本发明涉及一些用于治疗由RNA病毒引起的疾病(如AIDS)的 新型组合物及方法。本发明也提供了一种制备此类疾病的疫苗的方 法。此外，该组合物还可用于抑制核糖核酸酶。

尽管世界范围的努力，对于人类免疫缺陷病毒(HIV)，迄今为 止，所有试图求助超突变的有规立构聚合物研制出一种有效的抗- AIDS药物或疫苗的努力均告失败。突变的有规立构聚合物至今也同 样妨碍着试图研制出抗-其它RNA病毒所致疾病(诸如白血病和流 感)的有效疫苗的努力。

对付诸如HIV AIDS(获得性免疫缺陷综合征)病毒等RNA病毒 的方法之一，是灭活HIV的逆转录酶(HIV RT)。遗憾的是，由于此 病毒的突变率很高，至今仍无法研制出一种有效的抗-HIV的药物 或疫苗。此高度可变的HIV能迅速对所有已知的小分子量(Mr＜1000 道尔顿)抑制剂(如，叠氮胸苷(AZT)、2′，3′-双脱氧胞苷(ddc)、 2′，3′-双脱氧肌苷(ddI)及nevirapine等)产生耐受性[Larder，et al.，seience243，1731(1989)；Larder and kemp，science 246，1155(1989)；st.Clair，et al.，science 253，1557 (1991)；shih，et al.，proc.Natl.Acad.sci.USA88，9878 (1991)]。

已知(chuan and wang，J.Biol.Chem.263，13003(1981))， 亲和剂3′-O-(5-氟-2，4-二硝基苯基)ADP醚及3′-O-(5-氟-2，4-二硝 基苯基)ATP醚能够标记线粒体F1-ATP酶的活性位点并抑制该ATP酶。 然而，3′-O-(5-氟-2，4-二硝基苯基)ADP醚及相应的ATP醚需要上百 万倍高的摩尔浓度，才能抑制HIV的逆转录酶(HIV RT)，它们均不 能以突变-不敏感的方式抑制HIV RT或其它RNA病毒。

也已知(Fukui and De Clercq，Biochem J 203，755-760及 shannon，Ann.N.Y.Acad.sci.284，472-507)抗病毒化合物，如聚 (2-氟腺苷酸)、聚(2-溴腺苷酸)、聚(2-碘腺苷酸)及1-(4-氟苄氧 基)腺苷聚腺苷酸等，可抑制逆转录酶。所有这些化合物都是通过 将卤素原子或其它基团连接到聚合物中的腺嘌呤残基上衍生而来。 这些化合物中最好的是(fl2A)n，它可抑制鼠白血病逆转录酶，其 IC50为0.04μg/ml。本发明的FDNP-poly[A]能抑制此相同的RT(逆 转录酶)，IC50为0.0017μg/m[l(浓度低23倍)。

本发明的一个实施方案提出了一种组合物，该组合物含有Y- poly[A]，它可用公式Mn(Y)m Xi[A]n表示，其中：

[A]n＝含有n个腺苷酸残基的多聚腺苷酸(5′)，

Y＝FDNP，DNP，或部分为FDNP和部分为DNP，

FDNP＝3-氟-4，6-二硝基苯基，通过醚键共价结合到[A]n的n个

      2′羟基的m个上，

DNP＝2，4-二硝基苯基，通过醚键共价结合到[A]n的n个2′-羟

     基的m个上，

x＝一个酰基，

i＝0或1，

M＝一个阳离子，用来为该组合物提供所需的溶解度， 而且具有如下之一的一般结构： 或 并且其Y基团与腺嘌呤单位的比例至少为约1∶5；其中的n足够大， 使得Y-poly[A]能完全彻底地填充RNA病毒逆转录酶的活性位点裂口， 从而有效地灭活逆转录酶，和/或能有效地灭活核糖核酸酶。

本发明的另一个实施方案包括一种治疗一种由RNA病毒所致疾 病的哺乳动物的方法。该方法包括给该哺乳动物施用有效治疗剂量 的Y-poly[A]。

本发明的另一个实施方案是一种暂时性地保护一种健康哺乳动 物免受RNA病毒感染的方法。该方法包括给该哺乳动物施用有效预 防剂量的Y-poly[A]。

本发明的另一个实施方案包括制备抗-RNA-病毒疫苗的方法 及接种疫苗以提供对RNA病毒所致疾病的预防的方法。该方法包括， 向一个病人引入一种抗原，此抗原包括一种已被Y-poly[A]不可逆 地灭活的RNA病毒，其中的Y至少部分为FDNP，从而使病人产生一种 或多种抗该抗原的抗体，这些抗体也包括抗RNA病毒的抗体。

本发明的另一个实施方案包括一种在用于输注的血液等分样品 中消除RNA病毒的方法。该方法包括，向此血液等分样品中加入有 效消毒剂量的Y-poly[A]，其中的Y至少部分为FDNP。

本发明的另一个实施方案包括一种从溶液中去除核糖核酸酶的 方法。该方法包括，将此溶液通过一个含有固相化FDNP-poly[A]或 DNP-poly[A]的亲和柱。

核糖核酸酶也能通过在核糖核酸酶溶液中加入有效量的 Y-poly[A]被不可逆地抑制，其中Y至少部分为FDNP。

根据本发明的一个实施方案的另一个有用的方法是不可逆地灭 活RNA病毒。该方法包括将该RNA病毒与一种灭活此RNA病毒有效剂 量的FDNP-poly[A]接触。

本文提出了一种新型的聚合物抑制剂，它能紧紧地结合到并完 全彻底地填充HIV逆转录酶(HIV RT)活性位点上的长结合裂口上。 我们合成了这种新型抑制剂，并且发现它可迅速灭活溶液中的HIV RT，而且，如果其Y-poly[A]中的Y至少部分不可逆地是FDNP时，它 能使易感性淋巴细胞在往培养皿中加入活的HIV后仍能继续它们的 正常生长。该抑制剂中，DNP-和/或FDNP-基团共价结合到聚合物 的核糖残基上。这些抑制剂是功能-特异性的，因此其毒性低，但 不是种属-特异性的，因而被认为是突变-不敏感性的(mutation- insensitive)。本文公开了这种组合物和其在五种不同的药学和生 物技术学应用中这些新型化合物的使用方法。基于以下的基本原理， 我们研制出了一组突变-不敏感性的抑制剂。

最近的晶体学研究表明：HIV RT中的聚合酶位点包含一个开放 末端裂口(open-end cleft)，此裂口的长度足以容纳一个长度为25 至30个残基的RNA片断[K＜i，et al.，science 256，1783(1992)； Arnold，et al.，Nature 357，85(1992)]。可以推测，此活性裂 口优先地结合多聚腺苷酸(5′)(以下简称“poly[A]”)，因为 poly[A]-[dT]12复合物已被成功地而且相当频繁地作为模板-启动 子(template-promoter)使用于体外逆转录实验中。因此，将疏水 基团连接到poly[A]的2′-OH位置上，以改善与RT的结合亲和性，而 不影响其模板功能。所得的poly[A]衍生物能够结合到HIV RT上， 完全彻底地填充其活性位点裂口，并可作为一种多功能亲和剂。

鉴于惯常使用sanger试剂1-氟-2，4-二硝基苯基来标记蛋白质 的亲核基团，我们把亲电子的3-氟-4，6-二硝基苯基(FDNP)基团通 过醚键结合到poly[A]的2′-OH位置上，方法参照已发表的用于单核 苷酸的程序[chuan and wang，J.Bi0l.Chem.263，13003(1981)， 其内容引入本文作为参考]。这些亲电子的FDNP基团不可逆地与逆 转录酶活性位点裂口的亲核基团反应并与其结合，因此可阻断逆转 录酶的作用。所获得的聚合物衍生物(称为FDNA-poly[A])的结构， 可用如下所示的结构式表示，其通式为：Mn(FDNP)mXi[A]n，其中：

[A]n＝含有n个腺苷酸残基的多聚腺苷酸(5′)，

FDNP＝3-氟-4，6-二硝基苯基，通过醚键共价结合到[A]n的n个

      2′-羟基的m个上，

x＝一个酰基，

i＝0或1，

M＝一个阳离子，用来为该组合物提供一个所需的溶解度， 并且具有如下之一的一般结构： 或

我们进一步发现，DNP-poly[A]在灭活逆转录酶及核糖核酸酶 中也有效。事实上，虽然DNP-poly[A]的作用是可逆的，发现，如 果每1.5个腺嘌呤残基结合一个DNP-基团，此DNP-poly[A]的效率约 是FDNP-poly[A]的12倍(也就是说，其十二分之一的剂量具有相同 的效率)。此聚合物衍生物(称为DNP-poly[A])具有如下所示的 结构式。用通式表示：Mn(DNP)mXi[A]n，其中：

[A]n＝含有n个腺苷酸残基的多聚腺苷酸(5′)，

DNP＝2，4-二硝基苯基，通过醚键共价结合到[A]n的n个2′-羟

     基的m个上，

x＝一个酰基，

i＝0或1，

M＝一个阳离子，用来为该组合物提供一个所需的溶解度， 并且具有如下之一的一般结构： 或

在这两种情况中，n都足够大，使得Y-poly[A](其中Y＝DNP、 FDNP或部分为DNP另一部分为FDNP)能完全彻底地填充RNA病毒逆转 录酶的活性位点裂口，从而有效地灭活逆转录酶和/或能有效地灭 活核糖核酸酶。一般最好n相对较大，以20或更大为合适，25或更 大则更优。下面陈述的实验用于制备一个相对较高分子量的 Y-poly[A](h-Mr)、n≈270、m≈69、Mr≈1.1×105(其中Mr代表 分子量)以及用于制备一个相对较低分子量的Y-poly[A](l-Mr)、 n≈28、m≈9、Mr≈1.2×104    

FDNP基团一般能以FDNP基/[A]不超过1∶4的比例结合到poly[A] 上，DNP基团则能以一个相当高的比例(约1∶1.5)结合到poly[A] 上。也能合成混合型的FDNP/DNP-poly[A]聚合物。一般地，首先使 1，3-二氟-2，4-二硝基苯(DFDB)与poly[A]起反应，所得产物的FDNP /[A]的比例为约1∶4～约1∶10。然后，使此产物与1-氟-2，4-二硝基 苯(FDNB)起反应。如此获得的合成物就有一个尽可能高的(FDNP＋ DNP基团)/[A]的总比例，一般能大于l∶4，更优的能大于1∶2。

阳离子(M)可以是任何一种阳离子，只要它能使该合成物达到 一个足够的浓度以完成预期的目的，如灭活核糖核酸酶、治疗一种 由RNA病毒引起的疾病、生产可用于接种的灭活(死的)病毒、消 毒贮存的血液等等。在此报告的实验中用的是钾盐，不过，也可用 例如铵盐、铷盐、铯盐或其它盐来替代。

一个重要的因素是Y基团与[A](腺嘌呤)单位的摩尔比。一般 地说，单个Y-poly[A]化合物的效率随着Y/[A]的摩尔比的增加而增 加。因此，理想的是，此比例能相当高。一般，此比例至少应为约 1∶10，如果比例能更高些，如1∶5或更高，则更优。在此报告的实 验则是用比例为1∶1.5、1∶3.9及1∶4.8的Y-poly[A]化合物进行的。 更高的比例将更理想。

我们发现，在纳摩尔浓度时，Y-poly[A]即是一种逆转录酶的 有效抑制剂，因而它似乎是一种有效的抗-RNA病毒的治疗药物(而 且也是一种有效的和，当Y至少部分为FDNP时，不可逆的核糖核酸 酶的抑制剂)，而即使在微摩尔浓度下，它也不会抑制主要的宿主 细胞酶(是在体外试验中进行检测的)，包括RNA-聚合物II、 cAMP-依赖的蛋白激酶、丙酮酸激酶、己糖激酶及腺苷酸激酶。因 此，可制定出既能有效地、不可逆地抑制RNA病毒中的逆转录酶， 又不会抑制基本的细胞酶的剂量配方。Y-poly[A]能与核糖核酸酶 结合，此功能可用来灭活和/或去除溶液中的核糖核酸酶。例如， 可把Y-poly[A](其中至少有一部分Y是FDNP)加到核糖核酸酶的溶 液中，从而不可逆地抑制核糖核酸酶。另一种方法，也是更可取的 一种方法是将Y-poly[A]与一种亲和材料结合(一般常与亲和柱相 连)，然后将含核糖核酸酶的溶液流过该柱，其中的核糖核酸酶被 吸附到柱上，从柱中流出的溶液即为无核糖核酸酶的溶液。当使用 此柱技术时，Y-poly[A]最好是DNP-poly[A]，因为FDNP-poly[A]中 的FDNP基团在柱上会被水解，而一个DNP-poly[A]柱则能经洗涤后 再次使用。所用的柱材料并不严格，实际上只要是Y-poly[A]能被 结合上去的任何柱材料都行。例如，我们曾用过一个纤维素柱。

一个长的抑制剂分子(诸如Y-poly[A]，其FDNP基团的多个点 可与HIV RT活性位点处的许多特定的氨基酸残基共价结合，或其 DNP基团的多个点可与HIV RT活性位点处的许多特定的氨基酸残基 非共价结合)，可选择作为一种可能的突变-不敏感性抑制剂，因 为某一次随机突变极不可能改变所有这些特定的氨基酸残基，以致 此突变型的酶不能再结合Y-poly[A]，但仍能结合模板poly[A]。为 了能继续生存，这种高度可变性的HIV必须含有一种保持着一个长 的活性位点裂口的RT。这种存活的突变型HIV RT要避免与此种抑制 剂的结合，将是非常困难的。这一推论已被以下的观察所证实：尽 管HIV RT、禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV RT)及莫洛尼鼠白血 病病毒逆转录酶(MLV RT)的一级结构有极大的差别，但这三种逆转 录酶在25℃下，在10分钟或更短的时间内，均被纳摩尔浓度的FDNP -poly[A]所灭活。

经我们要求，由美国国立癌症研究所(NCI)癌症治疗部(the Division of Cancer Treatment)在治疗开发计划中(the Develop- mental Therapeutics program)，对Y-poly[A](h-Mr)和Y-poly[A] (1-Mr)作为可能的抗-HIV药物，与易感的淋巴细胞和HIV一起进行 体外试验。结果发现，这些活性聚合物能有效地保持HIV中的淋巴 细胞的存活(见下文实施例5)。

由于这些聚合物是被设计用来灭活所有的逆转录酶的，因此它 们也能被用来治疗由RNA病毒所致的其它疾病，例如：成人T细胞白 血病/淋巴瘤，甲-、丙-、丁-、戊-型肝炎，流感，副流感 (parainfluenza)，婴儿细支气管炎和肺炎，普通感冒，麻疹，流 行性腮腺炎等等。因此，由以下的RNA病毒(并不局限于所列举的) 引起的疾病都可用本发明进行控制，如HTLV(成人T细胞白血病/淋 巴瘤病毒)、HAV(甲型肝炎病毒)、HAC(丙型肝炎病毒)、HDV(丁型 肝炎病毒)、HAC(戊型肝炎病毒)、HEV(流感病毒)、副流感病毒、 RSV(呼吸合胞体病毒)、引起普通感冒的冠病毒(coronavirus)和鼻 病毒、麻疹病毒、以及流行性腮腺炎病毒。其它RNA病毒所致的疾 病也同样可用本发明控制。

为了使本发明被更好地理解，可参看以下实施例。

实施例1

Y-poly[A](h-Mr)的制备 程序1：

将10毫克多聚腺嘌呤钾盐(购自Sigma，Mr～1.1×105)溶于 含0.5ml水和1.6ml 0.2M K2CO3＋1.5M KHCO3的溶液(pH9.2) 中。搅拌下，将0.8ml含10倍过量的1，3-二氟-2，4-二硝基苯(DFDB 的丙酮溶液分三次等量加入上述溶液，每次间隔十二小时。室温下 反应48小时后，用7∶1(V/v)的二氯甲烷和二甲基亚砜混合溶剂多 次萃取过剩的DFDB。所获得的水溶液用Sephadex G-25-80进行离心 凝胶过滤，然后冻干。产物中3-氟-4，6-二硝基苯基与腺嘌呤基的 摩尔比可以通过分别观测330nm及259nm处的吸光率计算而得：摩 尔比为1/3.9，其中以3-氟-4，6-二硝基苯基乙醚(ε259＝3900，ε330 ＝6300)和一磷酸腺苷(AMP)(ε259＝15400)作为标准品。这样，聚 合物抑制剂平均每分子中含有270个腺嘌呤残基和69个2′-O-FDNP基 团。当pH值从9降低至5后，FDNP-poly[A](h-Mr)稀释溶液的吸光 率降低并不显著(＜5％)。这一观察表明，在制备过程中已被水解 成不反应的3-羟基-4，6-二硝基苯基基团的3-氟-4，6-二硝酸苯基基 团部分，在产物中所占的比例小于5％。产量＝3mg。 程序2：

将10毫克的多聚腺嘌呤钾盐(购自Sigma，Mr～1.1×105)溶 于0.5ml水和0.1ml 0.1M K2CO3＋2.0M KHCO3的溶液(PH＝8.8) 中。搅拌下，将0.4ml含5倍过量的1，3-二氟-2，4-二硝基苯的丙酮 溶液分四次等量加入上述溶液中，每次间隔6小时。在反应过程中， 检测反应混合液的pH，并加入K2CO3和KHCO3以调整pH至8.8。并通过 对反应混合液的薄层层析分析(TLC分析)监测反应的进程(它是 时间的函数)：将混合液滴在含有荧光指示剂的柯达纤维素平板上， 用(20mM K2HPO4＋20mM KH2PO2)∶CH3CN＝2∶1(V/V)作为展开剂。 最后，所有来自polyA的在Rf＝0.38处的带都变弱，而在Rf＝0.77 处一条新的FDNP-polyA的带变强。继续反应直至在Rf＝0.38处的带 消失后，一般是在室温下进行24小时以后，过剩的DFDB用7∶1(v/v) 的二氯甲烷和二甲基亚砜多次萃取移去。所得的水溶液用Sephadex G-50-80凝胶过滤或进行透析，然后冻干。产物中的3-氟-4，6-二硝 基苯基与腺嘌呤基团的摩尔比，可以从330nm和259nm处分别观察 到的吸光率计算而得，为1/4.8，其中，用3-氟-4，6-二硝基苯基乙 醚(ε259＝3900，ε330＝6300)和一磷酸腺苷(ε259＝15400)作为标准 品。此1/4.8的FDNP/腺嘌呤比例已被19F-NMR和31P-NMR两种核磁共 振证实。

尽管与程序2相比，程序1所得产物的FDNP基与腺嘌呤基团的比 率比较高、比较理想，但我们发现，反应48小时后，约有5％的5- 氟基团被水解成羟基。当反应被限定在24小时时，则并没有发现水 解作用。由于水解产物不能与产物分离，因此，程序2更优。

用1-氟-2，4-二硝基苯(FDNB)代替DFDB，可按程序2相似的方法 合成DNP-poly A。在合成DNP-poly A时，让poly A与过量的FDNB在 室温下反应48小时，产物DNP-poly A中DNP基团与腺嘌呤残基的摩 尔比为1/1.5。该比率高于FDNP-poly[A]中获得的比例，因为后者 为了避免5-氟基团发生明显的水解作用，于48小时后终止了反应。

实施例2

FDNP-poly[A](l-Mr)的制备

将867mg二磷酸腺苷(ADP，钾盐)、25mg一磷酸腺苷(AMP， 游离酸)和393mg K2CO3溶于4ml水中，制得摩尔比为28∶1的ADP和 AMP的混合液。不断添加固体K2CO3，使溶液的pH值从8.2变到9.05。 然后把该溶液与20μl含有1M MgCl2和8单位多聚核苷酸磷酸化酶 (购自Sigma，从大肠杆菌中制得)的溶液混合。将混合液在37℃ 下孵育48小时后，通过Sephadex G-25-80进行离心凝胶过滤以除掉 所有ADP、AMP及分子量低于5000的寡聚核苷酸。测定259nm处的吸 光率，显示滤液中含有63mg产物FDNP-poly[A](l-Mr)。取1小份 该FDNP-poly[A](l-Mr)溶液，过sephadex G-50-80柱进行第二次 凝胶过滤，表明用这种方法制得的寡聚物中，有99.7％分子量Mr＜ 10000。随后，用与前面所述相似的方法，使该FDNP-poly[A](l- Mr)与FDNB发生反应，以生成FDNP-poly[A](l-Mr)，FDNP基团/腺嘌 呤残基的摩尔比＝1/3.9。

按上述程序2也合成了FDNP-poly[A](l-Mr)，得到的产物其 FDNP/腺嘌呤的摩尔比为1/4.8。DNP-poly[A](l-Mr)的制备方法相 似，产物的DNP/腺嘌呤的摩尔比为1/1.5。

实施例3

用FDNP-poly[A]对溶液中的病毒逆转录酶的不可逆性抑制

将来自HIV的逆转录酶(HIV RT)样本、来自莫洛尼鼠白血病病 毒的逆转录酶(MLV RT)样本、以及来自禽类成髓细胞瘤病毒的逆转 录酶(AMV RT)样本，分别与FDNP-poly[A]一起，在内含1mM MgCl2和125mM KCl的Tris-HCl缓冲液(0.1M，pH8.2)中，25℃下孵育， 并测定RT的活性。每次实验中，所选的酶都在25℃下与给定浓度的 抑制剂的钾盐孵育10分钟。10分钟后，将孵育混合液迅速注入一测 定液中，并在37℃下再孵育10分钟，然后用三氯乙酸沉淀。经洗涤 后，用闪烁计数法测定生成的放射性多聚核苷酸。测定混合液内含 125mM Tris-HCl(pH 8.2)、1mM MgCl2、125mM KCl、250μM [3H]dTTP(作为底物)、和23nM poly[A]-[dT]12(作为模板)。

将每一种逆转录酶与FDNP-poly[A]在25℃下预孵育l0分钟所观 测到的残留酶活性的百分率作为抑制剂浓度的函数作图，并从图中 确定出抑制50％酶活性时所需的抑制剂浓度(IC50)。结果总结如下。 用DNP-poly[A]也得到相似的结果。

  酶           抑制剂          IC50(nM)

HIV RT    FDNP-poly[A](h-Mr)     6pM

HIV RT    FDNP-poly[A](1-Mr)   400nM

MLV RT    FDNP-poly[A](h-Mr)    15pM

AMV RT    FDNP-poly(A](h-Mr)    12pM

观测所得的IC50值显示，DNP-poly[A](h-Mr)、FDNP-poly[A] (h-Mr)和FDNP-poly[A](l-Mr)在水溶液中均是逆转录酶的强抑制 剂。动力学测定表明，DNP-poly[A]和FDNP-poly[A]都是与模板- 引物多聚腺苷酸-十二胸苷酸(poly[A]-[dT]12)竞争HIV RT分子中 的相同结合位点。将孵育后的混合液加到纤维素-寡聚[dt]柱上然 后用洗脱层析分离，结果显示，FDNP-poly[A]与逆转录酶是以共价 键相连。因此，它对酶的灭活作用是不可逆的。

上面的数据也显示了，尽管在一级结构上有显著的差异，这三 种病毒逆转录酶(HIV RT、MLV RT及AMV RT)均被亚纳摩尔浓度的 FDNP-poly[A]在25℃下作用10分钟后所灭活。这有力地说明了FDNP -poly[A]是突变-不敏感性的。

实施例4

DNP-poly[A]和FDNP-poly[A]对不同HIV逆转录酶的抑制 DNP-poly[A]和FDNP-poly[A]对不同的突变型HIV RT的抑制作 用由Joe C.wu博士免费测定，其中逆转录酶来自4株不同的人类病 毒：HIV-1 RT(野生型)、HIV-2(野生型)、HIV-145,215RT(AZT -耐受突变型，Thr(苏氨酸)215→Tyr(酪氨酸)，Met(甲硫氨 酸)41→Leu(亮氨酸))、及HIV-1181CRT(Nevirapine-耐受突 变型)，用poly C-[dG]12-18作为模板、[3H]dGTP作为底物。检测条 件与实施例3中的相同。观测到的IC50值总结如下表： 抑制剂                          逆转录酶的IC50(nm)

                     HIV-1(野生型)        HIV-2(野生型) DNP-poly[A]                3.8±0.5             1.6±0.2 poly[A]                    --------             -------- FDNP-poly[A]               1.5±0.6             1.1±0.2                            HIV-1141，215        HIV-2181C DNP-poly[A]                2.2±0.3             0.34±0.07 poly[A]                    --------             -------- FDNP-poly[A]               1.2±0.3             0.65±0.11

从这些实验，我们发现，DNP-poly[A]和FDNP-poly[A]两者都 是所有这四种逆转录酶的强有力的抑制剂，而poly[A]本身并没有 抑制作用。

实施例5

DNP-、FDNP-poly[A](h-Mr)和FDNP-poly[A](l-Mr)对易感的 淋巴细胞的抗HIV防护

由美国国立癌症研究所(NCI)癌症治疗部的治疗开发计划对 FDNP-poly[A](h-Mr)、DNP-poly[A](h-Mr)及FDNP-poly[A](1- Mr)作为可能的抗-HIV药物，使其与敏感的淋巴细胞与HIV在一起， 作了体外试验检测。确认这三种抑制剂均是有效的。国立癌症研究 所草案中包括：在微培养板中，把各种不同浓度的FDNP-poly[A] (h-Mr)、DNP-poly[A](h-Mr)或FDNP-poly[A](l-Mr)与易感的T4 淋巴细胞(CEM-SS细胞系)混合，其中含或不含HIV，将这些培养板 孵育6天，然后用比色终点法测定剩下的活细胞数(方法参考 Weislow，et al.，J.Natl.Cancer Inst.81，577-586(1989))。

试验结果显示，在HIV存在的情况下，FDNP-poly[A]和DNP- poly[A]均可有效地保持淋巴细胞的存活力。观测到的有效浓度 (EC50)为：FDNP-poly[A](h-Mr)为2.65±0.15μg/ml或24±2nM， DNP-poly[A](h-Mr)为0.2±0.1μg/ml或2±1nM。因此，这些聚 合物都是有效的抗病毒试剂。两种聚合物的可溶性盐，均可直接用 来治疗被HIV感染的哺乳动物。其施药方式为配成适当的溶液经非 肠胃给药，或制成药丸口服给药。

实施例6

在37℃下，0.01M HCl中并存在胃蛋白酶时Y-poly[A](h-Mr) 的稳定性

人体胃液中含有胃蛋白酶和大约0.01M的HCl。为了模拟人体 胃内的酸性环境，我们将FDNP-poly[A]在0.01M HCl中37℃下孵育， 结果发现0.01M HCl中孵育4小时以后，它作为HIV RT的一种不可 逆性抑制剂，其功效仅下降50％。并发现DNP-poly[A]在同样的条 件下具有更高的稳定性。有关FDNP-poly[A]的结果列于下表。

37℃下孵育时间(小时)    0    1/2    1     2    4

IC50(nM)              27    22    22    2l    34

在另一个单独的实验中，将FDNP-poly[A](h-Mr)(34nM)在 37℃下、内含1.0mg/ml胃蛋白的0.01M HCl溶液中进行孵育。发 现2小时后抑制剂的功效并不受影响，但孵育4小时后，其功效下降 到65％。这些观察结果提示，在胃液环境中，FDNP-poly[A]的抗 HIV能力在2小时之内不会被破坏。因此，FDNP-poly[A]的固体盐可 以与适当的掺入物混合，压成药丸或包装成胶囊，用于口服给药。

实施例7

FDNP-poly[A]在37℃下人血清中的稳定性

一份正常人血清冷冻标本(男性，AB型，购自Sigma)，解冻 后用来溶解FDNP-poly[A](h-Mr)(34nM)。HIV RT的这种抑制剂 的相对抑制效力，可以以37℃下，作为孵育时间的一个函数来确定， 并列于下表：

孵育时间(小时)     0    0.5    1.0    2.0    4.0

相对于效力(％)    100    95     91     93     80

由于人血清中的FDNP-poly[A]在37℃下，孵育4小时后，其效 力减少不超过20％，因此，该化合物可溶于适当的溶液中，用于非 肠道给药。

实施例8

使用FDNP-poly[A]完全而有效地灭活HIV：用于研制有效的抗 -HIV疫苗

被FDNP-poly[A](或Y-poly[A]，其中Y部分为FDNP)完全而不 可逆地灭活的HIV，也可以用作一种完全抗原，用于研制一种有效 的抗-AIDS疫苗。

全世界都在致力于发现一种预防AIDS的有效疫苗，至今尚未成 功。用AIDS病毒的基因工程片段研制而成的疫苗，不能提供对AIDS 的充分防护，其主要原因是病毒具有极高的突变率。最后报道了一 种活的HIV减毒疫苗，在其nef基因中有一缺失，这种疫苗具有令人 鼓舞的保护性作用[Daniel，et al.，science 258，1938(1992)]。 这一新发现提醒了以往实践中的研究人员，可利用完整病毒的减弱 变形体(weakened version)来触发保护性的免疫反应。例如，活病 毒可用甲醛处理，使其减弱，这种减弱的病毒可以用作抗原以触发 免疫反应。但是，这是一个具有危险的程序，因为在醛和氨基之间 形成席夫碱的反应是可逆的，该缩合反应的逆转将会重新产生全活 性病毒，这对于病人来说是致命的。

由于Y-poly[A](其中Y至少部分为FDNP)可以使HIV发生100％ 有效和不可逆的失活，因此可利用Y-poly[A](其中Y至少部分为 FDNP)为人类研制出一种真正有效的抗-AIDS疫苗-把灭活的HIV 作为抗原导入病人体内，例如注射给病人。

实施例9

对贮存的输注用血液中可能存在的痕量活HIV的灭活

由于捐献的血液中有可能存在即使是痕量的活HIV，对受血者 (同样地也对血液输注人员)构成一种长期性威胁。那么可在存入 血库之前，往捐献的血液中加入很少但足够量的Y-poly[A](其中Y 至少部分是FDNP)。由于不可逆性抑制剂的IC50会随时间的延长而 减小[Kang and Wang，J.Biol.Chem.，in press，May 1994]，当 作为一种安全措施时，该加入的Y-poly[A]能把在贮存过程中可能 存在的痕量HIV灭活。

为了检测Y-poly[A]的有效性，把HIV RT(57nM)与不同浓度 的抑制剂(FDNP-poly[A](h-Mr))在25℃下孵育10分钟。孵育后所 剩的原始酶活性的百分率列于下表：

抑制剂浓度(nm)    酶活性(％)

    0                100

   1.6                89

   4.8                72

  16.7                54

   25                 42

   33                 29

   42                 15

   50                  6

   55                  2

   60                  0

实施例10

FDNP-poly[A]对核糖核酸酶的不可逆性抑制

在生物技术工业及相关的研究室里，经常需要分离未受损的 RNA大片段。为了避免RNA产物被痕量外源性核糖核酸酶作用，发生 偶然裂解，常需要加入焦碳酸二乙酯(DEPC)把所有溶液预先煮一下， 或者加入一种核糖核酸酶的抑制剂，通常是用可买到的商品RNasin (可购自Promega)。对于大规模操作来说，这两种程序都是很昂 贵的。我们发现，Y-poly[A](其中Y至少部分为FDNP)是核糖核酸 酶的有效且不可逆的抑制剂，加入少量但已足够量的这种Y-poly[A] 既能不可逆地灭活可能存在于加工处理过程中所用的溶液或容器中 的痕量核糖核酸酶。这种Y-poly[A]作为核糖核酸酶的有效抑制剂， 其有效性可以从下面的实验中看出来。

核糖核酸酶A(RNase A)的催化活性是通过监测300nm处的吸 光率(A300)随时间而减少来确定，因为在25℃下，溶液中的胞苷- 2′，3′-环一磷酸(cCMP)被不断催化水解。检测液为内含1.9mM cCMP(钠盐)的50mM醋酸盐缓冲液(pH5.0)。无FDNP-poly[A]的 对照反应是将10μl 54.4μM的RNase A贮液注入到2.000ml检测液 中，混匀并监测A300随时间的减小。做抑制研究时，则先把RNase 与各种不同浓度的FDNP-poly[A](h-Mr)预孵育1.0分钟，然后注入 到cCMP溶液中开始检测。结果总结如下。所有RNase的最终总浓度 均为268nM，抑制剂浓度为54μM。 FDNP-poly[A]的总      0     0.5   0.8   1.3   1.7  2.3 预孵育浓度(μM) 混均后1分钟所剩的    100     89    73    48    25    0 起始RNase活力(％)

这些数据表明，即使是在亚微摩尔浓度，每个FDNP-poly[A]分 子都能迅速灭活很多外源性RNase分子。

实施例11

双螺旋DNP-polyA-poly[dT]的有效性

双螺旋DNP-polyA-poly[dT]已被发现是比DNP-polyA更有效的 HIV-1 RT的抑制剂。这种双螺旋DNP-poly[A]-poly[dT]可以通过混 合两种组分并在90℃下加热5分钟而生成。

以poly C-[dG]12-18作为模板-启动子，[3H]TTP作为HIV-1 RT 的底物，得到下表中所列的数据。 抑制剂浓度                            5nM  10nM  20nM 被DNP-poly[A]抑制的百分率             44    81    94 被DNP-poly[A]-poly[dT]抑制的百分率    93    98    100 很明显，双螺旋DNP-poly[A]-poly[dT]是比单链DNP-poly[A]更好 的HIV-1 RT的抑制剂。

实施例12

DNP-poly[A]向人细胞的自发迁移

将100μl成人淋巴细胞样本(2×106个细胞)与100μl RPMI (Roswell Park Memorial Institute)培养基和60μl DNP[14C]poly[A](1.3mg/ml，比放为120cpm/pmole)混合。将混 合液在37℃下孵育，并且每隔一段时间取出50μl等分液，经过滤、 洗涤后测定其放射性：将每一等分液点在一片滤膜上(FA1.0μm， Millipore)，抽滤，并用100mM KCl水溶液洗涤8次。最后每个已 干燥的附有细胞的滤膜用液体闪烁计数系统作放射性检测。下面是 来自一个典型实验的数据。 孵育时间(小时)     0.1    0.5     3      24     48 每分钟计数(cpm)    800    900    1300   1800   2200 这些数据表明，通过扩散作用或细胞内吞作用，疏水的 DNP[14C]poly[A]能自发地迁移到成人的淋巴细胞中。而在相同条 件下，[14C]poly[A]则根本不能进入这些淋巴细胞中。

实施例13

DNP-poly[A]向鼠白血病病毒的自发性迁移

在一模型实验中，用莫洛尼鼠白血病病毒和DNP-poly[A]来演 示抑制剂能自发迁移到逆转录病毒(retrovirus)中。每次实验中， 5μl的病毒悬浮液与37.5nMDNP-poly[A]一起在冰上孵育。一段 时间后，混合液经100,000g离心10分钟。小心移除上清液并将沉 淀(实际上看不见)用200μl Tris缓冲液(50nM Tris-HCl，pH 7.8)洗涤。将沉淀在检测缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.8，60mM KCl、2mM DTT和0.6mM醋酸锰)中搅匀，然后与0.02 poly[A]-寡 [dT]、1.5mM[3H]dTTP及0.1％Triton-100一起在37℃下孵育60 分钟。用10％的TCA终止反应。测定所沉淀的放射性产品[3H]poly [dT]的cpm，以计算逆转录酶的催化活性(A)。实验数据总结于下表 中，其中A°代表与抑制剂一起孵育前的原始催化活性。 孵育时间(小时)    0    0.16    0.5     1.0      24      48 A/A°             1    0.54    0.50    0.45    0.25    0.16 这些数据显示，DNP-poly[A]可以穿透鼠白血病病毒的包膜并且抑 制其中的逆转录酶。这些数据表明，FDNP-poly[A]也能穿透HIV的 包膜(envelop)并且产生一种永久性灭活的HIV，此灭活的HIV适合 于用作抗-AIDS疫苗的一个理想的抗原。而在相同的条件下， [3H]poly[dT]则根本不能进入此病毒。 工业上的实用性：

本发明提供了一种组合物，该物质可用于治疗RNA病毒引起的 病(如AIDS)；可用于贮存的输注用血液中的HIV的消毒；并可提 供针对RMA病毒所致疾病的疫苗。

在描述了本发明及其特殊的实施方案之后，我们将了解到，本 发明还可作进一步的修改，并且本申请的目的旨在覆盖凡遵循本发 明原理的各种变化、应用、改编，并包括根据本发明所属技术领域 里公知和习惯方法、和使用上文提出的实质特征、和落入本发明和 所附权利要求范围内的所有变化。

这一申请是1993年2月24日提出的、编号为08/022,055、有待 审批的申请的部分延续。