一种重组间充质干细胞在制备免疫抑制剂中的应用
阅读：1026发布：2020-09-09
专利汇可以提供一种重组间充质干细胞在制备免疫抑制剂中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种重组间充质干细胞在制备免疫 抑制剂 中的应用。具体涉及一种细胞膜上表达趋化因子受体CCR7的重组间充质干细胞，该重组间充质干细胞输注后可体内靶向迁移进至次级淋巴器官，并在二级淋巴器官中的T细胞富集区大量聚集，可以高效地抑制T细胞的免疫反应，在 治疗 骨髓移植后的移 植物 抗宿主病、器官移植后的免疫排斥反应以及自身免疫性 疾病 中可减少成本、减少细胞用量、减轻 副作用 。更特别的是，治疗中保留了 机体 杀伤 肿瘤 细胞的效应，为临床上治疗肿瘤高危人群的骨髓移植后的移植物抗宿主病、器官移植后的免疫排斥反应以及 自身免疫性疾病 提供了高效且有益的新策略。，下面是一种重组间充质干细胞在制备免疫抑制剂中的应用专利的具体信息内容。
1.一种重组间充质干细胞在制备免疫抑制剂中的应用，其特征在于，该重组间充质干细胞是通过在间充质干细胞的细胞膜上表达趋化因子受体CCR7来获得的，该免疫抑制剂应用于肿瘤高危人群的造血干细胞移植后的移植物抗宿主病、器官移植后的免疫排斥反应和/或自身免疫性疾病。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组间充质干细胞为自体来源、异体来源或商业来源。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述在间充质干细胞的细胞膜上表达趋化因子受体CCR7的方法包括：采用基因转染的方法将CCR7的基因导入到间充质干细胞中，使间充质干细胞细胞膜表达CCR7；通过载体转染体系，使间充质干细胞细胞膜表达CCR7；采用Trogocytosis的方法，通过抗原提呈细胞将CCR7提呈到间充质干细胞的细胞膜上；或者通过现有细胞膜蛋白改构或外接蛋白来实现。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因转染的方法，包括病毒载体转染体系和非病毒转染体系。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述病毒载体转染体系是腺相关病毒AA-V、慢病毒、腺病毒Ad-V、杆状病毒、疱疹病毒和逆转录病毒转染体系中的任一种或几种。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述非病毒转染体系是质粒载体转染体系、壳聚糖纳米粒转染体系或裸基因转染体系。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤高危人群为：1)45岁以上的中老年人群；2)遗传因素造成的高危人群：三代以内的直系或旁系亲属罹患恶性肿瘤的病史；3)有不良生活习惯的人群：长期大量吸烟、长期酗酒、药物滥用、长期过度劳累、熬夜、生活压力大、工作压力大、长期有不良情绪、性格抑郁或使用手机频率高的人群；4)有不良饮食习惯的人群：偏食、营养不良、饮食不洁、饮食不规律、进食速度慢、经常进食过热过硬过辣食品或经常进食腌制熏制油炸食品；5)职业因素长期接触有毒有害物质的人群；6)生存环境遭污染的人群：水源和/或空气化学污染、重金属污染、核污染、微生物污染或长期生活在雾霾天气中的人群；7)有慢性或反复性炎症人群：慢性支气管炎、慢性乙型肝炎病毒感染者、艾滋病毒感染者、慢性宫颈炎、慢性胃炎、胃息肉、胃溃疡、乳腺炎、乳腺慢性增生、肠息肉、胆囊息肉、前列腺炎、鼻窦炎或长期功能性子宫出血；8)治疗后的良恶性肿瘤患者。
8.权利要求1中所述的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病为系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病、溃疡性结肠炎、自身免疫性溶血性贫血、自发性血小板缺乏紫斑症、皮肌炎、混合结缔组织病、重症肌无力、甲状腺自身免疫病、胰岛素依赖型糖尿病、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髓硬化症或急性特发性多神经炎。
9.如权利要求1-8任一项的所述的应用，其特征在于，所述重组间充质干细胞与常规免疫抑制剂联合使用。
10.如权利要求1-8任一项的所述的应用，其特征在于，所述重组间充质干细胞对于人
4 6
体的给药量为1×10 ～1×10MSCs/kg。
一种重组间充质干细胞在制备免疫抑制剂中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 间充质干细胞是最先从骨髓中分离出来的一群具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。近年来的研究表明：间充质干细胞具有广泛的免疫调节功能。间充质干细胞对多种免疫细胞，包括T细胞、B细胞、NK细胞、DC等均有免疫调节作用。在有效的动物实验及临床疾病的治疗中发现间充质干细胞主要是通过分泌性细胞因子发挥的体内免疫调节作用。
[0003] 目前，间充质干细胞对临床疾病如造血干细胞移植或移植物抗宿主病、实体器官移植后的免疫排斥、克隆氏病、系统性红斑狼疮等进行免疫治疗在美国已进入临床II-III期阶段。2012年5月17日，加拿大卫生监管机构宣布批准一款人间充质干细胞TM TM药-Prochymal 上市，使得Prochymal 成为全球首个真正意义上获准用于治疗全身性疾病的干细胞药物，也标志着间充质干细胞作为免疫调节剂临床应用的大门已经打开。但仍面临的问题为：1)在多中心的III期临床结果表明：体内免疫调节作用不甚明显；2)细胞用量大[Tyndall A.Successes and failures of stem cell transplantation in autoimmune diseases.Hematology Am Soc Hematol Educ Program.2011；2011：280-284.][Martin I，Baldomero H，Tyndall A，Niederwieser D，Gratwohl A.A survey on cell and engineered tissue therapies in Europe in2008.Tissue Eng Part A2010；16：
2419-2427.]
2419-2427.]
[0004] 很多的间充质干细胞的临床治疗方式都包括原位注射和静脉注射两种方式[http：//www.clinicaltrials.gov/]。但是由于静脉注射简单易行，全身系统性疾病，如移植物抗宿主病、克隆氏病、系统性红斑狼疮等还是以静脉注射为主。所以，临床上治疗6
此类疾病需要大量的细胞，如临床间充质干细胞免疫治疗剂量为1-9×10MSCs/Kg，每周
2次，连续四周，此过程中无疑增加了治疗成本，于此同时还可能带来如栓塞，肿瘤复发等危险。因此，间充质干细胞有效的体内迁移是达到细胞治疗最高效、最经济两大目标的关键[Karp JM and Leng Teo GS.Mesenchymal Stem Cell Homing：The Devil Is in the Details.Cell Stem Cell.2009；4(3)：206-216.Ankrum J，Karp JM.Mesenchymal stem cell therapy：Two steps forward，one step back.Trends Mol Med.2010；16(5)：203-9]。
此类疾病需要大量的细胞，如临床间充质干细胞免疫治疗剂量为1-9×10MSCs/Kg，每周
2次，连续四周，此过程中无疑增加了治疗成本，于此同时还可能带来如栓塞，肿瘤复发等危险。因此，间充质干细胞有效的体内迁移是达到细胞治疗最高效、最经济两大目标的关键[Karp JM and Leng Teo GS.Mesenchymal Stem Cell Homing：The Devil Is in the Details.Cell Stem Cell.2009；4(3)：206-216.Ankrum J，Karp JM.Mesenchymal stem cell therapy：Two steps forward，one step back.Trends Mol Med.2010；16(5)：203-9]。
[0005] 二级淋巴器官，包括脾脏白髓(SPW)、淋巴结(LN)、肠系膜淋巴结(MLN)，PP结等，结构简单且相似，均由T、B淋巴细胞、抗原呈递细胞(APC)、基质细胞和微管连接组成。T细胞在二级淋巴器官中接受APC呈递的抗原，活化增殖，因此，二级淋巴器官是体内免疫反应启动的场所。间充质干细胞经静脉输注后在全身分布广泛，分布于肺、肠、肝、骨髓等，但极少存在于二级淋巴器官。间充质干细胞被“稀释”在几乎所有的组织器官，使之在主战场上身单力薄，以致其虽在体外实验中具有强大免疫调节能力，而在体内免疫调节治疗中效果不理想。
[0006] 临床上肿瘤患者造血干细胞移植后如进行大量的间充质干细胞输注，可增加肿瘤复发的危险[Ning H，etal.The correlation between cotransplantation of mesenchymal stem cells and higher recurrence rate in hematologic malignancy patients：outcome of a pilot clinical study.Leukemia.2008；22：593-599]。且目前大量的研究结果表明，间充质干细胞可促进肿瘤的发生、生长、耐药、侵袭和转移[Eterno V，et al.Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells(ASCs)may favour breast cancer recurrence via HGF/c-Met signaling.Oncotarget.2013；23.Epub ahead of print][Bergfeld SA，Blavier L，Declerck YA.Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Promote Survival and Drug Resistance in Tumor Cells.Mol Cancer Ther.2014；6.Epub ahead of print][Wang D1，Wang S，Shi C.Update on cancer related issues of mesenchymal stem cell-based therapies.Curr Stem Cell Res Ther.2012；7(5)：
370-80.]。
370-80.]。
[0007] 在临床治疗肿瘤患者造血干细胞移植后的移植物抗宿主病，肿瘤发生的高危人群中的器官移植后的免疫排斥反应和自身免疫性疾病治疗中，如应用具有广泛的免疫抑制功能的间充质干细胞大量输注，除了存在价格高昂、影响血液稳态的缺点的同时，更大的问题是间充质干细胞大量输注将带来增加肿瘤发生/复发的危险。因此，在这几类人群中的治疗中，普通间充质干细胞是慎用，甚至是禁用的。
[0008] 基于普通间充质干细胞在临床治疗中的体内免疫调节能力不强、细胞用量大、有着潜在的增加肿瘤复发/发生的危险的弊端，目前对于能够克服上述弊端的更经济、高效的细胞治疗策略的需求尤为急切。
发明内容
[0009] 本发明提供了一种重组间充质干细胞在制备免疫抑制剂中的应用。通过对间充质干细胞进行修饰，使其细胞膜表达CCR7，引导输注后的间充质干细胞靶向迁移进入二级淋巴器官，并在聚集在二级淋巴器官的T细胞富集区，可与T淋巴细胞近距离接触，高效地抑制了T细胞介导的免疫反应。更特别的是，本发明的重组间充质干细胞同时保留了机体抗肿瘤的能力。
[0010] 为实现上述目的，本发明包括如下技术方案：
[0011] 一种重组间充质干细胞在制备免疫抑制剂中的应用，该重组间充质干细胞是通过在间充质干细胞的细胞膜上表达趋化因子受体CCR7来获得的，该免疫抑制剂应用于肿瘤高危人群的造血干细胞移植后的移植物抗宿主病、器官移植后的免疫排斥反应和/或自身免疫性疾病。
[0012] 如上所述的应用，优选地，所述间充质干细胞为自体来源、异体来源或商业来源。
[0013] 如上所述的应用，优选地，所述在间充质干细胞的细胞膜上表达趋化因子受体CCR7的方法包括：采用基因转染的方法将CCR7的基因导入到间充质干细胞中，使间充质干细胞细胞膜表达CCR7；通过载体转染体系，使间充质干细胞细胞膜表达CCR7；采用Trogocytosis的方法，通过抗原提呈细胞将CCR7提呈到间充质干细胞的细胞膜上；或者通过现有细胞膜蛋白改构或外接蛋白来实现。
[0014] 如上所述的应用，优选地，所述基因转染的方法，包括病毒载体转染体系和非病毒转染体系。
[0015] 如上所述的应用，优选地，所述病毒载体转染体系是腺相关病毒AA-V、慢病毒、腺病毒Ad-V、杆状病毒、疱疹病毒和逆转录病毒转染体系中的任一种或几种。
[0016] 如上所述的应用，优选地，所述非病毒转染体系是质粒载体转染体系、壳聚糖纳米粒转染体系或裸基因转染体系。
[0017] 如上所述的应用，优选地，所述肿瘤高危人群包括：1)45岁以上的中老年人群；2)遗传因素造成的高危人群：三代以内的直系或旁系亲属罹患恶性肿瘤的病史；3)有不良生活习惯的人群：长期大量吸烟、长期酗酒、药物滥用、长期过度劳累、熬夜、生活压力大、工作压力大、长期有不良情绪、性格抑郁或使用手机频率高的人群；4)有不良饮食习惯的人群：偏食、营养不良、饮食不洁、饮食不规律、进食速度慢、经常进食过热过硬过辣食品或经常进食腌制熏制油炸食品；5)职业因素长期接触有毒有害物质的人群；6)生存环境遭污染的人群：水源和/或空气化学污染、重金属污染、核污染、微生物污染或长期生活在雾霾天气中的人群；7)有慢性或反复性炎症人群：慢性支气管炎、慢性乙型肝炎病毒感染者、艾滋病毒感染者、慢性宫颈炎、慢性胃炎、胃息肉、胃溃疡、乳腺炎、乳腺慢性增生、肠息肉、胆囊息肉、前列腺炎、鼻窦炎或长期功能性子宫出血；8)治疗后的良恶性肿瘤患者。
[0018] 如上所述的应用，优选地，所述自身免疫性疾病为系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病、溃疡性结肠炎、自身免疫性溶血性贫血、自发性血小板缺乏紫斑症、皮肌炎、混合结缔组织病、重症肌无力、甲状腺自身免疫病、胰岛素依赖型糖尿病、恶性贫 血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髓硬化症或急性特发性多神经炎。
[0019] 如上所述的应用，优选地，所述重组间充质干细胞与常规免疫抑制剂联合使用。
[0021] 本发明的有益效果在于：
[0022] 1.将间充质干细胞的细胞膜表达CCR7，输注后可体内靶向二级淋巴器官迁移，在二级淋巴器官局部大量聚集，尤其是其可在聚集在二级淋巴器官的T细胞富集区，可与T淋巴细胞近距离接触，高效地抑制了T细胞介导的免疫反应，临床治疗造血干细胞移植后的移植物抗宿主病、实体器官移植后的免疫排斥反应和自身免疫性疾病时可减少细胞用量，减少成本，减少栓塞等副作用。
[0023] 2.本发明的重组间充质干细胞同时保留了机体抗肿瘤的作用。因此，此种细胞临床治疗肿瘤患者造血干细胞移植后的移植物抗宿主病时可减少肿瘤复发的危险；在肿瘤发生的高危人群中的器官移植后的免疫排斥反应和自身免疫性疾病治疗中也可以减少肿瘤发生的危险。
[0024] 本发明的重组间充质干细胞制备的免疫抑制剂在治疗临床患者高发免疫反应时，克服了普通间充质干细胞的体内免疫调节能力不强、细胞用量大、有着潜在的增加肿瘤复发/发生的危险的弊端，是明显优于普通间充质干细胞的。此发明为临床上抑制患者免疫反应提供了高效且有益的新策略。附图说明
[0025] 图1：间充质干细胞(MSCs)的CCR7表达状况。
[0026] A：RT-PCR方法检测Balb/C小鼠和C57BL/6小鼠骨髓来源MSCs的CCR7表达情况；
[0027] B：RT-PCR方法检测三种细胞eGFP和CCR7的表达；
[0028] C：实时定量PCR检测三种细胞eGFP基因的mRNA表达水平；
[0029] D：实时定量PCR检测三种细胞CCR7基因的mRNA表达水平；
[0030] E：流式细胞仪检测三种细胞的膜表达CCR7的情况。
[0032] 图2B：eGFP+MSCs在体内各组织器官的频率。
[0033] 图3：尾静脉输注后的MSCs/CCR7-eGFP在脾脏和淋巴结内与CD3+T细胞、CD11c+树+突状细胞和B220B细胞的显微照片。
[0034] 图4：MSCs/CCR7-eGFP高效抑制移植物抗宿主病(GvHD)的实验结果。
[0035] 图5：GvHD小鼠模型中，MSCs/CCR7-eGFP对于机体抗肿瘤的能力测试结果。
[0036] 图6：小鼠异种皮肤移植模型中，MSCs/CCR7-eGFP的免疫调控及对机体肿瘤生长能力影响的测试结果。
[0037] 图7：小鼠炎性肠病模型中，MSCs/CCR7-eGFP的免疫调控及对机体肿瘤生长能力影响的测试结果。
具体实施方式
[0038] 本发明中在间充质干细胞的细胞膜上表达趋化因子受体CCR7可通过以下方法实现：采用基因转染的方法将CCR7的基因导入到间充质干细胞中，使间充质干细胞细胞膜表达CCR7；通过载体转染体系，使间充质干细胞细胞膜表达CCR7；采用Trogocytosis的方法，通过抗原提呈细胞将CCR7提呈到间充质干细胞的细胞膜上；或者通过现有细胞膜蛋白改构或外接蛋白来实现。
[0039] 其中，所述基因转染的方法，包括病毒载体转染体系和非病毒转染体系；所述病毒载体转染体系可以是腺相关病毒AA-V、慢病毒、腺病毒Ad-V、杆状病毒、疱疹病毒和逆转录病毒转染体系中的任一种或几种；所述非病毒转染体系可以是质粒载体转染体系、壳聚糖纳米粒转染体系或裸基因转染体系。
[0040] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
[0041] 下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
[0042] 实施例1制备表达趋化因子受体CCR7的重组间充质干细胞
[0043] 1.小鼠骨髓MSCs分离培养
[0044] 样本为2-3周龄C57BL/6小鼠(军事医学科学院实验动物中心)，断颈处死小鼠，75％酒精浸泡消毒小鼠→无菌条件下分离小鼠胫骨和股骨，置于平皿中→用无菌纱布搓去附着肌肉，去除干骺端→用PBS+10％FCS(Hyclone)反复冲洗骨髓腔，冲出骨髓细胞→接种于培养瓶中，使骨片均匀分布瓶底，培养体系含αt-MEM(Gibco)+10％FCS(Hyclone)+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素，37℃、5％CO2的饱和湿度条件下培养→每3天换液1次→细胞接近70-80％汇合时，0.25％胰酶(Hyclone)消化传代，传代细胞接种
2
密度为4000个细胞/cm。
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密度为4000个细胞/cm。
[0045] 2.腺相关病毒感染小鼠MSCs
[0046] Invitrogen公司定制的eGFP-腺相关病毒载体和CCR7-eGFP-腺相关病毒载体分4
别转入小鼠MSCs。方法为：将MSCs铺48孔板，2×10/孔。次日换成新培养基，其中加入病毒(MOI＝20)，polybrene(8μg/ml)，感染6小时后更换正常的培养体系。 将导入eGFP的MSCs命名为MSCs/eGFP；将导入CCR7-eGFP载体的MSCs命名为MSCs/CCR7-eGFP。
别转入小鼠MSCs。方法为：将MSCs铺48孔板，2×10/孔。次日换成新培养基，其中加入病毒(MOI＝20)，polybrene(8μg/ml)，感染6小时后更换正常的培养体系。 将导入eGFP的MSCs命名为MSCs/eGFP；将导入CCR7-eGFP载体的MSCs命名为MSCs/CCR7-eGFP。
[0047] 3.RT-PCR检测MSCs在mRNA水平的CCR7表达
[0048] 收集BalB/c小鼠和C57BL/6小鼠分离的MSCs，同品系的脾单个核细胞(SPMNC)作为阳性对照，同时收集转染后的MSCs/eGFP，MSCs/CCR7-eGFP。用RT-PCR方法检测各组细胞表达CCR7的mRNA水平。引物如下：
[0049] 表1
[0050]
[0051] 结果如图1所示，图1A：RT-PCR结果显示BalB/C小鼠和C57BL/6小鼠来源的MSCs均不表达CCR7，而同品系来源的脾细胞(SPMNC)则为阳性。看家基因HPRT的表达作为内参；图1B：正常MSCs为空白对照，转入空载体的MSC为转染对照(MSCs/eGFP)，将CCR7基因转入MSCs(MSCs/CCR7-eGFP)。RT-PCR检测结果显示：MSC/eGFP和MSC/eGFP-CCR7表达eGFP；三种细胞中，MSC/CCR7-eGFP成功表达CCR7的mRNA，看家基因HPRT的表达作为内参。此结果表明CCR7基因成功转入MSCs。
[0052] 4.实时定量PCR方法检测MSCs表达CCR7的mRNA水平
[0053] 分别收取MSCs、MSCs/eGFP、MSCs/eGFP-CCR7三组细胞。常规方法提取RNA，用实时定量PCR方法检测三种细胞CCR7的mRNA水平。引物如下：
[0054] 表2
[0055]
[0056] 结果参见图1C，D：实时定量PCR检测MSCs、MSCs/eGFP、MSCs/eGFP-CCR7三种细胞eGFP基因和CCR7基因的mRNA表达水平；进一步证实了图1B的结果。
[0057] 5.流式细胞仪检测MSCs膜表达CCR7的情况
[0058] MSCs、MSCs/eGFP、MSCs/CCR7-eGFP三 组 细 胞 分 别 用 小 鼠 CD16/32抗 体(ebioscience公司)封闭，然后用CCR7-PE抗体(ebioscience公司)标记细胞，图1E流式细胞仪检测结果显示：MSCs、MSCs/eGFP不表达膜分子CCR7，而MSCs/CCR7-eGFP有93.0-98.4％表达膜分子CCR7。
[0059] 实施例2检测MSCs体内向二级淋巴器官迁移能力和富集区域
[0060] 1.检测MSCs体内向二级淋巴器官迁移能力6
[0061] 将输注MSCs、MSCs/eGFP或MSCs/CCR7-eGFP(1×10)三组小鼠(每组4只)；在输注后5天后取脾(SP)、淋巴结(LN)、肠系膜淋巴结(MLN)、PP结做冰冻切片，DAPI进行细胞核标记。荧光显微镜下观察绿色荧光细胞。图2A结果表明：MSCs/eGFP不具有向二级淋巴器官迁移的能力，而MSCs/eGFP-CCR7在SP，LN，MLN，PP中有大量的分布。图2B所示计+算出各器官的eGFPMSCs在体内各组织器官分布的频率(绿色荧光的数目/高倍视野)，定量地显示输注的MSCs/eGFP在体内不具有向二级淋巴器官迁移的能力，而输注的MSCs/eGFP-CCR7才具有体内二级淋巴器官靶向迁移的能力。
[0062] 2.MSCs/eGFP-CCR7在二级淋巴器官中存在于T细胞富集区
[0063] 将各MSCs/eGFP-CCR7输注小鼠的SP，LN的冰冻切片做免疫荧光染色，用藻红蛋白标记(PE)的CD3抗体或B220抗体孵育后荧光显微镜下观察MSCs/CCR7-eGFP(绿色)与+ + +CD3T淋巴细胞(红色，图3A)，CD11c 树突状细胞(红色，图3B)或B220B淋巴细胞(红色，图3C)的关系，DAPI(蓝色)染色显示细胞核。在二级淋巴器官中有多种细胞，MSCs/CCR7-eGFP在二级淋巴器官中存在于T细胞富集区，此结果奠定了MSCs/CCR7-eGFP其体内对T细胞介导的免疫反应具有强大免疫调节能力的基础。
[0064] 实施例3MSCs/CCR7-eGFP体内免疫调节效果及对肿瘤生长影响的检测[0065] 1.MSCs/CCR7-eGFP对GvHD的抑制
[0066] GvHD是典型的T细胞介导的免疫疾病。小鼠GvHD模型的建立：取20-24g的BALB/7 7
c雄性小鼠，收集脾细胞和骨髓细胞，计数；2×10 脾细胞+1×10 骨髓细胞/0.25mlPBS尾静脉注射9Gy照射的22-24g C57BL/6雄性小鼠，建立aGvHD模型(GvHD组)。在此基础上
5 6 5 6 6
分别共输注1×10 或1×10 的MSCs/eGFP，1×10 或1×10MSCs/CCR7-eGFP。1×10MSCs/
6
eGFP尾静脉共输注的小鼠称为 GvHD+MSCs/eGFP小鼠；1×10MSCs/CCR7-eGFP尾静脉共输注的小鼠称为GvHD+MSCs/CCR7-eGFP小鼠。
c雄性小鼠，收集脾细胞和骨髓细胞，计数；2×10 脾细胞+1×10 骨髓细胞/0.25mlPBS尾静脉注射9Gy照射的22-24g C57BL/6雄性小鼠，建立aGvHD模型(GvHD组)。在此基础上
5 6 5 6 6
分别共输注1×10 或1×10 的MSCs/eGFP，1×10 或1×10MSCs/CCR7-eGFP。1×10MSCs/
6
eGFP尾静脉共输注的小鼠称为 GvHD+MSCs/eGFP小鼠；1×10MSCs/CCR7-eGFP尾静脉共输注的小鼠称为GvHD+MSCs/CCR7-eGFP小鼠。
[0067] 输注后每日观察三组小鼠生存及状态，记录生存曲线，以观察MSCs的体内免疫调节效果，并检测血清细胞炎性因子水平。如图4A所示，MSCs/CCR7-eGFP输注明显延长了GvHD小鼠的生存时间，其作用明显优于相同剂量的MSCs/eGFP输注组。建模2周后，GvHD小鼠表现为体重下降、弓背、腹泻、毛发蓬乱、活动力降低。而输注MSCs/CCR7-eGFP小鼠GvHD表现则有明显改善，其作用明显优于相同剂量的MSCs/eGFP共输注组(图4B)。ELISA结果显示，与GvHD、GvHD+MSCs/eGFP小鼠相比，MSCs/CCR7-eGFP共输注明显提高了小鼠血清中抗炎因子IL-4水平(图4C)，明显降低了炎性因子IFN-γ水平(图4D)。以上结果证明了：表达CCR7的MSCs具有比普通MSCs更强大的体内免疫调节能力。
[0068] 2.小鼠GvHD模型中，检测MSCs/eGFP-CCR7对于机体抗肿瘤的能力影响[0069] 小鼠GvHD、GvHD+MSCs/eGFP(1×106)、MSCs/CCR7-eGFP(1×106)模型的建立的当5
天，共输注5×10 的EL4白血病细胞，以建立荷瘤的GvHD小鼠模型。记录各组小鼠的生存时间，并绘制生存曲线，观察两种MSCs对肿瘤生长的影响。结果发现：与GvHD+EL4的荷瘤小鼠相比，MSCs/eGFP共输注没有延长小鼠的生存时间，而MSCs/eGFP-CCR7共输，明显延长了小鼠的生存时间(图5A)；建模2周后观察各组小鼠肝脏的肿瘤侵润情况，图5B结果显示：同系脾细胞与肿瘤细胞共输注组(syno-infusion+EL4)小鼠肝脏有明显的肿瘤结节，证明小鼠荷瘤成功(图5Ba)；GvHD+EL4组小鼠肝脏有明显的出血和坏死，说明小鼠有明显的GvHD发生(图5Bb)；GvHD+EL4+MSCs/eGFP组小鼠肝脏GvHD变化有一定的改善，也仍有许多的肿瘤结节(图5Bc)；GvHD+EL4+MSCs/CCR7-eGFP小鼠出血、坏死和肿瘤结节均有改善，说明MSCs/CCR7-eGFP共输注在减轻GvHD的同时，保留了机体抗肿瘤的能力(图5Bd)；
天，共输注5×10 的EL4白血病细胞，以建立荷瘤的GvHD小鼠模型。记录各组小鼠的生存时间，并绘制生存曲线，观察两种MSCs对肿瘤生长的影响。结果发现：与GvHD+EL4的荷瘤小鼠相比，MSCs/eGFP共输注没有延长小鼠的生存时间，而MSCs/eGFP-CCR7共输，明显延长了小鼠的生存时间(图5A)；建模2周后观察各组小鼠肝脏的肿瘤侵润情况，图5B结果显示：同系脾细胞与肿瘤细胞共输注组(syno-infusion+EL4)小鼠肝脏有明显的肿瘤结节，证明小鼠荷瘤成功(图5Ba)；GvHD+EL4组小鼠肝脏有明显的出血和坏死，说明小鼠有明显的GvHD发生(图5Bb)；GvHD+EL4+MSCs/eGFP组小鼠肝脏GvHD变化有一定的改善，也仍有许多的肿瘤结节(图5Bc)；GvHD+EL4+MSCs/CCR7-eGFP小鼠出血、坏死和肿瘤结节均有改善，说明MSCs/CCR7-eGFP共输注在减轻GvHD的同时，保留了机体抗肿瘤的能力(图5Bd)；
[0070] 3.异种皮肤移植模型(allogeneic skin graft，alloSG)小鼠负载黑色素瘤(B16)，检测MSCs/eGFP-CCR7对于机体肿瘤生长的能力影响。
[0071] 建立负载黑色素瘤的异种皮肤移植小鼠模型(alloSG+B16+PBS)：将Balb/C小鼠2 5
皮肤(1Gm)移植至C57小鼠背部，当天黑色素瘤细胞(B16)5×10 侧腹部皮下注射，建立负载黑色素瘤小鼠异种皮肤移植模型，次日，尾静脉输注0.2ml PBS；在模型基础上尾静
6 6
脉输注1×10MSCs/eGFP，定义为alloSG+B16+MSCs/eGFP组；或尾静脉输注1×10MSCs/CCR7-eGFP，定义为alloSG+B16+MSCs/CCR7-eGFP组。
皮肤(1Gm)移植至C57小鼠背部，当天黑色素瘤细胞(B16)5×10 侧腹部皮下注射，建立负载黑色素瘤小鼠异种皮肤移植模型，次日，尾静脉输注0.2ml PBS；在模型基础上尾静
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脉输注1×10MSCs/eGFP，定义为alloSG+B16+MSCs/eGFP组；或尾静脉输注1×10MSCs/CCR7-eGFP，定义为alloSG+B16+MSCs/CCR7-eGFP组。
[0072] 观察三组小鼠的异体皮肤的存活时间，结果显示alloSG+B16+MSCs/CCR7-eGFP组小鼠的异种皮肤存活时间明显延长(*，p＜0.05)，而alloSG+B16+MSCs/eGFP组小鼠 的异种皮肤的存活时间与对照组无差异(图6A)。建模2周后，alloSG+B16+MSCs/eGFP组黑色素瘤明显比对照组体积大，重量明显增加(*，p＜0.05)；然而，alloSG+B16+MSCs/CCR7-eGFP组黑色素瘤与对照组体积和重量均无明显区别(n.s.，无明显差别)(图6B，C)。
[0073] 4.负载黑色素瘤小鼠炎性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)模型中，MSCs/CCR7-eGFP的免疫调控及对机体肿瘤生长能力测试。
[0074] 用2％DSS喂小鼠，连续7天，在喂水的第一天黑色素瘤细胞(B16)5×105侧腹部皮下注射，尾静脉输注0.2ml PBS，诱导负载黑色素瘤的炎性肠病小鼠模型(IBD+B16)。在6
模型基础上尾静脉输注1×10MSCs/eGFP，定义为IBD+B16+MSCs/eGFP组；或尾静脉输注
6
1×10MSCs/CCR7-eGFP，定义为IBD+B16+MSCs/CCR7-eGFP组。
模型基础上尾静脉输注1×10MSCs/eGFP，定义为IBD+B16+MSCs/eGFP组；或尾静脉输注
6
1×10MSCs/CCR7-eGFP，定义为IBD+B16+MSCs/CCR7-eGFP组。
[0075] 观察三组小鼠的生存时间，结果表明：IBD+B16+MSCs/CCR7-eGFP组小鼠存活时间明显长于对照组(图7A)。建模14天后，IBD+B 16+MSCs/eGFP组黑色素瘤明显比对照组体积大，重量明显增加(*，p＜0.05)；然而，IBD+B16+MSCs/CCR7-eGFP组黑色素瘤与对照组体积和重量均无明显区别(n.s.，无明显差别)(图7B)。
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