本发明包括治疗哺乳动物炎症的方法，该方法包括将一种组合物 给药于哺乳动物，该组合物包括在哺乳动物中产生α-二羰基糖的酶途 径的抑制剂，该给药导致哺乳动物某一部位的α-二羰基糖的减少或消 除，该部位受到炎症的影响，因此而治疗炎症。
本发明还包括治疗哺乳动物疼痛的方法，该方法包括将一种组合 物给药于哺乳动物，该组合物包括在哺乳动物中产生α-二羰基糖的酶 途径的抑制剂，该给药导致哺乳动物某一部位的α-二羰基糖的减少或 消除，该部位受到疼痛的影响，因此而治疗疼痛。
本发明进一步包括治疗哺乳动物瘙痒的方法，该方法包括将一种 组合物给药于哺乳动物，该组合物包括在哺乳动物中产生α-二羰基糖 的酶途径的抑制剂，该给药导致哺乳动物某一部位的α-二羰基糖的减 少或消除，该部位受到瘙痒的影响，因此而治疗瘙痒。
在另一个方面中，通过局部，口服，直肠，阴道，肌内，皮下， 经皮或静脉内途径，或通过哺乳动物动物食用营养药(nutriceutical) 产品，来将组合物给药于哺乳动物。
在一个方面中，组合物包括Amadorase途径的抑制剂。在另一个 方面中，组合物包括果糖胺激酶的抑制剂。再一方面中，组合物包括α- 二羰基糖功能的抑制剂。在一个实施方案中，α-二羰基糖是3DG。在 另一个方面中，组合物包括果糖胺激酶的抑制剂和α-二羰基糖功能的 抑制剂。在另一个实施方案中，单种化合物可以作为果糖胺激酶的抑 制剂和α-二羰基糖功能的抑制剂。另一个实施方案中，果糖胺激酶的 抑制剂和α-二羰基糖功能的抑制剂是两种或多种分开的化合物。在本 发明的另一个方面中，根据本发明的组合物包括至少两种抑制剂或化 合物用于治疗。
在本发明的一个方面中，组合物用于治疗炎症。在另一个方面中， 组合物用于治疗疼痛。再一个方面中，组合物用于治疗瘙痒。在一个 方面中，组合物用于治疗炎症，疼痛或瘙痒中的至少两种病症。
在本发明的另一个方面中，组合物的给药导致哺乳动物受炎症影 响部位的3DG的降低或消除。在一个方面中，哺乳动物是人。
在本发明的一个方面中，炎症是硬皮病，湿疹，过敏症，阿尔茨 海默氏病，贫血，血管生成，主动脉瓣狭窄，动脉粥样硬化，血栓形 成，类风湿性关节炎，骨关节炎，痛风，痛风性关节炎，急性假性痛 风，急性痛风性关节炎，与癌症相关的炎症，充血性心力衰竭，膀胱 炎，纤维肌痛症，纤维化，血管球性肾炎，与胃肠疾病相关的炎症， 炎症性肠病，肾衰竭，肾小球肾炎，心肌梗塞，眼病，腮腺炎，牛皮 癣，多次灌输伤害或损伤，呼吸失调，再狭窄，脓毒性休克，内毒素 性休克，尿脓毒病，中风，手术并发症，全身性红斑狼疮(systemic lupus erthymotosus)，多形性妊娠疹，移植相关的动脉病，移植vs.宿主反应， 同种异体移植物排斥，慢性移植排斥，血管炎中的至少一种。
在一个方面中，癌症是如下的至少一种癌症，如NSCLC，卵巢癌， 胰腺癌，乳癌，结肠癌，直肠癌，肺癌，口咽癌，下咽部癌，食道癌， 胃癌，胰腺癌，肝癌，胆囊癌，胆管癌，小肠癌，尿道癌，肾癌，膀 胱癌，尿路上皮癌，女性生殖道癌，宫颈癌，子宫癌，卵巢癌，绒毛 膜癌，妊娠期滋养层疾病，男性生殖道癌，前列腺癌，精囊癌，睾丸 癌，生殖细胞肿瘤，内分泌腺癌，甲状腺癌，肾上腺癌，脑垂体腺癌， 皮肤癌，血管瘤，黑素瘤，肉瘤，骨和软组织肉瘤，Kaposi’s肉瘤，脑 肿瘤，神经肿瘤，眼睛肿瘤，脑脊膜肿瘤，星形细胞瘤，神经胶质瘤， 成胶质细胞瘤，成视网膜细胞瘤，神经瘤，成神经细胞瘤，许旺氏细 胞瘤，脑脊膜瘤，由造血性恶性肿瘤引起的实体肿瘤，以及由淋巴瘤 引起的实体肿瘤。
在一个方面中，由造血性恶性肿瘤引起的实体肿瘤选自白血病， 绿色瘤，浆细胞瘤以及蕈样肉芽肿的斑和肿瘤，和皮肤T-细胞淋巴瘤/ 白血病。
在另一个方面中，胃肠疾病选自口疮性溃疡，咽炎，食管炎，消 化性胃溃疡，牙龈炎，牙周炎，口腔粘膜炎，胃肠道粘膜炎，鼻粘膜 炎和直肠炎。
在另一个方面中，炎症性肠病选自节段性回肠炎，溃疡性结肠炎， 未确定型结肠炎，坏死性小肠结肠炎和传染性结肠炎。
在本发明的一个方面中，眼病选自结膜炎，视网膜炎和葡萄膜炎。
在另一个方面中，呼吸失调选自哮喘，单核吞噬细胞依赖性肺损 伤，特发性肺纤维化，慢性梗阻性肺病，成人呼吸窘迫综合征，镰状 细胞疾病中的急性胸部综合征，囊性纤维化。
在本发明的另一个实施方案中，疼痛是蛛网膜炎，关节炎，骨关 节炎，类风湿性关节炎，强直性脊柱炎，痛风，肌腱炎，滑囊炎坐骨 神经痛，脊椎滑脱，神经根病，烧伤疼痛，癌症疼痛，头痛，偏头痛， 群发性头痛，紧张性头痛，三叉神经痛，肌筋膜疼痛，神经病性疼痛， 与糖尿病性神经病变相关的疼痛，反射交感神经营养失调综合征，幻 肢痛，截肢手术后的疼痛，肌腱炎，疱疹后神经痛，带状疱疹相关的 疼痛，中枢疼痛综合征，外伤相关的疼痛，血管炎，与感染相关的疼 痛，皮肤肿瘤，囊肿，与多发性神经纤维瘤相关癌症相关的疼痛，与 扭伤相关的疼痛，擦伤，脱臼，骨折和由于暴露于化学物质引起的疼 痛中的至少一种。
在本发明的另一个实施方案中，瘙痒是选自皮肤瘙痒，神经性瘙 痒，神经原瘙痒、混合型瘙痒和心理性瘙痒的病症的结果。
在本发明的实施方案中，组合物进一步包括非甾族抗炎药 (NSAID)。在一个方面中，非甾族抗炎药(NSAID)选自布洛芬(2-(异 丁基苯基)-丙酸)；氨甲喋呤(N-[4-[(2，4-二氨基6-喋啶(pteridinyl)- 甲基]甲氨基]苯甲酰)-L-谷氨酸)；阿司匹林(乙酰水杨酸)；水杨酸； 苯海拉明(2-(二联苯甲氧基)-NN-二甲乙胺盐酸盐)；萘普生(2-萘醋 酸，6-甲氧基-9-甲基-，钠盐，(-))；保泰松(4-丁基-1，2-二苯基-3，5-吡 咯烷二酮(pyrazolidinedione))；舒林酸-(2)-5-氟-2-甲基-1-[[p-(甲基亚 硫酰基)苯基]亚甲基-]-1H-茚-3-醋酸；双氟尼酸(2’，4’，-二氟-4-羟基-3- 二苯基羧酸；炎痛喜康(4-羟基-2-甲基-N-2-吡啶-2H-1，2-苯并噻嗪-2- 氨甲酰1，1-二氧化物，奥昔康；消炎痛(1-(4-氯本甲酰)-5-甲氧基-2-甲 基-H-吲哚-3-醋酸)；甲氯胺苯酸钠(N-(2，6-二氯-m-甲苯基)-邻氨基苯 甲酸，钠盐，单水合物)；酮洛芬(2-(3-苯甲酰苯基)-丙酸；托美汀钠 (钠1-甲基-5-(4-甲基苯甲酰-1H-吡咯-2-醋酸钠二水合物)；双氯酚酸钠 (2-[(2，6-二氯苯基)氨基]benzeneatic acid，单钠盐)；羟氯喹硫酸盐 (2-{[4-[(7-氯-4-喹啉)氨基]苯基]乙氨基}乙醇硫酸盐(1：1)；青霉胺 (3-巯基-D-缬氨酸)；氟比洛芬([1，1-二苯基]-4-醋酸，2-氟-α甲基，(+ —.))；cetodolac(1-8-二乙基-13，4，9，四水吡喃-[3-4-13]吲哚-1-醋酸；甲 灭酸(N-(2，3-二甲苯基)邻氨基苯甲酸和盐酸苯海拉明(2-二苯基甲氧 基-N，N-二-甲乙胺盐酸盐)。
在一个方面中，果糖胺激酶抑制剂是抑制编码果糖胺激酶的基因 的转录和编码果糖胺激酶的mRNA的翻译的物质。在另一个方面中， 化合物是葡甲胺。在另一个方面中，组合物进一步包括精氨酸。在一 个方面中，治疗的结果高于单独使用葡甲胺治疗和单独使用精氨酸治 疗相加的结果。
在本发明的一个方面中，化合物选自半乳糖醇赖氨酸，3-脱氧山梨 糖醇赖氨酸，3-脱氧-3-氟-木糖醇赖氨酸，3-脱氧-3-氰基山梨糖醇赖氨 酸，3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸，山梨糖醇赖氨酸，甘露醇赖氨酸，山 梨糖醇和木糖醇。在另一个方面中，组合物包括含铜化合物。在一个 方面中，含铜化合物选自铜-水杨酸缀合物，铜-肽缀合物，铜-氨基酸 缀合物或铜盐。在另一个方面中，含铜化合物选自铜-赖氨酸缀合物或 铜-精氨酸缀合物。
在本发明的一个方面中，3DG的抑制剂螯合3DG，解毒3DG。在 一个方面中，抑制剂是N-甲基-葡糖胺-样化合物。在另一个方面中， 抑制剂包括葡甲胺。在另一个方面中，抑制剂进一步包括精氨酸。在 另一个方面中，α-二羰基糖功能的抑制剂抑制蛋白质交联。在另一个方 面中，α-二羰基糖功能的抑制剂抑制活性氧的形成。在另一个方面中， α-二羰基糖功能的抑制剂抑制凋亡。在另一个方面中，α-二羰基糖功能 的抑制剂抑制致突变性。在另一个方面中，α-二羰基糖功能的抑制剂抑 制早期糖化终产物修饰的蛋白质的形成。在另一个方面中，抑制剂是 精氨酸或其修饰衍生物。
本发明还包括治疗哺乳动物炎症的方法，该方法包括将含有哺乳 动物中α-二羰基糖抑制剂的组合物给药于哺乳动物，该给药导致哺乳 动物某一部位的α-二羰基糖功能的降低，消除或抑制，该部位受炎症 影响，因此治疗炎症。在一个方面中，组合物的给药导致哺乳动物中 受炎症影响部位的3DG功能的降低，消除或抑制。
本发明还包括治疗哺乳动物疼痛的方法，该方法包括将含有哺乳 动物中α-二羰基糖抑制剂的组合物给药于哺乳动物，该给药导致哺乳 动物某一部位的α-二羰基糖功能的降低，消除或抑制，该部位受疼痛 影响，因此治疗疼痛。在一个方面中，组合物的给药导致哺乳动物中 受疼痛影响部位的3DG功能的降低，消除或抑制。
本发明还包括治疗哺乳动物瘙痒的方法，该方法包括将含有哺乳 动物中α-二羰基糖抑制剂的组合物给药于哺乳动物，该给药导致哺乳 动物某一部位的α-二羰基糖功能的降低，消除或抑制，该部位受瘙痒 影响，因此治疗瘙痒。在一个方面中，组合物的给药导致哺乳动物中 受瘙痒影响部位的3DG功能的降低，消除或抑制。
附图说明
当结合附图阅读时，能更好地理解前面的概述以及后面本发明优 选实施方案的详述。为了说明本发明的目的，附图中显示了本发明优 选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于所示的精确安排和手段。 在附图中：
图1是描绘了导致蛋白质交联的多步骤反应中涉及的最初步骤的 略图。
图2是说明了赖氨酸恢复途径中涉及的反应的略图。果糖-赖氨酸 (FL)通过果糖胺激酶如amadorase磷酸化而形成果糖赖氨酸3-磷酸 盐(FL3P)。FL3P自发分解成赖氨酸，Pi和3DG(Brown等，U.S.专 利No.6,004,958)。
图3是表示尿液特征的图，显示了食用2克FL单个个体的3DF， 3DG和FL随着时间的变化并持续了24小时。
图4是表示7名食用2克果糖赖氨酸的志愿者尿液中随着时间3DF 排泄的图。
图5用图表比较了对照动物和用含有3％糖化蛋白的饲料喂养的实 验组中3DF和N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶(NAG)水平(Brown等)。
图6是证明了喂养对照膳食或富含糖化蛋白膳食的大鼠尿液中 3DF和3DG之间线性关系的图(Brown等，U.S.专利No.6,004,958)。
图7，包括图7A和图7B，用图表描绘了正常受试者和糖尿病患 者中尿液3DG的禁食水平，对3DF的禁食水平作图。
图8，包括图8A和图8B，描绘了说明含高水平糖化蛋白的膳食 对肾作用的显微照片图像。从喂食富含适度糖化蛋白膳食的大鼠(图 8A)和喂食正常膳食的大鼠(图8B)制备高碘酸和Schiff(PAS)染 色的肾切片。在该实验中，给非糖尿病大鼠喂食含3％糖化蛋白的膳食 8个月。这种膳食使FL及其代谢物的水平实质性地升高(在肾中>3倍)。 图8A是来自喂食糖化膳食8个月的大鼠的肾小球显微照片图像。肾小 球显示出肾小球簇节段性硬化，有硬化区与肾小囊(Bowman’s capsule) 发生粘连(左下侧)。在大约9至3点钟的位置还存在壁上皮的肾小管 组织变形。这些硬化和组织变形改变是糖尿病性肾病中观察到的病理 情况的暗示。图8B是来自食用对照膳食8个月的大鼠的图像，包括组 织学正常的肾小球。
图9是来自FL喂养后大鼠肾脏的肾小球和肾小管部分中3DG和 3DF水平的图示比较。
图10是描绘了人amadorase(果糖胺-3-激酶)的核酸序列(SEQ ID NO：1)的图像，NCBI登录号为NM_022158。染色体17上的人基因 的登录号为NT_010663。
图11是描绘人amadorase(果糖胺-3-激酶)的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的图像，NCBI登录号为NP_071441。
图12是证明了3DG对胶原蛋白交联的作用和使用精氨酸抑制 3DG诱导的交联的聚丙烯酰胺的图像。在精氨酸存在或不存在下，用 3DG处理I型胶原蛋白。将样品接受溴化氰(CNBr)消化，在16.5％SDS Tris-tricine凝胶上进行电泳，然后使用银染技术处理凝胶来观察蛋白 质。泳道1含有分子量标记标准品。泳道2和5含有CNBr消化后的 10和20μl胶原蛋白混合物。泳道3和6含有用3DG处理然后用CNBr 消化的胶原蛋白混合物，各自上样10和20μl。泳道4和7含有与5mM 3DG和10mM精氨酸一起孵育然后用CNBr消化的胶原蛋白混合物， 各自上样10和20μl。
图13是证明了人皮肤中存在amadorase/果糖胺激酶的mRNA的琼 脂糖凝胶的图像。使用RT-PCR并将公开的amadorase序列用作制备 PCR模板的基础。基于用于PCR反应的引物(参见实施例)，凝胶中 519bp片段的存在表示amadorase mRNA的存在。如基于519bp片段所 示的amadorase mRNA的存在，在肾脏(泳道1)和皮肤(泳道3)中 发现了amadorase的表达。在含有引物但没有模板的对照泳道中没有发 现519bp片段(泳道2和泳道4)。泳道5含有DNA分子量标记。
图14是DYN12(3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸)处理对皮肤弹性的 作用的图示。用DYN12(每日50mg/kg)或盐水处理糖尿病或正常大 鼠8周，然后接受皮肤弹性测试。所用的四组包括糖尿病对照(注射 盐水；实心黑条)，用DYN 12处理的糖尿病组(空心条)，正常动物 对照(注射盐水；点形条)以及用DYN 12处理的正常动物(交叉线 阴影条)。以千帕斯卡(kPA)表示数据。
图15是DYN 12(3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸)处理对皮肤弹性的 作用的图示。用DYN 12(每日50mg/kg)或盐水处理糖尿病或正常大 鼠8周，然后接受皮肤弹性测试。所用的四组包括糖尿病对照(注射 盐水；实心黑条)，用DYN 12处理的糖尿病组(空心条)，正常动物 对照(注射盐水；点形条)以及用DYN 12处理的正常动物(交叉线 阴影条)。以千帕斯卡(kPA)表示数据，并表示为每个特定测试患者 组获得的结果的平均值。对测试患者的后腿和由技术人员限制的警觉 动物取测量值。
图16是肾脏中新的代谢途径的图示。使用内源糖化蛋白或源自膳 食来源的糖化蛋白使肾脏中产生3DG的形成。通过内源途径，葡萄糖 和赖氨酸的化学结合产生糖化蛋白。或者，还可以从膳食来源获得糖 化蛋白。糖化蛋白的分解导致果糖赖氨酸的产生，其随后受到 Amadorase的作用。Amadorase，果糖胺-3-激酶，是两种途径的一部分。 Amadorase使果糖赖氨酸磷酸化，形成果糖赖氨酸-3-磷酸盐，其然后 转化成3-脱氧葡糖醛酮(3DG)，产生赖氨酸和无机磷酸盐的副产物(非 常少量的果糖赖氨酸(<5％总果糖赖氨酸)可以通过非酶途径转化成 3DG)。然后3DG通过转化解毒成3-脱氧果糖(3DF)或其可以继续来 产生活性氧(ROS)和晚期糖化终产物(advanced glycation end products) (AGE)。如图16中所示的，DYN 12(3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸)抑 制Amadorase对果糖赖氨酸的作用，而DYN 100(精氨酸)抑制3DG- 介导的ROS和AGE的产生。
图17是受活性氧(ROS)影响的病态的图示。3DG可以直接产生 ROS，或可以产生晚期糖化终产物，其继续形成ROS。然后ROS引起 图中所示的各种病态的进一步发展。
图18是根据本发明实施方案的加合物形成和加合物形成抑制的图 示。3DG可以与蛋白质上的伯氨基形成加合物。蛋白质-3DG加合物的 形成产生了席夫碱，图18中显示了该反应平衡。蛋白质-3DG席夫碱 加合物可以继续形成交联蛋白，通过形成第二种蛋白质-3DG加合物， 通过上述第一个蛋白质-3DG席夫碱加合物中涉及的3DG分子，因此 在单个蛋白质的两个伯氨基之间形成“3DG桥”(通路“A”)。或者， 这样的交联可以发生在分开的蛋白质的两个伯氨基之间，在两个分开 的蛋白质的两个伯氨基之间形成“3DG桥”，导致蛋白质分子的交联对。 可以防止第一个蛋白质-3DG席夫碱加合物继续形成如途径“A”中所 述的这样的交联蛋白。例如，可以通过亲核试剂如谷胱甘肽或青霉胺 抑制这样的蛋白质交联，如图18中通过途径“B”所示的。这样的亲 核试剂与引起形成第二个席夫碱的3DG碳原子反应，防止碳原子形成 席夫碱蛋白质-3DG加合物并因此防止蛋白质的交联。
图19是描绘了平均红斑分数的图，如通过用(i)基础霜(霜剂A)， (ii)含有葡甲胺-HCl和精氨酸的基础霜(霜剂B)处理后或(iii)没 有处理的人志愿者SLS-处理皮肤的专家分级所测定的。
图20是描绘了平均红斑分数的图，用(i)基础霜(霜剂A)，(ii) 含有葡甲胺-HCl和精氨酸的基础霜(霜剂B)处理后或(iii)没有处 理的人志愿者SLS-处理皮肤的色度测量仪所测量的。
图21是描绘了用(i)基础霜(霜剂A)，(ii)含有葡甲胺-HCl和 精氨酸的基础霜(霜剂B)处理后或(iii)没有处理的人志愿者SLS- 处理皮肤的平均经皮蒸发水损耗(TEWL)的图。
图22，包括图22A-22C，是系列图，说明了来自正常个体(图22A) 和来自患有多形性妊娠疹的人皮肤的发炎部分(图22B-C)的薄切片。 图22A-B是用3DG-咪唑啉酮的单克隆抗体，接着荧光二抗，染色，图 22C是用苏木精和曙红染色。

本发明总地涉及治疗有害病症的组合物和方法，涉及抑制受影响 组织中的α-二羰基糖如3DG的产生或影响和/或从受影响组织中除去 糖。这是因为现在已经发现，如本文中别处更详细描述的，有害病症 的潜在病因因素的去除导致有害病症的缓解。这样的有害病症，包括 但不限于，炎症，疼痛和瘙痒。
本发明还涉及在此第一次列出的新的发现，包括α-二羰基糖形成 的抑制剂和α-二羰基糖功能或效果的抑制剂的组合物，一起在α-二羰 基糖相关病症的缓解中呈现协同效果，如与包括任一种单独类型的抑 制剂的组合物相比较。一个特别有利的组合是葡甲胺和精氨酸的组合， 用于治疗α-二羰基糖相关的病症。
定义
除非另外定义，本文中所用的所有技术和科学术语具有本发明所 属领域技术人员通常理解的相同含义。尽管可以将与本文所述那些相 似或相等的任何方法和材料用于实施或测试本发明，但是在此描述了 优选的方法和材料。
如本文中所用的，以下每个术语具有该部分中与其相关的意思。
在此所用的冠词“a”和“an”指的是一种或多于一种(即，至少 一种)的物品的语法对象。例如，“一个要素”意思是一个要素或多于 一个要素。
如在此所用的术语“3DG的累积”或“α-二羰基糖的累积”指的 是3DG和/或α-二羰基糖的水平随着时间的可测量增加。
如在此所用的“α-二羰基糖”，指的是一个化合物家族，包括3-脱 氧葡糖醛酮，乙二醛，甲基乙二醛和葡糖醛酮。
如在此所用的“与α-二羰基糖相关的皮肤起皱，老化，疾病或失 调的参数”，指的是在此所述的生物标记，包括3DG水平，3DF水平， 果糖胺激酶水平，蛋白质交联以及与α-二羰基糖相关的皮肤起皱，老 化，疾病或失调的其他标记或参数。
如在此所用的“3-脱氧葡糖醛酮”或“3DG”，指的是1，2-二羰基 -3-脱氧糖(也称为3-脱氧己糖醛酮)，其可以通过酶途径形成或通过非 酶途径形成。对于本发明的目的，术语3-脱氧葡糖醛酮是可以通过包 括图1中所述的非酶途径和图2中所述的导致FL3P分解的酶途径的途 径来形成的α-二羰基糖。3DG的另一种来源是膳食。3DG是α-二羰基 糖家族的成员，也称为2-氧代醛类。
如在此所用的“3DG相关的”或“3DG有关的”疾病或失调，指 的是由3DG引起或相关的病症，病症或失调，包括与提高的3DG合 成，产生，形成和累积相关的缺陷以及由3DG介导引起的或与3DG 降低的降解，解毒，结合和清除水平相关的那些缺陷。
化合物的“3DG抑制量”或“α-二羰基抑制量”指的是足以抑制 目标功能或过程的化合物含量，如3DG或另一种α-二羰基糖的合成， 形成累积和/或功能。
“3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸(3-O-Me-山梨糖醇赖氨酸)”，是果糖 胺激酶的抑制剂，如在此所述的。可以与术语“DYN 12”相互交替使 用。
如在此所用的，“缓解疾病或失调症状”，意思是降低症状的严重 程度。
如在此所用的术语“AGE-蛋白质”(后期糖化终产物修饰的蛋白 质)，指的是糖和蛋白质之间的反应产物(Brownlee，1992，Diabetes Care，15：1835；Niwa等，1995，Nephron，69：438)。例如，蛋白质 赖氨酸残基和葡萄糖之间的反应，其没有停止于果糖-赖氨酸(FL)的 形成。FL可以接受多次脱水和重排反应来产生非酶3DG，其再次与游 离氨基反应，导致所涉及蛋白质的交联和褐变。AGE还包括3DG与其 它化合物如脂质和核酸反应形成的产物。
如在此所用的“Amadorase”，指的是引起3-DG产生的果糖胺激酶。 更具体地，指的是在另外提供高能磷酸盐来源时，可以将FL酶转化成 FL3P的蛋白质，如上所定义的。
如在此所用的术语“Amadori产物”，指的是酮胺，如但不限于， 果糖赖氨酸，包括葡萄糖与含赖氨酸蛋白质的ε-NH2基团相互反应后 的重排产物。
如在此所用的，“氨基酸”由其全名，相应的三字母代码或相应的 一字母代码所表示，如下表中所示：
全名               三字母代码                一字母代码
天冬氨酸           Asp                       D
谷氨酸             Glu                       E
赖氨酸             Lys                       K
精氨酸             Arg                       R
组氨酸             His                       H
酪氨酸            Tyr            Y
半胱氨酸          Cys            C
天冬酰胺          Asn            N
谷氨酰胺          Gln            Q
丝氨酸            Ser            S
苏氨酸            Thr            T
甘氨酸            Gly            G
丙氨酸            Ala            A
缬氨酸            Val            V
亮氨酸            Leu            L
异亮氨酸          Ile            I
甲硫氨酸          Met            M
脯氨酸            Pro            P
苯丙氨酸          Phe            F
色氨酸            Trp            W
术语“结合”指的是分子与另一个分子的粘合，如但不限于，酶 与底物，配体与受体，抗体与抗原，蛋白质的DNA结合结构域与DNA， 以及DNA或RNA链与互补链。
如在此所用的“结合伴侣”指的是能够结合另一个分子的分子。
如在此所用的“生物样品”指的是从活的生物体获得的样品，包 括皮肤，毛发，组织，血液，血浆，细胞，汗液和尿液。
如在此所用的术语“清除”指的是除去化合物或分子的生理过程， 如通过扩散，脱落，通过血流的去除和尿液的排泄，或通过其他汗液 或其他流体。
基因的“编码区”由基因编码链的核酸残基和基因非编码链的核 酸残基构成，其各自与通过基因转录产生的mRNA分子的编码区同源 或互补。
如在此所用的“互补”指的是两个核酸例如两个DNA分子之间亚 基序列互补的广义概念。当两个分子中的核苷酸位置由通常能够彼此 碱基配对的核苷酸占据时，那么认为核酸在该位置是彼此互补的。因 此，当每个分子中显著量(至少50％)的相应位置由通常彼此碱基配 对的核苷酸占据时(例如A：T和G：C配对)，两个核酸是彼此互补 的。因此，如果第二个片段的相应残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，已知第 一个核酸片段的腺嘌呤残基能够与第一个片段反平行的第二个核酸片 段的残基形成特异性氢键(“碱基配对”)。相似地，如果第二个片段的 残基是鸟嘌呤，已知第一个核酸链的胞嘧啶残基能够与第一链反平行 的第二个核酸链的残基碱基配对。如果两个片段以反平行方式排列时， 核酸的第一个片段与相同或不同核酸的第二个片段互补，第一个片段 的至少一个核苷酸残基能够与第二个片段的残基碱基配对。优选，第 一个片段包括第一个部分，第二个片段包括第二个部分，借此，当第 一个和第二个部分以反平行方式排列时，第一部分的至少约50％，优 选至少约75％，至少约90％，或至少约95％的核苷酸残基能够与第二 部分的核苷酸残基碱基配对。更优选，第一部分的全部核苷酸残基能 够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。
如在此所用的“化合物”，指的是任何类型的物质或试剂，通常认 为是药物或用作药物的候选物，以及上述的组合物和混合物，或化合 物的修饰形式或衍生物。
如在此所用的，术语“保守改变”或“保守置换”指的是氨基酸 残基由另一个生物上相似残基的替代。保守改变或置换不能显著改变 肽链的形状。保守改变或置换的实例，包括一个疏水残基如异亮氨酸， 缬氨酸，亮氨酸或丙氨酸取代另一个，或一个带电荷的氨基酸取代另 一个，如精氨酸替代赖氨酸，谷苷酸替代天冬氨酸，或谷氨酰胺替代 天冬酰胺等。
3DG的“解毒”指的是3DG分解或转化成使其不能执行正常功能 的形式。可以通过任何组合物或方法来引起或刺激解毒，包括“药理 解毒”，或可以引起3DG解毒的代谢途径。
“3DG”或其他α-二羰基糖的“药理解毒”指的是化合物结合或 修饰3DG的过程，其随后导致其失活或通过代谢过程去除，如但不限 于排泄。
“疾病”是动物不能维持体内平衡的动物健康状态，并且其中如 果疾病不能得到缓解，那么动物的健康将持续恶化。如在此所用的， 正常老化包括为疾病。
动物中的“失调”是动物能够维持体内平衡但其中动物的健康状 况不如该失调不存在时的理想的动物健康状态。如果不进行治疗，失 调不必定进一步降低动物的健康状况。
如在此所用的，术语“结构域”指的是具有相同理化特征的分子 或结构的一部分，如但不限于，疏水性，极性，球形和螺旋结构或特 征，如配体结合，信号转导，细胞渗透等。结合结构域的特异性实例 包括，但不限于，DNA结合结构域和ATP结合结构域。
化合物的“有效量”或“治疗有效量”是足以给给予化合物的患 者提供有益效果的化合物量，或在化妆品中给予提供治疗效果外观的 化合物量。
如在此所用的，术语“效应物结构域”指的是能够与细胞质中能 够调节生化途径的效应物分子，化学或结构直接相互作用的结构域。
“编码”指的是多核苷酸如基因，cDNA或mRNA中核苷酸特定 序列的内在特征，来作为用于合成生物过程中其他聚合物和大分子的 模板，具有限定的核苷酸序列(即，rRNA，tRNA和mRNA)或限定 的氨基酸序列和由此引起的生物特征。因此，如果对应于该基因的 mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因 编码该蛋白质。编码链(与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的 核苷酸序列)和非编码链(用作基因或cDNA的转录模板)均可以称 为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。除非另外指出，“编码氨 基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并编码相同氨基酸序列 的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包括内含子。
如在此所用的，术语“浮动的”，指的是取代基与环结构连接的键， 使得取代基可以在任何可用的碳连接位置上与环结构连接。“固定的” 键指的是取代基连接在特定的位置上。
术语“3DG的形成”指的是不一定通过合成途径形成的3DG，但 可以通过如自发或诱导的前体分解这样的途径来形成。
如在此所用的，应用于蛋白质或肽的术语“片段”，通常为至少约 3-15个氨基酸长，至少约15-25个氨基酸，至少约25-50个氨基酸长， 至少约50-75个氨基酸长，至少约75-100个氨基酸长，和高于100个 氨基酸长。
如在此所用的，应用于核酸的术语“片段”，通常为至少20个核 苷酸长，特别地，至少约50个核苷酸长，更常见为，约50至约100 个核苷酸，优选，至少约100至约200个核苷酸，再更优选，至少约 300至约350，在更优选，至少约350个核苷酸至约500个核苷酸，再 更优选，至少约500至约600，再更优选，至少约600个核苷酸至约 620个核苷酸，再更优选，至少约620至约650，最优选，核酸片段高 于约650个核苷酸长。
如在此所用的术语“果糖-赖氨酸”(FL)表示任何糖化的赖氨酸， 不管是引入蛋白质/肽或是通过蛋白酶消化从蛋白质/肽释放出来。该术 语并非特别限于通常称作果糖-赖氨酸的化学结构，据报道其由蛋白质 的赖氨酸残基与葡萄糖的反应形成。如上所述，赖氨酸氨基可以与各 种糖反应。实际上，一篇报道表明葡萄糖是所测试的一组十六种(16) 不同糖中反应性最低的糖(Bunn等，Science，213：222(1981))。因 此，无论在本说明书何处提及术语果糖-赖氨酸，和所有其他糖的缩合 产物一样，无论是否为天然出现的，均包括与葡萄糖类似的由半乳糖 和赖氨酸形成的塔格糖-赖氨酸。从本说明书中可以理解蛋白质-赖氨酸 残基与糖之间的反应涉及多个反应步骤。该反应序列中的最后步骤涉 及蛋白质的交联和称为AGE-蛋白质的多聚体物质的产生，其中一些是 荧光的。一旦AGE蛋白质形成，则这类AGE-蛋白质的蛋白酶水解消 化不会产生与糖分子共价连接的赖氨酸。因此，这些物质不包括在如 在此所用的术语“果糖-赖氨酸”的含义内。
如在此所用的术语“果糖-赖氨酸-3-磷酸盐”，指的是通过使高能 磷酸基团从ATP酶转移至FL而形成的化合物。如在此所用的术语果 糖-赖氨酸-3-磷酸(FL3P)意思是包括可以酶形成的所有磷酸化的果糖 -赖氨酸部分，无论是游离的或是结合蛋白质的。
如在此所用的“果糖-赖氨酸-3-磷酸盐激酶”(FL3K)，指的是一 种或多种蛋白质，如amadorase，其在提供高能磷酸来源时可以将FL 酶转化成FL3P，如在此所述的。术语“果糖-赖氨酸激酶(FLK)”和 “amadorase”可以交替使用。
如在此所用的术语“FL3P赖氨酸恢复途径”指的是存在于人皮肤 和肾脏以及其他可能的组织中的赖氨酸恢复途径，其将未修饰的赖氨 酸再生为游离氨基酸或引入多肽链中。
如在此所用的术语“糖化膳食”指的是任何给予的其中一定百分 比的正常蛋白质由糖化蛋白替代的膳食。表述“糖化膳食”和“糖化 蛋白质膳食”在此可以交替使用。
如在此所用的“糖化赖氨酸残基”指的是通过还原糖和含赖氨酸 蛋白质的反应产生的稳定加合物的修饰赖氨酸残基。
如对带正电荷的氨基酸预期的那样，大部分蛋白质赖氨酸残基位 于蛋白质的表面上。因此，接触血清或其他生物学流体的蛋白质上的 赖氨酸残基可以自由地与溶液中的糖分子反应。该反应以多阶段发生。 起始阶段包括在赖氨酸的游离氨基和糖酮基之间形成席夫碱。这最初 的产物然后经受Amadori重排，产生稳定的酮胺化合物。
这一系列反应可以与各种糖进行。当所涉及的糖是葡萄糖时，最 初的席夫碱产物包括葡萄糖C-1上的醛部分与赖氨酸ε-氨基之间形成 的亚胺。Amadori重排将导致与果糖的C-1碳偶联的赖氨酸的形成，1- 脱氧-1-(ε-氨基赖氨酸)-果糖，在此称为果糖-赖氨酸或FL。将与其他醛 糖发生相似的反应，例如半乳糖和核糖(Dills，1993，Am.J.Clin.Nutr. 58：S779)。对于本发明的目的，任何还原糖和蛋白质赖氨酸的ε-氨基 残基反应的早期产物包括在糖化赖氨酸残基的含义内，与修饰糖分子 的确切结构无关。
如在此所用的“同源”指的是两个多聚分子之间的亚基序列相似 性，例如，两个核酸分子之间，例如，两个DNA分子或两个RNA分 子之间，或两个多肽分子之间。当两个分子的亚基位置由相同的单体 亚基占据时，例如，两个DNA分子中的位置由腺嘌呤占据时，则它们 在该位置上是同源的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数目 的直接函数，例如，如果两个化合物序列上的半数(例如长度为10个 亚基单位中的5个位置)位置同源，那么两个序列为50％同源，如果 90％的位置(例如10个位置中9个)匹配或同源，那么两个序列具有 90％同源性。例如，DNA序列3’ATTGCC5’和3’TATGGC具有50％的 同源性。
如在此所用的，“同源”或“同源性”与“同一性”同义。可以使 用数学算法确定两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性或同源性百分 比。例如，可用于比较两个序列的数学算法为Karlin和Altschul的算 法(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268)，在Karlin和Altschul (1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877)中得到改进。将该 算法引入Altschul等的NBLAST和XBLAST程序中(1990，J.Mol.Biol. 215：403-410)，并且可以在例如国家生物技术信息中心(NCBI)的网 址上得到。为了获得与本文所述的核酸同源的核苷酸序列，可以使用 NBLAST程序(在NCBI网址命名为“blastn”)进行BLAST核苷酸检 索，使用以下参数：缺口罚分＝5；缺口延伸罚分＝2；错配罚分＝3；匹 配得分＝1；期望值10.0；字符大小＝11。为了获得与本文中所述的蛋白 质分子同源的氨基酸序列，可以使用XBLAST程序(在NCBI网址命 名为“blastn”)或NCBI“blastp”程序进行BLAST蛋白质检索，使用 以下参数：期望值10.0，BLOSUM 62得分矩阵。为了获得用于比较目 的的带缺口的比对，可以如Altschul等所述使用缺口BLAST(1997， Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。或者，可以将PSI-Blast或PHI-Blast 用于重复进行检索，检测分子(Id.)之间的远缘相关性和具有相同模 式的分子之间的相关性。使用BLAST，缺口BLAST，PSI-Blast和 PHI-Blast程序时，可以使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST) 的默认参数。
可以使用与上述那些相似的技术来测定两个序列之间的同一性百 分比，允许或不允许缺口。在计算同一性百分比中，通常计数确切的 匹配。如在此所用的术语“3DG的诱导”或“诱导3DG”，指的是启 动或刺激导致3DG合成，产生或形成的途径或事件或提高其水平或刺 激3DG功能增强的方法或方式。相似地，短语“α-二羰基糖的诱导”， 指的是诱导α-二羰基糖家族的成员，包括3DG，乙二醛，甲基乙二醛 和葡糖醛酮。
如在此描述的术语“抑制3DG”指的是抑制3DG合成、产生、形 成、累积或功能的任何方法或技术，以及诱导或刺激3DG合成、形成、 累积或功能的抑制的方法。其还指可以调节3DG功能或诱导的任何代 谢途径。该术语还可以指用于通过脱毒3DG而抑制3DG功能或用于 引起3DG清除的组合物或方法。抑制可以是直接的或间接的。诱导指 诱导3DG的合成或指诱导功能。相似地，短语“抑制α-二羰基糖”指 抑制α-二羰基糖家族的成员，该成员包括3DG，乙二醛，甲基乙二醛 和葡糖醛酮。
如在此所用的术语“抑制3DG的累积”指的是使用降低3DG合 成，提高降解或提高清除的任何组合物或方法，使得结果是降低检测 或治疗的组织中的3DG水平或3DG功能，与未使用组合物或方法处 理的组织中的水平相比较。相似地，短语“抑制α-二羰基糖的累积” 指的是抑制α-二羰基糖家族成员的累积，包括3DG，乙二醛，甲基乙 二醛和葡糖醛酮，及其中间产物。
如在此所用的“说明材料”包括可以用于传达本发明肽在缓解本 文中所述各种疾病或失调的试剂盒中的应用的出版物，录音，图表或 任意其他表达介质。任何或可替换的，说明材料可以描述一种或多种 缓解哺乳动物细胞或组织中的疾病或失调的方法。例如，可以将本发 明试剂盒的说明材料粘贴在含有本发明鉴定的化合物的容器上或随含 有所鉴定化合物的容器一起运送。或者，可以将说明材料与本发明的 容器分开运送以便接受者可以协调使用所述说明材料和化合物。
“分离的核酸”指的是与在天然状态下两侧的序列分离的核酸区 段或片段，例如，从与该片段正常相邻的序列，例如与天然出现在所 在基因组中的片段相邻的序列中取出的DNA片段。该术语还用来表示 天然伴随该核酸的其他成分中实质上纯化出来的核酸，例如细胞中天 然伴随的RNA或DNA或蛋白质。因此该术语包括，例如，合并入载 体，自主复制质粒或病毒、或者导入原核细胞或真核细胞的基因组DNA 或作为不依赖于其他序列的单独分子(例如作为PCR或限制酶消化产 生的cDNA或基因组或cDNA片段)的重组DNA。还包括属于编码其 他多肽序列的杂合基因中一部分的重组DNA。如在此所用的“修饰的” 化合物指的是化合物的修饰产物或衍生物，可以是化学修饰产物，如 通过化学方式改变化合物以增加或改变其功能性能力或活性。
术语“诱变性”指的是化合物诱导或增加突变频率的能力。术语 “核酸”通常指的是的大的核苷酸。
术语“寡核苷酸”通常指的是短的多核苷酸，通常不超过50个核 苷酸。可以理解的是由DNA序列(即A，T，G，C)表示核苷酸序列 时，还包括RNA序列(即，A，U，G，C)，其中“U”取代了“T”。
术语“肽”通常指的是短的多肽。
如在此使用的“渗透增强”和“渗透促进剂”涉及使难以透入皮 肤的药理活性剂的皮肤渗透性增加，从而例如增加药物通过皮肤透入 并进入血流的过程和所添加的物质。“渗透促进剂”和“吸收促进剂” 可以交替使用。
如在此所用的，术语“药物学上可接受的载体”指的是与合适的 化合物或衍生物混合并且在混合后可以用于将合适的化合物给予患者 的化学组合物。
如在此所用的，术语“生理学上可接受的”酯或盐意思是与药物 组合物的任何其他成分相容的活性成分的酯或盐形式，其对给药组合 物的患者是无害的。
“多肽”指的是由氨基酸残基构成的聚合物，涉及天然产生结构 变体，及其通过肽键连接的合成的非天然产生类似物，涉及天然产生 结构变体，及其合成的非天然产生类似物。
“多核苷酸”意思是核酸的单链或平行和反平行链。因此，多核 苷酸可以是单链或双链核酸。
“引物”指的是能够与指定的多核苷酸模板特异性杂交并提供用 于合成互补多核苷酸的起点的多核苷酸。将多核苷酸引物置于诱导合 成的条件下，即在核苷酸，互补多核苷酸模板，用于聚合的试剂如DNA 聚合酶的存在下，发生这样的合成。引物通常是单链的，但也可以是 双链的。引物通常是脱氧核糖核酸，而各种合成和天然产生的引物可 用于许多应用。引物与设计来与其杂交的模板互补，以便用作合成起 始位点，但不需要反映出模板的确切序列。在这样的情况中，引物与 模板的特异性杂交取决于杂交条件的严格性。例如，可以用化学发光， 放射性或荧光部分标记引物并用作可检测部分。
如在此所用的，术语“启动子/调节调控序列”意思是可操作连接 到启动子/调控序列的基因产物的表达需要的核酸序列。在一些情况中， 该序列可以为核心启动子序列，而在其他情况中，该序列还可以包括 基因产物表达需要的增强子序列和其他调控序列。例如，启动子/调控 序列可以是以组织特异性方式表达基因产物的序列。
“组成型”启动子是在细胞中以恒定方式驱动与其可操作连接的 基因的表达的启动子。例如，认为驱动细胞管家基因表达的启动子是 组成型启动子。
“诱导型”启动子是与编码或确定基因产物的多核苷酸可操作连 接时，基本上只在细胞中存在对应于启动子的诱导剂时，引起活细胞 中基因产物产生的核苷酸序列。
“组织特异性”启动子是与编码或确定基因产物的多核苷酸可操 作连接时，基本上只在如果细胞是对应于启动子的组织类型的细胞时， 引起活细胞中基因产物产生的核苷酸序列。
“预防性”治疗是对未显示出疾病的信号或只呈现出疾病的早期 信号的患者给予的治疗，目的在于降低与疾病相关的病理状况发展的 风险。
术语“蛋白质”通常指的是大的多肽。
活性氧：体内产生的各种有害形式的氧；单态氧，超氧化物自由 基，过氧化氢和羟基自由基都可以导致组织损害。用于这些和相似的 氧相关物质的统称术语为“活性氧”(ROS)。该术语还包括AGE内在 化至细胞中形成的ROS和由此形成的ROS。
如在此所用的“除去3-脱氧葡糖醛酮”指的是任何组合物和方法 的应用与组合物不存在下的3DG水平或功能性3DG水平相比较，导 致3-脱氧葡糖醛酮(3DG)水平降低或功能性3DG水平降低。较低水 平的3DG可来自于其降低的合成或形成，增加的降解、提高的清除或 其任何组合。较低的功能性3DG的水平可能因修饰3DG分子而使其 在糖化过程中的效率降低所致或可能因3DG与另一种阻断或抑制3DG 起作用的能力的分子相结合所致。降低3DG的水平还可能因3DG清 除和尿中排泄增加所致。该术语还可以与“抑制3DG累积”交替使用。 相似地，术语“除去α-二羰基糖类”指的是除去α-二羰基糖家族中的 成员，包括3DG，乙二醛，甲基乙二醛和葡糖醛酮。
此外，术语糖化赖氨酸残基，糖化蛋白和糖基化蛋白质或赖氨酸 残基在本文中可以交替使用，与现有技术中的现行用法一致，其中公 认这些术语可以交替使用。
如在此所用的术语“皮肤”指的是皮肤的常用定义，例如表皮和 真皮以及细胞、腺体、粘膜和包括皮肤的结缔组织。
如在此所用的术语“标准品”指的是用于比较的某些产品。例如， 可以是在给予测试化合物时给予并用于比较结果的已知标准试剂或化 合物，或可以是在测定试剂或化合物对参数或功能的影响时为获得对 照值而测定的标准参数或功能。“标准品”还可以指“内部标准”，如 在测定目标标记前处理样品或使其纯化或提取步骤时以已知量加入到 样品中并用于测定如纯化或回收率这类参数的试剂或化合物。内部标 准通常为，但不限于，纯化的标记，如由放射性同位素标记，使其区 别于样品中的内源性物质。
如在此使用的“易感测试动物”指的是实验室动物品系，其由于 例如存在特定的遗传突变，对选择的疾病或病症如糖尿病、癌症等具 有更高的易感性。
如在此所用的“3DG的合成”指的是3DG的形成或产生。3DG可 以基于酶依赖性途径或非酶依赖性途径而形成。相似地，短语“α-二羰 基糖的合成”，指的是α-二羰基糖家族成员的合成或自发形成，如在此 所述的α-二羰基糖的家族包括3DG、乙二醛、甲基乙二醛和葡糖醛酮 以及加合物。
“合成肽或多肽”意思是非天然产生的肽或多肽。例如，可以使 用自动化多肽合成仪来合成合成的肽或多肽。本领域技术人员了解各 种固相肽合成方法。
“治疗性”处理是对呈现出病理信号的患者给予的治疗，目的在 于减少或消除这些信号。
“经皮”传送指的是经皮(或“由皮”)和跨粘膜给药，即，使药 物通过皮肤或粘膜组织传递并进入血流。经皮还指以皮肤作为入口， 用于通过局部施用的药物或化合物的给药。
如在此所用的术语“局部施用”指的是对表面如皮肤给药。该术 语可以与“皮肤施用”交替使用。
如在此所用的术语“治疗”指的是减少病人或患者经历的症状的 频率或给予药剂或化合物来降低经历的症状的频率。
如在此所用的“治疗疾病或失调”指的是减少患者经历疾病或失 调的症状的频率。疾病和失调在本文中可交替使用。
如在此所用的，术语“野生型”指的是具有天然产生的并且与突 变体基因型和表型相对比的大部分种类成员特征性的基因型和表型。
因此，期望发现本发明的组合物和方法在治疗各种炎症起作用的 疾病和失调中的实用性。其中这些疾病和失调包括，过敏症、阿尔茨 海默氏病、贫血、血管生成、主动脉瓣狭窄、关节炎、动脉粥样硬化、 血栓形成、类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风、痛风性关节炎、急性 假性痛风、急性痛风性关节炎、与癌症相关的炎症、充血性心力衰竭、 膀胱炎、纤维肌痛症、纤维化、血管球性肾炎、与胃肠疾病相关的炎 症、炎症性肠病、肾衰竭、血管球性肾炎、心肌梗塞、眼病、胰腺炎、 牛皮癣、多次灌输伤害或损伤、呼吸失调、再狭窄、脓毒性休克、皮 肤的炎症状况、内毒素性休克、尿脓毒病、中风、手术并发症、全身 性红斑狼疮、移植相关的动脉病、移植vs.宿主反应、异源抑制排斥、 慢性移植排斥、血管炎。
根据本发明的特定方面，已经证明了含有3DG产品的抑制剂和 3DG功能的抑制剂的组合物的局部施用导致与剃刀烧伤相关的发红和 发炎的降低。皮肤发炎测试中的参与者报道了与没有含有活性剂的制 剂相比较，含有相同活性剂的局部制剂降低了与清洁剂皲裂相关的发 红，促进了愈合过程，并引起皮肤质地整体的改善。此外，已经发现 该组合物的局部施用降低了与牛皮癣、湿疹和红血球增多症相关的炎 症，并降低了面部痤疮损伤的数量和严重程度。
根据之前发明者的证明，特别认为皮肤的炎症顺从靶向α-二羰基 糖产生和功能的治疗。根据本发明的实施方案，打算治疗的皮肤炎症 包括，但不限于：由于通过刮须、上蜡、用镊子拔除，电蚀或使用脱 毛产品的发毛去除的皮肤的暂时炎症和刺激；各种形式的皮炎电蚀包 括脂溢性皮炎、钱币状皮炎、接触性皮炎、异位性皮炎、剥脱性皮炎、 口周皮炎和淤滞性皮炎，来指定一些常见的实例和炎性皮肤病或失调， 如牛皮癣、毛囊炎、红斑痤疮、毛细管扩张、痤疮、脓疱病、丹毒、 甲沟炎、红癣、湿疹、皮疹(尿疹、毒藤、毒栎)和晒伤。
本发明中还列出了，含有3DG产品的抑制剂和3DG功能的抑制 剂的组合物的局部施用导致与窦炎相关的疼痛的降低。还报道了将相 同的制剂局部施用至覆盖受影响关节组织的皮肤时，提供了关节炎患 者中关节肿胀、疼痛和触痛的减轻。
鉴于这些发明者的证明，还认为皮肤下的组织炎症特别顺从于通 过靶向α-二羰基糖产生和功能的治疗。组织下的炎症包括，但不限于： 窦压和炎症；与各种形式的关节炎疾病相关的关节组织炎症，如类风 湿性关节炎、骨关节炎、痛风、痛风性关节炎、急性假性痛风和急性 痛风性关节炎。
抑制3DG和其他α-二羰基糖的合成、形成和累积的方法
本发明中已经发现涉及3DG产生的酶合成途径的酶以高水平存在 于皮肤中(参见实施例20)。此外，本发明还发现3DG以高水平存在 于皮肤中(参见实施例19)。因此，本发明包括干扰皮肤中基于酶和非 酶的3DG的合成或形成的组合物和方法，其还干扰皮肤中3DG的功 能。3DG是称为α-二羰基糖的化合物家族的成员。该家族的其他成员 包括乙二醛，甲基乙二醛和葡糖醛酮。本发明还涉及抑制皮肤中3DG 和其他α-二羰基糖累积以及抑制3DG依赖性或相关的皮肤起皱，皮肤 老化或其他皮肤疾病或失调，以及与其他α-二羰基糖相关的其他皮肤 病和失调的组合物和方法。本发明还包括使用刺激导致3DG解毒，降 解或从皮肤清除的途径或途径的成份的组合物和方法来抑制皮肤中的 3DG累积。
应当注意到3DG是α-二羰基糖家族分子的成员。还应当注意到α- 二羰基糖家族的其他成员执行与3DG相似的功能，如在此所述的，以 及象3DG功能，α-二羰基糖家族其他成员的功能也是可抑制的。因此， 本发明应当还包括抑制其他α-二羰基糖的合成、形成和累积的方法。
皮肤中3DG合成、形成和累积的抑制可以是直接或间接的。例如， 3DG合成的直接抑制指的是阻断就在3DG合成或形成途径之前或上游 发生的事件，如阻断amadorase或果糖-赖氨酸-3-磷酸盐(FL3P)转化 成3DG，赖氨酸和无机磷酸盐。间接抑制可以包括阻断或抑制导致3DG 合成的上游前体，酶或途径。例如，上游途径的成份包括amadorase 基因和amadorase mRNA。本发明应当不限于只包括在此所述的酶和非 酶途径的抑制，而是应当包括抑制皮肤中3DG合成、形成和累积的其 他酶和非酶途径的方法。在合适的情况中，本发明还应当包括α-二羰 基糖家族的其他成员，包括乙二醛、甲基乙二醛和葡糖醛酮。
在此所述的各种测试可以用于直接测量3DG合成或3DG的水平， 或可以使用3DG合成或水平相关的测试，如其分解产物3DF的测量。
本发明包括抑制皮肤中3DG合成的新方法。优选，皮肤是哺乳动 物皮肤，更优选，哺乳动物皮肤是人皮肤。
在一个方面中，抑制剂抑制涉及3DG合成的酶。在一个实施方案 中，酶是果糖胺激酶。在另一个实施方案中，果糖胺激酶是amadorase， 如U.S.专利No.6,004,958中所公开的。
本发明的再一个方面中，抑制剂抑制皮肤中3DG的非酶合成和形 成。
本发明的一个实施方案中，抑制剂抑制皮肤中3DG的累积。在一 个方面中，在皮肤中合成或形成3DG。然而，抑制剂还可以抑制皮肤 中3DG的累积，其中3DG的来源不是皮肤。在一个方面中，3DG的 来源是膳食，即，源自外部来源而不是内部来源，然后在皮肤中累积。 因此，本发明的这个方面包括皮肤中3DG合成或形成的抑制和/或皮肤 中3DG累积的抑制。在后一种情况中，3DG的来源可以是皮肤中3DG 的直接酶合成，皮肤以外的组织中的3DG的酶合成，皮肤或非皮肤组 织中3DG的非酶合成或形成，或3DG的来源可以是外部的，如例如， 膳食。用于通过这些途径中任何一种来抑制3DG或其他α-二羰基糖累 积的方法在本文中别处得到更全面的描述。
本发明还涉及治疗皮肤以外的组织的方法和组合物。如本文中别 处详细描述的，以及具有本发明公开内容时本领域技术人员所理解的， 本发明的方法和组合物同样适用于其中存在3DG和可以存在的任何组 织。这样的组织包括，但不限于，肾脏和胰腺。因此，将理解本发明 的组合物和方法同样适用于含有或可以含有3DG的组织。
在本发明的另一个实施方案中，抑制皮肤和其他组织中3DG的合 成，形成或累积的方法用于防止炎症。如本文中别处详细列出的，3DG 的合成，形成或累积的抑制有助于炎症和炎症过程。因此，本发明的 特征在于通过抑制3DG的合成，形成和/或累积来减少或抑制炎症的方 法。
在本发明的另一个实施方案中，提供了使用本发明的组合物治疗 哺乳动物炎症或炎症相关病症的方法，其中炎症与哺乳动物的一种或 多种器官相关。在一个方面中，哺乳动物是人。主要器官包括，例如， 皮肤、心脏、眼睛、肾脏、胰腺、肺和循环系统。在另一个方面中， 以口服剂型给哺乳动物提供本发明的组合物。本文中别处详细描述了 这样用于根据本发明方法中的组合物。通过非限制性实施例，这样的 组合物包括葡甲胺和葡甲胺+精氨酸。
在本发明再一个实施方案中，提供了治疗哺乳动物疼痛的组合物 和方法。疼痛是涉及各种重要化学物质之间相互影响的复杂过程，这 些化学物质称为神经递质，将神经脉冲从一个神经细胞传递至另一个。 人体中存在许多不同的神经递质，并且在疼痛的情况中，以各种组合 起作用，在体内产生疼痛感。一些化学物质支配轻微的疼痛感；其他 控制强烈或重度痛。
身体化学物质通过刺激细胞表面上发现的神经递质受体在疼痛信 息传递中起作用；每个受体具有相应的神经递质。受体功能更像是大 门或港口，使疼痛信息穿过并传递至相邻的细胞。一种受神经科学家 关注的神经递质特异性的大脑化学物质是谷氨酸盐。在实验过程中， 谷氨酸盐受体阻断的小鼠显示出对疼痛的应答的降低。疼痛传递中其 他重要受体是鸦片样受体。吗啡和其他鸦片样药物通过锁住这些鸦片 样受体，开关疼痛-抑制途径或回路并因此阻断疼痛来工作。
应答疼痛刺激的另一种类型的受体称为伤害感受器。伤害感受器 是皮肤、肌肉和其它身体组织中的薄神经纤维，当受到刺激时，将疼 痛信号带至脊髓和大脑。通常，伤害感受器只应答强烈的物理刺激。 然而，当组织变得受到伤害或发炎时，它们释放使伤害感受器更敏感 的化学物质并使它们应答甚至柔和的刺激来传递疼痛信号。这种情况 称为异常性疼痛(allodynia)，一种疼痛是由无害的刺激产生的状况。
本文中第一次显示了将在此所列的组合物和方法用于减小或缓解 哺乳动物的疼痛。在一个方面中，哺乳动物是人。这样的方法包括将 本发明的组合物给药于哺乳动物，局部或口服。在本文中别处详细描 述了用于根据本发明的缓解或减小疼痛的方法中的组合物。通过非限 制性的实施例，这样的组合物包括葡甲胺和葡甲胺+精氨酸。
通过在此所列的组合物和方法可治疗的各种类型的疼痛包括蛛网 膜炎；关节炎，如骨关节炎和类风湿性关节炎；强直性脊柱炎；痛风； 肌腱炎；滑囊炎坐骨神经痛；脊椎滑脱；神经根病；烧伤疼痛；癌症 疼痛；头痛；偏头痛；群发性头痛；紧张性头痛；三叉神经痛；肌筋 膜疼痛；神经病性疼痛，包括糖尿病性神经病变、反射交感神经营养 失调综合征、幻肢痛、截肢手术后的疼痛；肌腱炎；腱鞘炎；带状疱 疹后遗神经痛；带状疱疹相关的疼痛；中枢疼痛综合征；外伤相关的 疼痛；血管炎；与感染相关的疼痛，包括单纯疱疹；皮肤肿瘤，囊肿， 与多发性神经纤维瘤相关的癌症；与扭伤、擦伤、脱臼、相关的疼痛； 骨折和由于暴露于化学物质引起的疼痛(例如，去角质剂(exfoliant) 如类维生素A、羧酸、β-羟基酸、α-酮酸、过氧化二苯甲酰和苯酚)。
在本发明的再一个实施方案中，提供了用于治疗哺乳动物中瘙痒 的组合物和方法。对于起因，瘙痒可以是皮肤的(“皮肤源性瘙痒 (pruritoceptive)”，例如皮炎)，神经性的(例如，多发性硬化)，神经 源性的(例如，胆汁郁积)，混合性的(例如，尿毒症)或心理性的。 尽管皮肤来源的瘙痒具有与疼痛共同的神经通路，传入C-纤维促进性 (subserving)瘙痒是功能上截然不同的子集：它们应答组胺，乙酰胆 碱和其他致痒原(pruritogen)，但是对机械刺激不敏感。
不同类型的瘙痒已经应答各种治疗。组胺是昆虫叮咬反应和大多 数荨麻疹形式中瘙痒的主要介质，并且在这些情况中，瘙痒很好地应 答H1-抗组胺。然而，在大多数皮肤病和全身疾病中，低镇定性H1- 组胺是无效的。阿片拮抗剂缓解由脊髓阿片、胆汁郁积以及可能尿毒 症引起的瘙痒。Ondansetron缓解由脊髓阿片(但不是胆汁郁积和尿毒 症)引起的瘙痒。用于瘙痒的其他药物治疗包括利福平，消胆胺和17- 烷基雄激素(胆汁郁积)、沙立度胺(尿毒症)、甲腈咪胍和皮质类固 醇(霍奇金淋巴瘤)、帕罗西汀(副肿瘤性瘙痒)、阿司匹林和帕罗西 汀(真性红细胞增多症)和吲哚美辛(一些HIV+患者)。紫外线B治 疗，特别是窄条带UVB，已经公设为尿毒症中瘙痒的治疗。这是因为 本文中第一次显示在此所示的组合物和方法可用于减小或缓解哺乳动 物中的瘙痒。在一个方面中，哺乳动物是人。这样的方法包括将本发 明的组合物给药于哺乳动物，局部或口服。在本文中别处详细描述了 用于根据本发明缓解或减小瘙痒方法中的组合物。通过非限制性实例， 这样的组合物包括葡甲胺和葡甲胺+精氨酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗在此所列的炎症， 瘙痒、疼痛和其他疾病或失调以及从公开内容中显而易见的那些方法， 其中治疗是通过包括两种或多种化合物的组合物，进一步其中化合物 的组合导致治疗的协同效果。即，使用化合物组合物治疗的结果大于 分开用每种化合物治疗结果的相加效果。
在本发明的一个实施方案中，治疗患者的方法包括用含有α-二羰 基糖形成的抑制剂和α-二羰基糖功能或效果的抑制剂的组合物来治 疗，与包括任一种单独类型的抑制剂的组合物相比较，其中多种抑制 剂一起在缓解α-二羰基糖相关的病症中呈现出协同效果。在优选的实 施方案中，方法包括葡甲胺和精氨酸的组合物，用于治疗α-二羰基糖 相关的病症。
尽管不希望受到任何特定理论的限制，注意到如本文中别处所详 细列出的，精氨酸不仅使3DG失活，而且精氨酸还进入氧化氮途径中 并刺激NO产生，其引起血管舒张。这补充了葡甲胺的抗氧化抗炎症 作用，因此葡甲胺和精氨酸组合的效果大于每种化合物单独治疗的相 加效果。
治疗糖尿病的方法
本发明还涉及用于治疗糖尿病的组合物和方法。糖尿病，特别是 II型糖尿病，与胰腺的损伤相关。II型糖尿病由遗传和生活方式因素的 结合引起。在通常偏向于糖尿病的人中，吃得过多和缺乏身体活动导 致胰岛素抗性，具有特征性的餐后高血糖。肥胖是特征在于升高水平 的前炎症细胞因子TNF-α，IL-6和IL-1的炎症疾病，所有这些因子有 助于胰岛素抗性(Wellen的综述，K.E.和Hotamisligil，G.S.2005.J.Clin. Invest.115：1111-1119)。在糖尿病前期BB大鼠中，在胰腺中存在升 高水平的同种异源移植炎症因子1(AIF)(Chen Z-W.等，1997.PNAS 94：13897-13884)。总而言之，“代谢综合症”特征性的炎症状态，升 高的脂质水平和氧化应激导致由于β细胞凋亡引起的胰腺功能降低， 导致II型糖尿病。这种病症可能进一步恶化，因为糖尿病还具有提高 水平的3DG，其还导致细胞因子的释放，炎症后期糖化终产物(AGE) 的产生和提高的氧化应激。
因此，本发明提供了用于治疗糖尿病的组合物和方法。在一个实 施方案中，本发明提供了包括将本文中别处详细列出的组合物给药于 患者的方法，其中该组合物缓解患者的糖尿病病症。在另一个实施方 案中，该方法包括将本文中详细列出的组合物给药于患者，其中该组 合物防止倾向于患糖尿病患者的糖尿病病症。用于治疗糖尿病的组合 物在本文中别处得到更详细的描述。这样组合物的实例包括，但不限 于，葡甲胺和葡甲胺+精氨酸。
因为胰腺具有升高水平的F3K酶活性，这导致升高水平的果糖赖 氨酸3磷酸盐，其分解成3DG。因此，胰腺制造自身的3DG，其具有 局部破坏β细胞的作用以及支持胰腺的胞外基质和血管形成的不利影 响。
从皮肤除去3DG的方法
本发明还涉及用于从皮肤中除去3DG和其他α-二羰基糖的组合物 和方法，和用于抑制3DG依赖性或相关的皮肤起皱，皮肤老化或其他 皮肤病或失调以及与其他α-二羰基糖相关的皮肤起皱，皮肤老化或其 他皮肤病或失调的组合物和方法。为此，本发明包括用于抑制皮肤中 3DG产生，合成、形成和累积的组合物和方法。本发明还包括用于刺 激导致3DG解毒，降解或从皮肤清除的途径或途径成分的组合物和方 法。
使用化合物来抑制3DG合成
在一个实施方案中，本发明包括抑制哺乳动物皮肤中3DG合成的 方法，所述方法包括将有效量的3DG合成的抑制剂或其衍生物或修饰 产物给药于哺乳动物，因此抑制哺乳动物皮肤中3DG合成。优选，哺 乳动物是人。
在一个实施方案中，抑制剂构成约0.0001％至约15重量％的药物 组合物。在一个实施方案中，作为受控释放制剂来给药抑制剂。在另 一个方面中，药物组合物包括洗剂、霜剂、凝胶、搽剂、膏剂、糊剂、 牙膏、漱口水、口腔漱液、涂料、溶液、粉末和悬浮液。在另一个方 面中，组合物进一步包括保湿剂、润湿剂、润滑剂、油、水、乳化剂、 增稠剂、稀释剂、表面活性剂、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、水溶助 剂、螯合剂、维生素、矿物质、渗透促进剂、化妆品佐剂、漂白剂、 褪色剂、发泡剂、调节剂、增粘剂、缓冲剂和遮光剂。
应当认为本发明包括各种给药方法，包括局部，口服，肌内和静 脉内。
在本发明的一个方面中，3DG合成的抑制剂是果糖胺激酶 /amadorase的抑制剂。果糖胺激酶的抑制剂可以是如N-甲基-葡糖胺和 N-甲基-葡糖胺-样化合物这样的化合物。在本发明的一个实施方案中， 3DG合成的抑制剂是葡甲胺。
在本发明的一个方面中，具有上述通式的代表性抑制剂化合物包 括半乳糖醇赖氨酸、3-脱氧山梨糖醇赖氨酸、3-脱氧-3-氟-木糖醇赖氨 酸和3-脱氧-3-氰基山梨糖醇赖氨酸和3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸。可以 用作本发明实践中的抑制剂的已知化合物的实例包括，但不限于，葡 甲胺、山梨糖醇赖氨酸、半乳糖醇赖氨酸、甘露醇赖氨酸、木糖醇和 山梨糖醇。优选的抑制剂是3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸。
可以通过本文中所述的几种方法的任何一种和通过本领域技术人 员已知的其他方法将本发明的化合物给药于，例如，细胞、组织或患 者。在一个实施方案中，可以使用本领域已知的技术在体外合成本发 明抑制3DG酶合成的抑制剂(参见实施例8)。
用于抑制3DG功能的组合物和方法
如本文中所述的，本发明涉及3DG在引起各种皮肤病和失调中的 牵连并涉及抑制3DG功能的方法，以便缓解或治疗3DG相关的皮肤 病或失调。本发明还涉及3DG在其他疾病和失调中的牵连，如牙龈病 和失调。这样的牙龈病和失调包括，但不限于，牙龈炎、牙龈萎缩和 其他3DG或其他α-二羰基糖相关的牙龈病和失调。如上所述，3DG功 能的抑制可以是直接或间接的。因此，可以使用本文中所述的许多方 法来抑制或3DG功能或使其降低。可以使用本文中所述的技术以及本 领域技术人员已知的其他技术来测试或监控3DG功能的抑制。可以直 接测量功能或可以使用测量已知与3DG功能相关的参数的技术来估 算。例如，可以使用如电泳分析(参见图12和实施例7和18)这样的 技术以及其他技术(参见实施例21-24)来直接测量蛋白质交联和蛋白 质产生。应当认为本发明不仅包括用于防止3DG诱导的分子交联的化 合物，这些分子如胶原蛋白，弹性蛋白和蛋白多糖，而且还应当认为 包括抑制其他分子交联的化合物。还应当认为本发明包括化合物调节 其他3DG功能的用途，如凋亡和活性氧的形成。已知可以通过甲基乙 二醛和3DG诱导巨噬细胞-衍生的细胞中的凋亡性细胞死亡(Okado等， 1996，Biochem.Biophys.Res.Commun.225：219-224)。本发明的再一 个方面中，3DG的抑制剂抑制活性氧(Vander Jagt等，1997，Biochem. Pharmacol.53：1133-1140)。应当认为本发明还包括其他α-二羰基糖。 可以使用细胞、组织、血液、血浆和尿样这几种方式来测量3DG及其 解毒产物3DF(参见实施例4、5、6、14、15和17)，还可以测量FL (参见实施例5)，在3DG合成过程中产生的产物，也可以测量前体， FL3P(参见图1和2以及实施例1、2和3)。
本发明公开了用于抑制皮肤中3DG功能的方法。这样的方法包括 将组合物中有效量的一种或多种3DG功能的抑制剂或其修饰产物或衍 生物给药于患者。
在本发明的一个方面中，3DG功能抑制剂抑制蛋白质交联。在另 一个方面中，抑制剂抑制后期糖化终产物修饰的蛋白质的形成。再一 个方面中，3DG功能抑制剂包括N-甲基-葡糖胺样化合物的结构，或是 精氨酸或其衍生物或修饰产物。
在一个实施方案中，抑制剂构成按重量计，约0.0001％至约15％ 的药物组合物。在一个方面中，作为受控释放制剂来给药抑制剂。在 另一个方面中，药物组合物包括洗剂、霜剂、凝胶、搽剂、膏剂、糊 剂、牙膏、漱口水、口腔漱液、涂料、溶液、粉末和悬浮液。在另一 个方面中，组合物进一步包括保湿剂、润湿剂、润滑剂、油、水、乳 化剂、增稠剂、稀释剂、表面活性剂、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、 水溶助剂、螯合剂、维生素、矿物质、渗透促进剂、化妆品佐剂、漂 白剂、褪色剂、发泡剂、调节剂、增粘剂、缓冲剂和遮光剂。应当认 为本发明包括各种给药方法，包括局部、口服、肌内和静脉内。
应当理解用于抑制导致3DG合成或产生的途径，事件和前体的组 合物和方法不仅抑制3DG合成，而且抑制其累积，并最终抑制其功能。 应当认为本发明包括抑制所有导致3DG合成的途径和前体的组合物和 方法(参见图1和2)。
在本发明的另一个实施方案中，公开内容提供了直接抑制与各种 皮肤病或失调相关的3DG功能的方法。在一个方面中，抑制皮肤中3DG 功能的方法包括使用如本文中所述的那些与N-甲基-葡糖胺-样化合物 相似结构通式的化合物来抑制3DG。包括这些通式的化合物结合3DG 和/或抑制其功能，如在此所述的。此外，本发明包括可以结合并阻断 3DG功能的其他分子。
应当理解在此所述的化合物不仅是能够抑制3DG功能或治疗3DG 相关的皮肤病或失调或其他组织和细胞的疾病和失调的化合物。本领 域技术人员将认识到在此所述的本发明的各种实施方案涉及3DG功能 的抑制，还包括用于抑制3DG功能的其他方法和化合物。本领域技术 人员还将认识到其他化合物和技术可以用来实践本发明。应当认为本 发明不仅包括因为它们抑制3DG功能和治疗3DG相关的皮肤病或失 调的能力而有用的化合物和方法，而且应当认为还包括抑制α-二羰基 糖家族化合物的其他成员的功能，包括乙二醛、甲基乙二醛和葡糖醛 酮。还应当认为本发明包括治疗皮肤以外的3DG相关的疾病和失调， 如3DG相关的牙龈疾病和失调。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于抑制3DG和3DG功能 的多成分组合物。鉴于在此所列出的公开内容，本领域技术人员将理 解特定的活性成分，赋形剂、添加剂、佐剂等，可以加入组合物中， 以便提高或另外调节抑制3DG和/或3DG功能的化合物的活性。在一 个方面中，本发明包括含有可可脂、牛油果油、芦荟油、维生素E、甘 油、水、二甲硅油和Natipide II，以及精氨酸-HCl和葡甲胺-HCl的组 合物。如本领域技术人员基于本发明的公开内容可以理解的，可以调 节本文中所列组合物的单个成分的比例和浓度，以便调节组合物相对 于3DG的活性。即，基于本文中所列的公开内容，本文中所提供的测 试和方法可以用于测定组合物中单个成分的效果。
在一个实施方案中，本发明还包括治疗哺乳动物炎症的方法，该 方法包括将含有哺乳动物中α-二羰基糖的抑制剂的组合物给药于哺乳 动物，该给药导致哺乳动物中特定部位的α-二羰基糖功能的降低，消 除或抑制。在本发明的一个方面中，组合物的给药导致哺乳动物中受 炎症影响部位的3DG功能的降低，消除或抑制。
在一个方面中，3DG功能抑制剂包括N-甲基-葡糖胺-样化合物的 结构，或是精氨酸或其衍生物或修饰产物。在另一个方面中，3DG功 能抑制剂包括葡甲胺的结构。
如本文中别处详述的，“3DG的抑制”部分指的是抑制3DG功能 的任何方法或技术，以及抑制3DG功能的诱导或刺激的方法。其部分 还指的是通过解毒3DG抑制3DG功能或引起3DG清除的任何组合物 或方法。抑制可以是直接或间接的。诱导部分指的是3DG功能的诱导。 相似地，短语“抑制α-二羰基糖”指的是抑制α-二羰基糖家族的成员， 包括3DG、乙二醛、甲基乙二醛和葡糖醛酮。
本领域技术人员将理解通过在此所述的α-二羰基糖抑制来治疗患 者的方法和组合物，包括3DG抑制，同样适用于治疗本文中所述的并 涉及α-二羰基糖如但不限于3DG的存在或累积的其他疾病或失调。即， 可以用含有3DG抑制剂的组合物治疗本文中所述的并涉及α-二羰基糖 如但不限于3DG的存在或累积的其他疾病或失调。在本发明的一个方 面中，可以用由3DG抑制剂组成的组合物治疗本文中所述的并涉及α- 二羰基糖如但不限于3DG的存在或累积的其他疾病或失调。
在另一个实施方案中，本发明还包括治疗哺乳动物疼痛的方法， 该方法包括将含有哺乳动物中α-二羰基糖的抑制剂的组合物给药于哺 乳动物，该给药导致哺乳动物中特定部位的α-二羰基糖功能的降低， 消除或抑制，来治疗疼痛。在本发明的一个方面中，组合物的给药导 致哺乳动物中受疼痛影响部位的3DG功能的降低，消除或抑制。
再一个实施方案中，本发明还包括治疗哺乳动物瘙痒的方法，该 方法包括将含有哺乳动物中α-二羰基糖的抑制剂的组合物给药于哺乳 动物，该给药导致哺乳动物中部位的α-二羰基糖功能的降低，消除或 抑制，来治疗瘙痒。在本发明的一个方面中，组合物的给药导致哺乳 动物中受瘙痒影响部位的3DG功能的降低，消除或抑制。
测试3DG和其他α-二羰基糖合成、形成，累积和功能抑制的试验
本发明的公开内容提供了一系列的试验，用于鉴定3DG合成、形 成、累积和功能的抑制剂，以及测量各种抑制剂对3DG合成、形成、 累积和功能的作用。这些试验还包括用于测量3DG降解，解毒和清除 的那些。本发明的试验包括，但不限于，HPLC测试、电泳测试、气相 色谱-质谱测试、氨基酸分析、酶活性测试、后期糖化测试、蛋白质交 联测试、NMR分析、离子交换色谱、各种化学分析、各种标记技术、 外科手术和gross dissection技术、RNA分离、RT-PCR、组织学技术、 各种化学、生化和分子合成技术、致畸性、诱变性和致癌性测试、尿 液测试、排泄物测试以及各种动物、组织、血液、血浆、细胞、生化 和分子技术。合成技术可以用于产生化合物，如：FL3P(实施例1，2 和3)；多元醇赖氨酸(实施例4)；3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸(实施例 8)；果糖基精胺(实施例9)和糖化蛋白质膳食(实施例13)的化学 和酶产生。可以使用本文中没有描述但是本领域技术人员已知的其他 技术。
在本发明的一个实施方案中，当测试新的药剂或化合物时或测量 在此所述的各种参数时，可以使用标准品。例如，果糖-赖氨酸是已知 的3DG和3DF调节剂，并可以将其作为标准品或对照给药于一组或受 试者，可以对照其来比较测试药剂或化合物的作用。此外，当测量参 数时，标准品的测量可以包括测量用测试化合物治疗受试者前从受试 者获得的组织或流体中的参数，如3DG或3DF浓度，并在用测试化合 物治疗后测量相同的参数。在本发明的另一个方面中，标准品可以是 外部添加的标准品，其可以是加入样品中的药剂或化合物并用作内部 控制，尤其是在通过几个步骤或程序加工样品的情况中，必须测定每 个步骤目标标记物的回收量。通常以标记的形式，即，放射性同位素， 来添加这样外部添加的内标。
诊断与3DG相关的皮肤病或失调的方法
本发明公开了皮肤中3DG的存在和用于测量皮肤中3DG水平和 测量引起皮肤中3DG合成的酶的方法(参见实施例19和20)。本发明 还包括用于诊断与起皱，老化或各种其他皮肤病或失调相关的皮肤中 3DG水平改变的方法。不应当认为本发明只包括诊断与3DG相关的皮 肤病和失调的方法，而应当认为包括用于诊断与其他α-二羰基糖相关 的皮肤病和失调的方法。还应当认为本发明包括用于诊断与3DG相关 的其他细胞和组织疾病或失调的方法，包括但不限于，牙龈疾病和失 调。
在本发明的一个实施方案中，患有皮肤起皱，皮肤老化或其他皮 肤病或失调的患者可以接受诊断测试来测定，例如，皮肤中的3DG水 平，3DG的功能活性，3DF的水平，3DF/3DG比例，存在的amadorase 蛋白质或mRNA的含量，或amadorase活性水平。这样的测试是基于 本文中描述的或本领域技术人员已知的各种方法和测试。与皮肤没受 影响的部位或正常患者的皮肤相比较，较高水平的3DG或amadorase， 或其活性，或较低水平的3DF，是与3DG相关的皮肤起皱，皮肤老化 或其他皮肤病或失调的表示，本发明的3DG抑制剂将是该问题的合适 处理。还应当认为本发明包括与3DG以外的α-二羰基糖家族的分子相 关的皮肤病和失调。
在本发明的一个方面中，可以测量3DG相关的皮肤病或失调的其 他标记，包括但不限于，测量3DF和FL水平，交联的蛋白质水平， 以及其他α-二羰基糖的水平，如乙二醛，甲基乙二醛和葡糖醛酮。
在本发明的公开内容中描述了许多用于测量3DG水平和功能的测 试，包括测量其前体(参见实施例1-22)。然而，应当认为本发明不只 是包括本文中所述的测试，而应当认为包括其他测量3DG水平或功能 的测试，包括间接测量3DG水平或功能活性的测试或技术。例如，在 本发明的一个方面中，可以通过测量3DF水平，蛋白质交联，蛋白多 糖交联这样的情况或任何显示出与3DG水平相关的其他测试来测定 3DG水平和功能的间接测量。
在本发明的一个方面中，用于测量3DG水平等的样品是皮肤样品。 可以通过以下的方法来获得皮肤样品，包括但不限于，打孔活组织检 查(punch biopsy)、刮削、发疱(blistering)技术。
在本发明的另一个方面中，可以使用皮肤中与3DG相关的皮肤病 或失调相关的3DG水平或功能的间接测试。这些测试包括，但不限于， 测量其他组织、汗液、血液、血浆、唾液或尿液中的3DG水平或功能。
本发明公开了诊断3DG或其他α-二羰基糖相关疾病或失调的方 法，包括从测试受试者获得生物样品并将皮肤起皱，老化，疾病或失 调的3DG或其他α-二羰基糖相关参数的水平与另外来自对照受试者的 相同生物样品中的相同参数的水平相比较。对照可以来自相同受试者 未受影响的部位或来自未受3DG或其他α-二羰基糖相关的皮肤病或失 调影响的受试者。测试受试者中较高水平的参数表示测试受试者具有 3DG或其他α-二羰基糖相关的皮肤起皱，老化，疾病或失调。可以测 量的参数是本文中所述的或是本领域技术人员已知的，包括但不限于， 3DG，蛋白质交联，蛋白多糖交联，后期糖化终产物修饰的蛋白质， 3DF，果糖胺激酶/amadrase水平和活性，以及果糖胺激酶/amadorase mRNA，活性氧水平的改变。
在本发明的另一个方面中，3DG或其他α-二羰基糖可以与选自皮 肤老化、光老化、皮肤起皱、皮肤癌、角化过度症、增生、棘皮病、 乳头瘤病、皮肤病、色素沉着过度、酒糟鼻、硬皮病、红斑痤疮和毛 细管扩张的皮肤疾病、失调和病症以及这些疾病，失调和病症的外观 相关。在本发明的另一个方面中，3DG与以下功能相关，包括但不限 于，蛋白质交联、诱变性、致畸性、凋亡、由活性氧形成引起的氧化 性损伤和细胞毒性。可以理解3DG和其他α-二羰基糖不仅与引起蛋白 质损害的功能相关，而且还与脂质和DNA损害的功能相关。在本发明 的一个方面中，3DG或其他α-二羰基糖还与皮肤(包括但不限于粘膜) 的疾病和失调相关，包括但不限于，牙龈疾病和失调、阴道和肛门粘 膜疾病等。
在本发明的再一方面中，测量3DG水平和功能的测试可以结合其 他测量皮肤病和失调的方法来使用，如测量皮肤的厚度或弹性和/或水 分。本文中描述了这些测试中的许多。本领域技术人员将认识到本文 中没有描述的其他测试可以结合3DG测试使用来形成所涉及皮肤问题 类型的完整诊断，无论是否是3DG相关的皮肤问题。
不应当认为本发明只包括通过测量α-二羰基糖3DG的水平来诊断 皮肤疾病，病症或失调，还应当认为其包括测量α-二羰基糖家族其他 成员及其分解产物的水平，包括但不限于，3-脱氧果糖。
因此，诊断测试测定3DG与皮肤病或失调之间相关性的用途将允 许在用3DG抑制剂开始治疗之前选择合适的受试者。
抑制或治疗3DG或其他α-二羰基糖相关的皮肤起皱、皮肤老化或 其他皮肤病、失调或病症的方法
本发明还包括用于抑制或治疗3DG相关的皮肤病或失调的方法。 3DG相关的疾病或失调的一些实例包括，但不限于，皮肤癌、牛皮癣、 老化、起皱、角化过度、增生、棘皮病、乳头瘤病、皮炎、肥大性酒 糟鼻和酒糟鼻。癌症或其他疾病或失调可以属于本文中所述的任一组 癌症或其他疾病或失调，以及本领域技术人员公知的任何其他相关的 癌症或其他疾病或失调。
不应当认为本发明仅限于这些实施例，因为目前还不了解的其他 3DG相关的疾病或失调，一旦了解后，也可以使用本发明的方法来治 疗。本领域技术人员将认识到3DG抑制剂可以预防性用于一些皮肤疾 病或失调，其中3DG是已知的，或变得已知的，3DG与皮肤病或失调 相关。例如，3DG抑制剂可以用于预防暴露于苛刻的环境因素，如日 光(光老化/光损害)，热，化学品或寒冷的受试者中起皱或其他皮肤问 题。这样的问题可以由于蛋白质或其他分子如脂质或核酸受到3DG或 α-二羰基糖导致的损害引起。
本领域技术人员将认识到，基于本文中提供的公开内容，本发明 包括预防老化，硬皮病和/或糖尿病皮肤中微循环和/或神经支配丧失的 方法，因为3DG增加氧化应激和AGE，它们随后与神经病和循环功能 失调相关。
本发明还包括用于预防老化，硬皮病和/或糖尿病个体群体中与微 循环丧失和/或神经支配丧失相关或由其介导的脱发的方法。这是因为 3DG是形成AGE的已知前体，而已知AGE与神经病发生有因果关系。 初步的数据证实用DYN 12治疗并在警觉时测定肌肉强度的糖尿病大 鼠具有比未治疗的糖尿病大鼠更强的肌肉强度。这一结果支持了维持 神经传导和支持神经支配的微循环不仅受到AGE，而且受到3DG有害 影响的概念。相似地，如果3DG可以导致支持毛囊神经支配的微循环 发生阻滞，那么毛囊就会萎缩并死亡，正如神经病中的情况。因此， 本发明包括用于预防脱发的方法，其中这些脱发与毛囊/毛干邻近的皮 肤中存在的3DG有关或由其介导。
相似地，本发明包括用于预防毛发灰化的方法。正如上述有关脱 发中所述的，这是因为抑制毛囊或毛干相关的皮肤中3DG的存在和/ 或其活性可以预防3DG对影响这类毛发的微循环的有害作用，由此预 防因这类有害作用导致的毛发灰化。
因此，本领域技术人员会基于本文提供的公开内容理解本发明包 括涉及预防脱发和/或毛发灰化的方法和组合物。这类组合物和方法包 括，但不限于，可以施用于毛发以及与毛囊相关的皮肤的香波或其他 组合物，以给予本发明的化合物，使得3DG和/或amadorase的形成， 累积和/或功能由此受到抑制。基于本文提供的公开内容，本领域技术 人员会理解这类化合物包括，但不限于葡甲胺。此外，本文公开了施 用于毛囊的组合物制剂及其剂量和治疗方案，它们也是本领域技术人 员公知的。
本发明包括用于使皮肤伤口愈合的治疗方法。这是因为ROS与伤 口的起源有关。因此，基于本文提供的公开内容，本领域技术人员会 理解任何ROS抑制剂可以对伤口愈合起正面作用。由于3DG在ROS 起源中的作用，所以通过抑制3DG产生来抑制ROS可以产生用于预 防和治疗伤口的方法。抑制皮肤中的3DG作为有用的愈合疗法的其他 支持结论由证实糖尿病患者(diqaetics)特别倾向于伤口愈合问题的研 究提供，因为如本文其他部分中所述，糖尿病患者具有升高的3DG水 平，且对3DG的解毒的有效性低于非糖尿病受试者。因此，皮肤中存 在3DG及其导致其酶促合成的酶这一令人意外的发现首次使研发用于 促进伤口愈合，尤其是糖尿病患者的伤口愈合的新治疗剂成为可能。
因为3DG及其形成途径存在于皮肤中，并参与产生ROS，而且 ROS与炎症有关，所以本领域技术人员也可以理解本发明包括用于治 疗或改善与粘膜炎症相关的疾病，失调或病症的方法。抑制皮肤中的 3DG形成，功能和/或累积可以抑制粘膜炎症，使得可以通过这类抑制 作用来抑制与粘膜(例如，鼻道、阴道、直肠、口腔等)炎症相关的 病症。例如，抑制3DG可以用于调节牙齿变黄、口腔炎症、牙龈炎、 牙周病、疱疹疮等。
此外，因为抑制3DG可以预防粘膜炎症，诱导伤口愈合，所以这 类抑制作用还可以为预防和/或治疗病毒，细菌或真菌感染提供有用的 疗法，其中所述感染由通过皮肤和/或粘膜的病原体感染介导。因此， 本发明包括用于预防或治疗真菌，病毒和细菌感染的方法和组合物， 其通过对需要这类治疗的患者提供amadorase和/或3DG的灭活剂来进 行。
本发明包括用于治疗或预防牙龈炎、牙周病、牙齿变黄等的方法。 这是因为本文公开的数据证实唾液和皮肤中均存在3DG，表明它存在 于粘膜中。因此，本领域技术人员可以基于本文提供的公开内容理解 抑制口腔中与粘膜相关的3DG可以抑制与该分子相关或由其介导的有 害作用，包括但不限于，牙龈炎、牙周病和牙齿变色。这是因为氧化 应激和AGE与这些病症相关，并且3DG诱导氧化应激和AGE。此外， 本领域技术人员借助于本文提供的教导可以理解本发明包括治疗威尔 逊病、类风湿性关节炎、进行性全身性硬化症、纤维化肺病、雷诺现 象、关节挛缩、斯耶格伦综合症等的方法。这是因为3DG导致活性氧 的诱导，而活性氧引起炎症，可以通过抑制3DG来预防或治疗由ROS 介导或与之相关的炎症相关的疾病。因此，可以按照本文所述涉及抑 制3DG和/或amadorase的方法治疗威尔逊病、类风湿性关节炎、进行 性全身性硬化症、纤维化肺病、雷诺现象、关节挛缩、斯耶格伦综合 症等。
本发明包括乳腺癌的治疗方法。如本文其他部分中更完整描述的， 这是因为本文公开的数据证实汗中存在3DG。因为乳腺为高度特化的 汗腺，所以本领域技术人员可以基于本文提供的公开内容理解抑制这 类组织中的3DG可以对与3DG相关或由其介导的有害作用提供有益 的治疗作用。
如本领域技术人员基于本文提供的公开内容理解的，抑制皮肤中 的3DG可以对治疗乳腺癌提供有用的治疗作用，因为3DG导致氧化 应激和活性氧形成并抑制攻击氧化应激的酶。因此，3DG使身体对炎 症的防御性缺失，特别是皮肤中存在高水平的3DG有害地使存在于皮 肤和粘膜中的防御性丧失。因此，不希望受到任何特定理论的束缚， 3DG的作用主要是由于其对氧化应激的作用以及依次的完整炎症级联 所致。这对乳腺癌是重要的，其中人们认为是长期的氧化应激而并非 单点突变导致了该疾病。
同样，本领域技术人员一旦了解了本文公开的教导，即可以理解 在通过皮肤产生或与皮肤相关的含有3DG的体液，如唾液、汗液、淋 巴、尿液、精液和血液的情况中，可以通过抑制3DG通过这类体液接 触细胞，组织或器官而介导的疾病，失调或病症。由存在于体液中的 3DG介导或与之相关的这类疾病，失调或病症包括，但不限于，非霍 奇金淋巴瘤，其中含有3DG的汗液充满了淋巴腺。此外，本发明包括 抑制3DG加合物形成和/或使这些加合物失活的方法，因为这些加合物 也可以导致与3DG相关的疾病，失调或病症，包括本文其他部分中所 公开的那些疾病，失调或病症。即，类似于防治3DG形成，累积和/ 或起作用可以预防与老化和疾病相关的该化合物的有害作用，更具体 地说，可以预防与本文另外部分中公开的3DG对皮肤的有害作用，对 无论何处发现的3DG加合物和/或中间体的有害作用进行抑制同样可 以预防其有害作用。本领域技术人员一旦借助于本文提供的教导就可 以理解这些3DG结合物/中间体包括，但不限于附图18中所述的那些 化合物，并且无论何处发现的这类由3DG形成的中间体/加合物也可以 导致老化和疾病。
这些加合物迄今为止是未知的，且本领域技术人员可以基于本文 新公开的内容理解抑制这类加合物会抑制皮肤中和其他存在这类加合 物的部位中由其介导或与之相关的疾病过程。因此，本发明包括抑制 这类3DG加合物的合成、形成和累积，无论它们是使用本文公开的， 本领域公知的或未来研发的检测方法检测到的。
本发明包括用于治疗或改善多种(wide plethora of)疾病的方法， 这些疾病由因皮肤中3DG与蛋白质如胶原蛋白和弹性蛋白的相互作用 导致的皮肤改变所介导或与之相关，并与诱导ROS及其随后与皮肤成 分的反应相关。即，本文中公开的数据证实皮肤中的3DG介导胶原蛋 白交联或与之相关，由此与皮肤增厚相关，因此防止皮肤中3DG和/ 或Amadorase累积、形成、功能和/或增加其清除可以对由这类增厚介 导或与之相关的疾病、失调或病症提供治疗有益作用。
此外，本发明包括治疗或改善由氧化应激介导或与之相关的疾病、 失调或病症。这是因为3DG诱导氧化应激，即3DG直接或通过形成 AGE而诱导氧化应激，因此3DG参与炎症反应。因此，抑制3DG可 以治疗或预防与炎症相关的疾病，失调或病症。这类疾病，失调或病 症包括，但不限于，牙龈炎、牙周病、牙齿变褐/变黄、疱疹损害和瘢 痕形成，因为它们由ROS介导或与之相关。因此，例如通过用3DG 抑制剂如葡甲胺治疗牙齿和/或口腔组织(例如牙龈等)预防ROS可以 减少ROS在口腔中的有害作用，如上述疾病，失调或病症。
本发明进一步包括基于抑制3DG，其加合物/中间体和抑制 amadorase和3DG合成对皮肤外观起作用的治疗方法。因此，即使所 述疾病，失调或病症得不到治疗或改善，本发明也包括对皮肤外观起 作用的治疗方法，使得病症、失调或疾病对皮肤外观的影响程度至少 低于未进行治疗时的程度。这些治疗方法因此是美容方法并可以对身 体外观产生改善。
本发明包括治疗与皮肤弹性丧失相关的皮肤老化的方法。如本文 中其他部分更完整描述的，这是因为本文公开的数据首次证实皮肤中 存在3DG以及与其合成相关的酶，并且抑制3DG可以预防与其在皮 肤中的存在相关的皮肤弹性丧失或使其发生逆转。因此，本领域技术 人员一旦借助于本文提供的教导就可以理解抑制皮肤中的3DG可以减 轻皮肤老化，从而本发明为抑制皮肤老化和皮肤弹性丧失提供了有用 的治疗方法。本领域技术人员可以进一步理解皮肤老化的治疗包括， 但不限于皮肤和美容领域中公知的各种治疗手段，包括但不限于，可 以用于实施本文公开的各种治疗方法的皮肤包裹、脱落、面膜等。
本发明包括通过抑制Amadorase和/或使3DG失活来预防尤其是口 腔，直肠和阴道途径中的病毒，真菌和细菌感染的易感性的方法。特 别地，可以降低对例如HIV、乳头瘤病毒和EB病毒感染的易感性，因 为皮肤中的改变可以影响对疾病的感受性，且3DG诱导ROS和AGE 形成，还与皮肤蛋白，特别是胶原蛋白和弹性蛋白积极的发生相互作 用，由此影响皮肤，使得感受性改变。
本领域技术人员可以基于本文提供的公开内容理解本发明为皮肤 中3DG相关的多种疾病，失调或病症提供了有用的治疗。这特别是因 为3DG介导ROS形成是本领域公知的，由此公知ROS参与本文中所 述的各种疾病、失调或病症。
本发明还包括抑制或治疗与3DG以外的α-二羰基糖家族化合物的 成员相关的皮肤病或失调的方法。
在本发明的一个方面中，在用3DG抑制剂治疗后测定皮肤中的各 种改变。可以用参数定义皮肤局部解剖学，如：(a)皱纹的数量；(b) 总皱纹面积；(c)总皱纹长度；(d)皱纹的平均长度和(e)平均皱纹 深度。可以基于深度，长度和面积确定皱纹的类型。当评价因疾病或 失调引起的皮肤改变或对皮肤的治疗作用时，可以使用这些特性。可 以基于本领域中公知的技术测定3DG水平和功能改变对各种皮肤品质 的作用。用于测定皮肤品质的方法包括，但不限于，如用冲击仪 (ballistometer)测定粘弹特性，如用cutometer测定机械/竖直形变特 性或用corneometer测定因水合程度改变导致的皮肤容量(capacitance) 改变。
组合物和给药方法
本发明设计以药物组合物或美容组合物来给予经鉴定的化合物以 实施本发明的方法，该组合物包括所述组合物或者化合物的合适衍生 物或片段和药物学上可接受的载体。例如，将混合合适的3DG酶依赖 性或非酶依赖性产生的抑制剂或3DG累积或功能抑制剂或3DG去除， 解毒或降解的刺激剂的化学组合物用于将合适的化合物给药于动物。 本发明应当包括使用一种或同时使用多种3DG抑制剂或3DG去除， 解毒或降解的刺激剂。当使用多种刺激剂或抑制剂时，它们可以一起 给药或可以分开给药。
在一个实施方案中，可以给药用于实施本发明的药物组合物来传 送1ng/kg/天至100mg/kg/天的剂量。在另一个实施方案中，可以给药 用于实施本发明的药物组合物来传送1ng/kg/天至100g/kg/天的剂量。
在本发明的另一个实施方案中，药物组合物是脂质体霜剂的形式。 在一个方面中，组合物包括23.9克BIOCREME浓缩物(BioChemica International Inc.)，混合2.9克可可脂，1.4克牛油果油，2.2克芦荟油， 1.1克维生素E，3.7克甘油，51克水，1.1克二甲硅油和10.8克Natipide II，以及1克精氨酸-HCl和1克葡甲胺-HCl。然而，本发明不应当限 于基于脂质体的传送载体。
如本领域技术人员所理解的，提供本文中所列的公开内容时，用 于本发明中的组合物可以包括一种活性成分。或者，用于本发明中的 组合物包括至少两种活性成分。在一个方面中，多种活性成分可以是 以叠加的方式活性的。在另一个方面中，多种活性成分可以是以协同 的方式活性的。即，本发明组合物种的多种活性成分可以提供高于各 个活性成分单独提供的治疗效果相加的治疗效果。通过非限制性实施 例，组合物可以包括α-二羰基糖形成的抑制剂和α-二羰基糖功能或作 用的抑制剂，一起在缓解α-二羰基糖相关病症中呈现出协同效果，与 含有任一单独类型的抑制剂的组合物相比较。在一个实施方案中，葡 甲胺和精氨酸的组合物用于α-二羰基糖相关病症的治疗。
其他有用的药物学上可接受的载体包括，但不限于，甘油，水， 盐水，乙醇和其他药物学上可接受的盐溶液，如磷酸盐和无机酸的盐。 这些和其他药物学上可接受的载体的实例描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences(1991，Mack Publication Co.，New Jersey)。
可以以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液形式制备，包装或销 售药物组合物。可以按照本领域公知的方法来配制这种悬浮液或溶液， 除了活性成分以外，它们还包括本文中所述的其他成分，如分散剂， 湿润剂或悬浮剂。可以使用无毒性的非肠道可接受的稀释剂或溶剂来 制备这类无菌可注射制剂，如水或1，3-丁二醇。其他可接受的稀释剂和 溶剂包括，但不限于，林格溶液、等渗氯化钠溶液和固定油，如合成 的单-或二-甘油酯。
可以以适于口服、直肠、阴道、非肠道、局部、肺、鼻内、经颊、 眼或另一种给药途径的制剂来给药，制备，包装和/或销售用于本发明 方法中的药物组合物。其他所考虑的制剂包括发射纳米颗粒，脂质体 制剂，含有活性组分的重新包封的红血球和基于免疫的制剂。
可以通过许多途径来给药本发明的组合物，包括但不限于、口服、 直肠、阴道、非肠道、局部、肺、鼻内、经颊或眼的给药途径。给药 途径对本领域技术人员而言是显而易见的，且取决于许多因素，包括 所治疗疾病的类型和严重程度，所治疗兽或人患者的类型和年龄等。
可以经全身来给予用于本发明方法中的药物组合物，其形式为口 服固体制剂、眼药、栓剂、气溶胶、局部用制剂或其他类似制剂。除 了如硫酸肝素这样的化合物或其生物学等价物以外，这类药物组合物 中还可以含有药物学上可接受的载体和已知用于促进和有利于给药的 其他组分。其他可能的制剂，如纳米颗粒、脂质体、重新包封的红血 球和基于免疫的系统、也可以根据本发明的方法用来给药化合物。
可以配制使用本文中所述任一种方法鉴定的化合物并给药于哺乳 动物来治疗本文中所述的皮肤老化，皮肤起皱和各种皮肤相关的疾病， 失调或病症。
本发明包括药物组合物的制备方法和用途，该组合物包括用于治 疗本文中所述各种皮肤相关疾病，失调或病症的化合物，包括皮肤老 化，光老化和皮肤起皱。本发明还包括皮肤那些以外的与3DG相关的 疾病和失调，包括但不限于，牙龈疾病和失调。这类药物组合物可以 由活性成分单独组成，其形式适于给药于患者，或药物组合物包括至 少一种活性成分和一种或多种药物学上可接受的载体，一种或多种其 他成分，或这些中的一些组合。活性成分可以以生理上可接受的酯或 盐形式存在，如结合生理学上可接受的阳离子或阴离子，如本领域公 知的。
药物局部给药的屏障是表皮的角质层。角质层是由蛋白质、胆固 醇、鞘脂、游离脂肪酸和各种其他脂质组成的高度抗性层，并包括角 化的和活的细胞。限制化合物通过角质层的透入率(流量)的因素之 一是可以加载或施用在皮肤表面上的活性物质的量，每单位面积皮肤 上施用的活性物质的量越大，则皮肤表面与皮肤下层之间的浓度梯度 越大，由此活性物质通过皮肤的扩散力也越大。因此，与所有其他情 况相同，只是与浓度更低的制剂相比，含有较大浓度活性物质的制剂 更能够使活性物质通过皮肤渗透，且透入地更多，透入比例更为恒定。
可以通过制药领域中的任意已知或后来研发的方法制备本文中所 述的药物组合物制剂。通常，这类制备方法包括下列步骤：使活性组 分与载体或一种或多种其他辅助成分混合，然后如果必要或需要，可 以使所得产物成型或将其包装成所需单剂量或多剂量单位。
尽管本文提供的对药物组合物的描述主要涉及适于伦理上给药于 人的药物组合物，本领域技术人员可以理解这样的组合物通常适于给 药与所有种类的动物。
为了使该组合物适于给药于各种动物，对适于给药于人的药物组 合物进行修饰是可以充分理解的，兽医领域的普通技术人员可以仅仅 使用普通试验(如果有的话)来设计和进行这样的改变。所考虑的给 予本发明药物组合物的患者包括，但不限于，人和其他灵长类，哺乳 动物，包括可购得的相关哺乳动物，如牛、猪、马、绵羊、猫和狗。
可以以适于口服、直肠、阴道、非肠道、局部、肺、鼻内、经颊、 眼、鞘内或另一种给药途径的制剂来制备，包装或销售适于本发明方 法的药物组合物。其他所考虑的制剂包括发射的纳米颗粒，脂质体制 剂，含有活性组分的重新包封的红细胞和基于免疫的制剂。
可以批量制备，包装或销售本发明的药物组合物，作为单一单位 剂量或作为多个单位剂量。如在此所用的，“单位剂量”是包括预定量 活性成分的药物组合物的个别量。活性成分的量通常等于给药于患者 的活性成分的剂量或这样剂量的适当部分，如这样剂量的一半或三分 之一。
本发明药物组合物中的活性成分，药物学上可接受的载体和任意 其他成分的相对含量将根据所治疗患者的身份，大小和病症并进一步 根据组合物的给药途径而改变。例如，组合物可以包括0.1％至100％ (w/w)活性成分。
除了活性成分，本发明的药物组合物可以进一步包括一种或多种 其他药物活性剂。特别考虑的其他药剂包括止吐药和清除剂，如氰化 物和氰酸酯清除剂。
可以使用常规技术来制备本发明药物组合物的受控-或持续-释放 制剂。
适于局部给药的制剂包括，但不限于，液体或半固体制剂，如， 搽剂、洗剂、水包油或油包水乳剂，如霜剂、膏剂或糊剂，以及溶液 或悬浮液。局部给药制剂可以，例如，包括约1％至约10％(w/w)活 性成分，尽管活性成分的浓度可以高至该活性成分在溶剂中的溶解度 极限。局部给药制剂可以进一步包括一种或多种本文中所述的其他成 分。
可以使用渗透促进剂。这些物质增强药物穿过皮肤的渗透速率。 本领域中典型的增强剂包括乙醇、甘油单月桂酸酯，PGML(聚乙二醇 单月桂酸酯)、二甲亚砜等。其他增强剂包括油酸、油醇、乙氧基二甘 醇、月桂氮卓酮、烷羧酸、二甲亚砜、极性脂质或N-甲基-2-吡咯烷酮。
用于局部传送本发明某些组合物的一种可接受的载体可以含有脂 质体。脂质体的组成及其用途是本领域已知的(例如，参见，U.S.专利 No.6,323,219)。
待配制的活性化合物的来源通常取决于化合物的具体形式。可以 通过化学方式合成并以适于药物/化妆品应用的纯化形式提供有机小分 子和肽基或寡聚物片段。可以按照本领域公知的技术纯化天然提取物 的产物。本领域技术人员还可以利用重组来源的化合物。
在可替换的实施方案中，可以将局部活性药物或化妆品组合物任 选与其他组分混合，如保湿剂、化妆品佐剂、抗氧化剂、螯合剂、漂 白剂、酪氨酸酶抑制剂和其他已知的脱色素剂、表面活性剂、发泡剂、 调节剂、湿润剂、增湿剂、乳化剂、香料、增粘剂、缓冲剂、防腐剂、 遮光剂等。在另一个实施方案中、组合物包括渗透或透入增强剂、相 比较缺乏增强剂的组合物而言，它们可有效地改善活性成分的经皮渗 透和通过角质层，包括油酸、油醇、乙氧基二甘醇、月桂氮卓酮、烷 羧酸、二甲亚砜、极性脂质或N-甲基-2-吡咯烷酮在内的各种渗透促进 剂是本领域技术人员公知的。在另一个方面中，组合物可以进一步包 括水溶助剂，其起到提高角质层结构失调的作用，并因此提高穿过角 质层的转运。各种水溶助剂如异丙醇，丙二醇或二甲苯磺酸钠是本领 域技术人员已知的。本发明的组合物还可以含有活性量的类视黄醇 (即，结合类视黄醇受体家族中任何成员的化合物)，包括，例如，维 生素A酸、视黄醇、维生素A酸和/或视黄醇的酯等。
应当以有效产生所需改变的含量来施用局部活性药物或化妆品组 合物。如在此所用的“有效量”意思是足以覆盖需要改变的皮肤表面 区域的含量。活性化合物的含量应当为约0.0001％至约15重量％体积 的组合物。更优选其含量为组合物的约0.005％至约5％；最优选其含 量为组合物的约0.001％至约1％。这样的化合物可以是合成-或天然- 衍生的。
可以将直接由生物来源制备的液体衍生物和天然提取物用于本发 明的组合物，其浓度(w/v)为约1至约99％。天然提取物的部分和蛋 白酶抑制剂具有约0.01％至约20％，更优选约1％至约10％组合物的不 同优选范围。当然，可以将本发明活性剂的混合物混合并且共同用于 同一制剂或连续施用的不同制剂中。
本发明的组合物可以包括约组合物总重0.005％至2.0％的防腐剂。 水凝胶暴露于环境形式的污染物时，例如，暴露于空气或患者的皮肤， 包括为施用本发明的组合物如治疗凝胶或霜剂使用手指接触，防腐剂 用于防止由于患者反复使用导致的水凝胶变质。用于本发明的防腐剂 实例包括，但不限于，选自苄醇、山梨酸、对羟基苯甲酸酯，咪脲及 其混合物的那些。特别优选的防腐剂是约0.5％至2.0％苄醇和0.05％至 0.5％山梨酸的组合物。
组合物优选包括抑制用于本发明水凝胶制剂中化合物降解的抗氧 化剂和螯合剂。对某些化合物优选的抗氧化剂为BHT，BHA，α-生育 酚和抗坏血酸，其优选范围为组合物总重的约0.01％至0.3％，更优选 BHT占组合物总重的0.03％至0.10％。优选的螯合剂含量占组合物总 重的0.01％至0.5％。特别优选的螯合剂包括乙二胺四乙酸盐(例如， 乙二胺四乙酸二钠)和柠檬酸，其重量范围占组合物总重的约0.01％ 至0.20％，更优选0.02％至0.10％的范围。螯合剂可以用于螯合组合物 中可能对制剂存储期有害的金属离子。尽管BHT和乙二胺四乙酸二钠 各自是某些化合物特别优选的抗氧化剂和螯合剂，但是可以用本领域 技术人员已知的其他合适的和等同的抗氧化剂和螯合剂来取代它们。
还可以使用受控释放的制剂，使用这样制剂的方法是本领域技术 人员已知的。
在一些情况中，可以将所用的剂型制成其中使用一种或多种活性 成分的缓慢或受控释放制剂，例如，羟丙基甲基纤维素、其他聚合物 基质、凝胶、可渗透膜、渗透系统、多层包衣层、微粒、脂质体或微 球体或其组合，因此提供不同比例的所需释放模式。可以容易地选择 本领域普通技术人员已知的合适受控释放制剂，包括本文中所述的那 些，用于本发明的药物组合物。因此，本发明包括适于口服给药的单 位剂型，如适于控制释放的片剂、胶囊、软胶囊和胶囊型片剂。
所有受控释放药物产品的共同目的是提供比其相应的非受控释放 产品更好的药物治疗。实际上，最佳设计的受控制及在药物治疗领域 中的应用特征在于使用最少量的药物在最短时间内治愈或控制病症。 受控释放制剂的优点包括延长的药物活性，减少的给药频率和增加的 患者顺应性。此外，受控释放制剂可以影响作用开始的时间或其他特 性，如血药浓度，由此可以影响副作用的产生。
将大部分受控释放制剂设计成开始时释放迅速产生所需治疗效果 的药物含量，并在延长时间期限内逐步和持续释放维持该治疗效果水 平的其他药物量。为了维持体内这一恒定药物水平，药物必须以取代 体内代谢和排泄的药物量的速率从剂型中释放出来。
可以通过各种诱导剂来刺激活性成分的受控释放，例如，pH、温 度、酶、水或其他生理条件或化合物。本文将本发明上下文中的术语 “受控释放成分”定义为有利于活性成分受控释放的化合物，包括但 不限于，聚合物、聚合物基质、凝胶、可渗透膜、脂质体或微球体或 其组合。
可以使用获得活性成分在水性或油性载体中的悬浮液的常规方法 来制备液体悬浮液。水性载体包括，例如，水和等渗盐水。油性在体 包括，例如，杏仁油、油酯、乙醇、植物油、如花生油、橄榄油、芝 麻油或椰子油、分级分离的植物油、和矿物油、如液体石蜡。液体悬 浮液可以进一步包括一种或多种其他成分，包括但不限于，悬浮剂、 分散剂或湿润剂、乳化剂、缓和剂、防腐剂、缓冲剂、盐、调味剂、 着色剂和甜味剂。油悬浮液可以进一步包括增稠剂。已知的悬浮剂包 括，但不限于，山梨糖醇糖浆、氢化食用脂肪、藻酸钠、聚乙烯吡咯 烷酮、黄耆胶、阿拉伯树胶和纤维素衍生物、如羧甲基纤维素钠、甲 基纤维素、羟丙基甲基纤维素。已知的分散剂或湿润剂包括，但不限 于，天然产生的磷脂，如卵磷脂；烯化氧与脂肪酸、长链脂肪醇，来 源于脂肪酸和己糖醇的偏酯或来源于脂肪酸和己糖醇酸酐的偏酯的缩 合产物(例如，各自为聚氧乙烯硬脂酸酯、十七碳乙烯氧基鲸蜡醇、， 聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。已知 的乳化剂包括，但不限于卵磷脂和阿拉伯胶。已知的防腐剂包括，但 不限于，甲基、乙基或正丙基对羟基苯甲酸酯、抗坏血酸和山梨酸。 已知的甜味剂包括，例如，甘油、丙二醇、山梨糖醇、蔗糖和糖精。 用于油悬浮液的已知增稠剂包括，例如，蜂蜡、硬石蜡和鲸蜡醇。
可以基本上按照与液体悬浮剂相同的方式来制备活性成分在水性 或油性溶剂中的液体溶液，主要差别在于将活性成分溶于而非悬浮于 溶剂中。本发明药物组合物的液体溶液可以包括对于液体悬浮液所述 的每种成分，应当理解悬浮剂不一定有助于活性成分在溶剂中的溶解。 水性溶剂包括，例如，水和等渗盐水。油性溶剂包括，例如，杏仁油、 油酯、乙醇、植物油、如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油、分级分 离的植物油和矿物油，如液体石蜡。
可以利用已知方法来制备本发明制剂的粉状和颗粒状药物制剂。 可以将这样的制剂直接给药于患者，用于例如形成片剂，填充胶囊， 或通过加入水性或油性载体来制备水性或油性悬浮液。这些制剂可以 各自进一步包括一种或多种分散剂或湿润剂，悬浮剂和防腐剂。这些 直接中还可以包括其他赋形剂，如填充剂和甜味剂，调味剂或着色剂。
还可以制备、包装或销售水包油型乳剂或油包水型乳剂形式的本 发明药物组合物。油相可以为植物油，如橄榄油或花生油；矿物油， 如液体石蜡，或其组合。这类组合物可以进一步包括：一种或多种乳 化剂，如天然产生的树胶，如阿拉伯树胶或黄耆树胶，天然产生的磷 脂，如大豆磷脂或卵磷脂，来源于脂肪酸与己糖醇酸酐组合的酯或偏 酯，如失水山梨糖醇单油酸酯和这样的偏酯与烯化氧的缩合产物，如 聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。这些乳剂还可以含有其他成分，如 包括甜味剂或调味剂。
如在此所用的，“油性”液体是包括含碳液体分子并且呈现出低于 水的极性特征的液体。
可以制备，包装或销售离散的固体剂量单位形式的适于口服给药 的本发明药物组合物制剂，包括，但不限于片剂、硬胶囊或软胶囊、 扁囊剂、药片或锭剂、各自含有预定量的活性组分。适于口服给药的 其他制剂包括，但不限于，粉剂或颗粒剂、水性或油性悬浮剂、水性 或油性溶液、糊剂、凝胶、牙膏、漱口水、涂层、口腔漱液或乳剂。 在本文中口腔漱液和漱口水可以交替使用。
可以制备，包装或销售适于口服或经颊给药的制剂形式的本发明 药物组合物。这样的制剂包括，但不限于，凝胶、液体、悬浮液、糊 剂、牙膏、漱口水或口腔漱液和涂层。例如，本发明的口腔漱液可以 包括约1.4％的本发明化合物、葡萄糖酸氯己定(0.12％)、乙醇(11.2％)、 糖精钠(0.15％)、FD&C Blue No.1(0.001％)、薄荷油(0.5％)、甘 油(10.0％)、吐温60(0.3％)和补足至100％的水。在另一个实施方 案中，本发明的牙膏包括约5.5％的本发明化合物，70％的山梨糖醇水 溶液(25.0％)、糖精钠(0.15％)、硫酸月桂酯钠(1.75％)、6％聚羧 乙烯934分散液(15％)、留兰香油(1.0％)、50％氢氧化钠水溶液 (0.76％)、磷酸氢钙二水合物(45％)和补足至100％的水。本文中所 述制剂的实例并非穷尽，可以理解本发明包括本文中未描述的，但是 本领域技术人员公知的这些和其他制剂的其他改进形式。
例如，可以任选与一种或多种其它成分一起通过压片或模制活性 成分来制备包括活性成分的片剂。可以通过在合适的装置中压制自由 流动形式的活性成分，如任选混有一种或多种粘合剂、润滑剂、赋形 剂、表面活性剂和分散剂的粉状或颗粒状制品来制备压制片剂。可以 通过在合适的装置中模压活性成分，药物学上可接受的载体和至少足 量使混合物润湿的液体的混合物来制备模制片剂。制备片剂中所用的 药物学上可接受的赋形剂包括，但不限于惰性稀释剂，成粒剂和崩解 剂，粘合剂和润滑剂。已知的分散剂包括，但不限于，马铃薯淀粉和 乙醇酸淀粉钠。已知的表面活性剂包括，但不限于，硫酸月桂酯钠。 已知的稀释剂包括，但不限于，碳酸钙、碳酸钠、乳糖、微晶纤维素、 磷酸钙、磷酸氢钙和磷酸钠。已知的成粒剂和崩解剂包括，但不限于， 玉米淀粉和藻酸。已知的粘合剂包括，但不限于，明胶、阿拉伯胶、 预糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基甲基纤维素。已知的润滑 剂包括，但不限于，硬脂酸镁、硬脂酸、二氧化硅和滑石。
可以不对片剂包衣或使用已知方法将它们包衣以便在患者胃肠道 中延缓崩解，从而使活性组分持续释放和吸收。例如，可以将如硬脂 酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯这样的物质用于给片剂包衣。更多实例， 可以使用U.S.专利号4,256,108；4,160,452和4,265,874中所述的方法 给片剂包衣以形成渗透受控释放片剂。片剂可以进一步包括甜味剂， 调味剂，着色剂，防腐剂或它们中的某些组合，以便提供药物学上精 巧和适口的制剂。
可以使用生理上可降解的组合物，如明胶，来制备包括活性成分 的硬胶囊。这些硬胶囊包括活性成分，并且可以进一步包括其他成分， 例如，包括：惰性固体稀释剂，如碳酸钙、磷酸钙或高岭土。
可以使用生理上可降解的组合物，如明胶，来制备包括活性成分 的软胶囊。这些软胶囊包括活性成分，其可以与水或油介质如花生油， 液体石蜡或橄榄油混合。
可以制备、包装和销售液体形式或在使用前用水或另一种合适的 载体重建的干品形式的本发明适于口服的药物组合物的液体制剂。
可以制备、包装或销售适于直肠给药的制剂形式的本发明药物组 合物。例如，这样的组合物可以为栓剂、滞留型灌肠剂和直肠或结肠 冲洗溶液的形式。
可以通过将活性成分与无刺激性的药物学上可接受的赋形剂混合 来制备栓剂，所述赋形剂在普通室温(即，约20℃)为固体，而在患 者直肠温度下(即，在健康人体内约为37℃)为液体。合适的药物学 上可接受的赋形剂包括，但不限于，可可脂、聚乙二醇和各种甘油酯。 栓剂可以进一步包括各种其他成分，包括但不限于，抗氧化剂和防腐 剂。
可以通过将活性成分与药物学上可接受的液体载体混合来制备用 于直肠或结肠冲洗的滞留型灌肠剂或溶液。如本领域中公知的，可以 使用适于患者直肠解剖结构的传送装置来给予灌肠剂，并可以将它们 包装在所述传递装置内。灌肠剂可以进一步包括各种其他成分，包括 但不限于，抗氧化剂和防腐剂。
可以制备，包装或销售适于阴道给药的制剂形式的本发明药物组 合物。例如，这类组合物可以为以下形式，栓剂、浸渍或包衣的可插 入阴道的物质，如阴道拴、灌洗剂或凝胶或霜剂或阴道冲洗溶液。
用化学组合物浸渍或包衣物质的方法是本领域公知的，包括但不 限于，使化学组合物沉积或结合在表面上的方法，在合成所述物质过 程中将化学组合物引入物质结构的方法(即，如使用生理上可降解的 材料)以及使水性或油性溶液或悬浮液吸收入吸附剂材料且随后干燥 或不进行干燥的方法。
可以通过将活性成分与药物学上可接受的液体载体混合来制备用 于阴道冲洗的灌洗剂或溶液。如本领域公知的，可以使用适于患者阴 道结构的传送装置给予灌洗剂，并且可以将它们包装在所述传送装置 内。
灌洗剂可以进一步包括各种其他成分，包括但不限于抗氧化剂， 抗真菌剂和防腐剂。本文所用的药物组合物的“非肠道给药”包括任 意给药途径，其特征在于对患者组织作物理切口并通过该组织裂口给 予药物组合物。非肠道给药包括，但不限于，通过注射组合物，通过 手术切口施用组合物，通过透入组织的非手术伤口使用组合物等给予 该药物组合物。特别考虑的非肠道给药，包括但不限于，皮下、腹膜 内、肌内、胸骨内注射和肾透析灌输技术。
适于非肠道给药的药物组合物制剂包括混合药物学上可接受载体 如无菌水或无菌等渗盐水的活性成分。可以以适于弹丸给药或连续给 药的形式制备，包装或销售这样的制剂。可以以单位剂型形式制备， 包装或销售可注射制剂，如含有防腐剂的安瓿或多剂量容器形式。用 于非肠道给药的制剂包括，但不限于，悬浮液，溶液，油性或水性载 体中的乳剂、糊剂和可植入缓释或可生物降解的制剂。这样的制剂可 以进一步包括一种或多种其他成分，包括但不限于，悬浮剂、稳定剂 或分散剂。在用于非肠道给药制剂的一个实施方案中，将活性组分制 成可用合适的载体(例如，无菌无热原的水)重建的干品(即，粉末 或颗粒)形式，此后经非肠道给予这种重建的组合物。
可以以无菌可注射水性或油性悬浮液或溶液的形式制备，包装或 销售药物组合物。可以按照本领域公知的方式来配制这样的悬浮液或 溶液，除了活性成分外，它们还可以包括本文中所述的其他成分，如 分散剂、湿润剂或悬浮剂。可以使用无毒性的非肠道可接受的稀释剂 或溶液来制备这样的无菌可注射制剂，如水或1，3-丁二醇。其他可接受 的稀释剂和溶剂包括，但不限于，林格溶液，等渗氯化钠溶液和固定 油，如合成的单酸甘油酯或二脂酰甘油酯。可用的其他非肠道给药用 制剂包括在脂质体制剂中含有微晶形式活性成分的那些或作为生物可 降解聚合物系统中的成分的制剂。用于缓释或植入的组合物可以包括 药物学上可接受的聚合或疏水材料，如乳剂、离子交换树脂，难溶聚 合物或难溶性盐。
可以制备、包装或销售适于经颊给药的制剂形式的本发明药物组 合物。例如，这样的制剂可以为使用常规方法制备的片剂或锭剂形式， 例如可以含有0.1-20％(w/w)活性成分，余量包括口服可溶解或可降 解的组合物和任选一种或多种本文中所述的其他成分。另一方面，适 于经颊给药的制剂可以包括含有活性组分的粉剂或气物化或雾化溶液 或悬浮液。这样的粉状、气雾化或雾化制剂在分散时优选具有约0.1 至约200纳米范围的平均颗粒或液滴大小，并且可以进一步包括本文 中所述的一种或多种其它成分。
如在此所用的，“其他成分”包括，但不限于，以下的一种或多种： 赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；成粒剂和崩解剂；粘合 剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理上可降解的组 合物，如明胶；水性载体和溶剂；油性载体和溶剂；悬浮剂；分散剂 或湿润剂；乳化剂；缓和剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填充剂；乳化剂； 抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂和药物学上可接受的聚合物或 疏水物质。其他本发明药物组合物中可以包括的“其他成分”是本领 域公知的，例如，描述于Genaro编辑的(1985，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA)中，在此 将其引入作为参考。
通常，可以给药于动物，优选人的本发明化合物的剂量将根据许 多因素而改变，包括，但不限于，所治疗的动物类型和疾病类型，动 物年龄和给药途径。
本发明化合物给药于动物的频率可以是每天数次，或者更不频繁 地给药，如每天一次，每周一次，每两周一次，每月一次乃至更不频 繁，如每隔几个月一次乃至每年一次或更低的频率。给药频率对本领 域技术人员而言是显而易见的，取决于许多因素，如但不限于，所治 疗的疾病类型和严重程度，动物类型和年龄等。
本领域技术人员可以认识到本发明如上所述涉及抑制3DG或治疗 与3DG相关疾病或病症方法的各种实施方案包括本文中未描述的其他 疾病和病症。
试剂盒
本发明应当包括用于抑制或刺激3DG，治疗与3DG相关的皮肤疾 病和失调的试剂盒，用于测定3DG以及与3DG相关参数的试剂盒和 用于诊断与3DG相关的皮肤病和失调的试剂盒。本发明还应当包括用 于3DG以外的α-二羰基糖的试剂盒。
本发明包括试剂盒，其含有3DG抑制剂或本发明中鉴定的化合物， 标准品和描述将抑制剂或含有抑制剂或化合物的组合物给药于细胞或 动物的说明材料。本发明应当包括本领域技术人员公知的试剂盒的其 他实施方案，如包括标准品和(优选无菌的)适于在给药于细胞或动 物前溶解或悬浮本发明组合物的溶剂的试剂盒。优选所述的动物为哺 乳动物。更优选所述的哺乳动物为人。
本发明还包括试剂盒，其含有3DG降解，解毒或清除的刺激剂或 本发明鉴定的这样的刺激化合物，标准品和描述将刺激剂或含有刺激 剂或化合物的组合物给药于细胞或动物的说明材料。本发明应当包括 本领域技术人员公知的试剂盒的其他实施方案，如包括标准品和(优 选无菌的)适于在给药于细胞或动物前溶解或悬浮本发明组合物的溶 剂的试剂盒。
根据本发明，如上所述或如下实施例中所述的，可以使用本领域 技术人员已知的常规化学，细胞，组织化学，生物化学，分子生物学， 微生物学和重组DNA技术。这样的技术在文献中得到更全面的解释。 参见，例如，Sambrook等，1989 Molecular Cloning-a Laboratory Manual (分子克隆-实验室手册)，Cold Spring Harbor Press；Glover，(1985) DNA Cloning：a Practical Approach(DNA克隆：实践方法)；Gait，(1984) Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)；Harlow等，1988 Antibodies-a Laboratory Manual(抗体-实验室手册)，Cold Spring Harbor Press；Roe 等，1996 DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques(DNA分 离和测序：必要的技术)，John Wiley和Ausubel等，1995 Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学的通用方案)，Greene Publishing。
无需进一步描述，本领域技术人员可以使用以上的描述和以下的 说明性实施例来制备和使用本发明的化合物并实施所要求的方法。因 此以下的操作实施例特别指出了本发明的优选实施方案，但它们不应 当以任何方式作为对本发明剩余部分的限制。
实施例
现在参照以下的实施例来描述本发明。提供这些实施例只是为了 说明的目的，本发明决不限于这些实施例，而应包括作为本文提供教 导的结果而显而易见的任何和所有变化形式。
方法
经皮药物传送
将化合物(包括药物或其他治疗剂)通过皮肤传送至体内存在几 种优势，这是称为经皮药物传送的过程。经皮药物传送提供了具有吸 引力的注射和口服药物的替换方案。其提供了使用单次施用持续多天 治疗的能力，因此提高了患者的顺从性。通过传送系统中存在的药物 存储器及其受控的释放特征，这样的传送将延长半衰期短的药物的活 性。经皮药物传送避免了吸收过程中由酶或药物与食品的相互作用引 起的胃肠道困难。不仅避免了首关通过，即，药物物质通过全身和部 分循环的最初通路。然而，因为低皮肤渗透性的结果，经皮药物传送 的应用只限于一些药物[Prausnitz，M.R.等，Current status and future potential of transdermal drug delivery(经皮药物传送的现状和将来的潜 能)2004.Nat Rev Drug Discov 3(2)：p.115-124]。
溶质的经皮转运很大程度上受到角质层脂质双层的控制。角质层 脂质双层中的溶质转运，和其他脂质双层系统一样，是高度各向异性 的和大小依赖性的。具体地，脂质双层呈现出强烈的结构不均匀性， 这导致溶质分配和扩散系数的空间变化。结果，认为分子按照尾组 (tail-group)(用于疏水性分子)或头组(head-group)(用于亲水性分 子)区域内的迂回途径穿过皮肤扩散，其中双层之间的转运可以发生 于双层-双层界面或结构瓦解的其他部位[Marrink，S.J.和Berendsen， H.J.Permeation Process of Small Molecules across Lipid Membranes Studied by Molecular Dynamics Simulations(通过分子动力学模拟研究 的小分子穿过脂质膜的渗透过程)1996.J.Phys.Chem.100(41)： p.16729-16738]。
一些药物将有效地渗透皮肤。烟碱，雌激素，东茛菪碱，芬太尼 和硝化甘油是其中可以成功地从贴剂经皮传送的一些药物，只是因为 它们相对小并且在0.1mg至15mg/天的小剂量是有效的[Kanikkannan， N.等，Structure-activity relationship of chemical penetration enhancers in transdermal drug delivery(化学渗透促进剂在经皮药物传送中的结构- 活性关系)，2000，Curr Med Chem 7(6)：p.593-608]。许多其他药物 只有在提供另外的增强系统来“迫使”它们穿过皮肤时，才能得到传 送。经皮药物传送的几种方法是电穿孔，超声波导入(sonophoresis)， 离子导入(iontophoresis)，渗透促进剂(环糊精)和脂质体。
可以通过局部使用这些经皮传送方法中的任一种来给药本发明的 化合物。
脂质体
脂质体是微观的，充满流体的小袋，它的壁是由与构成细胞膜的 那些相同的磷脂层构成的。它们是公知的并且它们的结构和特性已经 得到了彻底的研究。实质上，它们是小的单层或多层脂质/水结构，具 有微米范围的直径。可以从各种天然磷脂，如胆固醇，硬脂酰胺或磷 脂酰胆碱形成脂质体。可以将它们配制来掺入各种物质，作为水或脂 质间隔中的有效负荷。
由于它们的组成，脂质体是非常多用途的和易变的。它们可以用 于将疫苗，蛋白质(酶)，核苷酸，质粒，药物或化妆品传送至身体。 脂质体可以用作亲脂性药物如AZT的抗肿瘤和抗病毒衍生物的载体 [Kamps，J.A.等，Preparation and characterization of conjugates of (modified)human serum albumin and liposomes：drug carriers with an intrinsic anti-HIV activity((修饰的)人血清白蛋白和脂质体的缀合物的 制备和表征：具有内在抗-HIV活性的药物载体)1996.Biochim Biophys Acta 1278(2)：p.183-90]。胰岛素也可以通过脂质体来传送[Muramatsu， K.等，The relationship between the rigidity of the liposomal membrane and the absorption of insulin after nasal administration of liposomes modified with an enhancer containing insulin in rabbits(兔子中鼻内给药用含有胰 岛素的促进剂修饰的脂质体后脂质体膜的硬度和胰岛素吸收之间的关 系)1999，Drug Dev Ind Pharm 25(10)：p.1099-105]。对于作为药物 载体的医疗用途，还可以静脉内注射脂质体，并且用脂质修饰时，它 们的表面变得更亲水，并因此可以显著提高在血流中的循环时间。这 样称为“stealth”脂质体特别用作用于亲水性(水溶性)抗癌药物如阿 霉素的载体。Toxantrone和其他在治疗影响免疫系统的吞噬细胞的疾病 中特别有效，因为它们易于在吞噬细胞中累积，吞噬细胞将它们识别 为外源入侵者[Rentsch，K.M.等，Dertermination of mitoxantrone in mouse whole blood and different tissues by high-performance liquid chromatography(通过高性能液相色谱测定小鼠全血和不同组织中的米 托蒽醌)1996.J Chromatogr B Biomed Appl 679(1-2)：p.185-92]。还 已经在实验上将它们用于将正常基因携带至细胞中来替代缺陷的引起 疾病的基因[Guo，W.和Lee，R.J.Efficient gene delivery using anionic liposome-complexed polyplexes(LPDII)(使用阴离子脂质体复合的 polyplex(LPDII)的有效基因传送)2000，Biosci Rep20(5)：p.419-32]。
由于它们的保湿特性，脂质体有时候还用于化妆品中。发现磷脂 混合水立即形成球体，因为每个分子的一端是水溶性的，而相对的一 端是水不溶性的。
超声波导入
从60年代开始超声波导入或声波导入已经广泛用于运动医学。人 体内的受控研究已经证明了使用目前使用参数的技术的不存在的或适 度的效果(频率1-3MHz，强度1-2W/cm(2)，持续时间5-10分钟， 连续或脉冲模式)。然而，在1995年证明了使用低频率超声给药具有 恒定生物活性的大分子在动物体内是可行的。这导致对经皮给药的这 种方法的新的研究[Machet，L.和Boucaud，A.Phonophoresis：efficiency， mechanisms and skin tolerance(声波导入：效率，机理和皮肤耐受性) 2002.Int J Pharm 243(1-2)：p.1-15]。
在该方法中，超声的短期应用用于渗透皮肤持续延长的时间段。 通过超声诱导的提高在低频率(f<100kHz)特别显著。在该阶段的过 程中，超声渗透的皮肤可以用于药物传送。此外，可以通过渗透的皮 肤提取间隙流体或其成分的样品，用于诊断应用。已经使用胰岛素和 甘露醇作为模式药物进行了对药物传送的详细研究。使用葡萄糖作为 模式分析物进行了对诊断的研究[Mitragotri，S.和Kost，J.Low-frequency sonophoresis：a noninvasive method of drug delivery and diagnostics(低频 率超声波导入：一种非入侵的药物传送和诊断方法)2000.Biotechnol Prog16(3)：p.488-92]。
体外，体内以及临床研究还证明了低频率超声对经皮药物传送和 葡萄糖提取的成功效果。已经综述了通过各种研究获得的机理理解 [Mitragotri，S.和Kost，J.Low-frequency sonophoresis：a review(低频率 超声波导入：综述)2004.Adv Drug Deliv Rev 56(5)：p.589-601]。
在日内瓦大学，科学院，药剂学校，进行了研究来阐明低频率超 声(20KHz)提高皮肤渗透性的机理。特别研究了屏障的物理作用和 转运途径。通过红外光谱测定超声波导入后从角质层的胞间结构域除 去的脂质含量。通过激光扫描共焦显微镜评价荧光探针尼罗红和钙黄 绿素在超声波影响下的转运。将结果与合适的阳性(passive)对照数 据和从实验获得数据相比较，在该实验中将皮肤简单暴露于超声波处 理诱导的热效应。在应用低频率超声波导入的过程中，除去了显著部 分(大约30％)的角质层的胞间脂质，角质层主要负责皮肤屏障功能。 尽管来自尼罗红实验的共焦图像没有特别地提供资料，超声波清楚地 和显著地(再次，相对于相应的对照)促进了亲水性钙黄绿素通过离 散渗透区域的转运，而屏障的其他区域明显没有受到影响。从角质层 除去脂质暗示了是一种有助于所观察到的低频率超声波促进渗透效果 的因素[Alvarez-Roman，R.等，Skin permeability enhancement by low frequency sonophoresis：lipid extraction and transport pathways(通过低频 率超声波导入的皮肤渗透性增强：脂质提取和转运途径)2003.J Pham Sci92(6)：p.1138-46]。
低频率超声波导入的影响似乎比高频率超声波导入的更重要，在 其应用后进出皮肤的转运显著提高。尽管作用机理仍然没有完全确定， 但强烈暗示了成穴作用和热过程[Merino，G..等，Ultrasound-enhanced transdermal transport(超声波提高的经皮转运)2003.J Pham Sci 92(6)： p.1125-37]。
在另一个研究中，已经显示出低频率超声波的应用提高了皮肤渗 透性，因此有助于大分子的传送(低频率超声波导入)。研究设法来决 定通过低频率超声波导入诱导的亲水性渗入物的经皮转运的理论描 述。研究了很多参数，如孔大小分布，绝对孔隙度以及对溶质特征的 有效弯曲度的依赖性。将猪皮暴露于58kHz的低频率超声波来获得不 同的皮肤抵抗力。测量了四种渗入物[甘露醇，促黄体生成激素释放激 素(LHRH)，胰岛素，葡聚糖]在超声波存在和不存在下的经皮传送。 改进多孔途径模型以将渗入物特征掺入模型中和获得负责亲水性渗入 物传送的途径的详细理解。对单个溶质的log kp(p)对log R的斜率图随 着溶质分子面积而改变，表明了每种渗入物的渗透性-抵抗力相关性与 其大小相关。渗入物在皮肤中的经历的曲折度也取决于其大小，其中 越大的分子经历越少曲折的途径。使用改进的多孔途径模型，独立地 计算有效的曲折度和皮肤多孔性。该研究的结果表明低频率超声波导 入形成了具有各种孔大小的用于渗入物传送的途径。溶质使用的最佳 孔大小与其分子半径(molecular radii)有关。[Tezel，A.等，Description of transdermal transport of hydrophilic solutes during low-frequency sonophoresisi based on a modified porous pathway model(在基于改进的 多孔途径模型的低频率超声波导入过程中亲水性溶质的经皮转运的描 述)2003.J Pharm Sci 92(2)：p.381-93]。
在体外实验中，已经进行了使用全厚猪皮来测量皮肤传导性和药 物渗透性的提高，并将超声波用于预处理皮肤，使用以20或40kHz频 率来操作超声波仪。还记录了铝箔的点蚀来测量成穴作用，这是低频 率超声波导入的主要机理。发现皮肤传导性增强与电级臂(horn)离开 皮肤的距离按比例逆相关。随着强度增加，皮肤传导性增强也提高至 一定的阈值，然后跌落。发生最大增强的强度(I(max))，对于20kHz 为约14W/cm2，对40kHz为17W/cm2。这些发现在最佳化低频率超声 波导入中是有用的。总地，转运对超声波参数的相关性与铝箔点蚀相 似。因此，这些结果支持低频率超声波导入中的成穴作用[Terahara，T. 等Dependence of low-frequency sonophoresis on ultrasound parameters； distance of the hornand intensity(低频率超声波导入对超声参数的相关 性；电级臂的距离和强度)2002.Int J Pharm 235(1-2)：p.35-42]。
认为通过低频率超声波导入的药物转运提高是通过成穴作用(气 泡的形成和破裂)介导的。已经假设通过提供用于成穴作用的核可以 显著提高低频率超声波导入的效率。在特定的研究中，将两种多孔树 脂，Diaion HP20和Diaion HP2MG(2MG)，用作成穴作用的核。使用 铝箔的点蚀测量了这些树脂对成穴作用的作用。与Diaion HP20相比 较，2MG显示出更高的提高成穴作用的效率。2MG在提高经皮甘露醇 转运中也是有效的。这些结果证实了成穴作用核如多孔树脂的添加进 一步提高了低频率超声波对皮肤渗透性的作用[Terahara，T.等，Porous resins as a cavitation enhancer for low-freq uency sonophoresis(多孔树脂 作为用于低频率超声波导入的成穴作用增强剂).2002.J Pham Sci 91 (3)：p.753-9]。
电穿孔
电穿孔是由于应用非常短(<1秒)的高电压脉冲的脂质双层膜的 短时结构摄动(structural perturbation)。将其应用于皮肤已经显示出将 经皮药物传送提高几个数量级。此外，但是使用电穿孔或结合其他促 进方法，扩大了可以经皮传送的药物的范围(小分子到大分子，亲脂 性的或亲水性的，带电荷的或中性分子)。通过由电穿孔短时渗透的皮 肤的分子转运主要由提高的扩散和电泳引起。转运的效率取决于电参 数和药物的理化特征。高电压脉冲的体内应用是充分耐受的，但是通 常诱导肌肉收缩。电极和钳片设计是降低人电治疗中不舒适性的重要 方面[Denet，A.R.等，Skin electroporation for transdermal and topical delivery(用于经皮和局部传送的皮肤电穿孔)2004.Adv Drug Deliv Rev 56(5)：p.659-74]。
离子导入
离子导入或电动药物给药(EMDA)是非常有效的将药物传送至 受影响部位的方法，通常用于许多国家中，包括USA。替代将药物(通 常是类固醇)直接注射至发炎部位，离子导入传播高浓度的药物，均 匀地通过组织，使用低密度电流，持续几分钟至几小时的时间，吸引 药物分子中的离子并驱动它们通过皮肤，以被发炎的组织吸收。
已经研究了溶解于羟丙基-β-环糊精(HP-β-CyD)水溶液中的氢化 可的松的经皮离子导入传送，并与助溶剂制剂的化学促进进行了比较 [Chang，S.L.和Banga，A.K.Transdermal iontophoretic delivery of hydrocortisone from cyclodextrin solutions(氢化可的松从环糊精溶液的 经皮离子导入传送)1998.J Pharn Pharmacol 50(6)：p.635-40]。从丙 二醇传送时，氢化可的松通过人尸体皮肤的被动渗透比溶解于 HP-β-CyD水溶液后传送时的高。然而，1％氢化可的松-9％HP-β-CyD 的离子导入传送高于通过1％氢化可的松-丙二醇制剂的被动传送量， 即使将油酸用作化学促进剂。1％氢化可的松和3％或15％HP-β-CyD的 离子导入传送低于9％HP-β-CyD溶液。这些数据表明主要是游离的氢 化可的松而不是复合物通过离子导入传送通过皮肤并且HP-β-CyD复 合物作为载体来补充氢化可的松的消耗。HP-β-CyD防止氢化可的松形 成皮肤存储器。离子导入提供了比化学方法更好的氢化可的松的经皮 传送的提高，只有当加入足量HP-β-CyD来溶解氢化可的松时[Chang， S.L.和Banga，A.K.Transdermal iontophoretic delivery of hydrocortisone from cyclodextrin solutions(氢化可的松从环糊精溶液的经皮离子导入 传送)1998.J Pharm Pharmacol 50(6)：p.635-40]。
渗透促进剂
另一种长期存在的促进经皮药物传送的方法使用渗透增强剂(也 称为吸收促进剂或促进剂)，其渗透进入皮肤来可逆地降低屏障阻力。 已经评价了各种化合物的促进吸收活性，包括亚砜(如二甲亚砜， DMSO)，氮酮(例如，laurocapram)，吡咯烷酮(例如，2-吡咯烷酮， 2P)，醇和链烷醇(乙醇或癸醇)，二元醇(丙二醇，PG，局部施用剂 型中的常见赋形剂)，表面活性剂(也是剂型中常见的)和萜烯。已经 鉴定了许多潜在的皮肤渗透促进剂的位点和作用模式；促进剂在胞间 脂质基质中可以破坏包装基序，胞间角蛋白结构域或通过作为膜内渗 入物的溶剂提高药物进入组织中。更多可能的作用机理，例如促进剂 作用于角质细胞之间的桥粒连接或改变皮肤内的代谢活性，或发挥对 载体中药物的热力学活性/溶解性的影响，也是可行的[Williams，A.C. 和Barry，B.W.Penetration enhancers(渗透促进剂)2004.Adv Drug Deliv Rev 56(5)：p.603-18]。
环糊精是具有亲水性外表面和一定亲脂性中央腔的环状寡糖。环 糊精能够与许多亲脂性水不溶性药物形成水溶性内含物复合体。在水 溶液中，位于中央腔中的药物分子处于与游离药物分子的动态平衡中。 此外，水性复合介质中的亲脂性分子将相互竞争腔室中的空间。由于 它们的大小和亲水性，只有不显著含量的环糊精和药物/环糊精复合物 能够渗透进入亲脂性生物屏障，如完整的皮肤。通常，环糊精通过提 高药物在屏障表面的利用率来提高局部药物传送。在表面，从环糊精 腔分离的药物分子进入亲脂性屏障。因此，从环糊精水溶液的药物传 送是扩散控制的和膜控制的。似乎环糊精只能在水存在下提高局部药 物传送[Loftsson，T.和Masson，M.Cyclodextrins in topical drug formulations：theoryand practice(局部药物制剂中的环糊精：理论和实 践)2001.Int J Pharm 225(1-2)：p.15-30]。
公知环糊精可以提高可溶性差的药物通过生物膜的渗透。然而， 以超过使药物成为溶剂化物需要的浓度加入环糊精，将降低渗透性。 环糊精的作用不能只解释为由于药物在水供体相中提高的溶解性，也 不能通过环糊精作为传统的渗透促进剂来解释，即，通过降低亲脂性 膜的屏障功能。就由扩散和膜控制的扩散构成的混合屏障而言，研究 已经模式化了环糊精的作用，其中水扩散层中的药物扩散显著比大量 供体中的慢。通过简单的数学等式来描述这种扩散模型，其中根据两 个常数P(M)/Kd和M1/2来表示系统的特征。使各种环糊精和环糊精聚 合物混合物存在下氢化可的松通过无毛小鼠皮肤的渗透数据适合来获 得用于这两个常数的值。准确地预测使用提高的环糊精复合物浓度通 量的上升，和使用过量的环糊精通量的下降。也可以使药物通过半渗 透性玻璃纸膜的渗透数据适合于等式。推断环糊精作为渗透促进剂， 携带药物通过含水屏障，从总体溶液朝向生物膜的亲脂性表面，其中 药物分子从复合物分离出来进入亲脂性膜[Masson，M.等Cyclodextrins as permeation enhancer：some theoretical evaluationsand in vitro testing (环糊精作为渗透促进剂：一些理论评价和体外测试)1999.J Control Release 59(1)：p.107-18]。
实施例1
FL3P的分离和鉴定：
进行下列测试以便证实可以以磷酸化状态鉴定果糖-赖氨酸(FL)， 例如FL3P。对糖尿病型大鼠肾的高氯酸提取物进行31PNMR分析，并 在6.24ppm下显示出新的糖-单磷酸共振，这在非肾组织中未观察到且 在非糖尿病肾中以显著降低的水平存在。通过在微晶纤维素柱上对提 取物进行色谱来分离产生所观察引起共振的化合物，将1-丁醇-乙酸- 水(5：2：3)用作洗脱剂。通过质子2D COSY测定出该结构为果糖- 赖氨酸3-磷酸。之后通过给动物注射如上所述制备的FL证实了这点 (Finot和Mauson，1969，Helv.Chim.Acta，52：1488)，并且显示出 直接磷酸化成FL3P。
使用特别在3-位氘化的FL证实磷酸位于碳-3位上。该步骤通过分 析耦合和去耦合的31P NMR光谱来进行。正常的P-O-C-H耦合产生 FL3P双峰，J值为10.3Hz；而P-O-C-D没有耦合，产生耦合和去耦合 的单峰，正如针对3-氘化FL3P所发现的结果。FL3P的独特特性在于 用硼氢化钠处理时，它在5.85和5.95ppm处转化成两个新的共振，相 当于甘露糖醇和山梨糖醇-赖氨酸3-磷酸盐。
实施例2
FL3P的合成：
将1mmol二苄基-葡萄糖3-磷酸和0.25mmolα-苄酯基-赖氨酸在 50ml MeOH中回流3小时。用100ml水稀释该溶液并用Dow-50柱(2.5 ×20cm)在吡啶盐形式中进行色谱分析，首先用水(200ml)，然后用 600ml缓冲液(0.1M吡啶和0.3M乙酸)洗脱。在水洗涤结束和缓冲 液洗涤开始时洗脱下目标化合物。结果证实在20psi氢下使用5％Pd/C 除去cbz和苄基封端基后以产率6％得到FL3P。
实施例3
由FL和ATP酶促产生FL3P以及用于筛选抑制剂的试验：
开始将31P NMR用于证实肾皮质中的激酶活性。将3g新鲜的猪肾 皮质样品在含有150mM KCl，5mM DTT，15mM MgCl2，pH7.5的9ml 50mM Tris-HCl中均质。将其以10,000g离心30分钟，然后以100,000g 将上清液离心60分钟。加入硫酸铵至60％饱和。在4℃下1小时后， 通过离心收集沉淀并将其溶于5ml的原始缓冲液中。在37℃下将2ml 该溶液的等分部分与10mM ATP和10mM FL(如上所述实施例1中所 述制备)一起保温2小时。用300μl高氯酸使反应淬灭，离心以除去蛋 白质并在Sephadex G10柱(5×10cm)上脱盐。对该反应混合物的31P NMR分析检测到形成了FL3P。
基于由此获得的激酶活性证据，研发了放射性试验。该试验设计 成使用FL3P与Dow-50阳离子交换树脂之间的结合。在尝试分离FL3P 的过程中发现了它的这一特征。因为大部分磷酸盐不与树脂结合，所 以怀疑所有与ATP和任意过量ATP反应的化合物可能未结合。本试验 中的第一步用于测定试验中除去ATP所需的树脂量。该过程通过下列 步骤进行：用移液管将所述混合物吸入200mg Dow-1在0.9ml H2O中 的悬浮液中，涡旋并离心以沉淀树脂。用移液管从其中将0.8ml上清液 吸到200mg新鲜的干燥树脂上，涡旋并离心。用移液管将0.5ml体积 的上清液吸入10ml Ecoscint A中并计数。残余计数为85cpm。该步骤 用于本试验。在4℃下将从对粗制皮质匀浆进行60％硫酸铵沉淀得到的 沉淀重新溶于匀浆缓冲液中。本试验含有在0.1ml 50mM Tris·HCl，pH 7.5中的10mM γ33P-ATP(40,000cpm)，10mM FL，150mM KCl，15mM MgCl2，5mM DTT。在37℃使用重复三份1，2和4mg蛋白质测定30 分钟来确定FL3P产率和酶浓度之间的相关性。减去同时进行的没有 FL的空白并记录数据。观察到的活性相当于FL3P合成速率近似值为 20nmols/hr/mg蛋白质。
实施例4
葡甲胺和各种多元醇赖氨酸抑制3-脱氧葡糖醛酮的形成：
a.一般多元醇赖氨酸合成：
将糖(11mmole)，α-苄酯基-赖氨酸(10mmol)和NaBH3CN (15mmole)溶于50ml MeOH-H2O(3：2)并在25℃下搅拌18小时。 用过量的Dow-50(H)离子交换树脂处理该溶液以使过量的NaBH3CN 分解。将该混合物(液体+树脂)转至Dow-50(H)柱(2.5×15cm)上 并用水充分洗涤以除去过量的糖和硼酸。用5％NH4OH洗脱苄酯基-多 元醇赖氨酸。将蒸发时得到的残余物溶于水-甲醇(9：1)并用氢气 (20psi)，使用10％钯炭催化剂还原。过滤并蒸发得到多元醇赖氨酸。
b.用山梨糖醇赖氨酸，甘露糖醇赖氨酸和半乳糖醇赖氨酸还原尿 和血浆3-脱氧葡糖醛酮的实验方案：
从6只大鼠中采集尿3小时。还获得血浆样品。然后通过腹膜内 注射对动物给予10μmol山梨糖醇赖氨酸，甘露糖醇赖氨酸或半乳糖醇 赖氨酸。再采集3小时尿并在该3小时结束时得到血浆样品。
a.如下实施例5中所述测定样品中的3-脱氧葡糖醛酮并将可变体 积对肌酸酐校准。使用山梨糖醇赖氨酸将尿3-脱氧葡糖醛酮平均还原 50％，使用甘露糖醇赖氨酸将尿-3脱氧葡糖醛酮平均还原35％，使用 半乳糖醇赖氨酸将尿-3脱氧葡糖醛酮平均还原35％。使用山梨糖醇赖 氨酸将血浆3-脱氧葡糖醛酮平均还原40％，使用甘露糖醇赖氨酸将血 浆3-脱氧葡糖醛酮平均还原58％，使用半乳糖醇赖氨酸将血浆-3脱氧 葡糖醛酮平均还原50％。
b.使用葡甲胺还原尿3-脱氧葡糖醛酮：
如上述b)中处理所述3只大鼠，但经腹膜内注射葡甲胺(100μmol) 而不是上述赖氨酸衍生物。注射后3小时尿中的平均3-脱氧葡糖醛酮 浓度下降42％。
实施例5
摄取糖化蛋白后人尿FL，3DG和3DF升高：
a.含有糖化蛋白的食品的制备：
将260g酪蛋白，120g葡萄糖和720ml水混合得到均匀混合物。将 该混合物转至金属板上并在65℃下加热68小时。然后将得到的饼状物 粉碎成粗粉。
通过Kjeldahl步骤测定该粉末含有60％蛋白质。
b.糖化赖氨酸含量的测定：
通过与6N HCl一起回流20小时水解如上述步骤a中制备的1克 粉末。用NaOH溶液将所得溶液调节至pH1.8并稀释至100ml。用氨 基酸分析仪将果糖赖氨酸含量测定为获自果糖赖氨酸的酸水解产物糠 氨酸(furosine)。按照这种方式测定饼中含有5.5％(w/w)果糖赖氨酸。
c.实验方案：
志愿者花费2天食用不含果糖赖氨酸的膳食，然后消耗如本文所 述制备的22.5g食品，由此有效接受了2克剂量的果糖赖氨酸。间隔2 小时采集尿，持续14小时，并且在24小时时进行最终的采集。
d.尿中FL，3DG和3DF的测定：
在46℃下通过HPLC，使用Waters996二极管阵列测定FL，其中 使用Waters C18游离氨基酸柱和乙腈-甲醇-水(45:15:40)到乙腈-乙 酸钠-水(6:2:92)中的梯度洗脱系统，流速为1ml/分钟。定量测定中 使用葡甲胺作为内标。
在样品去离子化后通过HPLC测定3DF。使用Dionex DX-500 HPLC系统，使用PA1柱(Dionex)进行分析，并用32mM氢氧化钠 以1ml/分钟洗脱。根据每天使用合成3DF获得的标准曲线进行定量。
在样品去离子化后通过GC-MS测定3DG。使用在PBS中的10- 倍过量二氮基萘衍生3DG。进行乙酸乙酯萃取得到不含盐的级分，使 用Tri-Sil(Pierce)将其转化成三甲基甲硅烷基醚。使用Hewlett-Packard 5890选定离子监测GC-MS系统进行分析。使用熔凝硅石毛细管柱 (DB-5，25m x.25mm)，使用如下温度程序进行GC：注入口250℃， 起始柱温度150℃(将其保持1分钟)，然后以16℃/分钟增加至290℃， 并保持15分钟。3DG的定量使用应用U-13C-3DG内标的选定离子监 测。
现在列出本实施例中所述的实验结果。
图3中绘制的图表示消耗糖化蛋白后的1位志愿者尿中产生的FL， 3DF和3DG。显然所有三种代谢物均快速出现。甚至在24小时后，3DF 和3DG仍表现出适度升高。
图4中所示的图表示7人测试组中每一位成员中的3DF形成。在 所有例子中均观察到类似的模式。如图4中所示的，在FL弹丸注射后 约4小时，3DF排泄达到峰值，甚至在弹丸注射后24小时，3DF的适 度升高仍然明显。
实施例6
增加的糖化蛋白膳食摄取的影响：
N-乙酰-β-葡糖胺酶(NAGase)是糖尿病人中以升高的浓度排泄入 尿的酶。认为它是肾小管损害的早期标志，而尿中NAGase增加的发 病机理尚没有得到充分了解。已经提出糖尿病中NAGase在尿中排出 增加是由于糖尿病诱导的近端肾小管中溶酶体活化排入尿增加而非细 胞破坏所导致的。
在几个月内给大鼠饲喂含有3％糖化蛋白的膳食或对照组饲料。在 不同时间点测定NAGase和3DF的尿排出量，如图5中所示。还测定 了尿中排泄的3DG的量。
本实施例中获得的结果证实，在所有比较中，实验组中的3DF和 NAGase水平均比对照组高。因此，饲喂糖化蛋白的动物将过量的 NAGase排入尿中，与在糖尿病中获得的结果类似。实验组中NAGase 的排出量比对照动物增加约50％。实验动物还具有比对照组增加5倍 的尿3DF。发现尿3DF与3DG有极为密切的相关性，如图5和6中观 察到的。
实施例7
肾蛋白质的电泳分析
给2只大鼠每日注射5μmol FL或甘露糖醇(用作对照)，持续5 天。处死动物并取出肾，解剖成皮质和髓质。在5倍体积的含有150mM KCl，15mM MgCl2和5mM DTT(pH7.5)的50mM Tris-HCl中匀浆组 织。通过以10,000×g离心15分钟除去细胞碎片，然后以150,000×g将 上清液离心70分钟。通过使用12％聚丙烯酰胺凝胶以及4-15和10-20％ 梯度凝胶的SDS PAGE分析可溶性蛋白。
在所有情况中均发现，与注射甘露糖醇的动物相比，来自注射了 FL的动物的肾提取物中低分子量条带缺失或观察到减弱。
实施例8
3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸的合成
将3-OMe葡萄糖(25克，129mmol)和α-Cbz-赖氨酸(12克， 43mmol)溶于200ml水-甲醇(2:1)中。加入氰基硼氢钠(10克， 162mmol)并将该反应体系在室温下搅拌18天。通过使用1-丁醇-乙酸 -水(4:1:1)的硅胶薄层色谱法监测α-Cbz-赖氨酸的反应，将茚三酮 用于显色。没用α-Cbz-赖氨酸残留时，反应完全。用HCl将该溶液调 节至pH2，以使过量的氰基硼氢分解，中和，然后上Dowex-50(H+) 柱(5×50cm)，并用水充分洗涤该柱以便除去过量的3-O-me-葡萄糖。 用5％氢氧化铵洗脱目标化合物。蒸发后，将残余物溶于50ml水-甲醇 (2:1)中并加入10％Pd/C(0.5克)。将该混合物在20psi氢气环境中 振荡1小时。过滤出活性炭，并蒸发滤液得到白色粉末(10.7克，基 于α-Cbz-赖氨酸的产率为77％)，通过反相HPLC分析时，为均匀的异 硫氰酸苯酯衍生物。元素分析：对于C13H28N2O7CH3OH·2H2O的计算 值，C，42.86；H，9.18；N，7.14；测定值：C，42.94；H，8.50；N， 6.95。
可以按照本领域技术人员公知的程序，例如，通过用糖化剂例如 果糖(如果需要，其可以是化学修饰的)来糖化选定的含氮-或含氧- 原料(其可以是氨基酸，聚氨基酸，肽等)来制备本文中别处讨论的 3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸结构相关的化合物。
实施例9
用于FL3P激酶活性的其他试验：
a.储液的制备：
制备试验缓冲溶液，其为100mM HEPES pH8.0，10mM ATP，2mM MgCl2，5mM DTT，0.5mM PMSF。制备果糖基-精胺的储液，其为2mM 果糖基-精胺HCl。制备精胺对照溶液，其为2mM精胺HCl。
b.果糖基-精胺的合成：
通过改进的已知步骤合成果糖基-精胺(J.Hodge和B.Fisher，1963， Methods Carbohydr.Chem.，2：99-107)。制备摩尔比为8:4:1(精胺： 葡萄糖：焦亚硫酸盐)的精胺(500mg)，葡萄糖(500mg)和焦亚硫 酸钠(80mg)在50ml甲醇-水(1:1)中的混合物并回流12小时。用 水将产物稀释至200ml并上DOW-50柱(5×90cm)。用两个柱体积的 水除去未反应的葡萄糖，并用0.1M NH4OH除去产物和未反应的精胺。 冻干合并的产物峰级分并通过产物定量13C NMR光谱上C-2果糖基峰 的积分来确定果糖基-精胺的浓度(使用45°脉冲，10秒松弛延迟来收 集NMR数据，没有NOE去耦合)。
c.测定纯化的激酶测试：
制备包括10μl酶制剂，10μl试验缓冲液，1.0μCi33P ATP，10μl果 糖基-精胺储液和70μl水的保温混合物，并在37℃下保温1小时。在 保温结束时将90μl(2×45μl)样品点在两个2.5cm直径的磷酸纤维素 盘(Whatman P-81)上并使其干燥。用水将该盘充分洗涤。干燥后， 将盘置于闪烁瓶内并计数。
重复两份检测每种酶样品，使用合适的精胺作为对照。
实施例10
食用糖化蛋白膳食的测试动物中观察到的肾病理情况：
对3只大鼠维持糖化蛋白膳食(20％总蛋白；3％糖化)8个月并 与9只相同年龄的维持对照组膳食的大鼠进行比较。糖化蛋白膳食由 3％糖化蛋白取代非糖化蛋白的标准膳食组成。通过将酪蛋白和葡萄糖 (2:1)彼此混合，加水(2×干物质重量)并在60℃下将该混合物烘烤 72小时制备糖化蛋白。按照相同方式制备对照，但不加水并且不在烘 烤前混合酪蛋白和葡萄糖。
最初的发现是使用糖化膳食的动物体内的肾小球受损明显增加。 在这些动物中观察到的典型损害为肾小球与肾小囊粘连导致的节段硬 化，周缘上皮和间质纤维化的管状组织转化。使用糖化蛋白膳食的所 有动物和使用对照膳食的仅仅1只动物显示出13％以上的受损肾小球。 这种情况偶然发生的可能性低于2％。除在肾小球中观察到的病理改变 外，还观察到了肾小管内有大量透明管型。在使用糖化膳食的动物中 发现了更多的这些透明管型，不过并没有对其进行定量。在使用糖化 膳食的动物中还观察到NAGase水平升高。
基于本实验结果，看起来糖化膳食可以导致测试动物发生一系列 与在糖尿病肾中观察到的相似的组织损害。
实施例12
果糖赖氨酸途径的致癌作用：
为了研究果糖赖氨酸途径中形成的代谢物的致癌可能性，利用对 肾癌有高度易感性的大鼠品系进行实验。
给4只大鼠使用糖化蛋白膳食，3只大鼠使用对照膳食。在使用膳 食10周后，处死动物并检查其肾脏。
在使用所述膳食的所有4只动物中，发现有大于1mm尺寸的肾癌， 而在对照组动物中没有发现这么大的损害。偶然发生这种情况的可能 性低于2％。
数据证实在肾小管细胞(已知为大部分肾癌的来源细胞)中存在 由来源于膳食中糖化蛋白的过量果糖赖氨酸导致的3DG水平升高，并 且3DG可以与细胞DNA发生相互作用，从而产生各种诱变效果，并 最终导致致癌结果。有可能该过程在人肾和其他部位中的癌发生中很 重要。
实施例13
糖化蛋白膳食对易感性大鼠中肾细胞癌的膳食影响：
除上述实验外，还进行评价糖化蛋白膳食与肾细胞癌之间的相关 性实验。
将二十八只带有对肾癌发生易感突变的大鼠分成两组。给一组饲 喂糖化蛋白膳食，而另一组使用对照膳食。糖化蛋白膳食由加入了3％ 糖化蛋白的标准营养膳食组成。通过将酪蛋白和葡萄糖(2:1)彼此混 合，加水(2×干物质重量)并在60℃下将该混合物烘烤72小时制备糖 化蛋白。按照相同方式制备对照，但不加水并且不在烘烤前混合酪蛋 白和葡萄糖。在3周龄断奶后立即将大鼠置于所述膳食环境中并在接 下来的16周中维持其随意进食该膳食。然后处死动物，将肾固定并制 备苏木精和曙红切片。
由病理学家检查组织学样品。鉴定出4种类型的损害。它们包括： 囊肿；一般少于10个细胞的极小的肿瘤样细胞集合；0.5mm或0.5mm 以下的小肿瘤和大于0.5mm的肿瘤。就4种类型的损害而言，在使用 糖化膳食的动物中观察到的损害多于使用对照膳食的动物中观察到的 损害，如下表中所示的(表A)。
表A.
  囊肿 ≤10个细胞 ≤0.5mm >0.5mm 总计 对照 2 9 9 3 23
  糖化 9 21 32 6 68
为了概括结果，对每种膳食计算平均损害数量/肾切片。在对照和 糖化膳食中分别为0.82±0.74和2.43±2.33。偶然发生这种情况的可能性 在100,000中约为2。
这些结果为预测赖氨酸恢复途径的影响提供了强有力的支持，属 于本发明的这一发现可以扩展至导致突变，因此还产生了致癌作用。 这些结果为研发抑制这种途径的治疗方法和活性剂，以减少肾和这种 途径具有相似作用的其他器官中的癌症提供了基础。
实施例14
3-脱氧-果糖的尿排泄是患有I型糖尿病患者中微量蛋白尿发展的 象征：
如本文所述，糖化中间体3-脱氧-葡糖醛酮(3DG)及其还原解毒 产物3-脱氧-果糖(3DF)的血清水平在糖尿病中升高。已经在有胰岛 素依赖性糖尿病(IDDM)和微量蛋白尿(基于1990-1993之间开始的 2年基线过程中的多次测定)，但未使用ACE抑制剂的Joslin糖尿病中 心来自预测组患者的39个个体的组中检验了这些化合物的基线水平与 随后微量蛋白尿(MA)发展之间的相关性。
通过HPLC和GC-MS测定随机点样的尿中的3DF和3DG基线水 平。在接下来的4年中发展成高水平MA或蛋白尿个体(n＝24)具有 显著高于非发展者(n＝15)的log 3DF/尿肌酸酐比基线水平(p＝0.02)。
本研究中测定的基线水平在发展中约为0.24μmole/mg肌酸酐，而 在非发展者中约为0.18μmole/mg肌酸酐比例。基线3DG/尿肌酸酐比在 各组之间没有差异。调整HgAIC(糖基化血红蛋白的主要级分)的基线 水平基本上不会改变这些发现。这些结果又为尿3DF与糖尿病的肾并 发症发展之间的相关性提供了额外的证据。
a.3-脱氧果糖的定量：
通过使0.3ml测试样品的等分部分，通过含有0.15ml AG 1-X8和 0.15ml AG 50W-X8树脂的离子交换柱来处理样品。然后用0.3ml去离 子水洗涤该柱两次，抽吸以除去游离的液体并通过0.45mm Millipore 滤器过滤。
使用Dionex DX 500色谱系统分析注射的(50μl)经处理样品。使 用carbopac PA1阴离子交换柱，洗脱剂由16％氢氧化钠(200mM)和 84％去离子水组成。使用脉冲电流检测器通过电化学方式检测3DF。在 每种未知样品前后对跨越预计3DF浓度的标准3DF溶液进行实验。
b.尿肌酸酐的测定：
通过改动成适于平板读出器的终点比色法(Sigma诊断试剂盒 555-A)测定尿的肌酸酐浓度。评估肌酸酐浓度以校准尿体积，用于测 定其中所含代谢物的浓度。
c.尿中清蛋白的测定：
为了估计测定患者尿中清蛋白的水平，收集点样的尿并使用BN 100仪器与N-清蛋白试剂盒(Behring)进行免疫比浊 (immunoephelometry)。抗清蛋白抗体是可购得的。可以通过任意合适 的试验估计尿中的清蛋白水平，包括但不限于，ELISA测定，放射性 免疫测定，蛋白质印迹和斑点印迹。
基于对Joslin糖尿病中心患者的研究获得的数据，看起来尿3DF 水平升高与糖尿病中发展成微量蛋白尿有关。这一观察结果为评价患 有糖尿病的患者中发展成严重的肾并发症的可能性提供了新的诊断参 数。
实施例15
3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸降低正常和糖尿病大鼠中3DG的全身水 平：
将十二只糖尿病大鼠的组分成六只一组的两组。第一组仅接受盐 水注射，而第二组接受盐水溶液中的3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸注射 (50mg/kg体重)。对十二只非糖尿病大鼠的组实施相同的步骤。
如表B中所概括的，在一周内，在糖尿病和非糖尿病大鼠中，用 3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸治疗比相应的盐水对照组显著降低了血浆 3DG水平。
表B.3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸(3-OMe)降低了糖尿病和非糖尿 病大鼠的血浆3DG水平。
  糖尿病大鼠 非糖尿病大鼠 只有盐水 0.94±0.28μM(n＝6) 0.23±0.07μM(n＝6) 3-OMe 0.44±0.10μM(n＝6) 0.13±0.02μM(n＝7) 降低％ 53％ 43％ t-测试 p＝0.0006 p＝0.0024
3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸降低全身3DG水平的能力这一结果提示 非肾病的糖尿病并发症(例如，视网膜病和主动脉硬化)也可以受到 amadorase抑制剂疗法的控制。
实施例16
体内3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸吸收部位为肾：
给六只大鼠经腹膜内注射13.5nmol(4.4mg)的3-O-甲基山梨糖醇 赖氨酸。采集3小时尿，此后处死大鼠。取出将分析的组织并冷冻固 定在液氮中。将组织的高氯酸提取物用于代谢物分析。检验的组织取 自脑，心脏，肌肉，坐骨神经，脾脏，胰腺，肝脏和肾。还分析了血 浆。
仅在肾提取物中发现含有3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸。尿中也含有 3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸，但血浆中不含3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸。 从尿和肾中回收的注射剂量百分比在39％-96％之间变化，如下表C中 所示。
表C.
  大鼠#       注射的 3OMeSL  *nmols  尿中的 3OMeSL  nmols   肾中的 3OMeSL  nmols   总计回收 的       3OMeSL    回收的  3OMeSL％ 2084 13500 2940 10071 13011 96.4 2085 13500 1675 6582 8257 61.2 2086 13500 1778 5373 7151 53.0
  2087 13500 2360 4833 7193 53.3 2088 13500 4200 8155 12355 91.5 2089 13500 1355 3880 5235 38.8
*3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸
实施例17
amadorase/果糖胺激酶活性是3DG产生的主要原因：
在体外试验中，从反应中除去关键成分(10mMMg-ATP，部分纯 化的amadorase，2.6mM FL)来证实3DG的酶促产生，以评价它们在 3DG产生中的重要性。
结果证实在含有amadorase及其底物的肾提取物存在的情况下， 3DG产量高20倍以上(比较表D，反应1和3)。显然在amadorase存 在的情况下酶促介导了大部分3DG产生。
表D.24小时后3DG的amadorase-依赖性产生
  反应 Amadorase ATP FL(mM) FL3P(mM) 3DG(mM) 1 + + 2.6 0.2 1.58 2 + — 2.6 0 0.08 3 — + 2.6 0 0.09 4 — — 2.6 0 0.08 5 + + 0 0 0 6 — + 0 0 0
实施例18
3DG和3DG抑制对胶原蛋白交联的影响：
皮肤中存在高水平的胶原蛋白。为了证实这一点，可测定3DG对 胶原蛋白交联存在何种作用。
在体外有或没有3DG存在的情况下孵育胶原蛋白I。在37℃下将 小牛皮肤I型胶原蛋白(1.3mg；Sigma)在单独的pH7.25的20mM磷 酸钠缓冲液中或同时与5mM 3DG或5mM 3DG+10mM精氨酸一起以 1ml总体积孵育24小时，然后冷冻并冻干。将残余物溶于0.5ml的70％ 甲酸中，并加入溴化氰(20:1，w/w)。将该溶液在30℃孵育18小时。 在透析管中将样品对含有2％ SDS和2％甘油的pH6.8的0.125M Tris 透析，其中分子量截留值为10,000。将全部样品均调节至1ml体积。 通过使用等体积的样品并通过SDS-PAGE电泳(16.5％ Tris-tricine凝胶) 分析来测定胶原蛋白交联程度，如通过3DG对胶原蛋白迁移的影响所 确定的。
发现用3DG处理胶原蛋白导致胶原蛋白的迁移方式如同其具有更 高的分子量，这是交联的一个象征。图12中银染凝胶的影像证实了在 仅含有胶原蛋白或含有胶原蛋白+3DG+精氨酸的组中存在较少的高分 子条带。在没有3DG抑制剂存在的情况下，用3DG处理的组中存在 较多的高分子量条带。看起来在仅用3DG处理的样品中存在更多的蛋 白质。因为所有三份样品均以相同量的蛋白质开始，所以可推断在透 析过程中，因产生更多交联且保留了较高分子量的蛋白质而使得较少 的肽类从3DG处理的样品中脱离，当然本发明并不受此理论的约束。 换句话说，因为较小的分子肽类在透析过程中扩散出来，所以看起来 在对照组和3DG+精氨酸组中的蛋白质较少。
实施例19
皮肤中3DG的定位：
本说明书中所述的本发明首次鉴定了皮肤中存在3DG。
使用小鼠皮肤模型。制备1平方厘米(1cm)皮肤并接受高氯酸提 取。如上所述测定3DG。使用六只小鼠，在皮肤中测定的平均3DG量 为1.46+/-0.3μM。该值实质上高于在相同动物中检测到的血浆3DG浓 度(0.19+/-0.05μM)。这些数据和下述实施例20中所述的数据提示皮 肤中存在高水平的3DG是由于皮肤中产生了3DG。
实施例20
皮肤中Amadorase mRNA的定位：
尽管在皮肤中发现了高水平的3DG(参见上述实施例)，但是是否 局部形成了3DG和是否皮肤具有以酶促方式产生3DG的能力尚不了 解。分析amadorase mRNA的存在，并用作皮肤产生皮肤中存在的3DG 的能力的一种测量(参见上述实施例)。
从Stratagene购买从人肾脏和皮肤分离的Poly A+信使RNA。将该 mRNA用于RT-PCR过程。使用公开的amadorase序列(Delpierre等， 2000，Diabetes 49：10：1627-1634；Szwergold等，2001，Diabetes 50： 2139-2147)，利用基因3’末端的反向引物(bp930-912)进行RT来形 成用于PCR的cDNA模板。将同一引物与来自amadorase基因中段的 正向引物(bp412-431)一起用于从cDNA模板扩增amadorase基因。 PCR产物应为519bp片段。对人皮肤和肾脏样品进行RT-PCR，并通过 琼脂糖凝胶电泳进行分析，对不含cDNA模板的对照品进行同样的操 作。
结果证实皮肤确实表达amadorase mRNA。随后蛋白质的表达可能 导致了皮肤中3DG的产生。正如所预计的，观察到519bp产物(参见 图13)。不仅在肾中发现519bp片段(泳道1)，而且在皮肤中发现了 该片段(泳道3)。在未接受cDNA模板的组中没有检测到该519bp片 段(泳道2和4)。
实施例21
体外果糖赖氨酸对肾细胞的影响：
如上所述，高糖化蛋白如果糖赖氨酸的膳食对体内新陈代谢具有 显著作用。因此，体外直接测试果糖赖氨酸对肾细胞的作用。
结果证实体外对肾细胞给予果糖赖氨酸导致细胞中IV型胶原蛋白 水平增加。在小鼠肾小球膜细胞中测定到IV型胶原蛋白产生。对照组 (与10％葡萄糖一起生长)产生300ng IV型胶原蛋白/10,000个细胞， 而经果糖赖氨酸处理的细胞(5或10mM果糖赖氨酸与10mM葡萄糖) 产生560和1100ng/10,000个细胞。
实施例22
通过抑制Amadorase mRNA和蛋白质来抑制3DG：
可以通过抑制导致3DG合成的酶促途径中的成分来抑制3DG合 成。可以按照几种方式来实施该步骤。例如，可以使用上述的化合物 起作用来抑制导致3DG合成的本文中称为amadorase(果糖胺-3-激酶) 的酶，还可以通过上述化合物以外的阻断其信使或蛋白质合成或通过 阻断蛋白质自身来抑制这种酶。
可以使用化合物或分子如转录或翻译抑制剂，抗体，反义信使或 寡核苷酸或竞争性抑制剂来抑制amadorase mRNA和蛋白质合成和功 能。
核酸和蛋白质序列
以下表示了amadorase(果糖胺-3-激酶)的988bp mRNA-衍生的 DNA序列，登录号No.NM_022158(SEQ ID NO：1)(参见附图10)：
1   cgtcaagctt ggcacgaggc catggagcag ctgctgcgcg ccgagctgcg caccgcgacc
61  ctgcgggcc ttcggcggccc cggcgccggc tgcatcagcg agggccgagc ctacgacacg
121 gacgcaggcc cagtgttcgt caaagtcaac cgcaggacgc aggcccggca gatgtttgag
181 ggggaggtgg ccagcctgga ggccctccgg agcacgggcc tggtgcgggt gccgaggccc
241 atgaaggtca tcgacctgcc gggaggtggg gccgcctttg tgatggagca tttgaagatg
301 aagagcttga gcagtcaagc atcaaaactt ggagagcaga tggcagattt gcatctttac
361 aaccagaagc tcagggagaa gttgaaggag gaggagaaca cagtgggccg aagaggtgag
421 ggtgctgagc ctcagtatgt ggacaagttc ggcttccaca cggtgacgtg ctgcggcttc
481 atcccgcagg tgaatgagtg gcaggatgac tggccgacct ttttcgcccg gcaccggctc
541 caggcgcagc tggacctcat tgagaaggac tatgctgacc gagaggcacg agaactctgg
601 tcccggctac aggtgaagat cccggatctg ttttgtggcc tagagattgt ccccgcgttg
661 ctccacgggg atctctggtc gggaaacgtg gctgaggacg acgtggggcc cattatttac
721 gacccggctt ccttctatgg ccattccgag tttgaactgg caatcgcctt gatgtttggg
781 gggttcccca gatccttctt caccgcctac caccggaaga tccccaaggc tccgggcttc
841 gaccagcggc tgctgctcta ccagctgttt aactacctga accactggaa ccacttcggg
901 cgggagtaca ggagcccttc cttgggcacc atgcgaaggc tgctcaagta gcggcccctg
961 ccctcccttc ccctgtcccc gtccccgt
以下表示人amadorase(果糖胺-3-激酶)的309个氨基酸残基的序 列，登录号NP_071441(SEQ ID NO：2)(参照图11)：
1 meqllraelr tatlrafggp gagcisegra ydtdagpvfv kvnrrtqarq mfegevasle
61 alrstglvrv prpmkvidlp gggaafvmeh lkmkslssqa sklgeqmadl hlynqklrek
121 lkeeentvgr rgegaepqyv dkfgfhtvtc cgfipqvnew qddwptffar hrlqaqldli
181 ekdyadrear elwsrlqvki pdlfcgleiv pallhgdlws gnvaeddvgp iiydpasfyg
241 hsefelaial mfggfprsff tayhrkipka pgfdqrllly qlfnylnhwn hfgreyrsps
301 lgtmrrllk
由Delpierre等提交了上述鉴定的序列(2000，Diabetes 49： 16227-1634)。Szwergold等的序列数据(2001，Diabetes 50：2139-2147) 与Delpierre等的序列数据极为一致。例如，由Szwergold等推定的蛋 白质序列(2001，Diabetes 50：2139-2147)与Delpierre等克隆的人果 糖胺-3-激酶序列(2000，Diabetes 49：16227-1634)在309个氨基酸残 基中有307个相同。因此，依赖任一组公开的序列不应成为问题，不 过，为了确保在使用蛋白质序列时不会出现问题，仅使用两种公开序 列之间没有差异的那些序列部分。
实施例23
汗液中存在α-二羰基糖：
如本文中所公开的，皮肤中存在α-二羰基糖，但尚没有确定汗液 中存在。皮肤的功能之一在于起排泄器官的作用，因此，测定α-二羰 基糖是否存在于汗液中。
如上所述分析了人汗液样品中是否存在3DG。从4位患者获得样 品，测定出3DG的存在浓度分别为0.189，2.8，0.312和0.11μM。因 此，证实汗液中存在3DG。
实施例24
DYN12(3-O-甲基山梨糖醇赖氨酸)对皮肤弹性的影响：
给予小分子amadorase抑制剂DYN12后使糖尿病和非糖尿病动物 血浆中的3DG水平下降(Kappler等，2002，Diabetes Technol.Ther.， Winter 3：4：606-609)。
进行实验来测定DYN12对糖尿病相关的皮肤弹性丧失的影响。为 了达到这一目的，用DYN12或盐水对两组STZ-糖尿病大鼠和两组正 常大鼠进行治疗。一组STZ-糖尿病大鼠(n＝9)每天接受皮下注射 50mg/kg的DYN 12共8周，而一组正常大鼠(n＝6)接受同样的处理。 一组对照糖尿病大鼠(n＝10)和一组正常大鼠(n＝6)接受盐水而不是 DYN12处理。2周后从糖尿病DYN12组中除去1只大鼠，因为其血 糖读数与其他糖尿病大鼠不一致(过低)。
将基于使用皮肤弹性测定装置的CyberDERM，Inc.技术的非入侵 手段用于测定DYN 12处理对皮肤弹性的作用。该手段基于移动皮肤 所需的抽真空量提供了对皮肤弹性的非入侵测定。使抽吸杯探头与刮 毛后的皮肤区域粘合以形成气密。然后将真空施加在抽吸杯内的皮肤 区域上，直到皮肤移过位于探头内部的传感器。因此，移动皮肤所需 的压力越高，则皮肤的弹性越低。
数据证实8周治疗后，用DYN 12治疗的糖尿病大鼠的皮肤弹性 高于用盐水治疗的糖尿病动物的皮肤弹性。如图14中所示，移动用盐 水治疗的糖尿病大鼠皮肤所需的压力量(7.2+/-3.0kPA)约高于移动用 DYN 12治疗的糖尿病大鼠皮肤所需的压力量(3.2+/-1.2kPA)2-2.5倍。 此外，用DYN 12治疗的糖尿病大鼠中观察到的弹性值与用盐水治疗 的非糖尿病大鼠中测定的值没有统计学差异(p＝0.39)(表E)。因此， 用3DG间接抑制剂DYN 12治疗糖尿病动物的结果是皮肤具有高于仅 接受盐水的糖尿病动物的皮肤弹性。
表E.对各组的统计学分析和比较
  1组 2组 p值 糖尿病盐水 非糖尿病盐水 p＝0.01
  糖尿病盐水 糖尿病DYN 12 p＝0.001 糖尿病盐水 非糖尿病DYN 12 p＝0.003 糖尿病DYN 12 非糖尿病DYN 12 p＝0.39 糖尿病DYN 12 非糖尿病盐水 p＝0.26 非糖尿病盐水 非糖尿病DYN 12 p＝0.20
上述数据证实对糖尿病大鼠给予DYN 12防止了一般在未治疗的 糖尿病大鼠中观察到的皮肤弹性丧失(例如，皮肤基底膜硬化和增厚)， 这是糖尿病中发现的过量3DG是弹性丧失原因的证据。本文中公开的 数据进一步证实降低3DG水平还可以维持正常个体的皮肤弹性。
另外，如上所述从测试的患者取皮肤弹性测定值，但在测定前未 使测试动物镇静。图15中显示了取自测试患者后腿的皮肤弹性测定值， 其中患者有警觉并被技术人员控制。
在这些实验中，动物剧烈的反抗约束且结果不同。不使用药物治 疗的糖尿病动物表现出从抽吸杯中“脱离”的能力较低，由此表明“耐 拉性”较差。另一方面，接受药物的糖尿病动物和正常动物均具有较 高的从抽吸杯中脱离的能力，并且两组动物均表现出强直和较强的肌 肉张力。这表明抑制所述酶可以使以糖尿病为代表的微循环恶化和神 经恶化程度下降，灭活3DG则更有可能如此。
实施例25
硬皮病皮肤中3DG的水平：
已经按照上文其他部分公开的方法测定了正常皮肤中存在下列浓 度的3DG(数据来自几位患者)：0.9μM，0.7μM和0.6μM。以相似的 方式检测几位硬皮病患者的几份皮肤样品，它们具有如下浓度的3DG： 15μM，130μM和3.5μM。因此，这些数据证实硬皮病患者皮肤中的3DG 水平明显高于正常人皮肤中的3DG水平。
实施例26
脂质体霜剂传送系统的配制
将23.9克来自BioChemica International Inc.的BioCreme Concentrate与2.9克可可脂，1.4克牛油果脂，2.2克芦荟油，1.1克维 生素E，3.7克甘油，51克水，1.1克二甲基硅油以及10.8克含有1克 精氨酸-HCl和1克葡甲胺-HCl的Natipide II混合。
实施例27
牛皮癣的治疗
使用9名其2-10％的身体皮肤表面受牛皮癣影响的成人志愿者进 行盲检试验。对于每个志愿者选择2至4个受牛皮癣影响部位进行治 疗；对每个志愿者只使用一种类型的霜剂。将志愿者分成3组，每组3 名志愿者，并且每日施用两次以下霜剂中的一种来治疗每个组中志愿 者的受影响部位：1)含有水杨酸(1.9％)的基础霜(“SA霜”)；2) 含有水杨酸(1.9％)和葡甲胺(5.5％)以及精氨酸(3.8％)的基础霜 (“SAMA霜”)；或3)含有葡甲胺(5.5％)和精氨酸(3.8％)的基础 霜(“MA霜”)。
使用专门的分级机检测皮肤区域。在研究开始时和3周后进行评 定，关于：
A.红斑(0＝没有发红，1＝淡的红色，2＝红色，3＝非常鲜艳的红 色，4＝深红色)；
B.干燥(0＝没有干燥/剥落，1＝部分覆盖损伤的细鳞屑，2＝覆盖 大部分或全部损伤的细至粗的鳞屑，3＝主要覆盖大部分或全部损伤的 粗的，非持久的鳞屑，4＝覆盖大部分或全部损伤的粗的，厚的，持久 的鳞屑，粗糙的表面)；
C.硬结(0＝没有斑隆起的迹象，1＝轻微但是确切的斑隆起，通常 边缘模糊或倾斜，2＝中度的斑隆起，粗糙或倾斜的边缘，3＝显著的斑 隆起，通常具有硬的或尖锐的边缘，4＝非常显著的斑隆起，通常具有 硬的尖锐的边缘)和
D.瘙痒(0＝没有瘙痒，1＝轻微的令人麻烦的瘙痒，2＝令人麻烦 的瘙痒，但是没有失眠，3＝引起强烈不舒服的持续瘙痒并失眠)。
表F中显示了0周(研究开始时)时和3周后专门分级机的平均 值。使用统计t-检验来测定平均值之间的任何差异的显著性。粗体的值 表示p<0.05。用SA霜治疗的志愿者对于红斑呈现出统计学改善，但是 对于干燥，硬结或瘙痒没有统计学改善。用SAMA霜治疗的志愿者对 于红斑，硬结和瘙痒呈现出统计学益处，对于干燥呈现出接近的显著 性。用霜MA治疗的志愿者对于干燥，硬结和瘙痒呈现出统计学益处， 并呈现出非统计学改善的红斑。对于干燥，硬结和瘙痒，MA霜呈现出 优于霜SA的明显益处。对于干燥，硬结和瘙痒，SAMA霜提供了优 于SA霜的明显益处。
表F：在3-周时间段内的牛皮癣研究的结果


实施例28
大鼠胰腺中果糖赖氨酸3-磷酸盐(FL3P)的鉴定和定量
用过量的戊巴比妥处死250g雄性Sprague-Dawley大鼠，取出胰 腺并立即再液氮中快速冷冻。用5μmol苯膦酸(用于定量的内标)和 六体积含有10mmol/l反-1，2-二氨基环己烷-N，N，N’，N’-四醋酸的5％高 氯酸将胰腺在液氮中捣碎。将所得到的浆液在8,000g在4℃离心10分 钟。用KOH中和上清液并再次离心来除去高氯酸钾沉淀。将上清液冻 干成粉末并重悬浮于1-ml用于NMR测量的pH7.5的D2O中。在Bruker AM400光谱仪上161.98MHz在10-mm探针中获得31P-NMR光谱，使 用60°脉冲和1.5秒重复时间。在20,000扫描模块中获得光谱并参照 甘油磷酸胆碱设定在0.49ppm。通过峰面积的整合来测定FL3P共振的 定量，设定苯膦酸面积等于5umol。FL3P在6.23ppm共振并通过真实 物质的尖峰形成以及硼氢化钠对山梨糖醇赖氨酸3-磷酸盐(5.95ppm) 和甘露糖醇3-磷酸盐(5.85ppm)的降低来鉴定。胰腺中的FL3P浓度 为28μM。
治疗性霜剂列于实验性实施例29-36中，含有3-5.5％葡甲胺和 3-4％精氨酸作为活性成分。
实施例29
牛皮癣
五名患有牛皮癣的成人使用含有葡甲胺和精氨酸的基础霜，并体 验了降低的炎症和干燥。
实施例30
湿疹
一名患有湿疹的七岁大的女孩使用含有葡甲胺和精氨酸的基础 霜，并体验了降低的炎症，瘙痒和干燥。
实施例31
关节炎
两名患有关节炎的女性成人每日使用含有葡甲胺和精氨酸的基础 霜，并体验了关节疼痛的缓解，肿胀和触痛。
实施例32
窦性疼痛
患有围绕面部和前额区域为中心的头疼的成人男性和女性将含有 葡甲胺和精氨酸的基础霜施用至受影响部位。在使用后大约30分钟都 体验了疼痛缓解。
实施例33
痤疮
患有面部痤疮的成年妇女将含有葡甲胺和精氨酸的基础霜施用至 受影响的皮肤部位并体验了损伤数量/严重程度的降低，和提高的皮肤 光滑度和柔软性。
实施例34
剃刀烧伤
两名患有面部剃刀烧伤的成年男性在刮须后立即使用含有葡甲胺 和精氨酸的基础霜并体验了皮肤发红的降低。
实施例35
红血球增多症
由于红细胞增多症患有皮疹的女性成人使用补充葡甲胺和精氨酸 的基础霜并体验了降低炎症和瘙痒。
实施例36
硫酸月桂酯钠皮肤刺激试验
使用硫酸月桂酯钠(SLS)伤口愈合(刺激缓解)测试进行临床研 究来测定基础霜以及含有葡甲胺和精氨酸的基础霜来降低发红(炎症) 和修复皮肤损伤的有效性。实验方案包括研究参与者的自我评价，专 门分级机评价以及蒸发水损耗和发红的仪器测量。这是简单的盲的， 受控的，随机的研究。
将一组十二名18-55岁大的女性志愿者的手掌前臂的六个部位(每 个手臂三个部位)暴露于刺激溶液(0.3ml0.5％硫酸月桂酯钠溶液) 18-24小时。选择受刺激最大的四个部位，用于进一步处理，使用基础 霜(产品A)或含有3％葡甲胺和3％精氨酸的霜剂(产品B)，每日施 用两次，持续7天。剩余的两个部位没有处理。在SLS应用后1，2， 3，4，7和8天，使用Minolta Chromameter(来测量色强)，专门的分 级机(使用8-点等级)和使用TEWL探针的DermaLab Modular System (来测量水分丢失)来评价皮肤部位。
在处理的第八天，参与者填写自我评定调查问卷。反应列于表G 中。
表G：皮肤霜测试的结果

实施例37-伤口愈合试验
使用人志愿者的试验比较了如本文中别处所述的局部制剂(“B 霜”)和缺乏葡甲胺-HCl和精氨酸的基础霜(“A霜”)的伤口愈合特征。 将15名女性志愿者手掌前臂上的六个部位(每个手臂三个部位)在第 0天暴露于刺激溶液(0.5％硫酸月桂酯钠，SLS)，在闭塞下持续18-24hr。 在第一天，选择12名体验了显著SLS刺激影响的志愿者的具有最相似 程度损伤的四个手臂部位用于处理阶段的研究。除去贴剂，然后参与 者将测试霜施用至四个选定的部位，每日两次，持续7天。其他前臂 部位没有处理，因此将它们用作对照。
刺激的程度和愈合速率是基于第0天(在SLS暴露之前)和第1， 2，3，4，7和8天的用于红斑的专门分级机(使用10点等级)，使用 Minolta Chromameter的仪器测量(测量发红)和DermaLab Meter(测 量经皮的蒸发水份丢失(TEWL))的临床观察。图19和20显示出红 斑(发红)测定的平均值，图21显示出SLS处理后第1，2，3，4，7 和8天的总蒸发水份丢失(TEWL)的平均值。
这些研究结果证明B霜提高了去污剂损伤的皮肤的修复。尽管在 研究的早期阶段没有清楚的程度差异，从第3天往前，在A霜和B霜 之间存在显著的差异。对于专门分级机的视觉评定，B霜在降低红斑 中更有效(图19)。还测定了B霜提高了已经通过暴露于SLS破坏的 角质层屏障的恢复，比A霜高(图21)。
实施例38：喂养糖化膳食的大鼠中异构前列腺素水平的提高
由糖化膳食引起的升高水平的3DG导致氧化应激提高2-倍，如通 过异构前列腺素的尿液水平所测量的。异构前列腺素是由自由基介导 的脂蛋白过氧化产生的前列腺素样分子。将尿液异构前列腺素用作体 内氧化应激的非入侵测量。
将十只大鼠喂养含有3％糖化蛋白的膳食18周。将对照组的10只 大鼠置于对照膳食相同的时间段。将竞争性ELISA(Oxford Biochemicals)用来测量每只大鼠的尿液异构前列腺素水平。如实施例 5中所述的测定尿液3DG水平。将所有值标准化至尿液中的肌酸酐水 平来用作尿液体积的对照。如表H中所示的，喂养糖化膳食18周的大 鼠的异构前列腺素水平(提高的3DG水平)是正常膳食大鼠该水平的 两倍。统计学显著性是显著性0.005。
表H.喂养对照或糖化膳食18周的大鼠尿液中的3DG和异构前列 腺素水平
  对照膳食 (n＝10)  糖化膳食 (n＝10)  t-检验 pmol3DG/mg肌酸酐 23.3±3.8 113.5±24.2 p＝4×10-10 ng异构前列腺素/mg肌酸酐 222±188 496±236 p＝0.005
实施例39：发炎皮肤中3DG-咪唑酮的免疫荧光定位
多形性妊娠疹是特征在于炎症，瘙痒和发红的皮肤病症，主要发 生在一些怀孕末三个月的妇女的腹部。
获得患有多形性妊娠疹个体的发炎部位和正常皮肤个体的皮肤活 体样本。如下将该部分包埋并制备用于免疫荧光。用二甲苯处理两次， 每次10分钟，来使切片脱蜡，用乙醇处理两次，每次10分钟。用稀 释于PBS中的5％山羊血清来封闭切片并用PBS洗涤一次。将3DG- 咪唑酮的小鼠单克隆抗体(由TransGenic Inc.的Cosmo Bio分装)以 1:10稀释于PBS中并在湿润的室中在室温应用至切片40分钟。用PBS 将切片洗涤三次，每次2分钟。将Cy-2缀合的山羊抗小鼠抗体(Jackson Immunologicals)以1:50稀释于PBS中并在湿润的室中在室温应用至 切片40分钟。用PBS将切片洗涤三次，每次2分钟。用VectraShield 封固介质(Vectra Laboratories)将切片封固在载波片上并用Nikon E600 荧光显微镜观察。然后如下用苏木精和曙红将来自多形性妊娠疹样品 的相同皮肤切片染色。用苏木精将切片染色5分钟，用水洗涤3分钟， 用1％酸性酒精(495ml的70％乙醇，5ml 10M HCl)处理30秒，用水 洗涤3分钟，用Scott’s缓冲剂30(2g NaHCO3，20g MgSO4.7H2O，用 H2O补足至1升)处理30秒，用自来水洗涤3分钟，用曙红处理1分 钟，95％乙醇1分钟，两次，最后100％乙醇1分钟。用1滴Cryoseal 60 (Richard-Allen Scientific)将切片施加至载波片上，将盖玻片盖于上面， 并用明视野的显微镜观察。
图22显示出正常皮肤(图22A)和患有多形性妊娠疹个体的发炎 部位的皮肤(图22B)免疫荧光模式。图22C显示出图22B中所示的 皮肤切片的苏木精和曙红染色。用患有硬皮病个体和红斑狼疮个体的 发炎皮肤部位的皮肤切片获得了相似的3DG-咪唑酮模式。
这些结果表明可以使用一种或多种直接抑制3DG的化合物治疗其 中3DG水平升高的病症。即，可以降低特定部位的3DG浓度，分解 或消除3DG，或有效抑制3DG功能或活性的化合物可以用来治疗升高 的3DG浓度介导的疾病或失调。本文中别处详细描述了用于这样治疗 的化合物和方法。
将本文引述的每篇专利，专利申请和公开的公开内容以其整体引 入本文作为参考。
尽管已经参照特定的实施方案公开的本发明，但显而易见的是本 领域技术人员可以设计其他实施方案和变化形式而没有脱离本发明的 真实精神和范围。所附的权利要求应当理解为包括所有这样的实施方 案和等价变化。
序列表
<110>迪纳米斯治疗公司
     A·托维亚
     F·卡普勒
<120>炎症的治疗方法
<130>53991-5007-WO1
<150>60/691,562
<151>2005-06-17
<150>PCT/US2006/23568
<151>2006-06-16
<160>2
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>988
<212>DNA
<213>人
<400>1

<210>2
<211>309
<212>PRT
<213>人
<400>2