病毒与细胞表面分子的结合是病毒复制的启动步骤，因此，特异 性细胞病毒受体是病毒组织嗜性的主要决定因素。衰变加速因子 (DAF/CD55)是一种由四个细胞外短共有重复序列(SCRs)组成的 70kDa糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定补体调节蛋白，它起到多种人类肠 病毒膜结合蛋白的作用，其包括几种肠病毒(EV)、B型柯萨奇病毒 (CVB)和柯萨奇病毒A21(CVA21)。通常，病毒单独与DAF结合 并不足以使肠病毒感染，与DAF的相互作用不诱导产生135S异常(A) 颗粒，后者被认为是侵入细胞的必要条件。DAF的肠病毒感染生理作 用被认为是一种膜结合受体，其结合感染性病毒并使其集中，通过与 第二功能性细胞侵入受体的相互作用导致细胞侵入的可能性增加。
类似许多其它的小RNA病毒受体(脊髓灰质炎病毒、主要受体组 (major receptor group)鼻病毒和B型柯萨奇病毒使用)，CVA21细胞 内化受体细胞间粘附分子-1(ICAM-1/CD54)是免疫球蛋白超家族成 员，其结合在围绕五重轴的外壳峡谷内。峡谷底病毒受体之间的相互 作用使外壳不稳定，并诱导病毒脱壳的前奏——构象变化。
CVA21(Kuykendall)的原型病毒株是呼吸道感染的元凶，其既与 ICAM-1结合，又与DAF结合。但是，CVA21原型病毒株与表面表达 的DAF的结合不足以启动生产性感染或A-颗粒的形成，它与ICAM-1 的相互作用是侵入细胞所必需的。当表面DAF通过导向DAF非病毒 性结合区的单克隆抗体(mAb)交联时，在CVA21感染过程中观察到 DAF的更多功能，使得感染在不存在ICAM-1的情况下发生。
本申请人以前开发了使用识别ICAM-1的溶瘤病毒治疗恶性肿瘤 的新方法(WO01/37866)。通过在许多类型的癌细胞上使用多种A型柯 萨奇病毒株，获得了出色的治疗结果。为了扩大可能的癌症治疗并提 供更有效的治疗，本发明者已经通过修饰和生物选择获得了新的溶瘤 和杀伤特性提高的溶瘤病毒。

在第一个方面，本发明提供一种能够在基本上不存在细胞间粘附 分子-1(ICAM-1)的情况下溶解性地感染细胞或诱导细胞凋亡的分离、 选择的小RNA病毒。
优选地，选择的小RNA病毒能够通过细胞上的衰变加速因子 (DAF)溶解性地感染细胞。
优选地，小RNA病毒选自肠病毒的原型病毒株和临床分离物，所 述的肠病毒包括柯萨奇病毒、艾柯病毒、脊髓灰质炎病毒、未分类肠 病毒、鼻病毒、副肠弧病毒(Paraechovirus)、肝病毒和心病毒。
在一个优选方式中，小RNA病毒为柯萨奇病毒。优选地，柯萨奇 病毒为A或B型，更优选为A型柯萨奇病毒，更加优选地，柯萨奇病 毒为柯萨奇病毒A21。
在一个优选方式中，小RNA病毒为艾柯病毒。优选地，艾柯病毒 为艾柯病毒6、7、11、12、13或29。
在一个优选方式中，小RNA病毒为脊髓灰质炎病毒。优选地，脊 髓灰质炎病毒为1、2或3型脊髓灰质炎病毒。
在一个优选方式中，小RNA病毒为鼻病毒。优选地，鼻病毒是主 要组鼻病毒或次要组鼻病毒的成员。
在一个优选方式中，小RNA病毒是通过下列方法生物选择的：将 表达DAF、无ICAM-1的细胞系中的不能够在不存在ICAM-1的情况 下溶解性地感染细胞的小RNA病毒传代，并回收选择的能够在不存在 ICAM-1的情况下溶解性地感染细胞的小RNA病毒。
在另一个优选方式中，小RNA病毒可以通过任何已知方法(例如 定点诱变，或者在使用抗ICAM-1抗体阻断ICAM-1入口的细胞中进 行传代)被改变、突变或修饰。
优选地，与野生型病毒相比，选择的小RNA病毒的一个或多个外 壳蛋白发生了改变。例如在，柯萨奇病毒中，外壳蛋白选自VP1、VP2 和VP3。更优选地，突变选自VP3R96H；VP3E101A；VP3A239S； VP2S164L和VP2V209中的一种或多种。
优选地，细胞为肿瘤，更优选地，肿瘤为表达DAF的肿瘤。例子 包括但不限于：肺癌、前列腺癌、结直肠癌、甲状腺癌、肾癌、肾上 腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、癌前细胞、食管癌、乳癌、脑癌、 卵巢、胃癌和肠癌。
在第二个方面，本发明提供一种能够在基本上不存在细胞间粘附 分子-1(ICAM-1)的情况下溶解性地感染细胞的分离的小RNA病毒 的核酸分子。在一个实施方式中，核酸分子可以来自小RNA病毒，并 可以是病毒的单链RNA或互补DNA。优选地，核酸分子包括选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的核酸序列。
在第三个方面，本发明提供一种对能够在基本上不存在细胞间粘 附分子-1(ICAM-1)的情况下溶解性地感染细胞的小RNA病毒进行 生物选择的方法，该方法包括将不能够在基本上不存在细胞间粘附分 子-1(ICAM-1)的情况下溶解性地感染细胞的小RNA病毒培养在合 适的细胞系中进行足够多次的传代，选择能够在基本上不存在细胞间 粘附分子-1(ICAM-1)的情况下溶解性地感染细胞的小RNA病毒。
优选地，细胞系选自人类癌，例如横纹肌肉瘤、肺癌、前列腺癌、 结直肠癌、甲状腺癌、肾癌、肾上腺癌、肝癌、白血病、黑色素瘤、 癌前细胞、食管癌、乳癌、脑癌、卵巢癌、胃癌和肠癌。更优选地， 细胞系为不表达ICAM-1的表达DAF的细胞系。
典型地，足够多的传代次数通常为大约10代。但是，应当认识到， 根据小RNA病毒和细胞类型，可以使用1至100或更多次的传代。在 一个实施方式中，使用4次传代。在另一个实施方式中，使用5次传 代。在再另一个实施方式中，使用6、7或8次传代。
在第四个方面，本发明提供根据本发明第三个方面的方法得到的 小RNA病毒。
在第五个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含根据本发明 第一个或第四个方面的分离的小RNA病毒、以及合适的药物可接受赋 形剂或稀释剂。
在第六个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含根据本发 明第二个方面的病毒核酸的病毒核酸分子或互补DNA拷贝(copy)、 以及合适的药物可接受赋形剂或稀释剂。
在第七个方面，本发明提供一种治疗患肿瘤哺乳动物的肿瘤的方 法，该方法包括在导致病毒介导的肿瘤细胞溶解的条件下，用有效量 的根据本发明第一个或第五个方面的分离的小RNA病毒为哺乳动物给 药。
优选地，肿瘤为表达DAF的肿瘤。例子包括但不限于：肺癌、前 列腺癌、结直肠癌、甲状腺癌、肾癌、肾上腺癌、肝癌、白血病、黑 色素瘤、癌前细胞、食管癌、乳癌、脑癌、卵巢癌、胃癌和肠癌。
在第八个方面，本发明提供一种治疗患肿瘤哺乳动物的肿瘤的方 法，该方法包括在导致病毒介导的肿瘤细胞溶解的条件下，用有效量 的根据本发明第二个方面的病毒核酸的核酸分子或互补DNA拷贝或 者根据本发明第六个方面的药物组合物为哺乳动物给药。
优选地，肿瘤为表达DAF的肿瘤。例子包括但不限于：肺癌、前 列腺癌、结直肠癌、甲状腺癌、肾癌、肾上腺癌、肝癌、白血病、黑 色素瘤、癌前细胞、食管癌、乳癌、脑癌和卵巢癌。
在第九个方面，本发明提供根据本发明第一个或第五个方面的分 离的小RNA病毒在治疗方法或治疗中的用途。
在第十个方面，本发明提供根据本发明的第二个方面的核酸分子 在治疗方法或治疗中的用途。
在第十一个方面，本发明提供本文所定义的CVA21-DAFv形式的 分离、选择的小RNA病毒、或其修饰或变化形式。
在第十二个方面，本发明提供能够在基本上不存在细胞间粘附分 子-1(ICAM-1)的情况下溶解性地感染细胞或诱导细胞凋亡的分离筛 选的小RNA病毒在制造治疗哺乳动物肿瘤的药物中的用途。在优选的 实施方式中，提供产生本发明的小RNA病毒的接种物在制造用小RNA 病毒治疗哺乳动物肿瘤以杀死一些肿瘤细胞的药物中的用途。
在本发明的第十三个方面，提供一种将接种物提供给哺乳动物以 产生治疗哺乳动物肿瘤的病毒的施用器，其中所述的施用器包括充满 接种物的区域，使得接种物可以与哺乳动物接触，所述的病毒是能够 在基本上不存在细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的情况下溶解性地感染 细胞或诱导细胞凋亡的分离、选择的小RNA病毒。
本文所述的病毒样品根据布达佩斯条约的条款保藏在Australian Government Analytical Laboratories(澳大利亚国家分析实验室) (National Measurement Institute，1Suakin Street(PO Box385)Pymble NSW2073Australia)。分离物CVA21#272101(编号NM05/43993)、 CVA21#275238(编号NM05/43991)、和CVA21#272598(编号 NM05/43992)的保藏日为2005年1月14日。CVA21-DAFv的保藏 日为2005年1月17日，编号为NM05/43996。
在本说明书中，除非上下文另外指出，词语“包括(comprise)” 或其变化形式如“comprises”或“comprising”应当理解成表示包含所 述的要素、整体或步骤，或一组要素、整体或步骤，但是不排除任何 其它的要素、整体或步骤，或一组要素、整体或步骤。
在本说明书中所包括的文件、条例、材料、装置、文章或类似物 的任何论述，目的仅在于为本发明提供文字内容。不应当认为任何一 项或所有这些内容形成现有技术的一部分，或者在本申请的优先权日 之前为本发明相关领域所普遍公知。
为更清晰地理解本发明，参考下列附图和实施例对优选实施方式 进行说明。

图1.在存在和不存在抗-ICAM-1抗体的情况下，[35S]-蛋氨酸标记 的CVA21原型(Kuykendall)和三种CVA21的临床分离物(#272101、 #275238、#272598)与下列细胞的结合：(A)表达DAF的CHO细胞 和(B)表达ICAM-1的CHO细胞。[35S]-蛋氨酸标记病毒的结合水平 通过液体闪烁计数进行测定。结果表示成三份样品的平均值+SD。Y轴 显示结合的病毒(cpm x102)。
图2.在存在和不存在抗-DAF SCR1MAb、抗-ICAM-1结构域1 MAb、和/或PI-PLC处理的情况下，[35S]-蛋氨酸标记的CVA21原型 Kuykendall(A)和临床分离物#272101(B)与HeLa细胞的结合。[35S]- 蛋氨酸标记病毒的结合水平通过液体闪烁计数进行测定。结果表示成 三份样品的平均值+SD。Y轴显示结合的病毒(cpm x102)。
图3.[35S]-蛋氨酸标记的CVA21原型(Kuykendall)和三种CVA21 临床分离物(#272101、#275238、#272598)与单独表达DAF、或ICAM-1、 或同时表达二者的CHO细胞的结合。(A)表面DAF和ICAM-1表达 的流式细胞仪分析。转染的CHO细胞与单独的缀合物、抗-DAF MAb (IH4)或抗-ICAM-1MAb(WEHI)一起培育，在FACStar分析仪上 测定特异性结合。封闭直方图表示缀合物的结合，空心直方图代表抗 -DAF MAb的结合，虚线直方图代表抗-ICAM-1MAb的结合。(B)[35S]- 蛋氨酸标记病毒的结合水平通过液体闪烁计数进行测定。结果表示成 三份样品的平均值+SD。Y轴显示结合的病毒(cpm x102)。
图4.在存在抗-DAF MAbs IA10(SCR1)、VIIIA7(SCR2)、IH4 (SCR3)和IIH6(SCR4)的情况下，CVA21原型(Kuykendall)和 临床分离物(#272101、#275238、#272598)对ICAM-1阴性RD细胞 的溶解性感染。向培养于96孔板的RD细胞单层中加入抗-DAF MAbs (20μg/ml)。在37℃下培育1h后，用大约103TCID50/孔的CVA21分 离物攻击细胞，在37℃下培育48h。用结晶紫/甲醇溶液对细胞单层进 行染色，然后在540nm处测量吸光度，对细胞溶解进行评价。结果表 示成两个孔的平均溶解百分比。
图5.原型CVA21Kuykendall病毒株和临床分离物#272101、 #275238和#272598的VP1、VP2和VP3外壳蛋白的多序列排比。临 床分离物相对于Kuykendall病毒株的氨基酸变化以黑体表示。使用 Clustal X程序进行序列排比。构成CVA21-ICAM-1结合足迹的单个氨 基酸用闭合框突出显示。
图6.CVA21亲代和CVA21-DAFv对SkMel28和RD细胞的感染。 (A)RD和SkMel28细胞上ICAM-1和DAF表达的流式细胞仪分析。 实线直方图代表单独的缀合物的结合，虚线直方图代表抗-ICAM-1 mAb的结合，实心直方图表示抗-DAF mAb的结合。(B)96孔板中的 SkMel28和RD细胞单层用CVA21亲代和CVA21-DAFv的10倍稀释 液进行接种。培育72h后，固定单层，用结晶紫溶液染色。+表示通过 显微镜观察检测到的CPE。(C)典型的CVA21亲代和CVA21-DAFv 在SkMel28细胞上的噬斑形态学与CVA21-DAF变体在RD细胞上的 形态学的比较。将细胞用病毒的连续稀释液感染，感染后1h，用含0.7％ 琼脂糖的DMEM覆盖。培养板在37℃下培育，并在感染后48h用结 晶紫染色。
图7.抗-DAF和抗-ICAM-1mAb对CVA21-DAFv结合和溶解性感 染的影响。(A)CHO、CHO-DAF、CHO-ICAM-1和DOV13细胞上 DAF和ICAM-1表面水平的流式细胞仪分析。实线直方图代表仅有缀 合体的结合，虚线直方图代表抗-ICAM-1mAb的结合，实心直方图显 示抗-DAF mAb的结合。与CHO、CHO-ICAM-1、CHO-DAF、RD和 DOV13细胞上表面表达的ICAM-1(B)和DAF(C)结合的放射性同 位素标记的病毒通过液体闪烁计数进行测定。结果表示成三份样品+ SD。(D)DAF的mAb交联对RD和DOV13细胞的CVA21溶解性感 染的影响。在用CVA21亲代和CVA21-DAFv(1-106TCID50/孔)攻击 之前，将96孔板中的单层与抗-DAF SCR3mAb预培育。在37℃下培 育72h后，固定细胞单层，并用结晶紫溶液染色。+表示通过显微镜检 查检测的CPE。*病毒效价小于101TCID50/ml。
图8.从DAF洗脱CVA21-DAFv。(A)比较CVA21亲代和 CVA21-DAFv与表面DAF结合的严格性。将CHO-DAF细胞与放射性 同位素标记的病毒在4℃下培育2h，然后将与细胞结合的病毒用不同 浓度的抗-DAF SCR1mAb(IA10)在冰上洗脱1h。监测上清液中洗脱 病毒的水平，结果表示成放射性同位素标记的病毒被洗脱的细胞的％。 (B)结合DAF和ICAM-1的CVA21-DAFv病毒体的沉淀。将CHO-DAF 和CHO-ICAM-1细胞与放射性同位素标记的CVA21-DAFv病毒体在4 ℃下培育2h，将与细胞结合的病毒在37℃下洗脱2h。洗脱的病毒体沉 淀在5-30％蔗糖梯度上进行分析。使用成熟病毒体(160S)和原病毒 体(125S)作为内迁移参照。
图9.CVA21-DAFv溶解性感染被抗DAF SCR1mAb和可溶性DAF (sDAF)抑制。(A)用CVA21-DAFv感染之前，将成片的RD单层细 胞与抗-DAF SCR1mAb IA10培育。在37℃下培育24h后，观察细胞 的溶解情况并拍照。(B)将CVA21-DAFv与sDAF(85μg/m)在37 ℃下培育1h，并将其加入至RD细胞单层。在37℃下培育48h后，观 察细胞的溶解情况并拍照。
图10.预计的CVA21的受体-病毒结合表面的近观。(A)表示成 等值面的一个CVA21启动子的俯视图，其中VP1绘成黄色，VP2绘成 粉红色，VP3绘成紫红色。数字表示二十面体5-、3-、和2-重轴的相 应位置。相互作用的ICAM-1和DAF分子显示成蠕虫样图，DAF为麦 色，与峡谷结合的ICAM-1为绿色。CVA21亲代(空间填充模式)中 VP3 R96残基的位置被VP1C-端环所部分覆盖，仅有精氨酸侧链上的 一个氮原子(紧靠星号的蓝色表面)可以从病毒表面上看到。(B)CVA21 启动子的侧视图，蛋白上的颜色如上述，VP3残基R96和E101用以空 间填充模式突出显示。图像用pymol程序(http://www.pymol.org)生 成。
图11.放射性同位素标记的CVA21与嵌合DAF/CD46受体的结 合。(A)野生型DAF、CD46和DAF/CD46嵌合分子的示意图。(B) mAbs与DAF和CD46的单个SCR结合的流式细胞仪分析。抗-DAF mAbs为IA10(SCR1)、IH4(SCR3)、IIH6(SCR4)，抗-CD46mAb (SCR1)为MCI20.6。与合适的mAbs培育后，将细胞用PBS冲洗， 重新悬浮在100μl PBS(DAKO A/S，Denmark)中的缀合有R-藻红蛋 白的羊抗鼠免疫球蛋白F(ab′)2片段中，在冰上培育20min。如上文所 述对细胞进行冲洗并沉淀，重新悬浮在PBS中，并使用FACStar分析 仪(Becton Dickenson，Sydney，Australia)对DAF和CD46表达进行 分析。(C)放射性同位素标记的CVA21与表达DAF、CD46或嵌合 DAF/CD46分子的结合。将细胞与大约2×105cpm35S-标记的CVA21在 37℃下培育1h，然后用PBS冲洗四次。与细胞结合的CVA21的量通 过液体闪烁来测定。结果表示成三份样品的平均值+SD。
图12.从表达DAF的CHO细胞洗脱CVA21对时间、温度和培养 基pH的反应。(A)CVA21与细胞表面表达的DAF在4℃下结合，温 度升高至37℃后2h继续洗脱0、1、5、15、30和60分钟。洗脱的CVA21 的水平通过液体闪烁计数进行测定。(B)CVA21与细胞表面表达的 DAF在4℃下结合2h，然后在适当温度下培育，继续洗脱30分钟。(C) CVA21与细胞表面表达的DAF在4℃下结合2h，在适当pH的培养基 中在37℃下培育，继续洗脱30分钟。
图13.自DAF和ICAM-1洗脱后CVA21的感染性。(A)与细胞 表面表达的DAF和ICAM-1在4℃下结合的[35S]-蛋氨酸标记的CVA21 的水平，随后在37℃下培育后从每个受体上洗脱放射性同位素标记的 病毒。结合的[35S]-蛋氨酸标记病毒的水平在1450Microbeta TRILUX (Wallac，Turku，Finland)上通过液体闪烁计数进行测定。结果表示 成三份样品+SD。(B)与从细胞表面表达的DAF和ICAM-1结合并洗 脱后CVA21对RD-ICAM-1细胞的溶解性感染。通过用结晶紫/甲醇溶 液染色，从四个孔对细胞存活率进行定量，染色细胞单层的相对吸光 度在multiscan酶联免疫吸附试验平板读数仪(Flow Laboratories， McLean，Virginia，USA)上在540nm处进行读数。使用Reed和Muench 法计算50％终点效价，如果吸光度小于无病毒对照物减去标准误差的 3倍，则该孔被记为阳性。
图14.自交联DAF洗脱后CVA21的感染性。(A)在0℃下和37 ℃下，从RD细胞上细胞表面表达的ICAM-1(RD-ICAM-1)和RD细 胞上mAb交联的DAF上洗脱[35S]-蛋氨酸标记的CVA21。洗脱的[35S]- 蛋氨酸标记病毒的水平在1450Microbeta TRILUX(Wallac，Turku， Finland)上通过液体闪烁计数进行测定。结果表示成从三份样品上洗 脱的病毒的百分比+SD。(B)与对照CVA21相比，与ICAM-1或mAb 交联DAF结合并洗脱后CVA21对RD-ICAM-1细胞的溶解性感染。通 过用结晶紫/甲醇溶液染色，从四个孔对细胞存活率进行定量，染色细 胞单层的相对吸光度在multiscan酶联免疫吸附试验平板读数仪(Flow Laboratories，McLean，Virginia，USA)上在540nm处进行读数。如 图13所述计算50％终点效价。(C)CVA21与ICAM-1或交联DAF结 合的严格性。将RD-ICAM-1细胞或DAF-交联RD-细胞[与抗-DAF SCR3(IH4)mAb预培育的RD细胞]与大约2×105cpm35S-标记的CVA21 在0℃下培育2h。用冷PBS冲洗4次后，将细胞分在多个管中，并与 不同浓度(0-100μg/ml)的抗-DAF SCR1mAb或抗-ICAM-1结构域1 mAb在0℃下培育1h。通过液体闪烁计数监测细胞和上清液的放射活 性，结果表示成35S-标记CVA21被洗脱的细胞的％。
图15.在延迟诱导ICAM-1表达后，CVA21诱导的RD细胞溶解 性感染。(A)腺病毒转导的ICAM-1表达的时间进程。通过用2.5×107 TCID50/ml含人ICAM-1cDNA的重组腺病毒进行转导，诱导RD细胞 表达人ICAM-1。在腺病毒接种后的不同时间，通过流式细胞仪使用抗 -ICAM-1结构域mAb(IH4)测定细胞的ICAM-1表达。(B)在伪转 导或用含人ICAM-1或CD36cDNA的重组腺病毒进行转导后的24h， 对显示DAF、ICAM-1和CD36表面表达的RD细胞进行流式细胞仪分 析。闭合直方图表示DAF表达，粉红色直方图表示ICAM-1表达，蓝 色直方图表示CD36表达。使用Adeno-quest试剂盒(Quantum Biotechnologies Inc)，根据制造商的说明书构建含有ICAM-1cDNA或 CD36cDNA的重组腺病毒。(C)经由迟至24h后的ICAM-1表达的延 迟，RD细胞的CVA21溶解性感染。在CVA21(moi＝1.0TCID50)与 DAF结合后的0、6和24h，通过用2.5×107TCID50/ml含有ICAM-1或 CD36cDNA的重组腺病毒进行转导，诱导RD细胞表达ICAM-1或 CD36受体。以未转导的RD细胞作为对照物。通过用结晶紫/甲醇溶液 染色，从四个孔对细胞存活率进行定量，染色细胞单层的相对吸光度 在multiscan酶联免疫吸附试验平板读数仪(Flow Laboratories，McLean， Virginia，USA)上在540nm处进行读数。。使用Reed和Muench法计 算50％终点效价，如果吸光度小于无病毒对照物减去标准误差的3倍， 则该孔被记为阳性。(D)CVA21诱导的溶解性感染。在与CVA21(moi ＝1.0TCID50)培育后立即进行伪转导或用含有人ICAM-1或CD36 cDNA的重组腺病毒进行转导后的24h，对RD细胞单层进行显微拍照 (X200)。
图16.乳腺、卵巢、前列腺和结肠癌细胞系中的受体表达。在3 种人乳腺、卵巢、前列腺和结肠癌细胞系中对ICAM-1和DAF的表达 进行流式细胞仪分析。黑色实线直方图代表仅有缀合物，灰色直方图 表示ICAM-1的表达，黑色空心直方图表示DAF的表达。
图17.CVA21-DAFv的体内溶瘤作用。对CVA21-DAFv-诱导的人 乳腺、卵巢、前列腺和结肠癌细胞体外培养物的感染进行显微拍照。 细胞单层用CVA21亲代或CVA21-DAFv感染，并监测细胞的病变效应。 感染后的72小时，对单层进行拍照。
图18.对CVA21-DAFv在人乳腺、卵巢、前列腺和结肠癌细胞系 中的溶瘤能力进行定量。将96孔板中的单层癌细胞用CVA21亲代或 CVA21-DAFv母液的10倍稀释液进行接种。培育72小时后，观察细 胞单层中病变效应的存在。将显微镜下可检测到细胞病变效应(CPE) 的孔记为阳性，使用Reed和Muench法计算50％感染终点效价。
图19.CVA21-DAFv对人前列腺异源移植物的体内溶瘤作用。对 注射2×106PC3细胞后携带有生长于侧腹部的皮下PC3肿瘤(大约 50-100mm3)的SCID(严重的合并免疫缺陷)小鼠静脉内注射单次剂 量的CVA21亲代、CVA21-DAFv或PBS。使用卡钳从外部测量平均肿 瘤大小，使用球体公式估计肿瘤的体积。肿瘤体积表示成6只被处理 小鼠的平均值+/-SE。
图20.CVA21#272598分离物的外壳编码区的序列。(A)核苷酸 序列和(B)翻译的氨基酸序列，其分别对应于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
图21.CVA21#275238分离物的外壳编码区的序列。(A)核苷酸 序列和(B)翻译的氨基酸序列，其分别对应于SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
图22.CVA21#272101分离物的外壳编码区的序列。(A)核苷酸 序列和(B)翻译的氨基酸序列，其分别对应于SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
图23.CVA210-DAFv的外壳编码区的序列。(A)核苷酸序列和(B) 翻译的氨基酸序列，其分别对应于SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8。

尽管已知一些天然的小RNA病毒和其它病毒如呼肠病毒适用于治 疗有限种类的癌症，但仍需要开发改良的治疗方法。为扩大可能的癌 症治疗范围，并提供更有效的治疗，通过修饰和生物选择，当前的发 明人获得了溶瘤特性提高的新的溶瘤小RNA病毒。
如本文所述，当前发明人已经发现，野生型小RNA病毒可以加以 生物选择，以溶解性地感染表达DAF但不表达ICAM-1的细胞，这种 细胞通常对野生型小RNA病毒感染有抗性。细胞对小RNA病毒感染 的“抗性”表示用病毒感染细胞不引起显著的病毒产生或收率。“易感” 的细胞是表现出诱导细胞病变效应、病毒蛋白合成、和/或病毒产生的 细胞。
基于这些发现，当前发明人已开发出获得适用于治疗哺乳动物肿 瘤的新的小RNA病毒的方法。哺乳动物可以是人，或者是有社会、经 济或研究意义的任何种属的个体，这些种属包括但不限于小鼠、狗、 猫、绵羊、山羊、牛、马、猪、非人灵长类和人。在优选的实施方式 中，哺乳动物是人。
小RNA病毒可以是天然的或修饰的。当从天然来源中分离并且没 有在实验室中被人刻意修饰过时，小RNA病毒是“天然的”。例如， 小RNA病毒可以获自“野生来源(field source)”：即，来自人类患者。
小RNA病毒可以是修饰的，但其仍能够溶解性地感染表达DAF 和/或ICAM-1的哺乳动物细胞。可以通过下列方法对小RNA病毒进行 生物选择：将天然的小RNA病毒在细胞系中培养传代多次，直至获得 修饰的小RNA病毒。合适的细胞系包括表达DAF的细胞，如癌细胞 系。应当认识到，其它细胞系也是合适的。
小RNA病毒可以在为受试者细胞给药之前进行化学或生物化学上 的预处理(例如，用蛋白酶如糜蛋白酶或胰蛋白酶处理)。用蛋白酶预 处理除去病毒的外壳或外壳，可以增强病毒的感染性。小RNA病毒可 以包覆在脂质体或微团中，以减少或防止对小RNA病毒已产生免疫性 的哺乳动物的免疫反应。例如，可以在形成烷基硫酸盐去垢剂浓缩物 的微团的存在下，将病毒体用糜蛋白酶处理，以产生新的感染性亚病 毒体颗粒。
小RNA病毒可以是来自两种或多种类型的具有不同致病表型的小 RNA病毒的重组小RNA病毒，使得它就含有不同的抗原决定子，从 而减少或防止之前暴露于小RNA病毒亚型的哺乳动物的免疫反应。这 种重组病毒体可以通过哺乳动物细胞与不同亚型的小RNA病毒共感染 产生，生成的不同亚型的外壳蛋白重新分选并结合到生成的病毒体外 壳中。
小RNA病毒可以通过参入突变外壳蛋白来进行修饰，例如VP1、 VP2和VP3进入病毒体外外壳。蛋白可通过置换、插入或缺失而突变。 置换包括插入不同的氨基酸来代替天然氨基酸。插入包括在一个或多 个位点将额外的氨基酸残基插入到蛋白中。缺失包括蛋白中一个或多 个氨基酸残基的缺失。这些突变可通过本领域已知的方法产生。例如， 其中一个外壳蛋白的编码基因的寡核苷酸定点诱变可以导致生成所需 的突变外壳蛋白。在感染小RNA病毒的哺乳动物细胞中体外表达突变 蛋白将导致突变蛋白参入小RNA病毒病毒体颗粒。
小RNA病毒还可以修饰成减小或消除对小RNA病毒的免疫反应。 这样修饰的小RNA病毒被称为“免疫保护的小RNA病毒”。这种修饰 可以包括将小RNA病毒包装在脂质体、微团或其它载体中，使小RNA 病毒被掩蔽不受哺乳动物免疫系统影响。另外可选地，小RNA病毒体 颗粒的外外壳可以去除或改变，因为存在于外外壳上的蛋白是宿主体 液和细胞反应的主要决定因素。
在本发明的方法中，用小RNA病毒为个体哺乳动物的肿瘤给药。 可以使用的人小RNA病毒的代表类型包括肠病毒、柯萨奇病毒、艾柯 病毒、脊髓灰质炎病毒和未分类肠病毒、鼻病毒、副肠弧病毒、肝病 毒和心病毒。在优选的方式中，小RNA病毒为柯萨奇病毒。优选地， 柯萨奇病毒为A型，更优选为柯萨奇病毒A21。可以使用不同血清型 和/或不同病毒株的小RNA病毒的组合，例如来自不同动物种属的小 RNA病毒。小RNA病毒是“天然的”：即，它是从天然来源中分离的， 并且没有在实验室中被人刻意修饰过。例如，小RNA病毒可以是从“野 生来源”生物选择的：即，来自人类患者。如果需要的话，在为肿瘤 给药之前可以对小RNA病毒进行化学或生物化学上的预处理(例如， 用蛋白酶如糜蛋白酶或胰蛋白酶处理)。这种预处理除去了病毒的外壳 或外壳，可以增强病毒的感染性。
肿瘤可以是实体肿瘤(例如，肉瘤或癌)，或者是影响造血系统的 癌性生长物(“造血系肿瘤”；例如淋巴瘤或白血病)。肿瘤是一种异常 组织生长物，它通常形成明显的块状，并通过远远快于正常组织生长 的速度进行细胞增殖而生长。肿瘤部分或完全地表现出结构组织和与 正常组织功能协调的缺乏。如本文所用，“肿瘤”也指“瘤(tumor)”， 其用来包括造血系肿瘤和实体肿瘤。至少肿瘤的一些细胞表达DAF和 /或ICAM-1。对本发明方法的治疗特别易感的一种肿瘤是黑色素瘤。 其它对本发明方法的治疗特别易感的肿瘤包括乳癌、脑癌(例如成胶 质细胞瘤)、肺癌、前列腺癌、结直肠癌、甲状腺癌、肾癌、肾上腺癌、 肝癌、白血病、卵巢癌、胃癌和肠癌等。
通常将小RNA病毒在生理学可接受的载体或媒介(如磷酸盐缓冲 盐水)中为肿瘤给药。“为肿瘤给药”是指小RNA病毒的给药方式是 使其与肿瘤的细胞接触(本文也称为“肿瘤细胞”)。小RNA病毒给药 的途径、剂型、载体或媒介取决于肿瘤的位置及类型。可以采用范围 很宽的给药途径。例如，对于可触及的实体肿瘤，可以通过注射将小 RNA病毒直接为肿瘤给药。对于造血系肿瘤，例如，可以将小RNA 病毒静脉内或血管内给药。对于体内不容易触及的肿瘤，例如转移灶 或脑肿瘤，小RNA病毒的给药方式是使其可以通过哺乳动物机体全身 输送，从而到达肿瘤(例如，鞘内、静脉内或肌肉内)。另外可选地， 可以将小RNA病毒为单个实体肿瘤直接给药，然后它通过机体经全身 输送至转移灶。小RNA病毒也可以经皮下、腹膜内、局部(例如对黑 色素瘤)、口服(例如口腔或食管肿瘤)、经直肠(例如对于结直肠肿 瘤)、经阴道(例如，宫颈或阴道肿瘤)、经鼻或通过喷雾吸入(例如 对于肺肿瘤)给药。
通常，可以根据本领域普通技术人员公知的方法制备合适的组合 物，因此可以包括药物可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
这些组合物可以通过标准途径来给药。通常，组合物可通过胃肠 外(例如，静脉内、椎管内、皮下或肌肉内)、口服或局部途径给药。 更优选地，通过胃肠外途径给药。
就与组合物的其它成分相容而言，载体、稀释剂和佐剂必须是“可 接受的”，对其接受者是无害的。
药物可接受载体或稀释剂的例子是去离子水或蒸馏水；盐水溶液； 植物油如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、如花 生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油； 硅油类，包括聚硅氧烷，如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基 聚硅氧烷；挥发性硅酮类；矿物油，如液状石蜡、凡士林或角鲨烷； 纤维素衍生物，如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基 纤维素钠、或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇，例如乙醇或异丙醇；低 级芳烷醇(aralkanol)；低级聚烷撑二醇或低级烷撑二醇，例如聚乙二 醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯，如棕 榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯、或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂； 黄蓍胶或阿拉伯树胶、和矿脂。典型地，一种或多种载体可以占组合 物重量的10％至99.9％。
本发明的组合物可以是适合注射给药的形式、适合口服摄取的形 式(如胶囊、片剂、囊片、酏剂)、适合局部给药的软膏剂、霜剂或洗 剂的形式、适合作为滴眼液输送的形式、适合吸入给药(如通过经鼻 吸入或经口吸入)的气雾剂形式、适合胃肠外给药(即皮下、肌肉内 或静脉内注射)的形式。
对于以可注射溶液或悬液给药，胃肠外可接受的无毒稀释剂或载 体可以包括林格氏溶液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1，2-丙二 醇。
一些口服使用的合适载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的例子包括花 生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠、阿拉伯 树胶、黄蓍胶、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、明胶和卵磷脂。 此外，这些口服剂型可以包含合适的调味剂和着色剂。当以胶囊形式 使用时，胶囊可以用延缓崩解的化合物(如单硬脂酸甘油酯或二硬脂 酸甘油酯)包覆。
佐剂典型地包括润滑剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓 冲剂。
口服给药的固体剂型可以含有人类和兽医制药领域中可接受的粘 合剂、甜味剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂、 和/或延时剂。合适的粘合剂包括阿拉伯树胶、明胶、玉米淀粉、黄蓍 胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的甜味剂包括蔗糖、 乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基 纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、黄原胶、膨润土、藻酸、或琼脂。 合适的稀释剂包括乳糖、山梨糖醇、甘露醇、葡萄糖、高岭土、纤维 素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸氢钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、 樱桃味、橙味、或树莓味调味剂。合适的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基 丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶、 或谷蛋白。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血 酸、对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂 包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的延时剂包括 单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
口服给药的液体剂型除上述试剂以外还可以包括液体载体。合适 的液体载体包括水、油类，例如橄榄油、花生油、芝麻油、向日葵油、 红花油、花生油、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、 乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯、或其混合物。
口服给药的悬液可以进一步包括分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮 剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯吡咯 烷酮、海藻酸钠、或乙酰基醇。合适的分散剂包括卵磷脂、脂肪酸的 聚氧乙烯酯，如硬脂酸、聚氧乙烯山梨醇单或二油酸酯、-硬脂酸酯、 或-月桂酸酯、聚氧乙烯去水山梨糖醇单或二油酸酯、-硬脂酸酯、或- 月桂酯和类似物。
口服给药的乳液可以进一步包括一种或多种乳化剂。合适的乳化 剂包括上文例举的分散剂或天然树胶，如瓜尔胶、阿拉伯树胶或黄蓍 胶。
胃肠外给药组合物的方制备法对于本领域专业技术人员是显而易 见的，例如，更详细地见述于Remington′s Pharmaceutical Science，第 15版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，在此将其引入作为参考。
本发明的局部用药制剂包括活性成分以及一种或多种可接受的载 体，任选地包括任何其它治疗成分。适合局部用药的制剂包括适合透 过皮肤到达需治疗部位的液体或半液体制剂，例如擦剂、洗剂、霜剂、 软膏剂或糊剂，以及适合眼、耳或鼻给药的滴剂。
根据本发明的滴剂可包括无菌水性或油性溶液或悬液。可以通过 将活性成分溶解在杀菌剂和/或抗真菌剂和/或任何其它合适防腐剂的 水溶液(其任选地包括表面活性剂)中来制备这些。然后可以将得到 的溶液通过过滤澄清，转移到合适的容器中并消毒。消毒可以通过下 列方法完成：高压灭菌法，或者在90℃-100℃下维持半小时，或者通 过过滤、然后通过无菌技术转移至容器中。适合包含在滴剂中的杀菌 剂和抗真菌剂的例子是硝酸苯汞或醋酸苯汞(0.002％)、苯扎氯铵 (0.01％)和醋酸洗必泰(0.01％)。油性溶液制剂的合适溶剂包括甘 油、稀释的乙醇和丙二醇。
根据本发明的洗剂包括适合用于皮肤或眼部的剂型。眼洗剂可包 括无菌水溶液，其可任选地含有杀菌剂，可以通过与上述滴剂制备相 似的方法进行制备。用于皮肤的洗剂或擦剂还可以包括加速干燥和使 皮肤凉爽的试剂，例如乙醇或丙酮、和/或润湿剂如甘油、或油类如蓖 麻油或花生油。
根据本发明的霜剂、软膏剂或糊剂是外用的活性成分的半固体剂 型。它们可以通过下列方法制备：将单独的、或者水性或非水性液体 的溶液或悬液中的磨碎或粉末形式的活性成分与油质或非油质基质混 合。基质可以包括碳氢化合物，如硬石蜡、软石蜡或液体石蜡，甘油、 蜂蜡、金属皂；胶浆剂；天然来源的油，如杏仁油、玉米油、花生油、 蓖麻油、或橄榄油；羊毛脂或其衍生物，或者脂肪酸如硬脂酸或油酸， 以及醇，如丙二醇或聚乙二醇。
组合物中可以加入任何合适的表面活性剂如阳离子、阴离子或非 离子型表面活性剂，例如去水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物。还可 以包括悬浮剂，例如天然树胶、纤维素衍生物或无机物如硅酸盐，以 及其它成分如羊毛脂。
将小RNA病毒或者获自或源自小RNA病毒的核酸以足够治疗肿 瘤的量(例如，“有效量”)给药。用小RNA病毒为肿瘤细胞给药实现 肿瘤细胞溶解，引起肿瘤的大小减少、或肿瘤完全消失时，肿瘤得以 “治疗”。肿瘤大小的减少、或优选的肿瘤消失通常是肿瘤细胞被小 RNA病毒溶解(“溶瘤作用”)造成的。有效量可以根据个体的情况确 定，可以至少部分考虑小RNA病毒的类型；个体的大小、年龄、性别； 以及肿瘤的大小和其它特征。例如，对于人类的治疗，根据存在肿瘤 的类型、大小和数量，可以使用大约102至1012蚀斑形成单位(PFU) 的小RNA病毒。优选地，接种物含有大于约105PFU，例如，在大约 105至106PFU之间、或大约106至107PFU之间。更优选地，接种物 可以含有大约1×106至大约5×106PFU，如大约3×106PFU。例如，对 于人黑色素瘤的治疗，可以使用一种或多种大约3×106PFU的接种物。 可以将小RNA病毒以单次剂量或多次剂量(即，剂量超过一次)给药。 多次剂量可以同时给药，或连续给药(例如，在几天或几周的时间内)。 典型地，在治疗性应用中，治疗要根据疾病状态的持续时间维持一段 时间，例如，至少直至通过常规手段检查不到肿瘤。还应当考虑到， 在检查不到肿瘤以后可能需要继续进行治疗，例如，治疗医师怀疑存 在有未检查到的肿瘤。也可以将小RNA病毒或核酸为同一个体内的一 个以上的肿瘤给药。
需要用小RNA病毒多次给药时，可以每次用不同的病毒给药，以 避免对之前所给药病毒的任何免疫反应的影响或将这种影响降至最 低，治疗周期可以持续1至2周或更长时间，这一点可以由主治医生 确定。最优选地，可以用哺乳动物之前未接触过的病毒或者哺乳动物 对其产生的免疫反应相对较小的病毒给药，这一点可以通过标准技术 确定。
本发明包括能够在基本上不存在细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的 情况下溶解性地感染细胞的分离的小RNA病毒核酸分子。在一个实施 方式中，核酸分子可以源自小RNA病毒，也可以是来自病毒的单链 RNA或互补DNA。应当认识到，本发明的核酸序列包括来源于小RNA 病毒的核酸序列，例如，包括编码病毒基因组的核酸序列、或者其足 以使病毒产生或能够在细胞内引起溶解性感染的序列。例如，核酸分 子可以包括单个病毒RNA或DNA分子，例如互补DNA分子、或编 码不同病毒序列的多种上述分子。
本文所用的术语“聚核苷酸”是指单链或双链的脱氧核糖核苷酸、 核糖核苷酸碱基、已知的类似物、或天然核苷酸、或其混合物的聚合 物。
应当理解到，在本说明书的上下文中，术语“源自”包括：序列 可以是直接从小RNA病毒分离的病毒RNA、合成的RNA、对应于所 分离序列的cDNA。该术语还包括与野生型序列或亲代序列相比在序列 上包括一个或多个突变(其包括，例如外壳蛋白的突变)的合成聚核 苷酸。
可以使用任何合适的分离病毒RNA的方法，其包括基于使用苯酚 /氯仿提取的方法，例如市售的病毒RNA分离试剂盒如TrizolLS reagent(GIBCO BRL，Life Technologies Grand Island，NY，USA)所提供 的方法；采用基于磁珠分离的分离方法，例如Ambion MagMaxTM病毒 RNA分离试剂盒。病毒RNA的分离方法通常见述于：例如，Ausubel， F.等人主编，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学方 法).1992，Green Publishing Associates and Wiley-lnterscience，JohnWiley and Sons：New York和Sambrook等人，(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验手册)，第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York。
应当认识到，无论核酸序列(如病毒RNA)是从病毒中直接分离 的、合成的、呈现为质粒分子、还是在体外产生(如使用噬菌体T7RNA 聚合酶从cDNA模板产生)，本发明不要求其不含污染物质(如细胞碎 片)，其在本说明书的文中被认为是“分离的”。因此，在本说明书的 上下文中，当原料中的非RNA成分(如细胞蛋白)已经部分或全部地 从RNA中除去时，RNA被视为是分离的。例如，当超过50％的非RNA 物质被除去时，RNA被视为是“分离的”。优选超过60％的非RNA物 质被除去，更优选超过70％、80％或90％的非RNA物质被除去。典型 地，RNA含有小于10％的污染物质，更典型地，小于5％的污染物质。 因此，优选地，病毒RNA的RNA纯度大于95％，更优选纯度大于97％ 或纯度大于99％。
优选地，核酸分子包括选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7的核酸序列。本领域技术人员将会认识到，考 虑到遗传密码的简并性，这些聚核苷酸分子之间可能有相当大的序列 上的变化。
本发明还提供与在此公开的聚核苷酸(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO： 3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7)基本相似的分离的聚核苷酸序列， 这些序列包括或提供能够在基本上不存在细胞间粘附分子-1(ICAM-1) 的情况下溶解性地感染细胞的小RNA病毒。聚核苷酸序列变体与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7中的一个或 多个具有性质相同的生物学活性。本文所用的术语“基本相似”是指 与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7中的 任意一个所示序列的序列同一性为至少大约60％、更优选为至少大约 70％、再更优选为至少大约80％的序列。典型地，这种序列与SEQ ID NO： 1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7中的任意一个的同 一性更优选为至少大约90％，最优选为至少大约95％或更高。
本文所用的“序列同一性”是指当通过本领域公知的计算机程序 (例如GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August1996，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison， Wisconsin，USA53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)， Journal of Molecular Biology，48，443-453)提供的GAP)在特定的比较 窗中进行最大一致性排比时，两个序列中的残基是相同的。
除上文对本发明序列的描述以外，应当认识到，本发明的序列包 括变异的序列，例如，对于多肽序列来说，序列包括一个或多个氨基 酸置换、缺失和/或改变(如保守氨基酸的改变)，对于聚核苷酸序列来 说，序列编码包括一个或多个氨基酸置换、缺失和/或改变的(如一个 或多个保守氨基酸的改变)的多肽序列。优选地，这些改变的性质微 小，即，保守氨基酸的置换和其它置换不会显著影响到序列的活性， 例如使病毒能够在基本上不存在细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的情况 下溶解性地感染细胞。保守氨基酸的置换及其引入方法是本领域公知 的，通常，是指将多肽链(蛋白的一级序列)中的一个氨基酸置换或 替换性质相似的另一个氨基酸。例如，带电的谷氨酸(Glu)替换成 带有相似电荷的氨基酸天冬氨酸(Asp)便为保守氨基酸取代。可以使 用下列表格作为指导：
表1：保守氨基酸置换
碱性 精氨酸、赖氨酸、 组氨酸 疏水性 亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸 酸性 谷氨酸、天冬氨酸 芳香性 苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸 极性 谷氨酰胺、天冬酰胺 小 甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、 苏氨酸、蛋氨酸
变异的序列包括，例如，本文所述的外壳蛋白变更的保守置换。 例如，可以预计包括突变体VP3R96H的保守置换(如VP3R96K)的 序列具有所需的特性。类似地，可以预计包括突变体VP3E101A的保 守置换(如VP3E101G、VP3E101T、VP3E101S、或VP3E101M)的 一个或多个序列具有所需的特性。作为其它例子，可以预计包括突变 体VP3A239S的保守置换(如VP3A239G、VP3A239T、或VP3A239M) 的一个或多个序列具有所需的特性。仍然是其它例子，可以预计包括 突变体VP2S164L的保守置换(如VP2S1641或VP2S164V)的一个 或多个序列具有所需的特性。
如本文所述，根据本发明，很容易检测变异序列的功能性。
还应当认识到，可以通过使用RNA基因组或基因组的互补DNA 拷贝而将小RNA病毒间接给药。给药时，小RNA病毒仍然能够在细 胞中复制，并造成期望的溶解性感染和致死。
因此，除完整病毒之外，可以将参入产生病毒的核酸的病毒或其 它质粒或表达载体注射到肿瘤中，以被肿瘤细胞摄取，在细胞内产生 完整的病毒以发挥治疗作用。合适的表达载体包括能够表达编码产生 病毒所必需的病毒蛋白的DNA(例如基因组DNA或cDNA)插入片 断的质粒。表达载体典型地包括与插入的核酸可操作式连接的转录调 节控制序列。“可操作式连接”是指核酸插入片断与转录调节控制序列 连接，使得插入的序列可以在不进行插入片断读框移位的情况下进行 转录。这种转录调节控制序列包括促进RNA聚合酶的结合以启动转录 的启动子、以及使核糖体能够与转录的mRNA结合的表达控制元件。
更具体地，本文所用的术语“调节控制序列”应当理解成包括任 何参与驱动转录和控制(即调节)指定DNA序列转录水平的DNA。 例如，5′调节控制序列是位于编码序列上游的DNA序列，其可以包括 启动子和5′不翻译的前导序列。3′调节控制序列是位于编码序列下游的 DNA序列，其可以包括合适的包括一个或多个加A信号的转录终止(和 /或)调节信号。如本文所用，术语“启动子”包括任何在转录启动过 程中被依赖DNA的RNA聚合酶所识别并与其结合结合(直接或间接) 的DNA序列。启动子包括转录启动位点、和转录启动因子和RNA聚 合酶的结合位点，其可以包括各种可以结合基因表达调节蛋白的其它 位点或序列(如增强子)。
大量适于转染哺乳动物细胞的表达载体是本领域已知的。适于转 染哺乳动物细胞的表达载体包括pSV2neo、pEF-PGk.Puro、pTk2、和 参入聚腺苷酸化位点和延伸因子1-x启动子的非复制腺病毒穿梭载体、 和更优选参入巨细胞病毒(CMV)启动子的基于pAdEasy的表达载体 (例如，见He等人，1998)。还可以使用采用多肽延伸因子-α2作为启 动子的质粒pEFBOS。编码产生病毒所必需的病毒蛋白的cDNA可以 通过下列方法制备：使用本领域公知的重组技术，例如Sambrook等人 (1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆实验手册)，第 二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，New York和Ausubel等人， (1994)，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学方法)， USA，Vol.1and2中所述，逆转录病毒RNA基因组或其片段，并参入 到合适的载体中。
除cDNA之外，细胞可以用自纯化的病毒体中提取的病毒RNA转 染，或者，例如，如Ansardi，D.C.等人，2001所述，在体外使用噬菌 体T7RNA聚合酶从cDNA模板产生RNA转录物。
类似地，可以以单个质粒或RNA分子给药，以表达病毒蛋白和产 生病毒，或者以编码不同病毒蛋白的多种质粒或RNA分子给药，以转 染细胞和产生病毒。
可以将质粒或RNA通过，例如局部给药或注射，为肿瘤给药，以 便在不存在促进细胞转染的载体媒介或与这种媒介结合的情况下被肿 瘤细胞摄取。合适的载体媒介包括脂质体，典型地提供成本领域公知 的水包油乳剂。脂质体典型地包括脂类、特别是磷脂的组合，例如相 变温度高的磷脂，其通常具有一个或多个类固醇或类固醇前体(如胆 固醇)，以便为脂质体提供膜稳定性。用于提供脂质体的脂类的例子包 括磷脂酰化合物，如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、 磷脂酰乙醇胺、脑苷脂和神经节苷脂。特别合适的是磷脂酰甘油二酯 (diacyl phosphateidylglycerol)，其中脂质部分含有14至18个碳原子， 更优选为16至18个碳原子，并且是饱和的。
可以将小RNA病毒或包括小RNA病毒的组合物可以脂质体的形 式给药。脂质体通常来源于磷脂或其它脂类物质，由分散在水相介质 中的单层或多层水合液晶形成。可以使用任何能够形成脂质体的无毒、 生理可接受、且可代谢的脂类。脂质体形式的组合物可以含有稳定剂、 防腐剂、赋形剂和类似物。优选的脂类是天然或合成的磷脂和磷脂酰 胆碱(卵磷脂)。形成脂质体的方法是本领域公知的，与此相关可以查 阅以下文献：Prescott主编，Methods in Cell Biology(细胞生物学方法)， Volume XIV，Academic Press，New York，N.Y.(1976)，33页以后，在此并 入其内容作为参考。
脂质体与靶细胞的相互作用可以是被动的或主动的。主动靶向涉 及在脂质体膜中引入与靶细胞表达的相应配体结合或相互作用的特异 性配体对脂质体进行修饰。这种配体包括，例如，单克隆抗体或其结 合片段(例如，Fab或F(ab′)2片段)、糖或糖脂部分、或者特别优选的 对DAF有特异性的病毒蛋白或单克隆抗体。
可以将小RNA病毒与其它的治疗剂结合给药。例如，可以将小 RNA病毒可与一种或多种不同血清型或病毒株的小RNA病毒结合给 药。其它血清型或病毒株的小RNA病毒对细胞感染的受体要求与本发 明的小RNA可以是相同的，也可以是不同的。
作为其它例子，可以小RNA病毒或其组合与一种或多种能够调节 或抑制被治疗个体的免疫反应的药物结合给药。以这种方式，个体对 病毒感染的天然免疫反应可以被改变，因此优选地使病毒感染和/或溶 瘤结果更有效。典型地，能够改变免疫反应的药物是能够抑制免疫反 应的药物。能够调节或抑制个体(如人类个体)免疫反应的药物见述 于：例如，The Merck Index，第13版，Merck&Co.Inc，Whitehouse Station，NJ，USA.，再次并入其内容作为参考。
小RNA病毒或其组合可以与一种或多种化疗药物(也称为抗肿瘤 药)联合使用。抗肿瘤药见述于：例如，The Merck Index，第13版， Merck&Co.Inc，Whitehouse Station，NJ，USA。例如，可以将小RNA 病毒与下列化疗药物结合给药，例如：阿霉素、紫杉醇、氟尿嘧啶、 美法仑(melphalan)、顺铂(cisplatin)、α-干扰素、COMP(环磷酰胺、 长春新碱、甲氨喋呤和强的松)、依托泊甙(etoposide)、mBACOD(甲 氨喋呤、博来霉素、多柔比星(doxorubicin)、环磷酰胺、长春新碱、 地塞米松)、PROMACE/MOPP(强的松、甲氨喋呤(w/leucovin rescue)、 多柔比星、环磷酰胺、紫杉醇、依托泊甙/mechlorethamine、长春新碱、 强的松和甲基苄肼)、长春新碱、长春花碱、血管抑制素(angioinhibins)、 TNP-470、硫酸戊聚糖盐(pentosan polysulfate)、血小板因子4、血管 抑制素(angiostatin)、LM-609、SU-101、CM-101、Techgalan、沙立度 胺(thalidomide)、SP-PG、和类似物。其它的化疗药物包括烷化剂， 例如，氮芥，包括mechloethamine、melphan、苯丁酸氮芥、环磷酰胺 和异环磷酰胺；亚硝脲，包括卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、和链 脲霉素；烷基磺酸盐，包括白消安(busulfan)；三嗪类，包括达卡巴 嗪；ethyenimines，包括硫替派(thiotepa)和六甲蜜胺；叶酸类似物， 包括甲氨喋呤；嘧啶类似物包括5-氟尿嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷；嘌 呤类似物，包括6-巯基嘌呤和6-硫代鸟嘌呤；抗肿瘤抗生素，包括放 线菌素D；蒽环类，包括多柔比星、博来霉素、丝裂霉素C、和 methramycin；激素和激素拮抗剂，包括他莫西芬(tamoxifen)和皮质 醇(cortiosteroids)；混杂药物，包括顺铂和布喹那(brequinar)。小RNA 病毒可以与博来霉素、长春地辛、长春新碱、dactamycin、丙卡巴肼、 洛莫司汀或达卡巴嗪中的一种或多种结合给药，以治疗，例如，黑色 素瘤。小RNA病毒可以与顺铂和卡铂中的一种或多种结合给药，以治 疗，例如，卵巢癌。其它可以与小RNA病毒结合使用以治疗，例如乳 腺癌的化疗药物的例子包括环磷酰胺(Cytoxan)、甲氨喋呤 (Amethopterin、Mexate、Folex)、和氟尿嘧啶(Fluorouracil、5-FU、 Adrucil)[缩写为CMF]；环磷酰胺、多柔比星(Adriamycin)、和氟尿 嘧啶[缩写为CAF]；多柔比星(Adriamycin)和环磷酰胺[缩写为AC]； 多柔比星(Adriamycin)和环磷酰胺及紫杉醇(Taxol)；多柔比星 (Adriamycin)，然后是CMF；环磷酰胺、表柔比星(Ellence)、和氟 尿嘧啶。用于治疗例如女性乳腺癌的其它化疗药物包括，例如，多烯 紫杉醇(Taxotere)、长春瑞宾(Navelbine)、吉西他汀(Gemzar)、和 卡培他汀(Xeloda)。
应当认识到，小RNA病毒与一种或多种其它药物(如一种或多种 其它的小RNA病毒、一种或多种能够调节或刺激免疫反应的药物、或 一种或多种抗肿瘤药物)的“结合”使用给药，是指以小RNA病毒和 其它药物具有治疗作用(如重叠暂时作用)的方式使用或给药。可以 将结合的成员同时给药，或者以任何次序单独给药，以达到所需的治 疗作用。当考虑结合治疗时，小RNA病毒和其它药物可以是物理混合 物的形式，或者单独提供，例如，以带有或不带有使用说明书的试剂 盒的形式。根据本发明的试剂盒还可以包括其它实施本发明的方法所 需的成分，如缓冲液和/或稀释液。典型地，试剂盒包括容纳多种组件 的容器或和使用本发明方法中试剂盒成分的说明书。
应当认识到，本发明的药物组合物包括小RNA病毒与一种或多种 其它治疗药物物理混合的组合物，以及仅包括小RNA病毒作为治疗活 性药物的组合物。
还应当认识到，在本发明的方法中，小RNA病毒可以与其它的肿 瘤治疗方法结合使用，例如肿瘤的外科减积或切除和/或化疗和/或放 疗。例如，需要治疗实体肿瘤时，小RNA病毒可以作为肿瘤外科减积 或切除的辅助用药使用。
如本文所用，无论是天然病毒还是人类刻意或非刻意修饰的病毒， “分离的”病毒是指已经除去和其一起被发现的某些或所有的成分， 或者从和其一起被发现的某些或所有成分中除去。这些成分是指污染 的成分。应当认识到，“分离的”病毒并不需要是病毒的纯制剂，纯制 剂的含义是所有污染成分已经被除去。因此，当非病毒成分已经部分 或全部地从病毒中除去时，病毒将被视为是“分离的”。例如，当超过 大约50％的污染物质被除去时，病毒将被视为是“分离的”。优选超过 60％的污染物质被除去，更优选超过70％的污染物质被除去。典型地， 分离的病毒超过大约80％或超过大约90％的污染物质被除去。更典型 地，超过大约95％、或大约97％污染物质被除去。在一个实施方式中， 超过99％的污染物质被除去。
如本文所用，用于细胞时，“在基本上不存在ICAM-1的情况下” 是指细胞表达很少的ICAM-1，或不表达ICAM-1。特别地，应当理解 到，这种细胞表达的ICAM-1不足以为细胞被病毒溶解性感染提供基 础，所述病毒的感染要求存在有ICAM-1。
如本文所用，使细胞与病毒“接触”是指将病毒置于细胞培养液 中，使病毒有机会与细胞接触，这可以导致病毒成功地细胞或通过凋 亡诱导细胞死亡。
如本文所用，“病毒感染”是指病毒侵入细胞，随后病毒在细胞中 复制或通过凋亡诱导细胞死亡。
如本文所用，“感染复数”是指当病毒与细胞接触时，病毒数目与 细胞数目的比例。
如本文所用，“细胞溶解”是指细胞的细胞膜破坏，随后释放出细 胞的所有或部分内容物，或者通过凋亡诱导细胞死亡。
如本文所用，“完全溶解”是指多细胞培养物中的每个细胞的溶解。
如本文所用，“培养条件”是指培养细胞所用的条件，包括单不限 于温度、培养容器的种类、湿度、CO2或任何培养容器中使用的其它气 体的浓度、培养基的种类、培养细胞的初始密度、以及细胞是否被病 毒感染、初始的感染复数。
如本文所用，“细胞关联”的病毒是指吸附于其中已经生成病毒的 细胞的一部分中或包绕在其中的病毒。因此，宿主细胞溶解前病毒是 细胞关联的。当细胞开始溶解时，病毒可以仍然吸附于破裂细胞的一 部分或包绕在其中，保持与细胞关联。但是，当病毒被释放至培养基 中时，便不再与细胞关联。
如本文所用，当细胞膜破裂，并且从细胞中释放出至少一些细胞 内容物时，细胞被“破坏”。例如，可以通过冷冻-复温、超声或去污剂 处理来破坏细胞。
如本文所用，“收取”病毒是指从之前已经被病毒感染的细胞培养 物中收集生成的病毒的行为。如果病毒仍然与细胞关联，回收病毒可 以涉及破坏宿主细胞。可选择但并非优选地，可以从培养基中收取已 经释放至培养基中的病毒粒子。
如本文所用，细胞变得肿胀、外观呈颗粒状、细胞膜破坏表示“细 胞病变作用”。显示细胞病变作用的细胞在活细胞计数染色时为阴性， 因为它们摄取了染色染料，或者细胞DNA发生降解。
如本文所用，“粘附细胞”是在细胞培养中粘附于培养容器的细胞。 粘附细胞的例子包括单层细胞，其为在培养容器表面上形成细胞单层 的细胞。“悬浮细胞”或“悬浮的细胞”是指在细胞培养中不粘附于培 养容器的细胞。悬浮细胞可以“旋转培养”的方式生长，这是一种在 培养过程中对培养基进行连续搅拌的培养方法。
如本文所用，“细胞的生存力”或“活细胞百分比”是指在种群中 未显示细胞病变作用的细胞的百分比。
如本文所用，“收取时间”是指收集和纯化小RNA病毒的时间点。 优选地，当效价足够高、病毒仍然与细胞关联的时候收取病毒。尽管 即使在细胞完全溶解后也可以收取病毒，仍需在病毒从细胞释放之前 收取病毒，以简化纯化过程。因此，对细胞生存力进行定期测量，以 作为病毒是否仍与细胞关联的指征。通常，当至少5％的细胞存活时收 取病毒。优选地，当20-95％的细胞存活、更优选为35-90％的细胞存活、 最优选为50-80％的细胞存活时收取病毒。
为更清晰地理解本发明，参考下列实施例和附图对优选方式进行 描述，其不应当理解成对本发明的范围进行限定。
材料和方法
细胞和病毒
柯萨奇病毒A21(CVA21)原型病毒株Kuykendall和三个临床分 离株(#272101、#272598和#275238)从Dr Margery Kennett， Entero-respiratory Laboratory，Fairfield Hospital，Melbourne，Victoria， Australia处获得。分离株#272101从一名26岁的男性HIV感染者中获 得，分离株#275238从一名死于婴儿猝死综合症的3个月婴儿中获得， 分离株#272598从一名患有急性哮吼的8岁男孩中分离。临床CVA21 分离株在Hela细胞和/或人肺成纤维细胞或HeLa-T细胞中大约传代三 次，在表达ICAM-1的横纹肌肉瘤(RD)细胞(RD-ICAM-1)中传代 一次(Shafren，D.R.，D.J.Dorahy，R.A.Ingham，G.F.Burns和R.D. Barry.1997.Coxsackievirus A21 binds to decay-accelerating factor but requires intercellular adhesion molecule1for cell entry(柯萨奇病毒A21 与衰变加速因子结合但需要细胞间粘附分子1以侵入细胞).J.Virol.71： 4736-4743)。CVA21的原型病毒株在HeLa和/或人肺成纤维细胞或 HeLa-T细胞中大约传代10次，在RD-ICAM-1细胞中传代3-4次。
CVA21原型病毒株(Kuykendall，GenBank编号AF465515)从 Dr Margery Kennett处获得，在SkMel28(在此指定为CVA21亲代)细 胞中进行双噬斑纯化。对CVA21-DAFv进行生物选择，通过如本文所 述在RD细胞中进行连续传代在ICAM-1阴性细胞中生长。体内研究用 的病毒在SkMel28(CVA21亲代)或RD细胞(CVA21-DAFv)的单层 中制备，并如上文所述，通过以5-30％的蔗糖梯度进行速度离心来纯 化，将峰值馏分汇集在一起，使用PBS透析，并储存在-80℃下。使用 Reed和Muench终点法，在SkMel28细胞上测定病毒母液(CVA21亲 代和CVA21-DAFv)的效价。
HeLa细胞从American Type Culture Collection(美国典型培养物收 藏中心)Manassas，VA，USA获得；同时，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞 从Dr Bruce Loveland，Austin Research Institute，Heidelberg，Victoria， Australia处获得。
人黑色素瘤细胞系SkMel28从Dr.S.J.Ralph(Department of Biochemistry and Molecular Biology，Monash University，Victoria， Australia)获得；横纹肌肉瘤(RD)细胞从Dr Margery Kennett (Entero-respiratory Laboratory，Fairfield Hospital，Melbourne，Victoria， Australia)处获得；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞从Dr Bruce Loveland (Austin Research Institute，Heidelberg，Victoria，Australia)处获得；卵巢 癌细胞系DOV13从Dr lan Campbell(Peter MacCallum Cancer Centre， Melbourne，Australia)处获得。CHO细胞稳定地表达ICAM-1或DAF (CHO-DAF和CHO-ICAM-1细胞)。CVA21原型病毒株(Kuykendall， GenBank编号AF465515)从Dr Margery Kennett处获得，并在SkMel28 细胞中繁殖。
人乳腺癌细胞系(MDA-MB157、MDA-MB453、ZR-75-1)、上皮 卵巢癌细胞系(OVHS-1、OAW-42、DOV13)和无限增殖化的正常人 卵巢表面上皮细胞系(HOSE)从Peter MacCallum Cancer Centre (Melboume，Australia)获得；人前列腺细胞系(PC3和DU145)从 Garvan Institute，Sydney，Australia处获得，LNCaP细胞从Elizabeth Williams，Bernard O′Brien Institute of Microsurgery，Melbourne，Australia 处获得；人结直肠癌细胞系(HCT116、SW620)从Peter MacCallum Cancer Centre获得，HT-29从John Hunter Hospital(Newcastle，Australia) 获得。
抗体
对ICAM-1的第一个结构功能区有特异性的抗-ICAM-1MAb WEHI(Berendt，A.R.，A.McDowell，A.G.Craig，P.A.Bates，M.J.E. Sternberg，K.Marsh，C.1.Newbold，和N.Hogg.1992.The binding site on ICAM-1 for Plasmodium faiparum-infected erythrocytes overlaps，but is distinct from the LFA-1 binding site(恶性疟原虫感染的红细胞的 ICAM-1结合位点覆盖LFA-1结合位点，但与其不同).Cell68：71-81) 由Dr Andrew Boyd，Queensland Institute of Medical Research， Queensland，Australia提供。抗-DAF MAb IA10(IgG2a)识别DAF的 第一个短共有重复片断(SCR)，VIIIA7(IgG1)识别第三个SCR和第 二个SCR的一部分(Kinoshita，T.，M.E.Medof，R.Silber和V. Nussenzweig.1985.Distribution of decay accelerating factor in the peripheral blood of normal individuals and patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria(正常个体和阵发性夜间血红蛋白尿患者外周 血中衰变加速因子的分布).J.Exp.Med.162：75-92)，IH4(IgG1)识 别DAF的第三个SCR(Coyne，K.E.，E.S.Hall，M.A.Thompson，M.A. Arce，T.Kinoshoita，T.Fujita，D.J.Anstee，W.Rosse，和D.M.Lublin. 1992.Mapping of epitopes，glycosylation sites，and complement regulatory domains in human decay accelerating factor(人衰变加速因子表位、糖基 化位点、和补体调解功能结构区的分析).J.Immunol.149：2906-2913)， 而IIH6(IgG1)识别第四个SCR(Kinoshita，T.，M.E.Medof，R.Silber 和V.Nussenzweig.1985.Distribution of decay accelerating factor in the peripheral blood of normal individuals and patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria(正常个体和阵发性夜间血红蛋白尿患者外周 血中衰变加速因子的分布).J.Exp.Med.162：75-9)。MAbs IA10、 VIIIA7和IIH6由Dr Taroh Kinoshita，Department of Immunoregulation， Osaka University，Osaka，Japan馈赠。MAb IH4由Dr Bruce Loveland， Austin Research Institute，Heidelberg，Victoria，Australia馈赠。
对DAF的SCR3有特异性的抗-DAF mAb IH4(Coyne，K.E.，S.E. Hall，S.Thompson，M.A.Arce，T.Kinoshita，T.Fujita，D.J.Anstee，W. Rosse，和D.M.Lublin.1992.Mapping of epitopes，glycosylation sites， and complement regulatory domains in human decay accelerating factor (人衰变加速因子表位、糖基化位点、和补体调解功能结构区的基因 定位分析).J.Immunol.149：2906-2913)和人重组可溶性DAF(sDAF) 由Dr Bruce Loveland馈赠；指向SCR1的抗-DAF mAb IA10由Dr Taroh Kinoshita(Department of Immunoregulation，Osaka University，Osaka， Japan)馈赠；抗-ICAM-1WEHI mAb指向ICAM-1的N-端结构功能区
(Hoover-Litty，H.和J.M.Greve.1993.Formation of rhinovirus-soluble ICAM-1complexes and conformational changes in the virion(形成鼻病毒 可溶性ICAM-1复合体和病毒体中的构象变化).J Virol.67：390-397)， 由Dr Andrew Boyd(Queensland Institute for Medical Research， Queensland，Australia)提供。
病毒纯化和放射性同位素标记结合试验
将6孔组织培养板中的汇合成片的RD-ICAM-1细胞单层在37℃ 下用500μl合适的CVA21病毒株(1×105TCID50/ml)接种1h。用不 含蛋氨酸/半胱氨酸的DMEM(ICN Biochemicals，Aurora，Ohio，USA) 冲洗三次，除去未结合的病毒，然后加入不含蛋氨酸/半胱氨酸的 DMEM，将细胞单层继续培育2h，然后加入300μCi[35S]-蛋氨酸/半胱 氨酸Trans-Label(ICN Radiochemicals，Irvine，California，USA)。然后将 感染的单层在37℃下在5％CO2的环境中培育12h。在三次冷冻/复温 循环后，将病毒溶解物在5-30％的蔗糖梯度下进行纯化(Shafren，D.R.， R.C.Bates，M.V.Agrez，R.L.Herd，G.F.Burns和R.D.Barry.1995. Coxsackieviruses B1，B3andB5use decay accelerating factor as a receptor for cell attachment(柯萨奇病毒B1、B3和B5使用衰变加速分子作为 细胞吸附的受体).J.Virol.69：3873～3877)。从各试管的底部收集馏分， 并在1450Microbeta TRILUX(Wallac，Turku，Finland)上通过液体闪烁 计数进行监测，对放射性同位素标记病毒结合试验中使用的160S峰馏 分进行定位。
使用HeLa细胞的放射性同位素标记病毒结合试验在24孔组织培 养板中进行(Shafren等人，1995)。使用细胞悬液进行转染CHO细胞 的病毒结合试验。在存在300μl(大约1×105CPM)的[35S]-蛋氨酸标记 病毒的情况下，在室温下将大约1×106细胞在800μl含有1％牛血清白 蛋白(BSA)的DMEM中培育2小时。然后将细胞用溶解在200μl0.2 MNaOH-1％十二烷基硫酸钠(SDS)中的无血清DMEM冲洗四次，然 后通过液体闪烁计数测定[35S]-蛋氨酸标记病毒的结合量。当需要时， 在加入放射性同位素标记的病毒之前，将细胞与20μg/ml抗-DAF或抗 -ICAM-1MAb或磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)(Sigma Chemicals，Sydney，New South Wales，Australia)(每5×106细胞1.0U) (Davitz，M.A.，M.G.Low和V.Nussenzweig.1986.Release of decay-accelerating factor (DAF)from the cell membrane by phosphatidylinositol-specific phospholipase C(PI-PLC).Selective modification of a complement regulatory protein(通过磷脂酰肌醇特异性 磷脂酶C(PI-PLC)从细胞膜上释放衰变加速因子(DAF)。补体调控 蛋白的选择性修饰).J.Exp.Med.163：1150-1161)在37℃下预培育1 小时。
病毒感染性测定
在96孔组织培养板中，将汇合成片的RD和RD-ICAM-1细胞单 层用含有1％胎牛血清(FCS)的DMEM中的CVA21的10倍连续稀 释液(100μtl/孔，四份)接种，并在37℃、5％CO2的环境下培育48 小时。通过用100μl/孔结晶紫/甲醇溶液(0.1％结晶紫、20％甲醇、4.0％ 甲醛/PBS)对接种的单层染色24小时，对细胞生存力进行定量。在蒸 馏水中冲洗后，在multiscan酶联免疫吸收测定平板读数仪(Flow Laboratories，McLean，Virginia，USA)上在540nm处读取染色细胞单层 的相对吸光度。如果吸光度值小于对照无病毒孔的标准误差的3倍， 则该孔被记为阳性，使用Reed和Muench法计算50％终点效价(Reed， L.J.和H.A.Muench.1938.A simple method of estimating fifty per cent endpoints(一种估计50％终点的简单方法).Am.J.Hyg.27：493-497)。
需要用抗-受体MAb对细胞单层进行预处理时，将细胞在存在 MAb(1μg/ml)的情况下在37℃下培育1h。然后将细胞单层用合适病 毒的四份样品接种，在37℃、5％CO2的环境中培育48h，然后如上文 所述进行染色。
细胞转染
如上文所述，对CHO和RD细胞进行转染，以表达ICAM-1和/ 或DAF(Shafren，D.R.，D.J.Dorahy，S.J.Greive，G.F.Burns和R.D. Barry.1997.Mouse cells expressing human intercellular adhesion molecule-1 are susceptible to infection by coxsackievirus A21(表达人细胞 间粘附分子-1的小鼠细胞易于被柯萨奇病毒A21感染).J.Virol.71： 785-789)。简言之，将500μl等份细胞(5×106至1×107细胞/ml)重 新悬浮在电穿孔缓冲液(20mM HEPES、137mM NaCI、5mM KCl、 0.7mM Na2PO4、6mM葡萄糖，pH7.05)中，并与75μg编码DAF或 ICAM-1的pEF-BOS(Mizushima，S.和S.Nagata.1990.pEF-BOS，a powerful mammalian expression vector(一种强力的哺乳动物表达载体p EF-BOS，).Nucl.Acid.Res.18：5322)和5μg pcDNA.neo在电穿孔池 (Bio-Rad，Richmond，California，USA)中混合。用Bio-Rad基因脉冲 器在300V和250μF的条件下对细胞进行脉冲，然后接种在组织培养 瓶中，在37℃下培育48h，直至形成汇合连片的单层。表达受体的转 染细胞在含有G-418(400μg/ml)的DMEM中进行选择，并使用合适 的抗-受体MAb通过荧光活化细胞分选进行进一步富集。
流式细胞术
通过流式细胞仪对转染细胞上的DAF和ICAM-1表面表达进行分 析。简言之，将分散的细胞(1×106)与适当的MAbs(PBS中5μg/ml) 在冰上培育20分钟。然后将细胞用PBS冲洗，在1000xg下沉淀5 分钟，重新悬浮在100μl稀释在PBS中的缀合有R-藻红蛋白的羊抗鼠 免疫球蛋白F(ab′)2片段(DAKO A/S，Denmark)中，在冰上培育20分 钟。将细胞如上文所述进行冲洗和沉淀，重新悬浮在PBS中，用FACStar 分析仪(Becton Dickenson，Sydney，Australia)进行DAF和ICAM-1表 达的分析。
将分散的细胞(1×106)与抗-DAF IH4或抗-ICAM-1mAbs(5μg/ml， 稀释在磷酸盐缓冲盐水[PBS]中)在冰上培育20分钟。然后将细胞用 PBS冲洗，在1000xg下沉淀5分钟，并重新悬浮在100μl PBS中以 1∶100稀释的缀合有R-藻红蛋白的羊抗鼠免疫球蛋白F(ab′)2片段 (DAKO A/S，Denmark)中，在冰上培育20分钟。将细胞如上文所述 进行冲洗和沉淀，重新悬浮在PBS中，用FACStar分析仪(Becton Dickenson，Sydney，Australia)进行DAF和ICAM-1表达的分析。
病毒RNA序列分析
将CVA21分离株在RD-ICAM-1细胞的汇合单层中繁殖。将病毒 细胞溶解物通过低速离心预澄清，通过在4℃下在SW41Ti旋转器中 以40000rpm超速离心3h，沉淀上清液中的病毒体。病毒沉淀重新悬 浮在TE缓冲液(10mM Tris-HCI、1mM EDTA，pH7.5)中，使用 TRIZOL Ls试剂(Gibco BRL Life Technologies)从每株中分离RNA， 使用前述的长距离策略对基因组的P1区进行扩增(Lindberg，A.M.，C. Polack和S.Johansson.1997.Amplification and cloning of complete enterovirus genomes by long distance PCR(通过长距离PCR扩增和克隆 全部肠病毒基因组).J.Virol.Meth.65：191-199)。使用引物步移策略， 采用ABI Prism BigDyeTM terminator cycle sequencing ready reaction试剂 盒(PE Biosystems，Sweden)(Lindberg等人1997)根据各制造商的说 明书，从纯化的PCR扩增子测定CVA21P1区的核苷酸序列。使用 Clustal X程序生成核苷酸序列排比(Thompson，J.D.，D.G.Higgins和 T.J.Gobson.1994.Clustal_W-improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice(Clustal_W通过序列加权/位置特 异性缺口补偿和权矩阵选择提高渐进多序列排比的敏感性).Nucleic Acids Res.22：4673-4680)。
核苷酸编号
本研究中所述的CVA21临床分离株#272101/#275238和#272598 的P1区(外壳编码区)核苷酸序列已经提交Genbank，指定的编号分 别是AY319942、AY319943和AY319944。
病毒的分子特征和结构模拟
使用QlAamp病毒RNAmini试剂盒从CVA21亲代和CVA21-DAFv 病毒株中提取病毒RNA，使用CVA21特异性引物根据每个生产厂商的 说明书用一步RT-PCR(Qiagen一步RT-PCR试剂盒)对外壳编码区进 行扩增。使用ABI Prism BigDyeTM terminator cycle sequencing ready reaction试剂盒(PE Biosystems)，根据每个生产厂商的说明书，使用 纯化的PCR产物(QlAquick Gel提取试剂盒，QIAGEN GmbH)在循 环测序反应中测定核苷酸序列。
CVA21主要结构蛋白(VP1-3)的模型用Modeller程序在DEC-α 工作站上建立，其方式类似于脊髓灰质炎病毒受体结构的预测。CVA21 亲代序列与同源的肠病毒外壳蛋白进行排比，后者的分子结构此前已 经确定，并含有50％以上的序列同一性，包括脊髓灰质炎病毒1、EV1、 EV11、CVB3、CVA9和猪水泡病病毒(PDB代码分别为1AR7、1EV1、 1H8T、1COV、1D4M和1OOP)，通过FASTA生成排比。ICAM-1和 DAF相对CVA21-DAFv外壳的位置分别根据其配体与人鼻病毒3和 EV12的接触进行排比。
病毒感染性测定
将96孔板中的汇合细胞单层用100μl病毒的10-倍连续稀释液接 种，在37℃下培育72小时。为了对细胞生存率进行定量，在用结晶紫 /甲醇溶液进行固定之前，对通过显微镜对培养板进行观察。使用Reed 和Muench法计算50％终点效价(Reed，L.J和H.A.Muench.1938.A simple method of estimating fifty per cent endpoints(一种估计50％终点 的简单方法).Am.J.Hyg.27：493-497)。为了评价mAb对病毒介导的 细胞溶解的影响，在加入病毒之前，将细胞单层与50μl抗-DAF SCR3 IH4(5μg/ml)mAb在37℃下培育1小时，如上文所述对细胞溶解进 行定量。对于用抗-DAF SCR1mAb阻断的细胞溶解测定，在用病毒 (106TCID50)攻击前，将6孔板中的RD细胞单层用抗-DAF SCR1mAb (15μg/ml)进行预处理。在37℃下培育1小时后，未结合的病毒被除 去，将单层用Dulbecco′s Modified Eagle′s Media(DMEM)覆盖。通过 SkMel28细胞上的滴定研究病毒产量，评价抗-DAF SCR1 mAb的抑制 作用。
放射性同位素标记病毒结合试验
将亲代和CVA21-DAFv病毒株分别在SkMel28和RD细胞中用35S- 蛋氨酸进行放射性同位素标记，并在5-30％的蔗糖梯度下纯化。将分 散的细胞(1×106)与mAb(20g/ml稀释在含有1％牛血清白蛋白[BSA] 的DMEM中)在室温下预培育1小时，然后在含有2％胎牛血清(FCS) 的DMEM中与35S-标记的蔗糖纯化病毒(5×105cpm)在室温下培育 1小时。用DMEM-2％FCS冲洗三次后，在1450Microbeta TRILUX (Wallac，Turku，Finland)上通过液体闪烁计数测定35S-蛋氨酸标记病 毒的结合量。
结合DAF和ICAM-1的病毒体的沉淀
将纯化的放射性同位素标记的160S CVA21-DAFv病毒体(2.5× 106cpm)与CHO-DAF或CHO-ICAM-1细胞(2×107)在DMEM-1％BSA 中在4℃下培育2小时。用DMEM-2％FCS冲洗四次，除去未结合的 病毒体，在37℃下使结合细胞的病毒体洗脱2小时。离心除去细胞， 被洗脱的病毒体在5-30％蔗糖梯度上被分层，在SW41Ti旋转器中在4 ℃下以36,000rpm离心95分钟。从梯度底部收集馏分(～700μl)，通 过液体闪烁计数测定放射活性。
通过抗-DAF mAb洗脱结合细胞的病毒
将CHO-DAF细胞(3×106)与放射性同位素标记的病毒(4×105cpm) 在4℃下培育2小时。用冰冷的DMEM-2％FCS冲洗四次，除去未结 合的病毒体，将细胞重新悬浮在100μl DMEM-2％FCS中，并与不同 浓度(0-50μg/ml)的抗-DAF SCR1mAb(IA10)培育。在冰上mAb 竞争1小时后，细胞沉淀。收取上清液，监测被洗脱病毒的水平，结 果表示成放射性同位素标记病毒被洗脱的细胞的百分比。
用可溶性DAF中和病毒
将人重组sDAF(85μg/ml，稀释在PBS中)与1,000 50％组织培 养物感染剂量(TCID50)的CVA21-DAFv培育。在37℃下培育1小时 后，将病毒-DAF混合物提供给96孔板中的RD细胞单层，继续培育 48小时。
前列腺肿瘤异种移植物的CVA21-DAFv治疗
根据University ofNewcastle Animal Care and Ethics Committee(纽 卡斯尔大学动物中心和伦理委员会)批准的方案，将SCID小鼠在无病 原体的条件下圈养。PC3细胞在体外生长，收取，用PBS冲洗两次， 并悬浮在无菌PBS中。如台盼蓝染色法所评价，用于异种移植的细胞 的95％以上是存活的。在异种移植之前，将动物用3％的异荧烷 (isofiuorane)麻醉。通过在侧腹部皮下注射2×106PC3细胞，将肿瘤 细胞异种移植到被麻醉的7周龄SCID小鼠侧腹部。每天监测异种移植 物的生长，并用卡钳测量。使用球体公式计算肿瘤体积的估计值。一 旦发展成可触及的肿瘤(50-100mm3)，通过静脉注射将CVA21亲代、 CVA21-DAFv(3×107TCID50)或PBS给予PC3肿瘤，并监测42天。 通过病毒感染性测定监测血清中的病毒效价。
结果
I.肠病毒外壳相互作用
CVA21临床病毒株与DAF和ICAM-1结合
为了确定CVA21的临床分离株与DAF和ICAM-1的结合方式与 原型Kuykendall病毒株是相似还是不同，在放射性同位素标记病毒结 合实验中使用被稳定转染成表达DAF或ICAM-1的CHO细胞。对于 所有的CVA21分离株，在不存在DAF或ICAM-1的情况下没有观察 到与CHO细胞的显著结合(图1)。所有的CVA21病毒株与表达DAF 的CHO细胞结合(图1A)，该相互作用此前在原型CVA21 Kuykendall 病毒株中得到证明。如预计，所有的临床CVA21分离株还与CHO细 胞表面上表达的ICAM-1结合(图1B)。通过抗-ICAM-1结构功能区1 特异性MAb完全消除病毒与ICAM-1结合的作用，证实了 CVA21/ICAM-1相互作用的特异性(图1B)。总之，这些结果证实， CVA21的临床分离株以类似于原型病毒株的方式与两种独立的细胞受 体DAF和ICAM-1结合。
为了进一步表征CVA21临床分离株与DAF/ICAM-1的相互作用， 在广泛共同表达DAF和ICAM-1的HeLa细胞上进行CVA21病毒结合 试验。通过独立受体的MAb阻断或结合的MAb阻断对CVA21的结合 进行评价(图2)。将原型Kuykendall病毒株(图2A)的细胞粘附与 CVA21临床分离株#272101(图2B)进行比较，在不存在MAb受体阻 断的情况下，二者均显示出很高的与HeLa细胞的结合水平(图2)。 DAF SCR1的特异性MAb阻断部分地阻断了病毒结合，但是，由于与 ICAM-1的相互作用，不能完全消除病毒的粘附。当与ICAM-1的接触 被MAb阻断抑制时，病毒结合降低，临床分离株#272101比原型病毒 株更明显(图2B)，但是由于病毒可选择与DAF粘附，从而并未被完 全抑制。抗-DAF SCR1和抗+ICAM-1结构功能区1MAb抑制病毒粘附 的能力可以达到与用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(其切割GPI-连接蛋 白)和抗-ICAM-1MAb结合对细胞进行预处理相同的程度，从而证明 了CVA21临床和原型病毒株对DAF和ICAM-1 N-端功能结构区的特 异性。综合在一起，这些结果证实，临床分离株#272101与原型病毒株 类似，与DAF的第一个SCR和ICAM-1的N-端结构功能区结合。 CVA21与DAF和ICAM-1的结合不是累加性的
对CVA21临床分离株与DAF或ICAM-1单独结合或一起结合进 行评价，以确定宿主细胞表面上两种受体的存在是否会促成累加性病 毒体细胞粘附。为解决这一问题，将CHO细胞转染成单独表达DAF 或ICAM-1、或二者均表达。流式细胞仪分析显示，在单独表达受体或 一起表达受体的细胞上DAF或ICAM-1表达水平是可比的(图3A)。 对于所有的CVA21病毒株，均观察到与CHO细胞本底结合的最低水 平。所有的CVA21病毒株均表现出与单独表达的DAF或ICAM-1有 显著的结合水平(图3B)。出人意料地，与这些受体单独表达时的结 合量相比，与共同表达DAF和ICAM-1的CHO细胞结合的放射性同 位素标记病毒的量显著降低(图3B)。
CVA21的临床分离株可以通过与DAF的相互作用诱导ICAM-1阴性 细胞的溶解性感染
ICAM-1是CVA21原型病毒株成功侵入宿主细胞的主要决定子。 但是，在存在MAb交联DAF的情况下，CVA21介导的缺少ICAM-1 表达的细胞溶解性感染是可能的。我们考察了CVA21临床分离株是否 能够通过分立的与交联DAF的相互作用而溶解性地感染ICAM-1阴性 的细胞。在用单一导入复数(single input multiplicity)的CVA21攻击 之前，RD细胞单层不经处理，或者用导向单个SCR 1、2、3、或4的 特异性MAb或者抗-DAF SCR1和SCR3的组合进行预处理。  在用导 向DAF SCR2、3和4的MAb预处理过的RD细胞培养中观察CVA21- 介导的溶解性感染(图4)。通过向用抗SCR3 DAF MAb预处理过的细 胞中加入抗-SCR1 DAF MAb完全阻断细胞溶解这一发现，证实了特异 性CVA21外壳/DAF相互作用确实介导着溶解性细胞感染。
有趣的是，两种CVA21临床分离株#275238和#272598能够在不 存在抗-DAF MAb交联的情况下溶解性地感染ICAM-1阴性的RD细胞 (图4)。通常，肠病毒与DAF结合被认为是病毒体因与其它内化受体 的相互作用而螯合，因此目前没有阐明仅经由与DAF的相互作用介导 的细胞溶解性感染的结论性报道。在不存在DAF和ICAM-1二者抗体 交联的情况下，CVA21临床分离株#275238和#2727598溶解性地感染 细胞的能力是该受体用途的首次发现。用抗DAF SCR1 MAb阻断后， 细胞溶解被完全抑制(图4)，这些CVA21病毒株生成的子代病毒显著 减少，这进一步证实了该发现的完整性。
为了进一步分析这种新的DAF用途，在单独表达DAF(RD)或 共同表达ICAM-1(RD-ICAM-1)的单层细胞培养物上，对CVA21的 临床和原型病毒株的溶解感染性进行滴定。所有的CVA21病毒株在表 达DAF和ICAM-1二者的细胞中均表现出很高的细胞溶解活性水平， 同时，仅有分离株#275238和#2727598被观察到在仅表达DAF的RD 细胞中诱导的溶解效价与RD-ICAM-1细胞中所得到的是可比的。实际 上，分离株#275238在RD细胞中获得的溶解效价比在RD-ICAM-1细 胞中高大约20倍。有趣的是，在很高的病毒导入复数(viral input multiplicityes)下，分离株#272101对仅表达DAF的RD细胞另外显示 出水平显著的溶解性感染。原型病毒株在RD细胞中的活性水平最小 但可以检出，这可能是由于它是DAF利用表型增强的病毒体的最小群 体。
CVA21临床分离株ICAM-1结合足迹的分析
由于所有考察的CVA21病毒株均显示出很强的ICAM-1吸附/内化 表型(图1)，因此我们研究了它们是否具有保守的ICAM-1结合足迹。 构成CVA21-ICAM-1受体结合足迹的残基之前已经使用低温电子显微 镜用纯化的ICAM-1和原型Kuykendall病毒体进行了鉴定。所有CVA21 病毒株P1编码区的氨基酸序列分析表明存在有保守ICAM-1足迹，与 之前公开的足迹相同，除了VP2168处的保守编码变化，Ala改变为 Val(图5)。
为了解释CVA21临床分离株相对于原型病毒株在不存在ICAM-1 的情况下溶解性感染表达DAF的细胞的能力增强(图4)，我们搜索了 ICAM-1结合足迹之外的氨基酸差异(图5)。在P1区检测到三个CVA21 临床株和原型病毒株之间的大量氨基酸改变(图5)。在VP4编码区内 没有检测到任何CVA21病毒株之间的氨基酸改变。在VP3、VP2和 VP1外壳蛋白中，所有的临床分离株在相同位置检测到13个相对于原 型病毒株的相同改变。另外，分离株#272101在位点VP3 239显示出不 同的改变(Ser，相对的其它两个临床分离株为Ala)，并且与原型病毒 株相比进一步具有9个独立的分散在VP1、VP2、VP3中的氨基酸改变 (图5)。分离株#272598和#272238在氨基酸水平上是相同的，而在核 苷酸水平上检测到二者之间有许多沉默突变。
II.柯萨奇病毒A21变异体的生物选择和分子特征
不依赖ICAM-1作用而溶解性地感染细胞的CVA21变异体的生物选择
CVA21原型病毒株的细胞吸附是通过与DAF和/或ICAM-1的结 合介导的。仅有ICAM-1相互作用加速细胞内化，CVA21和DAF之间 的相互作用并不能诱导生产性的溶解性细胞感染，除非DAF被抗-DAF mAb交联。当细胞用ICAM-1转染时，CVA21也可以溶解性地感染表 达DAF的RD细胞，这表明CVA21不能在RD细胞中复制仅仅是在细 胞侵入层面上。人黑色素瘤细胞系SkMel28支持CVA21原型病毒株生 长至很高的病毒效价，流式细胞分析显示ICAM-1和DAF(几何平均 荧光强度[GMF]43.2)表面表达的水平都很高(图6A)。
通过重复传代(4代)，使SkMel28细胞(在此指定为CVA21亲 代)中双噬斑纯化的CVA21原型病毒株制剂适于产生RD细胞的快速 溶解性感染。流式细胞分析表明，RD细胞表达的DAF水平(GMF64.0) 较SkMel28细胞高，但不表达表面ICAM-1(图6A)。亲代CVA21在 RD细胞中连续传代，从亲代群体中生物选择出能够在不存在ICAM-1 的情况下导致快速溶解性感染的CVA21变异体(称为CVA21-DAFv)。 双重表达ICAM-1和DAF的SkMel28细胞支持亲代和CVA21-DAFv 发生效价超过107TCID50/ml的溶解性感染，同时仅有CVA21-DAFv在 RD细胞中诱导相当的溶解效价(图6B)。
CVA21-DAFv的表型特性
对ICAM-1阴性RD细胞进行适应之后，CVA21-DAFv在SkMel28 和RD细胞单层(5×107PFU/ml)上产生效率相似的噬斑。尽管病毒导 入复数很高(SkMel28细胞上1×108PFU/ml)，RD细胞上并没有观察 到亲代病毒株的噬斑。在不同的细胞底物上，CVA21-DAFv诱导的噬 斑有轻微的表型差异；在RD细胞上，在感染后2天内观察到混浊噬 斑，而在SkMel28细胞上仅观察到高清晰度的小噬斑(图6C)。 CVA21-DAFv在SkMel28细胞中连续回复传代10次，未能选择出 CVA21-DAFv仍能够在低感染复数(1TCID50/96孔，数据未显示)下 溶解性地感染RD细胞的亲代表型回复体。因此，CVA21-DAFv的DAF 利用增强似乎是一种稳定和合意的表型。更有趣的是以下发现：与亲 代病毒株(102TCID50)相比，CVA21-DAFv(102TCID50)需要集中更 高水平的免疫球蛋白以被中和(1∶63与1∶178)，这表示CVA21-DAFv 的血清特异性在RD细胞中生物选择的过程中发生了部分改变。 CVA21-DAFv与DAF和ICAM-1的N-端结构功能区结合
CVA21原型病毒株与ICAM-1和DAF二者的N-端结构功能区均 能结合。为了考察CVA21-DAFv是否以类似于原型病毒株的方式与 ICAM-1和/或DAF直接结合，使用稳定表达ICAM-1或DAF的CHO 细胞、RD细胞和卵巢癌细胞系DOV13进行放射性同位素标记结合实 验。流式细胞研究显示，在分别转染的CHO细胞系上DAF或ICAM-1 的表面表达水平很高(CHO-DAF细胞上DAF表达的GMF为296.2)， 而RD和DOV13细胞表面上仅表达DAF(RD和DOV13细胞上DAF 表达的GMF分别为64.0和84.0)(图6A和图7A)。CVA21亲代病毒 株与ICAM-1和DAF二者均结合(图7B和7C)。CVA21-DAFv与 CHO-DAF和CHO-ICAM-1细胞结合的水平均很显著，而CHO细胞则 仅仅观察到本底结合(图7B和7C)。通过病毒吸附的特异性抗-DAF 和抗-ICAM-1mAb阻断，证实了病毒与转染CHO细胞上表面表达的 ICAM-1和DAF相互作用的特异性。由于抗-ICAM-1(WEHI)和抗-DAF SCR1(IA10)mAb阻断将病毒的结合降低至本底水平，而抗-DAF SCR3(IH4)mAb阻断不影响CVA21制剂与转染CHO细胞的病毒结 合(图7B和7C)，因而得出结论：与亲代病毒株类似，CVA21-DAFv 可以与ICAM-1和DAF的N-端结构功能区结合。
抗体交联DAF不增强CVA21-DAFv的细胞感染性
为了考察CVA21亲代和CVA21-DAFv病毒株之间在DAF结合/ 利用方面，如果有的话，是否存在轻微的差异，采用放射性同位素标 记病毒结合试验评价在存在和不存在表面DAF交联的情况下与RD和 DOV13细胞吸附的相对水平。亲代CVA21和CVA21-DAFv二者均与 高水平表达表面DAF的CHO细胞结合(图7)，而CVA21原型病毒株 与表达DAF的ICAM-1阴性RD细胞的结合则很差。这最有可能是因 为在本研究中使用的CHO-DAF细胞上表面表达DAF的水平高于RD 和DOV13细胞(图6A和图7A)。生物选择的CVA21-DAFv显示出与 RD和DOV13细胞的吸附水平均很显著，而亲代病毒株则几乎观察不 到或观察不到与这些细胞的吸附(图7C)。与CHO-DAF细胞类似，通 过用抗-SCR1mAb进行预处理，CVA21-DAFv与RD和DOV13细胞的 特异性结合被降低至本底水平(图7C)。
表面表达的DAF与导向DAF非病毒结合SCR3功能结构区的mAb 交联增加了原型CVA21与RD细胞的结合，使该细胞更容易被溶解性 感染。接下来，我们考察了CHO-DAF和DOV13细胞表面上的DAF 的交联是否如RD细胞所观察的那样，导致病毒结合的增加。抗-SCR3 预处理使RD细胞上的亲代CVA21病毒结合增加了8倍，在DOV13 细胞上则增加4倍(图7C)。对于CVA21-DAFv，抗-DAF SCR3预处 理对增强与RD或DOV13细胞的结合作用极小或没有作用。实际上， 观察到CVA21-DAFv与DOV13细胞的结合有轻微的下降(图7C)。 在不存在mAb交联DAF的情况下CVA21-DAFv与RD和DOV13细 胞以显著水平结合的能力表明，与亲代病毒株相比，CVA21-DAFv的 DAF结合表型增强。两种病毒与CHO-DAF细胞的病毒吸附均不受抗 -DAF SCR3mAb预处理的影响(图7C)。稳定转染的CHO-DAF细胞 上DAF表面表达的水平显著高于瞬时表达DAF的CHO细胞，为抗 -DAF SCR3mAb预处理为什么不能增加亲代CVA21的病毒吸附给出 了一种可能的解释。
为了确定抗-DAF SCR3mAb预处理对RD和DOV13细胞对溶解 性感染的易感性是受CVA21亲代还是CVA21-DAFv的影响，病毒攻击 之前，将RD和DOV13细胞的汇合单层与抗-DAF SCR3mAb预培育。 在评价单层的溶解性感染之前，在37℃下使病毒感染进行3天。在不 存在抗-DAF SCR3mAb交联的情况下，即使病毒导入复数很高(106 TCID50/孔)，RD和DOV13细胞对CVA21亲代病毒株的感染均有抵抗 力。与此相反，通过用抗DAF SCR3mAb进行预处理，RD和DOV13 细胞均对亲代CVA21的溶解性感染易感(图7D)。CVA21-DAFv在 ICAM-1阴性RD和DOV13细胞中均诱导溶解性病毒效价(＞105.5 TCID50/ml)。出人意料地，与不存在mAb时观察到的效价相比，抗-DAF SCR3mAb预处理将RD和DOV13细胞中的CVA21-DAFv的溶解效价 减少～100倍(图7D)。用抗-DAF SCR3mAb预处理未增强 CVA21-DAFv与DAF表达细胞的结合(图7C)，对于DOV13，则引 起吸附减少。这些发现表明，DAF SCR3的mAb阻断干扰了DAF SCR1 结合CAV21-DAFv的细胞侵入机制(图7)。 ICAM-1而不是DAF的相互作用诱导CVA21-DAFv的外壳构象变化
针对CVA21-DAFv与DAF结合和溶解性感染ICAM-1阴性细胞的 能力增强的本底(图6和图7)，我们比较了亲代CVA21病毒株和 CVA21-DAFv的DAF相对结合严格性。将放射性同位素标记的病毒体 在4℃下与CHO-DAF细胞结合2小时，然后除去未结合的病毒体，将 与细胞结合的病毒体用浓度渐增的抗-DAF SCR1mAb从细胞中洗脱。 与CVA21亲代病毒体相比，从CHO-DAF细胞表面将CVA21-DAFv 病毒体移位需要大约10倍以上浓度的抗-DAF SCR1mAb(图8A)。这 一发现表明，与CVA亲代相比，CVA21-DAFv与DAF在更易接近的 外壳位点上结合，或者与DAF结合的亲合性更高。
假定DAF起到肠病毒螯合受体的作用，通常，DAF-肠病毒相互作 用不能诱导形成可检测的外壳构象改变。为了考察CVA21-DAFv A-颗 粒的形成是否是由与表面表达的DAF或ICAM-1的相互作用诱导的， 将纯化的160S病毒体与CHO-DAF或CHO-ICAM-1细胞在4℃下培育 2小时。除去未结合的病毒体之后，与细胞结合的病毒体在37℃下洗 脱2小时，然后在5-30％的蔗糖梯度上进行速度离心。从ICAM-1洗脱 的CVA21-DAFv病毒体表现出沉降系数减少，表明A颗粒的形成，感 染性保留极少或未保留感染性，这与CVA21原型病毒株观察到的情况 类似。尽管CVA21-DAFv的DAF相互作用增强，但是从DAF洗脱的 CVA21-DAFv病毒体没有任何可检测的构象变化(图8B)，病毒体保 留着高水平感染性。
DAF阻断抑制RD细胞中CVA21-DAFv的溶解性感染
溶解性细胞感染和竞争性结合实验表明，与亲代CVA21病毒株相 比，表面表达的DAF和CVA21-DAFv之间的相互作用增强(图7和图 8)。由于这种观察到的增强的相互作用，我们考察了与亲代病毒株相 比，抗-DAF SCR1mAb是否能阻断CVA21-DAFv对RD细胞的溶解性 感染。即使导入复数高达106TCID50/孔，抗-DAF SCR1mAb也能保护 RD细胞完全免受CVA21-DAFv诱导的溶解性感染(图9A)。而且， 将RD细胞用抗-DAF SCR1mAb预处理显著地抑制子代病毒的产生。
为了进一步证实CVA21-DAFv的细胞感染性需要直接与表面DAF 相互作用，对人重组sDAF(Dr.Bruce Loveland，未公开的交流)抑制 RD细胞感染的能力进行评价。可溶性DAF与CVA21-DAFv的相互作 用显著地抑制了细胞的溶解性感染，但是对于降低非DAF结合的 CVA20的感染则没有可检测的降低作用。尽管CVA20也与ICAM-1结 合，它需要一种未得到确认的受体来侵入细胞(图9B)。总之，这些 发现证明，CVA21-DAFv溶解性感染被抗-DAF SCR1mAb和sDAF抑 制，证实了DAF相互作用在CVA21-DAFv侵入中的重要性。 使CVA21-DAFv具有DAF表型的分子决定子
为了进一步研究扩展的细胞向性和CVA21-DAFv的DAF利用增强 显型，对CVA亲代病毒株和CVA21-DAFv的外壳编码区核苷酸序列进 行测定。将外壳蛋白序列与CVA21Kuykendall原型病毒株相比，后者 与DAF和ICAM-1的相互作用已经被充分阐明。对双噬斑纯化的亲代 病毒株外壳编码区的序列分析表明，与CVA21原型序列(GenBank AF465515)相比，在VP2(S164L)处有一个编码置换。与原型病毒 株相比，CVA亲代病毒株的DAF和ICAM-1结合特性(图7)并没有 被这一VP2氨基酸置换所改变。在RD细胞中进行生物选择后，VP2 L164残基保留在CVA21-DAFv中，而VP3中检测到两处其它的氨基 酸置换(R96H和E101A)，VP2中有一处沉默突变(V209)。由于VP2 L164氨基酸置换在亲代病毒株和CVA21-DAFv中均存在，它不可能参 与增强CVA21-DAFv的DAF结合表型。CVA21-DAFv在核苷酸位点 2038(VP3 101)处表现出混合种群(C/A)，导致Ala/Glu，而该位点 仅有A(Glu)由亲代CVA21编码。
因为CVA21的分子结构尚未在原子分辨度下得到确定，在与之前 确定的相关小RNA病毒结构相似的基础上，我们模拟了亲代CVA21 的结构，以试图解释CVA亲代和CVA21-DAFv之间在DAF结合上的 差异。可能增强CVA21-DAFv DAF结合显型的突变(VP3 R96H和 E101A)预测被包埋在外壳蛋白VP1、VP2和VP3的界面处(图5和 图10)。VP3残基R96和E101被一侧的VP3C-端和顶部的VP1C-端 覆盖，仅有精氨酸(R96)的侧链氮原子可以与溶剂接触(图10A中 的蓝色球体)。假设CVA21-DAFv与DAF的吸附发生在外壳峡谷的外 部，如EV12中那样。尽管CVA21-DAFv的VP3H96和A101突变并 不是直接位于提出的EV12-DAF结合位点，它定位仍然可以使DAF结 合足迹具有增强的构象，或者容易接触，导致其与DAF的亲合力比亲 代病毒株提高(图8A)。
III.DAF和柯萨奇病毒A21介导的细胞感染
CVA21与DAF的N-端结构功能区结合
对DAF的独立短共有重复片断(SCR)的初步抗体阻断研究表明 CVA21与DAF SCR1结合。但是，对肠病毒DAF结合表位定位的分 析可能受与DAF结合的mAb的空间位阻的间接影响这一可能性是存 在的。为了解决这些问题，表面表达的嵌合DAF分子和DAF缺失构 建体被用来对EV70的DAF结合结构功能区至SCR1(Karnauchow，T. M.，S.Dawe，D.M.Lublin，K.Dimock 1998，Short consensus repeat domain 1 of decay-accelerating factor is required for enterovirus 70 binding(衰变加速因子的短共有重复结构功能区1是肠病毒70结合所 必需的).J.Virol.72：9380-9383)、CVB3SCR2-3(Bergelson，J.M.，J.G. Mohanty，R.L.Crowell，N.F.St.John，D.M.Lublin，R.W.Crowell 1995. Coxsackievirus B3 adapted to growth in RD cells binds to decay- accelerating factor(CD55)(适应在RD细胞中生长的柯萨奇病毒B3与 衰变加速因子(CD55)结合).J.Virol.69：1903-1906)和EV7至SCR3 (Powell，R.M.，T.Ward，D.J.Evans，J.W.Almond 1997.Interaction between echovirus 7 and its receptor，decay-accelerating factor(CD55)： evidence for a secondary cellular factor in A-particle formation(艾柯病毒 7及其受体衰变加速因子(CD55)之间的相互作用：A颗粒形成中第二 种细胞因子的证据).J.Virol.71：9306-9312)进行分析。在试图对 CVA21-DAF结合区定位进行证实的尝试中，我们采用了嵌合 DAF/CD46受体(图11A)，其中CD46膜辅因子蛋白(MCP[CD46]) 结构功能区被相应的结构功能区DAF替换，并评价了它们与放射性同 位素标记CVA21结合的能力。使用对单个DAF SCR和对CD46有特 异性的mAb通过流式细胞分析对嵌合和野生型受体的表面表达相对水 平进行评价(图11B)。抗-DAF SCR1(IA10)、SCR3(IH4)和SCR4 (IIH6)mAb仅与野生型DAF和分别携带DAF SCR1/2、SCR3或SCR4 的DAF/CD46嵌合受体结合。抗-DAF mAb中无一与野生型CD46结 合。识别CD46的SCR1的抗-CD46mAb(MCI20.6)仅与野生型CD46 或携带CD46的SCR1的DAF/CD46嵌合受体结合。放射性同位素标 记的CVA21与野生型DAF和DAF SCR1/CD46嵌合受体均有显著水 平的结合，但是与野生型CD46或其它嵌合构建体不结合(图11C)。 通过用抗-DAF SCR1mAb进行抗体阻断，CVA21与野生型DAF和嵌 合DAF SCR1/CD46分子二者的结合均被抑制。尽管本项研究没有获得 DAF SCR2/CD46嵌合受体，但是上述发现清楚地证明：类似于EV70， CVA21的外壳结合表位最可能位于DAF分子的第一个SCR上。
CVA21与DAF的结合和从其上洗脱
小RNA病毒细胞吸附和随后侵入细胞的特征是在初始吸附之后很 高水平的病毒颗粒可从其特异性细胞表面受体上洗脱，表明受体介导 的病毒洗脱在小RNA病毒感染的发病机理中具有重要地位。与许多小 RNA病毒类似，当CVA21从其天然内化受体(在本文的情况下为 ICAM-1)上脱落时，它的感染性显著降低，因此使其启动随后感染的 能力降至最低。但是，直接从表面表达的DAF上洗脱的CVA21颗粒 的相对动力学特征和感染性之前并未阐明。因此，我们的研究集中在 时间、温度和pH对CVA21从DAF上洗脱的影响，在此使用表达DAF 的CHO细胞作为CVA21结合底物进行放射性同位素标记病毒结合实 验。15分钟时CVA21从DAF上洗脱达到最高水平，在此之后洗脱没 有进一步的明显增加(图12A)。从DAF上洗脱的CVA21的量随着温 度从4℃逐渐升高至42℃而不断增加，其间洗脱时间保持恒定的30 分钟(图12B)。在这种环境中，在42℃下CVA21的洗脱达到最高水 平。并不出乎意料地，42℃下洗脱的病毒的感染性显著低于37℃下洗 脱的病毒。温度高于37℃对病毒体的完整性可能有负面影响，导致受 体结合减少，从而使感染能力降低。将洗脱环境的pH从pH5.5升高 至pH8.0，其间保持洗脱时间为30分钟、温度为37℃，导致CVA21 从DAF上洗脱的水平持续升高(图12C)。
从DAF上洗脱的CVA21保持感染性
由于结合细胞的病毒体发生特异性受体介导的外壳构象变化，大 部分洗脱的小RNA病毒体通常被认为无感染性。为了比较与表面表达 的DAF或ICAM-1结合和从其上洗脱对CVA21感染性的相对影响， 使用CHO-DAF和CHO-ICAM-1表达细胞作为CVA21结合底物，进行 放射性同位素标记病毒结合试验和细胞溶解试验。流式细胞分析显示， 在合适的转染CHO细胞表面上DAF和ICAM-1表达的水平很高。放 射性同位素标记的CVA21与转染细胞表面上的DAF和ICAM-1结合 以及从其上洗脱的水平相似(图13A)。与从ICAM-1上洗脱的病毒相 反，仅有从DAF上洗脱的CVA21表现出显著的感染性保留(＞105 TCID50/100CPM)(图13B)。为了确定从交联DAF上脱落之后CVA21 是否保留着高水平感染性，采用相似的试验方案，DAF通过用抗-DAF SCR3mAb(IH4)预处理进行交联。从用ICAM-1转染的RD细胞 (RD-ICAM-1)评价ICAM-1上的洗脱。在0℃下从两种受体上洗脱的 CVA21水平最低，而在37℃下，15％至20％的结合病毒从两种受体上 洗脱(图14A)。但是，如上文中观察到的(图13A)，从ICAM-1上 洗脱的CVA21感染性极低(＜1.0TCID50/100CPM)，而从交联DAF上 洗脱的CVA21则表现出显著的感染性(＞102.5TCID50/100CPM)(图 14B)。尽管RD-ICAM-1细胞表面上存在有低水平的DAF，病毒洗脱 物中不存在感染性CVA21表明：当两种受体在细胞表面上共同表达时， CVA21优先结合ICAM-1，其次才是DAF。
为了评价CVA21与表面DAF和ICAM-1结合的相对严格性，放 射性同位素标记的病毒体在0℃下与RD-ICAM-1细胞上的ICAM-1、 或者RD细胞表面上的mAb交联DAF结合。除去未结合的病毒体之 后，向适当的表达交联DAF或ICAM-1的细胞悬液中加入浓度渐增的 阻断mAb(抗-DAF SCR1或抗-ICAM-1结构功能区1)的CVA21受体。 向RD-ICAM-1细胞中加入抗-ICAM-1结构功能区1mAb对代替与 ICAM-1结合的CVA21影响极小或没有影响(图14C)。与此相反，用 浓度低至0.1μg/ml的抗-DAF SCR1mAb对交联DAF的RD细胞进行 处理促使释放出大约50％的与DAF结合的CVA21，当mAb浓度增加 至1.0μg/ml时，导致基本上所有与DAF结合的病毒被排出(图14C)。 CVA21可以与DAF结合，保留感染性，并在ICAM-1的延迟表达后 引发生产性感染
已经确定，从表面表达的DAF上洗脱的CVA21保留了很高的感 染性水平(图13和图14)，研究集中于DAF洗脱的病毒是否在天然 CVA21感染的发病机理中具有积极作用。需要解决的具体问题是：被 表面表达的DAF螯合的病毒是否可以通过采用细胞表面ICAM-1的延 迟诱导来引发生产性感染。通常人们认为，人体中内源性ICAM-1的 表面表达相对较低，要等待炎性细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)-α和白 细胞介素(IL)-1β的作用来诱导。为了模拟这种环境，在CVA21与表面 DAF结合后的0、6和24小时，将正常情况下对CVA21溶解性感染有 抵抗力的表达DAF的RD细胞(ICAM-1阴性)转导成表达ICAM-1 或CD36(使用重组腺病毒载体)。流式细胞分析表明，转导后的4小 时有水平显著的表面ICAM-1表达，大约在腺病毒接种后的16小时这 种表达的水平达到最高(图15A)。另外的流式细胞分析(图15B)和 蛋白质印迹检验证实，通过携带重组腺病毒的适当受体转导后24小时， RD细胞的ICAM-1和CD36二者的表达水平均很高，而所有细胞之间 的内源性DAF表达是相当的。进行病毒感染性实验，以比较病毒与内 源性DAF结合后的0、6或24小时在存在转导ICAM-1和CD36受体 表达的情况下繁殖的子代CVA21的水平。最初用CVA21接种后的0、 6或24小时，诱导成表达ICAM-1的RD细胞产生的病毒产量显著高 于(大约200-倍)诱导成表达伪受体(CD36)的细胞或未转导的RD 细胞(图15C)。DAF结合后的0、6、24小时，在转导成表达ICAM-1 的RD细胞中的多周期CVA21复制造成了细胞单层的完全溶解性破 坏，而在表达CD36的细胞或未转导细胞中没有观察到细胞溶解(图 15D)。
IV.柯萨奇病毒A21DAF变异体(CVA21-DAFv)体外溶解人乳腺、前 列腺、结肠和卵巢癌细胞
CVA21原型病毒株能够快速地靶向和溶解表达高水平CVA21细胞 受体、细胞间粘附分子(ICAM-1)和衰变加速因子(DAF)的恶性黑 色素瘤细胞。最近，我们已经发现，生物选择的CVA21-DAFv病毒株 表现出更强的受体特异性，并且能够快速地感染和溶解表达ICAM-1 或DAF或这二者结合的细胞。在本研究中，对一组12个不同组织来 源的人癌细胞系进行了病毒受体表达方面的研究；三个肿瘤细胞系来 自人乳腺癌(MDA-MB157、MDA-MB453、ZR-75-1)，三个卵巢癌细 胞系(DOV13、OAW-42、OVHS-1)，三种前列腺癌细胞(DU145、LNCaP、 PC3)和三种人结肠癌细胞(HCT116、HT-29、SW620)。如通过流式 细胞仪所测定，在3/3乳腺、1/3卵巢、2/3前列腺和3/3结肠癌细胞系 上检测到水平显著的ICAM-1，而发现所有12个细胞系均表达高水平 的DAF(图16)。
为了研究CVA21-DAFv是否显示出比CVA21亲代病毒株更广泛的 溶瘤能力，CVA21-DAFv被用来攻击一组乳腺、卵巢、前列腺和结肠 癌细胞。显微镜观察表明，所有12种用CVA21-DAFv攻击的体外培养 物均表现出圆形表型(细胞病变作用的特征)，最终导致细胞死亡。与 此相反，用亲代CVA21病毒株攻击的癌细胞系中仅有7/12观察到细胞 病变作用(图17)。对CVA21-DAFv的溶瘤作用进行定量，证明了 CVA21-DAFv对所有12个被测体外培养物均引起效价＞103TCID50/ml 的溶解性感染，而CVA21亲代病毒株仅在7/12个癌细胞系(2/3乳腺、 1/3卵巢、2/3前列腺和2/3结肠癌细胞)中引发显著的溶解性感染(＞104 TCID50/ml)(图18)。据观察，表面ICAM-1表达量可忽略不计的细胞 系(ZR-75-1、DOV13、OAW-42、LNCaP和HCT116)不能维持CVA21 亲代病毒株的复制，而这些细胞系很容易被CVA21-DAFv感染。由于 生物筛选的CVA21-DAFv病毒株进行溶解性感染仅需要存在有表面 DAF，而不是ICAM-1，因此显然该病毒株较亲代CVA21病毒株能更 有效地杀死范围更广泛的人癌细胞系。
V.CVA21-DAFv在体内溶解人前列腺肿瘤异种移植物
体内数据表明，CAV21-DAFv特异性且有效地靶向细胞表面上表 达ICAM-1和/或DAF的人癌细胞。为了考察体外观察到的对一组癌细 胞的溶瘤作用是否预示CVA21-DAFv可作为体内抗癌药物，我们评价 了CVA21-DAFv对前列腺肿瘤异种移植物的治疗作用。携带已形成的 PC3前列腺异种移植物(50-100mm3)的SCID小鼠接受单次静脉剂量 的CVA21-DAFv、CVA21亲代、或PBS，对肿瘤负荷进行为期42天的 评价(图19)。在用病毒给药后早期的11天，用CVA21-DAFv或CVA21 亲代治疗的小鼠均观察到肿瘤体积的显著减小。出于伦理学原因，由 于其肿瘤负荷达到University Animal Ethics committee(大学动物伦理 委员会)强制规定的上限，治疗后的14天对用PBS治疗的小鼠进行安 乐死。如溶解性病毒感染性检验所测定(数据未显示)，CVA21-DAFv 和CVA21亲代治疗的小鼠均观察到相似的血清病毒载量(大约105至 107TCID50/ml)。这些结果证明，CVA21-DAFv与CVA21亲代病毒株在 降低人前列腺异种移植物肿瘤负荷方面同样有效。
讨论
I.肠病毒外壳相互作用
CVA21原型病毒株的生产性细胞感染是由分立的与表面表达的 DAF和ICAM-1的独立作用介导的。在这种关系中，DAF的作用是将 CVA21螯合在细胞表面，以便随后与诱导外壳构象改变并侵入细胞的 ICAM-1相互作用。但是，体外多次细胞传代是否对这种受体利用模式 起积极作用的问题是倍受关注的主题。具体地，考虑到种系发生相关 的原型A型柯萨奇病毒A13、A15、A18和A20(其同样采用ICAM-1 作为细胞内化受体，与表面表达的DAF不结合)，DAF结合表型是一 个颇受猜测的领域。因此，进行了许多研究，以观察CVA21原型病毒 株Kuykendall的DAF结合表型在体外低代数CVA21临床分离株中是 否是保守的，或者仅仅是细胞培养物多次传代的人工产物。
在此所述的放射性同位素标记病毒结合实验表明，CVA21的三种 临床分离株显示出与原型CVA21病毒株(Kuykendall)相似的受体吸 附方式，其特征在于能够独立地与DAF或ICAM-1结合(图1)。MAb 对DAF或ICAM-1的阻断不能完全抑制病毒结合(图2)，这表明两种 受体在CVA21临床分离株的吸附/感染过程中发挥重要的作用。同时， 对高水平DAF和ICAM-1共同表达的环境中的CVA21结合的研究表 明，病毒结合程度较在两种受体单独表达的环境中低(图3)。这些发 现表明，多个受体的高水平共同表达确实可以对最佳溶解性感染有抑 制作用。在宿主细胞表面上被共同表达时，DAF和ICAM-1的密切接 近可能引起空间位阻，导致有效的受体结合位点减少。如果是这样的 话，可以推断，尽管两种受体在宿主细胞上的高水平表达并不需要与 吸附水平的增加相关，两种不同细胞受体对一种病毒的表达水平不同 的环境可能潜在地是有益的。这种环境可能发生在人肠道的粘膜表面， 在此DAF的表达是广泛存在的，其水平显著高于ICAM-1，后者的内 源性表达水平相对较低，等待被适当的细胞因子诱导。
本项研究一个出乎意料的发现是，通过在不存在抗体交联的情况 下仅经由DAF结合而溶解性地感染RD细胞，低代数临床CVA21分 离株能够以更具有功能性的作用利用DAF相互作用(图4)。对这些新 的发现的一种可能的解释是：临床CVA21分离株的病毒外壳能够以比 原型病毒株更重要的方式与DAF交联，使病毒内化，其机制类似于抗 -DAF MAb的人工交联作用(图4)。类似地，在CVB3原型和低代数 临床分离株之间也观察到受体利用方面的差异。最近，有报道称口蹄 疫病毒(FMDV)的实验室和野外病毒株之间存在着不同αv整合蛋白 利用方面的差异，说明病毒分离株对其细胞受体的亲合性可以发生改 变。
在此，我们证实了在不存在ICAM-1的情况下，MAb交联的DAF 的作用是原型和临床CVA21分离株的功能性内化受体(图4)。之前已 经提出，MAb交联的DAF介导的CVA21侵入经由细胞窖发生，与 ICAM-1病毒相互作用中采用的网格蛋白-有被小窝侵入途径相反。 CVA21通过含有交联DAF的细胞窖侵入的假设由以下证据支持：MAb 集聚的DAF在募集至细胞窖后被胞吞。DAF相互作用在细胞窖介导的 CVA21侵入中的可能作用已经被最近的报道证实，该报道称EV11的 DAF结合株经由脂筏和/或细胞窖被细胞内化。
DAF在哺乳动物体内的广泛表达为与DAF亲合性较高并利用该 受体进行内化的病毒提供了适应性优势。由于在红细胞上进行DAF表 达，为DAF结合病毒提供了一种现成的向人体全身输送的运载体，因 此这种病毒与其他病毒株相比致病性更高。有趣的是，柯萨奇病毒B3 和B5分离株在极性上皮细胞(其天然的内化受体柯萨奇和腺病毒受体 位于细胞-细胞紧密连接处，DAF位于上表面)中的连续传代可以选择 DAF结合变异体，表明DAF在上皮细胞粘膜表面感染中的重要作用。
编码外壳结构蛋白的基因组P1区的遗传分析，在临床CVA21分 离株和原型病毒株的推算氨基酸序列之间检测到许多差异(图5)。所 观察到的编码变化无一定位成之前确定的ICAM-1足迹，差异散布在 VP1、VP2和VP3中。构成ICAM-1足迹的残基在原型Kuykendall病 毒株和所有的临床分离株中都是保守的，除了VP2中的氨基酸168(图 5)。VP2的168位点处，Val至Ala的氨基酸置换是保守的，可能在 ICAM-1结合位点的构象中意义极少。临床分离株#272101在仅表达 DAF的RD细胞中显示出显著的溶解活性，但是不如其余临床分离株 的活性大，其具有所有临床分离株相对于原型病毒株之间观察到的14 个编码改变中的13个。与其它临床分离株相比，#272101中进一步存 在有9处其它改变，这可能对分离株#275238和#2727598所显示的DAF 利用增强显型具有某种类型的抑制作用。在DAF和ICAM-1二者水平 都高的环境中DAF利用显型升高的临床CVA21分离株的体外重复细 胞传代可以对ICAM-1利用增强的病毒体的生物选择施加压力，其代 价是功能性DAF相互作用降低。产生这种病毒体群体可以确定决定受 体利用改变显型的关键P1氨基酸改变。
分离株#272101的DAF利用降低的一种可能解释由下列报道提 供：其中生物选择的丧失其DAF结合显型的EV11变异体在VP1的 BC环和VP2的疏松区(puff region)具有特异性的氨基酸改变。我们 的序列分析显示，#272101在VP1的BC环和VP2的疏松区存在有这 些独特差异，在其它CVA21临床分离株的相同外壳区则不存在这种差 异(图5)。尽管不是结论性的，但是在病毒吸附/侵入细胞的环境中， 这些所有临床分离株和原型株之间观察到的13处氨基酸改变可能在 DAF利用增强显型的发展过程中具有潜在的作用。但是，尽管没有在 本研究中解决，不能排除位于病毒基因组其他区(如5′未翻译区)的 其它改变参与介导细胞的溶解性感染。
但是，DAF/EV7、DAF/CVB3相互作用和DAF/CVA21相互作用 之间的显著差异是DAF SCR2、3或4参与EV和CVB结合，而DAF SCR1参与CVA21吸附。假定EV7、CVB3和CVA21外壳之间的整体 结构相似，则CVA21外壳上分别具有其各自结合位点的两个独立受体 (即DAF和ICAM-1)的N-端结构功能区在感染过程中的任何阶段均 可以参与。但是，DAF SCR2-4参与EV7/CVB3的结合表明，对于CVB3 来说，与其它受体(如CAR)的相互作用可以在DAF相互作用之后发 生，使得对与病毒外壳上特异性DAF结合表位接触的干扰将至最低。 令人感兴趣的一个发现可能是，检测到原型病毒株VP1相对于能够溶 解性地感染ICAM-1阴性RD细胞的临床分离株的迁移的微小差异。同 样，在RD细胞中连续传代后产生的CVB3原型的变异体(CB3-RD) 与原型相比VP1迁移率发生变化，与亲代病毒株相比与DAF的受体特 异性发生变化。
综合在一起，本研究的结果表明，临床分离株与其细胞受体的总 体结合能力对于原型病毒株是保守的，但是在临床CVA21分离株利用 这些受体的能力方面存在一些个别的差异。与CVB3野生病毒株类似， 临床CVA21分离株具有在细胞溶解性感染中促进DAF利用增加的显 型，这最可能是在人类中传代的结果。CVA21利用DAF和ICAM-1对 宿主细胞进行吸附和/或感染的能力表明，有益显型的保守性使得单个 和/或多个受体得以利用，从而扩大病毒的组织嗜性，并显著增加了生 产性感染的机会。
II.柯萨奇病毒A21变异体的生物选择和分子特性
尽管生产性CVA21感染需要有ICAM-1，如同许多其它肠病毒那 样，DAF起到CVA21原型病毒株吸附受体的作用。在本研究中，我们 描述了在ICAM-1阴性细胞中体外生物选择的CVA21变异体，其获得 了改变且扩大的细胞嗜性(图6和7)。本文所示的放射性同位素标记 病毒结合实验表明，尽管在ICAM-1阴性RD细胞中进行多次传代， CVA21-DAFv仍然保留了独立结合ICAM-1的N-端结构功能区或DAF SCR1的能力(图7)。在表面表达DAF水平极高的环境中(即，选择 表达水平最高的CHO-DAF细胞)，亲代和CVA21-DAFv与DAF结合 的水平相似，而CVA21-DAFv仅与RD细胞和内源性DAF表面表达显 著减少的DOV13细胞吸附。根据之前的研究，抗-DAF SCR3mAb与 DAF的mAb交联显著地增加了亲代CVA21与表达DAF的RD和 DOV13细胞的结合，并在不存在ICAM-1的情况下促进溶解性感染(图 7)。但是，没有观察到CVA21-DAFv与mAb交联RD或DOV13细胞 的病毒结合或溶解性感染。这一发现表明，与亲代病毒株相比，生物 选择的CVA21-DAFv与DAF的相互作用已经被优化，使得这种相互作 用不会进一步被mAb交联DAF增强。数据表明，在与表位竞争性抗 -DAF SCR1mAb培育的过程中，亲代CVA21病毒体较CVA21-DAFv 更容易从表面表达的DAF上移位，这进一步支持了CVA21-DAFv的 DAF结合显型比亲代病毒株增强的假说(图8)。
推测对于CVA21原型病毒株来说，DAF的作用是将病毒保持在感 染状态，等待与侵入受体ICAM-1相互作用，仅与DAF的直接结合并 不能引发CVA21原型病毒株的生产性感染。尽管转染CHO细胞表面 上的DAF或ICAM-1表面表达水平很高(图7A)，但是观察不到可检 测的细胞被亲代CVA21或CVA21-DAFv感染(数据未显示)。但是， ICAM-1阴性RD和DOV13细胞的溶解性感染提供了CVA21-DAFv的 DAF利用增强的证据，这种溶解性感染即使在病毒导入值很高时也可 以被单独的抗-DAF SCR1mAb阻断所完全阻断(图9)。而在DAF和 ICAM-1共表达的多受体环境中使用的CVA21原型株中观察到的被同 样的mAb部分阻断则与此相反，其中需要DAF和ICAM-1二者的mAb 来完全阻断感染。这些发现支持了以下假设：CVA21-DAFv采用表面 DAF作为功能性细胞受体。CVA21-DAFv感染在与之前显示对肠病毒 感染有抑制作用的浓度相当的浓度下被sDAF抑制，这一观察结果进 一步突出了DAF在RD细胞的CVA21-DAFv感染中的重要性(图9)。 另外，它提供了推翻以下可能性的证据：在生物选择过程中， CVA21-DAFv在不存在ICAM-1的情况下适于使用其它尚未确定的另 一种细胞受体参与细胞内化。与亲代CVA21相比，不仅在RD细胞中， 而且在表达DAF的卵巢癌细胞(DOV13)中，CVA21-DAFv的DAF 结合显型增强(图7和8)似乎已经转变成细胞的溶解性感染增强(图 7)。
许多人肠病毒与DAF的结合作用中有大量不同的差异。CVB3、 EV7和EV12病毒体上的DAF结合位点推测位于二十面体二重对称轴 上的外壳峡谷外部。尽管EV11也与峡谷区的外部的DAF相互作用， DAF结合足迹被推测位于病毒体5重轴附近。在与DAF吸附的人类肠 病毒当中，仅有肠病毒70和CVA21与DAF N末端SCR1结构功能区 结合，其它的DAF结合肠病毒则与中央结构功能区(SCR2-4)相互 作用。除与DAF结合的肠病毒位于峡谷外部这一事实之外，据报道这 些相互作用并不会引起细胞感染或A颗粒的形成。对于EV11(其与 DAF的结合已经被定量评价过)，与DAF的相互作用亲和力很低，这 与在峡谷结合鼻病毒的ICAM-1分子相反，后者的亲和力相近，但动 力学较慢。
尽管CVA21-DAFv显示了DAF结合增强的显型，在外壳编码区仅 有两处氨基酸与亲代病毒株不同。在生物选择过程中，CVA21-DAFv 保留了与ICAM-1结合的能力(图7)。因此，并不出乎意料，观察到 的外壳突变无一位于之前确定的ICAM-1结合足迹中，后者被假定为 横跨北部和南部的峡谷边缘。观察到的CVA21-DAFv突变据推测位于 被VP2EF-环和VP1和VP3的C-端围绕的VP3α-螺旋(CD-环)中外 壳峡谷的外部(图10)。两个突变据推测通过VP1R270和VP3H329 的相互作用与VP1和VP3的C-端紧密接触。我们提出CVA21-DAFv VP3中观察到的突变可能参与了增强VP3α-螺旋和VP1C-端区的构 象，后者对应于EV12表面上的DAF结合足迹。这种构象上的变化将 使得CVA21-DAFv外壳和DAF之间更好地接触。由于VP3H96和A101 的存在使DAF和CVA21-DAFv病毒体双重凹陷之间的亲和力增加这一 假设与下列发现相一致：通过用抗-DAF SCR1mAb攻击， CVA21-DAFv比亲代病毒体更难以从表面表达的DAF上移位(图8A)。 低代数CVA临床分离株在不存在mAb交联DAF和ICAM-1表达的情 况下可以不同程度地溶解感染表达DAF的RD细胞，它们也编码在 CVA21-DAFv中观察到的VP3H96，但没有A101突变。与之相比，原 型CVA21病毒株编码VP3R96。放射性同位素标记的CVA21-DAFv病 毒体与表面DAF吸附能力的增强反映了在外壳编码区内发生了突变， 而不是有其它的病毒基因组区参与。
交联DAF介导的原型CVA21细胞溶解性感染发生的速率比经由 ICAM-1相互作用介导的细胞溶解性感染慢，因此认为细胞侵入经由不 同的侵入机制发生。交联DAF介导的原型CVA21侵入无需形成可检 测的A颗粒便可以发生，推测其与细胞窖有关，这是最近发现的EV1 和EV11的DAF结合株的侵入所涉及的一种新的侵入途径。EV1与其 受体α2β1在细胞表面上的吸附引起整合蛋白的集聚，被认为以与原型 CVA21通过交联DAF介导侵入相似的方式促进病毒侵入。在mAb交 联之后，推测DAF以更有利的构象被呈递在细胞表面上，从而使细胞 容易被原型CVA21感染。CVA21-DAFv与表面DAF的结合似乎是在 不形成可检测A颗粒的情况下发生的(图8B)。对这一发现的一种可 能的解释是：以与之前假设的低代数临床CVA21分离株(也具有VP3 H96残基)相似的方式，CVA21-DAFv病毒体可以有效地交联DAF， 从而通过与交联mAb人工作用有关的机制进入细胞。表观上缺乏从细 胞表面洗脱的可检测CVA21-DAFv A颗粒并不能证明没有A颗粒的形 成。如果随后的脱壳发生速度比初始DAF介导的160S至135S颗粒的 转变快，A颗粒将不能积聚。使用α2β1整合蛋白进入细胞的EV1与外 壳峡谷中α2β1整合蛋白的功能性α21结构功能区结合。尽管是一种典 型的峡谷结合受体，EV1与α21的相互作用并不能引起病毒脱壳，这 与可溶形式的脊髓灰质炎病毒受体与脊髓灰质炎病毒、ICAM-1与鼻病 毒的结合相反。表达α2β1的细胞和EV1之间的相互作用已经提示介导 了病毒体的构象变化，但是EV1脱壳是否还需要其它的细胞分子尚不 清楚。同样，不能排除CVA21-DAFv脱壳需要其它的细胞蛋白，或者 如果病毒外壳中存在突变则可能使外壳不稳定，因而便不再需要受体 介导的构象变化。
CVA21-DAFv溶解性感染两种显型和组织来源不同的癌细胞系 (RD和DOV13)的能力突出说明，使用DAF作为功能受体并不限于 生物选择过程中所用的特定细胞底物。相对于正常细胞，DAF和其它 补体调控蛋白在许多不同来源的肿瘤细胞表面上的表达都得到增强， 以保护细胞不受补体介导的攻击。因此我们认为，由于DAF结合显型 增强，CVA21-DAFv介导的经由外壳与表面表达的DAF之间的特异性 相互作用的溶瘤作用潜在可以有效地控制一些人类恶性肿瘤。经由 ICAM-1和DAF(二者均在恶性黑色素瘤细胞表面上过度表达)靶向 的原型病毒株CVA21(其有效地控制黑色素肿瘤)的成功应用支持了 这一策略。本研究的主要发现是：病毒的生物选择可能是一种有生命 力的可选方法，以便在新型肿瘤靶向溶瘤性肠病毒的开发中对基因操 作进行指导。
III.柯萨奇病毒A21-DAF介导的细胞感染性
原型和临床分离株之间的肠病毒与DAF的相互作用似乎有所不 同。在不存在ICAM-1表达和抗体交联DAF的情况下，CVA21的临床 分离株可能是经由特异性病毒外壳作用通过DAF交联而不同程度地引 起宿主细胞的溶解性感染。然而，尽管详细描述了许多临床肠病毒分 离株的DAF相互作用，溶解性感染中DAF的直接功能性作用尚未阐 明。许多对肠病毒-DAF相互作用的研究一致认为DAF起到病毒螯合 受体的作用，从而增强了病毒向其他功能性内化受体的呈递。
在本研究中我们证实，与结合DAF的艾柯病毒和B型柯萨奇病毒 不同，CVA21与DAF的N-端SCR结合(图11)。考察了生物物理参 数如时间、温度和pH对从DAF洗脱CVA21的影响，结果显示，CVA21 颗粒相对较快地从DAF上洗脱，这种洗脱对温度和pH的增加是易感 的(图12)。CVA21从ICAM-1上洗脱的特征在于：与从DAF洗脱的 病毒体相比，病毒的感染性大幅度下降(图13和图14)。由于受体的 结合，从ICAM-1上洗脱的CVA21病毒粒子经历了不可逆的外壳构象 改变，使它们失去了结合和引发溶解性感染的能力。与此相反，CVA21 与mAb交联DAF的相互作用则不会引起A颗粒的形成。受体结合时 非感染性A颗粒的构象变化是许多小RNA病毒(如PV、主要组HRV 和CVB3)的特征。DAF洗脱颗粒能够保持感染性最可能的原因是DAF 不能诱导CVA21外壳的构象变化。从表达DAF的CHO细胞上洗脱的 CVA21颗粒在蔗糖梯度中的沉降系数与感染性160S颗粒相似，而从表 达ICAM-1的CHO细胞上洗脱的CVA21颗粒表现出的沉降系数减小， 更接近于135S改变的颗粒。CVA21的感染性在DAF相互作用之后仍 然保持的原因可能在于：与参与ICAM-1结合的情况相比，病毒体外 壳的不同区域参与了DAF结合。CVA21峡谷是ICAM-1的附着位点， 而DAF据推测在更容易接触到的外壳双重凹陷(twofold depression) 内结合，这一提议最近在EV7中使用低温电子显微镜重建得到证实。 同样，推测EV11也在峡谷外部的外壳区域与DAF结合，但是在这种 情况下，结合被认为涉及二十面体5重轴。这些发现支持了以下理论： 由于推测双重凹陷中的结合并不能引起外壳构象的可检测变化，主要 由DAF参与细胞吸附。
DAF与肠病毒外壳结合的特性被认为是亲和力很低，其原因在于 解离速率常数非常快。相反，ICAM-1与结构相似的病毒外壳的相互作 用亲和力相当，但在动力学上显著变慢，这与结合位点外壳峡谷相对 较难接近相符合。在与mAb接触竞争其受体结合表位的过程中，DAF- 结合的病毒体比ICAM-1结合的病毒体更容易移位，这一结果表明与 ICAM-1的结合比DAF更严格。因此，mAb介导的DAF结合CVA21 移位的明显差异是外壳表面上受体结合位点的各个位置的相对接近造 成的，即，由于mAb接近双重凹陷(twofold depression)内的可能性 增加，病毒的DAF结合更容易解离，由于mAb与外壳峡谷的接近受 限制，病毒的ICAM-1结合难以解离。
(ICAM-1阴性细胞上)CVA21与DAF结合并保持感染状态直至 24小时的能力突出了CVA21与DAF相互作用的可逆性质。当出现 ICAM-1表达延迟时，感染性的保留使得结合DAF的病毒粒子能够进 入细胞并随后溶解细胞(图15)。在不存在可检测细胞病理学变化的情 况下，在研究过程中RD细胞单层和用腺-CD36(图15C)转导的RD 细胞上的感染性CVA21始终保持相对较高的水平；最有可能是由于与 DAF结合的保留感染性的残余病毒接种物造成的(图13和图14)。另 一种解释是，在CVA21原型制剂中存在显型DAF利用增强的病毒体 亚群，使DAF交联，并引发随后的缓慢感染，这是之前对CVA21临 床分离株所述的一个发现。
假定DAF在哺乳动物体内特别是在红细胞上广泛分布，CVA21利 用DAF作为吸附受体并保持高度感染性的能力是一种非常有益的机 制。在这种情况下，表达DAF的红细胞为病毒提供了一种现成的运输 载体向全身输送，感染性病毒可以离开红细胞表面，与表达ICAM-1 的细胞相互作用进行溶解性感染。在存在炎性细胞因子如肿瘤坏死因 子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β的情况下，细胞表面的ICAM-1表达得 以强。在天然人鼻病毒感染过程中，被感染的细胞释放处这些介导周 围细胞ICAM-1表达增强的细胞因子。
在此给出的数据证实，CVA21溶解性感染过程中DAF的主要作用 是作为螯合受体，使病毒保持在感染状态，等待经由ICAM-1相互作 用进入细胞的机会。相对较短的结合和洗脱循环周期表明，细胞感染 过程中CVA21最有可能与DAF结合并从其上洗脱许多次。我们认为， 从DAF上洗脱并不会损害CVA21在后期引发生产性感染的能力，实 际上它增加了该病毒通过至少两种不同的机制实现侵入宿主细胞的可 能。首先，病毒可以与DAF结合并洗脱，同时仍然保持受体结合能力， 从而保持细胞感染性。其次，CVA21可以与DAF结合，等待在同一细 胞或邻近细胞上达到显著水平的ICAM-1表达，从而使病毒内化，随 后发生溶解性感染。就病毒进化和发病机理两个方面而言，结合DAF 的能力必须被认为最有利于CVA21原型株和其他DAF结合肠病毒使 细胞感染性最大，在有毒力的临床CVA21分离株中保留甚至增强的显 型。
IV.柯萨奇病毒A21DAF变异体(CVA21-DAFv)体外溶解人乳腺、前 列腺、结肠和卵巢癌细胞
在此展现的工作描述了通过体外选择方法分离的CVA21-DAFv的 特异性溶瘤能力。使用一组12个人癌细胞系，我们已经证明，这种生 物选择的病毒株迅速地感染所有来源于肿瘤的被测细胞。相反， CVA21-DAFv所源自的CVA21亲代病毒株，仅仅在被测的12个癌细 胞系中的7个中介导着溶瘤作用。重要的是，CVA21-DAFv相对于亲 代CVA21更出色的溶瘤活性并不限于产生该生物选择病毒株的RD细 胞，而是在大多数被测的来源于不同组织的其它人癌细胞系中均有观 察到(图18)。我们观察到，与需要存在ICAM-1来进入细胞的亲代 CVA21相比，CVA21-DAFv溶解性地感染大量被测肿瘤细胞系可能具 有深远的临床意义。人类实体肿瘤通常是一大团聚集的细胞，其往往 不表达ICAM-1。而且，已经显示ICAM-1的表达与前列腺癌细胞的转 移潜能相关，即，与转移性较小的LNCaP细胞相比，转移性较强的细 胞系DU145和PC3上表达有ICAM-1。在研究中我们已显示，LNCaP 细胞对CVA21的亲代病毒株的感染有抵抗力，该细胞系以及DU145 和PC3则被生物选择的变异体CVA21-DAFv溶解。
V.CVA21-DAFv对人前列腺肿瘤异种移植物的体内溶瘤作用
尽管CVA21-DAFv比CVA21亲代病毒株针对范围更宽的癌细胞系 表现出溶瘤活性，在人前列腺肿瘤异种移植物的体内模型中，生物选 择的病毒株的单次剂量同样有效地减小肿瘤的负荷。总之，在此所展 现的证据表明，CVA21-DAFv具有用作多种异种癌细胞种类的有效生 物治疗药物的潜力。
摘要
已经显示，低细胞培养代数的CVA21临床分离株除与ICAM-1结 合之外，还与DAF结合，具有DAF结合显型，因此，不可能从细胞 培养物的多次传代得到。越来越多的证据表明，DAF在肠病毒感染中 发挥更多的功能作用，这种临床CVA21分离株的DAF利用增强显型 在不存在抗-DAF mAb交联或ICAM-1表面表达的情况下，具有溶解性 地感染DAF表达细胞的能力。
我们研究了生物选择成溶解性地感染ICAM-1阴性横纹肌肉瘤 (RD)细胞的CVA21变异体CVA21-DAFv的受体利用性质。我们发 现，在表达DAF的RD细胞中进行多次传代后，与亲代病毒株相比， CVA21-DAFv表现出的结合DAF的能力增强，同时还保留着结合 ICAM-1的潜力。RD细胞的溶解性感染被抗-DAF SCR1mAb阻断完全 消除，这表明单是与DAF的相互作用介导了溶解性感染。为了更好地 认识CVA21-DAFv细胞相互作用的分子基础，对CVA21-DAFv外壳编 码区的核苷酸序列进行测定，并与亲代CVA21的序列进行比较。序列 比较显示，CVA21-DAFv的VP3中有两个独特的氨基酸取代，预计这 使得病毒外壳与DAF的相互作用得以增强。
本领域专业技术人员将会认识到，可以在不偏离本发明精神或广 义描述范围的前提下，对本发明的具体实施方式进行大量的变动和/或 修改。因此，本文的实施方式在所有方面均应被视为是说明性的，而 绝不是限制性的。
序列表
<110>维若塔歌私人有限公司
<120>修饰的溶瘤病毒
<130>699860C
<150>US60/552,095
<151>2004-03-11
<160>8
<170>PatentIn version3.2
<210>1
<211>2637
<212>DNA
<213>柯萨奇病毒A
<400>1
atgggggctc aagtctcaac tcaaaagacc ggtgcgcacg agaatcaaaa cgtggcagct      60
aatggatcca ccattaatta tactactatc aattactaca aagatagcgc gagtaattcg     120
gccactagac aagatctttc ccaagatcca tcaaaattca cggaaccggt taaggactta     180
atgttgaaaa cagcaccagc tttaaattca ccaaatgtgg aagcatgtgg atacagtgac     240
cgtgtaagac aaattaccct gggtaactca accattacca cacaagaagc agctaatgct     300
attgttgctt atggtgagtg gcctacttac ataaatgact cagaagcaaa cccagtagat     360
gcacccactg aaccagacgt tagtagcaac aggttttaca ccctagaatc ggtgtcttgg     420
aagactacct caaggggttg gtggtggaaa ctaccagact gtctaaaaga catgggaatg     480
tttggtcaga acatgtacta ccactactta ggacgctctg gttataccat tcatgtccag     540
tgcaatgcct caaaatttca ccaaggggca ttaggagttt ttctgatacc agagtttgtc     600
atggcctgca acactgagag caaaacatca tatgtttcat acattaacgc aaatcctggt     660
gagaggggcg gtgagttcac aaacacctac aacccatcaa acacagatgc tagtgagggc     720
agacaattcg cagcactaga ctatctgctg ggttctggcg ttctagctgg aaacgcattt     780
gtgtacccgc accagatcat taacttgcgt accaataaca gtgcaacaat cgtggtgcca     840
tatgtgaact cacttgtcat tgattgcatg gcaaaacata ataactgggg cattgtcatt     900
ctaccactgg cacccttggc ctttgctgca acatcgtcac cacaggtgcc tattacagtg     960
accattgcac ccatgtgcgc agaattcaat ggattgagaa acatcaccat cccagtgcat    1020
caagggttgc caacaatgaa tacacctggt tccaatcaat tcctcacatc tgatgacttc    1080
cagtcaccct gcgccttacc caattttgat gtcactccgc caatacacat acccggagaa    1140
gtgaagaaca tgatggaact ggctgaaatt gacacgctga tcccaatgaa tgcagtggac    1200
ggaaaggtga acactatgga aatgtatcaa ataccattaa atgacaattt gagcaaggca    1260
cccatatttt gcctatctct gtcgcctgct tctgacaaac gattaagtca tacaatgttg    1320
ggtgaaattc taaattatta cacccattgg acagggtcca ttaggttcac ctttctattt    1380
tgtggtagta tgatggctac tggtaagcta cttctcagtt attccccacc aggagctaaa    1440
ccaccaacca atcgcaaaga tgcaatgttg ggcacacaca tcatctggga cctggggtta    1500
caatccagtt gttccatggt tgcaccgtgg atctctaata cagtatacag gcggtgcgca    1560
cgtgatgact tcacagaagg cgggtttata acttgctttt atcaaactag aattgttgtg    1620
cctgcttcaa ctcctaccag tatgtttatg ttaggctttg tgagtgcatg tccagatttc    1680
agtgtcagac tgcttaggga cacttcccac attagtcaat caaaactaat agcacgctca    1740
caaggcattg aagaccttat tgactcagcg ataaagaatg ctttgagagt gtctcaacca    1800
tctacggccc agtcaactga agcaaccagt ggagcaaata gtcaggaagt gccagcacta    1860
actgctgtgg aaacaggagc atctggtcag gcaatcccca gtgacgtgat ggaaaccaga    1920
cacgtgataa attacaaaac taggtctgaa tcatgccttg agtcattctt tgggagagct    1980
gcgtgtgtca caatcctatc tctgaccaac tcttccaaga gtggcgagga gaaaaagcat    2040
ttcaacattt ggaatatcac atacaccgac actgttcagt tgcgtagaaa attagagttt    2100
ttcacatatt ccagatttga ccttgaaatg acttttgtgt tcacagagaa ctaccccagt    2160
acagctagtg gagaagtgcg caaccaagta taccagatca tgtacattcc accaggggca    2220
ccccgtccat catcctggga tgactataca tggcaatcct cctccaaccc ttccatcttt    2280
tacatgtatg ggaacgcacc accgcggatg tcaattcctt acgtggggat tgccaatgcc    2340
tattcacact tctatgacgg ttttgcacga gtgccacttg agggtgagaa tactgatgct    2400
ggtgatacgt tttatggatt ggtgtccata aacgattttg gagtcttagc agtcagagca    2460
gtaaaccgca gtaatccaca tacaatacac acatccgtga gagtgtacat gaaaccaaaa    2520
cacattcggt gttggtgccc cagaccccct cgcgctgtat tatacagagg agaaggagta    2580
gacatgatat ccagtgcaat tctacccctg actaaagtgg actcaattac cactttt       2637
<210>2
<211>879
<212>PRT
<213>柯萨奇病毒A
<400>2
Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Thr Gly Ala His Glu Asn Gln
1               5                   10                  15
Asn Val Ala Ala Asn Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr
            20                  25                  30
Tyr Lys Asp Ser Ala Ser Asn Ser Ala Thr Arg Gln Asp Leu Ser Gln
        35                  40                  45
Asp Pro Ser Lys Phe Thr Glu Pro Val Lys Asp Leu Met Leu Lys Thr
    50                  55                  60
Ala Pro Ala Leu Asn Ser Pro Asn Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp
65                  70                  75                  80
Arg Val Arg Gln Ile Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu
                85                  90                  95
Ala Ala Asn Ala Ile Val Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Thr Tyr Ile Asn
            100                 105                 110
Asp Ser Glu Ala Asn Pro Val Asp Ala Pro Thr Glu Pro Asp Val Ser
        115                 120                 125
Ser Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Glu Ser Val Ser Trp Lys Thr Thr Ser
    130                 135                 140
Arg Gly Trp Trp Trp Lys Leu Pro Asp Cys Leu Lys Asp Met Gly Met
145                 150                 155                 160
Phe Gly Gln Asn Met Tyr Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ser Gly Tyr Thr
                165                 170                 175
Ile His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Gly
            180                 185                 190
Val Phe Leu Ile Pro Glu Phe Val Met Ala Cys Asn Thr Glu Ser Lys
        195                 200                 205
Thr Ser Tyr Val Ser Tyr Ile Asn Ala Asn Pro Gly Glu Arg Gly Gly
    210                 215                 220
Glu Phe Thr Asn Thr Tyr Asn Pro Ser Asn Thr Asp Ala Ser Glu Gly
225                 230                 235                 240
Arg Gln Phe Ala Ala Leu Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Val Leu Ala
                245                 250                 255
Gly Asn Ala Phe Val Tyr Pro His Gln Ile Ile Asn Leu Arg Thr Asn
            260                 265                 270
Asn Ser Ala Thr Ile Val Val Pro Tyr Val Asn Ser Leu Val Ile Asp
        275                 280                 285
Cys Met Ala Lys His Asn Asn Trp Gly Ile Val Ile Leu Pro Leu Ala
    290                 295                 300
Pro Leu Ala Phe Ala Ala Thr Ser Ser Pro Gln Val Pro Ile Thr Val
305                 310                 315                 320
Thr Ile Ala Pro Met Cys Ala Glu Phe Asn Gly Leu Arg Asn Ile Thr
                325                 330                 335
Ile Pro Val His Gln Gly Leu Pro Thr Met Asn Thr Pro Gly Ser Asn
            340                 345                 350
Gln Phe Leu Thr Ser Asp Asp Phe Gln Ser Pro Cys Ala Leu Pro Asn
        355                 360                 365
Phe Asp Val Thr Pro Pro Ile His Ile Pro Gly Glu Val Lys Asn Met
    370                 375                 380
Met Glu Leu Ala Glu Ile Asp Thr Leu Ile Pro Met Asn Ala Val Asp
385                 390                 395                 400
Gly Lys Val Asn Thr Met Glu Met Tyr Gln Ile Pro Leu Asn Asp Asn
                405                 410                 415
Leu Ser Lys Ala Pro Ile Phe Cys Leu Ser Leu Ser Pro Ala Ser Asp
            420                 425                 430
Lys Arg Leu Ser His Thr Met Leu Gly Glu Ile Leu Asn Tyr Tyr Thr
        435                 440                 445
His Trp Thr Gly Ser Ile Arg Phe Thr Phe Leu Phe Cys Gly Ser Met
    450                 455                 460
Met Ala Thr Gly Lys Leu Leu Leu Ser Tyr Ser Pro Pro Gly Ala Lys
465                 470                 475                 480
Pro Pro Thr Asn Arg Lys Asp Ala Met Leu Gly Thr His Ile Ile Trp
                485                 490                 495
Asp Leu Gly Leu Gln Ser Ser Cys Ser Met Val Ala Pro Trp Ile Ser
            500                 505                 510
Asn Thr Val Tyr Arg Arg Cys Ala Arg Asp Asp Phe Thr Glu Gly Gly
        515                 520                 525
Phe Ile Thr Cys Phe Tyr Gln Thr Arg Ile Val Val Pro Ala Ser Thr
    530                 535                 540
Pro Thr Ser Met Phe Met Leu Gly Phe Val Ser Ala Cys Pro Asp Phe
545                 550                 555                 560
Ser Val Arg Leu Leu Arg Asp Thr Ser His Ile Ser Gln Ser Lys Leu
                565                 570                 575
Ile Ala Arg Ser Gln Gly Ile Glu Asp Leu Ile Asp Ser Ala Ile Lys
            580                 585                 590
Asn Ala Leu Arg Val Ser Gln Pro Ser Thr Ala Gln Ser Thr Glu Ala
        595                 600                 605
Thr Ser Gly Ala Asn Ser Gln Glu Val Pro Ala Leu Thr Ala Val Glu
    610                 615                 620
Thr Gly Ala Ser Gly Gln Ala Ile Pro Ser Asp Val Met Glu Thr Arg
625                 630                 635                 640
His Val Ile Asn Tyr Lys Thr Arg Ser Glu Ser Cys Leu Glu Ser Phe
                645                 650                 655
Phe Gly Arg Ala Ala Cys Val Thr Ile Leu Ser Leu Thr Asn Ser Ser
            660                 665                 670
Lys Ser Gly Glu Glu Lys Lys His Phe Asn Ile Trp Asn lle Thr Tyr
        675                 680                 685
Thr Asp Thr Val Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Phe Phe Thr Tyr Ser
    690                 695                 700
Arg Phe Asp Leu Glu Met Thr Phe Val Phe Thr Glu Asn Tyr Pro Ser
705                 710                 715                 720
Thr Ala Ser Gly Glu Val Arg Asn Gln Val Tyr Gln Ile Met Tyr Ile
                725                 730                 735
Pro Pro Gly Ala Pro Arg Pro Ser Ser Trp Asp Asp Tyr Thr Trp Gln
            740                 745                 750
Ser Ser Ser Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Met Tyr Gly Asn Ala Pro Pro
        755                 760                 765
Arg Met Ser Ile Pro Tyr Val Gly Ile Ala Asn Ala Tyr Ser His Phe
    770                 775                     780
Tyr Asp Gly Phe Ala Arg Val Pro Leu Glu Gly Glu Asn Thr Asp Ala
785                 790                     795             800
Gly Asp Thr Phe Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asn Asp Phe Gly Val Leu
                805                     810             815
Ala Val Arg Ala Val Asn Arg Ser Asn Pro His Thr Ile His Thr Ser
            820                     825             830
Val Arg Val Tyr Met Lys Pro Lys His Ile Arg Cys Trp Cys Pro Arg
        835                     840             845
Pro Pro Arg Ala Val Leu Tyr Arg Gly Glu Gly Val Asp Met Ile Ser
    850                     855             860
Ser Ala Ile Leu Pro Leu Thr Lys Val Asp Ser Ile Thr Thr Phe
865                     870             875
<210>3
<211>2637
<212>DNA
<213>柯萨奇病毒A
<400>3
atgggggctc aagtctcaac tcaaaagacc ggtgcgcacg agaatcaaaa cgtggcagct      60
aatggatcca ccattaatta tactactatc aattactaca aagatagcgc gagtaattcg     120
gccactagac aagatctttc ccaagatcca tcgaaattca cggaaccggt taaggactta     180
atgttgaaaa cagcaccagc tttaaattca ccaaatgtgg aagcatgtgg atacagtgac     240
cgtgtaagac aaattaccct gggtaactca accattacca cacaagaagc agctaatgct     300
attgttgctt atggtgagtg gcctacttac ataaatgact cagaagcaaa cccagtagat     360
gcacccactg aaccagacgt tagtagcaac aggttttaca ccctagaatc ggtgtcttgg     420
aagactacct caaggggttg gtggtggaaa ctaccagact gtctaaaaga catgggaatg     480
tttggtcaga acatgtacta ccactactta ggacgctctg gttataccat tcatgtccag     540
tgcaatgcct caaaatttca ccaaggggca ttaggagttt ttctgatacc agagtttgtc     600
atggcctgca acactgagag caaaacatca tatgtttcat acattaacgc aaatcctggt     660
gagaggggcg gtgagttcac aaacacttac aacccatcaa acacagatgc tagtgagggc     720
agacaattcg cagcactaga ctatctgctg ggttctggcg ttctagctgg aaacgcattt     780
gtgtacccgc accagatcat taacttgcgt accaataaca gtgcaacaat cgtggtgcca     840
tatgtgaact cacttgtcat tgattgcatg gcaaaacata ataactgggg cattgtcatt     900
ctaccactgg cacccttggc ctttgctgca acatcgtcac cacaggtgcc tattacagtg     960
accattgcac ccatgtgcgc agaattcaat ggattgagaa acatcaccat cccagtgcat    1020
caagggttgc caacaatgaa tacacctggt tccaatcaat tcctcacatc tgatgacttc    1080
cagtcaccct gcgccttacc caattttgat gtcactccgc caatacacat acccggagaa    1140
gtgaagaaca tgatggaatt ggctgaaatt gacacgctga tcccaatgaa tgcagtggac    1200
ggaaaggtga acactatgga aatgtatcaa ataccattaa atgacaattt gagcaaggca    1260
cccatatttt gcctatctct gtcgcctgct tctgacaaac gattaagtca tacaatgttg    1320
ggtgaaattc taaattatta cacccattgg acagggtcca ttaggttcac ctttctattt    1380
tgtggtagta tgatggctac tggtaagcta cttctcagtt attccccacc aggagctaaa    1440
ccaccaacca atcgcaaaga tgcaatgttg ggcacacaca tcatctggga cctggggtta    1500
caatccagtt gttccatggt tgcaccgtgg atctctaata cagtatacag gcggtgcgca    1560
cgtgatgact tcacagaagg cgggtttata acttgctttt atcaaactag aattgttgtg    1620
cctgcttcaa ctcctaccag tatgtttatg ttaggctttg tgagtgcatg tccagatttc    1680
agtgtcagac tgcttaggga cacttcccac attagtcaat caaaactaat agcacgctca    1740
caaggcattg aagaccttat tgactcagcg ataaagaatg ctttgagagt gtctcaacca    1800
tctacggccc agtcaactga agcaaccagt ggagcaaata gtcaggaagt gccagcacta    1860
actgctgtgg aaacaggagc atctggtcag gcaattccca gtgacgtgat ggaaaccaga    1920
cacgtgataa attacaaaac taggtctgaa tcatgccttg agtcattctt tgggagagct    1980
gcgtgtgtca caatcctatc tctgaccaac tcttccaaga gtggcgagga gaaaaagcat    2040
ttcaacattt ggaatatcac atacaccgac actgttcagt tgcgtagaaa attagagttt    2100
ttcacatatt ccagatttga ccttgaaatg acttttgtgt tcacagagaa ctaccccagt    2160
acagctagtg gagaagtgcg caaccaagta taccagatca tgtacattcc accaggggca    2220
ccccgtccat catcctggga tgactataca tggcaatcct cctccaaccc ttccatcttt    2280
tacatgtatg ggaacgcacc accgcggatg tcaattcctt acgtggggat tgccaatgcc    2340
tattcacact tctatgacgg ttttgcacga gtgccacttg agggtgagaa tactgatgct    2400
ggtgatacgt tttatggatt ggtgtccata aacgattttg gagtcttagc agtcagagca    2460
gtaaaccgca gtaatccaca tacaatacac acatccgtga gagtgtacat gaaaccaaaa    2520
cacattcggt gttggtgccc cagaccccct cgcgctgtat tatacagagg agaaggagta    2580
gacatgatat ccagtgcaat tctacccctg actaaagtgg actcaattac cactttt       2637
<210>4
<211>879
<212>PRT
<213>柯萨奇病毒A
<400>4
Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Thr Gly Ala His Glu Asn Gln
1               5                   10                  15
Asn Val Ala Ala Asn Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr
            20                  25                  30
Tyr Lys Asp Ser Ala Ser Asn Ser Ala Thr Arg Gln Asp Leu Ser Gln
        35                  40                  45
Asp Pro Ser Lys Phe Thr Glu Pro Val Lys Asp Leu Met Leu Lys Thr
    50                  55                  60
Ala Pro Ala Leu Asn Ser Pro Asn Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp
65                  70                  75                  80
Arg Val Arg Gln Ile Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu
                85                  90                  95
Ala Ala Asn Ala Ile Val Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Thr Tyr Ile Asn
            100                 105                 110
Asp Ser Glu Ala Asn Pro Val Asp Ala Pro Thr Glu Pro Asp Val Ser
        115                 120                 125
Ser Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Glu Ser Val Ser Trp Lys Thr Thr Ser
    130                 135                 140
Arg Gly Trp Trp Trp Lys Leu Pro Asp Cys Leu Lys Asp Met Gly Met
145                 150                 155                 160
Phe Gly Gln Asn Met Tyr Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ser Gly Tyr Thr
                165                 170                 175
Ile His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Gly
            180                 185                 190
Val Phe Leu Ile Pro Glu Phe Val Met Ala Cys Asn Thr Glu Ser Lys
        195                 200                 205
Thr Ser Tyr Val Ser Tyr Ile Asn Ala Asn Pro Gly Glu Arg Gly Gly
    210                 215                 220
Glu Phe Thr Asn Thr Tyr Asn Pro Ser Asn Thr Asp Ala Ser Glu Gly
225                 230                 235                 240
Arg Gln Phe Ala Ala Leu Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Val Leu Ala
                245                 250                 255
Gly Asn Ala Phe Val Tyr Pro His Gln Ile Ile Asn Leu Arg Thr Asn
            260                 265                 270
Asn Ser Ala Thr Ile Val Val Pro Tyr Val Asn Ser Leu Val Ile Asp
        275                 280                 285
Cys Met Ala Lys His Asn Asn Trp Gly Ile Val Ile Leu Pro Leu Ala
    290                 295                 300
Pro Leu Ala Phe Ala Ala Thr Ser Ser Pro Gln Val Pro Ile Thr Val
305                 310                 315                 320
Thr Ile Ala Pro Met Cys Ala Glu Phe Asn Gly Leu Arg Asn Ile Thr
                325                 330                 335
Ile Pro Val His Gln Gly Leu Pro Thr Met Asn Thr Pro Gly Ser Asn
            340                 345                 350
Gln Phe Leu Thr Ser Asp Asp Phe Gln Ser Pro Cys Ala Leu Pro Asn
        355                 360                 365
Phe Asp Val Thr Pro Pro Ile His Ile Pro Gly Glu Val Lys Asn Met
    370                 375                 380
Met Glu Leu Ala Glu Ile Asp Thr Leu Ile Pro Met Asn Ala Val Asp
385                 390                 395                 400
Gly Lys Val Asn Thr Met Glu Met Tyr Gln Ile Pro Leu Asn Asp Asn
                405                 410                 415
Leu Ser Lys Ala Pro Ile Phe Cys Leu Ser Leu Ser Pro Ala Ser Asp
            420                 425                 430
Lys Arg Leu Ser His Thr Met Leu Gly Glu Ile Leu Asn Tyr Tyr Thr
        435                 440                 445
His Trp Thr Gly Ser Ile Arg Phe Thr Phe Leu Phe Cys Gly Ser Met
    450                 455                 460
Met Ala Thr Gly Lys Leu Leu Leu Ser Tyr Ser Pro Pro Gly Ala Lys
465                 470                 475                 480
Pro Pro Thr Asn Arg Lys Asp Ala Met Leu Gly Thr His  Ile Ile Trp
                485                 490                  495
Asp Leu Gly Leu Gln Ser Ser Cys Ser Met Val Ala Pro Trp Ile Ser
            500                 505                 510
Asn Thr Val Tyr Arg Arg Cys Ala Arg Asp Asp Phe Thr Glu Gly Gly
        515                 520                 525
Phe Ile Thr Cys Phe Tyr Gln Thr Arg Ile Val Val Pro Ala Ser Thr
    530                 535                 540
Pro Thr Ser Met Phe Met Leu Gly Phe Val Ser Ala Cys Pro Asp Phe
545                 550                 555                 560
Ser Val Arg Leu Leu Arg Asp Thr Ser His Ile Ser Gln Ser Lys Leu
                565                 570                 575
Ile Ala Arg Ser Gln Gly Ile Glu Asp Leu Ile Asp Ser Ala Ile Lys
            580                 585                 590
Asn Ala Leu Arg Val Ser Gln Pro Ser Thr Ala Gln Ser Thr Glu Ala
        595                 600                 605
Thr Ser Gly Ala Asn Ser Gln Glu Val Pro Ala Leu Thr Ala Val Glu
    610                 615                 620
Thr Gly Ala Ser Gly Gln Ala Ile Pro Ser Asp Val Met Glu Thr Arg
625                 630                 635                 640
His Val Ile Asn Tyr Lys Thr Arg Ser Glu Ser Cys Leu Glu Ser Phe
                645                 650                 655
Phe Gly Arg Ala Ala Cys Val Thr Ile Leu Ser Leu Thr Asn Ser Ser
            660                 665                 670
Lys Ser Gly Glu Glu Lys Lys His Phe Asn Ile Trp Asn Ile Thr Tyr
        675                 680                 685
Thr Asp Thr Val Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Phe Phe Thr Tyr Ser
    690                 695                 700
Arg Phe Asp Leu Glu Met Thr Phe Val Phe Thr Glu Asn Tyr Pro Ser
705                 710                 715                 720
Thr Ala Ser Gly Glu Val Arg Asn Gln Val Tyr Gln Ile Met Tyr Ile
                725                 730                 735
Pro Pro Gly Ala Pro Arg Pro Ser Ser Trp Asp Asp Tyr Thr Trp Gln
            740                 745                 750
Ser Ser Ser Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Met Tyr Gly Asn Ala Pro Pro
        755                 760                 765
Arg Met SerIle  Pro Tyr Val Gly Ile Ala Asn Ala Tyr Ser His  Phe
    770                 775                 780
Tyr Asp Gly Phe Ala Arg Val Pro Leu Glu Gly Glu Asn Thr Asp Ala
785                 790                 795                 800
Gly Asp Thr Phe Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asn Asp Phe Gly Val Leu
                805                 810                 815
Ala Val Arg Ala Val Asn Arg Ser Asn Pro His Thr Ile His Thr Ser
            820                 825                 830
Val Arg Val Tyr Met Lys Pro Lys His Ile Arg Cys Trp Cys Pro Arg
        835                 840                 845
Pro Pro Arg Ala Val Leu Tyr Arg Gly Glu Gly Val Asp Met Ile Ser
    850                 855                 860
Ser Ala Ile Leu Pro Leu Thr Lys Val Asp Ser Ile Thr Thr Phe
865                 870                 875
<210>5
<211>2637
<212>DNA
<213>柯萨奇病毒A
<400>5
atgggggctc aagtctcaac tcaaaagacc ggtgcgcacg agaatcaaaa cgtggcagct      60
aatggatcca ccattaatta tactactatt aattactaca aagatagcgc gagtaattcg     120
gctactagac aagatctttc ccaagatcca tcaaaattca cggaaccggt taaggactta     180
atgttgaaaa cagcaccagc tttaaattca ccaaatgtgg aagcatgtgg atacagtgac     240
cgtgtaagac agattaccct gggtaattca accattacca cacaagaagc agctaatgct     300
attgttgctt atggtgagtg gcctacttac ataaatgact cagaagcaaa cccagtagat     360
gcacccactg aaccagacgt tagtagcaac aggttttaca ccttagaatc ggtgtcttgg     420
aagactacct caaggggttg gtggtggaaa ctaccagact gtctaaaaga catgggaatg     480
tttggtcaaa acatgtacta ccactactta ggacgctctg gttataccat tcatgtccag     540
tgcaatgcgt caaaatttca ccaaggggca ttaggagttt ttctgatacc agagtttgtc     600
atggcctgca acactgagag caaaacatca tatgtttcat acattaacgc aaatcctggt     660
gagaggggcg gtgagtttac aaacacctat aacccatcag acacagatgc taatgagggc     720
agacaattcg cagcactaga ctatttgctg ggttctggtg ttctagctgg aaacgcattt     780
gtgtacccgc accagatcat taacttgcgt accaataaca gtgcaacaat tgtggtacca     840
tatgtgaact cacttgtcat tgattgcatg gcaaaacaca ataactgggg cattgtcatt     900
ctgccactgg cacccttggc ctttgctgca acatcgtcac cacaggtgcc tattacagtg     960
accattgcac ccatgtgcgc agaattcaat ggattgagaa acatcaccat cccagtgcat    1020
caagggttgc caacaatgaa tacacctggt tccaatcaat tcctcacatc tgatgacttc    1080
cagtcgccct gcgccttgcc caatttcgat gtcactccgc caatacacat acccggagaa    1140
gtgaagaaca tgatggaact ggctgaaatt gacacactga tcccaatgaa tgcagtggac    1200
ggaaaggtga acactatgga aatgtatcaa ataccattaa atgacaattt gagcaaggca    1260
cccatatttt gcctatctct gtcgcctgct tctgacagac gactacgtca tacaatgttg    1320
ggtgaaattc taaattatta cacccattgg acagggtcca ttaggttcac ctttctattt    1380
tgtggtagta tgatggctac tggtaagcta cttctcagtt attccccacc aggagctaaa    1440
ccaccaacca atcgcaaaga tgcaatgttg ggcacacaca tcatctggga cctgggatta    1500
caatccagtt gttccatggt tgcaccgtgg atctctaata cagtatacag gcggtgcgca    1560
cgtgatgact tcacagaagg cgggtttata acttgctttt atcaaactag aattgttgtg    1620
cctgcttcaa ctcctaccag tatgtttatg ttaggctttg tgagtgcatg tccagatttc    1680
agtgtcagac tgcttaggga cacttcccat attagtcaat caaaattaat agcacgcgca    1740
caaggcattg aagaccttat tgactcagcg ataaagagtg ctttgagagt gtctcaacca    1800
tctacggccc agtcaactga agcaaccagt ggagcaaata gtcaggaagt gccagcacta    1860
actgctgtgg aaacaggagc atctggtcag gcaatcccca gtgacgtgat ggaaaccaga    1920
cacgtgataa attacaaaac caggtctgaa tcatgccttg agtcattctt tgggagagct    1980
gcgtgtgtca caatcctatc tctgactaac tcttccgaga gaggggagga gaggaagcat    2040
ttcaacattt ggaatatcac atacaccgac actgttcagt tgcgtagaaa attggagttt    2100
ttcacatatt ccagatttga ccttgaaatg acttttgtgt tcacagagaa ctatcccagt    2160
acagccagtg gagaagtgcg caaccaagta taccagatca tgtacattcc accaggggca    2220
ccccgtccat catcctggga tgactataca tggcaatcct cctccaaccc ttccatcttt    2280
tacatgtatg ggaacgcacc accgcggatg tcaattcctt acgtggggat tgccaatgcc    2340
tattcacact tctacgacgg ttttgcacga gtgccacttg agggtgagaa tactgatgct    2400
ggtgacacgt tttatggatt ggtgtccata aacgattttg gagtcttagc agtcagagca    2460
gtaaaccgca gtaatccaca tacaatacac acatccgtga gagtgtacat gaagccaaaa    2520
cacattcggt gttggtgccc cagaccccct cgtgctgtat tatacagagg agaaggagta    2580
gacatgatat ccagtgcaat tctacccctg actgaagtgg actcaattac cactttt       2637
<210>6
<211>879
<212>PRT
<213>柯萨奇病毒A
<400>6
Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Thr Gly Ala His Glu Asn Gln
1               5                   10                  15
Asn Val Ala Ala Asn Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr
            20                  25                  30
Tyr Lys Asp Ser Ala Ser Asn Ser Ala Thr Arg Gln Asp Leu Ser Gln
        35                  40                  45
Asp Pro Ser Lys Phe Thr Glu Pro Val Lys Asp Leu Met Leu Lys Thr
    50                  55                  60
Ala Pro Ala Leu Asn Ser Pro Asn Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp
65                  70                  75                  80
Arg Val Arg Gln Ile Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu
                85                  90                  95
Ala Ala Asn Ala Ile Val Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Thr Tyr Ile Asn
            100                 105                 110
Asp Ser Glu Ala Asn Pro Val Asp Ala Pro Thr Glu Pro Asp Val Ser
        115                 120                 125
Ser Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Glu Ser Val Ser Trp Lys Thr Thr Ser
    130                 135                 140
Arg Gly Trp Trp Trp Lys Leu Pro Asp Cys Leu Lys Asp Met Gly Met
145                 150                 155                 160
Phe Gly Gln Asn Met Tyr Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ser Gly Tyr Thr
                165                 170                 175
Ile His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Gly
            180                 185                 190
Val Phe Leu Ile Pro Glu Phe Val Met Ala Cys Asn Thr Glu Ser Lys
        195                 200                 205
Thr Ser Tyr Val Ser Tyr Ile Asn Ala Asn Pro Gly Glu Arg Gly Gly
    210                 215                 220
Glu Phe Thr Asn Thr Tyr Asn Pro Ser Asp Thr Asp Ala Asn Glu Gly
225                 230                 235                 240
Arg Gln Phe Ala Ala Leu Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Val Leu Ala
                245                 250                 255
Gly Asn Ala Phe Val Tyr Pro His Gln Ile Ile Asn Leu Arg Thr Asn
            260                 265                 270
Asn Ser Ala Thr Ile Val Val Pro Tyr Val Asn Ser Leu Val Ile Asp
        275                 280                 285
Cys Met Ala Lys His Asn Asn Trp Gly Ile Val Ile Leu Pro Leu Ala
    290                 295                 300
Pro Leu Ala Phe Ala Ala Thr Ser Ser Pro Gln Val Pro Ile Thr Val
305                 310                 315                 320
Thr Ile Ala Pro Met Cys Ala Glu Phe Asn Gly Leu Arg Asn Ile Thr
                325                 330                 335
Ile Pro Val His Gln Gly Leu Pro Thr Met Asn Thr Pro Gly Ser Asn
            340                 345                 350
Gln Phe Leu Thr Ser Asp Asp Phe Gln Ser Pro Cys Ala Leu Pro Asn
        355                 360                 365
Phe Asp Val Thr Pro Pro Ile His Ile Pro Gly Glu Val Lys Asn Met
    370                 375                 380
Met Glu Leu Ala Glu Ile Asp Thr Leu Ile Pro Met Asn Ala Val Asp
385                 390                 395                 400
Gly Lys Val Asn Thr Met Glu Met Tyr Gln Ile Pro Leu Asn Asp Asn
                405                 410                 415
Leu Ser Lys Ala Pro Ile Phe Cys Leu Ser Leu Ser Pro Ala Ser Asp
            420                 425                 430
Arg Arg Leu Arg His Thr Met Leu Gly Glu Ile Leu Asn Tyr Tyr Thr
        435                 440                 445
His Trp Thr Gly Ser Ile Arg Phe Thr Phe Leu Phe Cys Gly Ser Met
    450                 455                 460
Met Ala Thr Gly Lys Leu Leu Leu Ser Tyr Ser Pro Pro Gly Ala Lys
465                 470                 475                 480
Pro Pro Thr Asn Arg Lys Asp Ala Met Leu Gly Thr His Ile Ile Trp
                485                 490                 495
Asp Leu Gly Leu Gln Ser Ser Cys Ser Met Val Ala Pro Trp Ile Ser
            500                 505                 510
Asn Thr Val Tyr Arg Arg Cys Ala Arg Asp Asp Phe Thr Glu Gly Gly
        515                 520                 525
Phe Ile Thr Cys Phe Tyr Gln Thr Arg Ile Val Val Pro Ala Ser Thr
    530                 535                 540
Pro Thr Ser Met Phe Met Leu Gly Phe Val Ser Ala Cys Pro Asp Phe
545                 550                 555                 560
Ser Val Arg Leu Leu Arg Asp Thr Ser His Ile Ser Gln Ser Lys Leu
                565                 570                 575
Ile Ala Arg Ala Gln Gly Ile Glu Asp Leu Ile Asp Ser Ala Ile Lys
            580                 585                 590
Ser Ala Leu Arg Val Ser Gln Pro Ser Thr Ala Gln Ser Thr Glu Ala
        595                 600                 605
Thr Ser Gly Ala Asn Ser Gln Glu Val Pro Ala Leu Thr Ala Val Glu
    610                 615                 620
Thr Gly Ala Ser Gly Gln Ala Ile Pro Ser Asp Val Met Glu Thr Arg
625                 630                 635                 640
His Val Ile Asn Tyr Lys Thr Arg Ser Glu Ser Cys Leu Glu Ser Phe
                645                 650                 655
Phe Gly Arg Ala Ala Cys Val Thr Ile Leu Ser Leu Thr Asn Ser Ser
            660                 665                 670
Glu Arg Gly Glu Glu Arg Lys His Phe Asn Ile Trp Asn Ile Thr Tyr
        675                 680                 685
Thr Asp Thr Val Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Phe Phe Thr Tyr Ser
    690                 695                 700
Arg Phe Asp Leu Glu Met Thr Phe Val Phe Thr Glu Asn Tyr Pro Ser
705                 710                 715                 720
Thr Ala Ser Gly Glu Val Arg Asn Gln Val Tyr Gln Ile Met Tyr Ile
                725                 730                 735
Pro Pro Gly Ala Pro Arg Pro Ser Ser Trp Asp Asp Tyr Thr Trp Gln
            740                 745                 750
Ser Ser Ser Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Met Tyr Gly Asn Ala Pro Pro
        755                 760                 765
Arg Met Ser Ile Pro Tyr Val Gly Ile Ala Asn Ala Tyr Ser His Phe
    770                 775                 780
Tyr Asp Gly Phe Ala Arg Val Pro Leu Glu Gly Glu Asn Thr Asp Ala
785                 790                 795                 800
Gly Asp Thr Phe Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asn Asp Phe Gly Val Leu
                805                 810                 815
Ala Val Arg Ala Val Asn Arg Ser Asn Pro His Thr Ile His Thr Ser
            820                 825                 830
Val Arg Val Tyr Met Lys Pro Lys His Ile Arg Cys Trp Cys Pro Arg
        835                 840                 845
Pro Pro Arg Ala Val Leu Tyr Arg Gly Glu Gly Val Asp Met Ile Ser
    850                 855                 860
Ser Ala Ile Leu Pro Leu Thr Glu Val Asp Ser Ile Thr Thr Phe
865                 870                 875
<210>7
<211>2637
<212>DNA
<213>柯萨奇病毒A
<400>7
atgggggctc aagtttcaac gcaaaagacc ggtgcgcac9 agaatcaaaa cgtggcagcc      60
aatggatcca ccattaatta cactactatc aactattaca aagacagtgc gagtaattcc     120
gctactagac aagacctctc ccaagatcca tcaaaattca cagaaccggt taaggactta     180
atgttgaaaa cagcaccagc tctaaactcg cctaacgtgg aagcatgtgg gtacagtgac     240
cgtgtgaggc aaatcacttt aggcaactcg actattacta cacaagaagc agccaatgct     300
attgttgctt acggtgaatg gcccacttac ataaatgatt cagaagctaa tccggtagat     360
gcacccactg agccagatgt tagtagcaac cggttttaca ccctagaatc ggtgtcttgg     420
aagaccactt caaggggatg gtggtggaag ttaccagatt gtttgaagga catgggaatg     480
tttggtcaga atatgtacta tcactacttg gggcgctctg gttacaccat tcatgtccag     540
tgcaacgctt caaaatttca ccaaggggcg ttaggagttt ttctgatacc agagtttgtc     600
atggcttgca acactgagag taaaacgtca tacgtttcat acatcaatgc aaatcctggt     660
gagagaggcg gtgagtttac gaacacctac aatccgttaa atacagacgc cagtgagggc     720
agaaagtttg cagcattgga ttatttgctg ggttctggtg ttctagcagg aaacgccttt     780
gtgtacccgc accagatcat caacctacgt accaacaaca gtgcaacaat tgtggtgcca     840
tacgtaaact cacttgtgat tgattgtatg gcaaaacaca ataactgggg cattgtcata     900
ttaccactgg cacccttggc ctttgccgca acatcgtcac cacaggtgcc tattacagtg     960
accattgcac ccatgtgtac agaattcaat gggttgagaa acatcaccgt cccagtacat    1020
caagggttgc cgacaatgaa cacacctggt tccaatcaat tccttacatc tgatgacttc    1080
cagtcgccct gtgccttacc taattttgat gttactccac caatacacat acccggggaa    1140
gtaaagaata tgatggaact agctgaaatt gacacattga tcccaatgaa cgcagtggac    1200
gggaaggtga acacaatgga gatgtatcaa ataccattga atgacaattt gagcaaggca    1260
cctatattct gtttatccct atcacctgct tctgataaac gactgagcca caccatgttg    1320
ggtgmaatcc taaattatta cacccattgg acggggtcca tcaggttcac ctttctattt    1380
tgtggtagta tgatggccac tggtaaactg ctcctcagct attccccacc gggagctaaa    1440
ccaccaacca atcgcaagga tgcaatgcta ggcacacaca tcatctggga cctagggtta    1500
caatccagtt gttccatggt tgcaccgtgg atctccaaca cagtgtacag acggtgtgca    1560
cgtgatgact tcactgaggg cggatttata acttgcttct atcaaactag aattgtggta    1620
cctgcttcaa cccctaccag tatgttcatg ttaggctttg ttagtgcgtg tccagacttc    1680
agtgtcagac tgcttaggga cactccccat attagtcaat cgaaactaat aggacgtaca    1740
caaggcattg aagacctcat tgacacagcg ataaagaatg ccttaagagt gtcccaacca    1800
ccctcgaccc agtcaactga agcaactagt ggagtgaata gccaggaggt gccagctcta    1860
actgctgtgg aaacaggagc atctggtcaa gcaatcccca gtgatgtggt ggaaactagg    1920
cacgtggtaa attacaaaac caggtctgaa tcgtgtcttg agtcattctt tgggagagct    1980
gcgtgtgtca caatcctatc cttgaccaac tcctccaaga gcggagagga gaaaaagcat    2040
ttcaacatat ggaatattac atacaccgac actgtccagt tacgcagaaa attagagttt    2100
ttcacgtatt ccaggtttga tcttgaaatg acttttgtat tcacagagaa ctatcctagt    2160
acagccagtg gagaagtgcg aaaccaggtg taccagatca tgtatattcc accaggggca    2220
ccccgcccat catcctggga tgactacaca tggcaatcct cttcaaaccc ttccatcttc    2280
tacatgtatg gaaatgcacc tccacggatg tcaattcctt acgtagggat tgccaatgcc    2340
tattcacact tctacgatgg ctttgcacgg gtgccacttg agggtgagaa caccgatgct    2400
ggcgacacgt tttacggttt agtgtccata aatgattttg gagttttagc agttagagca    2460
gtaaaccgca gtaatccaca tacaatacac acatctgtga gagtgtacat gaaaccaaaa    2520
cacattcggt gttggtgccc cagacctcct cgagctgtat tatacagggg agagggagtg    2580
gacatgatat ccagtgcaat tctacctctg accaaggtag actcaattac cactttt       2637
<210>8
<211>879
<212>PRT
<213>柯萨奇病毒A
<220>
<221>misc_feature
<222>(442)..(442)
<223>Xaa可是是任何天然氨基酸
<400>8
Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Thr Gly Ala His Glu Asn Gln
1               5                   10                  15
Asn Val Ala Ala Asn Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr
            20                  25                  30
Tyr Lys Asp Ser Ala Ser Asn Ser Ala Thr Arg Gln Asp Leu Ser Gln
        35                  40                  45
Asp Pro Ser Lys Phe Thr Glu Pro Val Lys Asp Leu Met Leu Lys Thr
    50                  55                  60
Ala Pro Ala Leu Asn Ser Pro Asn Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp
65                  70                  75                  80
Arg Val Arg Gln Ile Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu
                85                  90                  95
Ala Ala Asn Ala Ile Val Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Thr Tyr Ile Asn
            100                 105                 110
Asp Ser Glu Ala Asn Pro Val Asp Ala Pro Thr Glu Pro Asp Val Ser
        115                 120                 125
Ser Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Glu Ser Val Ser Trp Lys Thr Thr Ser
    130                 135                 140
Arg Gly Trp Trp Trp Lys Leu Pro Asp Cys Leu Lys Asp Met Gly Met
145                 150                 155                 160
Phe Gly Gln Asn Met Tyr Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ser Gly Tyr Thr
                165                 170                 175
Ile His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Gly
            180                 185                 190
Val Phe Leu Ile Pro Glu Phe Val Met Ala Cys Asn Thr Glu Ser Lys
        195                 200                 205
Thr Ser Tyr Val Ser Tyr Ile Asn Ala Asn Pro Gly Glu Arg Gly Gly
    210                 215                 220
Glu Phe Thr Asn Thr Tyr Asn Pro Leu Asn Thr Asp Ala Ser Glu Gly
225                 230                 235                 240
Arg Lys Phe Ala Ala Leu Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Val Leu Ala
                245                 250                 255
Gly Asn Ala Phe Val Tyr Pro His Gln Ile Ile Asn Leu Arg Thr Asn
            260                 265                 270
Asn Ser Ala Thr Ile Val Val Pro Tyr Val Asn Ser Leu Val Ile Asp
        275                 280                 285
Cys Met Ala Lys His Asn Asn Trp Gly Ile Val Ile Leu Pro Leu Ala
    290                 295                 300
Pro Leu Ala Phe Ala Ala Thr Ser Ser Pro Gln Val Pro Ile Thr Val
305                 310                 315                 320
Thr Ile Ala Pro Met Cys Thr Glu Phe Asn Gly Leu Arg Asn Ile Thr
                325                 330                 335
Val Pro Val His Gln Gly Leu Pro Thr Met Asn Thr Pro Gly Ser Asn
            340                 345                 350
Gln Phe Leu Thr Ser Asp Asp Phe Gln Ser Pro Cys Ala Leu Pro Asn
        355                 360                 365
Phe Asp Val Thr Pro Pro Ile His Ile Pro Gly Glu Val Lys Asn Met
    370                 375                 380
Met Glu Leu Ala Glu Ile Asp Thr Leu Ile Pro Met Asn Ala Val Asp
385                 390                 395                 400
Gly Lys Val Asn Thr Met Glu Met Tyr Gln Ile Pro Leu Asn Asp Asn
                405                 410                 415
Leu Ser Lys Ala Pro Ile Phe Cys Leu Ser Leu Ser Pro Ala Ser Asp
            420                 425                 430
Lys Arg Leu Ser His Thr Met Leu Gly Xaa Ile Leu Asn Tyr Tyr Thr
        435                 440                 445
His Trp Thr Gly Ser Ile Arg Phe Thr Phe Leu Phe Cys Gly Ser Met
    450                 455                 460
Met Ala Thr Gly Lys Leu Leu Leu Ser Tyr Ser Pro Pro Gly Ala Lys
465                 470                 475                 480
Pro Pro Thr Asn Arg Lys Asp Ala Met Leu Gly Thr His Ile Ile Trp
                485                 490                 495
Asp Leu Gly Leu Gln Ser Ser Cys Ser Met Val Ala Pro Trp Ile Ser
            500                 505                 510
Asn Thr Val Tyr Arg Arg Cys Ala Arg Asp Asp Phe Thr Glu Gly Gly
        515                 520                 525
Phe Ile Thr Cys Phe Tyr Gln Thr Arg Ile Val Val Pro Ala Ser Thr
    530                 535                 540
Pro Thr Ser Met Phe Met Leu Gly Phe Val Ser Ala Cys Pro Asp Phe
545                 550                 555                 560
Ser Val Arg Leu Leu Arg Asp Thr Pro His Ile Ser Gln Ser Lys Leu
                565                 570                 575
Ile Gly Arg Thr Gln Gly Ile Glu Asp Leu Ile Asp Thr Ala Ile Lys
            580                 585                 590
Asn Ala Leu Arg Val Ser Gln Pro Pro Ser Thr Gln Ser Thr Glu Ala
        595                 600                 605
Thr Ser Gly Val Asn Ser Gln Glu Val Pro Ala Leu Thr Ala Val Glu
    610                 615                 620
Thr Gly Ala Ser Gly Gln Ala Ile Pro Ser Asp Val Val Glu Thr Arg
625                 630                 635                 640
His Val Val Asn Tyr Lys Thr Arg Ser Glu Ser Cys Leu Glu Ser Phe
                645                 650                 655
Phe Gly Arg Ala Ala Cys Val Thr Ile Leu Ser Leu Thr Asn Ser Ser
            660                 665                 670
Lys Ser Gly Glu Glu Lys Lys His Phe ASn Ile Trp Asn Ile Thr Tyr
        675                 680                 685
Thr Asp Thr Val Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Phe Phe Thr Tyr Ser
    690                 695                 700
Arg Phe Asp Leu Glu Met Thr Phe Val Phe Thr Glu Asn Tyr Pro Ser
705                 710                 715                 720
Thr Ala Ser Gly Glu Val Arg Asn Gln Val Tyr Gln Ile Met Tyr Ile
                725                 730                 735
Pro Pro Gly Ala Pro Arg Pro Ser Ser Trp Asp Asp Tyr Thr Trp Gln
            740                 745                 750
Ser Ser Ser Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Met Tyr Gly Asn Ala Pro Pro
        755                 760                 765
Arg Met Ser Ile Pro Tyr Val Gly Ile Ala Asn Ala Tyr Ser His Phe
    770                 775                 780
Tyr Asp Gly Phe Ala Arg Val Pro Leu Glu Gly Glu Asn Thr Asp Ala
785                 790                 795                 800
Gly Asp Thr Phe Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asn Asp Phe Gly Val Leu
                805                 810                 815
Ala Val Arg Ala Val Asn Arg Ser Asn Pro His Thr Ile His Thr Ser
            820                 825                 830
Val Arg Val Tyr Met Lys Pro Lys His Ile Arg Cys Trp Cys Pro Arg
        835                 840                 845
Pro Pro Arg Ala Val Leu Tyr Arg Gly Glu Gly Val Asp Met Ile Ser
    850                 855                 860
Ser Ala Ile Leu Pro Leu Thr Lys Val Asp Ser Ile Thr Thr Phe
865                 870                 875