一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法
阅读：475发布：2023-02-08
专利汇可以提供一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种包埋取向 纳米 纤维 膜的微流控芯片的制备方法，包括：将PEI/PVA纺丝液， 静电纺丝 ， 蒸汽 交联，得到取向PEI/PVA纳米纤维膜；表面修饰两性离子MPC和靶向配体Cys-PEG-FA得到PEI/PVA-PMPC-FA；与鱼骨形PDMS微流控通道盖片等离子键合，得到包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片，可用于循环 肿瘤 细胞分选。本发明操作简单，可快速实现血液中循环肿瘤细胞的高纯度捕获和快速释放，以两性离子修饰赋予了纳米纤维膜优异的抗蛋白和抗血细胞粘附性能，提高了捕获细胞的纯度，取向纳米纤维膜减少了血细胞的非特异性粘附，进一步提高了捕获纯度，具有广阔的应用前景。，下面是一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法，包括：
(1)将末端为巯基的PEG化叶酸SH-PEG-FA溶解于去离子水中，加入半胱氨酸Cysteine和双氧水，冰浴磁力搅拌反应，然后透析、真空冷冻干燥得到浓度为5～15mg/mL的Cys-PEG-FA水溶液；其中SH-PEG-FA、半胱氨酸、双氧水的摩尔比为1：1.5～2：2～4；去离子水与双氧水的体积比为5mL：8～12μL；
(2)将聚乙烯亚胺PEI和聚乙烯醇PVA加入去离子水中，磁力搅拌，得到质量分数为8～
12wt％的PEI/PVA纺丝液，静电纺丝，得到PEI/PVA纳米纤维膜，蒸汽交联，得到交联处理后的取向PEI/PVA纳米纤维膜；其中PEI和PVA的质量比为0.5：1～2；
(3)将步骤(2)得到的交联处理后的取向PEI/PVA纳米纤维膜浸没在无水二氯甲烷溶液中，加入三乙胺Et3N，再逐滴加入2-溴异丁酰溴BBIB，冰浴反应，然后室温反应，经超声清洗得到表面溴化的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-Br；其中Et3N和BBIB的摩尔比为1～3：1，BBIB的无水二氯甲烷溶液浓度为20～50mg/mL；
(4)在氮气氛围下将步骤(3)得到的PEI/PVA-Br加入到甲醇和去离子水的混合溶液，继续加入溴化亚铜CuBr、联吡啶BPY、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱MPC单体，聚合反应，然后经超声清洗，真空干燥得到两性离子MPC功能化修饰的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-Br；其中MPC的浓度为50～300mg/mL，CuBr、BPY、MPC的摩尔比为1：2：15～17；
(5)将步骤(1)得到的Cys-PEG-FA溶解于溶剂中，磁力搅拌充分溶解，加入缚酸剂和步骤(4)得到的PEI/PVA-PMPC-Br，升温反应，然后超声清洗，真空干燥后得到两性离子MPC和靶向配体Cys-PEG-FA功能化修饰的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-FA；其中溶剂的用量为18～22mL，Cys-PEG-FA与缚酸剂的摩尔比为1：1～1.2；
(6)将负载步骤(5)得到的PEI/PVA-PMPC-FA的载玻片作为基底，与鱼骨形聚二甲基硅氧烷PDMS微流控通道盖片，通过等离子键合，得到包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片。
2.根据权利要求1所述的一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的双氧水的质量分数为30％；冰浴磁力搅拌时间为1～2h；透析的工艺参数为：以截留分子量为1000的透析袋，在去离子水中透析3天；真空冷冻干燥的工艺参数为：真空度为0.085～0.1mBar，冷冻干燥温度为-40～-50℃，冷冻干燥时间为48～72h。
3.根据权利要求1所述的一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中磁力搅拌的工艺参数为：搅拌温度为80～100℃，搅拌时间为3～5h；静电纺丝的工艺参数为：选用16号针头，纺丝电压为25kV，流速0.6mL/h，接收距离10cm，环境温度20～25℃，湿度40～50％，以包覆在转速为2000～2500r/min转轴上的铝箔纸为接收装置；蒸汽交联的工艺参数为：在底部放有质量分数为20～30％的戊二醛溶液的真空干燥器中抽真空至真空度达到0.08～0.09Mpa，交联处理11～13h。
4.根据权利要求1所述的一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中冰浴反应时间为3～5h；室温反应时间为8～12h；超声清洗的工艺参数为：以二氯甲烷和去离子水依次超声清洗3～8min。
5.根据权利要求1所述的一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中混合溶液中甲醇和去离子水的体积比为1：1；聚合反应时间为1～6h；
超声清洗的工艺参数为：以甲醇和去离子水依次超声清洗3～8min；真空干燥的工艺参数为：真空度为0.09～0.1MPa，干燥温度为40～50℃，干燥时间为22～26h。
6.根据权利要求1所述的一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中溶剂为二甲基亚砜DMSO；缚酸剂为碳酸钾或三乙胺；磁力搅拌时间为
0.5～1h；升温反应的工艺参数为：反应温度为70～80℃，时间为5～7h；超声清洗的工艺参数为：以甲醇和去离子水超声清洗5～10min；真空干燥的工艺参数为：真空度为0.09～
0.1MPa，干燥温度为35～45℃，干燥时间为46～50h。
7.根据权利要求1所述的一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中的鱼骨形PDMS微流控通道盖片是通过设计出包含一个入口、一个出口、四条平行的鱼骨形通道的鱼骨形微流控通道结构，然后打印出掩膜版，再在硅片上光刻制备出模具，然后倒模得到；其中鱼骨形微流控通道结构的微流控通道高度为40μm，鱼骨高度为30μm，通道入口到出口的总长度为65mm，鱼骨形通道长度为45.5mm，通道总宽度为
20mm，单条鱼骨形通道宽度为4mm。
8.根据权利要求1所述的一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中的等离子键合的工艺参数为：真空度为20～26Pa，空气中键合处理40～50s。
9.根据权利要求1所述的一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)得到的包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片用于循环肿瘤细胞CTC分选，包括癌细胞的捕获和释放。
10.根据权利要求9所述的一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述癌细胞的捕获和释放的工艺参数为：先向所述包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片中通入磷酸盐缓冲液PBS，然后通入含有癌细胞的细胞悬液或癌症患者血液，再通入磷酸盐缓冲液PBS，完成捕获过程；向所述包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片中持续通入谷胱甘肽GSH溶液，并收集回收液，完成捕获癌细胞的释放。
一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于微流控芯片和细胞分选技术领域，特别涉及一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法。
背景技术
[0002] 循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTC)的检测对于肿瘤的早期诊断、疾病发展预测、疗效评估、预后判断和个体化治疗具有极其重要的意义。但血液中CTC数目极少，采用常规手段难以实现捕获和分离。例如，依据密度的不同，采用密度梯度离心的方法分离血液中各种组分是最为经典的方法。但CTC可能会迁移至血浆层或留于红细胞或中性粒细胞中，造成分离过程中CTC的丢失[Lalmahomed ZS,et al.Circulating tumor cells and sample size:the more,the better.Journal of Clinical Oncology.2010,28:e288-e289.]。流式细胞术可以快速、准确的筛选细胞，但操作复杂，且依赖分析细胞的数量，需要大量外周血方可有效检验肿瘤细胞负荷，因此难以对血液中的CTC变化进行长期监控。有一些研究采用膜过滤的方式，利用细胞尺寸的区别将CTC从全血中分离[Desitter I,et al.A new device for rapid isolation by size and characterization of rare circulating tumor cells.Anticancer Research.2011；31:427-441.]，但一般纯度不高。
因此，探索一种高效、简便、高纯度的CTC捕获技术是目前研究的重点。
因此，探索一种高效、简便、高纯度的CTC捕获技术是目前研究的重点。
[0003] 近年来，基于微流控技术和纳米材料的检测平台受到了广泛的关注。微流控芯片是通过设计和制作出各种结构、尺寸在微米量级的管道进行实验的装置。微流控通道的特征尺度与细胞尺寸相匹配，通过对细胞周围流场的精细控制，或是芯片上加工的各种微型结构，可以对细胞进行各种操作。此外，微流控芯片具有装置体积小、样品需求量少以及对微量液体精准操作的优点，非常适用于血液中CTC的分选。静电纺纳米纤维具有极大的比表面积，能提供大量的细胞接触位点，使单位体积内捕获细胞的数量增加，因而静电纺纳米纤维被越来越多的应用在CTC的捕获与检测领域。此外，静电纺纳米纤维还具有制备工艺简单、原料来源广泛、便于后续多功能化修饰等诸多优点。例如，聚乙烯亚胺/聚乙烯醇PEI/PVA静电纺纳米纤维是一种以水为溶剂的绿色纳米纤维，PEI/PVA纳米纤维表面带有大量的氨基和羟基便于后续的功能化修饰，可将靶向配体修饰在纳米纤维表面用于癌细胞的特异性捕获。本课题组前期的研究中发现，无规的PEI/PVA纳米纤维多孔网状结构可能会造成细胞的非特异性嵌入，导致捕获到的癌细胞纯度降低[Zhao Y,et al.Hyaluronic acid-functionalized electrospun polyvinyl alcohol/polyethyleneimine nanofibers for cancer cell capture applications.Adv.Mater.Interfaces,2015,2,1500256.]。因此，可以尝试制备取向性的纳米纤维，以提高最终捕获癌细胞的纯度。
[0004] 研究表明，使用微纳米基质或含特定结构设计的微流控芯片可获得理想的分离效率，但CTC目前的分离纯度普遍较低[Sheng W,et al.Multivalent DNA nanospheres for enhanced capture of cancer cells in microfluidic devices.ACS Nano,2013,7(8):7067.]。因此通过发明新材料或发展新方法，保证CTC高效捕获的同时，采取有效手段提高CTC的分离纯度是当前的一个重要研究方向。Wang等人利用两性离子半胱氨酸修饰的纳米粒子用于肿瘤的磁共振成像，发现两性离子具有良好的抗污性能，采用两性离子修饰可赋予纳米材料优异的抗蛋白黏附性能，同时两性离子修饰还可减少巨噬细胞的吞噬，延长纳米材料在血液中的循环时间[Wang P,et al.Antifouling manganese oxide nanoparticles:synthesis,characterization,and applications for enhanced mr imaging of tumors.Acs Applied Materials&Interfaces.2017,9:47-53.]。同时，查阅文献发现，修饰两性离子的纳米材料可获得血液惰性表面，减小血细胞黏附[Chang Y,et al.Blood-inert surfaces via ion-pair anchoring of zwitterionic copolymer brushes in human whole blood.Adv Funct Mater.2013,23:1100-1110.]。因此，可以通过在材料表面修饰两性离子，使其获得血液惰性表面，从而减少血液中蛋白质和血细胞的非特异性黏附，提高最终捕获到的CTC的纯度。
[0005] 目前，常见的CTC分选技术大多是对血液中的CTC进行捕获或者富集，捕获后的肿瘤细胞继续保留于基质上，不利于后续的检测分析，如细胞培养、PCR分析等。Yu等人于2014年发表在《Science》上的研究成果表明，若能将CTC从捕获基质有效解离并对其进行体外培养，结合基因测序与体外药敏实验，将有助于建立基于CTC的肿瘤个性化诊断技术[Yu M,et al.Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.Science,2014,345(6193):216-220.]。因此，发展有效的技术手段，满足CTC高效捕获的同时实现CTC无损释放，获取具有高生物活力的CTC，是当前CTC研究的另一热点。当前，已有部分CTC可逆释放体系取得了可喜进展，但释放过程中存在细胞损伤及释放效率较低等问题。因此必须建立温和的CTC释放体系，获取纯度高、活力好的CTC，方便对其进行后续培养及再分析。二硫键是一种还原敏感性的化学基团，在还原性物质(如二硫苏糖醇DTT、谷胱甘肽GSH、硼氢化钠等)作用下可快速断裂。利用二硫键可实现纳米材料负载药物的控制释放，通过还原性物质实现二硫键的快速断裂，用于肿瘤的药物和基因治疗。[Zhao D,et al.Redox-sensitive mPEG-SS-PTX/TPGS mixed micelles:An efficient drug delivery system for overcoming multidrug resistance.International Journal of Pharmaceutics,2016,515,281-292]。有研究者将二硫键作为癌细胞靶向配体的中间连接体，室温下采用DTT溶液处理30min，实现捕获细胞的快速释放[Huang C,et al.Multifunctional"smart"particles engineered from live immunocytes:toward capture and release of cancer cells.Adv.Mater.2015,
27,310-313]。
27,310-313]。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法及其在循环肿瘤细胞分选中的应用，该方法制得的微流控芯片可实现CTC的高纯度捕获和快速无损释放，为用于循环肿瘤细胞分选的微流控芯片的制备提供了一种新方法，应用前景广阔。
[0007] 本发明的一种包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片的制备方法，包括：
[0008] (1)将末端为巯基的PEG化叶酸SH-PEG-FA溶解于去离子水中，加入半胱氨酸Cysteine和双氧水，冰浴磁力搅拌反应，然后透析、真空冷冻干燥得到浓度为5～15mg/mL的Cys-PEG-FA水溶液；其中SH-PEG-FA、半胱氨酸、双氧水的摩尔比为1：1.5～2：2～4；去离子水与双氧水的体积比为5mL：8～12μL；
[0009] (2)将聚乙烯亚胺PEI和聚乙烯醇PVA加入去离子水中，磁力搅拌，得到质量分数为8～12wt％的PEI/PVA纺丝液，静电纺丝，得到PEI/PVA纳米纤维膜，蒸汽交联，得到交联处理后的取向PEI/PVA纳米纤维膜；其中PEI和PVA的质量比为0.5：1～2；
[0010] (3)将步骤(2)得到的交联处理后的取向PEI/PVA纳米纤维膜浸没在无水二氯甲烷溶液中，加入三乙胺Et3N，再逐滴加入2-溴异丁酰溴BBIB，冰浴反应，然后室温反应，经超声清洗得到表面溴化的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-Br；其中Et3N和BBIB的摩尔比为1～3：1，BBIB的无水二氯甲烷溶液浓度为20～50mg/mL；
[0011] (4)在氮气氛围下将步骤(3)得到的PEI/PVA-Br加入到甲醇和去离子水的混合溶液，继续加入溴化亚铜CuBr、联吡啶BPY、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱MPC单体，聚合反应，然后经超声清洗，真空干燥得到两性离子MPC功能化修饰的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-Br；其中MPC的浓度为50～300mg/mL，CuBr、BPY、MPC的摩尔比为1：2：15～17；
[0012] (5)将步骤(1)得到的Cys-PEG-FA溶解于溶剂中，磁力搅拌充分溶解，加入缚酸剂和步骤(4)得到的PEI/PVA-PMPC-Br，升温反应，然后超声清洗，真空干燥后得到两性离子MPC和靶向配体Cys-PEG-FA功能化修饰的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-FA；其中溶剂的用量为18～22mL，Cys-PEG-FA与缚酸剂的摩尔比为1：1～1.2；
[0014] 所述步骤(1)中的双氧水的质量分数为30％。
[0015] 所述步骤(1)中冰浴磁力搅拌时间为1～2h。
[0016] 所述步骤(1)中透析的工艺参数为：以截留分子量为1000的透析袋，在去离子水中透析3天。
[0017] 所述步骤(1)中真空冷冻干燥的工艺参数为：真空度为0.085～0.1mBar，冷冻干燥温度为-40～-50℃，冷冻干燥时间为48～72h。
[0018] 所述步骤(2)中磁力搅拌的工艺参数为：搅拌温度为80～100℃，搅拌时间为3～5h。
[0019] 所述步骤(2)中静电纺丝的工艺参数为：选用16号针头，纺丝电压为25kV，流速0.6mL/h，接收距离10cm，环境温度20～25℃，湿度40～50％，以包覆在转速为2000～2500r/min转轴上的铝箔纸为接收装置。
[0020] 所述步骤(2)中蒸汽交联的工艺参数为：在底部放有质量分数为20～30％的戊二醛溶液的真空干燥器中抽真空至真空度达到0.08～0.09Mpa，交联处理11～13h。
[0021] 所述步骤(3)中冰浴反应时间为3～5h。
[0022] 所述步骤(3)中室温反应时间为8～12h。
[0023] 所述步骤(3)中超声清洗的工艺参数为：以二氯甲烷和去离子水依次超声清洗3～8min。
[0024] 所述步骤(4)中混合溶液中甲醇和去离子水的体积比为1：1。
[0025] 所述步骤(4)中聚合反应时间为1～6h。
[0026] 所述步骤(4)中超声清洗的工艺参数为：以甲醇和去离子水依次超声清洗3～8min。
[0027] 所述步骤(4)中真空干燥的工艺参数为：真空度为0.09～0.1MPa，干燥温度为40～50℃，干燥时间为22～26h。
[0028] 所述步骤(5)中溶剂为二甲基亚砜DMSO。
[0030] 所述步骤(5)中磁力搅拌时间为0.5～1h。
[0031] 所述步骤(5)中升温反应的工艺参数为：反应温度为70～80℃，时间为5～7h。
[0032] 所述步骤(5)中超声清洗的工艺参数为：以甲醇和去离子水超声清洗5～10min。
[0033] 所述步骤(5)中真空干燥的工艺参数为：真空度为0.09～0.1MPa，干燥温度为35～45℃，干燥时间为46～50h。
[0035] 所述鱼骨形微流控通道结构的微流控通道高度为40μm，鱼骨高度为30μm，通道入口到出口的总长度为65mm，鱼骨形通道长度为45.5mm，通道总宽度为20mm，单条鱼骨形通道宽度为4mm。
[0036] 所述步骤(6)中的等离子键合的工艺参数为：真空度为20～26Pa，空气中键合处理40～50s。
[0037] 所述步骤(6)得到的包埋取向纳米纤维膜的微流控芯片用于循环肿瘤细胞CTC分选，包括癌细胞的捕获和释放。
[0038] 所述癌细胞的捕获和释放的工艺参数为：先向所述包埋取向纳米纤维的微流控芯片中通入磷酸盐缓冲液PBS，保证通道和纳米纤维膜充分浸润，将含有癌细胞的细胞悬液或癌症患者血液通入微流控芯片中，随后再次通入磷酸盐缓冲液PBS清洗微流控通道，完成捕获过程；以8mL/h的流速向微流控芯片中通入事先配置好的30mM的谷胱甘肽GSH溶液，持续通入一定时间后，并收集回收液，完成捕获癌细胞的释放。
[0039] 本发明综合纳米纤维和微流控技术，通过在取向纳米纤维表面修饰两性离子MPC，赋予纳米纤维膜抗蛋白吸附和抗血细胞粘附的能力，从而提高捕获到的癌细胞的纯度；在纳米纤维膜表面进一步修饰靶向配体FA，使得纳米纤维膜能够特异性地结合叶酸受体过表达的癌细胞，实现肿瘤细胞的特异性捕获；以还原敏感断裂的二硫键作为靶向配体与纳米纤维的中间连接体，实现了循环肿瘤细胞的快速无损释放；利用鱼骨形通道产生的紊流，增加癌细胞与纳米纤维膜基底的碰撞接触几率，提高了捕获的效率。本发明制备的包埋取向纳米纤维的微流控芯片实现了CTC的高效捕获和快速无损释放，为用于循环肿瘤细胞分选的微流控芯片的开发提供了一种新方法。
[0040] 有益效果
[0041] (1)本发明中主体材料为取向PEI/PVA纳米纤维膜和PDMS微流控盖片，材料加工工艺简单，成本低廉，具有产业化实施的前景。
[0042] (2)本发明通过两性离子对纳米纤维膜的功能化修饰，赋予纳米纤维膜抗蛋白吸附和抗血细胞粘附的能力，从而提高捕获到的癌细胞的纯度。
[0043] (3)本发明通过制备取向纳米纤维，减少细胞的非特异性黏附，进一步提高了捕获癌细胞的纯度。
[0044] (4)本发明以叶酸为靶向配体，叶酸廉价易得，且对叶酸受体过表达的癌细胞靶向特异性强，灵敏度高。
[0045] (5)本发明以还原敏感性断裂的二硫键作为靶向配体与纳米纤维基底的中间连接体，实现了循环肿瘤细胞的快速无损释放，便于后续对CTC的检测分析。
[0046] (6)本发明将功能化取向纳米纤维和微流控技术相结合，制备的包埋取向纳米纤维的微流控芯片可实现CTC的高纯度捕获和快速无损释放，为用于循环肿瘤细胞分选的微流控芯片的开发提供了一种新方法，在循环肿瘤细胞的分离和检测分析方面具有广阔的应用前景。附图说明
[0047] 图1为本发明中SH-PEG-FA和Cys-PEG-FA的红外光谱对比图；
[0048] 图2为本发明中取向PEI/PVA纳米纤维膜的扫描电镜图及尺寸分布图；其中(a)为扫描电镜图，(b)为尺寸分布图；
[0049] 图3为本发明中功能化纳米纤维PEI/PVA-PMPC-FA的合成示意图；
[0050] 图4为本发明中取向纤维膜修饰前后的红外光谱图和热重分析图，其中(a)为红外光谱图，(b)为热重分析图；
[0051] 图5为本发明中取向纤维膜修饰前后的溶血试验结果和动态凝血试验结果，其中(a)为溶血试验结果，(b)为动态凝血试验结果；
[0052] 图6为本发明中取向纳米纤维膜修饰前后对蛋白质的抗吸附试验结果和对血细胞的抗黏附试验结果，其中(a)为对蛋白质的抗吸附试验结果，(b)为对血细胞的抗黏附试验结果；
[0053] 图7为本发明中包埋取向纳米纤维的微流控芯片对癌细胞的捕获效果，其中(a)为不同流速条件下微流控芯片对癌细胞HeLa的捕获效率，(b)为不同流速条件下微流控芯片对癌细胞HeLa的捕获纯度；
[0054] 图8为本发明中包埋取向纳米纤维的微流控芯片对捕获到的癌细胞的释放效果，(a)为不同处理时间后癌细胞的释放效率，(b)为不同处理时间后释放癌细胞的活性；
[0055] 图9为本发明中鱼骨形微流控通道结构示意图。
具体实施方式
[0056] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0057] 实施例1
[0058] (1)将37.2mg SH-PEG-FA溶解于5mL去离子水中，加入2.42mg半胱氨酸Cysteine和10μL质量分数为30％的双氧水，冰浴磁力搅拌反应1h，然后以截留分子量为1000的透析袋，在去离子水(9次，2L/次)中透析三天，在真空度为0.09mBar，-45℃低温条件下冷冻干燥
48h，得到Cys-PEG-FA水溶液。
48h，得到Cys-PEG-FA水溶液。
[0059] (2)将0.5g聚乙烯亚胺PEI和1.5g聚乙烯醇PVA加入18g去离子水中，90℃下磁力搅拌4h，得到质量分数为10wt％的PEI/PVA纺丝液，以10mL的注射器吸取PEI/PVA纺丝液，注射器连接16号针头，设置注射泵流速为0.6mL/h，以包覆在转速为2500r/min转轴上的铝箔纸为接收装置，调节接收距离为20cm，设置纺丝电压为25kV，在环境温度25℃，湿度50％条件下进行静电纺丝处理，得到PEI/PVA纳米纤维膜，放入真空干燥器中进行蒸汽交联，真空干燥器底部放有质量分数为25％的戊二醛溶液，然后抽真空至真空度达到0.085Mpa，交联处理12h，得到交联处理后的PEI/PVA纳米纤维膜。
[0060] (3)将步骤(2)得到的交联处理后的PEI/PVA纳米纤维膜浸没在20mL的无水二氯甲烷溶液中，加入500μL的三乙胺，再逐滴加入412μL的2-溴异丁酰溴BBIB，冰浴反应4h，然后室温反应8h，反应完成后以二氯甲烷和水依次超声清洗5min，得到表面溴化的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-Br。
[0061] (4)将步骤(3)得到的PEI/PVA-Br加入圆底烧瓶中，充氮赶氧5次，然后在氮气氛围下加入20mL甲醇和去离子水的混合溶液(v/v＝1:1)，继续加入107mg溴化亚铜CuBr、234mg联吡啶、1.77g的2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱MPC单体，聚合反应2h，随后取出纳米纤维膜，以甲醇和去离子水依次超声清洗5min，在真空度为0.095MPa，45℃条件下真空干燥24h，得到两性离子MPC功能化修饰的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-Br。
[0062] (5)将步骤(1)得到的Cys-PEG-FA溶解于20mL二甲基亚砜DMSO溶剂中，磁力搅拌1h充分溶解，加入2.1mg碳酸钾作为缚酸剂和步骤(4)得到的PEI/PVA-PMPC-Br，随后升温至75℃，保持温度回流反应6h，然后以甲醇和去离子水超声清洗8min，在真空度为0.095MPa，40℃条件下真空干燥48h后得到两性离子MPC和靶向配体Cys-PEG-FA功能化修饰的PEI/PVA纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-FA。
[0063] (6)利用Auto CAD软件设计微流控通道结构，微流控通道设计采用鱼骨形通道，包括：一个入口，一个出口，四条平行的鱼骨形通道，通道高度40μm，鱼骨高度30μm，通道入口到出口的总长度为65mm，鱼骨形通道长度45.5mm，通道总宽度为20mm，单条鱼骨形通道宽度为4mm(如图9所示)；然后把设计好的芯片利用高分辨率的打印机打印出掩膜版，再利用光刻技术在硅片上制备出微流控芯片模具，最后利用制备好的芯片模具倒模出相应的聚二甲基硅氧烷PDMS微流控通道盖片。
[0064] (7)通过等离子键合技术，设置真空度为21Pa，空气氛围下处理50s，将负载步骤(5)得到的PEI/PVA-PMPC-FA的载玻片作为基底，与步骤(6)得到的PDMS微流控通道盖片键合，得到包埋两性离子功能化纳米纤维膜的微流控芯片。
[0065] 实施例2
[0066] 本发明以扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、热重(TG)以及溶血-凝血试验、抗蛋白和血细胞黏附试验、癌细胞的捕获和释放试验表征本发明中制备的功能化取向纳米纤维膜的各项性能及其结合微流控芯片在循环肿瘤细胞分选中的应用潜能。
[0067] 傅里叶变换红外光谱测试：
[0068] 采用FTIR表征实施例1步骤(1)是否合成了含有二硫键的Cys-PEG-FA，红外光谱表-1征分析结果如图1所示，在2591cm 处为SH-PEG-FA中巯基SH的红外特征吸收峰，而Cys-PEG-FA红外图谱中2591cm-1处巯基SH的红外特征吸收峰消失，在456cm-1处出现了二硫键-S-S-的红外吸收峰，说明半胱氨酸与SH-PEG-FA通过巯基的氧化反应得到了含有二硫键的Cys-PEG-FA。
[0069] 采用FTIR表征实施例1步骤(5)得到的PEI/PVA-PMPC-FA中两性离子MPC和靶向配体Cys-PEG-FA是否成功修饰在其表面，结果如图4(a)所示：(1)曲线为PEI/PVA纳米纤维膜的红外曲线，(2)曲线在1275cm-1处出现了属于两性离子MPC的磷氧双键的特征吸收峰，说明两性离子MPC已成功修饰在纳米纤维表面；此外，相比(1)，(2)曲线，曲线(3)在1570cm-1和1485cm-1出现了叶酸FA中苯环的红外特征吸收峰，说明靶向配体FA已成功修饰在纳米纤维表面。
[0070] 扫描电子显微镜测试：
[0071] 采用SEM表征步骤(2)取向PEI/PVA纳米纤维膜的形貌和直径大小。SEM结果如图2(a)所示，直径大小如图2(b)所示，通过静电纺丝技术制备出了表面光滑、尺寸均一、平均直径为357nm的取向PEI/PVA纳米纤维膜，纤维取向性好，网孔较少。
[0072] 热失重测试：
[0073] 通过TGA来检测实施例1步骤(5)得到的取向纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-FA中的两性离子MPC和靶向配体Cys-PEG-FA的质量百分比。TGA测试结果如图4(b)所示：对比图中PEI/PVA和PEI/PVA-PMPC的热重曲线可知，修饰在纳米纤维PEI/PVA-PMPC表面的两性离子所占含量为20.36％；通过分析PEI/PVA-PMPC和PEI/PVA-PMPC-FA的热重曲线并计算可知，功能化纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-FA中，Cys-PEG-FA所占含量约为28.03％。从而得出功能化纳米纤维膜PEI/PVA-PMPC-FA中，两性离子MPC和靶向配体Cys-PEG-FA的质量百分比分别为14.65％和28.03％。
[0074] 实施例3
[0075] 溶血试验测试：
[0076] 通过溶血试验研究修饰前后纳米纤维膜的血液相容性。取新鲜的健康成年人全血1mL，2000r/min离心处理5min然后以磷酸盐缓冲液PBS洗涤3次，得到红细胞HRBCs。将HRBCs用PBS溶液稀释30倍，取出0.2mL HRBCs稀释液转移至含有0.8mL PBS的1.5mL离心管中，作为阴性对照。取0.2mL HRBCs稀释液转移至含有0.8mL蒸馏水的1.5mL离心管中，作为阳性对照。随后，将所配置的HRBCs稀释液用PBS再稀释5倍，取实施例1步骤(2)的交联处理后的PEI/PVA纳米纤维膜、步骤(4)的PEI/PVA-PMPC-Br纳米纤维膜、步骤(5)的PEI/PVA-PMPC-FA纳米纤维膜各4mg浸入到1mL稀释5倍后的HRBCs悬液中，每个样品设置5个平行样，在37℃环境下孵育2h。最后，取出纤维膜，将对照组及浸泡过纤维膜的HRBCs悬液以10000r/min的转速离心1min，离心后拍照，并取上清液用紫外分光光度计测试上清液在450～800nm处的吸光值，并利用公式计算溶血率。
[0077] 溶血试验的测试结果如图5(a)所示：溶血试验结果可知PBS阴性对照组和3种纳米纤维膜均未出现明显的溶血现象，且3种纳米纤维膜的溶血率均小于5％，说明纳米纤维膜具有良好的血液相容性。
[0078] 动态凝血试验测试：
[0079] 采用动态凝血试验对纳米纤维膜的抗凝血性能进行评价。首先将直径为14mm的圆形盖玻片负载的3种纳米纤维膜，放入12孔培养板中，每个样品取4个平行样，直径为14mm的盖玻片作为对照。然后，向每孔中纤维毡以及对照组盖玻片上滴加20μL肝素锂稳定的健康成年人全血，同时加入10μL浓度为0.2mol/L的氯化钙CaCl2溶液，置于37℃环境下孵育5、10、20、30、40、60min。在每个培养时间结束后，向每孔加5mL蒸馏水并37℃孵育5分钟，然后用UV-Vis测试上清夜中在540nm处的吸光值。
[0080] 动态凝血试验的测试结果如图5(b)所示：动态凝血试验结果可知经过两性离子和靶向配体的修饰，功能化纳米纤维膜获得了一定的抗凝血性能。
[0081] 实施例4
[0082] 抗粘附性能测试：
[0083] 选用牛血清白蛋白BSA表征修饰前后纳米纤维膜对蛋白的吸附情况。首先配置梯度浓度纤维蛋白原的PBS溶液，利用UV-Vis分光光度计测试不同浓度BSA溶液的在280nm处的吸光值，得到BSA溶液的浓度-吸光度标准曲线。将负载有3种纳米纤维膜的圆形盖玻片放入24孔板中，每孔加入500μL的PBS溶液室温下平衡4h，随后吸出PBS溶液，再向每孔中加入1mL浓度为1mg/mL的BSA溶液，每个样品设置5个平行，将孔板放入37℃恒温摇床中孵育1h，测试纳米纤维膜吸附前后上清液中蛋白的吸光度，进而计算出蛋白质的吸附量。
[0084] 抗蛋白黏附试验结果如图6(a)所示：与修饰前的PEI/PVA纳米纤维膜相比，PEI/PVA-PMPC和PEI/PVA-PMPC-FA对蛋白的吸附率明显减小，呈现出显著性差异，说明经过两性离子功能化修饰以后，纳米纤维膜获得了优异的抗蛋白粘附性能。
[0085] 取5mL新鲜的健康人血液，利用红细胞裂解液除去血液中的红细胞，1500r/min离心处理5min，得到白细胞沉淀，用钙黄绿素(Calcein-AM)染料对白细胞染色15min，再用PBS清洗3次，然后向预染色的白细胞沉淀中加入5mL细胞培养液，吹打均匀得到白细胞悬液。取出10μL白细胞悬液，用培养液稀释至1mL，用细胞计数枪计数，随后向白细胞悬液中加入一定量的新鲜培养基，得到白细胞浓度为106/mL的白细胞悬液。将负载有3种纳米纤维膜的圆形盖玻片放入24孔板中，每孔加入500μL的PBS溶液室温下平衡4h。吸出PBS溶液，每孔加入500μL的浓度为106/mL的白细胞悬液，置于37℃恒温培养箱中共培养2h。吸出白细胞悬液，用500μL的PBS溶液的清洗纤维膜3次，然后利用荧光显微镜观察黏附在纳米纤维膜上的白细胞并计数。
[0086] 抗血细胞黏附试验结果如图6(b)所示：修饰前的PEI/PVA纳米纤维膜上单位面积的血细胞粘附数目接近300个/mm2，经过两性离子修饰后的纳米纤维膜血细胞粘附数仅为0～8个/mm2，这充分说明经两性离子修饰后的纳米纤维膜表面黏附的白细胞数明显减少，几乎没有白细胞黏附，具有优异的抗血细胞粘附性能。
[0087] 实施例5
[0088] 癌细胞捕获试验测试：
[0089] 采用实施例1得到的包埋取向纳米纤维的微流控芯片研究微流控芯片对癌细胞的捕获效果。首先，研究不同流速条件下微流控芯片对癌细胞的捕获效率。取新鲜的健康人血液，裂解红细胞后得到白细胞沉淀，用钙黄绿素橙对白细胞进行染色，然后用细胞培养液重悬浮并用细胞计数仪进行计数，随后将一定数量的人宫颈癌HeLa细胞掺入到白细胞悬液中，得到白细胞浓度为106/mL、癌细胞浓度为200/mL的混合细胞悬液，掺入前对HeLa细胞用钙黄绿素红进行荧光染色，以便于后续观察计数。先向微流控芯片通入磷酸盐缓冲液PBS，保证通道和纳米纤维膜充分浸润，随后分别取1mL混合细胞悬液以不同的流速(1mL/h，2mL/h，4mL/h，6mL/h，8mL/h，10mL/h)通入到微流控芯片中，捕获完成以后再次通入磷酸盐缓冲液(PBS)清洗微流控通道，然后利用荧光显微镜观察统计纳米纤维膜上的癌细胞(红色)和白细胞(绿色)数目，计算癌细胞的捕获效率。
[0090] 不同流速条件下微流控芯片对癌细胞的捕获效率测试如图7(a)所示：随着入场流速的增大，微流控芯片对HeLa的捕获效率逐渐降低，在流速为6mL/h时，捕获效率仍能达到90％以上，说明本发明中的微流控芯片在高流速条件下，仍能保持较高的捕获效率，可在短时间内可完成癌细胞的高效捕获。
[0091] 不同流速条件下微流控芯片对癌细胞的捕获纯度测试如图7(b)所示：不同流速条件下，HeLa细胞的捕获纯度均可达到60％以上，在流速为6mL/h时，捕获纯度最高为73.2％，远远高于目前常见的癌细胞分选方法的捕获纯度(0.1％～1％)，说明本发明中的微流控芯片可实现癌细胞的高纯度捕获。
[0092] 实施例6
[0093] 癌细胞的释放试验测试：
[0094] 采用实施例1得到的包埋取向纳米纤维的微流控芯片研究微流控芯片研究对捕获到的癌细胞的释放效果。首选把HeLa细胞用胰酶消化，用无血清的培养基重悬浮细胞，然后加入钙黄绿素(Calcein-AM)染料对HeLa细胞染色15min，然后离心并以PBS溶液清洗两次除去多余染料，最后再用无血清培养基悬浮细胞，计数后利用无血清培养基调节HeLa细胞浓4 4
度为10/mL。先向微流控芯片通入磷酸盐缓冲液PBS，随后取1mL浓度为10/mL的HeLa细胞悬浮以4mL/h的流速通入微流控芯片，完成捕获后再次通入磷酸盐缓冲液PBS清洗微流控通道，用荧光显微镜观察并计数。然后以8mL/h的流速向微流控芯片中通入事先配置好浓度为
30mM的谷胱甘肽GSH溶液，通入不同时间后，利用荧光显微镜观察纳米纤维膜表面存留的癌细胞并计数，从而计算出处理不同时间后癌细胞的释放效率。
度为10/mL。先向微流控芯片通入磷酸盐缓冲液PBS，随后取1mL浓度为10/mL的HeLa细胞悬浮以4mL/h的流速通入微流控芯片，完成捕获后再次通入磷酸盐缓冲液PBS清洗微流控通道，用荧光显微镜观察并计数。然后以8mL/h的流速向微流控芯片中通入事先配置好浓度为
30mM的谷胱甘肽GSH溶液，通入不同时间后，利用荧光显微镜观察纳米纤维膜表面存留的癌细胞并计数，从而计算出处理不同时间后癌细胞的释放效率。
[0095] 不同处理时间后癌细胞的释放效率测试结果如图8(a)所示：随着处理时间的延长，癌细胞的释放效率逐渐增大，持续通入GSH溶液15min，癌细胞的释放效率即可达到91.2％，说明通入GSH溶液处理可以实现捕获癌细胞的快速释放。
[0096] 把HeLa细胞用胰酶消化，用新鲜培养基重悬浮细胞，计数后利用培养基调节HeLa细胞浓度为104/mL。先向微流控芯片通入磷酸盐缓冲液PBS，随后取1mL浓度为104/mL的HeLa细胞悬浮以4mL/h的流速通入微流控芯片，完成捕获后再次通入磷酸盐缓冲液PBS清洗微流控通道。然后以8mL/h的流速向微流控芯片中通入事先配置好的30mM的谷胱甘肽GSH溶液，收集回收液，并对通入不同时间后回收液中的癌细胞进行活死细胞染色，向回收液中加入5μL浓度为8μM的碘化丙啶PI溶液和5μL浓度为2μM的钙黄绿素AM溶液，室温下染色20min，离心处理去除染色液，随后用荧光显微镜观察并统计活(绿色)死(红色)细胞的数目，进而计算出不同处理时间后释放癌细胞的活性。
[0097] 不同处理时间后释放癌细胞的活性测试结果如图8(b)所示：经过GSH溶液处理60min后，释放癌细胞的活性仍可达到85％以上，说明本发明中的微流控芯片可以实现捕获癌细胞的无损释放。
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