用溶瘤病毒表达PTEN-LONG
阅读：270发布：2020-05-14
专利汇可以提供用溶瘤病毒表达PTEN-LONG专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了包含重组PTEN-Long的新型经修饰的病毒和使用其 治疗 癌症的方法。，下面是用溶瘤病毒表达PTEN-LONG专利的具体信息内容。
1.一种重组病毒，所述重组病毒包含哺乳动物的PTEN-Long基因。
2.根据权利要求1所述的重组病毒，其中所述病毒已被修饰成靶向肿瘤细胞。
3.根据权利要求1所述的重组病毒，其中所述病毒已被修饰成将对于病毒复制而言关键的基因置于肿瘤特异性启动子的控制下。
4.根据权利要求1所述的重组病毒，其中所述重组病毒包括单纯疱疹病毒-1主链。
5.根据权利要求1所述的重组病毒，其中所述PTEN-Long基因操作地连接到组织特异性启动子。
6.根据权利要求1所述的重组病毒，其中所述PTEN-Long基因操作地连接到诱导型启动子。
7.根据权利要求1所述的重组病毒，其中所述PTEN-Long基因操作地连接到组成型启动子。
8.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1所述的病毒。
9.一种抑制癌症细胞中的PD-L1的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1所述的病毒。
10.一种增加受试者的癌症部位处的浸润性CD8 T细胞数量的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1所述的病毒。
11.一种增加受试者的癌症部位处的浸润性自然杀伤细胞数量的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1所述的病毒。
12.一种抑制受试者的癌症的癌细胞转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1所述的病毒。
13.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含哺乳动物的PTEN-Long基因的重组病毒。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述病毒已被修饰成靶向肿瘤细胞。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述重组病毒包括单纯疱疹病毒-1主链。
用溶瘤病毒表达PTEN-LONG
[0002] 该工作得到NIH 1R01NS064607和NIH P01 CA163205支持，并且由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)提供资金。政府对本发明拥有一定的权利。
[0003] 相关申请的交叉引用
[0004] 本申请要求于2016年7月29日提交的美国临时专利申请序列No.62/368,822和2017年3月31日提交的美国临时专利申请序列No.62/479,671的权益，每个美国临时专利申请明确地全文以引用方式并人本文。
背景技术
[0005] 胶质母细胞瘤(GBM)是世界卫生组织的IV级星形细胞瘤，患者存活低，其特征在于极端异质性和侵袭性，以及对放射药物和化疗药物的抗性。脑癌细胞转移的发生率为GBM的2-3倍，其中在排名前3的脑癌细胞转移肿瘤类型中有乳腺癌。接受目前标准治疗的患者的存活中值对于GBM为18个月以下，而对于乳腺癌脑癌细胞转移(BCBM)为2-25个月。所需要的是针对脑肿瘤和一般癌症的新型疗法。
[0006] 胶质母细胞瘤(GBM)是世界卫生组织的IV级星形细胞瘤，患者存活低，其特征在于极端异质性和侵袭性，以及对放射药物和化疗药物的抗性。脑癌细胞转移的发生率为GBM的2-3倍，其中在排名前3的脑转移肿瘤类型中有乳腺癌。接受目前标准治疗的患者的存活中值对于GBM为18个月以下，而对于乳腺癌脑癌细胞转移(BCBM)为2-25个月。所需要的是针对脑肿瘤和一般癌症的新型疗法。
发明内容
[0008] 在一个方面，本文公开了任何前述方面的重组病毒，其中该重组病毒是包含PTEN-Long基因的重组HSV-1病毒。
[0009] 在一个方面，本文公开了任何前述方面的重组病毒，其中该病毒已被修饰成靶向肿瘤细胞，或被修饰成将对于病毒复制而言关键的基因置于肿瘤特异性启动子的控制下。
[0010] 在一个方面，本文公开了任何前述方面的重组病毒，其中PTEN-Long基因操作地连接到组织特异性启动子、诱导型启动子或组成型启动子。
[0011] 本文还公开了治疗癌症的方法，该方法包括向受试者施用任何前述方面的重组病毒。
[0012] 在一个方面，本文公开了抑制癌症和/或抑制癌细胞转移的方法，该方法包括向受试者施用任何前述方面的重组病毒。
[0013] 本文还公开了抑制癌症细胞中的PD-L1的方法，该方法包括向受试者施用任何前述方面的病毒。
[0014] 在一个方面，本文公开了增加受试者的癌症部位处的浸润性CD8T细胞数量的方法，该方法包括向受试者施用任何前述方面的病毒。
[0017] 图1A显示了在HSVQuik主链内的PTEN-Long转基因表达载体。
[0018] 图1B显示了在U87ΔEGFR神经胶质瘤细胞(WB)中感染后3小时内可检测到转基因表达。
[0020] 图2显示了来自切片的人乳腺癌脑癌细胞转移(顶部，40X)和携带颅内DB7的FVB/N小鼠(底部，20X)的代表性苏木精和伊红(H&E)和PTEN染色。
[0021] 图3显示了包含PTEN-Long表达载体(HSV-P10)的HSV可以在体外在神经胶质瘤细胞以及对照HSVQ病毒中复制和扩散。
[0022] 图4A、图4B、图4C和图4D显示了PTEN-Long表达不抑制多种细胞系中的HSV-P10细胞杀伤。MTT测定(DB7，小鼠乳腺癌；MDA-MB-468，人乳腺癌；LN229和U87ΔEGFR，人神经胶质瘤)。
[0023] 图5A显示了携带DB7-dsRed肿瘤的FVB/N小鼠的存活。肿瘤植入后7天瘤内注射病毒。
[0024] 图5B显示了携带DB7肿瘤的裸鼠的存活。肿瘤植入后7天瘤内注射病毒。
[0025] 图6A、图6B、图6C和图6D显示了病毒处理后7天的脑免疫浸润物。图6A显示了CD11b+F4/80+小胶质细胞(CD45低-中)与巨噬细胞(CD45高)的比率。图6B显示了MHC-II+小胶质细胞(红色)和巨噬细胞(绿色)的百分比。图6C显示了浸润性CD49b+CD335+NK细胞。图6D显示了浸润性细胞毒性CD3+CD8+T细胞。
[0026] 图7显示了在24hpi，HSV-P10消除了感染的和邻近未感染的DB7乳腺癌细胞表面上病毒诱导的PD-L1表达。通过流式细胞术进行测量。
[0028] 图9显示了表达PTEN-Long的重组病毒(诸如HSV-P10，也称为RAPTOR)可以攻击癌症细胞的途径的表示。如图所示，抗肿瘤抗体应答增加，并且由于AKT的磷酸化降低，PD-L1表达降低，从而阻止降低T细胞和NK细胞增殖的抑制信号。因此，浸润性NK细胞和T细胞增加并且可发挥抗肿瘤活性。
具体实施方式
[0029] 应当理解，在公开和描述本发明化合物、组合物、制品、装置和/或方法之前，除非另有说明，否则它们不限于特定合成方法或特定重组生物技术方法，或者除非另有说明，否则不限于特定试剂，因此当然可以改变。另外应当了解，本文所用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，并非旨在进行限制。
[0030] A.定义
[0032] 在本文中，范围可被表达为从“约”一个特定值，和/或到“约”另一个特定值。当表示这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到其他特定值。相似地，当前面用“约”将值表示为近似值时，应当理解，该值的特定值构成了另一个实施方案。还应当理解，每个范围的端值相对于另一个端值以及独立于另一个端值都是有意义的。还应当理解，本文公开了许多值，并且除了值本身之外，每个值在本文中也被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应当理解，当公开一个值时，“小于或等于”该值、“大于或等于该值”和在值之间的可能范围也被公开，如本领域技术人员适当理解的。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应当理解，在整个申请中，数据以许多不同格式提供，并且该数据表示端点和起点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，则应当理解，认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15以及介于10和15之间。还应当理解，还公开了在两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
[0033] 在本说明书和随后的权利要求书中，将提及的许多术语将被定义为具有下列含义：
[0034] “任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的示例和不发生的示例。
[0035] “降低”可指导致较少量的症状、组合物或活性的任何改变。当含有该物质的基因产物的遗传输出相对于不含该物质的基因产物的输出较少时，该物质也被理解为降低基因的遗传输出。还例如，降低可以是障碍症状的改变，使得症状比先前观察到的要少。
[0036] “抑制(Inhibit、inhibiting和inhibition)”是指降低活性、响应、病症、疾病或其他生物学参数。这可包括但不限于活性、响应、病症或疾病的完全消融。例如，这也可包括相比于天然或对照水平，活性、响应、病症或疾病降低10％。因此，相比于天然或对照水平，所述降低可为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或其间的任何降低量。
[0037] 如本文所用，“治疗(treatment、treat或treating)”可意指降低疾病或病症的影响的方法。治疗还可指降低疾病或病症本身而不只是症状的方法。治疗可以是天然水平的任何降低，并且可以是但不限于疾病、病症或者疾病或病症的症状的完全消融。因此，在所公开的方法中，“治疗”可指降低已确立的疾病或疾病进展的严重性的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者100％。例如，如果在患有该疾病的受试者中一种或多种疾病症状与同一受试者或对照受试者中的天然水平相比时降低10％，则本文所公开的用于降低或抑制癌症影响(诸如，抑制或降低癌细胞转移)的方法被认为是治疗。因此，相比于天然或对照水平，所述降低可为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、
100％、或其间的任何降低量。应当理解并在本文中设想的是，“治疗”不一定是指疾病或病症的治愈，而是疾病或病症前景的改善。
100％、或其间的任何降低量。应当理解并在本文中设想的是，“治疗”不一定是指疾病或病症的治愈，而是疾病或病症前景的改善。
[0038] 多种出版物的引用贯穿于本申请。这些出版物的公开内容据此全文以引用方式并入本申请中以便更全面地描述其所属领域的现状。所公开的参考文献所含有的材料也单独且具体地通过引用方式并入本文，这些材料在引用文献所依据的句子中进行了讨论。
[0039] B.组合物
[0040] 公开了用于制备所公开的组合物的组分以及在本文所公开的方法内使用的组合物本身。本文公开了这些及其他材料，并且应当理解，当公开这些材料的组合、子组、交互、组等时，尽管可能没有明确公开对这些化合物的各种单独和集合组合和排列中每一者的特定引用，但本文对每一者都进行了具体地设想和描述。例如，如果公开和讨论了特定表达PTEN-Long的重组病毒，并且讨论了可以对包括PTEN-Long和/或病毒主链的许多分子进行的许多修饰，则具体地设想PTEN-Long的每种组合和排列以及可能的任何病毒主链和修饰，除非具体地指出相反的情况。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，并且公开了组合分子的一个示例A-D，则即使没有单独地列举每一个，每一个都是单独且全部地设想的意义组合，也认为公开了A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F。同样，还公开了这些的任何子组或组合。因此，例如，将考虑公开A-E、B-F和C-E的子组。该概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可进行的各种另外的步骤，则应当理解，这些另外的步骤中的每一个步骤可利用所公开的方法的任何特定实施方案或实施方案的组合来进行。
[0041] 10号染色体上的肿瘤抑制磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)是抑制细胞中AKT信号传导途径的磷酸酶。PTEN在所有高分级神经胶质瘤的约50％中发生突变或缺失，并且在所有乳腺癌的33％-49％中丢失。PTEN-Long是最近发现的PTEN的替代起始位点变体，其在N-末端具有173个另外的氨基酸。这种较长形式的PTEN是分泌的和膜可渗透的，并且在分泌和重新进入细胞中后保持其磷酸酶活性。本文公开了使用从感染的细胞分泌PTEN-Long的经修饰的病毒(例如，经修饰的单纯性疱疹病毒(HSV-P10))的新型肿瘤疗法(例如，脑肿瘤疗法)。
[0042] 1.将组合物递送至细胞
[0043] 在一个方面，本文中应理解和设想本文公开的功能性效果和治疗效果是PTEN-Long在细胞(诸如，癌症细胞)中表达的结果。存在可用于在体外或体内将核酸(诸如，表达PTEN-Long的核酸)递送至细胞的许多组合物和方法。这些方法和组合物可以在很大程度上分为两类：基于病毒的递送系统和基于非病毒的递送系统。例如，核酸可通过许多直接递送系统递送，诸如电穿孔、脂质转染、磷酸钙沉淀、质粒、病毒载体、病毒核酸、噬菌体核酸、噬菌体、粘粒或经由细胞或载体(诸如阳离子脂质体)中遗传物质的转移。因此，在一个方面为包含PTEN-Long的病毒载体、质粒、噬菌体、粘粒。本文还公开了治疗受试者的癌症的方法，包括向受试者施用PTEN-Long，其中经由脂质转染、磷酸钙沉淀、质粒、病毒载体、病毒核酸、噬菌体核酸、噬菌体、粘粒或经由细胞或载体(诸如阳离子脂质体)中遗传物质的转移将PTEN-Long递送至癌症细胞。用于转染的适当方法，包括病毒载体、化学转染子或物理机械方法(诸如电穿孔和DNA的直接扩散)，描述于例如Wolff，J.A.等人，Science，第247卷，第1465-1468页，1990年；以及Wolff，J.A.Nature，第352卷，第815-818页，1991年。此类方法是本领域熟知的，并且容易地适用于本文所述的组合物和方法。在某些情况下，将修改这些方法以特异性地对大DNA分子起作用。此外，这些方法可用于通过使用载体的靶向特性来靶向某些疾病和细胞群。
[0044] a)基于核酸的递送系统
[0045] 转移载体可以是用于将基因递送到细胞中的任何核苷酸构建体(例如质粒)，或作为递送基因的一般策略的一部分，例如作为重组逆转录病毒或腺病毒的一部分(Ram等人，Cancer Res.第53卷，第83-88页，1993年)。
[0046] 如本文所用，质粒或病毒载体是将所公开的核酸(诸如PTEN-Long)转运到细胞中而不降解的试剂，并且包括在其递送到的细胞中产生基因表达的启动子。病毒载体是例如腺病毒、腺相关联的病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、艾滋病病毒、神经元营养性病毒、辛德毕斯病毒和其他RNA病毒，包括具有HIV主链的这些病毒。还优选的是具有这些病毒特性的任何病毒科，这些病毒特性使这些病毒适合用作载体。逆转录病毒包括小鼠马罗尼白血病病毒、MMLV和逆转录病毒，这些病毒表达MMLV作为载体的期望特性。逆转录病毒载体能够携带比其他病毒载体更大的遗传有效载荷，即转基因或标记基因，因此是常用的载体。然而，它们在非增殖细胞中不那么有用。腺病毒载体相对稳定且易于使用，具有高滴度，并且可以气溶胶制剂递送，并且可转染非分裂细胞。痘病毒载体是大的并且具有几个用于插入基因的位点，它们是热稳定的并且可在室温下储存。优选的实施方案是病毒载体，其经工程化以便抑制由病毒抗原引发的宿主生物体的免疫应答。该类型的优选的载体将携带白介素8或10的编码区。
[0047] 与将基因引入细胞中的化学或物理方法相比，病毒载体可具有更高的交易能力(引入基因的能力)。通常，病毒载体含有非结构早期基因、结构晚期基因、RNA聚合酶III转录物、复制和衣壳化所必需的反向末端重复序列，以及用于控制病毒基因组的转录和复制的启动子。当工程化为载体时，病毒通常具有被除去的早期基因中的一个或多个，并将基因或基因/启动子盒插入病毒基因组中代替被除去的病毒DNA。这种类型的构建体可携带至多达约8kb的外源遗传物质。被除去的早期基因的必需功能通常由细胞系提供，该细胞系已经工程化为反式表达早期基因的基因产物。
[0048] (1)溶瘤载体
[0049] 在一个方面，该病毒载体可为溶瘤的。溶瘤病毒通过直接裂解感染的细胞、分泌毒素和/或刺激宿主抗肿瘤免疫应答来优先感染并杀伤癌症细胞。溶瘤病毒可以是任何类型的病毒载体，包括但不限于腺病毒、HSV、呼肠孤病毒、痘苗病毒、VSV和麻疹。例如，基于HSV的溶瘤病毒可包含无效突变或ICP34.5(本文也称为神经毒力因子γ-34.5)的检测。该突变产生不再能够在终末分化的非分裂细胞中复制的HSV载体，但保留了感染和裂解快速分裂的细胞诸如癌症的能力。在一个方面，所公开的表达PTEN-Long的经修饰的病毒的病毒载体主链可以是溶瘤的HSV载体，诸如例如HSVQuick(HSVQ)、HSV1716、HF10(该载体缺乏UL56蛋白表达)和OncoVex GM-CSF(该载体缺乏ICP34.5和GM-CSF的功能性表达)。溶瘤病毒还可以是溶瘤腺病毒，包括但不限于，ONYX-015、H101和KH901；溶瘤呼肠孤病毒，包括但不限于，Reolysin和RT3D；溶瘤痘苗病毒，包括但不限于，GL-ONC1和JX-594；以及溶瘤麻疹病毒，包括但不限于，MV-NIS。病毒载体的选择可取决于病毒主链的趋性、转基因大小或对于科学家的可用性。因此，本文公开了表达PTEN-Long的HSV病毒载体，其中该病毒主链是溶瘤HSV-1主链，该主链已被修饰成靶向肿瘤细胞，并且/或者被修饰成将对于病毒复制而言关键的基因置于肿瘤特异性启动子(例如，HSVQuick(HSVQ))的控制下。
[0050] (2)疱疹病毒载体
[0051] 疱疹病毒是属于疱疹病毒科的动物病毒。疱疹病毒具有广泛的宿主范围，并且可接受大转基因有效载荷。另外，疱疹病毒具有建立潜伏感染的能力并且在受试者中无限期地持续存在。
[0052] 疱疹病毒载体诸如单纯疱疹病毒-1载体(例如HSVQuick)可以减毒以除去对复制不是必需但影响宿主细胞范围的基因。例如，可以修饰病毒以包括在神经毒力因子γ-34.5和/或病毒核糖核苷酸还原酶ICP6处的缺失。进一步的修饰可包括ICP47和/或GM-CSF表达的缺失或无效突变。
[0053] 所公开的疱疹病毒载体也可以是复制缺陷型。HSV编码超过80种病毒基因产物，并且约一半是病毒复制必需的。通过删除一种必需基因并通过互补细胞系反式提供基因产物来制备复制缺陷型突变体相对容易。此类突变型病毒无法在非互补细胞中复制，但由于它们仍然表达许多病毒基因产物这一事实，所以它们能够保持细胞毒性。病毒复制也很容易被在体外可反式互补的立即早期基因中的无效突变破坏，从而能够直接产生非致病性载体的高滴度纯制剂。用复制缺陷型载体进行的转导会导致神经和非神经组织两者中的潜伏类感染；这些载体是非致病性的，不能重新激活并长期存在。例如，修饰HSVQuick病毒载体(HSVQ)以限制对非神经元组织的感染。在一个方面，本文公开了包含哺乳动物的PTEN-Long基因的重组病毒，其中该重组病毒是疱疹病毒，诸如例如单纯疱疹病毒。在一些方面，本文公开了表达PTEN-Long的HSV病毒载体，其中该病毒主链是HSV-1主链，该主链已被修饰成靶向肿瘤细胞，并且/或者被修饰成将对于病毒复制而言关键的基因置于肿瘤特异性启动子(诸如例如，HSVQuick(HSVQ))的控制下。表达PTEN-Long转基因的HSVQ病毒在本文中被称为HSV P10或RAPTOR病毒(参见，例如，图1A)。
[0054] (3)逆转录病毒载体
[0055] 逆转录病毒是属于逆转录病毒的病毒科的动物病毒，包括任何类型、亚科、属或趋性。一般来讲，逆转录病毒载体描述于Verma，I.M.，“用于基因转移的逆转录病毒载体”。
[0056] 逆转录病毒本质上是将核酸承载物装入其中的包装。核酸承载物携带包装信号，该包装信号确保复制的子代分子将有效地包装在包装衣壳内。除了包装信号之外，还有许多顺式所需的分子，用于复制和包装复制的病毒。通常，逆转录病毒基因组含有涉及蛋白质衣壳制备的gag、pol和env基因。gag、pol和env基因通常被外源DNA取代，该外源DNA将被转移到靶细胞。逆转录病毒载体通常含有用于掺入包装衣壳中的包装信号、表示gag转录单元的起始的序列、逆转录所必需的元件，包括结合逆转录的tRNA引物的引物结合位点、指导DNA合成期间RNA链的转换的末端重复序列、富含嘌呤的序列5′到3′LTR(作为合成第二条DNA合成链的引发位点)，以及LTR末端附近的特定序列，其能够插入逆转录病毒的DNA状态以插入宿主基因组中。除去gag、pol和env基因允许约8kb的外源序列被插入病毒基因组中，成为逆转录的，并在复制时包装到新的逆转录病毒颗粒中。根据每种转录物的大小，该量的核酸足以递送一个至多个基因。优选的是在插入物中包括阳性或阴性可选择标记以及其他基因。
[0057] 由于大多数逆转录病毒载体中的复制机制和包装蛋白质已被除去(gag、pol和env)，因此通常通过将载体置于包装细胞系中来产生载体。包装细胞系是用含有复制和包装机制的逆转录病毒转染或转化的细胞系，但缺乏任何包装信号。当携带所选DNA的载体转染到这些细胞系中时，通过由辅助细胞顺式提供的机制复制含有目标基因的载体并将其包装到新的逆转录病毒颗粒中。没有包装该机制的基因组是因为它们缺乏必需的信号。
[0058] (4)腺病毒载体
[0059] 已经描述了复制缺陷型腺病毒的构建(Berkner等人，J.Virology，第61卷，第1213-1220页，1987年；Massie等人，Mol.Cell.Biol.第6卷，第2872-2883页，1986年；Haj-Ahmad等人，J.Virology，第57卷，第267-274页，1986年；Davidson等人，J.Virology，第61卷，第1226-1239页，1987年；Zhang“Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis”，BioTechniques，第15卷，第868-872页，1993年)。使用这些病毒作为载体的益处在于它们在其可扩散到其他细胞类型的程度上受到限制，因为它们可以在初始感染的细胞内复制，但不能形成新的感染性病毒颗粒。已显示重组腺病毒在直接体内递送至气道上皮、肝细胞、血管内皮、CNS实质和许多其他组织部位后实现高效基因转移。重组腺病毒通过结合到特定细胞表面受体实现基因转导，之后病毒通过受体介导的内吞作用以与野生型或复制缺陷型腺病毒相同的方式被内化。
[0060] 病毒载体可以是基于除去了E1基因的腺病毒的载体，并且这些病毒体在细胞系诸如人293细胞系中产生。在另一个优选的实施方案中，从腺病毒基因组除去E1基因和E3基因两者。
[0061] (5)腺相关联的病毒载体
[0062] 另一种类型的病毒载体基于腺相关联的病毒(AAV)。这种缺陷型细小病毒是优选的载体，因为它可以感染许多细胞类型并且对人类是非致病性的。AAV型载体可转运约4kb至5kb，并且已知野生型AAV稳定地插入染色体19中。含有该位点特异性整合特性的载体是优选的。这种类型载体的一个特别优选的实施方案是由加利福尼亚州旧金山(San Francisco，CA)的Avigen产生的P4.1C载体，其可含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因、HSV-tk和/或标记基因，诸如编码绿荧光蛋白GFP的基因。
[0063] 在另一种类型的AAV病毒中，AAV含有一对反向末端重复序列(ITR)，该对序列侧接含有启动子的至少一个盒，该启动子指导可操作地连接到异源基因的细胞特异性表达。在该上下文中异源是指对AAV或B19细小病毒不是天然的任何核苷酸序列或基因。
[0064] 通常，AAV和B19编码区已被删除，产生安全的非细胞毒性载体。AAV ITR或其修饰赋予感染性和位点特异性整合，但不具有细胞毒性，并且启动子指导细胞特异性表达。美国专利No.6,261,834以引用方式并入本文，用于与AAV载体相关的材料。
[0065] 因此，所公开的载体提供了能够整合到哺乳动物的染色体中而没有实质毒性的DNA分子。
[0066] 病毒和逆转录病毒中插入的基因通常含有启动子和/或增强子，以帮助控制所需的基因产物的表达。启动子通常是DNA的一个或多个序列，其在处于相对于转录起始位点的相对固定的位置时起作用。启动子含有RNA聚合酶和转录因子的基本相互作用的所需的核心元件，并且可含有上游元件和应答元件。
[0067] (6)大有效载荷病毒载体
[0068] 大人疱疹病毒的分子遗传学实验提供了一种方法，通过该方法可在允许疱疹病毒感染的细胞中克隆、繁殖和建立大异源DNA片段(Sun等人，Nature genetics，第8卷，第33-41页，1994年；Cotter和Robertson，Curr Opin Mol Ther，第5卷，第633-644页，1999年)。这些大DNA病毒(单纯疱疹病毒(HSV)和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV))有可能向特定细胞递送＞
150kb的人异源DNA片段。EBV重组体可将感染的B细胞中DNA的大片段保持为附加体DNA。携带至多达330kb的人基因组插入物的单个克隆表现为遗传上稳定的。这些附加体的维持需要特异性EBV核蛋白EBNA1，其在EBV感染期间组成性表达。另外，这些载体可用于转染，其中可在体外瞬时产生大量蛋白质。疱疹病毒扩增子系统也被用于包装>220kb的DNA片段并感染可将DNA稳定保持为附加体的细胞。
150kb的人异源DNA片段。EBV重组体可将感染的B细胞中DNA的大片段保持为附加体DNA。携带至多达330kb的人基因组插入物的单个克隆表现为遗传上稳定的。这些附加体的维持需要特异性EBV核蛋白EBNA1，其在EBV感染期间组成性表达。另外，这些载体可用于转染，其中可在体外瞬时产生大量蛋白质。疱疹病毒扩增子系统也被用于包装>220kb的DNA片段并感染可将DNA稳定保持为附加体的细胞。
[0069] 其他有用的系统包括，例如，复制型和宿主限制的非复制型痘苗病毒载体。
[0070] b)基于非核酸的系统
[0071] 如本文所公开的，可以多种方式将PTEN-Long递送至靶细胞。例如，组合物可通过电穿孔或通过脂质转染或通过磷酸钙沉淀来递送。所选择的递送机制将部分取决于所靶向的细胞的类型以及递送是发生在例如体内还是体外。
[0072] 因此，除了所公开的包含所述PTEN-Long转基因的PTEN-Long和HSVQ载体之外，所述组合物还可包含脂质，诸如脂质体，诸如阳离子脂质体(例如，DOTMA、DOPE、DC-胆固醇)或阴离子脂质体。如果需要，脂质体还可包含蛋白质以促进靶向特定细胞。包含化合物和阳离子脂质体的组合物的施用可施用于传入靶器官的血液或吸入呼吸道中以靶向呼吸道的细胞。关于脂质体，参见例如Brigham等人，Am.J.Resp.Cell.Mol.Biol.第1卷，第95-100页，1989年；Felgner等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，第84卷，第7413-7417页，1987年；美国专利No.4,897,355。此外，该化合物可作为微胶囊的组分施用，该微胶囊可靶向特定细胞类型诸如巨噬细胞，或者其中化合物的扩散或化合物从微胶囊的递送被设计用于特定速率或剂量。
[0073] 在上述包括向受试者细胞中施用和摄取外源DNA(即，基因转导或转染)的方法中，可经由多种机制将组合物递送至细胞。举例来说，递送可经由脂质体，使用可商购获得的脂质体制剂诸如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg，MD)的GIBCO-BRL公司)、SUPERFECT(德国希尔登的凯杰公司(Qiagen，Inc.Hilden，Germany))和TRANSFECTAM(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格生物技术有限公司(Promega Biotec，Inc.，Madison，WI))，以及根据本领域的程序标准开发的其他脂质体。此外，所公开的核酸或载体可以通过电穿孔在体内递送，用于电穿孔的技术可由加利福尼亚州圣地亚哥的Genetronics公司提供以及通过SONOPORATION机(亚利桑那州图森的ImaRx制药公司(ImaRx Pharmaceutical Corp.，Tucson，AZ))提供。
[0074] 材料可以是溶液、悬浮液(例如，掺入微粒、脂质体或细胞中)。这些可以经由抗体、受体或受体配体靶向特定细胞类型。以下参考文献是使用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的示例(Senter等人，Bioconjugate Chem，第2期，第447-451页，1991年；Bagshawe，K.D.，Br.J.Cancer，第60期，第275-281页，1989年；Bagshawe等人，Br.J.Cancer，第58期，第700-703页，1988年；Senter等人，Bioconjugate Chem.，第4期，第3-9页，1993年；Battelli等人，Cancer Immunol.Immunother.，第35期，第421-425页，1992年；Pietersz和McKenzie，Immunolog.Reviews，第129期，第57-80页，1992年；以及Roffler等人，Biochem.Pharmacol，第42期，第2062-2065页，1991年)。这些技术可用于多种其他特定细胞类型。载体诸如“隐形”和其他抗体缀合脂质体(包括靶向结肠癌的脂质介导的药物)，受体介导的DNA通过细胞特异性配体靶向，淋巴细胞定向肿瘤靶向和体内小鼠神经胶质瘤细胞的高度特异性治疗性逆转录病毒靶向。以下参考文献是使用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的示例(Hughes等人，Cancer Research，第49期，第6214-6220页，1989年；以及Litzinger和Huang，Biochimica et Biophysica Acta，第1104期，第179-187页，1992年。通常，受体涉及组成型或配体诱导的内吞作用途径。这些受体聚集在披网格蛋白小窝中，经由披网格蛋白小泡进入细胞，通过其中受体被分选的酸化内体，并且然后循环到细胞表面在细胞内储存，或在溶酶体中降解。内化途径具有多种功能，诸如营养摄取、除去活化蛋白、清除大分子、机会性进入病毒和毒素、解离和降解配体，以及调节受体水平。许多受体遵循超过一种的细胞内途径，这取决于细胞类型、受体浓度、配体类型、配体化合价和配体浓度。综述了受体介导的内吞作用的分子和细胞机制(Brown和Greene，DNA and Cell Biology，第10卷第6期，第399-
409页，1991年)。
409页，1991年)。
[0075] 递送至细胞并且待整合进宿主细胞基因组中的核酸，通常含有整合序列。这些序列通常是病毒相关序列，特别是当使用基于病毒的系统时。这些病毒整合系统也可整合到核酸中，所述核酸使用基于非核酸的递送系统(诸如脂质体)递送，使得递送系统中含有的核酸可整合到宿主基因组中。
[0076] 用于整合到宿主基因组中的其他一般技术包括，例如，设计用于促进与宿主基因组的同源重组的系统。这些系统通常依赖于侧接待表达核酸的序列，该序列与宿主细胞基因组内的靶序列具有足够的同源性，使得在载体核酸和靶核酸之间发生重组，导致所递送的核酸整合到宿主基因组中。促进同源重组所需的这些系统和方法是本领域技术人员已知的。
[0077] c)体内/体外
[0078] 如上所述，组合物可以在药用载体中施用，并且可以通过本领域熟知的多种机制(例如，裸DNA的摄取、脂质体融合、经由基因枪肌内注射DNA、内吞作用等)在体内和/或体外递送至受试者的细胞。
[0079] 如果采用体外方法，则可根据本领域熟知的标准方案除去细胞或组织并维持在体外。可经由任何基因转移机制将组合物引入细胞中，例如磷酸钙介导的基因递送、电穿孔、显微注射或蛋白脂质体。然后可以按照细胞或组织类型的标准方法将转导的细胞输注(例如，在药用载体中)或等位移植回受试者中。标准方法已知用于将各种细胞移植或输注到受试者中。
[0080] 2.表达系统
[0081] 递送给细胞的核酸通常含有表达控制系统。例如，病毒和逆转录病毒系统中插入的基因通常含有启动子和/或增强子，以帮助控制所需的基因产物的表达。启动子通常是DNA的一个或多个序列，其在处于相对于转录起始位点的相对固定的位置时起作用。启动子含有RNA聚合酶和转录因子的基本相互作用的所需的核心元件，并且可含有上游元件和应答元件。
[0082] a)病毒启动子和增强子
[0083] 控制哺乳动物的宿主细胞中载体转录的优选的启动子可从各种来源获得，例如，病毒的基因组，诸如：多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒，并且最优选地巨细胞病毒，或者获自异源哺乳动物的启动子，例如β肌动蛋白启动子。SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地作为SV40限制性片段获得，该片段还含有SV40病毒复制起点(Fiers等人，Nature，第273卷，第113页，1978年)。人巨细胞病毒的立即早期启动子方便地作为HindIII E限制性片段获得(Greenway，P.J.等人，Gene，第18卷，第355-360页，1982年)。当然，来自宿主细胞或相关物种的启动子也可用于本文。
[0084] 增强子通常是指在与转录起始位点没有固定距离的情况下起作用的DNA序列，并且可以是转录单元的5′(Laimins，L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.第78卷，第993页，1981年)或3′(Lusky，M.L.等人，Mol.Cell Bio.第3卷，第1108页，1983年)。此外，增强子可在内含子内(Banerji，J.L.等人，Cell，第33卷，第729页，1983年)以及在编码序列本身内(Osborne，T.F.等人，Mol.Cell Bio.第4卷，第1293页，1984年)。它们通常长度在10bp到300bp之间，并且它们以顺式起作用。增强子用于增加来自附近启动子的转录。增强子也通常含有介导转录调节的应答元件。启动子也可含有介导转录调节的应答元件。增强子通常确定基因表达的调节。虽然许多增强子序列现在已知来自哺乳动物的基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、胎蛋白和胰岛素)，但通常人们将使用来自真核细胞病毒的增强子来进行一般表达。优选的示例是复制起点后侧上的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。
[0086] 在某些实施方案中，启动子和/或增强子区可充当组成型启动子和/或增强剂，以最大化待转录的转录单元的区的表达。在某些构建体中，启动子和/或增强子区在所有真核细胞类型中都是有活性的，即使它仅在特定时间在特定类型的细胞中表达。此类型的优选的启动子是CMV启动子(650个碱基)。其他优选的启动子是SV40启动子、巨细胞病毒(全长启动子)和逆转录病毒载体LTR。在一些方面，组成型启动子是在病毒主链上表达的启动子，诸如用于HSV的立即早期基因启动子。因此，在一个方面，本文公开了包含哺乳动物的PTEN-Long基因的重组病毒，其中PTEN-Long基因可操作地连接到组成型启动子，诸如例如HSV IE4/5启动子。
[0087] 在一些实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子或诱导型启动子，以限制对某些组织的表达，或者当满足某些条件时或当监督医师想要开始和/或停止表达时。诱导型启动子可包括本领域已知的任何诱导型启动子，包括但不限于四环素诱导型转基因系统(四环素反式激活因子(tTA)或“Tet-Off”和反向四环素反式激活因子(rtTA)或“Tet-On”)和Cre-lox。组织特异性启动子是那些表达限于特定组织/细胞类型的启动子。组织特异性启动子是本领域熟知的，并且可包括任何已知或可商购获得的组织特异性启动子。组织特异性启动子的选择基于需要表达的细胞类型。因此，在一个方面，本文公开了包含哺乳动物的PTEN-Long基因的重组病毒，其中PTEN-Long基因可操作地连接到组织特异性启动子或诱导型启动子。
[0088] 已经表明，可以克隆所有特定调节元件并用于构建在特定细胞类型诸如黑素瘤细胞中选择性地表达的表达载体。神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子已被用于在神经胶质起源的细胞中选择性地表达基因。
[0089] 用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或有核细胞)的表达载体也可含有终止转录所必需的序列，其可影响mRNA表达。这些区在编码组织因子蛋白质的mRNA的非翻译部分中被转录为聚腺苷酸化片段。3′非翻译区还包括转录终止位点。优选的是，转录单元还含有聚腺苷酸化区。该区的一个好处是它增加了转录单元像mRNA一样被加工和转运的可能性。已经很好地建立了聚腺苷酸化信号在表达构建体中的鉴定和使用。优选的是，同源聚腺苷酸化信号用于转基因构建体中。在某些转录单元中，聚腺苷酸化区来源于SV40早期聚腺苷酸化信号并且由约400个碱基组成。还优选的是，单独含有其他标准序列或与上述序列组合的转录单元改善来自构建体的表达或其稳定性。
[0090] b)标记
[0091] 病毒载体可包括编码标记产物的核酸序列。该标记产物用于确定基因是否已被递送至细胞并且一旦递送即表达。优选的标记基因是大肠杆菌(E.Coli)lacZ基因，其编码β-半乳糖苷酶和绿荧光蛋白。
[0092] 在一些实施方案中，该标记可以是可选择标记。适用于哺乳动物的细胞的可选择标记的示例为二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、潮霉素和嘌呤霉素。当这些可选择标记成功转移到哺乳动物的宿主细胞中时，如果置于选择性压力下，转化的哺乳动物的宿主细胞可存活。有两种广泛使用的不同类别的选择性制度。第一类别是基于细胞的代谢和突变细胞系的使用，其缺乏独立于补充培养基生长的能力。两个示例为：CHO DHFR-细胞和小鼠LTK-细胞。这些细胞在不添加胸苷或次黄嘌呤等营养素的情况下缺乏生长能力。由于这些细胞缺乏完整的核苷酸合成途径所必需的某些基因，除非在补充培养基中提供缺失的核苷酸，否则它们不能存活。补充培养基的替代方案是将完整的DHFR或TK基因引入缺乏相应基因的细胞中，从而改变其生长要求。未用DHFR或TK基因转化的单个细胞不能在非补充培养基中存活。
[0093] 第二类别是显性选择，其是指在任何细胞类型中使用的选择方案，并且不需要使用突变细胞系。这些方案通常使用药物来抑制宿主细胞的生长。具有新型基因的那些细胞将表达传递耐药性的蛋白质并且将在选择中存活。此类显性选择的示例使用药物新霉素(Southern P.和Berg，P.，J.Molec.Appl.Genet.第1卷，第327页，1982年)、霉酚酸(Mulligan，R.C.和Berg，P.，Science，第209卷，第1422页，1980年)或潮霉素(Sugden，B.等人，Mol.Cell.Biol.第5卷，第410-413页，1985年)。这三个示例在真核生物控制下使用细菌基因分别对适当药物G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素传递抗性。其他包括新霉素类似物G418和嘌呤霉素。
[0094] 3.序列相似性
[0095] 应当理解，如本文所讨论，术语同源性和同一性的使用是与相似性相同的。因此，例如，如果在两个非天然序列之间使用单词同源性，则应理解，这不一定表示这两个序列之间的进化关系，而是在研究它们的核酸序列之间的相似性或相关性。用于确定在两个进化相关分子之间的同源性的许多方法通常应用于任何两种或更多种核酸或蛋白质，以便测量序列相似性，而不管它们是否是进化相关的。
[0096] 应当理解，本文公开的基因和蛋白质的任何已知变体和衍生物或可能出现的任何已知变体和衍生物的一种定义方法是通过在与特定已知序列的同源性方面定义变体和衍生物。例如，SEQ ID NO：1示出了PTEN-Long基因的特定序列。具体地公开了本文公开的这些和其他基因和蛋白质的变体，这些变体与所述序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性。本领域技术人员容易理解确定两种蛋白质或核酸诸如基因的同源性的方法。例如，可以在比对两个序列后计算同源性，使得同源性处于其最高水平。
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同源性。本领域技术人员容易理解确定两种蛋白质或核酸诸如基因的同源性的方法。例如，可以在比对两个序列后计算同源性，使得同源性处于其最高水平。
[0097] 一般来讲，应当理解，本文公开的基因和蛋白质的任何已知变体和衍生物或可能出现的任何已知变体和衍生物的一种定义方法是通过在与特定已知序列的同源性方面定义变体和衍生物。本文所公开的特定序列的这种同一性也在本文别处讨论。一般来讲，本文公开的基因和蛋白质的变体通常与所述序列或天然序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、93％、96％、97％、98％、99％的同源性。本领域技术人员容易理解确定两种蛋白质或核酸诸如基因的同源性的方法。例如，可以在比对两个序列后计算同源性，使得同源性处于其最高水平。
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、93％、96％、97％、98％、99％的同源性。本领域技术人员容易理解确定两种蛋白质或核酸诸如基因的同源性的方法。例如，可以在比对两个序列后计算同源性，使得同源性处于其最高水平。
[0098] 计算同源性的另一种方法可以通过公开的算法来进行。用于比较的序列的最佳比对可以通过“Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，第2期，第482页，1981年”的局部同源性算法，通过“Needleman和Wunsch，J.MoL Biol.，第48期，第443页，1970年”的同源性比对算法，通过“Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第85期，第2444页，1988年”的搜索相似性方法，通过这些算法的计算机化实现方式(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)，或通过检查进行。
[0099] 应当理解，通常可以使用任何方法，并且在某些情况下，这些不同方法的结果可以不同，但是本领域技术人员应当理解，如果这些方法中的至少一种发现了同一性，则可以说序列具有所述的同一性，并在本文中公开。
[0100] 例如，如本文所用，所述与另一序列具有特定百分比同源性的序列是指具有通过上述任何一种或多种计算方法计算的所述同源性的序列。例如，如果使用Zuker计算方法计算出第一序列与第二序列具有80％的同源性(如本文所定义)，则第一序列与第二序列具有80％的同源性，即使根据任何其他计算方法计算的第一序列与第二序列不具有80％的同源性。又如，如果使用Zuker计算方法与Pearson和Lipman计算方法两者计算出第一序列与第二序列具有80％的同源性(如本文所定义)，则第一序列与第二序列具有80％的同源性，即使根据Smith和Waterman计算方法、Needleman和Wunsch计算方法、Jaeger计算方法或任何其他计算方法计算的第一个序列与第二个序列不具有80％的同源性。又如，如果使用每种计算方法计算出第一序列与第二序列具有80％的同源性(如本文所定义)，则第一序列与第二序列具有80％的同源性(尽管实际上，不同的计算方法通常会得出不同的计算同源性百分比)。
[0101] 4.杂交/选择性杂交
[0102] 术语杂交通常意指至少两个核酸分子(诸如引物或探针和基因)之间的序列驱动的相互作用。序列驱动的相互作用意指以核苷酸特异性方式在两个核苷酸或核苷酸类似物或核苷酸衍生物之间发生的相互作用。例如，G与C相互作用或A与T相互作用是序列驱动的相互作用。通常，序列驱动的相互作用发生在核苷酸的Watson-Crick面或Hoogsteen面上。两种核酸的杂交受本领域技术人员已知的许多条件和参数影响。例如，反应的盐浓度、pH和温度均影响两个核酸分子是否会杂交。
[0103] 用于在两个核酸分子之间选择性杂交的参数是本领域技术人员所熟知的。例如，在一些实施方案中，选择性杂交条件可被定义为严格杂交条件。例如，杂交的严格性通过杂交步骤和洗涤步骤中的任一者或两者的温度和盐浓度来控制。例如，实现选择性杂交的杂交条件可涉及在高离子强度溶液(6X SSC或6X SSPE)中在比Tm低约12℃至25℃的温度下杂交(半数分子从它们的杂交配偶体中解离的熔化温度)，然后在选择的温度和盐浓度的组合下洗涤，使得洗涤温度比Tm低约5℃至20℃。在初步实验中易于凭经验确定温度和盐条件，其中固定在过滤器上的参考DNA样品与标记的目标核酸杂交，并且然后在不同的严格性条件下洗涤。杂交温度通常高于DNA-RNA和RNA-RNA杂交。所述条件可如上所述用于实现严格性，或如本领域已知的那样。DNA：DNA杂交的优选严格杂交条件可以是在6X SSC或6X SSPE中在约68℃下(在水性溶液中)，然后在68℃下洗涤。如果需要，杂交和洗涤的严格性可以随着所需的互补程度降低而相应地降低，并且进一步取决于搜索可变性的任何区域的G-C或A-T丰度。同样，如果需要，杂交和洗涤的严格性可相应地增加，因为所需的同源性增加，并且进一步地取决于其中需要高同源性的任何区域的G-C或A-T丰度，均如本领域已知的那样。
[0104] 定义选择性杂交的另一种方法是通过研究与另一种核酸结合的核酸之一的量(百分比)。例如，在一些实施方案中，选择性杂交条件将是当至少约60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的限制性核酸结合到非限制性核酸时。通常，非限制性引物过量例如10倍或100倍或1000倍。这种类型的测定可在限制性和非限制性引物都在例如为其kd的1/10或1/100或1/1000，或者在仅一个核酸分子为其10倍或100倍或1000倍，或者在一个或两个核酸分子高于其kd的条件下进行。
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的限制性核酸结合到非限制性核酸时。通常，非限制性引物过量例如10倍或100倍或1000倍。这种类型的测定可在限制性和非限制性引物都在例如为其kd的1/10或1/100或1/1000，或者在仅一个核酸分子为其10倍或100倍或1000倍，或者在一个或两个核酸分子高于其kd的条件下进行。
[0105] 定义选择性杂交的另一种方法是通过研究在需要杂交以促进所需的酶促操作的条件下得到酶促操作的引物的百分比。例如，在一些实施方案中选择性杂交条件将是当至少约60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％、100％的引物在促进酶促操作的条件下被酶促操作时，例如如果该酶促操作是DNA的延伸，则选择性杂交条件将是当至少约60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的引物分子被延伸时。优选的条件还包括由制造商所建议的或本领域已指示的适于进行操作的酶的那些条件。
97％、98％、99％、100％的引物在促进酶促操作的条件下被酶促操作时，例如如果该酶促操作是DNA的延伸，则选择性杂交条件将是当至少约60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的引物分子被延伸时。优选的条件还包括由制造商所建议的或本领域已指示的适于进行操作的酶的那些条件。
[0106] 与同源性一样，应当理解，本文公开了多种方法来确定在两个核酸分子之间的杂交水平。应当理解，这些方法和条件可在两个核酸分子之间提供不同的杂交百分比，但除非另有说明，否则满足任何方法的参数就足够了。例如，如果需要80％杂交，并且只要在这些方法的任一种方法中在所需的参数内发生杂交，则认为本文公开了杂交。
[0107] 应当理解，本领域技术人员理解，如果组合物或方法满足这些标准中的任一个以共同地或单独地确定杂交，则其是本文公开的组合物或方法。
[0108] 5.核酸
[0109] 本文公开的多种分子是基于核酸的，包括例如编码例如PTEN-Long的核酸或其片段，以及各种功能性核酸。所公开的核酸由例如核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物构成。本文讨论了这些和其他分子的非限制性示例。应当理解，例如，当载体在细胞中表达时，表达的mRNA将通常由A、C、G和U构成。同样，应当理解，例如，如果反义分子通过例如外源递送被引入细胞或细胞环境中，则有利的是反义分子由降低细胞环境中反义分子降解的核苷酸类似物构成。
[0110] a)核苷酸和相关分子
[0111] 核苷酸是含有碱基部分、糖部分和磷酸部分的分子。核苷酸可通过它们的磷酸部分和糖部分连接在一起，形成核苷间键。核苷酸的碱基部分可以是腺嘌呤-9-基(A)、胞嘧啶-1-基(C)、鸟嘌呤-9-基(G)、尿嘧啶-1-基(U)和胸腺嘧啶-1-基(T)。核苷酸的糖部分是核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸部分是五价磷酸。核苷酸的非限制性示例将为3′-AMP(3′-腺苷一磷酸)或5′-GMP(5′-鸟苷一磷酸)。这些类型的分子有许多种，这些分子在本领域中可用并在本文中可用。
[0112] 核苷酸类似物是含有对碱基、糖或磷酸部分的某种类型修饰的核苷酸。对核苷酸的修饰是本领域熟知的，并且将包括例如，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和2-氨基腺嘌呤以及糖或磷酸部分的修饰。这些类型的分子有许多种，这些分子在本领域中可用并在本文中可用。
[0113] 核苷酸替代物是与核苷酸具有相似的功能性特性的分子，但是不含磷酸部分，诸如肽核酸(PNA)。核苷酸替代物是将以Watson Crick或Hoogsteen方式识别核酸的分子，但其通过除磷酸部分以外的部分连接在一起。当与适当靶核酸相互作用时，核苷酸替代物能够适形于双螺旋类型结构。这些类型的分子有许多种，这些分子在本领域中可用并在本文中可用。
[0114] 还可以将其他类型的分子(缀合物)连接到核苷酸或核苷酸类似物以增强例如细胞摄取。缀合物可与核苷酸或核苷酸类似物化学连接。此类缀合物包括但不限于脂质部分，诸如胆固醇部分。(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989年，第86卷，第6553-6556页)。这些类型的分子有许多种，这些分子在本领域中可用并在本文中可用。
[0115] Watson-Crick相互作用是与核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的Watson-Crick面的至少一种相互作用。核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的Watson-Crick面包括基于嘌呤的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的C2、N1和C6位置以及基于嘧啶的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的C2、N3、C4位置。
[0116] Hoogsteen相互作用是在核苷酸或核苷酸类似物的Hoogsteen面上发生的相互作用，该核苷酸或核苷酸类似物暴露于双链DNA的大沟中。Hoogsteen面包括N7位置和嘌呤核苷酸C6位置的反应性基团(NH2或O)。
[0117] b)序型
[0118] 存在与本文公开的信号传导途径中涉及的蛋白质分子相关的多种序列，例如PTEN-Long，或本文公开的用于制备PTEN-Long的任何核酸，所有这些核酸均由核酸编码或为核酸。这些基因的人类类似物以及其他类似物的序列，和这些基因的等位基因，以及剪接变体和其他类型的变体，可在多种蛋白质和基因数据库(包括基因库)中获得。本领域技术人员理解如何解决序列不一致和差异以及将与特定序列相关的组合物和方法调整为其他相关序列。鉴于本文公开的和本领域已知的信息，可以针对任何给定的序列设计引物和/或探针。
[0119] 6.药物载体/药物产品递送
[0120] 如上所述，组合物也可在药用载体中体内施用。所谓“药用”是指不在生物学上或其他方面不期望的材料，即，该材料可以与核酸或载体一起施用于受试者，而不引起任何不期望的生物效应或不与含有其的药物组合物中的任何其他组分以有害的方式相互作用。自然地选择载体以使活性成分的任何降解最小化，并且使对受试者的任何不良副作用最小化，如本领域的技术人员所熟知的。
[0121] 组合物可以口服、非肠道(例如，静脉内)、通过肌内注射、通过腹膜内注射、透皮、体外、局部等施用，包括局部鼻内施用或通过吸入剂施用。如本文所用，“局部鼻内施用”意指通过两个鼻孔中的一个或两个将组合物递送到鼻和鼻腔通道中，并且可以包括用喷涂机制或液滴机制进行递送，或通过核酸或载体的雾化。通过吸入剂施用组合物可以是通过用喷雾或液滴机制经由递送而经鼻或经口的。也可以经由插管法直接递送到呼吸系统的任何区域(例如肺)。所需的组合物的确切的量将因受试者而异，取决于受试者的种类、年龄、体重和一般状况、所治疗的过敏性障碍的严重程度，所用的特定核酸或载体、其施用模式等。因此，不可能为每种组合物指定确切的量。但是，在给定本文的教导的情况下，本领域的普通技术人员可以仅使用常规实验来确定适当量。
[0122] 如果使用的话，非肠道施用组合物通常以注射为特征。注射剂可以以常规形式制备，可以是液体溶液或悬浮液，适于在注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式、或者是乳液。最近改进的非肠道施用方法涉及使用缓慢释放或持续释放系统使得保持恒定的剂量。参见例如美国专利No.3,610,795，该专利以引用方式并入本文。
[0123] 材料可以是溶液、悬浮液(例如，掺入微粒、脂质体或细胞中)。这些可以经由抗体、受体或受体配体靶向特定细胞类型。以下参考文献是使用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的示例(Senter等人，Bioconjugate Chem，第2期，第447-451页，1991年；Bagshawe，K.D.，Br.J.Cancer，第60期，第275-281页，1989年；Bagshawe等人，Br.J.Cancer，第58期，第700-703页，1988年；Senter等人，Bioconjugate Chem.，第4期，第3-9页，1993年；Battelli等人，Cancer Immunol.Immunother.，第35期，第421-425页，1992年；Pietersz和McKenzie，Immunolog.Reviews，第129期，第57-80页，1992年；以及Roffler等人，Biochem.Pharmacol，第42期，第2062-2065页，1991年)。载体诸如“隐形”和其他抗体缀合脂质体(包括靶向结肠癌的脂质介导的药物)，受体介导的DNA通过细胞特异性配体靶向，淋巴细胞定向肿瘤靶向和体内小鼠神经胶质瘤细胞的高度特异性治疗性逆转录病毒靶向。以下参考文献是使用该技术将特定蛋白质靶向肿瘤组织的示例(Hughes等人，Cancer Research，第49期，第6214-
6220页，1989年；以及Litzinger和Huang，Biochimica et Biophysica Acta，第1104期，第
179-187页，1992年。通常，受体涉及组成型或配体诱导的内吞作用途径。这些受体聚集在披网格蛋白小窝中，经由披网格蛋白小泡进入细胞，通过其中受体被分选的酸化内体，并且然后循环到细胞表面在细胞内储存，或在溶酶体中降解。内化途径具有多种功能，诸如营养摄取、除去活化蛋白、清除大分子、机会性进入病毒和毒素、解离和降解配体，以及调节受体水平。许多受体遵循超过一种的细胞内途径，这取决于细胞类型、受体浓度、配体类型、配体化合价和配体浓度。综述了受体介导的内吞作用的分子和细胞机制(Brown和Greene，DNA and Cell Biology，第10卷第6期，第399-409页，1991年)。
6220页，1989年；以及Litzinger和Huang，Biochimica et Biophysica Acta，第1104期，第
179-187页，1992年。通常，受体涉及组成型或配体诱导的内吞作用途径。这些受体聚集在披网格蛋白小窝中，经由披网格蛋白小泡进入细胞，通过其中受体被分选的酸化内体，并且然后循环到细胞表面在细胞内储存，或在溶酶体中降解。内化途径具有多种功能，诸如营养摄取、除去活化蛋白、清除大分子、机会性进入病毒和毒素、解离和降解配体，以及调节受体水平。许多受体遵循超过一种的细胞内途径，这取决于细胞类型、受体浓度、配体类型、配体化合价和配体浓度。综述了受体介导的内吞作用的分子和细胞机制(Brown和Greene，DNA and Cell Biology，第10卷第6期，第399-409页，1991年)。
[0124] a)药用载体
[0125] 包括抗体的组合物可与药用载体在治疗学上结合使用。
[0126] 合适的载体及其制剂描述于Remington：The Science and Practice of Pharmacy(第19版)，编辑A.R.Gennaro，Mack Publishing Company，Easton，PA，1995年。通常，在制剂中使用适当量的药用盐以使制剂等渗。药用载体的示例包括但不限于盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。溶液的pH优选地为约5至约8，并且更优选地约7至约7.5。其他载体包括缓释制剂，诸如含有抗体的半透性固体疏水性聚合物基质，所述基质为成形制品形式，例如膜、脂质体或微粒。对于本领域的技术人员将显而易见的是，根据例如施用途径和所施用组合物的浓度，某些载体可能是更优选的。
[0127] 药物载体是本领域的技术人员已知的。这些药物载体最典型地将是用于向人类施用药物的标准载体，包括溶液诸如生理pH下的无菌水、盐水以及缓冲溶液等。组合物可以肌内或皮下施用。其他化合物将根据本领域的技术人员所使用的标准方法施用。
[0129] 药物组合物可以许多方式施用，取决于是否需要局部或全身治疗，并且取决于治疗区域。可以局部地(包括经眼地、经阴道地、经直肠地、鼻内给药)、口服、通过吸入或非肠道地施用，所述非肠道施用为例如通过静脉滴注、皮下、腹膜内或肌内注射。所公开的抗体可以静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内或透皮施用。
[0130] 非肠道施用的制剂包括无菌水性溶液或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油，以及可注射的有机酯诸如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水性溶液、乳液或包括盐水和缓冲介质的悬浮液。非肠道载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内载体包括流体和营养补充剂，电解质补充剂(诸如基于林格氏葡萄糖的那些)等等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
[0131] 用于局部施用的制剂可以包括膏剂、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷剂、液体和粉剂。常规的药物载体、水性、粉剂或油性基质、增稠剂等可能是必需或期望的。
[0133] 一些组合物可以潜在地作为药用酸或碱加成盐施用，所述酸或碱加成盐是通过与无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸)和有机酸(诸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸)反应，或通过与无机碱(诸如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾)和有机碱(诸如单烷基胺、二烷基胺、三烷基胺和芳基胺以及取代的乙醇胺)反应形成的。
[0134] b)治疗用途
[0135] 用于施用组合物的有效剂量和时间表可凭经验确定，并且使此类确定在本领域技术范围内。组合物施用的剂量范围大到足以产生障碍症状受到影响的所需的效应。剂量不应大到引起不良副作用，诸如不希望的交叉反应、过敏反应等。一般来讲，剂量将随患者的年龄、状况、性别和疾病程度、施用途径或是否包括在该方案中的其他药物而变化，并且可由本领域的技术人员确定。在任何禁忌症的情况下，个体医师可以调整剂量。剂量可以变化，并且可在一天或几天内每天给予一次或多次剂量施用。对于给定类别的药物产品，可以在文献中找到关于适当剂量的指导。例如，可以在关于抗体的治疗用途的文献中找到关于选择抗体的适当剂量的指导，例如，Handbook of Monoclonal Antibodies，Ferrone等人编辑，Noges Publications，Park Ridge，N.J.，1985年，第22章，第303-357页；Smith等人，Antibodies in Human Diagnosis and Therapy，Haber等人编辑，Raven Press，New York，1977年，第365-389页。根据上述因素，单独使用的抗体的典型日剂量可以为每天约1μg/kg至至多达100mg/kg体重或更多。
[0136] C.治疗癌症的方法
[0137] 应当理解并在本文中设想的是，所公开的表达PTEN-Long的重组病毒在治疗癌症中是有效的。因此，在一个方面，本文公开了治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文所公开的任何表达PTEN-Long的病毒。例如，在一个方面，本文公开了治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用重组病毒，该重组病毒包含哺乳动物的PTEN-Long基因(诸如，包含PTEN-Long转基因的溶瘤HSV病毒载体，例如HSV-P10)。
[0138] 本文所公开的PTEN-Long表达病毒可用于治疗发生不受控制的细胞增殖的任何疾病诸如癌症。不同类型癌症的非限制性列表如下：淋巴瘤(霍奇金和非霍奇金)、白血病、癌、实体组织癌、鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤、神经胶质瘤、高分级神经胶质瘤、母细胞瘤、成神经细胞瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、黑素瘤、腺瘤、缺氧肿瘤、骨髓瘤、艾滋病相关淋巴瘤或肉瘤、转移性癌症或一般癌症。
[0139] 所公开的表达PTEN-Long病毒可用于治疗的癌症的代表性但非限制性列表如下：淋巴瘤，B细胞淋巴瘤，T细胞淋巴瘤，蕈样霉菌病，霍奇金病，骨髓性白血病，膀胱癌，脑癌，神经系统癌症，头颈癌，头颈部鳞状细胞癌，肺癌诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌，神经母细胞瘤，胶质母细胞瘤，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，皮肤癌，肝癌，黑色素瘤，口腔、咽喉、喉和肺的鳞状细胞癌，结肠癌，宫颈癌，宫颈鳞癌，乳腺癌和上皮癌，肾癌，泌尿生殖系统癌，肺癌，食管癌，头颈癌，大肠癌，造血系统癌；睾丸癌；结肠癌和直肠癌。
[0140] 本文所公开的表达哺乳动物的PTEN-Long的重组病毒也可用于治疗癌前病症，诸如宫颈和肛门发育异常、其他发育异常、严重发育异常、增生、非典型增生和瘤形成。
[0141] 在一个方面，所公开的表达PTEN-Long的病毒可治疗地施用以抑制、降低或治疗已经存在于受试者中的癌症。然而，本文还设想了表达PTEN-Long的病毒可预防地施用以抑制或降低癌细胞转移。因此，在一个方面，本文公开了抑制或推断受试者的癌症的癌细胞转移的方法，包括向受试者施用表达哺乳动物的PTEN-Long基因的重组病毒。
[0142] 如本文所公开的，治疗、抑制和/或降低癌症的能力在很大程度上可为浸润性免疫细胞诸如NK细胞和CD8+T细胞增加的结果。通常，抑制CD8T细胞和NK细胞浸润感染部位和/或癌症。癌症细胞通常利用PD1-PD-L1相互作用作为检查点来抑制NK细胞和CD8T细胞的浸润。PD1在T细胞上表达，并且当与其配体PD-L1结合时，信号传导途径被抑制增殖的PD1触发。癌症细胞上调PD-1并避免T细胞和NK细胞介导的死亡。所公开的表达PTEN-Long的重组病毒抑制PD-L1的表达。通过抑制PD-L1，抑制PD1-PD-L1检查点，允许NK细胞和CD8T细胞浸润并杀灭癌症。因此，在一个方面，本文公开了增加受试者的癌症部位处的浸润性CD8 T细胞和/或浸润性NK细胞数量的方法，包括向受试者施用本文所公开的任何表达PTEN-Long的重组病毒。例如，在一个方面，本文公开了增加受试者的癌症部位处的浸润性CD8T细胞和/或浸润性NK细胞数量的方法，包括向受试者施用包含哺乳动物的PTEN-Long基因的重组病毒(诸如，包含PTEN-Long转基因的溶瘤HSV病毒载体，例如HSV-P10)。
[0143] D.实施例
[0144] 提出以下实施例以便向本领域的普通技术人员提供如何制备和评价本文要求保护的复合物、组合物、制品、设备和/或方法的完整公开内容和描述，并且预期这些实施例仅仅是示例性的，并非旨在限制本公开。已经努力确保关于数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应当考虑一定的误差和偏差。除非另有说明，否则份数是重量份，温度是℃或为环境温度，并且压力是大气压或接近大气压。
[0145] 1.实施例1
[0146] 使用HSVQuik系统生成溶瘤HSV-1载体。该系统使用G207病毒主链，其为针对神经毒力因子γ-34.5和病毒核糖核苷酸还原酶ICP6双重缺失的F-毒株HSV-1(图1A)。该病毒在非神经元衍生的肿瘤细胞中有条件地复制，缺乏蛋白激酶R信号传导，并在分裂期间产生它们自己的核糖核苷酸还原酶。PTEN-L转基因包括经典PTEN起始位点(SEQ ID NO：1)的上游519bp的ATG起始位点。该第二起始位点在转基因中突变以通过使用定点诱变将其第二ATG起始位点突变为ATA来排除经典PTEN。该突变迫使完整PTEN-L基因的表达，并阻止PTEN的短的细胞内形式的表达。根据HSVquik方案，将突变的PTEN-L转基因克隆到G207病毒主链中。
[0147] 使用标准的蔗糖纯化方案扩增并纯化HSV-P10。在最小体积的2％-FBS DMEM中以低MOI感染70％汇合度的Vero细胞的10-20个150mm板。将感染的板在有5％ C02+空气的潮湿培养箱中转移至34℃。一旦板上的大部分细胞开始变圆(通常3-4天)，刮下并收集细胞和培养基。通过离心沉淀细胞，并将上清液转移至分开的50ml锥形管。将所有细胞一起重悬于20-30ml上清液中，将细胞和培养基在液氮中快速冷冻并储存在-80C。将冷冻的细胞在37C水浴中解冻至4C并超声处理以从完整细胞中释放病毒颗粒。通过离心再次沉淀细胞碎片，并将含有病毒颗粒的培养基与不含细胞的分离培养基合并。通过超速离心沉淀病毒颗粒并重悬于无菌盐水中。将重悬的病毒覆盖在30％蔗糖层的顶部，并且将分离的层再次超离心以仅纯化病毒颗粒。将沉淀的病毒重悬在无菌盐水中最小体积的20％甘油中，并以20μl等分试样等分，以储存在-80C下。
[0148] 为了测试表达PTEN-L的病毒(HSV-P10，也称为RAPTOR)的体外和体内功效，用感染复数为1的HSV-P10(即，RAPTOR)感染U87胶质母细胞瘤细胞，并在不同时间点测量PTEN-Long的表达(图1B)。在感染后4小时内观察PTEN-Long表达。接下来，为了比较PTEN-Long对AKT磷酸化的影响，用来自未感染的细胞(NV)的细胞裂解物或仅用HSVQ载体(Q)或HSV-P10感染的细胞(即，表达PTEN-Long的HSVQ)(R)感染DB7细胞。这里用HSVQ-P10感染的DB7细胞表达PTEN-Long并降低AKT磷酸化。与HSVQ感染的细胞比较。
[0149] PTEN通常在乳腺癌脑癌细胞转移(BCBM)中丢失。为了证实这显示了来自切片的人乳腺癌脑癌细胞转移(顶部，40X)和携带颅内DB7(小鼠乳腺癌细胞)的FVB/N小鼠(底部，20X)的代表性苏木精和伊红(H&E)和PTEN染色。染色证实了BCBM细胞中PTEN的显著丢失。
[0150] 为了显示RAPTOR病毒(即，HSV-P10)具有与HSVQ病毒相同的细胞趋性和增殖能力，用感染复数(MOI)为0.1的HSVQ或HSV-P10感染LN229(胶质母细胞瘤细胞系)、U251-T3(神经胶质瘤细胞)和U87AEGFR(神经胶质瘤细胞)细胞。观察细胞的活力和感染。如图3所示，HSVQ和HSV-P10都感染了所有三种细胞类型，并且能够完全裂解LN229和U251-T3细胞。
[0151] 接下来，对DB7(图4A)、MDA-MB-468(人乳腺癌)(图4B)、LN229(图4C)和U87ΔEGFR细胞(图4D)进行MTT测定，并且观察到PTEN-Long表达不抑制多种细胞系中的HSV-P10细胞杀伤。在每个细胞场景中，感染的细胞的裂解速率是相同的。确定大小差异是由于施用于细胞的病毒负荷的变化而不是病毒感染的真实差异，如通过96小时培养完全维持的任何差异所证明的。
[0152] 为了观察PTEN-Long的表达如何影响体内肿瘤负荷，用盐水对照或HSVQ病毒主链或表达PTEN-Long的HSV-P10(即，RAPTOR)感染携带DB7-dsRed肿瘤的免疫活性FVB/N小鼠和携带DB7的裸鼠(图5)。感染后40天，90％的模拟感染的动物和50％HSVQ感染的动物死亡。相比之下，感染后100天，超过90％的HSV-P10动物存活。在免疫功能不全的裸鼠中，所有荷瘤小鼠在HSVQ组和盐水组中在第15天死亡，并且在RAPTOR感染的组中在第19天死亡。这表示HSV-P10增强了携带乳腺癌脑癌细胞转移的小鼠的存活。
[0153] 为了确定HSV-P10感染的小鼠的保护机制，除去感染的肿瘤细胞并测量浸润性巨噬细胞、NK细胞和CD8T细胞的存在(图6)。在CD11b+和F4/80+的染色中，观察到HSVQ和HSV-P10细胞中CD11b+F4/80+小胶质细胞(CD45低-中)与巨噬细胞(CD45高)的比率降低，HSV-P10感染的细胞中存在相对较多的巨噬细胞(图6A)。当测量以确定小胶质细胞和巨噬细胞的活化状态时，进一步观察到在HSVQ和ISV-P10感染的细胞中活化细胞的百分比也增加，在HSV-P10细胞群中有显著更多的活化(图6B)。对浸润性NK细胞(图6C)和浸润性CD8T细胞(图6D)的测量显示，虽然HSVQ的浸润性NK细胞或CD8T细胞的百分比没有统计学增加，但RAPTOR感染的细胞(即，HSV-P10感染的细胞)显示，NK细胞和CD8T细胞相对于HSVQ和模拟感染的百分比显著增加。
[0154] 假定浸润性NK细胞和浸润性CD8T细胞的增加可能是由于PD-L1表达的降低，其通常用于通过PD1发出信号以抑制NK细胞和CD8T细胞增殖，测试细胞的PD-L1表达(图7)。模拟感染的DB7细胞显示几乎检测不到的PD-L1水平，这是预期的。类似地预期，HSVQ感染的细胞在感染后24小时显示病毒诱导的PD-L1表达。然而，用表达PTEN-Long的HSV-P10(即，RAPTOR)感染的细胞显示出PD-L1表达的显著降低。由于在HSVQ主链和HSV-P10之间的唯一区别是PTEN-Long转基因，PD-L1的这种降低是PTEN-Long表达的直接结果。
[0155] 另外，HSV-P10感染的动物能够产生抗DB7抗体(图8)。
[0156] 结论
[0157] HSV-P10病毒是1型单纯疱疹病毒，具有双重缺失的γ-34.5基因和病毒ICP6中的插入突变，包括GFP和PTEN-Long表达载体。HSV-P10：在感染的细胞中表达PTEN-L并分泌PTEN-L，并且还降低感染的细胞中的Akt磷酸化。与HSVQ相比，HSV-P10在神经胶质瘤细胞中显示出等同的复制，并且与HSVQ一样有效地杀伤神经胶质瘤和乳腺癌细胞系。
[0158] 然而，HSV-P10增强了携带DB7乳腺癌脑癌细胞转移的免疫活性小鼠的存活。这部分是由于携带DB7肿瘤的脑半球中激活的免疫效应细胞的募集增加的结果，其不再受PD-L1表达的抑制，因为本文显示HSV-P10降低感染的和邻近未感染的细胞中的PD-L1表达。另外，HSV-P10诱导针对DB7癌抗原的强烈抗原扩散。
[0159] HSV-P10以三种主要方式起作用以引发肿瘤细胞杀伤：首先，病毒能够选择性地在感染的肿瘤细胞中复制并破坏感染的肿瘤细胞。第二，HSV-P10诱导肿瘤抑制因子PTEN-Long的分泌，其可用于局部减缓未感染的肿瘤细胞的生长，并且还可充当“损伤相关联的分子模式”分子以将先天免疫系统募集到感染部位。第三，HSV-P10充当“癌症疫苗”，通过肿瘤细胞裂解和免疫细胞募集到感染部位，将非自身肿瘤肽暴露于免疫系统，从而激发针对肿瘤细胞的适应性免疫应答(图9)。
[0160] E.参考文献
[0161] 1Cerami，E.，Demir，E.，Schultz，N.，Taylor，B.S.，&Sander，C.，2010年，“Automated network analysis identifies core pathways in glioblastoma”，PloS One，第5卷，第2期，第e8918页。
[0162] 2Hopkins，B.D.，Fine，B.，Steinbach，N.，Dendy，M.，Rapp，Z.，Shaw，J.，Parsons，R.，2013年，“A secreted PTEN phosphatase that enters cells to alter signaling and survival”，Science(New York，N.Y.)，第341卷，第6144期，第399-402页。
[0163] 3Mineharu Y，Kamran N，Lowenstein PR，Castro MG.“Blockade of mTOR signaling via rapamycin combined with immunotherapy augments antiglioma cytotoxic and memory T-cell functions”，Mol Cancer Ther.2014年，第13卷，第12期，第3024-3036页。
[0164] 4Terada，K.，Wakimoto，H.，Tyminski，E.，Chiocca，E.A.，&Saeki，Y.，2006年。“Development of a rapid method to generate multiple oncolytic HSV vectors and their in vivo evaluation using syngeneic mouse tumor models”，Gene Therapy，第
13卷，第8期，第705-714页。
13卷，第8期，第705-714页。
[0165] 5Zhang L，Zhang S，Yao J等人，“Microenvironment-induced PTEN loss by exosomal microRNA primes brain metastasis outgrowth”，Nature.2015年，第527卷，第7576期，第100-104页。
[0166] F.序列
[0167] SEQ ID NO：1PTEN-Long编码区
[0168]
[0169]
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