一种lncRNA的应用以及试剂盒和药物
阅读：5发布：2020-11-06
专利汇可以提供一种lncRNA的应用以及试剂盒和药物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 分子诊断 技术领域，具体涉及一种lncRNA的应用以及 试剂 盒 和药物，一种lncRNA在制备用于诊断和/或 预后 评估NSCLC的试剂盒中的应用。其中，所述lncRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该lncRNA在NSCLC病人手术前的 血浆 中高表达，手术后血浆中表达 水 平显著下降，而且在NSCLC癌组织中、在NSCLC病人血浆中、以及在NSCLC细胞中的表达水平均分别显著高于癌旁组织、健康人血浆，以及正常支气管上皮细胞。研究结果表明该lncRNA具有显著的抑制NSCLC细胞 肿瘤 活性的能 力 ，是一个新发现的肿瘤抑制lncRNA。，下面是一种lncRNA的应用以及试剂盒和药物专利的具体信息内容。
1.一种lncRNA在制备用于诊断和/或预后评估NSCLC的试剂盒中的应用；其中，所述lncRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，用于扩增所述lncRNA的核苷酸序列的引物如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
3.一种用于诊断和/或预后评估NSCLC的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如SEQ ID No.1所示的lncRNA分子。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于扩增所述lncRNA的引物，如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
5.一种lncRNA基因作为靶点在筛选或制备用于预防和/或治疗NSCLC的药物中的应用；
其中，所述lncRNA基因编码如SEQ ID No.1所示的lncRNA。
6.一种lncRNA在制备用于预防和/或治疗NSCLC的药物中的应用；其中，所述lncRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物包括编码如SEQ ID No.1所示lncRNA的核苷酸序列的重组载体、编码如SEQ ID No.1所示lncRNA的核苷酸序列的重组病毒和编码如SEQ ID No.1所示lncRNA的核苷酸序列的重组病毒载体中的至少一种。
8.一种用于预防和/或治疗NSCLC的药物，其特征在于，所述药物含有如SEQ ID No.1所示lncRNA的核苷酸序列以及药物学可接受的载体。
9.如权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物包括编码如SEQ ID No.1所示lncRNA的核苷酸序列的重组载体、编码如SEQ ID No.1所示lncRNA的核苷酸序列的重组病毒和编码如SEQ ID No.1所示lncRNA的核苷酸序列的重组病毒载体中的至少一种。
10.一组针对BRCAT54基因靶点的干扰RNA，其特征在于，所述BRCAT54基因靶点的序列如SEQ ID NO:1所示，所述干扰RNA包括第一siRNA、第二siRNA和第三siRNA中的至少一种；
其中，
所述第一siRNA的正义链序列如SEQ ID NO:4所示，反义链序列如SEQ ID NO:5所示；
所述第二siRNA的正义链序列如SEQ ID NO:6所示，反义链序列如SEQ ID NO:7所示；
所述第三siRNA的正义链序列如SEQ ID NO:8所示，反义链序列如SEQ ID NO:9所示。
一种lncRNA的应用以及试剂盒和药物
技术领域
背景技术
[0002] 肺癌是当今世界最常见的恶性肿瘤，全世界每年新发现的肺癌病人人数超过180万人，肺癌所引起的死亡约占所有癌症相关死亡的30％。在过去的三十年中，中国的肺癌发病率及死亡率一直处于迅速攀升阶段，目前每年发病人数将近100万人，肺癌已成为当前威胁我国居民生存健康的重要危险因素。在肺癌患者中，小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)约占15％，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占85％，后者是造成肺癌相关死亡的主要原因。近20年来虽然NSCLC的治疗手段增多，治疗水平不断提高，但NSCLC病人5年总生存率一直只有大约15％。
[0003] 在临床上，手术切除是早期(I-II期)NSCLC治疗的最佳手段。病理分期为IA的患者，手术后5年生存率可达80-90％；而IV期的病人术后5年存活率仅有5％。但是，由于早期无典型的临床症状和体征以及缺乏有效的早期诊断方法，大多数NSCLC病人(～70％)确诊时已为中晚期(III-IV期)，因此失去了手术治疗的机会。对于中晚期患者，以铂类药物为基础的联合化疗是临床治疗NSCLC的主流手段。多数患者化疗初期对药物敏感，表现为肿瘤体积缩小，临床症状明显减轻。但后期效果不佳，有效率仅有20％。而且化疗的毒副作用较大，多数病人容易产生耐药。其中多药耐药性(MDR)是导致肺癌化疗失败的主要原因。
[0004] 近年来，以作用于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因活性突变和间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)基因重排分子为代表的靶向药物以其高效性、低毒性为晚期NSCLC的个体化治疗开辟了新的途径。靶向治疗的原理是通过在基因分子层面改变肿瘤的信号传导途径、影响血管生成等方式抑制肿瘤细胞的生长。但EGFR突变的NSCLC患者经一代EGFR-TKI靶向药物治疗6-12个月后，大约60％的患者会出现获得性T790M突变，产生继发性耐药。二代EGFR-TKI靶向药物可同时抑制T790M突变型及野生型，提高治疗效果。但与野生型的结合而产生的毒性作用限制了二代EGFR-TKI靶向药物在T790M突变NSCLC患者中的应用。第三代EGFR-TKI靶向药物选择性作用于EGFR的L858R、ex19del、T790M等突变，但对野生型EGFR作用很小。总的来说，靶向药物治疗只对大约20％的NSCLC患者(主要是年轻的腺癌病人)有效，鳞癌以及高龄患者从EGFR-TKI靶向药物治疗中获益有限。
[0005] 在过去的5年中，以抗PD-1，PD-L1，CTLA-4的单克隆抗体为代表的免疫治疗异军突起，成为继手术、化疗、靶向治疗后又一种具有潜力的治疗NSCLC的方式。但是，PD-1抗体单用的有效率仅为20％；PD-L1的不同检测方法结果一致性较低，治疗疗效的持续时间还有待验证。同既往任何一种化疗药物一样，免疫单抗也面临着显著的耐药问题，包括原发性耐药、适应性耐药、及获得性耐药。
[0006] 嵌合抗原受体基因修饰T细胞(CAR-T)作为“活的药物”通过识别肿瘤抗原激活T细胞增殖，细胞因子释放及细胞毒性作用等方式杀灭癌细胞。CAR-T在血液肿瘤的治疗中已取得令人振奋的结果，但由于实体肿瘤缺乏特异的肿瘤抗原，目前CAR-T治疗实体肿瘤的临床疗效还有待进一步验证。CAR-T产生的脱靶毒性及细胞因子风暴等毒副作用还有待克服。
[0007] 总的来说，虽然近年来在NSCLC治疗上已经取得一些令人鼓舞的结果。但是，现有的各种治疗方法只对少部分病人有效，总体治疗效果不够理想，NSCLC的5年总生存率仍然低于20％。
[0008] 长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度一般大于200bp的非编码RNA。lncRNA失调可影响细胞分化、增生、代谢及凋亡等过程，从而在肿瘤的发生、发展、转移中发挥重要作用。能抑制肿瘤发生发展的lncRNA被称为肿瘤抑制lncRNAs。发现新的肿瘤抑制lncRNAs并阐释他们的功能对研发新的治疗靶点非常重要，抑制性的lncRNA在肿瘤治疗方面具有广泛的潜力和应用前景。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于提供一种lncRNA的应用以及试剂盒和药物，旨在解决现有非小细胞肺癌(NSCLC)的诊断、治疗和预后效果有限的技术问题。
[0010] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0011] 本发明一方面提供一种lncRNA在制备用于诊断和/或预后评估NSCLC的试剂盒中的应用；其中，所述lncRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0012] 本发明另一方面提供一种用于诊断和/或预后评估NSCLC的试剂盒，所述试剂盒含有如SEQ ID No.1所示的lncRNA分子。
[0013] 以及，一种lncRNA基因作为靶点在筛选或制备用于预防和/或治疗NSCLC的药物中的应用；其中，所述lncRNA基因编码如SEQ ID No.1所示的lncRNA分子。
[0014] 以及，一种lncRNA在制备用于预防和/或治疗NSCLC的药物中的应用；其中，所述lncRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0015] 以及，一种用于预防和/或治疗NSCLC的药物，所述药物含有如SEQ ID No.1所示lncRNA的核苷酸序列以及药物学可接受的载体。
[0016] 以及，一组针对BRCAT54基因靶点的干扰RNA，所述BRCAT54基因靶点的序列如SEQ ID NO:1所示，所述干扰RNA包括第一siRNA、第二siRNA和第三siRNA中的至少一种；其中，[0017] 所述第一siRNA的正义链序列如SEQ ID NO:4所示，反义链序列如SEQ ID NO:5所示；
[0018] 所述第二siRNA的正义链序列如SEQ ID NO:6所示，反义链序列如SEQ ID NO:7所示；
[0019] 所述第三siRNA的正义链序列如SEQ ID NO:8所示，反义链序列如SEQ ID NO:9所示。
[0020] 本发明通过实验分析证明，如SEQ ID No.1所示lncRNA在NSCLC病人手术前的血浆中高表达，手术后血浆中表达水平显著下降；而且进一步分析了NSCLC癌组织/癌旁组织，NSCLC病人血浆/健康对照组血浆，NSCLC癌细胞/正常肺支气管上皮细胞之间如SEQ ID No.1所示lncRNA的表达差异。结果表明该lncRNA在NSCLC癌组织中、在NSCLC病人血浆中、以及在NSCLC细胞中的表达均分别显著高于癌旁组织、健康人血浆，以及正常支气管上皮细胞。检测结果证明BRCAT54在NSCLC中高表达，而且研究结果表明该lncRNA具有显著的抑制NSCLC细胞肿瘤活性的能力，是一个新发现的肿瘤抑制lncRNA。因此，该lncRNA可以用于制备诊断和/或预后评估NSCLC的试剂盒，以及用于制备预防和/或治疗NSCLC的药物。而且该lncRNA基因作为靶点可以用于筛选或制备用于预防和/或治疗NSCLC的药物。附图说明
[0021] 图1是本发明实施例中NSCLC病人手术前/手术后血浆BRCAT54表达水平差异结果图；
[0022] 图2是本发明实施例中BRCAT54在NSCLC病人血浆和健康人血浆表达差异结果图；
[0023] 图3是本发明实施例中NSCLC癌组织和癌旁组织BRCAT54表达水平差异结果图；
[0024] 图4是本发明实施例中BRCAT54在NSCLC癌细胞和正常支气管上皮细胞表达差异结果图；
[0025] 图5是本发明实施例中采用的pcDNA3.1质粒图；
[0026] 图6是本发明实施例中BRCAT54过表达抑制NSCLC细胞增殖的实验结果图；
[0027] 图7是本发明实施例中BRCAT54敲低促进NSCLC细胞增殖的实验结果图；
[0028] 图8是本发明实施例中BRCAT54过表达抑制NSCLC迁移、以及BRCAT54敲低促进NSCLC迁移的实验结果图；
[0029] 图9是本发明实施例中BRCAT54过表达促进NSCLC细胞凋亡、以及BRCAT54敲低抑制NSCLC细胞凋亡的实验结果图；
[0030] 图10是本发明实施例中BRCAT54过表达延长NSCLC病人生存时间的分析结果图。
具体实施方式
[0031] 为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0032] 本发明实施例中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。
[0033] 本发明实施例提供的lncRNA为BRCAT54，在NCBI基因库里BRCAT54有另一个名称叫MRPS30-DT，它们的基因ID为:100506674；核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0034] 一方面，本发明实施例提供了一种lncRNA在制备用于诊断和/或预后评估NSCLC的试剂盒中的应用；其中，所述lncRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0035] 进一步地，用于扩增所述lncRNA的核苷酸序列的引物如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
[0036] 本发明另一方面提供一种用于诊断和/或预后评估NSCLC的试剂盒，所述试剂盒含有如SEQ ID No.1所示的lncRNA分子。
[0037] 进一步地，所述试剂盒还包括用于扩增所述lncRNA的引物，如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。以及，所述试剂盒还包括抽提总RNA的试剂；以总RNA为模板将lncRNA逆转录为cDNA的试剂；将cDNA实时定量PCR的试剂。
[0038] 本发明实施例还提供一种lncRNA基因作为靶点在筛选或制备用于预防和/或治疗NSCLC的药物中的应用；其中，所述lncRNA基因编码如SEQ ID No.1所示的lncRNA。
[0039] 本发明实施例还提供一种lncRNA在制备用于预防和/或治疗NSCLC药物中的应用；其中，所述lncRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0040] 以及，一种用于预防和/或治疗NSCLC的药物，所述药物含有如SEQ ID No.1所示lncRNA的核苷酸序列以及药物学可接受的载体。
[0041] 进一步地，所述药物包括编码如SEQ ID No.1所示lncRNA的核苷酸序列的重组载体、编码如SEQ ID No.1所示lncRNA的核苷酸序列的重组病毒和编码如SEQ ID No.1所示lncRNA的核苷酸序列的重组病毒载体中的至少一种。
[0042] 其中，所述编码如SEQ ID No.1所示lncRNA的核苷酸序列的重组载体由所述lncRNA的核苷酸序列克隆入表达载体pcDNA3.1中得到。
[0043] 具体地，上述药物可以是抑制NSCLC肿瘤细胞生长药物、抑制NSCLC肿瘤细胞迁移药物、增强NSCLC肿瘤细胞凋亡药物。
[0044] 即所述BRCAT54在制备用于抑制NSCLC肿瘤细胞生长产品中的用途，BRCAT54在制备用于抑制NSCLC肿瘤细胞迁移产品中的用途，BRCAT54在制备用于增强NSCLC肿瘤细胞凋亡产品中的用途。上述产品包括药物、治疗制剂或试剂中的一种，其使用方式包括单独使用或与其他分子成分联合使用。
[0045] 最后，本发明实施例还提供一组针对BRCAT54基因靶点的干扰RNA，所述BRCAT54基因靶点的序列如SEQ ID NO:1所示，即该干扰RNA可以针对BRCAT54基因，所述干扰RNA包括第一siRNA、第二siRNA和第三siRNA中的至少一种；其中，
[0046] 所述第一siRNA的正义链序列如SEQ ID NO:4所示，反义链序列如SEQ ID NO:5所示；
[0047] 所述第二siRNA的正义链序列如SEQ ID NO:6所示，反义链序列如SEQ ID NO:7所示；
[0048] 所述第三siRNA的正义链序列如SEQ ID NO:8所示，反义链序列如SEQ ID NO:9所示。
[0049] 本发明一实施例中，采用全基因组高通量芯片技术分析比较非小细胞肺癌(NSCLC)病人手术前/手术后血浆lncRNAs表达差异，用定量PCR验证芯片检测结果。分析结果表明BRCAT54在NSCLC病人手术前的血浆中高表达，手术后血浆中BRCAT54表达水平显著下降，这提示BRCAT54(MRPS30-DT)与NSCLC肿瘤组织有高度相关性。
[0050] 本发明一实施例中，用定量PCR技术分别分析NSCLC癌组织/癌旁组织，NSCLC病人血浆/健康对照组血浆，NSCLC癌细胞/正常肺支气管上皮细胞之间BRCAT54的表达差异。结果表明BRCAT54在NSCLC癌组织中、在NSCLC病人血浆中、以及在NSCLC细胞中的表达水平均分别显著高于癌旁组织、健康人血浆，以及正常支气管上皮细胞。检测结果证明BRCAT54在NSCLC中高表达。
[0051] 本发明一实施例中，构建BRCAT54过表达载体，将BRCAT54过表达载体分别转染NSCLC细胞系，发现BRCAT54过表达显著抑制了NSCLC细胞的增殖和迁移能力，并诱导NSCLC细胞的凋亡。研究结果表明BRCAT54具有显著的抑制NSCLC细胞肿瘤活性的能力，BRCAT54是一个新发现的肿瘤抑制lncRNA。
[0052] 本发明一实施例中，合成针对BRCAT54的干扰RNA(siRNA)，将si-BRCAT54转染入NSCLC细胞内后，发现敲低BRCAT54的表达可促进NSCLC细胞的增殖和迁移，并抑制NSCLC细胞凋亡。
[0053] 本发明实施例中，通过Kaplan-Meier及多因素COX回归分析表明，BRCAT54高表达的NSCLC病人比BRCAT54低表达的病人生存时间更长，其生存时间差异具有统计学显著性。
[0054] 因此，本发明实施例发现的一种新的具有显著抗癌活性的lncRNA：BRCAT54，为NSCLC个体化精准治疗方案新思路提供了科学依据。而且提供了一种BRCAT54过表达重组载体，该载体通过抑制癌细胞增殖和迁移以及促进凋亡抑制NSCLC细胞的肿瘤活性，具有抗癌应用价值。而且提供了BRCAT54相关的引物，这些引物可检测生物标本中BRCAT54的表达水平，为进一步研究BRCAT54在NSCLC癌细胞中的功能及靶向BRCAT54的药物研发提供了基础。
[0055] 本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
[0056] 实施例1 BRCAT54的选择及其表达差异分析
[0057] 1.研究对象选择与分组
[0058] 从深圳大学第一附属医院(深圳市第二人民医院)收集符合研究条件要求的成年(≥18岁)NSCLC病例及与病例年龄匹配的健康对照。研究对象均签署了知情同意书。研究方案得到医院医学伦理委员会的审核通过。
[0059] NSCLC的诊断根据《中国原发性肺癌诊疗规范(2015年版)》有关诊断标准进行诊断，以病理学明确诊断的病例作为研究病例。NSCLC病人血液标本采血前未经过手术或放化疗治疗。通过对样本资料的分析整理，从中选择了符合标准的标本作为lncRNA芯片及后续一系列qRT-PCR验证的实验样品：
[0060] A组：用全基因组lncRNA芯片分析NSCLC病人手术前/手术后血浆筛选NSCLC相关的lncRNA。
[0061] B组：用独立的NSCLC患者及健康对照者血浆样本及qRT-PCR方法验证芯片分析结果。
[0062] C组：用NSCLC癌组织及癌旁组织分析差异表达的候选lncRNA。
[0063] D组：用qRT-PCR方法分析验证NSCLC患者/健康对照血浆候选lncRNA表达差异。
[0064] 2.NSCLC患者术前/术后血浆全基因组lncRNA表达谱分析比较
[0065] 在上述符合条件的个体中选取年龄匹配的NSCLC患者共8例，用全基因组lncRNA芯片分析比较手术前/手术后血浆lncRNA表达谱，获得相关实验数据。具体步骤如下：
[0066] (1)用TRIzol试剂(Invitrogen life technologies)提取血浆/血清RNA，按常规方法操作。提取出的RNA用RNasey Mini Kit(Qiagen p/n 74104)进行纯化。用ND-1000测定RNA浓度和纯度。
[0067] (2)使用Quick Amp Labeling Kit,One-Color(Agilent p/n 5190-0442)对样本进行标记，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen p/n 74104)及NanoDrop ND-1000对标记后的样本进行纯化。
[0068] (3)使用Agilent Gene Expression Hybridization Kit(Agilent p/n 5188-5242)对样本进行杂交。
[0069] (4)芯片分别用Gene Expression Wash Buffer 1(Agilent p/n 5188-5325)，Gene Expression Wash Buffer 2(Agilent p/n 5188-5326)，Magnetic stir bar(Corning p/n 401435)，Magnetic stir plate(Corning p/n 6795-410)，Slide-staining dish,with slide rack(Thermo Shandon p/n 121)洗涤。
[0070] (5)芯片洗涤后，使用Agilent DNA Microarray Scanner扫描。用Agilent Microarray Scanner(Agilent p/n G2565BA)采集芯片信号值。使用Agilent GeneSpring GXv12.1软件进行芯片标准化并挑选差异表达lncRNAs和mRNAs,并对差异lncRNAs和mRNAs进行GO和KEGG分析。
[0071] (6)术前/术后血浆lncRNA表达差异用fold change(t检验)进行比较。
[0072] (7)全基因组lncRNAs和mRNAs芯片分析结果：和手术前比较，NSCLC病人手术后血浆有826条lncRNA表达升高，有359条lncRNA表达水平下降(Fold change≧2.0；P值<0.01)。
[0073] 3.qRT-PCR方法测量血浆lncRNA表达量
[0074] (1)根据lncRNA芯片分析结果，选择满足下列条件的lncRNAs用qRT-PCR方法进一步验证芯片测定结果：在术前/术后差异表达≥4.0，P值<0.001。选择供验证的lncRNA如表1和表2所示。
[0075] (2)总RNA提取：将1.5ml离心管振荡2min，室温孵育5min；按0.2ml氯仿/1ml Trizol加入氯仿并充分振荡20s；12000g，4℃离心10min；吸取上清(0.5ml上清/1ml Trizol)转移至新离心管中，按0.5ml异丙醇/1ml Trizol加入异丙醇；混匀后，-20℃冷冻30min；12000g，4℃离心10min，弃去上清保留RNA沉淀；按1ml 75％乙醇/1ml Trizol，加入
75％乙醇洗涤RNA沉淀；混匀后，-20℃冷冻30min；7500g，4℃离心5min，弃去上清，保留RNA沉淀；打开EP管盖10min，让剩余乙醇自然挥发；加入30μl RNase-free ddH2O室温溶解RNA沉淀10min；电泳检测RNA样品质量，并分光光度计测定各RNA样品的OD260/OD280，计算总RNA浓度及杂志污染程度；
75％乙醇洗涤RNA沉淀；混匀后，-20℃冷冻30min；7500g，4℃离心5min，弃去上清，保留RNA沉淀；打开EP管盖10min，让剩余乙醇自然挥发；加入30μl RNase-free ddH2O室温溶解RNA沉淀10min；电泳检测RNA样品质量，并分光光度计测定各RNA样品的OD260/OD280，计算总RNA浓度及杂志污染程度；
[0076] (3)制备cDNA：选用TaKaRa PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(D6210A)试剂盒制备cDNA混合反应液。RNA 700ng；基因特异引物mix(10uM)1μl；dNTPs Mix(2.5mM)1.6μl；加无RNA酶的H2O至总体积14.5μl。混合液在65℃水浴5分钟，冰上放置2分钟。离心后，在离心管中依次加入RT反应液：5X First-Strand Buffer 4μl；0.1M DTT 1μl；RNase Ihibitor 0.3μl；SuperScript III RT 0.2μl。混合后37℃恒温1分钟。50℃温育60分钟；70℃温育15分钟使酶失活；cDNA置冰浴待用或-20℃保存。
[0077] (4)qRT-PCR反应：将所有cDNA样品分别配置Real time PCR反应体系。体系配置如下：2×Master Mix 5μl；10uM的PCR特异引物F 0.5μl；10uM的PCR特异引物R 0.5μl；加水至总体积为8μl。5000rpm短暂离心。加样：a.将8μl混合液加到384-PCR板对应的每个孔中；b.再加入对应的2μl cDNA；c.小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合；c.在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上；将上述384-PCR板置于Real time PCR仪上进行PCR反应。将PCR板置于PCR仪上进行PCR反应，程序如下：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)，从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/秒)。结果与计算：各样品的目的lncRNA或mRNA和内参β-actin分别进行Real time PCR反应；数据采用2-△△CT法进行分析。
[0078] (5)qRT-PCR测定结果表明在NSCLC患者术前/术后血浆lncRNAs两组间的表达有显著性差异，如表1所示。具体地，BRCAT54表达水平差异如图1所示：BRCAT54的相对表达水平(Relative BRCAT54expression level)，在术前(pre-operation)明显高于术后(post-operation)。
[0079] 表1
[0080]lncRNA名称 术前 术后 差异倍数 P-值
RRM-AS1 0.0148 0.00732 2.02 0.0159
TLN2 0.00571 0.00212 2.69 0.0025
TAPT1-AS1 0.129 0.0541 2.38 0.0496
BRCAT54 0.07 0.03 2.53 0.0225
RRM-AS1 0.0148 0.00732 2.02 0.0159
TLN2 0.00571 0.00212 2.69 0.0025
TAPT1-AS1 0.129 0.0541 2.38 0.0496
BRCAT54 0.07 0.03 2.53 0.0225
[0081] 4.血浆lncRNAs在NSCLC病人及健康对照组中差异表达qRT-PCR实验第一阶段验证[0082] qRT-PCR测定结果数据如表2所示，显示血浆BRCAT54在NSCLC病人及健康对照组血浆中表达差异倍数值最高，P值最小。具体地，BRCAT54表达水平差异如图2所示：BRCAT54的表达水平在NSCLC病人组中明显高于健康对照组(Healthy Control)。提示BRCAT54在NSCLC中可能发挥重要作用。因此，我们选择BRCAT54做进一步的功能和临床分析。
[0083] 表2
[0084]
[0085] 5.BRCAT54在癌组织和癌旁组织中表达差异的比较
[0087] (2)采用qRT-PCR分析8对NSCLC癌组织及相应的癌旁组织中BRCAT54的表达水平，检测结果如图3所示：显示BRCAT54在NSCLC癌组织(Tumor)中显著高于癌旁组织(Adjacent)(P＝0.0036)。
[0088] 6.BRCAT54在NSCLC癌细胞及正常气管上皮细胞内表达差异的比较
[0089] (1)细胞样本总RNA提取：按照107细胞的量加1mL Trizol，按前述Trizol法提取总RNA的有关步骤进行。
[0090] (2)采用qRT-PCR分析BRCAT54在3种NSCLC细胞系(A549,H226,PC9)及正常肺气管上皮细胞(Beas2b)的表达水平，检测结果显示BRCAT54在3种NSCLC细胞中的表达均显著高于正常细胞，如图4所示。
[0091] 另外，BRCAT54过表达延长NSCLC病人生存时间如图10所示：BRCAT54表达水平较高(High)的NSCLC患者存活率(Survival Probability)相对较高。
[0092] 实施例2 BRCAT54高表达抑制NSCLC细胞增殖、迁移，促进凋亡
[0093] 1.构建BRCAT54过表达质粒：
[0094] 根据NCBI数据库中BRCAT54(NR_109862的序列设计引物如下：
[0095] 上游引物
[0096] SEQ ID No.2：5′CCCAAGCTTAGTCGTGGTTTCCTGCGTTTGTAGA3′；
[0097] 下游引物
[0098] SEQ ID No.3：5′CCGCTCGAGAGCATGATTCCCTGAGATAGGGTTT3′。
[0099] 用上述引物扩增人全长BRCAT54序列(1395bp)。并将目的片段克隆入表达载体pcDNA3.1(Life，USA)，图谱如图5所示，最终命名为pcDNA3.1-BRCAT54，其中，HindIII和XhoI之间为BRCAT54插入区间。
[0100] 先用上述引物经PCR扩增目的基因，然后用HindIII和XhoInei内切酶消化pcDNA3.1质粒，按目的基因与载体量3：1～8：1的比例配置连接体系(vector 1μl、gene 1μl、T4ligase 0.5μl、10×ligase Buffer 1μl、DdH2O To 10μl)，14～16℃，16hrs完成连接，连接产物热激法转化大肠杆菌感受态细胞，PCR鉴定阳性菌落，使用测序引物开展一代测序验证。
[0101] 2.siRNA的构建：根据BRCAT54序列设计了3条干扰siRNA及一条siRNA对照，分别为：
[0102] (1)S154：
[0103] 正义链F(5'-3')为GUCAGCAAUGUGAUGGUGUUU(SEQ ID No.4)，
[0104] 反义链R(5'-3')为ACACCAUCACAUUGCUGACUU(SEQ ID No.5)；
[0105] (2)S155：
[0106] 正义链F(5'-3')为CACAUAACACCUUCACUAG UU(SEQ ID No.6)，
[0107] 反义链R(5'-3')为CUAGUGAAGGUGUUAUGUGUU(SEQ ID No.7)；
[0108] (3)S156：
[0109] 正义链F(5'-3')为GUAAGUGUCUGAUUUCACAUU(SEQ ID No.8)，
[0110] 反义链R(5'-3')为UGUGAAAUCAGACACUUACUU(SEQ ID No.9)。
[0111] (4)siRNA NCS20
[0112] 正义链F(5'-3')为UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT，
[0113] 反义链R(5'-3')为ACGUGACACGUUCGGAGAA dTdT。
[0114] 3.细胞分组：空培对照组，空白对照组(Blank)，空载质粒vector组(Empty Vector，或简称VEC)，过表达BRCAT54质粒组(pcDNA3.1-BRCAT54，简称vec BRCAT54)，干扰对照组(scrambled，含有与BRCAT54相似的序列)，siRNAa组(即si BRCAT54a，采用上述S154干扰siRNA对照)，siRNAb组(即si BRCAT54b，采用上述S155干扰siRNA对照)。
[0115] 4.细胞转染：将对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化，进行细胞计数，然后种于6孔板中，加入Opti-MEM稀释以备转染。生长约24h待细胞长满，分别采用Lipofectamine 2000转染。向BRCAT54过表达组中加入质粒pcDNA3.1-BRCAT54进行转染，向阴性对照组转入空载体质粒pcDNA3.1，空白对照组不作处理。静止10～20min，置37℃、5％CO2细胞培养箱孵育，24～48hrs后收集细胞供下游实验检测。
[0116] 5.细胞增殖实验：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100uL，以每孔2000个细胞接种到96孔板中。37℃，5％CO2孵育过夜，将EndoFectin-Lenti、质粒或siRNA、无血清DMEM平衡至+15～25℃；用无血清DMEM培养基稀释适量质粒，用同样的培养基稀释EndoFectin-Lenti试剂；轻轻涡旋质粒溶液，并逐滴添加稀释的EndoFectin-Lenti试剂，充分混匀后，室温静置10～25min以形成DNA-EndoFectin-Lenti复合物；将DNA-EndoFectin-Lenti复合物逐滴加入培养皿中，边加边摇晃；37℃，5％CO2培养24h；每孔加入10μL CCK8溶液，继续孵育1-4h，终止培养。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
[0117] 6.细胞增殖实验结果如图6和图7所示，与空载vector(Empty Vector)比较，pcDNA3.1-BRCAT54过表达可显著抑制PC9细胞增殖活性(Rate of Cell Proliferation)。与scrambled比较，转染siRNA(即si BRCAT54，包括S154、S155和S156)干扰后，促进PC9细胞增值。
[0118] 7.细胞侵袭实验：待细胞长满至70-80％，无血清化12-24h，分组；实验前，用无血清培养基水化铺有细胞外基质的transwell小室过夜；将转染后的细胞，用胰酶消化，呈细胞悬液状，计数板计数，每组细胞数相同，为1.2×104/ml；铺有细胞外基质transwell小室下室加入含15％FBS血清的培养基700μl后，将小室轻放其上；上室中加入准备好的细胞悬液200μl，放入培养箱中培养24h；将上室取出放入另一干净24板孔中，用PBS清洗3遍，加入纯甲醇200μl，固定细胞15min，然后将其吸出，加入结晶紫200μl染色15min；将结晶紫吸出，加入PBS清洗2遍；采用相差显微镜技术随机选取5个视野计算细胞数。
[0119] 8.细胞侵袭实验如图8所示：A为空白对照组(Blank)，B为空载质粒vector组(VEC)，C为过表达BRCAT54质粒组(vecBRCAT54)，D为干扰对照组(scrambled)，E为siRNAa组(即si BRCAT54a)，F为siRNAb组(即si BRCAT54b)。与scrambled相比，转染siBRCAT54的细胞侵袭率升高；与VEC相比，转染vecBRCAT54的细胞侵袭率降低。
[0120] 9.细胞凋亡实验：调整待测细胞的浓度为5×105个/ml左右。取1ml细胞，1000rpm，4℃离心5分钟，弃上清。加入1ml冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮。用去离子水按1:3稀释Binding Buffer(4ml Binding Buffer+12ml去离子水)。用250μl Binding Buffer重新悬浮细胞，调节其浓度为1×106/ml。取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/FITC和10μl 20μg/ml的PI溶液。混匀后于室温避光孵育15分钟。在反应管中加400μl PBS，流式细胞仪分析。
[0121] 10.细胞凋亡实验如图9所示：与scrambled对照相比，干扰BRCAT54后，细胞凋亡率(Apoptotic rate)降低；与VEC相比，过表达BRCAT54后，细胞凋亡率增加。
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