主细胞中繁殖的多核苷酸。载体可以包括一种或多种下述元件：复制起点、一种或多种调节感兴趣多肽表达的调节序列(诸如例如启动子和/或增强子)、和/或一种或多种选择标记基因(诸如例如抗生素抗性基因和可用于比色测定法的基因，例如β-半乳糖苷酶)。术语“表达载体”指用于在宿主细胞中表达感兴趣多肽的载体。
[0089] “宿主细胞”指可以是或已经是载体或分离的多核苷酸的接受者的细胞。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。例示性真核细胞包括哺乳动物细胞，诸如灵长类动物或非灵长类动物细胞；真菌细胞；植物细胞；和昆虫细胞。例示性哺乳动物细胞包括但不限于293和CHO细胞以及它们的衍生物，诸如分别为293-6E和DG44细胞。
[0090] 如本文中使用的，术语“分离的”指如下分子，该分子已经与在自然界中通常与其一起发现的至少一些成分分开。例如，当多肽与生成它的细胞的至少一些成分分开时，该多肽称作是“分离的”。在多肽在表达后由细胞分泌时，以物理方式将含有该多肽的上清液与生成它的细胞分开被认为是“分离”该多肽。类似地，当多核苷酸并非在自然界中通常在其中发现它的更大多核苷酸(在DNA多核苷酸的情况中，诸如例如基因组DNA或粒线体DNA)的一部分，或例如在RNA多核苷酸的情况中与生成它的细胞的至少一些成分分开时，该多核苷酸称作是“分离的”。因此，在宿主细胞内部的载体中含有的DNA多核苷酸可称作是“分离的”，只要在自然界中在该载体中未发现该多核苷酸。
[0091] 术语“抗赘生性组合物”指在治疗癌症中有用的包含至少一种活性治疗剂(例如“抗癌剂”)的组合物。治疗剂(抗癌剂)的实例包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、在放射疗法中使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它用于治疗癌症的药剂，诸如抗VEGF抗体(例如贝伐珠单抗(bevacizumab)， )、抗HER-2抗体(例如曲妥珠单抗(trastuzumab)， )、抗CD20抗体(例如利妥昔单
抗(rituximab)， )、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑
制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如厄洛替尼(erlotinib)， )、血小板衍生生
长因子抑制剂(例如 甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate))、COX-2抑制
剂(例如塞来考昔(celecoxib))、干扰素、细胞因子、结合下述靶物ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体中一种或多种的拮抗剂(例如中和性抗体)、TRAIL/Apo2、及其它生物活性剂和有机化学剂、等。本发明中还包括其组合。
抗(rituximab)， )、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑
制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如厄洛替尼(erlotinib)， )、血小板衍生生
长因子抑制剂(例如 甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate))、COX-2抑制
剂(例如塞来考昔(celecoxib))、干扰素、细胞因子、结合下述靶物ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体中一种或多种的拮抗剂(例如中和性抗体)、TRAIL/Apo2、及其它生物活性剂和有机化学剂、等。本发明中还包括其组合。
[0092] “化疗剂”指在治疗癌症中有用的化学化合物。化疗剂的实例包 括 烷 化 剂 (alkylating agent)，诸 如 塞 替 派 (thiotepa) 和 环 磷 酰 胺(cyclophosphamide) 磺酸烷基酯(alkyl sulfonate)，诸如白消安
(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)、和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺(ethylenimine)和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和 三 羟 甲 蜜 胺 (trimethylomelamine)；番 荔 枝 内 酯(acetogenin)(尤 其 是 布拉 他 辛 (bullatacin)和 布 拉 他 辛 酮 (bullatacinone))；δ-9- 四 氢 大 麻 酚(delta-9-tetrahydrocannabinol)( 屈 大 麻 酚 (dronabinol)， )；
β-拉 帕醌 (beta-lapachone)；拉 帕醇 (lapachol)；秋 水仙 素(colchicine)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康
(topotecan) CPT-11(伊立替康(irinotecan)，
)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；
卡利司他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；
鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素(cryptophycins)(尤其是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱
(pancratistatin)；沙 考 地 汀(sarcodictyin)；海 绵 抑 素(spongistatin)；氮 芥(nitrogen mustard)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；
亚硝脲(nitrosourea)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Nicolaou et al.,Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；CDP323，一 种 口 服α-4 整联蛋白抑制剂；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；埃斯波霉素(esperamicin)；
以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二 氮-5-氧-L-正 亮 氨酸、多柔 比 星(doxorubicin)(包 括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸
多柔比星脂质体注射剂 脂质体多柔比星TLC D-99 PEG
化脂质体多柔比星 和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索
比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(诸如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine) 培美曲塞(pemetrexed) 替
加氟(tegafur) 卡培他滨(capecitabine) 埃坡霉素
(epothilone)、和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、
6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍斯塔布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；
地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗利散(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱(maytansinoid)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；喷那美特(phenamet)；
吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)； 多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；
细交链孢菌 酮酸(tenuazonic acid)；三 亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2’-三 氯三乙胺；单端孢菌素(trichothecene)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine) 达 卡巴 嗪(dacarbazine)；甘 露醇 氮
芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoid)，例如帕利他赛(paclitaxel) 清蛋白改造
TM
的纳米颗粒剂型帕利他赛(ABRAXANE )、和多西他赛(docetaxel) 苯
丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；
甲氨蝶呤(methotrexate)；铂剂，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)(例如 )、和卡 铂(carboplatin)；长 春花 药(vinca)，其阻 止 微
管蛋白聚合形成微管，包括长春碱(vinblastine) 长春新碱
(vincristine) 长春地辛(vindesine)
和 长 春 瑞 滨(vinorelbine) 依 托 泊 苷 (etoposide)(VP-16)；
异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovorin)；能灭 瘤(novantrone)；依 达 曲沙 (edatrexate)；道 诺 霉素 (daunomycin)；氨 基 蝶呤(aminopterin)；伊本 膦酸盐 (ibandronate)；拓 扑异 构酶 抑制剂 RFS 2000；
二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoid)，诸如视黄酸(retinoic acid)，包 括 贝 沙 罗 汀(bexarotene) 二 膦 酸 盐 (bisphosphonate)，
诸如氯膦 酸盐(clodronate)(例如 或 )、依替膦酸盐
(etidronate) NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/
zoledronate) 阿伦膦酸盐(alendronate) 帕米膦酸盐
(pamidronate) 替鲁膦酸盐(tiludronate) 或利塞膦酸盐
(risedronate) 曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶
类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常细胞增殖的信号传导途经中的基因(诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras、和表皮生长因子受体(EGF-R))表达的反义寡核苷酸；疫苗，诸如疫苗和基因疗法疫苗，例如 疫苗、
疫苗、和 疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如 )；rmRH(例
如 )；BAY439006( 索 拉 非 尼 (sorafenib)， Bayer)；
SU-11248(舒尼替尼(sunitinib)， Pfizer)；哌立福辛(perifosine)，
COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib))，蛋白体抑
制剂(例如PS341)；波普单抗(bortezomib) CCI-779；替吡法尼
(tipifarnib)(R11577)；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如奥利默森钠(oblimersen sodium) 匹克生琼(pixantrone)；EGFR抑制剂(见下文定义)；酪氨酸
激酶抑制剂(见下文定义)；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，诸如雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus)， )；法尼基转移酶抑制剂，诸如洛那法尼(lonafarnib)
TM
(SCH 6636，SARASAR )；及任何上述各项的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多种上述各项的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、和泼尼松龙组合疗法的缩写)；和FOLFOX(使用奥沙利铂 与5-FU和亚叶酸的组合的治疗方案的缩
写)。
(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)、和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺(ethylenimine)和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和 三 羟 甲 蜜 胺 (trimethylomelamine)；番 荔 枝 内 酯(acetogenin)(尤 其 是 布拉 他 辛 (bullatacin)和 布 拉 他 辛 酮 (bullatacinone))；δ-9- 四 氢 大 麻 酚(delta-9-tetrahydrocannabinol)( 屈 大 麻 酚 (dronabinol)， )；
β-拉 帕醌 (beta-lapachone)；拉 帕醇 (lapachol)；秋 水仙 素(colchicine)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康
(topotecan) CPT-11(伊立替康(irinotecan)，
)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；
卡利司他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；
鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素(cryptophycins)(尤其是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱
(pancratistatin)；沙 考 地 汀(sarcodictyin)；海 绵 抑 素(spongistatin)；氮 芥(nitrogen mustard)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；
亚硝脲(nitrosourea)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Nicolaou et al.,Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；CDP323，一 种 口 服α-4 整联蛋白抑制剂；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；埃斯波霉素(esperamicin)；
以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二 氮-5-氧-L-正 亮 氨酸、多柔 比 星(doxorubicin)(包 括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸
多柔比星脂质体注射剂 脂质体多柔比星TLC D-99 PEG
化脂质体多柔比星 和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索
比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)(诸如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine) 培美曲塞(pemetrexed) 替
加氟(tegafur) 卡培他滨(capecitabine) 埃坡霉素
(epothilone)、和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、
6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；倍斯塔布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；
地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗利散(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱(maytansinoid)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；喷那美特(phenamet)；
吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)； 多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；
细交链孢菌 酮酸(tenuazonic acid)；三 亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2’-三 氯三乙胺；单端孢菌素(trichothecene)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine) 达 卡巴 嗪(dacarbazine)；甘 露醇 氮
芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoid)，例如帕利他赛(paclitaxel) 清蛋白改造
TM
的纳米颗粒剂型帕利他赛(ABRAXANE )、和多西他赛(docetaxel) 苯
丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；
甲氨蝶呤(methotrexate)；铂剂，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)(例如 )、和卡 铂(carboplatin)；长 春花 药(vinca)，其阻 止 微
管蛋白聚合形成微管，包括长春碱(vinblastine) 长春新碱
(vincristine) 长春地辛(vindesine)
和 长 春 瑞 滨(vinorelbine) 依 托 泊 苷 (etoposide)(VP-16)；
异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovorin)；能灭 瘤(novantrone)；依 达 曲沙 (edatrexate)；道 诺 霉素 (daunomycin)；氨 基 蝶呤(aminopterin)；伊本 膦酸盐 (ibandronate)；拓 扑异 构酶 抑制剂 RFS 2000；
二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoid)，诸如视黄酸(retinoic acid)，包 括 贝 沙 罗 汀(bexarotene) 二 膦 酸 盐 (bisphosphonate)，
诸如氯膦 酸盐(clodronate)(例如 或 )、依替膦酸盐
(etidronate) NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/
zoledronate) 阿伦膦酸盐(alendronate) 帕米膦酸盐
(pamidronate) 替鲁膦酸盐(tiludronate) 或利塞膦酸盐
(risedronate) 曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶
类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉异常细胞增殖的信号传导途经中的基因(诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras、和表皮生长因子受体(EGF-R))表达的反义寡核苷酸；疫苗，诸如疫苗和基因疗法疫苗，例如 疫苗、
疫苗、和 疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如 )；rmRH(例
如 )；BAY439006( 索 拉 非 尼 (sorafenib)， Bayer)；
SU-11248(舒尼替尼(sunitinib)， Pfizer)；哌立福辛(perifosine)，
COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib))，蛋白体抑
制剂(例如PS341)；波普单抗(bortezomib) CCI-779；替吡法尼
(tipifarnib)(R11577)；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如奥利默森钠(oblimersen sodium) 匹克生琼(pixantrone)；EGFR抑制剂(见下文定义)；酪氨酸
激酶抑制剂(见下文定义)；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，诸如雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus)， )；法尼基转移酶抑制剂，诸如洛那法尼(lonafarnib)
TM
(SCH 6636，SARASAR )；及任何上述各项的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多种上述各项的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、和泼尼松龙组合疗法的缩写)；和FOLFOX(使用奥沙利铂 与5-FU和亚叶酸的组合的治疗方案的缩
写)。
[0093] 如本文中定义的，化疗剂包括起调节、降低、阻断、或抑制能促进癌生长的激素效果作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”。它们自身可以是激素，包括但不限于：具有混合的激动剂/拮抗剂概况的抗雌激素，包括他莫昔芬(tamoxifen)4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene) 艾多昔芬(idoxifene)、屈
洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene) 曲沃昔芬(trioxifene)、
那洛昔芬(keoxifene)，和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，诸如SERM3；没有激动剂特性的纯的抗雌激素，诸如氟维司群(fulvestrant) 和EM800(此
类药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、提高ER周转、和/或阻抑ER水平)；芳香酶抑制剂，包括类固醇芳香酶抑制剂，诸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane) 和非类固醇芳香酶抑制剂，诸如阿那曲唑
(anastrazole) 来 曲唑(letrozole) 和氨鲁米特
(aminoglutethimide)，和其它芳香酶抑制剂，包括伏氯唑(vorozole) 醋酸
甲地孕酮(megestrol acetate) 法倔唑(fadrozole)、和4(5)-咪唑；促黄
体生成激素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(leuprolide)( 和
)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)、和曲普瑞林(tripterelin)；性类固醇(sex steroid)，包括妊娠素(progestin)(诸如醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate))、雌激素(诸如己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普雷马林(premarin))、和雄激素/类视黄酸(诸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、全反式视黄酸(transretinoic acid)和芬维A胺(fenretinide))；
奥那司酮(onapristone)；抗孕酮；雌激素受体下调剂(ERD)；抗雄激素，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及任何上述各项的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述各项的组合。
洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene) 曲沃昔芬(trioxifene)、
那洛昔芬(keoxifene)，和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，诸如SERM3；没有激动剂特性的纯的抗雌激素，诸如氟维司群(fulvestrant) 和EM800(此
类药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、提高ER周转、和/或阻抑ER水平)；芳香酶抑制剂，包括类固醇芳香酶抑制剂，诸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane) 和非类固醇芳香酶抑制剂，诸如阿那曲唑
(anastrazole) 来 曲唑(letrozole) 和氨鲁米特
(aminoglutethimide)，和其它芳香酶抑制剂，包括伏氯唑(vorozole) 醋酸
甲地孕酮(megestrol acetate) 法倔唑(fadrozole)、和4(5)-咪唑；促黄
体生成激素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(leuprolide)( 和
)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)、和曲普瑞林(tripterelin)；性类固醇(sex steroid)，包括妊娠素(progestin)(诸如醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate))、雌激素(诸如己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普雷马林(premarin))、和雄激素/类视黄酸(诸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、全反式视黄酸(transretinoic acid)和芬维A胺(fenretinide))；
奥那司酮(onapristone)；抗孕酮；雌激素受体下调剂(ERD)；抗雄激素，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及任何上述各项的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述各项的组合。
[0094] “血管发生因子或血管发生剂”指刺激血管发育，例如促进血管发生、内皮细胞生长、血管稳定性、和/或血管生成、等的生长因子。例如，血管发生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成员(VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D)、PlGF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体(血管生成素)、肝配蛋白、德耳塔样配体4(DLL4)、del-1、成纤维细胞生长因子(酸性(aFGF)和碱性(bFGF))、卵泡抑素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)/散播因子(SF)、白介素-8(IL-8)、瘦蛋白、中期因子、神经毡蛋白、胎盘生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生生长因子(尤其是PDGF-BB或PDGFR-β)、多营养因子(PTN)、颗粒体蛋白前体、增殖蛋白、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、等。它还会包括加速伤口愈合的因子，诸如生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF和其家族成员，及TGF-α和TGF-β。参见例如Klagsbrun and D'Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53:217-39；Streit and Detmar(2003)Oncogene 22:3172-3179；Ferrara and Alitalo(1999)Nature Medicine 5(12):1359-1364；Tonini et al.(2003)Oncogene 22:6549-6556(例如列举已知血管发生因子的表1)；和Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8:200-206。
[0095] “抗血管发生剂”或“血管发生抑制剂”指直接或间接抑制血管发生、血管生成、或不合需要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸(包括例如抑制性RNA(RNAi或siRNA))、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体、或其缀合物或融合蛋白。应理解，抗血管发生剂包括结合且阻断血管发生因子或其受体的血管发生活性的那些药剂。例如，抗血管发生剂是如上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如结合VEGF的融合蛋TM白，诸如ZALTRAP (阿柏西普(Aflibercept))；VEGF的抗体，诸如 (贝伐
珠单抗)或VEGF受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体；抗PDGFR抑制剂，诸如
(甲磺酸伊马替尼)；阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如PTK787/
ZK2284、SU6668、 (苹果酸舒尼替尼)、AMG706，或例如国际专利申请
WO 2004/113304中描述的那些)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如血管他汀、内皮他汀、等。参见例如Klagsbrun and D'Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53:217-39；
Streit and Detmar(2003)Oncogene 22:3172-3179(例如列举恶性黑素瘤的抗血管发生疗法的表3)；Ferrara and Alitalo(1999)Nature Medicine 5(12):1359-1364；Tonini et al.(2003)Oncogene 22:6549-6556(例如列举已知抗血管发生因子的表2)；和Sato(2003)Int.J.Clin.dOncol.8:200-206(例如列举临床试验中使用的抗血管发生剂的表1)。
珠单抗)或VEGF受体(例如KDR受体或Flt-1受体)的抗体；抗PDGFR抑制剂，诸如
(甲磺酸伊马替尼)；阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如PTK787/
ZK2284、SU6668、 (苹果酸舒尼替尼)、AMG706，或例如国际专利申请
WO 2004/113304中描述的那些)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如血管他汀、内皮他汀、等。参见例如Klagsbrun and D'Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53:217-39；
Streit and Detmar(2003)Oncogene 22:3172-3179(例如列举恶性黑素瘤的抗血管发生疗法的表3)；Ferrara and Alitalo(1999)Nature Medicine 5(12):1359-1364；Tonini et al.(2003)Oncogene 22:6549-6556(例如列举已知抗血管发生因子的表2)；和Sato(2003)Int.J.Clin.dOncol.8:200-206(例如列举临床试验中使用的抗血管发生剂的表1)。
[0096] 如本文中使用的，术语“VEGF”或“VEGFA”指如由Leung et al.(1989)Science246:1306和Houck et al.(1991)Mol.Endocrin,5:1806描述的165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子和相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，以及天然存在的其等位基因和加工形式。术语“VEGF”还指来自非人物种(诸如小鼠、大鼠或灵长类动物)的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF由以下术语表示，诸如hVEGF表示人VEGF、mVEGF表示鼠VEGF、等等。术语“VEGF”还用来指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸8至109或1至109的截短形式多肽。对任何此类形式的VEGF的提及在本申请案中例如可用“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”、“VEGFA109”或“VEGF165”来标识。“截短型”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示来编号。例如，截短型天然VEGF中的氨基酸位置17(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的位置17(甲硫氨酸)。截短型天然VEGF对KDR和Flt-1受体的结合亲和力与天然VEGF相当。
[0097] “VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性(包括但不限于它与一种或多种VEGF受体的结合)的分子。VEGF拮抗剂包括但不限于抗VEGF抗体和其抗原结合片段、特异性结合VEGF由此隔离它与一种或多种受体结合的受体分子和衍生物、抗VEGF受体抗体、VEGF受体拮抗剂(诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂，例如帕唑帕尼)及结合VEGF的免疫粘附素(诸如VEGF诱捕剂，例如阿柏西普)。如本文中使用的，术语“VEGF拮抗剂”具体包括结合VEGF且能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性的分子，包括抗体、抗体片段、其它结合多肽、肽、和非肽小分子。因此，术语“VEGF活性”具体包括VEGF的由VEGF介导的生物学活性。
[0098] 如本文中使用的，术语“VEGF诱捕剂”意指结合VEGF且能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性的蛋白质，诸如融合分子。VEGF诱捕剂的一个实例是阿柏西普。
[0099] 术语“抗VEGF抗体”或“结合VEGF的抗体”指能够以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体，该抗体可用作靶向VEGF的诊断和/或治疗剂。抗VEGF中和性抗体阻抑多种人肿瘤细胞系在裸小鼠中的生长(Kim et al.,Nature 362:841-844(1993)；Warren et al.,J.Clin.Invest.95:1789-1797(1995)； et al.,Cancer
Res.56:4032-4039(1996)；Melnyk et al.,Cancer Res.56:921-924(1996))，
而且还抑制缺血性视网膜病症模型中的眼内血管发生。Adamis et al.,Arch.
Ophthalmol.114:66-71(1996)。例如，抗VEGF抗体可作为治疗剂用于靶向且干扰涉及VEGF活性的疾病或状况。参见例如美国专利6,582,959、6,703,020；WO98/45332；WO 96/30046；
WO94/10202、WO2005/044853；EP 0666868B1；美国专利申请20030206899、20030190317、
20030203409、20050112126、20050186208、和 20050112126；Popkov et al.,Journal of Immunological Methods 288:149-164(2004)；和WO2005012359。选定抗体通常对VEGF会具有足够强的结合亲和力。例如，抗体与hVEGF结合的Kd值可以在100nM至1pM之间。抗体亲和力可例如通过基于表面等离振子共振的测定法(诸如如PCT申请公开文本WO2005/012359中描述的BIAcore测定法)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、和竞争测定法(例如RIA)来测定。可对抗体进行其它生物学活性测定法，例如用以评估它作为治疗剂的有效性。此类测定法在本领域中为已知的且取决于抗体的靶抗原和预期用途。实例包括HUVEC抑制测定法；肿瘤细胞生长抑制测定法(如例如WO 89/06692中描述的)；抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利5,500,362)及激动活性或造血测定法(参见WO 95/27062)。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同源物，诸如VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E，也不会结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。
Res.56:4032-4039(1996)；Melnyk et al.,Cancer Res.56:921-924(1996))，
而且还抑制缺血性视网膜病症模型中的眼内血管发生。Adamis et al.,Arch.
Ophthalmol.114:66-71(1996)。例如，抗VEGF抗体可作为治疗剂用于靶向且干扰涉及VEGF活性的疾病或状况。参见例如美国专利6,582,959、6,703,020；WO98/45332；WO 96/30046；
WO94/10202、WO2005/044853；EP 0666868B1；美国专利申请20030206899、20030190317、
20030203409、20050112126、20050186208、和 20050112126；Popkov et al.,Journal of Immunological Methods 288:149-164(2004)；和WO2005012359。选定抗体通常对VEGF会具有足够强的结合亲和力。例如，抗体与hVEGF结合的Kd值可以在100nM至1pM之间。抗体亲和力可例如通过基于表面等离振子共振的测定法(诸如如PCT申请公开文本WO2005/012359中描述的BIAcore测定法)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、和竞争测定法(例如RIA)来测定。可对抗体进行其它生物学活性测定法，例如用以评估它作为治疗剂的有效性。此类测定法在本领域中为已知的且取决于抗体的靶抗原和预期用途。实例包括HUVEC抑制测定法；肿瘤细胞生长抑制测定法(如例如WO 89/06692中描述的)；抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利5,500,362)及激动活性或造血测定法(参见WO 95/27062)。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同源物，诸如VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E，也不会结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。
[0100] 在一个实施方案中，抗VEGF抗体包括与由杂交瘤ATCC HB 10709产生的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体；重组人源化抗VEGF单克隆抗体(参见Presta et al.(1997)Cancer Res.57:4593-4599)，包括但不限于称为“贝伐珠单抗”、也称为“rhuMAb VEGF”或 的抗体。 目前在市场上有售。可用贝伐珠单抗治疗的非限制性例示性癌症包括非小细胞肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、多形性成胶质细胞瘤、儿科骨肉瘤、胃癌和胰腺癌。贝伐珠单抗包含突变型人IgG1框架区和来自阻断人VEGF与其受体结合的鼠抗体A.4.6.1的抗原结合互补决定区。贝伐珠单抗和其它人源化抗VEGF抗体进一步描述于美国专利No.6,884,879和
7,169,901。别的抗VEGF抗体描述于PCT申请公开文本WO2005/012359和WO2009/073160；
美国专利No.7,060,269、6,582,959、6,703,020；6,054,297；WO98/45332；WO 96/30046；
WO94/10202；EP 0666868B1；美 国 专 利 申 请 公 开 文 本 2006009360、20050186208、
20030206899、20030190317、20030203409、和20050112126；及Popkov et al.,Journal of Immunological Methods 288:149-164(2004)。
7,169,901。别的抗VEGF抗体描述于PCT申请公开文本WO2005/012359和WO2009/073160；
美国专利No.7,060,269、6,582,959、6,703,020；6,054,297；WO98/45332；WO 96/30046；
WO94/10202；EP 0666868B1；美 国 专 利 申 请 公 开 文 本 2006009360、20050186208、
20030206899、20030190317、20030203409、和20050112126；及Popkov et al.,Journal of Immunological Methods 288:149-164(2004)。
[0101] 如本文中使用的，“VEGF抗性肿瘤”和“VEGF抗性癌症”指具有比参照样品、细胞、或组织更高的FGF2水平的肿瘤或癌症。在一些实施方案中，VEGF抗性肿瘤具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平。在一些实施方案中，VEGF抗性肿瘤样品中的FGF2水平对VEGF水平的比率为大于1。在一些实施方案中，具有VEGF抗性肿瘤的受试者先前已经用至少一种选自帕唑帕尼、贝伐珠单抗、阿西替尼、阿柏西普、索拉非尼、和舒尼替尼的治疗剂治疗过。
[0102] 如本文中使用的，“帕唑帕尼抗性肿瘤”和“帕唑帕尼抗性癌症”指最初响应帕唑帕尼但不再响应或以较低的程度响应的肿瘤或癌症。在一些实施方案中，帕唑帕尼抗性肿瘤或癌症在帕唑帕尼存在下不再消退，或甚至进展。
[0103] 术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物。在一些实施方案中，受试者或患者为人。在其它实施方案中，还提供治疗其它哺乳动物的方法，所述其它哺乳动物包括但不限于啮齿类动物、猿、猫、犬、马、牛、猪、绵羊、山羊、哺乳类实验室动物、哺乳类家畜、哺乳类竞技动物、和哺乳类宠物。
[0104] 如本文中使用的，术语“样品”或“患者样品”指自感兴趣受试者获得或衍生的含有要例如基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体的组合物。例如，短语“疾病样品”和其变化形式指自感兴趣受试者获得的预期或已知含有要表征的细胞和/或分子实体的任何样品。“组织或细胞样品”意指自受试者或患者的组织获得的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活组织检查或吸出物的实体组织；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊髓液、羊水、腹膜液、或间质液；来自受试者妊娠或发育中任何时间的细胞。组织样品还可以是原代的或培养的细胞或细胞系。任选地，组织或细胞样品是自疾病组织/器官获得的。组织样品可含有在自然界中不与组织天然混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝血剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素、等等。
[0105] 如本文中使用的，“参照样品”、“参照细胞”、或“参照组织”指自已知或相信未罹患正使用本发明方法或组合物鉴定的疾病或状况的来源获得的样品、细胞或组织。在一些实施方案中，参照样品、参照细胞或参照组织是自正使用本发明组合物或方法鉴定的疾病或状况的同一受试者或患者的身体的健康部分获得的。在一些实施方案中，参照样品、参照细胞或参照组织是自并非正使用本发明组合物或方法鉴定的疾病或状况的受试者或患者的一位或多位个体的身体的健康部分获得的。
[0106] 如本文中使用的，“癌症”和“肿瘤”是可互换的术语，指动物中的任何异常细胞或组织生长或增殖。如本文中使用的，术语“癌症”和“肿瘤”涵盖实体和血液学/淋巴癌，而且还涵盖恶性、恶变前、和良性生长，诸如发育异常。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更特定的非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食道癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胃肠基质肿瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃癌(stomach cancer、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer)、肾癌(renal cancer)、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、阴门癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、胆管癌、胆囊癌、胃癌(gastric cancer)、黑素瘤、间皮瘤、和各种类型的头和颈癌。
[0107] “具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平的细胞”指在细胞中具有比VEGF mRNA或蛋白质水平更高的FGF2 mRNA或蛋白质水平的细胞。“具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平的癌症”指至少一部分细胞具有比VEGF mRNA或蛋白质水平更高的FGF2 mRNA或蛋白质水平的癌症。在一些实施方案中，“至少一部分细胞”为癌症样品中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的细胞。在一些实施方案中，具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平的细胞或至少一部分细胞具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平的癌症具有大于1的FGF2对VEGF比率。在一些实施方案中，具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平的细胞或至少一部分细胞具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平的癌症具有比VEGF要多5％、7％、10％、12％、15％、17％、20％、或25％的FGF2。在一些实施方案中，所述FGF2和VEGF水平为mRNA水平。在一些此类实施方案中，通过选自定量RT-PCR、微阵列、数字PCT、RNA-Seq、RNA酶保护测定法(RPA)、Northern印迹、和原位杂交(ISH)的方法来测定所述水平。在一些实施方案中，通过定量RT-PCR来测定所述水平。在一些实施方案中，通过微阵列来测定所述水平。在一些实施方案中，所述FGF2和VEGF水平为蛋白质水平。在一些此类实施方案中，通过选自免疫组织化学、ELISA、质谱术、反相蛋白质阵列(RPPA)、抗体阵列、纳米免疫测定法、Western印迹、和毛细管蛋白质分析测定法的方法来测定所述水平。在一些实施方案中，通过免疫组织化学来测定所述水平。
[0108] “具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平的细胞”指在细胞中具有比VEGF mRNA或蛋白质水平更低的FGF2 mRNA或蛋白质水平的细胞。“具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平的癌症”指至少一部分细胞具有比VEGF mRNA或蛋白质水平更低的FGF2 mRNA或蛋白质水平的癌症。在一些实施方案中，癌症样品中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的细胞具有与VEGF mRNA或蛋白质水平相比更低的FGF2 mRNA或蛋白质水平。在一些实施方案中，具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平的细胞或至少一部分细胞具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平的癌症具有小于1的FGF2对VEGF比率。在一些实施方案中，具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平的细胞至少一部分细胞具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平的癌症具有比VEGF要少5％、7％、
10％、12％、15％、17％、20％、或25％的FGF2。在一些实施方案中，所述FGF2和VEGF水平为mRNA水平。在一些此类实施方案中，通过选自定量RT-PCR、微阵列、数字PCT、RNA-Seq、RNA酶保护测定法(RPA)、Northern印迹、和原位杂交(ISH)的方法来测定所述水平。在一些实施方案中，通过定量RT-PCR来测定所述水平。在一些实施方案中，通过微阵列来测定所述水平。在一些实施方案中，所述FGF2和VEGF水平为蛋白质水平。在一些此类实施方案中，通过选自免疫组织化学、ELISA、质谱术、反相蛋白质阵列(RPPA)、抗体阵列、纳米免疫测定法、Western印迹、和毛细管蛋白质分析测定法的方法来测定所述水平。在一些实施方案中，通过免疫组织化学来测定所述水平。
10％、12％、15％、17％、20％、或25％的FGF2。在一些实施方案中，所述FGF2和VEGF水平为mRNA水平。在一些此类实施方案中，通过选自定量RT-PCR、微阵列、数字PCT、RNA-Seq、RNA酶保护测定法(RPA)、Northern印迹、和原位杂交(ISH)的方法来测定所述水平。在一些实施方案中，通过定量RT-PCR来测定所述水平。在一些实施方案中，通过微阵列来测定所述水平。在一些实施方案中，所述FGF2和VEGF水平为蛋白质水平。在一些此类实施方案中，通过选自免疫组织化学、ELISA、质谱术、反相蛋白质阵列(RPPA)、抗体阵列、纳米免疫测定法、Western印迹、和毛细管蛋白质分析测定法的方法来测定所述水平。在一些实施方案中，通过免疫组织化学来测定所述水平。
[0109] 如本文中使用的，“治疗/处理”包括针对哺乳动物(包括人)中的状况的治疗剂的任何施用或应用，且包括例如通过引起消退或恢复或修复丧失的、缺少的、或缺陷的功能；或刺激低效过程来抑制状况或其进展、抑制或减缓状况或其进展、阻滞其发展、部分或完全减轻状况、或治愈状况。在一些实施方案中，“治疗/处理”指试图改变所治疗/处理的个体或细胞的自然过程的临床干预，且可为了预防或在临床病理学过程期间实施。合乎需要的治疗效果包括预防疾病发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、及消退或改善预后。
[0110] 分子或分子组合的“有效量”或“治疗有效量”意指当单独或与其它治疗组合给予时足以在至少一种受试者子集中治疗状况和/或抑制肿瘤细胞生长的量。在某些实施方案中，治疗有效量指在必要剂量和时间段下有效实现期望的治疗或预防结果的量。本发明的FGFR1融合蛋白的治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别、和体重，及FGFR1融合蛋白在个体中引发期望响应的能力的因素而变化。治疗有效量也是FGFR1融合蛋白的治疗有益作用胜过任何毒性或有害作用的量。在癌症的情况中，有效量的药物可减少癌细胞数目；缩小肿瘤尺寸；抑制(即在某种程度上减缓且通常终止)癌细胞浸润入周围器官中；抑制(即在某种程度上减缓且通常终止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；容许对肿瘤进行治疗，和/或在某种程度上减轻一种或多种与病症有关的症状。就药物可阻止已有的癌细胞生长和/或杀死已有的癌细胞的程度而言，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。
[0111] “预防有效量”指在必要的剂量和时间段下有效实现期望预防结果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病之前或在疾病的早期阶段用于受试者的，因此预防有效量会小于治疗有效量。
[0112] 术语“抑制”指任何表型特征减少或停止或该特征的发生率、程度、或可能性降低或停止。非限制性例示性抑制包括对肿瘤生长的抑制。
[0113] 如本文中在受益于或响应施用治疗剂的语境中使用的，术语“益处”、“临床益处”、“响应性”、和“治疗响应性”可通过评估各种终点来测量，所述终点例如在某种程度上抑制疾病进展，包括减缓和完全阻滞；减少疾病发作和/或症状数目；缩小病变尺寸；抑制(即减少、减缓或完全终止)疾病细胞浸润到相邻周围器官和/或组织中；抑制(即减少、减缓或完全终止)疾病扩散；减少自身免疫反应，此可能但并非必然导致疾病病变消退或消融；在某种程度上减轻一种或多种与病症有关的症状；延长治疗后无疾病表现的长度，例如无进展存活；延长总体存活；更高的响应率；和/或在治疗后的给定时间点降低的死亡率。
[0114] “与”一种或多种其它治疗剂“组合”施用包括并行(包括同时)施用和按任意次序的连续(即序贯)施用。
[0115] “药学可接受载剂”指本领域中常规的与治疗剂一起使用以构成用于对受试者施用的“药物组合物”的无毒的固体、半固体、或液体填充剂、稀释剂、封装材料、配制助剂、或载剂。药学可接受载剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的且与配制剂的其它组分相容。药学可接受载剂适合所采用的配制剂。例如，如果要口服施用治疗剂，那么载剂可以是凝胶胶囊。如果要皮下施用治疗剂，那么载剂理想的是对皮肤无刺激性且不引起注射部位反应。
[0116] 治疗性组合物和方法
[0117] 使用FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子治疗癌症的方法
[0118] 在一些实施方案中，本发明提供治疗至少一部分癌细胞具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平的癌症的方法。在一些实施方案中，癌症样品中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的细胞具有与VEGF mRNA或蛋白质水平相比更高的FGF2 mRNA或蛋白质水平。在一些实施方案中，已经发现此类癌症特别响应使用成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子的治疗。因而，在一些实施方案中，治疗具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平的癌症的方法包括对受试者施用治疗有效量的FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。在一些实施方案中，治疗受试者中的癌症的方法包括对所述受试者施用治疗有效量的成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子，其中在施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子之前，所述癌症的至少一部分细胞已经确定具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平。在一些实施方案中，癌症样品中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的细胞已经确定具有与VEGF mRNA或蛋白质水平相比更高的FGF2 mRNA或蛋白质水平。在此类方法中，癌症中与VEGF水平相比更高的FGF2水平指示所述癌症对FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子的治疗响应性。在一些实施方案中，一种方法包括对受试者施用治疗有效量的FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和治疗有效量的至少一种抗血管发生剂。在一些实施方案中，所述抗血管发生剂为VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，所述VEGF拮抗剂选自帕唑帕尼、贝伐珠单抗、阿西替尼、阿柏西普、索拉非尼、或舒尼替尼。在一些实施方案中，所述VEGF拮抗剂选自帕唑帕尼、索拉非尼、和阿西替尼。
[0119] 在一些实施方案中，本发明提供治疗至少一部分癌细胞具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平的癌症的方法。在一些实施方案中，癌症样品中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的细胞具有与VEGF mRNA或蛋白质水平相比更低的FGF2 mRNA或蛋白质水平。在一些实施方案中，所述水平为mRNA水平。在一些实施方案中，所述水平为蛋白质水平。在一些实施方案中，治疗具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平的癌症的方法包括对受试者施用治疗有效量的FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和治疗有效量的至少一种抗血管发生剂。在一些实施方案中，治疗受试者中的癌症的方法包括对所述受试者施用治疗有效量的成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)胞外域(ECD)或FGFR1 ECD融合分子和治疗有效量的至少一种抗血管发生剂，其中在施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂之前，所述癌症的至少一部分细胞已经确定具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平。在一些实施方案中，癌症样品中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少
80％、或至少90％的细胞已经确定具有与VEGF mRNA或蛋白质水平相比更低的FGF2 mRNA或蛋白质水平。在一些实施方案中，所述抗血管发生剂为VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，所述VEGF拮抗剂选自帕唑帕尼、贝伐珠单抗、阿西替尼、阿柏西普、索拉非尼、或舒尼替尼。
在一些实施方案中，所述VEGF拮抗剂选自帕唑帕尼、索拉非尼、和阿西替尼。
80％、或至少90％的细胞已经确定具有与VEGF mRNA或蛋白质水平相比更低的FGF2 mRNA或蛋白质水平。在一些实施方案中，所述抗血管发生剂为VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，所述VEGF拮抗剂选自帕唑帕尼、贝伐珠单抗、阿西替尼、阿柏西普、索拉非尼、或舒尼替尼。
在一些实施方案中，所述VEGF拮抗剂选自帕唑帕尼、索拉非尼、和阿西替尼。
[0120] 在一些实施方案中，所述癌症选自前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、脑癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头和颈癌、喉癌、肝癌、肾癌、成胶质细胞瘤、和胰腺癌。在某些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、食道癌、和肺癌。在一些实施方案中，所述癌症为肾癌，诸如肾细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症为肝癌，诸如肝细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症为肺癌。在一些实施方案中，所述肺癌选自非小细胞肺癌和小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述肺癌为鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症为头和颈癌。在一些实施方案中，所述头和颈癌为头和颈鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症选自肾癌(诸如肾细胞癌)、肝癌(诸如肝细胞癌)、成胶质细胞瘤、和间皮瘤。在一些实施方案中，所述癌症为肾细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症为肝细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症为间皮瘤。在一些实施方案中，所述癌症为成胶质细胞瘤。
[0121] 在一些实施方案中，FGFR1 ECD具有选自SEQ ID NO:1至4的氨基酸序列。在一些实施方案中，FGFR1 ECD具有选自SEQ ID NO:2和4的氨基酸序列。在一些实施方案中，FGFR1 ECD融合分子具有选自SEQ ID NO:5和6的氨基酸序列。在一些实施方案中，FGFR1 ECD融合分子为具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的FGFR1 ECD.339-Fc。
[0122] 在一些实施方案中，FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子与一种或多种另外的抗癌疗法一起施用。另外的抗癌疗法的实例包括但不限于手术、放射疗法(放疗)、生物疗法、免疫疗法、和化学疗法或这些疗法的组合。另外，细胞毒剂、抗血管发生剂和抗增殖剂可以与FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子组合使用。在任何方法和用途的某些方面，本发明提供通过对受试者施用治疗有效量的FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子和一种或多种化疗剂来治疗癌症。在一些实施方案中，受试者的癌症先前未受治疗。多种化疗剂可以用在本发明的组合治疗方法和用途中。在本文中的“定义”中提供了所涵盖的例示性和非限制性化疗剂的列表。
[0123] 在一些实施方案中，本发明提供通过对受试者施用治疗有效量的FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子及一种或多种抗血管发生剂来治疗癌症的方法。在一些实施方案中，本发明提供通过对受试者施用治疗有效量的FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子及一种或多种VEGF拮抗剂来治疗癌症。在一些实施方案中，本发明提供通过对受试者施用治疗有效量的FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子及一种或多种VEGF拮抗剂与一种或多种化疗剂的组合来治疗癌症。在一些实施方案中，一种或多种VEGF拮抗剂为抗VEGF抗体和/或VEGF诱捕剂。在一些实施方案中，所述VEGF拮抗剂选自帕唑帕尼、贝伐珠单抗、阿西替尼、阿柏西普、索拉非尼、或舒尼替尼。在一些实施方案中，所述VEGF拮抗剂选自帕唑帕尼、索拉非尼、和阿西替尼。
[0124] 在一些实施方案中，提供治疗癌症的方法，其包括对受试者施用FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子与至少一种另外的治疗剂的组合，所述另外的治疗剂选自多西他赛、帕利他赛、长春新碱、卡铂、顺铂、奥沙利铂、多柔比星、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、培美曲塞、索拉非尼、舒尼替尼、阿西替尼、帕唑帕尼、依托泊苷、拓扑替康、VEGF拮抗剂、抗VEGF抗体、VEGF诱捕剂、阿柏西普、和贝伐珠单抗。在另一个实施例中，提供治疗癌症的方法，其包括对受试者施用FGFR1-ECD.339-Fc与至少一种另外的治疗剂的组合，所述另外的治疗剂选自多西他赛、帕利他赛、长春新碱、卡铂、顺铂、奥沙利铂、多柔比星、5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、培美曲塞、索拉非尼、舒尼替尼、阿西替尼、帕唑帕尼、依托泊苷、拓扑替康、VEGF拮抗剂、抗VEGF抗体、VEGF诱捕剂、阿柏西普、和贝伐珠单抗。在一些实施方案中，提供治疗癌症的方法，所述方法包括对受试者施用FGFR1-ECD.339-Fc和多西他赛。在一些实施方案中，提供治疗癌症的方法，所述方法包括对受试者施用FGFR1-ECD.339-Fc、帕利他赛、和卡铂。在一些实施方案中，提供治疗癌症的方法，所述方法包括对受试者施用FGFR1-ECD.339-Fc、培美曲塞、和顺铂。在一些实施方案中，所述癌症选自肝癌(包括肝细胞癌)、肾癌(包括肾细胞癌)、成胶质细胞瘤、和间皮瘤。在一些实施方案中，所述癌症为肾细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症为肝细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症为间皮瘤。在一些实施方案中，所述癌症为成胶质细胞瘤。
[0125] 在一些实施方案中，提供治疗癌症的方法，所述方法包括对具有癌症的受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子，其中所述受试者先前已经用至少一种选自帕唑帕尼、贝伐珠单抗、阿西替尼、阿柏西普、索拉非尼、和舒尼替尼的治疗剂治疗过。在一些实施方案中，所述受试者先前已经用至少一种选自阿西替尼、帕唑帕尼、和索拉非尼的治疗剂治疗过。在一些实施方案中，所述受试者先前已经用帕唑帕尼治疗过。在一些实施方案中，所述受试者的癌症已经在帕唑帕尼治疗期间或之后变成帕唑帕尼抗性。在一些实施方案中，提供治疗帕唑帕尼抗性癌症的方法，所述方法包括对具有帕唑帕尼抗性癌症的受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。在一些实施方案中，所述方法包括施用帕唑帕尼和FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。
[0126] 在一些此类实施方案中，所述受试者具有VEGF抗性癌症。在一些实施方案中，VEGF抗性癌症表达高水平的FGF2和/或具有大于1的FGF2/VEGF比率。在一些实施方案中，所述具有VEGF抗性癌症的受试者先前已经用至少一种选自帕唑帕尼、贝伐珠单抗、阿西替尼、阿柏西普、索拉非尼、和舒尼替尼的治疗剂治疗过。在一些实施方案中，至少一种治疗剂选自帕唑帕尼和索拉非尼。在一些实施方案中，与阿西替尼组合施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。
[0127] 在一些实施方案中，当受试者已经接受过一种药剂的完整或部分疗程(单独的或与一种或多种另外的药剂组合的)时，认为所述受试者先前已经用所述药剂治疗过。在一些此类实施方案中，所述受试者可以未曾响应所述药剂或药剂组合，或者可以最初响应所述药剂或药剂组合，但是可以已经变成不太响应所述药剂或药剂组合，或者可以已经变成不响应所述药剂或药剂组合。例如，可以根据所治疗的癌症的生长和/或转移来测定响应性。
[0128] 在一些实施方案中，所述癌症(包括VEGF抗性癌症)选自前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、脑癌、卵巢癌、子宫内膜癌、头和颈癌、喉癌、肝癌、肾癌、成胶质细胞瘤、间皮瘤、和胰腺癌。在一些实施方案中，所述癌症(包括VEGF抗性癌症)为肾癌，诸如肾细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症(包括VEGF抗性癌症)为肝癌，诸如肝细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症(包括VEGF抗性癌症)为间皮瘤。
[0129] 在一些实施方案中，提供降低实体癌中的血管密度的方法，所述方法包括对具有所述癌症的受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。在一些实施方案中，提供降低实体癌中的血管密度的方法，其中所述癌症具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平，其中所述方法包括对具有所述癌症的受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。在一些实施方案中，提供降低VEGF抗性实体癌中的血管密度的方法，所述方法包括对具有所述癌症的受试者施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。在一些实施方案中，所述癌症选自肾癌(诸如肾细胞癌)、肝癌(诸如肝细胞癌)、肺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、食道癌、头和颈癌、成胶质细胞瘤、间皮瘤、和前列腺癌。在一些实施方案中，所述癌症选自肾癌(诸如肾细胞癌)、肝癌(诸如肝细胞癌)、成胶质细胞瘤、和间皮瘤。在一些实施方案中，所述癌症为肾细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症为肝细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症为间皮瘤。
[0130] 在一些实施方案中，通过本领域中的方法来测定血管密度。在一些实施方案中，如实施例11中所述来测定血管密度。在一些实施方案中，在整个肿瘤样品中测定血管密度。
[0131] 以针对特定适应症的治疗有效量施用包含FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子(例如FGFR1-ECD.339-Fc)的药物组合物。治疗有效量通常取决于所治疗的受试者的重量、他或她的身体或健康状况、所治疗的状况的广泛性、和/或所治疗的受试者的年龄。通常，FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子(例如FGFR1-ECD.339-Fc)要以每剂约50μg/kg体重至约100mg/kg体重范围中的量施用。任选地，FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子(例如FGFR1-ECD.339-Fc)可以以每剂约100μg/kg体重至约30mg/kg体重范围中的量施用。进一步任选地，FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子(例如FGFR1-ECD.339-Fc)可以以每剂约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重范围中的量施用，使用1.42mL/mg*cm的消光系数计算的。
在某些实施方案中，FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子(例如FGFR1-ECD.339-Fc)以约
8mg/kg体重至约20mg/kg体重的剂量施用，使用1.42mL/mg*cm的消光系数计算的。在一些实施方案中，FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子(例如FGFR1-ECD.339-Fc)以约8mg/kg体重至约16mg/kg体重(或约10mg/kg体重至约20mg/kg体重，当使用1.11mL/mg*cm的消光系数计算时)的剂量施用。在一些实施方案中，FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子(例如FGFR1-ECD.339-Fc)以约8mg/kg体重、约10mg/kg体重、约11mg/kg体重、约12mg/kg体重、约13mg/kg体重、约14mg/kg体重、约15mg/kg体重、约16mg/kg体重、约17mg/kg体重、约18mg/kg体重、约19mg/kg体重、或约20mg/kg体重的剂量施用，使用1.42mL/mg*cm的消光系数计算的。在一些实施方案中，如使用1.11mL/mg*cm的消光系数计算的，FGFR1融合蛋白以约10mg/kg体重的剂量施用。在其它实施方案中，如使用1.11mL/mg*cm的消光系数计算的，FGFR1融合蛋白以约20mg/kg体重的剂量施用。也可以以上述一种剂量至另一种剂量的范围施用FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子。在一些实施方案中，可以一周两次、每周、隔周、以介于每周和隔周之间的频率、每三周、每四周、或每月来施用剂量。
在某些实施方案中，FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子(例如FGFR1-ECD.339-Fc)以约
8mg/kg体重至约20mg/kg体重的剂量施用，使用1.42mL/mg*cm的消光系数计算的。在一些实施方案中，FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子(例如FGFR1-ECD.339-Fc)以约8mg/kg体重至约16mg/kg体重(或约10mg/kg体重至约20mg/kg体重，当使用1.11mL/mg*cm的消光系数计算时)的剂量施用。在一些实施方案中，FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子(例如FGFR1-ECD.339-Fc)以约8mg/kg体重、约10mg/kg体重、约11mg/kg体重、约12mg/kg体重、约13mg/kg体重、约14mg/kg体重、约15mg/kg体重、约16mg/kg体重、约17mg/kg体重、约18mg/kg体重、约19mg/kg体重、或约20mg/kg体重的剂量施用，使用1.42mL/mg*cm的消光系数计算的。在一些实施方案中，如使用1.11mL/mg*cm的消光系数计算的，FGFR1融合蛋白以约10mg/kg体重的剂量施用。在其它实施方案中，如使用1.11mL/mg*cm的消光系数计算的，FGFR1融合蛋白以约20mg/kg体重的剂量施用。也可以以上述一种剂量至另一种剂量的范围施用FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子。在一些实施方案中，可以一周两次、每周、隔周、以介于每周和隔周之间的频率、每三周、每四周、或每月来施用剂量。
[0132] 在某些实施方案中，根据所使用的消光系数(EC)，可通过两种方式来计算FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子的剂量。消光系数随是否考虑蛋白质的糖基化而不同。在一个实施方案中，基于FGFR1-ECD.339-Fc的氨基酸组成的消光系数为例如1.42mL/mg*cm。在另一个实施方案中，当考虑FGFR1-ECD.339-Fc的碳水化合物部分以及氨基酸部分时，消光系数为1.11mL/mg*cm。使用1.11mL/mg*cm的EC计算FGFR1-ECD.339-Fc剂量使计算剂量增加28％，如表1中所示。虽然使用两种消光系数计算的剂量不同，但是所施用的药物的摩尔浓度或实际量相同。除非另外说明，本文中公开的剂量各自使用不考虑糖基化的消光系数来计算。对于FGFR1-ECD.339-Fc，这些剂量与使用考虑糖基化的消光系数计算的剂量的比较状况显示于表1。从表1可以看出，本文中使用1.42mL/mg*cm的EC的约8mg/kg(例如7.8和8.0)的剂量对应于使用1.11mL/mg*cm的EC计算的约10mg/kg(例如10.0和10.2)的剂量。本文中使用1.42mL/mg*cm的EC的约16mg/kg(例如15.6和16.0)的剂量对应于使用1.11mL/mg*cm的EC计算的约20mg/kg(例如20.0和20.5)的剂量。如上文“定义”节中说明的，本文中提供的测量数值是近似值且涵盖具有其它四舍五入有效数字的值。例如，8mg/kg涵盖具有两个有效数字的值，诸如7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、和8.45，其各自四舍五入为8。同样，诸如16mg/kg的值涵盖四舍五入为16的具有三个有效数字的值，诸如例如15.6和16.0。
[0133] 表1：FGFR1-ECD.339-FC剂量的换算
[0134]
[0135]
[0136] a以mg/kg显示的剂量。
[0137] 在需要时可对受试者施用包含FGFR1 ECD、FGFR1 ECD融合分子、和/或至少一种另外的治疗剂的药物组合物。在某些实施方案中，一或多次对受试者施用有效剂量的治疗性分子。在各种实施方案中，至少每两个月一次、至少一个月一次、至少一个月两次、一周一次、一周两次、或一周三次对受试者施用有效剂量的治疗性分子。在各种实施方案中，对受试者施用有效剂量的治疗性分子持续至少一周、至少一个月、至少三个月、至少六个月、或至少一年。
[0138] 在某些实施方案中，FGFR1 ECD、FGFR1 ECD融合分子和至少一种另外的治疗剂的组合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的并行施用(包括同时施用)，以及按任意次序的连续施用。任选地，有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生物学活性。与FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子(例如FGFR1-ECD.339-Fc)组合施用的治疗剂的治疗有效量会由医师或兽医斟酌。进行剂量施用和调整来实现对所治疗的状况的最大程度上的管理。剂量另外会取决于诸如所使用的治疗剂的类型、所治疗的特定患者、疾病的阶段、和治疗方案的期望攻击性等因素。
[0139] 在某些实 施方案中，用FGFR1 ECD和 /或FGFR1 ECD融合分子(例 如FGFR1-ECD.339-Fc)和抗血管发生剂的组合治疗患者。在一些实施方案中，所述抗血管发生剂为VEGF拮抗剂。在一些实施方案中，所述VEGF拮抗剂为VEGF诱捕剂(例如阿柏西普)。在一些实施方案中，所述VEGF拮抗剂为酪氨酸激酶抑制剂(例如帕唑帕尼、阿西替尼、索拉非尼、或舒尼替尼)。在一些实施方案中，所述VEGF拮抗剂为抗VEGF抗体。在一些实施方案中，所述VEGF抗体为贝伐珠单抗。贝伐珠单抗的一种例示性剂量在约0.05mg/kg至约20mg/kg的范围中。因此，可以对受试者施用一或多剂约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg或15mg/kg(或其任意组合)。可以间歇施用此类剂量，例如每周、每两周、或每三周。
[0140] 在一些实施方案中，与另一种治疗剂(诸如化疗剂或抗血管发生剂)组合施用FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子(例如FGFR1-ECD.339-Fc)，以所述治疗剂的推荐或处方剂量和/或频率进行。
[0141] 在一些实施方案中，另外的治疗剂以由负责批准治疗性处理的机构(诸如食品与药品管理局)批准的剂量或以制造商推荐的剂量来施用。
[0142] 施用路径和载剂
[0143] 在一些实施方案中，FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子可以静脉内和/或皮下施用。在一些实施方案中，FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子可以通过另一种路径来施用，诸如动脉内、胃肠外、鼻内、肌肉内、心内、心室内、气管内、口腔、直肠、腹膜内、皮内、表面、经皮、或鞘内、或另外通过植入或吸入来施用。在各种实施方案中，至少一种另外的治疗剂可以通过多种路径在体内施用，包括静脉内、动脉内、皮下、胃肠外、鼻内、肌肉内、心内、心室内、气管内、口腔、直肠、腹膜内、皮内、表面、经皮、和鞘内、或另外通过植入或吸入来施用。每种主题组合物均可以单独或组合配制成固体、半固体、液体、或气体形式的制剂，诸如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、灌肠剂、注射剂、吸入剂、和气雾剂。
[0144] 在各种实施方案中，包含FGFR1 ECD、FGFR1 ECD融合分子、和/或至少一种另外的治疗剂的组合物以含有药学可接受载剂的配制剂来提供，在本领域中已知多种药学可接受载剂(参见例如Gennaro,Remington:The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons:Drugfacts Plus,20th ed.(2003)；Ansel et al.,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,7th ed.,Lippencott Williams and Wilkins(2004)；Kibbe et al.,Handbook of Pharmaceutical Excipients,3rd ed.,Pharmaceutical Press(2000))。公众可得包括媒介、佐剂、载剂、和稀释剂的各种药学可接受载剂。此外，公众也可得诸如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂等等的各种药学可接受辅助物质。某些非限制性例示性载剂包括盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇、和其组合。在一些实施方案中，治疗剂配制成上文定义节中指出的商标名称药物或通用等效物。在一些实施方案中，多西他赛配制成 (Sanofi Aventis)或通用等效物。
[0145] 在各种实施方案中，包含FGFR1 ECD、FGFR1 ECD融合分子、和/或至少一种另外的治疗剂的组合物可以通过使它们在水性或非水性溶剂(诸如植物油或其它油、合成脂族酸甘油酯、高级脂族酸的酯、或丙二醇)中溶解、悬浮、或乳化；且在需要时与诸如增溶剂、等张剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂的常规添加剂一起配制成用于注射。在各种实施方案中，组合物例如可使用加压的可接受推进剂(诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气、等等)配制成用于吸入。在各种实施方案中，组合物还可以诸如与生物可降解或非生物可降解聚合物一起配制成持续释放微胶囊。一种非限制性例示性生物可降解配制剂包括聚乳酸-乙醇酸聚合物。一种非限制性例示性非生物可降解配制剂包括聚甘油脂肪酸酯。制备此类配制剂的某些方法描述于例如EP 1 125584 A1。
[0146] 还提供包含一个或多个容器的药物剂量包装，每个容器含有一个或多个剂量的FGFR1 ECD、FGFR1 ECD融合分子、和/或至少一种另外的治疗剂。在某些实施方案中，提供单位剂量，其中所述单位剂量含有预定量的包含FGFR1 ECD、FGFR1 ECD融合分子、和/或至少一种另外的治疗剂且具有或不具有一种或多种另外的药剂的组合物。在某些实施方案中，在用于注射的一次性使用预装注射器中供应此类单位剂量。在各种实施方案中，单位剂量中含有的组合物可包含盐水、蔗糖、等等；缓冲剂，诸如磷酸盐、等等；和/或在稳定且有效的pH范围内配制。或者，在某些实施方案中，可以作为冻干粉末提供组合物，所述冻干粉末可以在添加适宜液体(例如无菌水)后重建。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。在某些实施方案中，本发明的组合物包含肝素和/或蛋白聚糖。
[0147] 在一些实施方案中，剂量包装包含在恰当时，在施用FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子，和/或至少一种抗血管发生剂之前，确定癌症是否具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平的说明书，和/或确定癌症是否具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平的说明书。在一些此类实施方案中，说明书指出与VEGF水平相比更高的FGF2水平指示对FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子的治疗响应性。
[0148] 如本文中使用的，术语“说明书”包括但不限于标签、包装插页、可诸如在计算机可读媒体(例如磁盘、光盘、或DVD)上以电子形式得到的说明书、可诸如在因特网上远程得到的说明书、等。当剂量包装提供获取说明书的途径、获取说明书的链接(诸如统一资源定位符或url)、或获得说明书拷贝的其它机制(诸如回函卡、可请求说明书的物理地址、可请求说明书的电子邮件地址、可呼叫以得到说明书的电话号码、等)时，认为剂量包装包括说明书。
[0149] FGFR1 ECD和FGFR1 ECD融合分子
[0150] 非限制性例示性FGFR1 ECD包括全长FGFR1 ECD、FGFR1 ECD片段、和FGFR1 ECD变体。FGFR1 ECD可包括或缺少信号肽。例示性FGFR1 ECD包括但不限于具有选自SEQ ID NO.:1、2、3、和4的氨基酸序列的FGFR1 ECD。
[0151] 非限制性例示性FGFR1 ECD片段包括在氨基酸339(自无信号肽的成熟形式的第一个氨基酸开始计数)处结束的人FGFR1 ECD。在一些实施方案中，FGFR1 ECD片段在介于氨基酸339和氨基酸360(自无信号肽的成熟形式的第一个氨基酸开始计数)之间的一个氨基酸处结束。例示性FGFR1 ECD片段包括但不限于具有选自SEQ ID NO.:3和4的氨基酸序列的FGFR1 ECD片段。
[0152] 在一些实施方案中，FGFR1 ECD包含选自SEQ ID NO:1至4的序列。在一些实施方案中，FGFR1 ECD由选自SEQ ID NO:1至4的序列组成。当FGFR1 ECD“由”选自SEQ ID NO:1至4的序列“组成”时，FGFR1 ECD可含有或不含各种翻译后修饰，诸如糖基化和唾液酸化。换言之，当FGFR1 ECD由特定氨基酸序列组成时，它在连续氨基酸序列中不含另外的氨基酸，但可含有对氨基酸侧链、N端氨基基团、和/或C端羧基基团的修饰。
[0153] 在一些实施方案中，FGFR1 ECD融合分子包含信号肽。在一些实施方案中，FGFR1 ECD融合分子缺少信号肽。在一些实施方案中，FGFR1 ECD融合分子的FGFR1 ECD部分包含选自SEQ ID NO:1至4的序列。在一些实施方案中，FGFR1 ECD融合分子的FGFR1 ECD部分由选自SEQ ID NO:1至4的序列组成。当FGFR1 ECD融合分子的FGFR1 ECD部分“由”选自SEQ ID NO:1至4的序列“组成”时，FGFR1 ECD融合分子的FGFR1 ECD部分可含有或不含各种翻译后修饰，诸如糖基化和唾液酸化。换言之，当FGFR1 ECD融合分子的FGFR1 ECD部分由特定氨基酸序列组成时，它在连续氨基酸序列中不含来自FGFR1的另外的氨基酸，但可含有对氨基酸侧链、N端氨基基团、和/或C端羧基基团的修饰。此外，因为FGFR1 ECD连接至融合分子，所以在FGFR1 ECD的N端和/或C端可以有另外的氨基酸，但是那些氨基酸并非来自FGFR1序列，而是可来自例如接头序列或融合伴侣序列。
[0154] 在一些实施方案中，FGFR1 ECD融合分子的融合伴侣部分选自Fc、清蛋白、和聚乙二醇。本文中讨论了非限制性例示性融合伴侣。
[0155] 发明人发现在至少一部分癌细胞具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平的癌症中FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂的施用比单独施用抗血管发生剂的治疗更加有效。发明人进一步发现在至少一部分癌细胞具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平的癌症中FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子的施用是有效的。在一些实施方案中，FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子的施用作为单药疗法在此类癌症中是有效的。
[0156] 在一些实施方案中，具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平的癌症可具有与参照样品、细胞、或组织相比升高的FGF2和VEGF二者水平，尽管FGF2水平比VEGF水平更高。在一些实施方案中，具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平的癌症可具有与参照样品、细胞、或组织相比升高的FGF2和VEGF二者水平，尽管FGF2水平比VEGF水平更低。
[0157] 在一些实施方案中，在具有与VEGF水平相比更高的FGF2水平的癌症中，FGF2水平可以比参照细胞中的FGF2水平更高或更低，而且VEGF水平可以比参照细胞中的VEGF水平更高或更低，只要FGF2水平比VEGF水平更高。类似地，在一些实施方案中，在具有与VEGF水平相比更低的FGF2水平的癌症中，FGF2水平可以比参照细胞中的FGF2水平更高或更低，而且VEGF水平可以比参照细胞中的VEGF水平更高或更低，只要FGF2水平比VEGF水平更低。
[0158] 融合伴侣和缀合物
[0159] 如本文中讨论的，FGFR1 ECD可以与至少一个融合伴侣组合，产生FGFR1 ECD融合分子。这些融合伴侣可促进纯化，且FGFR1 ECD融合分子可在体内显示延长的半衰期。FGFR1 ECD的合适融合伴侣包括例如聚合物，诸如水溶性聚合物；免疫球蛋白的恒定域；人血清清蛋白(HSA)的全部或部分；胎球蛋白A；胎球蛋白B；亮氨酸拉链结构域；四连接素三聚化结构域；甘露糖结合蛋白(也称作甘露糖结合凝集素)，例如甘露糖结合蛋白1；和Fc区，如本文中描述的且如美国专利No.6,686,179中进一步描述的。非限制性例示性FGFR1 ECD融合分子描述于例如美国专利No.7,678,890。
[0160] FGFR1 ECD融合分子可以通过将聚氨基酸或分支点氨基酸附着至FGFR1 ECD来制备。例如，聚氨基酸可以是用来延长FGFR1 ECD的循环半衰期(在经由融合分子实现的优点以外)的载体蛋白。出于本发明的治疗目的，此类聚氨基酸理想地应该是不具有或不产生中和抗原反应或其它不利反应的聚氨基酸。此类聚氨基酸可选自血清清蛋白(诸如HSA)、另外的抗体或其部分(例如Fc区)、胎球蛋白A、胎球蛋白B、亮氨酸拉链核因子红细胞衍生物-2(NFE2)、神经视网膜亮氨酸拉链、四连接素、或其它聚氨基酸(例如赖氨酸)。如本文所述，附着聚氨基酸的位置可位于N端或C端，或其间的其它位置，而且也可以通过化学接头模块连接至选定分子。
[0161] 聚合物
[0162] 聚合物(例如水溶性聚合物)作为融合伴侣来减少FGFR1 ECD融合分子在水性环境(诸如通常在生理环境中所见的)中沉淀可能是有用的。本发明中采用的聚合物对于制备治疗性产品或组合物会是药学上可接受的。
[0163] 合适的临床上可接受的水溶性聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇的共聚物、单甲氧基-聚乙二醇、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚(β-氨基酸)(均聚物或随机共聚物)、聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物(PPG)和其它聚烯烃氧化物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(POG)(例如甘油)和其它聚氧乙烯化多元醇、聚氧乙烯化山梨糖醇、或聚氧乙烯化葡萄糖、结肠酸(colonic acid)或其它碳水化合物聚合物、Ficoll、或右旋糖苷和其混合物。
[0164] 如本文中使用的，聚乙二醇(PEG)意欲涵盖已经用于衍生其它蛋白质的任何形式，诸如单-(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。聚乙二醇丙醛因其在水中的稳定性而可在制造方面具有优势。
[0165] 本文中使用的聚合物(例如水溶性聚合物)可具有任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。在一些实施方案中，聚合物具有介于约2kDa至约100kDa之间的平均分子量(术语“约”表示在聚合物的制备物中，一些分子的分子量会高于、某种程度上低于规定的分子量)。每种聚合物的平均分子量可以介于约5kDa和约50kDa之间，或介于约12kDa和约25kDa之间。一般来说，分子量越高或分支越多，聚合物:蛋白质的比率越高。也可以使用其它大小，取决于期望的治疗概况；例如持续释放的持续时间；对生物活性可能存在的影响；操作容易性；抗原性的程度或缺失；及聚合物对FGFR1 ECD的其它已知影响。
[0166] 本发明中采用的聚合物通常在考虑对多肽的功能或抗原性结构域的影响的情况下附着至FGFR1 ECD。一般来说，可在任何适用于使蛋白质与活化的聚合物分子反应的条件下进行化学衍生。可用于将聚合物连接至活性模块的活化基团包括砜、马来酰亚胺、巯基、硫醇、三氟甲磺酸酯(triflate)、三氟乙磺酸酯(tresylate)、氮杂环丙烷(azidirine)、环氧乙烷(oxirane)、和5-吡啶基。
[0167] 本发明的聚合物通常在氨基酸的阿尔法(α)或厄普西隆(ε)氨基基团或反应性硫醇基团处附着至异源多肽，但还涵盖聚合物基团可附着至蛋白质的具有足够反应性以便可在合适反应条件下附着至聚合物基团的任何反应性基团。因此，聚合物可以经由反应性基团(诸如游离氨基或羧基基团)与FGFR1 ECD共价结合。具有游离氨基基团的氨基酸残基可包括赖氨酸残基和N端氨基酸残基。具有游离羧基基团的氨基酸残基可包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基、和C端氨基酸残基。具有反应性硫醇基团的氨基酸残基包括半胱氨酸残基。
[0168] 用于制备与聚合物(诸如水溶性聚合物)缀合的融合分子的方法各自一般会涉及(a)使FGFR1 ECD与聚合物在可使多肽附着至一个或多个聚合物的条件下反应，并(b)获得反应产物。用于每种缀合的反应条件可选自本领域中已知的任何反应条件或后来开发的反应条件中的任一者，但应该选择以避免或限制暴露于会灭活要修饰的蛋白质的反应条件，诸如温度、溶剂、和pH水平。一般来说，用于反应的最佳反应条件会基于已知参数和期望结果而根据具体情况来确定。例如，聚合物:多肽缀合物的比率越大，缀合的产物的百分比就越大。最佳比率(就反应效率而言，即不存在过量的未反应的多肽或聚合物)可由诸如期望的衍生程度(例如单、二、三、等)、选择的聚合物的分子量、聚合物是分支的还是不分支的及使用的反应条件的因素来决定。聚合物(例如PEG)与多肽的比率一般会在1:1至100:1的范围中。一种或多种纯化的缀合物可通过标准纯化技术自各自混合物制备，所述标准纯化技术包括透析、盐析、超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析、和电泳等等。
[0169] 可能具体期望N端化学修饰的FGFR1 ECD。可以根据分子量、分支、等、反应混合物中聚合物与FGFR1 ECD分子的比例、要实施的反应的类型、和获得选定N端化学修饰FGFR1 ECD的方法来选择聚合物。获得N端化学修饰FGFR1 ECD制备物(在必要时将此模块与其它单衍生模块分开)的方法可以是通过自化学修饰蛋白质分子群体纯化N端化学修饰FGFR1 ECD材料。
[0170] 选择性N端化学修饰可以通过还原性烷基化来实现，还原性烷基化利用特定蛋白质中可用于衍生的不同类型的主要氨基基团(赖氨酸对N端)的差异反应性。在适宜的反应条件下，实现含有羰基基团的聚合物在N端对蛋白质的实质性选择性衍生。例如，可以通过在容许利用蛋白质的赖氨酸残基的ε-氨基基团与N端残基的α-氨基基团之间的pKa差异的pH实施反应来将聚合物选择性附着至蛋白质的N端。通过此类选择性衍生，聚合物对蛋白质的附着得以控制：主要在蛋白质的N端发生与聚合物的缀合且不发生对其它反应性基团(诸如赖氨酸侧链氨基基团)的显著修饰。使用还原性烷基化，聚合物可以属于上文所述类型，而且应具有单个反应性醛用于与蛋白质偶联。也可以使用含有单个反应性醛的聚乙二醇丙醛。
[0171] 在一个实施方案中，本发明涵盖经化学衍生而包括单个或多个(例如2-4个)PEG模块的FGFR1 ECD。可通过任何可用的PEG化反应来进行PEG化。用于制备PEG化蛋白质产物的方法一般会包括(a)使多肽与聚乙二醇(诸如PEG的反应性酯或醛衍生物)在可使蛋白质变成附着至一个或多个PEG基团的条件下反应；并(b)获得反应产物。一般来说，最佳反应条件会基于已知参数和期望结果根据具体情况来确定。
[0172] 本领域中已知多种PEG附着方法。参见例如EP 0 401 384；Malik et al.,Exp.Hematol.,20:1028-1035(1992)；Francis,Focus on Growth Factors,3(2):4-10(1992)；EP 0 154 316；EP 0 401 384；WO 92/16221；WO 95/34326；和本文中引用的涉及PEG化的其它出版物。
[0173] 例如，可以经由与反应性聚乙二醇分子的酰化反应或烷基化反应来进行PEG化。因此，依照本发明的蛋白质产物包括PEG化蛋白质，其中PEG基团经由酰基或烷基基团附着。此类产物可以是单PEG化的或多PEG化的(例如含有2-6个或2-5个PEG基团的产物)。PEG基团一般在氨基酸的α-或ε-氨基基团处附着至蛋白质，但也涵盖PEG基团可附着至任何附着至蛋白质且具有足够反应性以在合适反应条件下附着至PEG基团的氨基。
[0174] 通过酰化进行PEG化一般涉及使聚乙二醇(PEG)的活性酯衍生物与FGFR1 ECD反应。对于酰化反应，选择的聚合物通常具有单个反应性酯基团。可使用任何已知的或后来发现的反应性PEG分子来进行PEG化反应。合适的活化的PEG酯的一个实例是酯化成N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PEG。如本文中使用的，酰化涵盖包括但不限于治疗性蛋白质和聚合物(诸如PEG)之间的下述类型的连接：酰胺、氨基甲酸酯、聚氨酯、等等，参见例如Chamow,Bioconjugate Chem.,5:133-140(1994)。反应条件可选自任何当前已知的反应条件或后来开发的反应条件，但应该避免会灭活要修饰的多肽的条件，诸如温度、溶剂、和pH。
[0175] 通过酰化进行PEG化一般会产生多PEG化蛋白质。联系的连接可以是酰胺。所得产物可以基本上仅(例如>95％)单PEG化的、二PEG化的、或三PEG化的。然而，可形成PEG化程度更高的一些种类，其量取决于使用的具体反应条件。在需要时，可以通过标准纯化技术自混合物(特别是未反应的种类)分出更加纯化的PEG化种类，所述标准纯化技术包括透析、盐析、超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析、和电泳等等。
[0176] 通过烷基化进行PEG化一般涉及使PEG的末端醛衍生物与多肽在还原剂存在下反应。对于还原性烷基化反应，选择的聚合物应具有单个反应性醛基团。一种例示性反应性PEG醛是具有水稳定性的聚乙二醇丙醛，或其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物，参见例如美国专利No.5,252,714。
[0177] 标志物
[0178] 此外，本发明的FGFR1 ECD可以与标志物序列融合，诸如促进融合多肽纯化的肽。标志物氨基酸序列可以是六组氨酸肽，诸如在pQE载体(Qiagen,Mississauga,Ontario,Canada)中提供的标签等等，其中许多在市场上有售。如Gentz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.86:821-824(1989)中描述的，例如，六组氨酸为融合蛋白的纯化提供便利。另一种对于纯化有用的肽标签，血凝素(HA)标签对应于自流感HA蛋白衍生的表位(Wilson et al.,Cell 37:767(1984))。可使用本文所述FGFR1 ECD对任何这些上述融合物进行工程化改造。
[0179] 寡聚化结构域融合伴侣
[0180] 在各种实施方案中，寡聚化为融合蛋白提供一些功能优势，包括但不限于多价、升高的结合强度、和不同结构域的组合功能。因而，在一些实施方案中，融合伴侣包含寡聚化结构域，例如二聚化结构域。例示性寡聚化结构域包括但不限于卷曲螺旋结构域，包括α-螺旋卷曲螺旋结构域；胶原蛋白结构域；胶原蛋白样结构域；和某些免疫球蛋白结构域。例示性卷曲螺旋多肽融合伴侣包括但不限于四连接素卷曲螺旋结构域；软骨寡聚基质蛋白的卷曲螺旋结构域；血管生成素卷曲螺旋结构域；和亮氨酸拉链结构域。例示性胶原蛋白或胶原蛋白样寡聚化结构域包括但不限于在胶原蛋白、甘露糖结合凝集素、肺表面活性蛋白A和D、脂连蛋白、纤维胶凝蛋白(ficolin)、共凝集素、巨噬细胞清除受体、和弹联蛋白中发现的那些。
[0181] 抗体Fc免疫球蛋白结构域融合伴侣
[0182] 本领域中已知可用作融合伴侣的多种Fc结构域。在一些实施方案中，融合伴侣是Fc免疫球蛋白结构域。Fc融合伴侣可以是在天然发生的抗体中发现的野生型Fc、其变体、或其片段。非限制性例示性Fc融合伴侣包括包含人IgG(例如人IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4)的铰链和CH2和CH3恒定域的Fc。另外的例示性Fc融合伴侣包括但不限于人IgA和IgM。在一些实施方案中，Fc融合伴侣包含例如IgG1中的C237S突变(见例如SEQ ID NO:8)。在一些实施方案中，Fc融合伴侣包含具有P331S突变的人IgG2的铰链、CH2、和CH3结构域，如美国专利No.6,900,292中描述的。某些例示性Fc结构域融合伴侣显示于SEQ ID NO:8至10。
[0183] 清蛋白融合伴侣和清蛋白结合分子融合伴侣
[0184] 在一些实施方案中，融合伴侣是清蛋白。例示性清蛋白包括但不限于能够延长/提高与它们融合的多肽的血清半衰期或生物利用度的人血清清蛋白(HSA)和HSA片段。在一些实施方案中，融合伴侣是清蛋白结合分子，诸如例如结合清蛋白的肽或与结合清蛋白的脂质或其它分子缀合的分子。在一些实施方案中，如例如美国专利No.6,686,179中所述来制备包含HSA的融合分子。
[0185] 例示性的融合伴侣附着
[0186] 融合伴侣可以共价或非共价附着至FGFR1 ECD的N端或C端。附着也可以发生在FGFR1 ECD内除N端或C端以外的位置，例如经由氨基酸侧链(诸如例如半胱氨酸、赖氨酸、丝氨酸、或苏氨酸的侧链)。
[0187] 在共价或非共价附着的实施方案中，在融合伴侣和FGFR1 ECD之间可包括接头。此类接头可以由至少一个氨基酸或化学模块构成。将融合伴侣共价附着至FGFR1 ECD的例示性方法包括但不限于将融合伴侣和FGFR1 ECD翻译成单个氨基酸序列及将融合伴侣化学附着至FGFR1 ECD。在将融合伴侣和FGFR1 ECD翻译成单个氨基酸序列时，在融合伴侣和FGFR1 ECD之间可包括另外的氨基酸作为接头。在一些实施方案中，基于编码接头的多核苷酸序列来选择接头，以便于将融合伴侣和/或FGFR1 ECD克隆入单个表达构建体(例如，可将含有特定限制性位点的多核苷酸放置在编码融合伴侣的多核苷酸和编码FGFR1 ECD的多核苷酸之间，其中含有限制性位点的多核苷酸编码短氨基酸接头序列)。在通过化学手段共价偶联融合伴侣和FGFR1 ECD时，偶联反应期间通常可包括各种尺寸的接头。
[0188] 将融合伴侣非共价附着至FGFR1 ECD的例示性方法包括但不限于经由结合对的附着。例示性结合对包括但不限于生物素和亲合素或链霉亲合素、抗体和它的抗原、等。
[0189] 共翻译和翻译后修饰
[0190] 本发明涵盖施用在翻译期间或翻译后，例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生、蛋白水解切割、或与抗体分子或其它细胞配体的连接而差异修饰的FGFR1 ECD和FGFR1 ECD融合分子。可通过已知技术来进行任何多种化学修饰，所述技术包括但不限于由溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶进行的特异性化学切割；NABH4；乙酰化；甲酰化；氧化；还原；和/或在衣霉素存在下的代谢合成。
[0191] 本发明所涵盖的另外的翻译后修饰包括例如N连接或O连接的碳水化合物链、对N端或C端末端的加工、化学模块对氨基酸主链的附着、对N连接或O连接的碳水化合物链的化学修饰、及原核宿主细胞表达所致N端甲硫氨酸残基的添加或删除。对FGFR1 ECD和FGFR1 ECD融合分子的各种翻译后修饰的非限制性讨论可见于例如美国专利No.7,678,890。
[0192] FGFR1 ECD和FGFR1 ECD融合分子表达和生产载体
[0193] 提供包含编码FGFR1 ECD的多核苷酸的载体。还提供包含编码FGFR1 ECD融合分子的多核苷酸的载体。此类载体包括但不限于DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体、等。
[0194] 在一些实施方案中，选择经优化用于在CHO细胞或CHO衍生细胞中表达多肽的载体。例示性的此类载体描述于例如Running Deer et al.,Biotechnol.Prog.20:880-889(2004)。
[0195] 在一些实施方案中，选择载体用于在动物(包括人)中体内表达FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子。在一些此类实施方案中，多肽的表达在以组织特异性方式发挥功能的启动子控制下。例如，肝特异性启动子描述于例如PCT公开文本WO 2006/076288。对各种表达载体的非限制性讨论可见于例如美国专利No.7,678,890。
[0196] 宿主细胞
[0197] 在各种实施方案中，FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子可以在原核细胞，诸如细菌细胞；或真核细胞，诸如真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞、和哺乳动物细胞中表达。例如，可以依照本领域中已知的规程来进行此类表达。可用来表达多肽的例示性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S和DG44细胞；及NSO细胞。在一些实施方案中，基于对FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子进行某些期望翻译后修饰的能力来选择特定真核宿主细胞。例如，在一些实施方案中，CHO细胞所生成的FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子具有比在293细胞中生成的相同多肽要高的唾液酸化水平。
[0198] 可以通过本领域中已知的任何方法将核酸导入期望宿主细胞中，所述方法包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染、等。非限制性例示性方法描述于例如Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)。可以依照本领域中已知的方法在期望宿主细胞中瞬时或稳定转染核酸。关于宿主细胞和在宿主细胞中生成多肽的方法的非限制性讨论可见于例如美国专利No.7,678,890。
[0199] 在一些实施方案中，可以依照本领域中已知的方法，在已经用编码多肽的核酸分子工程化改造或转染的动物中体内生成多肽。
[0200] FGFR1 ECD多肽的纯化
[0201] FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子可以通过本领域中已知的各种方法来纯化。此类方法包括但不限于使用亲和基质或疏水性相互作用层析。合适的亲和配体包括FGFR1 ECD或融合伴侣的任何配体。在结合FGFR1的抗体的情况中合适的亲和配体包括但不限于FGFR1自身和其片段。此外，可以使用蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、或抗体亲和柱来结合Fc融合伴侣，从而纯化FGFR1 ECD融合分子。也可以使用FGFR1 ECD的抗体来纯化FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子。疏水性相互作用层析(例如丁基或苯基柱)也可能适合纯化一些多肽。本领域中已知多种纯化多肽的方法。关于各种纯化多肽的方法的非限制性讨论可见于例如美国专利No.7,678,890。
[0202] 鉴定会受益于FGFR1 ECD和/或FGFR1 ECD融合分子的患者的方法
[0203] 在一些实施方案中，提供鉴定可受益于施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子的患有癌症的患者的方法。在一些此类实施方案中，所述方法包括确定自受试者获得的样品中至少一部分癌细胞是否包含与VEGF水平相比更高的FGF2水平。在一些实施方案中，癌症样品中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的细胞已确定具有与VEGF mRNA或蛋白质水平相比更高的FGF2 mRNA或蛋白质水平。在一些实施方案中，与VEGF水平相比更高的FGF2水平指示所述癌症对FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子的治疗响应性。在一些实施方案中，自患有或怀疑患有癌症的患者获取样品。在至少一部分癌细胞中发现与VEGF水平相比更高的FGF2水平指示患有或怀疑患有癌症的患者可受益于FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子疗法。在一些实施方案中，患者患有或怀疑患有肾癌、肝癌、成胶质细胞瘤、或间皮瘤。
[0204] 在一些实施方案中，提供鉴定可受益于施用FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂的患有癌症的患者的方法。在一些此类实施方案中，所述方法包括确定自受试者获得的样品中至少一部分癌细胞是否包含与VEGF水平相比更低的FGF2水平。在一些实施方案中，癌症样品中至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％的细胞已确定具有与VEGF mRNA或蛋白质水平相比更低的FGF2 mRNA或蛋白质水平。在一些实施方案中，自患有或怀疑患有癌症的患者获取样品。在至少一部分癌细胞中发现与VEGF水平相比更低的FGF2水平指示患有或怀疑患有癌症的患者可受益于FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂疗法。在一些实施方案中，患者患有或怀疑患有肾癌、肝癌、成胶质细胞瘤、或间皮瘤。
[0205] 在一些实施方案中，FGF2水平和/或VEGF水平由实验室测定。实验室可以是医院实验室或独立于医院的实验室。在一些实施方案中，在测定FGF2水平和/或VEGF水平后，将测定结果传达给医学专业人员。在一些实施方案中，将FGF2水平与VEGF水平比较，并将比较结果传达给医学专业人员(诸如例如“FGF2高于VEGF”、“FGF2低于VEGF”、“FGF2/VEGF>1”、“FGF2/VEGF<1”，等)。在一些实施方案中，传达结果以便确定患者是否会受益于或响应FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子疗法。在一些实施方案中，传达结果以便确定患者是否会受益于或响应FGFR1 ECD或FGFR1 ECD融合分子和至少一种抗血管发生剂疗法。在一些实施方案中，医学专业人员包括但不限于医生、护士、医院行政部分和职员、等。
[0206] 可以使用测定蛋白质水平的任何合适方法。在某些实施方案中，使用免疫组织化学(“IHC”)和染色方案来检查样品中的蛋白质水平。组织切片的免疫组织化学染色已经显示是一种评估或检测样品中蛋白质的存在的可靠方法。免疫组织化学技术一般通过显色或荧光方法，利用抗体来原位探测和显现细胞抗原。
[0207] 可以通过常规方法来固定(即保存)组织样品(参见例如“Manual ofHistological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”,3rd edition(1960)Lee G.Luna,HT(ASCP)Editor,The Blakston Division McGraw-Hill Book Company,New York；The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology(1994)Ulreka V.Mikel Editor,Armed Forces Institute of Pathology,American Registry of Pathology,Washington,D.C.)。本领域技术人员会领会，根据要对样品进行组织学染色或以其它方式进行分析的目的来确定固定剂的选择。本领域技术人员还会领会，固定的时长取决于组织样品的大小和使用的固定剂。
举例而言，可以使用中性缓冲福尔马林、布安氏固定剂(Bouin's)或低聚甲醛来固定样品。
举例而言，可以使用中性缓冲福尔马林、布安氏固定剂(Bouin's)或低聚甲醛来固定样品。
[0208] 一般来说，首先固定样品，接着经由一系列递增的酒精进行脱水，用石蜡或其它切片介质浸润且包埋以便可将组织样品切片。或者，可将组织切片且固定所得切片。举例而言，可以通过常规方法在石蜡中包埋且加工组织样品(参见例如“Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”，同上)。可使用的石蜡的实例包括但不限于Paraplast、Broloid、和Tissuemay。一旦包埋组织样品，就可以用切片机等等将样品切片(参见例如“Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”，同上)。举例而言，对于此规程，切片的厚度可以在约3微米至约5微米的范围中。一旦切片，就可以通过数种标准方法将切片粘附到载片上。载片粘附剂的实例包括但不限于硅烷、明胶、聚-L-赖氨酸等等。举例而言，可以使经石蜡包埋的切片粘附到带正电荷的载片和/或包被有聚-L-赖氨酸的载片上。
[0209] 如果已经使用石蜡作为包埋材料的话，一般将组织切片去石蜡且与水再水合。可以通过数种常规标准方法将组织切片去石蜡。例如，可以使用二甲苯和一系列逐渐递减的酒精(参见例如“Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”，同上)。或者，可以使用市售的用于去石蜡的非有机试剂，诸如Hemo-De7(CMS,Houston,Tex.)。
[0210] 在一些实施方案中，在样品制备后，可以使用IHC来分析组织切片。IHC可以与另外的技术(诸如形态学染色和/或荧光原位杂交)组合实施。可用IHC的两种通用方法；直接和间接测定法。依照第一种测定法，直接测定抗体与靶抗原的结合。此直接测定法使用经标记的试剂，诸如荧光标签或酶标记的一抗，无需进一步抗体相互作用就能显现。在一种典型的间接测定法中，未缀合的一抗与抗原结合，接着经标记的二抗与一抗结合。在二抗与酶标记物缀合的情况中，添加显色或荧光底物以便显现抗原。因为数个二抗可以与一抗上的不同表位反应，所以发生信号放大。
[0211] 用于免疫组织化学的一抗和/或二抗通常会用可检测模块来标记。多种标记物35 14 125 3 131
是可得的，一般可分组入下述范畴：(a)放射性同位素，诸如 S、C、 I、H、和 I。可以使用例如Current Protocols in Immunology,Volumes 1 and 2,Coligen et al.,Ed.Wiley-Interscience,New York,N.Y.,Pubs.(1991)中描述的技术，用放射性同位素来标记抗体，并且可以使用闪烁计数来测量放射性。(b)胶态金粒子。(c)荧光标记物，包括但不限于稀土螯合物(铕螯合物)、德克萨斯红、罗丹明、荧光素、丹酰、丽丝胺、伞形酮(umbelliferone)、藻红蛋白、藻蓝蛋白、或市售的荧光团，诸如SPECTRUM ORANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或上述任一种或多种的衍生物。可使用例如Current Protocols in Immunology(同上)中公开的技术将荧光标记物与抗体缀合。可使用荧光计来定量荧光。(d)各种酶-底物标记物是可得的且美国专利No.4,275,149提供了一些这些标记物的综述。酶一般催化显色底物的化学变化，这可使用各种技术来测量。例如，酶可催化底物的颜色变化，这可通过分光光度法来测量。或者，酶可改变底物的荧光或化学发光。上文描述了用于定量荧光变化的技术。化学发光底物通过化学反应变成电子激发的，接着可发射可测量(例如使用化学发光计)的光或将能量提供给荧光受体。酶标记物的实例包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶(诸如辣根过氧化物酶(HRPO))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶、等等。用于将酶与抗体缀合的技术描述于O'Sullivan et al.,Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay,Methods in Enzym.(ed.J.Langone and H.Van Vunakis),Academic press,New York,73:147-166(1981)。
是可得的，一般可分组入下述范畴：(a)放射性同位素，诸如 S、C、 I、H、和 I。可以使用例如Current Protocols in Immunology,Volumes 1 and 2,Coligen et al.,Ed.Wiley-Interscience,New York,N.Y.,Pubs.(1991)中描述的技术，用放射性同位素来标记抗体，并且可以使用闪烁计数来测量放射性。(b)胶态金粒子。(c)荧光标记物，包括但不限于稀土螯合物(铕螯合物)、德克萨斯红、罗丹明、荧光素、丹酰、丽丝胺、伞形酮(umbelliferone)、藻红蛋白、藻蓝蛋白、或市售的荧光团，诸如SPECTRUM ORANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或上述任一种或多种的衍生物。可使用例如Current Protocols in Immunology(同上)中公开的技术将荧光标记物与抗体缀合。可使用荧光计来定量荧光。(d)各种酶-底物标记物是可得的且美国专利No.4,275,149提供了一些这些标记物的综述。酶一般催化显色底物的化学变化，这可使用各种技术来测量。例如，酶可催化底物的颜色变化，这可通过分光光度法来测量。或者，酶可改变底物的荧光或化学发光。上文描述了用于定量荧光变化的技术。化学发光底物通过化学反应变成电子激发的，接着可发射可测量(例如使用化学发光计)的光或将能量提供给荧光受体。酶标记物的实例包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶(诸如辣根过氧化物酶(HRPO))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶、等等。用于将酶与抗体缀合的技术描述于O'Sullivan et al.,Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay,Methods in Enzym.(ed.J.Langone and H.Van Vunakis),Academic press,New York,73:147-166(1981)。
[0212] 酶-底物组合的实例包括例如：(i)辣根过氧化物酶(HRPO)与作为底物的过氧化氢酶，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的磷酸对硝基苯酯；和(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与显色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物(例如4-甲基伞形酮基-β-D-半乳糖苷酶)。
[0213] 许多其它酶-底物组合对于本领域技术人员来说是可得的。关于这些组合的一般综述参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。有时，将标记物与抗体间接缀合。本领域技术人员会知晓用于实现此缀合的各种技术。例如，可将抗体与生物素缀合，且可将上述四大范畴的标记物中的任一种与亲合素缀合，或反之亦然。生物素选择性结合亲合素，因此可以以此间接方式将标记物与抗体缀合。或者，为了实现标记物与抗体的间接缀合，将抗体与小的半抗原缀合，且将上述不同类型的标记物之一与抗半抗原抗体缀合。由此，可实现标记物与抗体的间接缀合。
[0214] 在上文讨论的样品制备规程以外，在IHC之前、期间或之后可能想要对组织切片进行进一步处理。例如，可进行表位修复方法，诸如在柠檬酸盐缓冲液中加热组织样品(参见例如Leong et al.,Appl.Immunohistochem.4(3):201(1996))。
[0215] 在任选的封闭步骤之后，在足够的时段和合适的条件下使组织切片暴露于一抗，使得一抗与组织样品中的靶蛋白质抗原结合。用于实现此结合的适宜条件可通过常规实验来确定。通过使用上文讨论的可检测标记物中的任一者来测定抗体与样品的结合程度。在一些实施方案中，标记物为酶标记物(例如HRPO)，其催化显色底物(诸如3,3'-二氨基联苯胺发色团)的化学变化。在一个实施方案中，酶标记物与特异性结合一抗的抗体缀合(例如，一抗是家兔多克隆抗体且二抗是山羊抗家兔抗体)。
[0216] 可封固如此制备的标本并盖上盖玻片。接着例如使用显微镜确定载片评估，而且可以采用本领域中常规使用的染色强度标准。
[0217] 在一些实施方案中，当使用IHC时，使用分级染色系统来确定细胞或细胞集合中的FGF2和/或VEGF水平。例如，在一些实施方案中，使用四级系统，其中各级为无染色、1+、2+、和3+，其中1+、2+、和3+分别表示递增的染色水平。在一些实施方案中，在FGF2染色处于比VEGF染色更高的等级的情况中发现与VEGF相比更高的FGF2水平。在一些实施方案中，在FGF2染色和VEGF染色处于相同的等级但组织学家确定更大面积的肿瘤具有FGF2染色较之VEGF染色的情况中发现与VEGF相比更高的FGF2水平。在一些实施方案中，在FGF2染色处于比VEGF染色更低的等级的情况中发现与VEGF相比更低的FGF2水平。在一些实施方案中，在FGF2染色和VEGF染色处于相同的等级但组织学家确定更大面积的肿瘤具有VEGF染色较之FGF2染色的情况中发现与VEGF相比更低的FGF2水平。本领域技术人员能根据特定的IHC测定法(包括特定抗体)、细胞类型、等确定指示与VEGF相比更高或更低的FGF2水平的染色水平。
[0218] 可以使用测定mRNA水平的任何合适方法。用于评估细胞中的mRNA的方法是公知的，且包括例如使用互补DNA探针的杂交测定法(诸如使用经标记的对FGF2或VEGF特异性的核糖核酸探针的原位杂交、Northern印迹、和相关技术)及各种核酸扩增测定法(诸如使用对FGF2和/或VEGF特异性的互补引物的RT-PCR及其它扩增型检测方法，诸如例如分支DNA、SISBA、TMA等等)。
[0219] 可使用Northern印迹、点印迹或PCR分析来方便地对来自哺乳动物的组织或细胞样品测定mRNA。例如，本领域中公知诸如定量PCR测定法的RT-PCR测定法。在一些实施方案中，mRNA水平是使用实时qRT-PCR定量的水平。在本发明的一些实施方案中，用于检测生物学样品中的靶mRNA的方法包括使用至少一种引物通过逆转录自样品生成cDNA；使用靶多核苷酸作为有义和反义引物扩增如此生成的cDNA，从而扩增其中的靶cDNA；并检测扩增的靶cDNA的存在。另外，此类方法可包括一个或多个容许测定生物学样品中靶mRNA的水平的步骤(例如通过同时检查“持家”基因(诸如肌动蛋白家族成员)的比较性对照mRNA序列的水平)。任选地，可测定扩增的靶cDNA的序列。
[0220] 本发明的任选方法包括通过微阵列技术检查或检测组织或细胞样品中的mRNA(诸如靶mRNA)的方案。使用核酸微阵列，将来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品逆转录并进行标记以产生cDNA探针。接着将探针与在固体支持物上固定化的核酸阵列杂交。构造阵列，使得每个阵列成员的序列和位置是知道的。经标记的探针与特定阵列成员杂交表示衍生探针的样品表达该基因。疾病组织的差异基因表达分析可提供有价值的信息。微阵列技术利用核酸杂交技术和计算技术，在单个实验内评估数以千计的基因的mRNA表达概况(关于阵列制造的讨论，参见例如2001年10月11日公布的WO 01/75166；参见例如美国专利No.5,700,637、美国专利No.5,445,934、和美国专利No.5,807,522；
Lockart,Nature Biotechnology,14:1675-1680(1996)；Cheung,V.G.et al.,Nature Genetics 21(Suppl):15-19(1999))。DNA微阵列是含有在玻璃或其它基材上直接合成或点样的基因片段的微型阵列。通常在单个阵列中呈现数以千计的基因。典型的微阵列实验涉及下述步骤：1)自分离自样品的RNA制备荧光标记的靶物，2)将经标记的靶物与微阵列杂交，3)对阵列进行清洗、染色、和扫描，4)分析扫描的图像，并5)产生基因表达概况。当前正在使用两大类DNA微阵列：寡核苷酸(通常是25至70聚物)阵列和含有自cDNA制备的PCR产物的基因表达阵列。在形成阵列时，可预先制造寡核苷酸并点样到表面上或直接合成到表面上(原位)。在一些实施方案中，DNA微阵列是一种单核苷酸多态性(SNP)微阵列，例如 SNP阵列6.0。
Lockart,Nature Biotechnology,14:1675-1680(1996)；Cheung,V.G.et al.,Nature Genetics 21(Suppl):15-19(1999))。DNA微阵列是含有在玻璃或其它基材上直接合成或点样的基因片段的微型阵列。通常在单个阵列中呈现数以千计的基因。典型的微阵列实验涉及下述步骤：1)自分离自样品的RNA制备荧光标记的靶物，2)将经标记的靶物与微阵列杂交，3)对阵列进行清洗、染色、和扫描，4)分析扫描的图像，并5)产生基因表达概况。当前正在使用两大类DNA微阵列：寡核苷酸(通常是25至70聚物)阵列和含有自cDNA制备的PCR产物的基因表达阵列。在形成阵列时，可预先制造寡核苷酸并点样到表面上或直接合成到表面上(原位)。在一些实施方案中，DNA微阵列是一种单核苷酸多态性(SNP)微阵列，例如 SNP阵列6.0。
[0221] Affymetrix 系统是一种市售的微阵列系统，其包含通过在玻璃表面上直接合成寡核苷酸而制造的阵列。探针/基因阵列：通过基于半导体的光刻法和固相化学合成技术的组合在玻璃晶片上直接合成寡核苷酸(通常为25聚物)。每个阵列含有多达
400,000种不同寡聚物且每种寡聚物存在数以百万计的拷贝。由于在阵列上的已知位置中合成寡核苷酸探针，因此可以通过Affymetrix微阵列套装软件就基因身份和相对水平来解读杂交样式和信号强度。每种基因在阵列上由一系列不同寡核苷酸探针来表示。每种探针对由完全匹配的寡核苷酸和错配的寡核苷酸组成。完全匹配的探针具有与特定基因精确互补的序列且因此测量该基因的表达。错配的探针与完全匹配的探针的不同之处在于中心碱基位置处的单碱基替代，从而妨碍靶基因转录物的结合。这有助于测定背景和非特异性杂交，它们对为完全匹配的寡聚物所测量的信号有贡献。微阵列套装软件将错配探针的杂交强度自完全匹配探针的杂交强度中减去，从而确定每种探针集的绝对或特异性强度值。
基于来自GenBank和其它核苷酸全集的当前信息来选择探针。相信这些序列能识别基因3'端的独特区域。使用基因芯片杂交炉(“旋转式”炉)一次进行多达64个阵列的杂交。射流站对探针阵列实施清洗和染色。它是完全自动化的且含有四个模块，每个模块持有一个探针阵列。每个模块经由微阵列套装软件使用预先编程的射流方案独立控制。扫描仪是一种共焦激光荧光扫描仪，它测量由与探针阵列结合的经标记cRNA发射的荧光强度。具有微阵列套装软件的计算机工作站控制射流站和扫描仪。微阵列套装软件可以使用预先编程的用于探针阵列的杂交、清洗、和染色方案来控制多达八个射流站。该软件还获取杂交强度数据并使用适宜算法将其转换成每种基因的存在/缺失呼叫。最后，该软件通过比较分析来检测各实验之间的基因表达变化，并将输出变成.txt文件格式，这可与其它软件程序一起用于进一步数据分析。
400,000种不同寡聚物且每种寡聚物存在数以百万计的拷贝。由于在阵列上的已知位置中合成寡核苷酸探针，因此可以通过Affymetrix微阵列套装软件就基因身份和相对水平来解读杂交样式和信号强度。每种基因在阵列上由一系列不同寡核苷酸探针来表示。每种探针对由完全匹配的寡核苷酸和错配的寡核苷酸组成。完全匹配的探针具有与特定基因精确互补的序列且因此测量该基因的表达。错配的探针与完全匹配的探针的不同之处在于中心碱基位置处的单碱基替代，从而妨碍靶基因转录物的结合。这有助于测定背景和非特异性杂交，它们对为完全匹配的寡聚物所测量的信号有贡献。微阵列套装软件将错配探针的杂交强度自完全匹配探针的杂交强度中减去，从而确定每种探针集的绝对或特异性强度值。
基于来自GenBank和其它核苷酸全集的当前信息来选择探针。相信这些序列能识别基因3'端的独特区域。使用基因芯片杂交炉(“旋转式”炉)一次进行多达64个阵列的杂交。射流站对探针阵列实施清洗和染色。它是完全自动化的且含有四个模块，每个模块持有一个探针阵列。每个模块经由微阵列套装软件使用预先编程的射流方案独立控制。扫描仪是一种共焦激光荧光扫描仪，它测量由与探针阵列结合的经标记cRNA发射的荧光强度。具有微阵列套装软件的计算机工作站控制射流站和扫描仪。微阵列套装软件可以使用预先编程的用于探针阵列的杂交、清洗、和染色方案来控制多达八个射流站。该软件还获取杂交强度数据并使用适宜算法将其转换成每种基因的存在/缺失呼叫。最后，该软件通过比较分析来检测各实验之间的基因表达变化，并将输出变成.txt文件格式，这可与其它软件程序一起用于进一步数据分析。
[0222] 在一些实施方案中，例如，在使用定量RT-PCR时，在FGF2和VEGF之间比较阈循环数，并且更低的阈指示更高水平的相应mRNA。作为一个非限制性实例，在一些实施方案中，如果分析FGF2 mRNA和VEGF mRNA水平且FGF2的阈循环数(Ct)为28而VEGF的Ct为30，那么FGF2处于与VEGF相比更高的水平。在各种实施方案中，可以对任何类型的定量或半定量分析方法进行类似的比较。
[0223] 在一些实施方案中，在比较之前将FGF2水平和VEGF水平二者标准化。在一些实施方案中，此类标准化可容许在不是同时和/或在同一测定法反应中测定FGF2水平和VEGF水平时将FGF2水平与VEGF水平比较。本领域技术人员能根据测定法选择合适标准化mRNA、蛋白质、或其它因子。实施例
[0224] 下文讨论的实施例旨在仅仅例示本发明，且不应认为是以任何方式限制本发明。实施例并非旨在表示下文实验是所实施的全部或仅有实验。应理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实施各种其它实施方案。已经努力确保所使用的数值(例如量、温度、等)的精确度，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指示，份数为重量份数，分子量为重量平均分子量，温度以摄氏度计，且压力为大气压或接近大气压。
[0225] 实施例1：癌细胞系中的FGF2和VEGF水平。
[0226] 使用来自Broad-Novartis癌细胞系百科全书(CCLE；www.broadinstitute.org/ccle/home)的数据评估人肝细胞癌(HCC)和肾细胞癌(RCC)细胞系中FGF2和VEGF的相对水平。CCLE是一种公众可得的数据库，提供超过1000种人癌细胞系的基因组和转录组数据。通过实施Affymetrix U133 Plus 2.0微阵列产生基因表达值，使用Robust Multi-array Average(RMA)将原始Affymetrix CEL文件转换成每个探针集的单一值，并使用分位数标准化将值标准化。对于FGF2，检查的所有癌细胞间的平均表达值为6.0，中值5.4。肾癌细胞系展现8.36的平均FGF2表达值及8.47的中值。检查已知在体内生长的RCC细胞系时，选择ACHN和Caki-1作为具有“高”FGF2水平，分别为9.79和10.67的值。
RCC细胞系Caki-2和786-0具有8.26和7.20的值，因此认为代表“低”FGF2水平。A498具有9.85的FGF2表达值，这超出这种组织类型的平均值，但是此系还展现高VEGF表达且具有<1的FGF2/VEGF比率(下文讨论)。对于肝癌细胞系，FGF2的平均和中位表达值分别为6.53和6.81。
RCC细胞系Caki-2和786-0具有8.26和7.20的值，因此认为代表“低”FGF2水平。A498具有9.85的FGF2表达值，这超出这种组织类型的平均值，但是此系还展现高VEGF表达且具有<1的FGF2/VEGF比率(下文讨论)。对于肝癌细胞系，FGF2的平均和中位表达值分别为6.53和6.81。
[0227] HCC细胞系SK-Hep-1具有9.45的FGF2值，因此认为是具有“高”FGF2水平。
[0228] 使用CCLE类似地评估VEGF的相对表达值。检查的所有癌细胞间的平均VEGF值为8.13，中值8.06。肾癌细胞系具有9.24的平均VEGF值及9.38的中值。RCC细胞系A498和786-0具有9.77和9.39的VEGF值，因此认为是具有“高”VEGF水平。RCC细胞系ACHN和Caki-1具有7.19和7.53的VEGF值，因此认为是具有“低”VEGF水平。
[0229] HCC系展现8.40的平均VEGF值及8.17的中值。HCC细胞系SK-Hep-1细胞具有7.03的VEGF值，因此认为是具有“低”VEGF水平。
[0230] 另外，我们利用CCLE表达值来计算这些RCC和HCC细胞系中FGF2对VEGF的比率。具有>1的FGF2/VEGF比率的细胞系包括RCC系ACHN和Caki-1和HCC细胞系SK-Hep-1，而具有≤1的比率的细胞系包括RCC细胞系A498、Caki-2、和786-0。
[0231] 表2和3显示每种癌细胞系中的FGF2和VEGF mRNA水平，和FGF2/VEGF水平的比率。表2中的细胞系衍生自人肾细胞癌，而表3中的细胞系衍生自人肝细胞癌。
[0232] 表2：RCC细胞系
[0233]细胞系 FGF2 VEGF FGF2/VEGF
Caki-1 10.67 7.53 1.42
ACHN 9.79 7.19 1.36
A-498 9.85 9.77 1.01
Caki-2 8.26 8.61 0.96
786-0 7.20 9.39 0.77
RCC平均 8.36 9.24 0.93
CCLE平均 6.00 8.13 0.75
Caki-1 10.67 7.53 1.42
ACHN 9.79 7.19 1.36
A-498 9.85 9.77 1.01
Caki-2 8.26 8.61 0.96
786-0 7.20 9.39 0.77
RCC平均 8.36 9.24 0.93
CCLE平均 6.00 8.13 0.75
[0234] 表3：HCC细胞系
[0235]细胞系 FGF2 VEGF FGF2/VEGF
SK-Hep-1 9.45 7.03 1.34
SNU182 9.32 5.86 1.59
HLF 9.74 7.9 1.23
Hep3B 5.17 8.33 0.62
PLC/PRF/5 4.76 7.78 0.61
HepG2 4.62 8.60 0.54
Huh7 4.19 7.83 0.53
HCC平均 6.53 8.40 0.80
CCLE平均 6.00 8.13 0.75
SK-Hep-1 9.45 7.03 1.34
SNU182 9.32 5.86 1.59
HLF 9.74 7.9 1.23
Hep3B 5.17 8.33 0.62
PLC/PRF/5 4.76 7.78 0.61
HepG2 4.62 8.60 0.54
Huh7 4.19 7.83 0.53
HCC平均 6.53 8.40 0.80
CCLE平均 6.00 8.13 0.75
[0236] 细胞系分成两组，具有>1的FGF2/VEGF比率的细胞系(在一些实施方案中，认为是“高FGF2，低VEGF”)，和具有<1的FGF2/VEGF比率的细胞系(在一些实施方案中，认为是“低FGF2，高VEGF”)。
[0237] 实施例2：FGFR1-ECD.339-Fc作为单一药剂和与帕唑帕尼组合在ACHN异种移植物模型中的施用
[0238] 自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)购买六周龄的雌性CB17SCID小鼠，并在开始研究之前使其适应1周。自ATCC(Manassas,VA；产品目录号CRL-1611)购买人透明细胞肾癌(RCC)细胞系ACHN。将细胞在完全生长培养基中培养三代以扩增用于植入。在Eagle氏极限必需培养基(EMEM)中培养ACHN细胞。培养基补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)和抗生-抗霉菌溶液。细胞于37℃在含5％CO2的增湿气氛中生长。
[0239] 当培养的细胞达到85-90％汇合时，收获细胞并以每毫升5x107个细胞在含有2+ 2+
50％基质胶(Matrigel)的冷的无Ca 和Mg 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬浮。将细胞
6
以每只小鼠每100μl 5x10个细胞皮下植入小鼠的右体侧上。细胞植入后一周两次对小
3 2
鼠监测肿瘤生长。一旦根据公式肿瘤大小(mm)＝(宽度(mm)x长度(mm))/2，ACHN肿瘤
3
达到100mm的平均大小，就挑选小鼠并随机化(n＝10)，启动处理。
50％基质胶(Matrigel)的冷的无Ca 和Mg 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬浮。将细胞
6
以每只小鼠每100μl 5x10个细胞皮下植入小鼠的右体侧上。细胞植入后一周两次对小
3 2
鼠监测肿瘤生长。一旦根据公式肿瘤大小(mm)＝(宽度(mm)x长度(mm))/2，ACHN肿瘤
3
达到100mm的平均大小，就挑选小鼠并随机化(n＝10)，启动处理。
[0240] 每周两次经腹膜内注射以15mg/kg剂量给药FGFR1-ECD.339-Fc(FP-1039)或作为阴性对照的清蛋白。每天经强饲法以100mg/kg剂量给药帕唑帕尼 媒介充3 3
当阴性对照。当肿瘤为100mm时启动FP-1039处理；随后，当肿瘤达到大约450mm 时对用FP-1039处理的肿瘤组的一半启动帕唑帕尼共处理。在疗法启动时，一周两次测量每只小鼠的肿瘤大小。使用测径器测量每个肿瘤的长度和宽度，并依照上文公式计算肿瘤大小。当
3
皮下肿瘤体积超过2000mm时或当肿瘤变得过度坏死时，对小鼠实施安乐死。
当阴性对照。当肿瘤为100mm时启动FP-1039处理；随后，当肿瘤达到大约450mm 时对用FP-1039处理的肿瘤组的一半启动帕唑帕尼共处理。在疗法启动时，一周两次测量每只小鼠的肿瘤大小。使用测径器测量每个肿瘤的长度和宽度，并依照上文公式计算肿瘤大小。当
3
皮下肿瘤体积超过2000mm时或当肿瘤变得过度坏死时，对小鼠实施安乐死。
[0241] 如果P<0.05，那么确定作为FP-1039和/或帕唑帕尼处理的后果的肿瘤体积的比较具有统计学显著性。使用计算肿瘤体积的不配对，双尾t检验分析来计算P值。
[0242] 图1显示这项实验的结果。ACHN异种移植物模型(高FGF2，低VEGF；FGF2/VEGF＝1.36；见表2)响应作为单一疗法的FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)。第63天开始的帕唑帕尼施用看来导致更大的肿瘤生长抑制。见图1A。如图1B中所
示，单独的FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)在第63天时导致51％肿瘤生长抑制(p<0.0001)。帕唑帕尼和FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)的组合看来导致比单独的FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)更大的肿瘤生长抑制，尽管该结果没有达到统计学显著性(p＝0.0552)。见图1C。这项分析证明单独的FGFR1-ECD.339-Fc在具有高FGF2和低VEGF(比率＝1.36，见表2)的ACHN异种移植物模型中显著降低肿瘤生长。
示，单独的FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)在第63天时导致51％肿瘤生长抑制(p<0.0001)。帕唑帕尼和FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)的组合看来导致比单独的FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)更大的肿瘤生长抑制，尽管该结果没有达到统计学显著性(p＝0.0552)。见图1C。这项分析证明单独的FGFR1-ECD.339-Fc在具有高FGF2和低VEGF(比率＝1.36，见表2)的ACHN异种移植物模型中显著降低肿瘤生长。
[0243] 实施例3：FGFR1-ECD.339-Fc作为单一药剂和与帕唑帕尼组合在786-0异种移植物模型中的施用
[0244] 自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)购买六周龄的雌性CB17SCID小鼠，并在开始研究之前使其适应1周。自ATCC(Manassas,VA；产品目录号CRL-1932)购买人透明细胞肾癌(RCC)细胞系786-0。将细胞在完全生长培养基中培养三代以扩增用于植入。在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)和抗生-抗霉菌溶液的RPMI-1640培养基中培养786-0。细胞于37℃在含5％CO2的增湿气氛中生长。
[0245] 当培养的细胞达到85-90％汇合时，收获细胞并以每毫升5x107个细胞在含有2+ 2+
50％基质胶(Matrigel)的冷的无Ca 和Mg 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬浮。将细胞
6
以每只小鼠每100μl 5x10个细胞皮下植入小鼠的右体侧上。细胞植入后一周两次对小
3 2
鼠监测肿瘤生长。一旦根据公式肿瘤大小(mm)＝(宽度(mm)x长度(mm))/2，786-0肿瘤
3
达到100mm的平均大小，就挑选小鼠并随机化(n＝10)，启动处理。
50％基质胶(Matrigel)的冷的无Ca 和Mg 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬浮。将细胞
6
以每只小鼠每100μl 5x10个细胞皮下植入小鼠的右体侧上。细胞植入后一周两次对小
3 2
鼠监测肿瘤生长。一旦根据公式肿瘤大小(mm)＝(宽度(mm)x长度(mm))/2，786-0肿瘤
3
达到100mm的平均大小，就挑选小鼠并随机化(n＝10)，启动处理。
[0246] 每周两次经腹膜内注射以15mg/kg剂量给药FGFR1-ECD.339-Fc(FP-1039)或作为阴性对照的清蛋白。每天经强饲法以100mg/kg剂量给药帕唑帕尼 媒介充当阴性对照。同时启动FP-1039和帕唑帕尼剂量给药。在疗法启动时，一周两次测量每只小鼠的肿瘤大小。使用测径器测量每个肿瘤的长度和宽度，并依照上文公式计算肿瘤大小。当
3
皮下肿瘤体积超过2000mm时或当肿瘤变得过度坏死时，对小鼠实施安乐死。
3
皮下肿瘤体积超过2000mm时或当肿瘤变得过度坏死时，对小鼠实施安乐死。
[0247] 如果P<0.05，那么确定作为FP-1039和/或帕唑帕尼处理的后果的肿瘤体积的比较具有统计学显著性。使用计算肿瘤体积的不配对，双尾t检验分析来计算P值。
[0248] 图2显示这项实验的结果。786-0异种移植物模型(低FGF2，高VEGF；FGF2/VEGF＝0.77；见表2)不响应作为单一疗法的FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)。见图2A和2B。相反，786-0异种移植物模型响应作为单一疗法的帕唑帕尼。见图2A-C。令人惊讶地，FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)和帕唑帕尼的组合显示比单独的帕唑帕尼更大的功效(第
86天p＝0.0046和第97天p＝0.0022)。见上文。这项分析证明单独的FGFR1-ECD.339-Fc在具有低FGF2和高VEGF(比率＝0.77，见表2)的786-0异种移植物模型中不抑制肿瘤生长，而帕唑帕尼在该模型中是有效的。然而，与帕唑帕尼组合的FGFR1-ECD.339-Fc在786-0异种移植物模型中显示甚至比单独的帕唑帕尼更大的肿瘤生长抑制。
86天p＝0.0046和第97天p＝0.0022)。见上文。这项分析证明单独的FGFR1-ECD.339-Fc在具有低FGF2和高VEGF(比率＝0.77，见表2)的786-0异种移植物模型中不抑制肿瘤生长，而帕唑帕尼在该模型中是有效的。然而，与帕唑帕尼组合的FGFR1-ECD.339-Fc在786-0异种移植物模型中显示甚至比单独的帕唑帕尼更大的肿瘤生长抑制。
[0249] 实施例4：FGFR1-ECD.339-Fc作为单一药剂和与帕唑帕尼组合在A498异种移植物模型中的施用
[0250] 自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)购买六周龄的雌性CB17SCID小鼠，并在开始研究之前使其适应1周。自ATCC(Manassas,VA；产品目录号HTB-44)购买人透明细胞肾癌(RCC)细胞系A498。将细胞在完全生长培养基中培养三代以扩增用于植入。在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)和抗生-抗霉菌溶液的Eagle氏极限必需培养基(EMEM)中培养A498细胞。细胞于37℃在含5％CO2的增湿气氛中生长。
[0251] 当培养的细胞达到85-90％汇合时，收获细胞并以每毫升5x107个细胞在含有2+ 2+
50％基质胶(Matrigel)的冷的无Ca 和Mg 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬浮。将细胞
6
以每只小鼠每100μl 5x10个细胞皮下植入小鼠的右体侧上。细胞植入后一周两次对小
3 2
鼠监测肿瘤生长。一旦根据公式肿瘤大小(mm)＝(宽度(mm)x长度(mm))/2，A498肿瘤
3
达到100mm的平均大小，就挑选小鼠并随机化(n＝10)，启动处理。
50％基质胶(Matrigel)的冷的无Ca 和Mg 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬浮。将细胞
6
以每只小鼠每100μl 5x10个细胞皮下植入小鼠的右体侧上。细胞植入后一周两次对小
3 2
鼠监测肿瘤生长。一旦根据公式肿瘤大小(mm)＝(宽度(mm)x长度(mm))/2，A498肿瘤
3
达到100mm的平均大小，就挑选小鼠并随机化(n＝10)，启动处理。
[0252] 每周两次经腹膜内注射以15mg/kg剂量给药FGFR1-ECD.339-Fc(FP-1039)或作为阴性对照的清蛋白。每天经强饲法以100mg/kg剂量给药帕唑帕尼 媒介充当阴性对照。同时启动FP-1039和帕唑帕尼剂量给药。在疗法启动时，一周两次测量每只小鼠的肿瘤大小。使用测径器测量每个肿瘤的长度和宽度，并依照上文公式计算肿瘤大小。
3
当皮下肿瘤体积超过2000mm时或当肿瘤变得过度坏死时，对小鼠实施安乐死。在第89天
3
(肿瘤细胞接种后)，将用帕唑帕尼处理的肿瘤组(平均肿瘤体积410mm)分成两组用于进一步处理和分析。一组继续接受每天单独的帕唑帕尼处理，而第二组接受每天帕唑帕尼处理以及每周两次腹膜内注射FGFR1-ECD.339-Fc。继续依照上文方法一周两次测量肿瘤。
3
当皮下肿瘤体积超过2000mm时或当肿瘤变得过度坏死时，对小鼠实施安乐死。在第89天
3
(肿瘤细胞接种后)，将用帕唑帕尼处理的肿瘤组(平均肿瘤体积410mm)分成两组用于进一步处理和分析。一组继续接受每天单独的帕唑帕尼处理，而第二组接受每天帕唑帕尼处理以及每周两次腹膜内注射FGFR1-ECD.339-Fc。继续依照上文方法一周两次测量肿瘤。
[0253] 如果P<0.05，那么确定作为FP-1039和/或帕唑帕尼处理的后果的肿瘤体积的比较具有统计学显著性。使用计算肿瘤体积的不配对，双尾t检验分析来计算P值。
[0254] 图3显示实验第一阶段的结果。A498异种移植物模型(低FGF2，高VEGF；FGF2/VEGF＝1.01；见表2)显示对作为单一疗法的FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)的很少响应。见图3A。相反，A498异种移植物模型响应作为单一疗法的帕唑帕尼。见图3A-C。令人惊讶地，FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)和帕唑帕尼的组合显示比单独的帕唑帕尼更大的功效(第53天p＝0.0045和第81天p＝0.0012)。见上文。这项分析证明单独的FGFR1-ECD.339-Fc在具有低FGF2和高VEGF(比率＝1.01，见表2)的A498异种移植物模型中不抑制肿瘤生长，而帕唑帕尼在该模型中是有效的。然而，与帕唑帕尼组合的FGFR1-ECD.339-Fc在A498异种移植物模型中显示甚至比单独的帕唑帕尼更大的肿瘤生长抑制。
[0255] 图14显示实验第二阶段的结果。通过将相对于动物再分组那天(第89天)的百分比肿瘤体积绘图来显示肿瘤大小的变化。见图14A。使用公式％肿瘤大小＝100x(体积3 3
(mm)/第89天的体积(mm))来计算每只动物的百分比肿瘤体积。如果P<0.05，那么确定作为FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)和/或帕唑帕尼处理的后果的百分比肿瘤大小的比较具有统计学显著性。使用测量肿瘤的最后那天(第110天)的计算百分比肿瘤大小的不配对，双尾t检验分析来计算P值。如图14B中所示，对肿瘤已经变成对帕唑帕尼处理有抗性的小鼠施用帕唑帕尼+FGFR1-ECD.339-Fc导致肿瘤大小相对于继续单独的帕唑帕尼处理的显著缩小。
(mm)/第89天的体积(mm))来计算每只动物的百分比肿瘤体积。如果P<0.05，那么确定作为FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)和/或帕唑帕尼处理的后果的百分比肿瘤大小的比较具有统计学显著性。使用测量肿瘤的最后那天(第110天)的计算百分比肿瘤大小的不配对，双尾t检验分析来计算P值。如图14B中所示，对肿瘤已经变成对帕唑帕尼处理有抗性的小鼠施用帕唑帕尼+FGFR1-ECD.339-Fc导致肿瘤大小相对于继续单独的帕唑帕尼处理的显著缩小。
[0256] 实施例5：FGFR1-ECD.339-Fc作为单一药剂和与帕唑帕尼组合在Caki-2异种移植物模型中的施用
[0257] 自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)购买六周龄的雌性CB17SCID小鼠，并在开始研究之前使其适应1周。自ATCC(Manassas,VA；产品目录号HTB-47)购买人透明细胞肾癌(RCC)细胞系Caki-2。将细胞在完全生长培养基中培养三代以扩增用于植入。在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)和抗生-抗霉菌溶液的McCoy氏5a改良培养基中培养Caki-2。细胞于37℃在含5％CO2的增湿气氛中生长。
[0258] 当培养的细胞达到85-90％汇合时，收获细胞并以每毫升5x107个细胞在含有2+ 2+
50％基质胶(Matrigel)的冷的无Ca 和Mg 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬浮。将细胞
6
以每只小鼠每100μl 5x10个细胞皮下植入小鼠的右体侧上。细胞植入后一周两次对小
3
鼠监测肿瘤生长。对于Caki-2肿瘤，一旦根据公式肿瘤大小(mm)＝(宽度(mm)x长度
2 3
(mm))/2，肿瘤达到200mm的平均大小，就挑选小鼠并随机化(n＝10)，启动处理。
50％基质胶(Matrigel)的冷的无Ca 和Mg 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬浮。将细胞
6
以每只小鼠每100μl 5x10个细胞皮下植入小鼠的右体侧上。细胞植入后一周两次对小
3
鼠监测肿瘤生长。对于Caki-2肿瘤，一旦根据公式肿瘤大小(mm)＝(宽度(mm)x长度
2 3
(mm))/2，肿瘤达到200mm的平均大小，就挑选小鼠并随机化(n＝10)，启动处理。
[0259] 每周两次经腹膜内注射以15mg/kg剂量给药FGFR1-ECD.339-Fc(FP-1039)或作为阴性对照的清蛋白。每天经强饲法以100mg/kg剂量给药帕唑帕尼 媒介充当阴性对照。同时启动FP-1039和帕唑帕尼剂量给药。在疗法启动时，一周两次测量每只小鼠的肿瘤大小。使用测径器测量每个肿瘤的长度和宽度，并依照上文公式计算肿瘤大小。当
3
皮下肿瘤体积超过2000mm时或当肿瘤变得过度坏死时，对小鼠实施安乐死。
3
皮下肿瘤体积超过2000mm时或当肿瘤变得过度坏死时，对小鼠实施安乐死。
[0260] 如果P<0.05，那么确定作为FP-1039和/或帕唑帕尼处理的后果的肿瘤体积的比较具有统计学显著性。使用计算肿瘤体积的不配对，双尾t检验分析来计算P值。
[0261] 图4显示这项实验的结果。Caki-2异种移植物模型(低FGF2，高VEGF；FGF2/VEGF＝0.96；见表2)显示对作为单一疗法的FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)的很少响应。见图4A。相反，Caki-2异种移植物模型显示对作为单一疗法的帕唑帕尼的强响应。见图4A和4B。在这项实验中，FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)和帕唑帕尼的组合像作为单一疗法的帕唑帕尼一样有效。见上文。这项分析证明单独的FGFR1-ECD.339-Fc在具有低FGF2和高VEGF(比率＝0.96，见表2)的Caki-2异种移植物模型中不抑制肿瘤生长，而帕唑帕尼在该模型中是有效的。与帕唑帕尼组合的FGFR1-ECD.339-Fc显示与单独的帕唑帕尼相似的抑制，这可能反映这种模型对帕唑帕尼的特别敏感性。根据2008年12月19日提交至药品评估和研究中心(Center for Drug Evaluation and Research)的帕唑帕尼新药申请(NDA)药理学/毒理学审查和评估No.22-465，CB-17SCID小鼠中的Caki-2肿瘤异种移植物在10、30、和100mg/kg帕唑帕尼分别显示90％、77％、和99％的肿瘤抑制。
[0262] 实施例6：FGFR1-ECD.339-Fc作为单一药剂和与帕唑帕尼组合在SK-Hep-1异种移植物模型中的施用
[0263] 自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)购买六周龄的雌性CB17SCID小鼠，并在开始研究之前使其适应1周。自ATCC(产品目录号HTB-52)购买人肝细胞癌(HCC)细胞系SK-Hep-1。将细胞在完全生长培养基中培养三代以扩增用于植入。在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)和抗生-抗霉菌溶液的Eagle氏极限必需培养基(EMEM)中培养SK-Hep-1细胞。细胞于37℃在含5％CO2的增湿气氛中生长。
[0264] 当培养的细胞达到85-90％汇合时，收获细胞并以每毫升5x107个细胞在含有2+ 2+
50％基质胶(Matrigel)的冷的无Ca 和Mg 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬浮。将细胞
6
以每只小鼠每100μl 5x10个细胞皮下植入小鼠的右体侧上。细胞植入后一周两次对小鼠
3 2
监测肿瘤生长。一旦根据公式肿瘤大小(mm)＝(宽度(mm)x长度(mm))/2，SK-Hep-1肿
3
瘤达到100mm的平均大小，就挑选小鼠并随机化(n＝10)，启动处理。
50％基质胶(Matrigel)的冷的无Ca 和Mg 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬浮。将细胞
6
以每只小鼠每100μl 5x10个细胞皮下植入小鼠的右体侧上。细胞植入后一周两次对小鼠
3 2
监测肿瘤生长。一旦根据公式肿瘤大小(mm)＝(宽度(mm)x长度(mm))/2，SK-Hep-1肿
3
瘤达到100mm的平均大小，就挑选小鼠并随机化(n＝10)，启动处理。
[0265] 每周两次经腹膜内注射以15mg/kg剂量给药FGFR1-ECD.339-Fc(FP-1039)或作为阴性对照的清蛋白。每天经强饲法以100mg/kg剂量给药帕唑帕尼 媒介充3 3
当阴性对照。当肿瘤为100mm时启动FP-1039处理；随后，当肿瘤达到大约550mm 时对用FP-1039处理的肿瘤组的一半启动帕唑帕尼共处理。在疗法启动时，一周两次测量每只小鼠的肿瘤大小。使用测径器测量每个肿瘤的长度和宽度，并依照上文公式计算肿瘤大小。当
3
皮下肿瘤体积超过2000mm时或当肿瘤变得过度坏死时，对小鼠实施安乐死。
当阴性对照。当肿瘤为100mm时启动FP-1039处理；随后，当肿瘤达到大约550mm 时对用FP-1039处理的肿瘤组的一半启动帕唑帕尼共处理。在疗法启动时，一周两次测量每只小鼠的肿瘤大小。使用测径器测量每个肿瘤的长度和宽度，并依照上文公式计算肿瘤大小。当
3
皮下肿瘤体积超过2000mm时或当肿瘤变得过度坏死时，对小鼠实施安乐死。
[0266] 如果P<0.05，那么确定作为FP-1039和/或帕唑帕尼处理的后果的肿瘤体积的比较具有统计学显著性。使用计算肿瘤体积的不配对，双尾t检验分析来计算P值。
[0267] 图5显示这项实验的结果。SK-Hep-1异种移植物模型(高FGF2，低VEGF；FGF2/VEGF＝1.34；见表3)响应作为单一疗法的FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)(p＝0.0076)。见图5A和5B。添加帕唑帕尼在该实验中没有显著提高肿瘤生长抑制。见图5C。这项分析证明单独的FGFR1-ECD.339-Fc在具有高FGF2和低VEGF(比率＝1.34，见表3)的SK-Hep-1异种移植物模型中抑制肿瘤生长。
[0268] 实施例7：FGFR1-ECD.339-Fc作为单一药剂在HepG2、Huh7、和Hep3B异种移植物模型中的施用
[0269] 自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)购买六周龄的雌性CB17SCID小鼠，并在开始研究之前使其适应1周。自ATCC(Manassas,VA)购买人肝细胞癌(HCC)细胞系HepG2和Hep3B，并自JCRB(日本科研生物资源中心)购买Huh7。将细胞在完全生长培养基中培养三代以扩增用于植入。在补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、和青霉素-链霉素抗生溶液的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)中培养HepG2和Hep3B细胞。在补充有10％胎牛血清(FBS)和青霉素-链霉素抗生溶液的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)中培养Huh7细胞。细胞于37℃在含5％CO2的增湿气氛中生长。
[0270] 当培养的细胞达到85-90％汇合时，收获细胞并在含有50％基质胶(Matrigel)的2+ 2+ 6
冷的无Ca 和Mg 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬浮。将细胞以每只小鼠每100μl 5x10
6
个细胞(用于HepG2和Hep3B)或1x10个细胞(用于Huh7)皮下植入小鼠的右体侧上。细胞植入后一周两次对小鼠监测肿瘤生长。
冷的无Ca 和Mg 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬浮。将细胞以每只小鼠每100μl 5x10
6
个细胞(用于HepG2和Hep3B)或1x10个细胞(用于Huh7)皮下植入小鼠的右体侧上。细胞植入后一周两次对小鼠监测肿瘤生长。
[0271] 每周两次经腹膜内注射以15mg/kg剂量给药FGFR1-ECD.339-Fc(FP-1039)或作为阴性对照的清蛋白。对于Huh7异种移植物，使用媒介作为阴性对照。对于HepG2和Hep3B，3 3
在肿瘤细胞接种后一天启动剂量给药。容许Huh7肿瘤达到90mm±20mm，此时将它们分组并启动剂量给药。在疗法启动时，一周两次测量每只小鼠的肿瘤大小。使用测径器测量每
3 2
个肿瘤的长度和宽度，并依照公式肿瘤大小(mm)＝(宽度(mm)x长度(mm))/2计算肿瘤
3 3 3
大小。当皮下肿瘤体积超过500mm(用于HepG2)、600mm(用于Hep3B)、或2000mm(用于Huh7)时，对小鼠实施安乐死。
在肿瘤细胞接种后一天启动剂量给药。容许Huh7肿瘤达到90mm±20mm，此时将它们分组并启动剂量给药。在疗法启动时，一周两次测量每只小鼠的肿瘤大小。使用测径器测量每
3 2
个肿瘤的长度和宽度，并依照公式肿瘤大小(mm)＝(宽度(mm)x长度(mm))/2计算肿瘤
3 3 3
大小。当皮下肿瘤体积超过500mm(用于HepG2)、600mm(用于Hep3B)、或2000mm(用于Huh7)时，对小鼠实施安乐死。
[0272] 如果P<0.05，那么确定作为FP-1039处理的后果的肿瘤体积的比较具有统计学显著性。使用计算肿瘤体积的不配对，双尾t检验分析来计算P值。
[0273] 图6显示这项实验的结果。在HepG2细胞、Hep3B细胞、或Huh7细胞中(它们均具有<1的FGF2/VEGF比率)使用FP-1039没有观察到单一药剂功效。见表3。
[0274] 实施例8：FGFR1-ECD.339-Fc作为单一药剂和与索拉非尼组合在SK-Hep-1异种移植物模型中的施用
[0275] 自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)购买六周龄的雌性CB17SCID小鼠，并在开始研究之前使其适应1周。自ATCC(产品目录号HTB-52)购买人肝细胞癌(HCC)细胞系SK-Hep-1。将细胞在完全生长培养基中培养三代以扩增用于植入。在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)和抗生-抗霉菌溶液的Eagle氏极限必需培养基(EMEM)中培养SK-Hep-1细胞。细胞于37℃在含5％CO2的增湿气氛中生长。
[0276] 当培养的细胞达到85-90％汇合时，收获细胞并以每毫升5x107个细胞在含有2+ 2+
50％基质胶(Matrigel)的冷的无Ca 和Mg 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬浮。将细胞
6
以每只小鼠每100μl 5x10个细胞皮下植入小鼠的右体侧上。细胞植入后一周两次对小鼠
3 2
监测肿瘤生长。一旦根据公式肿瘤大小(mm)＝(宽度(mm)x长度(mm))/2，SK-Hep-1肿
3
瘤达到100mm的平均大小，就挑选小鼠并随机化(n＝10)，启动处理。
50％基质胶(Matrigel)的冷的无Ca 和Mg 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬浮。将细胞
6
以每只小鼠每100μl 5x10个细胞皮下植入小鼠的右体侧上。细胞植入后一周两次对小鼠
3 2
监测肿瘤生长。一旦根据公式肿瘤大小(mm)＝(宽度(mm)x长度(mm))/2，SK-Hep-1肿
3
瘤达到100mm的平均大小，就挑选小鼠并随机化(n＝10)，启动处理。
[0277] 每周两次经腹膜内(IP)注射以15mg/kg剂量给药FGFR1-ECD.339-Fc(FP-1039)或作为阴性对照的清蛋白。每天经强饲法以20mg/kg剂量给药索拉非尼 每周五次。作为索拉非尼处理的对照，每天经强饲法对动物剂量给药媒介(1％DMSO/19％1:1
3
克列莫佛/乙醇/80％水)。当肿瘤为100mm时启动FP-1039处理。在疗法启动时，一周两次测量每只小鼠的肿瘤大小。使用测径器测量每个肿瘤的长度和宽度，并依照上文公式
3
计算肿瘤大小。当皮下肿瘤体积超过1000mm时、当肿瘤变得过度坏死时、或当动物健康变得受损时，对小鼠实施安乐死。
3
克列莫佛/乙醇/80％水)。当肿瘤为100mm时启动FP-1039处理。在疗法启动时，一周两次测量每只小鼠的肿瘤大小。使用测径器测量每个肿瘤的长度和宽度，并依照上文公式
3
计算肿瘤大小。当皮下肿瘤体积超过1000mm时、当肿瘤变得过度坏死时、或当动物健康变得受损时，对小鼠实施安乐死。
[0278] 如果P<0.05，那么确定作为FP-1039和/或索拉非尼处理的后果的肿瘤体积的比较具有统计学显著性。使用测量肿瘤的最后那天的计算肿瘤体积的不配对，双尾t检验分析来计算P值。
[0279] 图7显示这项实验的结果。SK-Hep-1异种移植物模型(高FGF2，低VEGF；FGF2/VEGF＝1.34；见表3)响应作为单一疗法的FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)(第61天p＝0.0036)，而且也响应作为单一药剂疗法的索拉非尼(第61天p<0.0001)。见图7A、B、和C。FGFR1-ECD.339-Fc和索拉非尼的组合显著提高肿瘤生长抑制胜过单独的索拉非尼(第
61天p＝0.0004)或单独的FGFR1-ECD.339-Fc(p＝0.001)。见上文。这项分析证明单独的FGFR1-ECD.339-Fc在具有高FGF2和低VEGF的SK-Hep-1异种移植物模型中抑制肿瘤生长，而且FGFR1-ECD.339-Fc和索拉非尼的组合具有加性效应，显著提高肿瘤生长抑制胜过单独的索拉非尼或FGFR1-ECD.339-Fc。
61天p＝0.0004)或单独的FGFR1-ECD.339-Fc(p＝0.001)。见上文。这项分析证明单独的FGFR1-ECD.339-Fc在具有高FGF2和低VEGF的SK-Hep-1异种移植物模型中抑制肿瘤生长，而且FGFR1-ECD.339-Fc和索拉非尼的组合具有加性效应，显著提高肿瘤生长抑制胜过单独的索拉非尼或FGFR1-ECD.339-Fc。
[0280] 还在HepG2异种移植物模型中测试作为单一药剂的和与索拉非尼组合的FGFR1-ECD.339-Fc。HepG2细胞具有0.54的低FGF2/VEGF比率，而且FGFR1-ECD.339-Fc作为单一药剂是无效的。见实施例7。虽然作为单一药剂的索拉非尼在HepG2异种移植物模型中抑制肿瘤生长，但是没有发现FGFR1-ECD.339-Fc和索拉非尼的组合比单独的索拉非尼更加有效。
[0281] 实施例9：FGFR1-ECD.339-Fc响应的预测因子
[0282] 使用qRT-PCR，在一组35种肿瘤细胞系和异种移植物中测定一组基因(包括FGF配体、FGF受体、FGF结合蛋白、FGF信号传导分子、及一组血管发生相关靶物)的RNA表达。使用 迷你试剂盒(Qiagen,Germany)自体外生长的细胞系或体内生长的肿瘤异种移植物提取RNA。用DNA酶I处理提取的RNA，然后使用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen,Germany)用随机六聚物引发和逆转录酶产生cDNA。使用QuantiTect引物测定法(Qiagen,Germany)，采用人GUSB对照参照QuantiTect引物测定法(Qiagen,Germany)测定人和小鼠RNA表达。使用QuantiTect SYBR绿色PCR试剂盒(Qiagen,Germany)，使用实TM
时qRT-PCR和ABI Prism ViiA 7实时PCR系统(Applied Biosystems,Foster City,CA)来定量mRNA表达水平。依照比较性Ct方法，使用人GUSB作为参照且使用市售RNA对照-(ΔCt样品-ΔCt校准物)
(Stratagene,La Jolla,CA)来计算相对基因表达定量。依照公式2 确定相
对定量。
时qRT-PCR和ABI Prism ViiA 7实时PCR系统(Applied Biosystems,Foster City,CA)来定量mRNA表达水平。依照比较性Ct方法，使用人GUSB作为参照且使用市售RNA对照-(ΔCt样品-ΔCt校准物)
(Stratagene,La Jolla,CA)来计算相对基因表达定量。依照公式2 确定相
对定量。
[0283] 此实验中使用的肿瘤细胞系和异种移植物在表4中显示。在表4中还显示了小鼠异种移植物模型中的FGFR1-ECD.339-Fc的给药进度表、百分比肿瘤生长抑制(TGI(％))和肿瘤生长抑制的统计学显著性(P值)、以及FGFR1基因在细胞系中是否扩增。
[0284] 表4：FGFR1-ECD.339-Fc在一组异种移植物模型中的抗肿瘤活性
[0285]
[0286]
[0287] 一项例示性异种移植物实验如下。对于Caki-1和MSTO-211H，在SCID小鼠(每6
组N＝10)的右体侧上皮下植入5x10个细胞。以表4中所示剂量一周两次腹膜内施用FGFR1-ECD.339-Fc或清蛋白。在肾细胞癌(RCC)Caki-1模型中，以10mg/kg一周两次施用FGFR1-ECD.339-Fc持续6周导致81％(P<0.001)肿瘤生长抑制(TGI)。在MSTO-211H间皮瘤模型中，施用FGFR1-ECD.339-Fc使肿瘤生长降低64％(P<0.0001)。在有响应的肿瘤中，如通过曲线下面积(AUC)分析评估的，FGFR1-ECD.339-Fc使肿瘤体积显著缩小。在所检查的35种模型中，在19种模型(54％)中观测到响应，抑制范围为25-96％(见表4)。
组N＝10)的右体侧上皮下植入5x10个细胞。以表4中所示剂量一周两次腹膜内施用FGFR1-ECD.339-Fc或清蛋白。在肾细胞癌(RCC)Caki-1模型中，以10mg/kg一周两次施用FGFR1-ECD.339-Fc持续6周导致81％(P<0.001)肿瘤生长抑制(TGI)。在MSTO-211H间皮瘤模型中，施用FGFR1-ECD.339-Fc使肿瘤生长降低64％(P<0.0001)。在有响应的肿瘤中，如通过曲线下面积(AUC)分析评估的，FGFR1-ECD.339-Fc使肿瘤体积显著缩小。在所检查的35种模型中，在19种模型(54％)中观测到响应，抑制范围为25-96％(见表4)。
[0288] 使用qRT-PCR在表4中的某些异种移植物模型中检查一组基因(包括FGF配体、FGF受体、FGF结合蛋白和FGF信号传导分子)的RNA表达。接着将基因表达与FGFR1-ECD.339-Fc响应关联起来以确定与抗肿瘤活性正和负相关的RNA表达签名。
[0289] 图8显示了FGFR1-ECD.339-Fc响应者和非响应者异种移植物中的(A)FGF2 mRNA(针对GUSB标准化)和(B)FGF2蛋白质表达。FGF2的表达(P＝0.03569)与FGFR1-ECD.339-Fc响应正相关。FGFR1-ECD.339-Fc响应者和非响应者异种移植物之间的FGF2的mRNA基因表达呈现高比率(247.7倍)。FGF2蛋白质水平也确认与
FGFR1-ECD.339-Fc响应相关。
FGFR1-ECD.339-Fc响应相关。
[0290] 图9显示了FGFR1-ECD.339-Fc响应者和非响应者异种移植物中的(A)VEGFA mRNA(针对GUSB标准化)和(B)VEGFA蛋白质表达。VEGFA表达(P＝0.042)与FGFR1-ECD.339-Fc响应负相关。VEGFA蛋白质水平也确认与FGFR1-ECD.339-Fc响应负相关(P＝0.0303)。
[0291] 实施例10：间皮瘤细胞系中的FGF2和VEGF水平
[0292] 自癌细胞系百科全书(CCLE；www.broadinstitute.org/ccle/home)获取并汇编12种间皮瘤细胞系的FGF2和VEGF mRNA表达水平数据。使用Affymetrix U133+2阵列推导CCLE mRNA数据。使用Robust Multi-array Average(RMA)将原始Affymetrix CEL文件转换成每个探针集的单一值，并使用分位数标准化进行标准化。参见例如Irizarry,R.A.et al.Exploration,normalization,and summaries of high density oligonucleotide array probe level data.Biostatistics 4,249-264,(2003)；Bolstad,B.M.,Irizarry,R.A.,Astrand,M.&Speed,T.P.A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias.Bioinformatics
19,185-193,(2003)。每种基因的特异性探针集ID如下：FGF2(2247_at)；VEGF(7422_at)。
在CCLE中，间皮瘤细胞系具有与其它癌细胞系相比最高的FGF2 mRNA水平之一(数据未显示)。而且，如表5中所示，在分析的12种间皮瘤细胞系中的11种中，FGF2 mRNA水平高于VEGF水平。
19,185-193,(2003)。每种基因的特异性探针集ID如下：FGF2(2247_at)；VEGF(7422_at)。
在CCLE中，间皮瘤细胞系具有与其它癌细胞系相比最高的FGF2 mRNA水平之一(数据未显示)。而且，如表5中所示，在分析的12种间皮瘤细胞系中的11种中，FGF2 mRNA水平高于VEGF水平。
[0293] 表5：来自CCLE的间皮瘤细胞系中的FGF2和VEGF水平
[0294]间皮瘤细胞系 FGF2 mRNA VEGF mRNA
MSTO-211H 10.67467 7.594727
RS5 10.60627 9.440938
ISTMES1 10.30963 7.107872
MPP89 10.12146 7.619482
NCI-H226 9.905197 7.045242
NCI-H2052 9.808463 6.856421
MSTO-211H 10.67467 7.594727
RS5 10.60627 9.440938
ISTMES1 10.30963 7.107872
MPP89 10.12146 7.619482
NCI-H226 9.905197 7.045242
NCI-H2052 9.808463 6.856421
[0295]NCI-H2452 9.446462 7.908656
JL1 9.411504 8.830768
ISTMES2 9.098945 7.419612
DM3 8.865603 7.968453
ACCMESO1 8.663109 7.583632
NCI-H28 8.01711 9.426254
JL1 9.411504 8.830768
ISTMES2 9.098945 7.419612
DM3 8.865603 7.968453
ACCMESO1 8.663109 7.583632
NCI-H28 8.01711 9.426254
[0296] 实施例11：FGFR1-ECD.339-Fc在间皮瘤肿瘤异种移植物模型中的施用6
[0297] 以5x10个细胞/小鼠给七周龄的雌性SCID小鼠(Taconic,Hudson,NY)皮下植入3
NCI-H226细胞(ATCC,Manassas,VA)，并且，当肿瘤大小达到约176-277mm时，将荷瘤小鼠随机化入4个组(n＝8/组)。一周三次(t.i.w.)以三种不同浓度(1.024、5.12或25.6mg/kg)用FGFR1-ECD.339-Fc处理小鼠，持续29天。一周两次测量肿瘤大小和体重。
NCI-H226细胞(ATCC,Manassas,VA)，并且，当肿瘤大小达到约176-277mm时，将荷瘤小鼠随机化入4个组(n＝8/组)。一周三次(t.i.w.)以三种不同浓度(1.024、5.12或25.6mg/kg)用FGFR1-ECD.339-Fc处理小鼠，持续29天。一周两次测量肿瘤大小和体重。
[0298] 如图10中所示，在以1.024mg/kg(16.2％TGI)、5.12mg/kg(56.8％TGI)和25.6mg/kg(77.8％TGI)用FGFR1-ECD.339-Fc处理的小鼠中在第29天观察到肿瘤生长抑制(TGI)。
6
6
[0299] 以5x10个细胞/小鼠给五至六周龄的雌性SCID小鼠皮下植入MSTO-211H细3
胞(ATCC,Manassas,VA)，并且，当肿瘤大小达到约150-225mm时，将荷瘤小鼠随机化入3个组(n＝10/组)。一周三次(t.i.w.)以两种不同浓度(5.12或25.6mg/kg)用
FGFR1-ECD.339-Fc处理小鼠，持续29天。一周两次测量肿瘤大小和体重。
胞(ATCC,Manassas,VA)，并且，当肿瘤大小达到约150-225mm时，将荷瘤小鼠随机化入3个组(n＝10/组)。一周三次(t.i.w.)以两种不同浓度(5.12或25.6mg/kg)用
FGFR1-ECD.339-Fc处理小鼠，持续29天。一周两次测量肿瘤大小和体重。
[0300] 如图11中所示，在以5.12mg/kg(20.3％TGI)和25.6mg/kg(50.1％TGI)用FGFR1-ECD.339-Fc处理的小鼠中在第29天观察到肿瘤生长抑制(TGI)。
[0301] 对来自NCI-H226(间皮瘤)异种移植物研究的肿瘤实施使用大鼠抗小鼠泛内皮细胞抗原抗体(MECA-32；BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)的内皮细胞免疫组织化学(IHC)染色。如上所述，一周三次(t.i.w.)用媒介(0.9％盐水)或渐增剂量的FGFR1-ECD.339-Fc(1.024、5.12、或25.6mg/kg)处理荷瘤小鼠，持续29天。在第30天收获肿瘤。通过测量血管数目/组织面积来分析MECA-32IHC染色的定量。
[0302] 如图12中所示，对于FGFR1-ECD.339-Fc处理，使用外部区域数据(A)和外部+内部区域数据集(整个肿瘤块；C)观察到剂量依赖性的且统计学显著的血管密度降低。在这项实验中，内部区域数据集没有展现显著差异(B)。
[0303] 通过IHC测量血管密度的另一种非限制性例示性方法使用识别CD31/PECAM-1的抗体。
[0304] 实施例12：FGFR1-ECD.339-Fc在HLF肿瘤异种移植物模型中的施用
[0305] 自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)购买六周龄的雌性CB17SCID小鼠，并在开始研究之前使其适应1周。自JCRB(产品目录号JCRB0405)购买人肝细胞癌(HCC)细胞系HLF。将细胞在完全生长培养基中培养三代以扩增用于植入。在补充有10％胎牛血清(FBS)和抗生-抗霉菌溶液的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)中培养HLF细胞。细胞于37℃在含5％CO2的增湿气氛中生长。7
[0306] 当培养的细胞达到85-90％汇合时，收获细胞并以每毫升2.5x10个细胞在含有2+ 2+
50％基质胶(Matrigel)的冷的无Ca 和Mg 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬浮。将细胞
6
以每只小鼠每100μl 2.5x10个细胞皮下植入小鼠的右体侧上。细胞植入后一周两次对
3 2
小鼠监测肿瘤生长。一旦根据公式肿瘤大小(mm)＝(宽度(mm)x长度(mm))/2，HLF肿瘤
3
达到100mm的平均大小，就挑选小鼠并随机化入四个处理组之一，启动剂量给药。第一批
3
肿瘤在大约2个月中达到此体积。随着它们达到大约100mm的体积，继续将荷瘤小鼠添加至体内研究(n＝8-10每组)。
50％基质胶(Matrigel)的冷的无Ca 和Mg 的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中重悬浮。将细胞
6
以每只小鼠每100μl 2.5x10个细胞皮下植入小鼠的右体侧上。细胞植入后一周两次对
3 2
小鼠监测肿瘤生长。一旦根据公式肿瘤大小(mm)＝(宽度(mm)x长度(mm))/2，HLF肿瘤
3
达到100mm的平均大小，就挑选小鼠并随机化入四个处理组之一，启动剂量给药。第一批
3
肿瘤在大约2个月中达到此体积。随着它们达到大约100mm的体积，继续将荷瘤小鼠添加至体内研究(n＝8-10每组)。
[0307] 每周两次经腹膜内(IP)注射以15mg/kg剂量给药FGFR1-ECD.339-Fc或作为阴性对照的清蛋白。每天经强饲法以20mg/kg剂量给药索拉非尼 每周五次。作为索拉非尼处理的对照，每天经强饲法对动物剂量给药媒介(1％DMSO/19％1:1克列莫佛/乙醇/80％水)。在疗法启动时，一周两次测量每只小鼠的肿瘤大小。使用测径器测量每
3
个肿瘤的长度和宽度，并依照上文公式计算肿瘤大小。当皮下肿瘤体积超过1500mm时、当肿瘤变得过度坏死时、或当动物健康变得受损时，对小鼠实施安乐死。
3
个肿瘤的长度和宽度，并依照上文公式计算肿瘤大小。当皮下肿瘤体积超过1500mm时、当肿瘤变得过度坏死时、或当动物健康变得受损时，对小鼠实施安乐死。
[0308] 如果P<0.05，那么确定作为FGFR1-ECD.339-Fc和/或索拉非尼处理的后果的肿瘤体积的比较具有统计学显著性。使用启动处理后第24天的计算肿瘤体积的不配对，双尾t检验分析来计算P值。
[0309] 图13显示这项实验的结果。HLF异种移植物模型(高FGF2，低VEGF；FGF2/VEGF＝1.23；见表3)响应作为单一疗法的FGFR1-ECD.339-Fc(“FP-1039”)(第24天p＝0.0175)，而且也响应作为单一药剂疗法的索拉非尼(第24天p＝0.0020)。见图13A和B。FGFR1-ECD.339-Fc和索拉非尼的组合显著提高肿瘤生长抑制胜过单独的索拉非尼(p＝0.0289)或单独的FGFR1-ECD.339-Fc(p＝0.0026)。见上文。这项分析证明单独的FGFR1-ECD.339-Fc在具有高FGF2和低VEGF的HLF异种移植物模型中抑制肿瘤生长，而且FGFR1-ECD.339-Fc和索拉非尼的组合显著提高肿瘤生长抑制胜过单独的索拉非尼或FGFR1-ECD.339-Fc。
[0310] 序列的表格
[0311] 下表列举本文中讨论的某些序列。除非另外指明，所示FGFR1序列无信号肽。
[0312] 序列和描述
[0313]
[0314]
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
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