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官能团与蛋白质及其底物的共价束缚

阅读：645发布：2021-12-30

专利汇可以提供官能团与蛋白质及其底物的共价束缚专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供任选地融合至目标蛋白的突变 水 解 酶。所述突变水解酶能够与对应非突变(野生型)水解酶的底物形成相比于所述野生型水解酶和所述底物之间所形成的键更为稳定的键，所述突变水解酶相比于野生型水解酶具有至少两个 氨 基酸置换。本发明还提供含一个或多个官能团的水解酶底物，以及使用所述突变水解酶和本发明底物的方法。本发明还提供能够与底物形成稳定键的融合蛋白和表达所述融合蛋白的细胞。，下面是官能团与蛋白质及其底物的共价束缚专利的具体信息内容。

1.式(I)的化合物：R-连接基团-A-X，其中：
R是一个或多个官能团；
连接基团是含一个或多个环的基团；
A-X为脱卤素酶底物；和
X为卤素。
2.权利要求1的化合物，所述化合物为红球菌(Rhodococcus) 脱卤素酶底物。
3.权利要求1-2中任一项的化合物，其中X为Cl或Br。
4.权利要求1-3中任一项的化合物，其中A为(CH2)n，n＝2- 10。
5.权利要求1-4中任一项的化合物，其中所述连接基团为含 约2至约30个碳原子的二价直链或支链碳链，所述链任选包含一个 或多个双键或三键，所述链任选由一个或多个羟基或氧代基(＝O)基团 取代，其中所述链上的一个或多个碳原子任选由非过氧化物-O-、-S- 或-NH-替换，其中所述链上的一个或多个碳原子由芳环或杂芳环替 换。
6.权利要求1-4中任一项的化合物，其中所述连接基团将R 和A分隔开至少12个原子。
7.权利要求1的化合物，其中L和/或A包含一个或多个芳 环或杂芳环。
8.权利要求1-7中任一项的化合物，其中至少一个官能团包 含氨基酸、氨酰化tRNA、化疗剂、螯合剂、蛋白质、糖蛋白、多糖、 酶、非脱卤素酶的酶的底物、酶抑制剂、自杀底物、辅酶、辅因子、 生物素或其它抗生物素蛋白结合分子、光学可检测分子、光学可检 测分子的猝灭剂、核酸分子、金属、血红素、金属螯合剂、谷胱甘 肽、琥珀酰亚胺酯或醛、核苷酸类似物、cAMP、NTA、cAMP配体、 磷脂酰肌醇、药物、脂质、固相支持体、结合Ca2+的分子、结合K+ 的分子、结合Na+的分子、pH敏感的分子、放射性核素、电子不透 明的分子；发色团、MRI造影剂、X-射线造影剂、在NO存在下有 荧光的分子、三重态感光剂、对活性氧敏感的分子或纳颗粒。
9.权利要求8的化合物，其中所述固相支持体是表面等离振 子共振传感芯片、磁性粒子、Sepharose珠、纤维素珠或导电支持体。
10.权利要求8的化合物，其中所述核酸分子为寡核苷酸、对 应于目标基因的DNA、结合蛋白的DNA、对应于目标基因的RNA、 没有终止密码子的mRNA或用于RNAi的双链RNA。
11.权利要求8的化合物，其中所述蛋白质为免疫球蛋白分子。
12.权利要求8的化合物，其中所述化疗剂为多柔比星、5-氟 尿嘧啶或CPT-11。
13.权利要求8的化合物，其中所述脂质为聚乙二醇化磷脂。
14.权利要求8的化合物，其中所述三重态感光剂为曙红或孔 雀绿。
15.权利要求8的化合物，其中所述纳颗粒为免疫金颗粒、量 子点、顺磁纳颗粒或上转换纳颗粒。
16.权利要求8的化合物，其中所述官能团为ATP、ADP、 AMP、GTP、GDP、NADP、NAD+、黄素腺嘌呤核苷酸(FAD)、磷 酸吡哆醛、金属离子、5′脱氧腺苷钴胺素、四氢叶酸辅酶A、硫胺素、 核黄素、烟酰胺、CoA或辅酶B12。
17.权利要求8的化合物，其中所述抑制剂为可逆酶抑制剂。
18.权利要求8的化合物，其中所述抑制剂为不可逆酶抑制剂。
19.权利要求8的化合物，其中所述抑制剂为胱天蛋白酶抑制 剂、任选为逆转录酶抑制剂的聚合酶抑制剂、激酶抑制剂、端粒酶 抑制剂或磷酸酶抑制剂。
20.权利要求8的化合物，其中所述光学可检测分子为荧光团。
21.权利要求8的化合物，其中所述官能团为烷基鸟嘌呤DNA 烷基转移酶或烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶底物或胱天蛋白酶底物。
22.权利要求1-7中任一项的化合物，所述化合物包含两个官 能团。
23.权利要求22的化合物，所述化合物包含荧光团和生物素。
24.权利要求22的化合物，其中所述至少两个官能团包含两 种不同酶的底物。
25.权利要求24的化合物，其中一个官能团为萤光素酶底物， 另一个官能团为蛋白酶底物。
26.权利要求1-7中任一项的化合物，其包含至少三个官能团。
27.权利要求26的化合物，其中所述三个官能团包括荧光团、 具有蛋白酶识别位点的肽和所述荧光团的猝灭剂。
28.式(I)的化合物：R-连接基团-A-X，其中R是一个或多个官 能团，其中所述连接基团是含C、N、S或O的多原子直链或支链， 其中A-X为脱卤素酶底物，其中X为卤素，其中至少一个官能团为 氨酰化tRNA、化疗剂、螯合剂、光学可检测分子的猝灭剂、多糖、 表面等离振子共振传感芯片、Sepharose珠、纤维素珠、导电支持体、 聚乙二醇化磷、X-射线造影剂、三重态感光剂、免疫金颗粒、量子 点、顺磁纳颗粒、上转换纳颗粒、NADP、NAD+、黄素腺嘌呤核苷 酸(FAD)、磷酸吡哆醛、金属离子、5′脱氧腺苷钴胺素、四氢叶酸辅 酶A、硫胺素、核黄素、烟酰胺、CoA或辅酶B12、琥珀酰亚胺酯 或醛、谷胱甘肽、血红素、ATP、ADP、AMP、GTP、GDP、核苷酸 类似物、NTA、cAMP、磷脂酰肌醇、cAMP配体、自杀底物、烷基 谷氨酰胺DNA烷基转移酶、可逆酶抑制剂或不可逆酶抑制剂，或者 其中如果存在两个或更多个官能团，则其任选包括荧光团和生物素 或两种不同酶的两种底物，或者其中如果存在三个或更多个官能团， 则其任选包括荧光团、具有蛋白酶识别位点的肽和所述荧光团的猝 灭剂。
29.突变脱卤素酶，其相比于对应野生型脱卤素酶包含至少两 个氨基酸置换，其中所述突变脱卤素酶与含一个或多个官能团的脱 卤素酶底物形成相比于对应野生型脱卤素酶和所述底物所形成的键 更为稳定的键，其中突变脱卤素酶中的所述至少一个氨基酸置换为 在对应野生型脱卤素酶中与水分子活化相关的氨基酸残基上的置 换，其中所述水分子裂解对应野生型脱卤素酶和所述底物形成的键， 或者所述置换为在对应野生型脱卤素酶中与所述底物形成酯中间体 的氨基酸残基上的置换，其中第二个置换在野生型脱卤素酶中位于 活性位点空穴内并在结合至野生型脱卤素酶的脱卤素酶底物的3-5 内的氨基酸残基处。
30.权利要求29的突变脱卤素酶，其中第二个置换将置换成 这样的氨基酸：其导入一个或多个电荷、导入一个或多个氢键或降 低位阻，由此增强底物结合。
31.权利要求29-30中任一项的突变脱卤素酶，其中所述至少 一个置换在对应于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)脱卤素酶氨 基酸残基272的位置上。
32.权利要求31的突变脱卤素酶，其中所述在对应于氨基酸 残基272的位置上的置换后氨基酸是苯丙氨酸、甘氨酸或丙氨酸。
33.权利要求29-32中任一项的突变脱卤素酶，其中所述至少 一个置换在对应于紫红红球菌脱卤素酶氨基酸残基106的位置上。
34.权利要求33的突变脱卤素酶，其中所述在对应于氨基酸 残基106的位置上的置换后氨基酸是半胱氨酸或谷氨酸。
35.权利要求29-34中任一项的突变脱卤素酶，其中第二个置 换在对应于紫红红球菌脱卤素酶氨基酸残基175、176或273的位置 上。
36.权利要求35的突变脱卤素酶，其中所述在对应于氨基酸 残基175的位置上的置换后氨基酸是甲硫氨酸、缬氨酸、谷氨酸、 天冬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸或半胱氨酸，其中在对应于氨 基酸残基176的位置上的置换后氨基酸为丝氨酸、甘氨酸、天冬酰 胺、天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸或精氨酸，或其中在对应于氨基酸 残基273的位置上的置换后氨基酸为亮氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸。
37.权利要求29-36中任一项的突变脱卤素酶，所述突变脱卤 素酶还在野生型脱卤素酶中位于活性位点空穴内并在结合至野生型 脱卤素酶的脱卤素酶底物的3-5内的氨基酸残基处，包含第三个和 任选的第四个置换。
38.权利要求37的突变脱卤素酶，其中第三个或第四个置换 在对应于紫红红球菌脱卤素酶的氨基酸残基175、176或273的位置 上。
39.权利要求38的突变脱卤素酶，其中所述在对应于氨基酸 残基175的位置上的置换后氨基酸是甲硫氨酸、缬氨酸、谷氨酸、 天冬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸或半胱氨酸，在对应于氨基酸 残基176的位置上的置换后氨基酸为丝氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、 天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸或精氨酸，或在对应于氨基酸残基273 的位置上的置换后氨基酸为亮氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸。
40.权利要求29-39中任一项的突变脱卤素酶，所述突变脱卤 素酶还包含一个或多个目标蛋白，由此产生融合蛋白。
41.权利要求29-40中任一项的突变脱卤素酶，所述突变脱卤 素酶与对应野生型脱卤素酶的氨基酸序列同一性至少为85％。
42.突变水解酶，其相比于对应野生型水解酶包含至少两个氨 基酸置换，其中至少一个氨基酸置换导致所述突变水解酶与底物形 成相比于对应野生型水解酶与所述底物所形成的键更为稳定的键， 其中在突变水解酶中的一个氨基酸置换为在对应野生型水解酶中与 水分子活化相关的氨基酸残基上的置换，其中所述水分子裂解对应 野生型水解酶和所述底物形成的键，或者所述置换为在对应野生型 水解酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换，其中第 二个置换在野生型水解酶中位于活性位点空穴内并在结合至野生型 水解酶的水解酶底物的3-5内的氨基酸残基处。
43.权利要求42的突变水解酶，其中第二个置换将置换成这 样的氨基酸：其导入一个或多个电荷、导入一个或多个氢键或降低 位阻，由此增强底物结合。
44.权利要求42的突变水解酶，所述突变水解酶不是丝氨酸β- 内酰胺酶。
45.权利要求42-44中任一项的突变水解酶，其中第二个置换 在对应于紫红红球菌脱卤素酶的氨基酸残基175、176或273的位置 上。
46.权利要求45的突变水解酶，其中所述在对应于氨基酸残 基175的位置上的置换后氨基酸是甲硫氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天 冬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸或半胱氨酸，其中所述在对应于 氨基酸残基176的位置上的置换后氨基酸为丝氨酸、甘氨酸、天冬 酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸或精氨酸，或其中所述在对应于 氨基酸残基273的位置上的置换后氨基酸为亮氨酸、甲硫氨酸或半 胱氨酸。
47.权利要求42-46中任一项的突变水解酶，所述突变水解酶 还在野生型脱卤素酶中位于活性位点空穴内并在结合至野生型脱卤 素酶的脱卤素酶底物的3-5内的氨基酸残基处，包含第三个和任选 的第四个置换。
48.权利要求47的突变水解酶，其中第三个或第四个置换在 对应于紫红红球菌脱卤素酶的氨基酸残基175、176或273的位置上。
49.权利要求48的突变水解酶，其中所述在对应于氨基酸残 基175的位置上的置换后氨基酸是甲硫氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天 冬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸或半胱氨酸，所述在对应于氨基 酸残基176的位置上的置换后氨基酸为丝氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、 天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸或精氨酸，或所述在对应于氨基酸残基273 的位置上的置换后氨基酸为亮氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸。
50.检测或测定突变水解酶的存在或量的方法，所述方法包 括：
a)使权利要求42-49中任一项的突变水解酶和包含一个或多 个官能团的水解酶底物接触；和
b)检测或测定所述官能团的存在或量，由此检测或测定所述 突变水解酶的存在或量。
51.分离样品中的目标分子、细胞或亚细胞器的方法，所述方 法包括：
a)使样品与含权利要求42-49中任一项的突变水解酶的融合 蛋白以及包含一个或多个官能团的水解酶底物接触，其中所述融合 蛋白包含结合目标分子、细胞或亚细胞器的蛋白；和
b)分离所述目标分子、细胞或亚细胞器。
52.权利要求51的方法，其中所述至少一个官能团为固相支 持体或结合固相支持体的分子。
53.权利要求51的方法，其中所述目标分子为蛋白质。
54.标记细胞的方法，所述方法包括：
使含权利要求42-49中任一项的突变水解酶的细胞与包含一个 或多个官能团的水解酶底物接触，以便标记细胞。
55.权利要求54的方法，所述方法还包括检测或测定所述官 能团的存在或量。
56.权利要求50-55中任一项的方法，其中所述突变水解酶存 在于细胞中或存在于细胞表面上。
57.权利要求50-56中任一项的方法，其中所述突变水解酶还 包含一种或多种目标蛋白，由此产生融合蛋白。
58.权利要求57的方法，其中所述目标蛋白为GST或FLAG。
59.权利要求57的方法，其中一种目标蛋白将所述突变水解 酶靶向细胞膜或内质网。
60.权利要求57的方法，其中所述目标蛋白为整联蛋白或其 结构域、钙粘着蛋白或其结构域、配体门控离子通道或其结构域、 或者HERG通道或其结构域。
61.权利要求57的方法，其中所述融合蛋白包含两种目标蛋 白，其中一种目标蛋白将所述突变水解酶靶向内质网，另一种目标 蛋白为糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号序列。
62.权利要求50-61中任一项的方法，其中所述水解酶为脱卤 素酶。
63.权利要求50-62中任一项的方法，其中至少一个官能团为 氨基酸、蛋白质、糖蛋白、核酸分子、药物、脂质、生物素、固相 支持体、光学可检测分子。
64.权利要求63的方法，其中至少一个官能团为荧光团。
65.权利要求50-64中任一项的方法，其中所述底物包含两个 官能团。
66.权利要求50-65中任一项的方法，其中所述底物为权利要 求1-28中任一项的化合物。
67.权利要求51的方法，其中所述突变水解酶还包含选择标 记蛋白。
68.权利要求67的方法，其中所述底物中的至少一个官能团 为荧光团。
69.权利要求51的方法，所述方法还包括在所述细胞与所述 底物接触之前或之后使所述细胞与固定剂接触。
70.权利要求51的方法，所述方法还包括在所述细胞与所述 底物接触的同时使所述细胞与固定剂接触。
71.权利要求69或70的方法，其中所述细胞用甲醇、丙酮和/ 或多聚甲醛固定。
72.权利要求62的方法，其中所述突变脱卤素酶由为在选定 宿主细胞中表达而优化的核酸序列编码。
73.化合物，所述化合物为式XXIX-XXXIV的任一种。
74.权利要求50-72中任一项的方法，其中所述突变水解酶为 突变脱卤素酶，其中所述底物为式(I)的化合物：R-连接基团-A-X， 其中：
R是一个或多个官能团；
连接基团是分隔R和A的基团；
A-X为水解酶底物；和
X为卤素。
75.权利要求74的方法，其中所述连接基团是含C、N、S或 O的多原子直链或支链。
76.检测或测定突变水解酶的存在或量的方法，所述方法包 括：
a)使突变水解酶和包含一个或多个官能团的水解酶底物接 触，其中所述突变水解酶相比于对应野生型水解酶包含至少一个氨 基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致所述突变水解酶与所 述底物形成相比于对应野生型脱卤素酶和所述底物所形成的键更为 稳定的键，其中所述突变脱卤素酶中的所述至少一个氨基酸置换为 在对应野生型水解酶中与水分子活化相关的氨基酸残基上的置换， 其中所述水分子裂解对应野生型水解酶和所述底物形成的键，或者 所述置换为在对应野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的氨基 酸残基上的置换，其中所述底物为权利要求1-28中任一项的化合物； 和
b)检测或测定所述官能团的存在或量，由此检测或测定所述 突变水解酶的存在或量。
77.权利要求76的方法，其中所述突变水解酶在细胞中。
78.分离样品中的目标分子、细胞或亚细胞器的方法，所述方 法包括：
a)使样品与含突变水解酶的融合蛋白以及包含一个或多个官 能团的水解酶底物接触，其中所述突变水解酶相比于对应野生型水 解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致 所述突变水解酶与所述底物形成相比于对应野生型脱卤素酶和所述 底物所形成的键更为稳定的键，其中所述突变脱卤素酶中的所述至 少一个氨基酸置换为在对应野生型水解酶中与水分子活化相关的氨 基酸残基上的置换，其中所述水分子裂解对应野生型水解酶和所述 底物形成的键，或者所述置换为在对应野生型水解酶中与所述底物 形成酯中间体的氨基酸残基上的置换，其中所述融合蛋白包含结合 目标分子、细胞或亚细胞器的蛋白，其中所述底物为权利要求1-28 中任一项的化合物；和
b)分离所述目标分子、细胞或亚细胞器。
79.标记细胞的方法，所述方法包括：
使含突变水解酶的细胞和包含一个或多个官能团的水解酶底物 接触，以便标记细胞，其中所述突变水解酶相比于对应野生型水解 酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致所 述突变水解酶与所述底物形成相比于对应野生型脱卤素酶和所述底 物形成的键更为稳定的键，其中所述突变水解酶中的所述至少一个 氨基酸置换为在对应野生型水解酶中与水分子活化相关的氨基酸残 基上的置换，其中所述水分子裂解对应野生型水解酶和所述底物形 成的键，或者所述置换为在对应野生型水解酶中与所述底物形成酯 中间体的氨基酸残基上的置换，所述置换在对应于紫红红球菌脱卤 素酶的175、176或273位的氨基酸残基处。
80.权利要求79的方法，所述方法还包括检测或测定所述官 能团的存在或量。
81.多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求42-49中任一项的 突变水解酶。
82.突变水解酶，所述突变水解酶相比于对应野生型水解酶含 至少两个氨基酸置换，其中一个置换在对应于紫红红球菌脱卤素酶 的氨基酸残基272的位置上，或在对应于紫红红球菌脱卤素酶的氨 基酸残基106的位置上，第二个置换在对应于紫红红球菌脱卤素酶 的175、176或273位的氨基酸残基处。
83.权利要求82的突变水解酶，所述突变水解酶还在对应于 紫红红球菌脱卤素酶的175、176或273位的氨基酸残基处包含第三 个和任选的第四个置换。
84.权利要求82的突变水解酶，所述突变水解酶为在对应于 紫红红球菌脱卤素酶的氨基酸残基175和272的位置上具有置换的 突变脱卤素酶。
85.权利要求84的突变水解酶，所述突变水解酶还在对应于 氨基酸残基176和/或273的位置上包含置换。
86.热稳定突变脱卤素酶，所述热稳定突变脱卤素酶包含至少 一个在对应于紫红红球菌脱卤素酶的氨基酸残基175的位置上的置 换，所述置换与相比于在对应于氨基酸残基175的位置上无置换的 对应突变脱卤素酶其热稳定性增强相关。
87.权利要求86的热稳定脱卤素酶，其中所述置换后的氨基 酸为甲硫氨酸。
88.分离样品中的目标分子、细胞或亚细胞器的方法，所述方 法包括：
使样品与以下物质接触以便分离所述目标分子、细胞或亚细胞 器：融合蛋白，其含能够结合第一部分的第一种蛋白和突变水解酶； 水解酶底物，其含一个或多个官能团且连接至能够结合第三部分的 第二部分；融合体，其为第三部分与结合所述目标分子、细胞或亚 细胞器的蛋白的融合体；和第一部分，其被固定化或能够被固定化；
其中所述突变水解酶相比于对应野生型水解酶包含至少一个氨 基酸置换，其中一个氨基酸置换导致所述突变水解酶与所述底物形 成相比于对应野生型脱卤素酶和所述底物形成的键更为稳定的键， 其中所述突变脱卤素酶中的一个氨基酸置换为在对应野生型水解酶 中与水分子活化相关的氨基酸残基上的置换，其中所述水分子裂解 对应野生型水解酶和所述底物形成的键，或者所述置换为在对应野 生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换。
89.权利要求88的方法，其中第一种蛋白为Flag标签或GST。
90.权利要求88的方法，其中第一部分为抗体或其片段。
91.权利要求88的方法，其中第三部分为His-标签。
92.分离目标分子的方法，所述方法包括：
a)提供含一种或多种融合蛋白的样品以及含一种或多种水解 酶底物的固相支持体，所述融合蛋白中的至少一种包含突变水解酶 和结合所述目标分子的蛋白，其中所述突变水解酶相比于对应野生 型水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换 导致所述突变水解酶与所述底物形成相比于对应野生型水解酶与所 述底物所形成的键更为稳定的键，其中所述突变水解酶中的所述至 少一个氨基酸置换为在对应野生型水解酶中与水分子活化相关的氨 基酸残基上的置换，其中所述水分子裂解对应野生型水解酶和所述 底物形成的键，或者所述置换为在对应野生型水解酶中与所述底物 形成酯中间体的氨基酸残基上的置换；和
b)使所述样品与所述固相支持体接触，以便分离所述目标分 子。
93.分离目标蛋白的方法，所述方法包括：
a)提供含一种或多种融合蛋白的样品以及含一种或多种水解 酶底物的固相支持体，所述融合蛋白中的至少一种包含突变水解酶 和目标蛋白，其中所述突变水解酶相比于对应野生型水解酶包含至 少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致所述突变水 解酶与所述底物形成相比于对应野生型水解酶与所述底物所形成的 键更为稳定的键，其中所述突变水解酶中的所述至少一个氨基酸置 换为在对应野生型水解酶中与水分子活化相关的氨基酸残基上的置 换，其中所述水分子裂解对应野生型水解酶和所述底物形成的键， 或者所述置换为在对应野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的 氨基酸残基上的置换；和
b)使所述样品与所述固相支持体接触，以便分离所述目标蛋 白。
94.权利要求92的方法，其中所述目标分子为染色质。
95.权利要求92-94中任一项的方法，其中所述固相支持体为 表面等离振子共振芯片、磁性粒子、膜、玻璃、纤维素、自组装单 层、多孔平板的孔、导电表面或琼脂糖珠。
96.权利要求92的方法，其中两种或多种融合蛋白具有与不 同目标分子结合的蛋白。
97.权利要求93的方法，其中两种或多种融合蛋白具有不同 目标蛋白。
98.权利要求92-97中任一项的方法，其中所述突变水解酶包 含至少两个置换，其中第二个置换在野生型水解酶中位于活性位点 空穴内并在结合至野生型水解酶的水解酶底物的3-5内的氨基酸残 基处。
99.权利要求98的方法，其中第二个置换在对应于紫红红球 菌脱卤素酶的氨基酸残基175、176或273的位置上。
100.权利要求98的方法，所述方法还在野生型水解酶中位于 活性位点空穴内并在结合至野生型水解酶的水解酶底物的3-5内的 氨基酸残基处，包含第三个和任选的第四个置换。
101.权利要求98的方法，其中第二个置换将置换成这样的氨 基酸：其导入一个或多个电荷、导入一个或多个氢键或降低位阻， 由此增强底物结合。
102.由样品中分离一种或多种目标分子的方法，所述方法包 括：
a)提供含突变水解酶的固相支持体以及含一个或多个官能团 的水解酶底物，所述官能团中的至少一个能够结合一种或多种目标 分子，其中所述突变水解酶相比于对应野生型水解酶包含至少一个 氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致所述突变水解酶与 所述底物形成相比于对应野生型水解酶与所述底物所形成的键更为 稳定的键，其中所述突变水解酶中的所述至少一个氨基酸置换为在 对应野生型水解酶中与水分子活化相关的氨基酸残基上的置换，其 中所述水分子裂解对应野生型水解酶和所述底物形成的键，或者所 述置换为在对应野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸 残基上的置换；和
b)使所述样品、所述固相支持体和所述水解酶底物接触，由 此分离一种或多种目标分子。
103.权利要求102的方法，其中所述固相支持体为磁性粒子、 纳颗粒、导电支持体、多孔平板的孔、表面等离振子共振传感芯片、 玻璃、膜、塑料表面或藻酸盐。
104.权利要求102或103的方法，其中一个官能团是谷胱甘肽、 生物素或其它抗生物素蛋白结合分子、金属、NTA、琥珀酰亚胺酯 或醛、酶底物、酶抑制剂、对应于目标基因的DNA、结合蛋白的DNA 或对应于目标基因的RNA。
105.权利要求104的方法，其中所述官能团为可逆的酶抑制剂。
106.权利要求102的方法，其中所述目标分子融合至蛋白或肽。
107.权利要求106的方法，其中所述蛋白质或肽为GST、FLAG- 标签、Strep-标签、钙调蛋白结合肽、NusA、麦芽糖结合蛋白、生物 素化肽、硫氧还蛋白、小泛素样修饰物或His-标签。
108.权利要求102的方法，其中所述目标分子为蛋白质、基因、 RNA或肽-核酸。
109.权利要求102-108中任一项的方法，其中所述突变水解酶 包含至少两个置换，其中第二个置换在野生型水解酶中位于活性位 点空穴内并在结合至野生型水解酶的水解酶底物的3-5内的氨基酸 残基处。
110.权利要求102-108中任一项的方法，其中第二个置换将置 换成这样的氨基酸：其降低位阻、导入一个或多个电荷或导入一个 或多个氢键，由此增强底物结合。
111.权利要求110的方法，其中第二个置换在对应于紫红红球 菌脱卤素酶的氨基酸残基175、176或273的位置上。
112.权利要求102-110中任一项的方法，所述方法还在野生型 水解酶中位于活性位点空穴内并在结合至野生型水解酶的水解酶底 物的3-5内的氨基酸残基处，包含第三个和任选的第四个置换。
113.由样品中分离一种或多种目标分子的方法，所述方法包 括：
使样品、突变水解酶和含一个或多个官能团的水解酶底物接触， 所述官能团中的至少一个结合所述目标分子；使含突变水解酶的样 品和含一个或多个官能团的水解酶底物接触，所述官能团中的至少 一个结合所述目标分子；或使包含含一个或多个官能团的水解酶底 物的样品和突变水解酶接触，所述官能团中的至少一个结合所述目 标分子；以便由样品中分离所述一种或多种分子，
其中所述突变水解酶相比于对应野生型水解酶包含至少一个氨 基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致所述突变水解酶与所 述底物形成相比于对应野生型水解酶与所述底物所形成的键更为稳 定的键，其中所述突变水解酶中的所述至少一个氨基酸置换为在对 应野生型水解酶中与水分子活化相关的氨基酸残基上的置换，其中 所述水分子裂解对应野生型水解酶和所述底物形成的键，或者所述 置换为在对应野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸残 基上的置换。
114.检测样品中的一种或多种目标分子的方法，所述方法包 括：
a)使样品、突变水解酶和含一个或多个官能团的水解酶底物 接触，所述官能团中的至少一个结合所述目标分子；使含突变水解 酶的样品和含一个或多个官能团的水解酶底物接触，所述官能团中 的至少一个结合所述目标分子；或使包含含一个或多个官能团的水 解酶底物的样品和突变水解酶接触，所述官能团中的至少一个结合 所述目标分子，
其中所述突变水解酶相比于对应野生型水解酶包含至少一个氨 基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致所述突变水解酶与所 述底物形成相比于对应野生型水解酶与所述底物所形成的键更为稳 定的键，其中所述突变水解酶中的所述至少一个氨基酸置换为在对 应野生型水解酶中与水分子活化相关的氨基酸残基上的置换，其中 所述水分子裂解对应野生型水解酶和所述底物形成的键，或者所述 置换为在对应野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸残 基上的置换；和
b)检测或测定所述目标分子的存在或量。
115.权利要求113或114的方法，其中至少一个官能团是萤光 素、蛋白酶识别位点、荧光团、荧光团猝灭剂、对应于目标基因或 其部分并任选结合蛋白的DNA或RNA、谷胱甘肽、金属、NTA、 琥珀酰亚胺酯或醛、酶底物、酶抑制剂、生物素或其它抗生物素蛋 白结合分子、磷脂酰肌醇、cAMP配体、荧光cAMP、无终止密码子 的mRNA或氨酰化tRNA。
116.权利要求113或114的方法，其中所述目标分子为蛋白质、 酶、cAMP、RNA、DNA、转录复合物或翻译复合物。
117.权利要求116的方法，其中所述酶为激酶、磷酸二酯酶或 蛋白酶。
118.权利要求117的方法，其中所述蛋白酶为胱天蛋白酶。
119.权利要求117的方法，其中所述激酶为磷脂酰肌醇3激酶。
120.权利要求113或114的方法，其中所述底物包含至少两个 官能团。
121.权利要求120的方法，其中一个官能团是磷脂酰肌醇，另 一个官能团为荧光团。
122.权利要求120的方法，其中至少一个官能团不结合目标分 子，而为发光的或发荧光的。
123.权利要求120的方法，其中所述至少一个不结合所述目标 分子的官能团为萤光素酶底物。
124.权利要求113或114中任一项的方法，其中至少一个官能 团为光学可检测分子。
125.权利要求124的方法，其中至少一个官能团为荧光团。
126.权利要求124的方法，其中所述底物包含至少3个官能团。
127.权利要求113-126中任一项的方法，其中所述突变水解酶 包含至少两个氨基酸置换，其中第二个置换在野生型水解酶中位于 活性位点空穴内并在结合至野生型水解酶的水解酶底物的3-5内的 氨基酸残基处。
128.权利要求127的方法，其中第二个置换在对应于紫红红球 菌脱卤素酶的氨基酸残基175、176和/或273的位置上。
129.权利要求113-128中任一项的方法，其中还在野生型水解 酶中位于活性位点空穴内并在结合至野生型水解酶的水解酶底物的 3-5内的氨基酸残基处，包含第三个和任选的第四个置换。
130.权利要求113-129中任一项的方法，其中第二个置换将置 换成这样的氨基酸：其降低位阻、导入一个或多个电荷或导入一个 或多个氢键，由此增强底物结合。
131.权利要求113的方法，其中所述突变水解酶结合至固相支 持体。
132.权利要求113或114的方法，其中所述底物包含磷脂酰肌 醇，其中磷脂酰肌醇激酶使用32P、镓III和/或NTA进行检测。
133.权利要求92、93、102、113或114中任一项的方法，其 中所述突变水解酶融合至一种或多种蛋白，由此产生融合蛋白。
134.权利要求127的方法，其中所述一种或多种蛋白包括His- 标签、GST、Strep-标签、生物素、免疫球蛋白或其片段、或钙调蛋 白结合蛋白。
135.权利要求92、93、102、113或114中任一项的方法，其 中所述突变水解酶是突变脱卤素酶，其中所述底物是式(I)的化合物： R-连接基团-A-X，其中：
R是一个或多个官能团；
连接基团是分隔R和A的基团；
A-X为水解酶底物；和
X为卤素，其中所述连接基团为含C、N、S或O的多原子直链 或支链或含一个或多个环的基团。
136.检测细胞中的一种或多种目标分子的方法，所述方法包 括：
a)使含突变水解酶的细胞和含两个或多个官能团的水解酶底 物接触，至少所述官能团中的第一个结合所述目标分子，所述结合 改变了第二个官能团的特性，其中所述突变水解酶相比于对应野生 型水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换 导致所述突变水解酶与所述底物形成相比于对应野生型水解酶与所 述底物所形成的键更为稳定的键，其中所述突变水解酶中的所述至 少一个氨基酸置换为在对应野生型水解酶中与水分子活化相关的氨 基酸残基上的置换，其中所述水分子裂解对应野生型水解酶和所述 底物形成的键，或者所述置换为在对应野生型水解酶中与所述底物 形成酯中间体的氨基酸残基上的置换；和
b)检测或测定第二个官能团的存在或量。
137.在转基因动物中标记细胞的方法，所述方法包括：
a)提供一种转基因非人动物，所述转基因非人动物的细胞的 基因组用含转录调节元件的表达盒增大，所述转录调节元件有效连 接至编码突变水解酶或含突变水解酶的融合蛋白以及任选的靶向肽 的核酸片段、并任选为组织或细胞特异性的，其中所述突变水解酶 相比于对应野生型水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少 一个氨基酸置换导致所述突变水解酶与所述底物形成相比于对应野 生型水解酶与所述底物所形成的键更为稳定的键，其中所述突变水 解酶中的所述至少一个氨基酸置换为在对应野生型水解酶中与水分 子活化相关的氨基酸残基上的置换，其中所述水分子裂解对应野生 型水解酶和所述底物形成的键，或者所述置换为在对应野生型水解 酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换；和
b)使所述转基因非人动物或其细胞与含一个或多个官能团的 水解酶底物接触。
138.权利要求137的方法，其中所述突变水解酶在血细胞的细 胞表面上表达。
139.标记动物的方法，所述方法包括：
将含表达盒的细胞和含一个或多个官能团的水解酶底物导入非 人动物中，所述表达盒含转录调节元件，所述转录调节元件有效连 接至编码突变水解酶或含突变水解酶的融合蛋白以及任选的靶向肽 的核酸片段、并任选为组织或细胞特异性的，其中所述突变水解酶 相比于对应野生型水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少 一个氨基酸置换导致所述突变水解酶与所述底物形成相比于对应野 生型水解酶与所述底物所形成的键更为稳定的键，其中所述突变水 解酶中的所述至少一个氨基酸置换为在对应野生型水解酶中与水分 子活化相关的氨基酸残基上的置换，其中所述水分子裂解对应野生 型水解酶和所述底物形成的键，或者所述置换为在对应野生型水解 酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换。
140.选择性抑制细胞中的一种或多种目标蛋白或细胞活性的方 法，所述方法包括：
a)使含细胞的样品和突变水解酶接触，所述细胞含融合蛋 白，所述融合蛋白含突变水解酶和目标蛋白；或使具有融合蛋白编 码表达盒的细胞与水解酶底物接触，所述融合蛋白含突变水解酶和 目标蛋白；产生混合物，其中所述水解酶底物包含一个或多个官能 团，所述官能团中的至少一个在对一定波长的光曝光时产生单态氧， 其中所述突变水解酶相比于对应野生型水解酶包含至少一个氨基酸 置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致所述突变水解酶与所述底 物形成相比于对应野生型水解酶与所述底物所形成的键更为稳定的 键，其中所述突变水解酶中的所述至少一个氨基酸置换为在对应野 生型水解酶中与水分子活化相关的氨基酸残基上的置换，其中所述 水分子裂解对应野生型水解酶和所述底物形成的键，或者所述置换 为在对应野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸残基上 的置换；和
b)使所述混合物对所述一定波长的光曝光。
141.权利要求140的方法，其中一个官能团是曙红或孔雀绿。
142.含突变水解酶的固相支持体，其中所述突变水解酶相比于 对应野生型水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨 基酸置换导致所述突变水解酶与所述底物形成相比于对应野生型水 解酶与所述底物所形成的键更为稳定的键，其中所述突变水解酶中 的所述至少一个氨基酸置换为在对应野生型水解酶中与水分子活化 相关的氨基酸残基上的置换，其中所述水分子裂解对应野生型水解 酶和所述底物形成的键，或者所述置换为在对应野生型水解酶中与 所述底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换，所述突变水解酶能 够结合水解酶底物。
143.权利要求142的固相支持体，所述固相支持体为磁性粒子、 塑料、表面等离振子共振传感芯片、膜、玻璃、纤维素、自组装单 层、多孔平板的孔、纳颗粒、琼脂糖珠或导电支持体。
144.第一种水解酶底物，所述水解酶底物包括谷胱甘肽、NTA、 磷脂酰肌醇、cAMP、非第一种水解酶底物的酶底物、酶抑制剂、非 生物素的抗生物素蛋白结合分子、氨酰化tRNA、或琥珀酰亚胺酯或 醛基团。
145.检测样品中的目标分子的方法，所述方法包括：
a)提供一种复合物，所述复合物包含第一种融合蛋白和第二 种融合蛋白，第一种融合蛋白含突变水解酶和能够结合第三种蛋白 的第一种蛋白，第一种融合蛋白中的突变水解酶结合至含一个或多 个官能团的第一种底物，所述官能团中的一个为荧光团，第二种融 合蛋白包含结合第二种底物的第二种蛋白和第三种蛋白，第二种蛋 白结合至含一个或多个官能团的第二种底物，所述官能团中的一个 猝灭所述荧光团，或为与第一种底物中的荧光团不同的荧光团，其 中所述突变水解酶相比于对应野生型水解酶包含至少一个氨基酸置 换，其中所述至少一个氨基酸置换导致所述突变水解酶与所述底物 形成相比于对应野生型水解酶与所述底物所形成的键更为稳定的 键，其中所述突变水解酶中的所述至少一个氨基酸置换为在对应野 生型水解酶中与水分子活化相关的氨基酸残基上的置换，其中所述 水分子裂解对应野生型水解酶和所述底物形成的键，或者所述置换 为在对应野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸残基上 的置换；和
b)混合所述复合物和所述样品；和
c)检测或测定荧光。
146.检测样品中的目标分子的方法，所述方法包括：
a)提供一种复合物，所述复合物包含第一种融合蛋白和第二 种融合蛋白，第一种融合蛋白含突变水解酶和能够结合第二种蛋白 的第一种蛋白，第一种融合蛋白中的突变水解酶结合至含一个或多 个官能团的第一种水解酶底物，所述官能团中的一个为荧光团，第 二种融合蛋白包含第二种蛋白和发光或荧光报告蛋白，其中所述突 变水解酶相比于对应野生型水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中 所述至少一个氨基酸置换导致所述突变水解酶与所述底物形成相比 于对应野生型水解酶与所述底物所形成的键更为稳定的键，其中所 述突变水解酶中的所述至少一个氨基酸置换为在对应野生型水解酶 中与水分子活化相关的氨基酸残基上的置换，其中所述水分子裂解 对应野生型水解酶和所述底物形成的键，或者所述置换为在对应野 生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换，其 中第一种蛋白和第二种蛋白二聚化；和
b)混合所述复合物和所述样品；和
c)检测或测定荧光和/或发光。
147.权利要求146的方法，其中第一种蛋白是PKA调节亚基 或PKA催化亚基或者与全长亚基具有大致相同的结合活性的其部 分。
148.权利要求145或146的方法，其中所述目标分子为cAMP。
149.权利要求145的方法，其中第二种蛋白为与第二种底物形 成稳定键的突变水解酶。
150.检测细胞中的一种或多种蛋白酶的方法，所述方法包括：
a)提供一种细胞或其裂解物，所述细胞或其裂解物含第一表 达盒和第二表达盒，第一表达盒含与第一核酸片段连接的第一启动 子，第一核酸片段结合第一转录阻遏蛋白且连接至第一报告基因， 第二表达盒含与第二核酸片段连接的第二启动子，第二核酸片段编 码含异源蛋白酶识别位点的第一修饰型转录阻遏蛋白，其中在没有 所述蛋白酶时，第一修饰型转录阻遏蛋白能够结合第一核酸片段并 抑制由第一启动子转录，其中在有所述蛋白酶存在时，第一修饰型 转录阻遏蛋白与第一核酸片段的结合被抑制；和
b)检测或测定在所述细胞或其裂解物中的报告基因表达，其 中第一报告基因表达或表达增加指示存在所述蛋白酶。
151.检测细胞中的一种或多种蛋白酶的方法，所述方法包括：
a)提供一种细胞或其裂解物，所述细胞或其裂解物含第一表达 盒、第二表达盒和融合蛋白，第一表达盒含与第一核酸片段连接的 第一启动子，第一核酸片段结合第一转录阻遏蛋白且连接至报告基 因，第二表达盒含与第二核酸片段连接的第二启动子，第二核酸片 段结合融合蛋白中的第一种蛋白且有效连接至所述转录阻遏蛋白的 编码区，其中所述融合蛋白含有可结合第二核酸片段的第一种蛋白、 蛋白酶识别位点和在第一种蛋白结合第二核酸片段时活化第二启动 子的第二种蛋白；和
b)检测或测定在所述细胞或其裂解物中的报告基因表达，其 中所述报告基因表达或表达增加指示存在所述蛋白酶。
152.权利要求150或151的方法，其中所述报告基因编码萤光 素酶或与水解酶底物形成稳定键的突变水解酶。
153.权利要求150或152的方法，其中所述转录阻遏蛋白是tet 阻遏蛋白或lac阻遏蛋白。
154.权利要求150或151的方法，其中在检测或测定之前，向 所述细胞或其裂解物中加入所述报告基因之基因产物的底物。
155.权利要求154的方法，其中所述底物是权利要求1-28中任 一项的化合物。
156.权利要求151的方法，其中所述融合蛋白包括Gal4、蛋白 酶识别位点和VP16、泛素的一部分、腺苷酸环化酶或鸟苷酸环化酶。
157.权利要求150的方法，其中所述细胞包含第二表达盒和第 二修饰型转录阻遏蛋白，第二表达盒含连接至第二核酸片段的第二 启动子，第二核酸片段结合第二转录阻遏蛋白且与第二报告基因连 接，第二修饰型转录阻遏蛋白包含第二种蛋白酶识别位点，其中第 二修饰型转录阻遏蛋白能够结合第二核酸片段并抑制由第二启动子 转录，其中在第二种蛋白酶存在下，第二修饰型转录阻遏蛋白与第 二核酸片段的结合受到抑制，其中检测或测定两种不同的蛋白酶。
158.权利要求151的方法，其中所述细胞还包含第三表达盒、 第四表达盒，第三表达盒含连接至第三核酸片段的第三启动子，第 三核酸片段结合第二转录阻遏蛋白且与第二报告基因连接，第四表 达盒含连接至第四核酸片段的第四启动子，第四核酸片段结合第二 种融合蛋白中的第三种蛋白且有效连接至第二转录阻遏蛋白编码 区，其中第二种融合蛋白包含结合第四核酸片段的第三种蛋白、蛋 白酶识别位点以及当第三种蛋白结合第四核酸片段时活化第四启动 子的第四种蛋白，其中检测或测定两种不同的蛋白酶。
159.检测细胞中的一种或多种蛋白酶的方法，所述方法包括：
a)提供一种含表达盒的细胞，所述表达盒含连接至融合蛋白 编码核酸的启动子，所述融合蛋白含蛋白去稳定序列、蛋白酶识别 位点和报告蛋白；和
b)检测或测定报告蛋白表达，其中所述报告蛋白表达或表达 延长指示存在所述蛋白酶。
160.权利要求161的方法，其中所述蛋白去稳定序列包括 PEST。
161.权利要求150-159中任一项的方法，其中一种蛋白酶为胱 天蛋白酶。
162.权利要求150-159中任一项的方法，其中所述报告蛋白为 萤光素酶或与水解酶底物形成稳定键的突变水解酶。
163.权利要求159的方法，其中所述细胞还含有第二表达盒， 第二表达盒含连接至第二种融合蛋白编码核酸的第二启动子，第二 种融合蛋白含可选的蛋白去稳定序列、不同的蛋白酶识别位点和不 同的报告蛋白。
164.权利要求150-159中任一项的方法，所述方法还包括使所 述细胞与一种或多种物质接触，并检测或测定相对于未与所述一种 或多种物质接触的细胞而言所述一种或多种物质是否抑制报告基因 表达。
165.权利要求150-152中任一项的方法，所述方法还包括检测 或测定不同报告基因的表达，由此检测或测定不同分子的存在情况。
166.权利要求150-152中任一项的方法，其中所述蛋白酶对传 染物或生物武器是特异性的。
167.含融合多肽编码核酸序列的分离的核酸分子，所述融合多 肽含至少一个异源蛋白去稳定序列、蛋白酶识别位点和报告蛋白， 所述融合多肽相比于没有所述异源蛋白去稳定序列的对应报告蛋白 具有降低的半寿期。
168.权利要求167的分离的核酸分子，其中所述启动子为可调 节启动子。
169.权利要求167的分离的核酸分子，其中所述报告蛋白编码 萤光素酶或与水解酶底物形成稳定键的突变水解酶。
170.标记蛋白的方法，所述方法包括：
使细胞或翻译混合物与含一个或多个官能团的水解酶底物接 触，所述官能团中的至少一个为氨酰化tRNA或氨基酸，以便标记新 合成的蛋白。
171.权利要求170的方法，所述方法还包括使所述新合成的蛋 白与和所述突变水解酶底物形成稳定键的突变水解酶接触，所述突 变水解酶任选地固定在固相支持体上，其中所述突变水解酶相比于 对应野生型水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨 基酸置换导致所述突变水解酶与所述底物形成相比于对应野生型水 解酶与所述底物所形成的键更为稳定的键，其中所述突变水解酶中 的所述至少一个氨基酸置换为在对应野生型水解酶中与水分子活化 相关的氨基酸残基上的置换，其中所述水分子裂解对应野生型水解 酶和所述底物形成的键，或者所述置换为在对应野生型水解酶中与 所述底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换。
172.权利要求136-171中任一项的方法，其中所述突变水解酶 是突变脱卤素酶，其中所述底物是式(I)的化合物：R-连接基团-A-X， 其中：
R是一个或多个官能团；
连接基团是分隔R和A的基团；
A-X为水解酶底物；和
X为卤素，其中所述连接基团是含C、N、S或O的多原子直链 或支链或含一个或多个环的基团。
173.权利要求136-171中任一项的方法，其中所述突变水解酶 包含至少两个置换，其中第二个置换在所述野生型水解酶中位于活 性位点空穴内并在结合至所述野生型水解酶的水解酶底物的3-5内 的氨基酸残基处。
174.分离的核酸分子，其包含启动子、结合转录阻遏蛋白且有 效连接至突变水解酶编码区的核酸片段，所述突变水解酶与水解酶 底物形成稳定键。
175.权利要求114的方法，其中所述样品为生理样品。
176.权利要求175的方法，其中所述目标分子对至少一种传染 物是特异性的。
177.检测样品中的一种或多种蛋白酶的方法，所述方法包括：
a)提供一种含样品和分离的修饰型转录阻遏蛋白的混合物， 所述样品含细胞或其裂解物，所述细胞或其裂解物含第一表达盒， 第一表达盒含连接至第一核酸片段的第一启动子，第一核酸片段结 合第一转录阻遏蛋白且连接至第一报告基因，所述分离的修饰型转 录阻遏蛋白包含异源蛋白酶识别位点；或提供含样品、细胞或其裂 解物和分离的修饰型转录阻遏蛋白的混合物，所述细胞或其裂解物 含第一表达盒，第一表达盒含连接至第一核酸片段的第一启动子， 第一核酸片段结合第一转录阻遏蛋白且连接至第一报告基因，所述 分离的修饰型转录阻遏蛋白包含异源蛋白酶识别位点；其中在没有 所述蛋白酶存在时，第一修饰型转录阻遏蛋白能够结合第一核酸片 段并抑制由第一启动子转录，其中在所述蛋白酶存在时，第一修饰 型转录阻遏蛋白与第一核酸片段的结合受到抑制；和
b)检测或测定所述混合物中的报告基因表达，其中第一报告 基因表达或表达增加指示所述样品中存在所述蛋白酶。
178.权利要求177的方法，其中所述裂解物是S30、麦芽、兔 网织红细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞裂解物。
179.检测样品中的一种或多种蛋白酶的方法，所述方法包括：
a)提供一种含样品的混合物，所述样品含细胞或其裂解物， 所述细胞或其裂解物含第一表达盒、第二表达盒和第三表达盒，第 一表达盒含连接至第一核酸片段的第一启动子，第一核酸片段结合 转录活化蛋白且连接至转录阻遏蛋白基因，第二表达盒含连接至第 二核酸片段的第二启动子，第二核酸片段结合转录阻遏蛋白且有效 连接至报告基因，第三表达盒含连接至融合蛋白编码核酸序列的第 三启动子，所述融合蛋白含DNA结合蛋白酶、蛋白酶识别位点和所 述转录活化蛋白；或提供含样品和细胞或其裂解物的混合物，所述 细胞或其裂解物含第一表达盒、第二表达盒和第三表达盒，第一表 达盒含连接至第一核酸片段的第一启动子，第一核酸片段结合转录 活化蛋白且连接至转录阻遏蛋白基因，第二表达盒含连接至第二核 酸片段的第二启动子，第二核酸片段结合转录阻遏蛋白且有效连接 至报告基因，第三表达盒含连接至融合蛋白编码核酸序列的第三启 动子，所述融合蛋白含DNA结合蛋白酶、蛋白酶识别位点和所述转 录活化蛋白；和
b)检测或测定所述混合物中的报告基因表达，其中所述报告 基因表达或表达增加指示所述样品中存在所述蛋白酶。
180.检测样品中的一种或多种蛋白酶的方法，所述方法包括：
a)提供一种含样品的混合物，所述样品含细胞或其裂解物， 所述细胞或其裂解物含表达盒，所述表达盒含连接至融合蛋白编码 核酸的启动子，所述融合蛋白含蛋白去稳定序列、蛋白酶识别位点 和报告蛋白；或提供含样品和细胞或其裂解物的混合物，所述细胞 或其裂解物含表达盒，所述表达盒含连接至融合蛋白编码核酸的启 动子，所述融合蛋白含蛋白去稳定序列、蛋白酶识别位点和报告蛋 白；和
b)检测或测定所述混合物中的报告蛋白表达，其中所述报告 蛋白表达或表达延长指示所述样品中存在所述蛋白酶。
181.检测样品中的一种或多种蛋白酶的方法，所述方法包括：
a)提供含结合至融合蛋白的水解酶底物的固相支持体，所述 融合蛋白含突变水解酶、蛋白酶识别位点和报告蛋白；或提供含水 解酶底物的固相支持体和融合蛋白，所述融合蛋白含突变水解酶、 蛋白酶识别位点和报告蛋白；其中所述突变水解酶相比于对应野生 型水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换 导致所述突变水解酶与所述底物形成相比于对应野生型水解酶与所 述底物所形成的键更为稳定的键，其中所述突变水解酶中的所述至 少一个氨基酸置换为在对应野生型水解酶中与水分子活化相关的氨 基酸残基上的置换，其中所述水分子裂解对应野生型水解酶和所述 底物形成的键，或者所述置换为在对应野生型水解酶中与所述底物 形成酯中间体的氨基酸残基上的置换；
b)使样品与所述含结合至融合蛋白的水解酶底物的固相支持 体接触，或与所述固相支持体和融合蛋白接触；和
c)检测或测定报告蛋白活性。
182.权利要求139的方法，其中所述水解酶底物在细胞之前导 入到所述动物中。
183.权利要求139的方法，其中所述水解酶底物在细胞之后导 入到所述动物中。
184.权利要求139的方法，其中将所述突变水解酶导入到细胞 中，然后将所述细胞导入到动物中。
185.权利要求138或139的方法，所述方法还包括检测所述一 个或多个官能团。
186.权利要求177的方法，其中所述样品包含一种或多种分离 的蛋白酶。
187.检测样品中的酶底物的方法，所述方法包括：
a)提供一种样品、一种或多种融合蛋白和含一种或多种水解 酶底物的固相支持体，所述融合蛋白中的至少一种包括突变水解酶 和所述酶；或提供一种样品和含一种或多种结合至一种或多种融合 蛋白的水解酶底物的固相支持体，所述融合蛋白中的至少一种包括 突变水解酶和所述酶；其中所述突变水解酶相比于对应野生型水解 酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致所 述突变水解酶与所述底物形成相比于对应野生型水解酶与所述底物 所形成的键更为稳定的键，其中所述突变水解酶中的所述至少一个 氨基酸置换为在对应野生型水解酶中与水分子活化相关的氨基酸残 基上的置换，其中所述水分子裂解对应野生型水解酶和所述底物形 成的键，或者所述置换为在对应野生型水解酶中与所述底物形成酯 中间体的氨基酸残基上的置换，其中所述突变水解酶与所述水解酶 底物的结合改变所述固相支持体的电化学特性；
b)使所述样品与所述固相支持体接触；和
c)检测或测定所述样品中所述底物的存在情况。
188.权利要求187的方法，其中所述酶为氧化酶。
189.权利要求187-188中任一项的方法，其中所述样品为生理 性液体样品。
190.权利要求187-189中任一项的方法，其中所述固相支持体 为电极或金纳颗粒。
191.检测样品中的一种或多种蛋白酶或激酶的方法，所述方法 包括：
a)提供一种样品和含结合至融合蛋白的水解酶底物的固相支 持体，所述融合蛋白含突变水解酶和蛋白酶或激酶识别位点，其中 所述突变水解酶相比于对应野生型水解酶包含至少一个氨基酸置 换，其中所述至少一个氨基酸置换导致所述突变水解酶与所述底物 形成相比于对应野生型水解酶与所述底物所形成的键更为稳定的 键，其中所述突变水解酶中的所述至少一个氨基酸置换为在对应野 生型水解酶中与水分子活化相关的氨基酸残基上的置换，其中所述 水分子裂解对应野生型水解酶和所述底物形成的键，或者所述置换 为在对应野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的氨基酸残基上 的置换，其中所述突变水解酶与所述水解酶底物的结合改变所述固 相支持体的电化学特性；
b)使所述样品与所述含结合至融合蛋白的水解酶底物的固相 支持体接触；和
c)检测或测定所述样品中蛋白酶和激酶的存在情况。
192.检测样品中的一种或多种蛋白酶或激酶抑制剂的方法，所 述方法包括：
a)提供样品、分离的蛋白酶或激酶和含结合至融合蛋白的水 解酶底物的固相支持体，所述融合蛋白含突变水解酶和蛋白酶或激 酶识别位点，其中所述突变水解酶相比于对应野生型水解酶包含至 少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换导致所述突变水 解酶与所述底物形成相比于对应野生型水解酶与所述底物所形成的 键更为稳定的键，其中所述突变水解酶中的所述至少一个氨基酸置 换为在对应野生型水解酶中与水分子活化相关的氨基酸残基上的置 换，其中所述水分子裂解对应野生型水解酶和所述底物形成的键， 或者所述置换为在对应野生型水解酶中与所述底物形成酯中间体的 氨基酸残基上的置换，其中所述突变水解酶与所述水解酶底物的结 合改变所述固相支持体的电化学特性；
b)使所述样品、所述分离的蛋白酶或激酶以及所述含结合至 融合蛋白的水解酶底物的固相支持体接触；和
c)检测或测定所述样品中所述蛋白酶和激酶的抑制剂的存在 情况。
193.检测两种分子的相互作用的方法，所述方法包括：
a)提供第一种融合蛋白和第二种融合蛋白，第一种融合蛋白 含突变水解酶和能够结合第二种蛋白的第一种蛋白，第一种融合蛋 白中的突变水解酶结合至含一个或多个官能团的第一种水解酶底 物，所述一个或多个官能团中的一个为荧光团，第二种融合蛋白含 第二种蛋白和发光或荧光报告蛋白，其中所述突变水解酶相比于对 应野生型水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基  酸置换导致所述突变水解酶与所述底物形成相比于对应野生型水解 酶与所述底物所形成的键更为稳定的键，其中所述突变水解酶中的 所述至少一个氨基酸置换为在对应野生型水解酶中与水分子活化相 关的氨基酸残基上的置换，其中所述水分子裂解对应野生型水解酶 和所述底物形成的键，或者所述置换为在对应野生型水解酶中与所 述底物形成酯中间体的氨基酸残基上的置换，其中第一种和第二种 蛋白二聚化；
b)检测或测定荧光和/或发光。

说明书全文

发明领域

本发明涉及生化检测和试剂领域。更具体地说，本发明涉及共 价连接(束缚(tethered))一个或多个官能团的突变蛋白及其使用方法。

发明背景

分子特异性检测是了解该分子在细胞中作用的关键。例如与目 标分子共价连接的标记物使得可以快速检测复杂混合物中的该分 子。标记物可以是通过体外化学合成添加的标记物或通过例如重组 技术体内附着的标记物。例如，传统上在蛋白纯化后通过体外化学 修饰将荧光标记物或其它标记物附着于蛋白上(Hermanson，1996)。至 于标记物的体内连接，可将得自维多利亚水母(Aequorea victoria)的绿 色荧光蛋白(GFP)与众多宿主蛋白遗传融合，原位产生荧光嵌合体 (Tsien，1998；Chalfie等，1998)。但是，尽管基于GFP的指示剂目前用 于各种测定，例如检测pH(Kneen等，1998；Llopis等，1998；Miesenbck 等，1998)、Ca2+(Miyawaki等，1997；Rosomer等，1997)和膜电位(Siegel 等，1997)，但固有标记蛋白如GFP的荧光受限于蛋白结构特性，例 如有限的荧光颜色范围和相对较低的固有亮度(Cubitt等，1995；Orm 等，1996)。
为克服GFP原位标记的缺陷，Griffen等(1998)合成了一对紧密 结合的分子组分：由少至6个天然氨基酸组成的小型受体域和可连 接至各种光谱探针或交联剂的小型(＜700道尔顿)合成配体。受体域 在α螺旋的i、i+1、i+4和i+5位包含4个半胱氨酸，而配体为4′，5′- 双(1，3，2-二硫杂砷杂环戊烷-2-基)荧光素(FLASH)。Griffen等公开： 所述配体在非转染哺乳动物细胞中的结合位点较少，可透过膜，直 至其高亲和且特异性地结合重组蛋白中的四半胱氨酸域才有荧光， 使细胞被荧光标记(“FLASH”标记)，其解离常数为纳摩尔浓度或更 低。但是，关于细胞中的本底结合，Stroffekova等(2001)披露 FLASH-EDT2非特异性结合内源性富半胱氨酸蛋白。此外，荧光团的 可用范围限制了用FLASH标记蛋白。
受体介导的靶向方法使用基因编码的靶向序列将荧光团定位于 几乎任一细胞位点，前提是靶标蛋白能够正确折叠。例如，Farinas 等(1999)公开了使用cDNA转染将单链抗体(sFv)靶向细胞中的特定位 点。Farinas等公开了半抗原(4-乙氧基亚甲基-2-苯基-2-唑啉-5-酮， phOx)和荧光探针(例如BODIPY F1、四甲基罗丹明和荧光素)的缀合 物高亲和性(约5nM)结合活体中国仓鼠卵巢细胞中sFv的亚细胞位 点，表明靶向抗体作为可穿透细胞的半抗原-荧光团缀合物的高亲和 性受体。不过，功能性sFv表达在还原性条件下比较低。
因此，需要标记目的分子的改进方法。
发明概述
本发明提供了例如通过共价键或其它稳定键使一个或多个官能 团和本发明蛋白或包含本发明蛋白的融合蛋白(嵌合体)束缚(连接)的 方法、组合物和试剂盒。本发明蛋白在结构上与野生型(天然)水解酶 相关，但与对应野生型水解酶相比含有至少一个氨基酸置换，在某 些实施方案中含有至少两个氨基酸置换，并结合对应野生型水解酶 的底物，但与对应野生型水解酶相比缺少或降低了催化活性(该突变 蛋白在本文称为突变水解酶)。前述束缚发生在例如溶液或悬浮液中、 细胞中、固相支持体上或溶液/表面交界面，使用包含反应基并被修 饰以包含一个或多个官能团的水解酶底物实现。本文使用的“底物” 包括含反应基和任选具有一个或多个官能团的底物。含一个或多个 官能团的底物在本文一般称为本发明底物。本文使用的“官能团” 是可检测或能够检测的分子，例如可通过直接或间接手段检测的分 子(例如光激活分子、地高辛配基、镍NTA(次氮基三乙酸)、发色团、 荧光团或发光团)，可结合或附着于第二种分子(例如生物素、半抗原 或交联基团)的分子，或者可为固相支持体。
官能团可具有一种以上的特性，例如能够检测和结合另一个分 子。本文使用的“反应基”是底物中最少数目的原子，其被特定的 野生型水解酶或本发明的突变水解酶特异性识别。底物中的反应基 和野生型水解酶相互作用产生产物，并使所述野生型水解酶再生。 底物(例如本发明的底物)还可以任选地包含连接基团，例如可裂解的 连接基团，其将底物中一个或多个官能团与反应基物理分隔，在一 个实施方案中，连接基团优选为12-30个原子长。所述连接基团可以 不总是存在于本发明底物中，但在某些实施方案中，可能需要物理 分隔反应基和官能团，以使反应基可与突变水解酶中的活性残基相 互作用而形成共价键。优选当所述连接基团存在时，相对于对应的 没有所述连接基团的底物和野生型或突变水解酶的特异性或反应 性，其基本上不改变(例如削弱)具有所述连接基团的底物和野生型或 突变水解酶的特异性或反应性。而且，所述连接基团的存在优选基 本上不改变(例如削弱)官能团的一种或多种特性(例如功能)。例如， 对于某些突变水解酶，即具有较深催化袋的突变水解酶，本发明底 物可包括足够长度和结构的连接基团，以使本发明底物的一个或多 个官能团不扰乱水解酶(野生型和突变型)的三维结构。例如，本发明 脱卤素酶底物的一个实例包含如(CH2)2-3X(其中X是卤化物)的反应 基和如羧基四甲基罗丹明的官能团，例如羧基四甲基罗丹明- C10H21NO2-Cl。
在一个实施方案中，本发明提供一种式(I)：R-连接基团-A-X的 化合物，其中R是一个或多个官能团，其中连接基团是含C、N、S 或O的多原子直链或支链，或是含一个或多个环的基团，如饱和或 不饱和环，例如一个或多个芳基环、杂芳基环、芳基环、杂芳基环 或其任意组合，其中A-X为脱卤素酶底物，所述脱卤素酶例如为卤 代烷脱卤素酶或裂解脂肪族或芳族卤化底物中的碳-卤键的脱卤素 酶，所述脱卤素酶底物例如为红球菌(Rhodococcus)、鞘氨醇单胞菌 (Spingomonas)、葡萄球菌(Staphylococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、 伯克氏菌(Burkholderia)、土壤杆菌(Agrobacterium)或黄色杆菌 (Xanthobacter)脱卤素酶底物，其中X为卤素。在一个实施方案中， 烷基卤共价连接至连接基团L，L是共价连接一个或多个官能团的一 个或多个基团，以形成脱卤素酶底物。如本文所述，红球菌 (Rhodococcus)脱卤素酶(DhaA)(参见图2示例的野生型红球菌 (Rhodococcus)脱卤素酶“DhaA.WT”序列)的突变体DhaA.H272F结 合DhaA底物，该底物包括5-(和6-)羧基荧光素，例如羧基荧光素- C10H21NO2-Cl；羧基四甲基罗丹明，例如羧基四甲基罗丹明- C10H21NO2-Cl；以及生物素，例如生物素-C10H21NO2-Cl，此结合对羧 基荧光素或羧基四甲基罗丹明荧光或生物素与链霉抗生物素蛋白的 结合没有显著的猝灭作用。又如本文所述，突变脱卤素酶，例如 DhaA.D106C和DhaA.D106E以及DhaA.D106C:H272F 和 DhaA.D106E:H272F，结合羧基荧光素-C10H21NO2-Cl和/或羧基四甲 基罗丹明-C10H21NO2-Cl。在一个实施方案中，所述底物为R- (CH2)2O(CH2)2O(CH2)2O(CH2)6Cl，其中R为官能团。为制备这种底物， 可使官能团与诸如NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2O(CH2)6Cl的分子反应。
在一个实施方案中，本发明底物可穿透细胞的质膜。例如，如 本文所述，羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl和生物素-C10H21NO2-Cl 可穿透原核细胞(大肠杆菌)和真核细胞(CHO-K1)的质膜，在没有突 变水解酶的情况下可将这些底物快速有效地输入和洗出细胞。当存 在突变水解酶时，可防止至少一部分底物洗出细胞。因此，结合部 分的底物可用作标记物或捕获突变水解酶或其融合体的工具。
在一个实施方案中，本发明底物包括两个或多个官能团。在一 个实施方案中，其中一个官能团为酶。在另一个实施方案中，其中 一个官能团为酶底物。例如，一个官能团可为萤光素，另一个官能 团为蛋白酶识别位点，即含足以被蛋白酶识别的序列的蛋白酶识别 位点，所述序列包含待切割的位点；一个官能团可为生物素，另一 个官能团为荧光团；或一个官能团可为蛋白酶识别位点，另一个官 能团为荧光团。
本发明进一步提供制备水解酶底物的方法，该底物被修饰以包 含一个或多个官能团。
如本文更详细的描述，本发明的突变水解酶相比于对应的野生 型水解酶包含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换 使所述突变水解酶能够与底物形成相比于对应的野生型水解酶和底 物所形成的键更为稳定的键。突变水解酶中的所述至少一个氨基酸 置换是在对应野生型水解酶中与水分子活化有关的氨基酸残基处的 置换，其中该水分子裂解对应的野生型水解酶和底物形成的键，或 是在对应野生型水解酶中与底物形成酯中间体的氨基酸残基处的置 换。在一个实施方案中，突变水解酶相比于对应的野生型水解酶包 含至少两个氨基酸置换，其中一个置换位于野生型水解酶中与水分 子活化有关的残基处，或位于野生型水解酶中通过底物对水解酶的 亲核攻击而形成酯中间体的残基处，另一个置换位于野生型水解酶 中处于或邻近水解酶底物结合位点的残基处，例如在结合至野生型 水解酶的水解酶底物的3-5内的残基处，但不在对应野生型水解酶 中与水分子活化有关的残基处或与底物形成酯中间体的残基处。在 一个实施方案中，第二个置换位于野生型水解酶中嵌入(line)供底物 进入水解酶催化袋用的位点的残基处，例如，所述残基为处于活性 位点空穴(cavity)内并在结合了野生型水解酶的水解酶底物的3-5内 的残基，例如在底物隧道(tunnel)中的残基，所述残基不是对应野生 型水解酶中与水分子活化有关的残基或与底物形成酯中间体的残 基。其余的置换优选增加突变体结合对应野生型水解酶底物、形成 稳定共价键的速率。
突变水解酶可以为融合蛋白，例如由编码突变水解酶和至少一 种目标蛋白的重组DNA所表达的融合蛋白或化学合成形成的融合蛋 白。例如，所述融合蛋白可包含突变水解酶和目标酶(例如萤光素酶、 RNA酶蛋白抑制剂或RNA酶)，和/或通道蛋白、受体、膜蛋白、胞 质蛋白、核内蛋白、结构蛋白、磷蛋白、激酶、信号蛋白、代谢蛋 白、线粒体蛋白、受体相关蛋白、荧光蛋白、酶底物、转录因子、 转运蛋白和/或将突变水解酶(例如融合蛋白)导向特定位置的靶向序 列，例如十四烷基化序列、线粒体定位序列或核定位序列。目标蛋 白可融合至突变水解酶的N-末端或C-末端。在一个实施方案中，所 述融合蛋白在突变水解酶的N-末端包含目标蛋白，而在突变水解酶 的C-末端包含另一种蛋白，例如不同的蛋白。例如，目标蛋白可以 为荧光蛋白或抗体。融合体中的蛋白任选由连接序列分隔，例如优 选具有至少2个氨基酸残基的连接序列，例如具有13-17个氨基酸残 基的连接序列。相比于各个体蛋白的功能，在本发明融合蛋白中存 在连接序列并不显著改变融合体中任一种蛋白的功能。
本发明还提供含水解酶(例如本发明的突变水解酶)编码核酸序列 的分离的核酸分子(多核苷酸)。在一个实施方案中，所述分离的核酸 分子包含为在至少一种选定宿主中表达而优化的核酸序列。优化序 列包括密码子优化(即在一种生物中比在另一种生物(例如远缘生物) 中更经常使用的密码子)的序列，以及修饰以加入或修饰Kozak序列 和/或内含子和/或去除不需要的序列(例如潜在的转录因子结合位 点)。在一个实施方案中，所述多核苷酸包括编码脱卤素酶的核酸序 列，该核酸序列为在选定宿主细胞中表达进行了优化。在一个实施 方案中，优化多核苷酸不再与对应的非优化序列杂交，例如在中等 或高严格条件下不与非优化序列杂交。在另一个实施方案中，所述 多核苷酸与对应的非优化序列的核酸序列同一性低于90％，例如低 于80％，任选其编码多肽与非优化序列编码多肽的氨基酸序列同一 性至少为80％，例如至少85％、90％或更高。本发明还提供包含分 离核酸分子的构建物(例如表达盒)和载体以及含分离的核酸分子、构 建物或载体的试剂盒。
本发明还包括组合物和试剂盒，其包括含连接基团的水解酶底 物、含一个或多个官能团并任选含连接基团的水解酶底物、具有一 个或多个官能团的连接基团、没有一个或多个官能团并任选含连接 基团的水解酶底物、连接基团或突变水解酶，或其任意组合。例如， 本发明包括含本发明底物的固相支持体、含本发明突变水解酶或其 融合体的固相支持体、含本发明底物的试剂盒、含本发明脱卤素酶 或其融合体的编码载体的试剂盒、或含本发明丝氨酸β-内酰胺酶或其 融合体的编码载体的试剂盒。
本发明的底物和突变水解酶可用于分离、检测、鉴别、造影、 展示或定位目标分子、标记细胞(包括活细胞造影)或体外和/或体内标 记蛋白。例如，结合于固相支持体的本发明底物或结合于固相支持 体的突变水解酶可用于生成蛋白阵列、细胞阵列、囊泡/细胞器阵列、 基因阵列和/或细胞膜阵列。因此，在一个实施方案中，本发明提供 分离目标分子的方法。该方法包括提供含一种或多种融合蛋白(其中 至少一种包含本发明突变水解酶和结合目标分子的蛋白)的样品，以 及含一种或多种水解酶底物的固相支持体。然后使样品和固相支持 体接触，以便分离目标分子。例如，所述方法可用于分离与融合至 突变水解酶的蛋白结合的DNA。
在一个实施方案中，本发明提供检测或测定突变水解酶的存在 或量的方法。该方法包括使本发明的突变水解酶与含一个或多个官 能团的水解酶底物接触。检测或测定官能团的存在或量，由此检测 或测定突变水解酶的存在或量。在一个实施方案中，所述突变水解 酶在细胞中或在细胞表面上。在另一个实施方案中，所述突变水解 酶在细胞裂解物中。
本发明还提供本发明的突变水解酶和含一个或多个官能团的对 应水解酶底物用于例如分离分子或者检测或测定细胞中某些分子的 存在或量、定位(例如胞内、亚细胞或胞外定位)或移动的方法。
在另一个实施方案中，本发明包括物质的鉴定方法，所述物质 改变目标蛋白与推测与目标蛋白相互作用的分子的相互作用。该方 法包括使至少一种物质与推测与目标蛋白相互作用的分子、含本发 明突变水解酶和目标蛋白的融合蛋白以及含一个或多个官能团的水 解酶底物接触。然后测定所述物质是否改变目标蛋白与推测与目标 蛋白相互作用的分子的相互作用。
本发明因此提供监测细胞中蛋白表达、定位和/或移动(运输)以 及监测细胞中微环境变化的方法。在一个实施方案中，本发明突变 水解酶和本发明底物的应用使得可以对蛋白(例如离子通道)进行功能 分析。在另一个实施方案中，两对突变水解酶/底物的应用使得可以 进行多重同步检测以及基于FRET或BRET的测定。
为分离、分拣或纯化细胞，可在细胞外表面表达本发明的突变 水解酶(例如通过与质膜蛋白或膜锚定信号融合)。例如，表达整联蛋 白的胞质和跨膜结构域与突变水解酶的融合体、或糖基磷脂酰肌醇 信号序列与突变水解酶的融合体的细胞，可通过与本发明底物(例如 结合于固相支持体的本发明底物)接触来分离(“被捕获”)。为分离、 纯化或分隔细胞器，在目标细胞器的胞质面上表达突变水解酶。在 另一个实施方案中，为创造培养不同细胞用的最佳平台，将突变水 解酶与胞外基质组分或外膜蛋白融合，并束缚至三维细胞培养物或 组织工程用平台。作为实例，可在所述平台上培养初级神经元或胚 胎干细胞，以形成饲养层。
其它应用包括检测或标记细胞。因此，使用本发明突变水解酶 和对应的本发明底物可检测细胞，例如检测植入或注射入动物后的 体外或体内细胞迁移(例如血管生成/趋化性测定、植入神经元的迁 移、植入/注射入动物中的正常、恶性或重组修饰细胞的迁移，等等)， 以及活细胞造影后进行免疫细胞化学。在另一个实施方案中，本发 明提供标记新合成蛋白的方法。例如，使含本发明突变水解酶或其 融合体表达载体的细胞与没有官能团的水解酶底物接触。然后使细 胞与基因表达诱导剂之类的物质以及含一个或多个官能团的水解酶 底物接触。然后检测或测定突变水解酶或其融合体的存在、量或位 置。突变水解酶或其融合体的存在、量或位置应归因于新合成的突 变水解酶或其融合体。或者，使含本发明突变水解酶或其融合体表 达载体的细胞与具有官能团(例如绿色荧光团)的水解酶底物接触，然 后与一种物质和具有不同官能团(例如红色荧光团)的底物接触。在一 个实施方案中，所述突变水解酶与膜定位信号融合，所以可用于监 测膜中或膜附近的事件。
在另一个实施方案中，本发明提供一种方法，其中提供含一种 或多种融合蛋白(其中至少一种包含本发明突变水解酶和目标蛋白)的 样品，以及含一种或多种水解酶底物的固相支持体。使样品和固相 支持体接触，以便分离目标蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供由样品分离一种或多种目标 分子的方法。该方法包括提供含本发明突变水解酶的固相支持体， 和含一个或多个官能团的水解酶底物，所述官能团中的至少一个能 够结合所述一种或多个目标分子。混合样品、固相支持体和水解酶 底物，由此分离一种或多种目标分子。
本发明还提供例如在转基因或非转基因非人动物中标记细胞的 方法。例如，为标记细胞，可在细胞外表面表达本发明的突变水解 酶(例如通过与质膜蛋白或膜锚定信号融合)。例如，表达整联蛋白的 胞质和跨膜结构域与本发明突变水解酶的融合体、或糖基磷脂酰肌 醇信号序列与本发明突变水解酶的融合体的细胞，可通过与本发明 底物接触来鉴别或标记。在一个实施方案中，本发明包括在转基因 动物中标记细胞的方法。该方法包括提供转基因非人动物，其细胞 的基因组用含转录调节元件和可选的靶向肽的表达盒增大，所述转 录调节元件有效连接至编码本发明突变水解酶的核酸片段并任选为 组织或细胞特异性的。然后使转基因非人动物与含一个或多个官能 团的水解酶底物接触，由此标记表达突变水解酶的细胞。
使用表达选择标记蛋白(例如编码新霉素、潮霉素或嘌呤霉素抗 性的蛋白质)的细胞，用外源DNA稳定转化细胞。可能理想的是观 测哪些细胞含选择标记蛋白以及荧光标记分子。例如，可优选可用 由外部加入到活细胞中的荧光分子来标记选择标记蛋白。利用此方 法，选择标记蛋白仅在需要时通过加入该荧光团成为可见的，随后 当选择标记蛋白通过细胞代谢自然再生时荧光消失。因此，在一个 实施方案中，本发明提供标记表达选择标记蛋白的细胞的方法。该 方法包括提供含表达盒的细胞，该表达盒含编码融合蛋白的核酸序 列。融合蛋白含选择标记蛋白(例如赋予至少一种抗生素抗性的蛋白) 和第二种能够稳定和任选不可逆结合底物或其部分的蛋白，所述底 物或其部分包含光学可检测分子。例如，所述蛋白可为将烷基和光 学可检测分子由底物不可逆转移至其自身的烷基转移酶，由此标记 烷基转移酶，例如O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶等烷基转移酶。 用于本发明该实施方案的示例性蛋白包括但不限于烷基转移酶、肽 基甘氨酸-α-酰胺化单加氧酶、I型拓扑异构酶、水解酶如丝氨酸和环 氧化物水解酶以及本文描述的突变水解酶、氨基转移酶、细胞色素 P450单加氧酶、酰基转移酶、脱羧酶、氧化酶如单胺氧化酶、还原 酶如核糖核苷酸还原酶、合成酶如环ADP核糖合成酶或胸苷酸合成 酶、脱氢酶如醛脱氢酶、合酶如一氧化氮合酶(NOS)、内酰胺酶、胱 硫醚γ-裂合酶、肽酶如羧肽酶A、芳化酶、蛋白酶如丝氨酸蛋白酶、 木聚糖酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶和脱甲基酶以及其它蛋白，包括 与一种或多种底物形成不可逆或其它稳定键的野生型蛋白，例如能 够机制型失活的酶。因此，在此实施方案中，稳定键，即底物和野 生型酶或突变酶之间形成的键，其t1/2至少为30分钟，优选至少4小 时，直到至少10小时，并抗清洗、蛋白变性和/或高温的破坏，例如 该键对在SDS中煮沸稳定。
使表达融合蛋白的细胞与底物接触，以便标记细胞。在一个实 施方案中，所述细胞固定后接触底物。在另一个实施方案中，所述 底物和固定剂同时与细胞接触。在又一个实施方案中，在细胞与底 物接触后将固定剂加入到细胞中。在一个实施方案中，融合蛋白与 底物形成酯键。在另一个实施方案中，融合蛋白与底物形成硫酯键。
在一个实施方案中，本发明提供一种方法，其中将含表达盒的 细胞导入到非人动物(例如非人哺乳动物)或包括人在内的动物中，所 述表达盒含有效连接至编码本发明突变水解酶和可选的靶向肽的核 酸片段并任选为组织或细胞特异的的转录调节元件。在使所述动物 与所述细胞接触的同时、之前或之后使动物与含一个或多个官能团 的水解酶底物接触，由此标记表达突变水解酶的细胞。在一个实施 方案中，随后检测一个或多个官能团。在另一个实施方案中，所述 细胞在导入动物之前与水解酶底物接触。
本发明还提供由样品分离一种或多种目标分子的方法。所述方 法包括使样品、本发明的突变水解酶和含一个或多个官能团(其中至 少一个结合目标分子)的水解酶底物接触，使含本发明突变水解酶的 样品和含一个或多个官能团(其中至少一个结合目标分子)的水解酶底 物接触，或使含包含一个或多个官能团(其中至少一个结合目标分子) 的水解酶底物的样品和本发明突变水解酶接触，以便分离所述一种 或多种分子。
本发明进一步提供检测样品中的一种或多种目标分子的方法。 所述方法包括使样品、本发明的突变水解酶和含一个或多个官能团(其 中至少一个结合目标分子)的水解酶底物接触，使含本发明突变水解 酶的样品和含一个或多个官能团(其中至少一个结合目标分子)的水解 酶底物接触，或使含包含一个或多个官能团(其中至少一个结合目标 分子)的水解酶底物的样品和本发明突变水解酶接触。然后检测或测 定目标分子的存在或量。
本发明还提供一种方法，其中含本发明突变水解酶的细胞与含 两个或多个官能团(其中至少一个结合目标分子，且该结合改变第二 个官能团的特性)的水解酶底物接触。然后检测或测定第二个官能团 的存在或量。
本发明还提供一种在细胞中选择性失活一种或多种目标蛋白和/ 或细胞活性的方法。所述方法用于使含融合蛋白(其包含本发明的突 变水解酶和目标蛋白)的样品或者具有表达盒(其编码含本发明的突变 水解酶和目标蛋白的融合蛋白)的细胞与含一个或多个官能团(其中至 少一个在对一定波长的光曝光时产生单态氧)的水解酶底物接触，获 得混合物。将所述混合物以在细胞中选择性(例如局部)失活一种或多 种目标蛋白和/或细胞活性的量对特定波长的光曝光。在一个实施方 案中，检测或测定一种或多种蛋白功能和/或细胞活性的变化。
本发明还提供检测样品中的目标分子的方法。所述方法包括提 供一种复合物，该复合物含第一种融合蛋白并提供第二种融合蛋白， 所述第一种融合蛋白包含本发明突变水解酶和能够结合第二种蛋白 的第一种蛋白，所述突变水解酶结合含一个或多个官能团(其中一个 是荧光团)的第一种水解酶底物，第二种融合蛋白包含第三种蛋白(例 如本发明的突变水解酶)和第二种蛋白，第三种蛋白结合含一个或多 个官能团(其中一个猝灭所述荧光团)的第二种底物，第二种底物是第 三种蛋白的底物。将复合物与样品混合，并检测或测定荧光。
在另一个实施方案中，本发明包括一种方法，该方法提供复合 物，该复合物包含第一种融合蛋白和第二种融合蛋白，第一种融合 蛋白含本发明突变水解酶和能够结合第二种蛋白的第一种蛋白，所 述突变水解酶结合含一个或多个官能团(其中一个是荧光团)的第一种 水解酶底物，第二种融合蛋白包含第二种蛋白和荧光或发光报告蛋 白。将复合物与样品混合，并通过发光至荧光团的共振能量转移(BRET) 检测相互作用。在一个实施方案中，本发明包括一种方法，其提供 第一种融合蛋白和第二种融合蛋白，第一种融合蛋白含本发明突变 水解酶和能够结合第二种蛋白的第一种蛋白，所述突变水解酶结合 含一个或多个官能团(其中一个是荧光团)的第一种水解酶底物，第二 种融合蛋白含第二种蛋白和荧光或发光报告蛋白。混合第一种和第 二种融合蛋白，并通过BRET检测相互作用。
在另一个实施方案中，提供检测细胞中的一种或多种蛋白酶的 方法。所述方法包括提供含第一表达盒和第二表达盒的细胞或其裂 解物，第一表达盒含连接至第一核酸片段(其结合第一转录阻遏蛋白 并连接至第一报告基因)的第一种启动子，例如诱导型或组成型启动 子，第二表达盒含连接至第二核酸片段(其编码含蛋白酶识别位点的 第一修饰型转录阻遏蛋白)的第二启动子，例如诱导型或组成型启动 子。在一个实施方案中，所述报告基因是萤光素酶或本发明的突变 水解酶。在无蛋白酶切割时，第一修饰型转录阻遏蛋白能够结合第 一核酸片段，并抑制由第一启动子转录，由此抑制报告基因的转录。 在有蛋白酶时，修饰的转录阻遏蛋白被切割，失去或降低了对第一 核酸片段的结合。检测或测定报告基因表达。因此，报告基因的表 达或表达增加表明存在蛋白酶。在另一个实施方案中，所述方法包 括提供无细胞表达系统，例如S30、麦芽、兔网织红细胞、昆虫细胞 或哺乳动物细胞裂解物，该系统包含含第一启动子的表达盒，所述 第一启动子连接至结合转录阻遏蛋白并与第一报告基因连接的核酸 片段。在一个实施方案中，报告基因是萤光素酶或本发明的突变水 解酶。将含蛋白酶识别位点的分离的修饰型转录阻遏蛋白和/或分离 的蛋白酶、具有一种或多种蛋白酶的裂解物或预期具有一种或多种 蛋白酶的样品加入到无细胞裂解物中。检测或测定报告基因表达。 报告基因表达或表达增加表明存在蛋白酶。
在另一个实施方案中，提供细胞或其裂解物，其包含第一表达 盒、第二表达盒和融合蛋白，所述第一表达盒含连接至第一核酸片 段(其结合第一转录阻遏蛋白并连接报告基因)的第一启动子，第二表 达盒含连接至第二核酸片段的第二启动子，第二核酸片段结合融合 蛋白的第一种蛋白并有效连接至转录阻遏蛋白的编码区。在一个实 施方案中，报告基因是萤光素酶或本发明的突变水解酶。融合蛋白 含结合第二核酸片段的第一种蛋白、蛋白酶识别位点和第二种蛋白， 第二种蛋白在第一种蛋白结合第二核酸片段时活化第二启动子。检 测或测定报告基因表达。报告基因表达或表达增加表明存在蛋白酶。
在又一个实施方案中，细胞或其裂解物含第一种、第二种和第 三表达盒，所述第一表达盒含连接至第一核酸片段(其结合转录活化 蛋白并连接至转录阻遏蛋白基因)的第一启动子，第二表达盒含连接 至第二核酸片段(其结合转录阻遏蛋白并有效连接至报告基因)的第二 启动子，所述第三表达盒含连接至核酸序列(其编码含DNA结合蛋 白、蛋白酶识别位点和转录活化蛋白的融合蛋白)的第三种启动子。 在一个实施方案中，报告基因是萤光素酶或本发明的突变水解酶。 在没有蛋白酶时，融合蛋白激活转录阻遏蛋白的表达，转录阻遏蛋 白的表达又抑制报告蛋白的表达。检测或测定报告基因表达。在有 蛋白酶时，融合蛋白被裂解，第一表达盒的转录阻遏蛋白表达受到 抑制，这导致第二表达盒的报告蛋白表达。
本发明还提供检测细胞中一种或多种蛋白酶的方法，该方法包 括提供含表达盒的细胞，所述表达盒包含连接至融合蛋白编码核酸 的启动子，所述融合蛋白包含蛋白去稳定序列、蛋白酶识别位点和 报告蛋白，检测或测定报告蛋白表达，其中报告蛋白表达或延时表 达表示存在蛋白酶。
在又一个实施方案中，本发明提供检测细胞中的一种或多种蛋 白酶的方法。所述细胞包含表达盒，所述表达盒含连接至融合蛋白 编码核酸的启动子，所述融合蛋白包含蛋白去稳定序列、蛋白酶识 别位点和报告蛋白。检测或测定报告蛋白表达，其中报告蛋白表达 或表达增加表示存在蛋白酶。在一个实施方案中，报告基因是萤光 素酶或本发明的突变水解酶。
本发明还提供检测样品中的一种或多种蛋白酶的方法。所述方 法包括提供含结合至融合蛋白的水解酶底物的固相支持体，所述融 合蛋白含本发明的突变水解酶、蛋白酶识别位点和报告蛋白，或提 供含水解酶底物的固相支持体和融合蛋白，所述融合蛋白含本发明 的突变水解酶、蛋白酶识别位点和报告蛋白。使样品与含结合至融 合蛋白的水解酶底物的固相支持体接触，或与固相支持体和融合蛋 白接触。任选地收集溶液相。然后检测或测定报告蛋白活性。
在又一个实施方案中，本发明提供检测样品中的一种或多种蛋 白酶的方法，其中提供一种混合物。所述混合物包含含细胞或其裂 解物的样品以及含异源蛋白酶识别位点的分离的修饰型转录阻遏蛋 白，所述细胞或其裂解物含第一表达盒，第一表达盒含连接至第一 核酸片段(其结合第一转录阻遏蛋白)并连接至第一报告基因的第一启 动子，或者混合物包含样品、含第一表达盒的细胞或其裂解物以及 含异源蛋白酶识别位点的分离的修饰型转录阻遏蛋白，第一表达盒 含连接至第一核酸片段(其结合第一转录阻遏蛋白并连接至第一报告 基因)的第一启动子。在没有蛋白酶时，第一修饰型转录阻遏蛋白能 够结合第一核酸片段，并抑制起于第一启动子的转录；在有蛋白酶 时，第一修饰型转录阻遏蛋白与第一核酸片段的结合受到抑制。检 测或测定混合物中的报告基因。第一报告基因的表达或表达增加表 示样品中存在蛋白酶。
在一个实施方案中，提供包含结合至融合蛋白的水解酶底物的 固相支持体，所述融合蛋白包含突变水解酶、蛋白酶识别位点和报 告蛋白，或提供含水解酶底物的固相支持体和融合蛋白，所述融合 蛋白包含突变水解酶、蛋白酶识别位点和报告蛋白。突变水解酶相 对于对应的野生型水解酶含至少一个氨基酸置换，其中所述至少一 个氨基酸置换使所述突变水解酶与底物形成相比于对应的野生型水 解酶和底物所形成的键更为稳定的键，其中所述突变水解酶在突变 水解酶中包含至少一个氨基酸置换，该置换是在对应野生型水解酶 中与水分子活化有关的氨基酸残基处的置换，其中所述水分子裂解 对应的野生型水解酶和底物形成的键，或是在对应野生型水解酶中 与底物形成酯中间体的氨基酸残基处的置换。使样品与含结合至融 合蛋白的水解酶底物的固相支持体接触，或与固相支持体和融合蛋 白接触。检测或测定报告蛋白活性。
本发明还提供生物传感器。在一个实施方案中，本发明提供检 测样品中的酶底物的方法。所述方法包括提供样品、一种或多种融 合蛋白(其中至少一种包含本发明的突变水解酶和所述酶)和含一种或 多种水解酶底物的固相支持体，或提供样品和含一种或多种水解酶 底物的固相支持体，其中所述水解酶底物结合于一种或多种融合蛋 白(其中至少一种含本发明的突变水解酶和所述酶)。突变水解酶与水 解酶底物的结合改变了固相支持体(例如铂电极、金包被表面、金纳 颗粒或碳纳管)的电化学特性。在一个实施方案中，所述样品是生理 样品，例如生理性液体样品。所述样品与固相支持体接触，通过检 测或测定固相支持体电化学特性的改变，检测或测定样品中底物的 存在。在一个实施方案中，所述酶是葡萄糖氧化酶。在另一个实施 方案中，所述酶是胆固醇氧化酶。
在另一个实施方案中，提供一种标记蛋白的方法。所述方法包 括使细胞或体外翻译混合物与含一个或多个官能团(其中至少一个是 氨酰化tRNA或氨基酸)的水解酶底物接触，以便标记新合成蛋白。 在一个实施方案中，本发明的突变水解酶用于分离新合成蛋白。
本发明还提供分离的核酸分子。所述分离的核酸分子包含编码 融合多肽的核酸序列，所述融合多肽包含至少一个异源蛋白去稳定 序列、蛋白酶识别位点和报告蛋白，相比于没有异源蛋白去稳定序 列的对应报告蛋白，所述融合多肽的半衰期降低。
本发明进一步提供分离的核酸分子，其包含启动子、结合转录 阻遏蛋白并有效连接至本发明突变水解酶编码区的核酸片段。
本发明还提供本文公开的用于制备本发明化合物、组合物、核 酸、蛋白或其它物质的方法和中间体。
附图简述
图1A-B提供了DhaA对卤代烷底物的两步催化机制的示意图。 A).以Asp106羧酸亲核取代卤化物基团，并形成共价酯中间体。B). 活化的水分子水解共价中间体，释放醇和再生催化性Asp106。
图2A显示了DhaA.H272F蛋白的分子模型。螺旋帽结构域以淡 蓝色显示。α/β水解酶中心结构域(深蓝色)包含催化三联体残基。接 近帽和中心结构域交界面的红色底纹残基代表H272F和D106亲核 体。黄色底纹残基表示E130和卤化物螯合残基W107的位置。
图2B显示了紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)脱卤素酶 (DhaA)蛋白的序列(Kulakova等，1997)(SEQ ID NO：82)。催化三联体 残基Asp(D)、Glu(E)和His(H)标以下划线。组成帽结构域的残基以 斜体显示。能够与卤代烷底物产生共价键的DhaA.H272F和 DhaA.D106C蛋白突变体分别包含Phe(F)和Cys(C)对催化三联体His (H)和Asp(D)残基的取代。
图2C图解了DhaA.H272F与卤代烷底物形成共价中间体的机 制。在Asp106亲核取代卤化物基团之后形成共价酯中间体。Phe残 基对His272的取代防止水活化并捕获共价中间体。
图2D图示了DhaA.D106C与卤代烷底物形成共价中间体的机 制。Cys106硫醇亲核取代卤化物，形成对水解稳定的硫醚中间体。
图2E图示了DhaA.H272F变体的结构模型，共价连接的羧基四 甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl配体处于活性位点空穴中。接近帽和中心 结构域交界面的红色底纹残基代表H272F和D106亲核体。黄色底 纹残基表示E130和卤化物-螯合残基W107的位置。
图2F显示了DhaA.H272F底物结合隧道的结构模型。
图3A图解了质粒pGEX5X3DhaA.H272F.FLAG的物理图谱。该 质粒和pGEX5X3DhaA.D106C.FLAG(未展示)在诱变和筛选研究中用 作亲代模板。DhaA编码区以N末端和谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合， 以C末端和FLAG表位融合。Xa因子切割位点位于GST和DhaA 编码区之间。
图3B显示了GST-DhaA融合蛋白的纯化。发现DhaA.WT(奇数 泳道)和DhaA.H272F(偶数泳道)融合蛋白是可溶的，并在GSS- Sepharose 4FF上有效纯化(泳道3和4：粗制大肠杆菌上清液；泳道 5和6：清洗液；泳道7-10：纯化蛋白)。用Xa因子处理融合蛋白导 致形成两种蛋白：GST和DhaA(野生型或H272F突变体；分别为泳 道11和12)。而且，GST在GSS-Sepharose 4FF上被有效去除(DhaA.WT 或突变体；分别为泳道13和14)。所有蛋白都具有预计的分子量。
图4图解了DhaA.WT和突变DhaA对1-Cl-丁烷的水解。
图5显示了用各种浓度的(NH4)2SO4沉淀DhaA.WT和 DhaA.H272F/A/G/Q突变体。泳道1、5和9：0％(NH4)2SO4；泳道2、 6和10：10％(NH4)2SO4；泳道3、7和11：10-45％(NH4)2SO4；泳道 4、8和12：45-70％(NH4)2SO4。图A：泳道1-4，DhaA.WT；泳道5-8， DhaA.H272G；和泳道9-12，DhaA.H272Q。图B：泳道1-4，DhaA.WT； 泳道5-8，DhaA.H272F；和泳道9-12，DhaA.H272A。
图6描述了野生型DhaA的底物特异性。使用基于酚红的测定 (E558)，在加入酶后的首个60秒内以4次15秒读数测定反应初速度。
图7A-B显示了包含官能团(例如5-(和6-)-羧基荧光素、Anth(蒽) 或生物素)和连接基团的DhaA底物。“生物素-14-Cl”指生物素- C10H21NO2-Cl；“生物素-X-14-Cl”指生物素-C16H32N2O3-Cl；“生物 素-PEG4-14-Cl”指生物素-C21H42N2O7-Cl。
图8A显示了DhaA.WT和DhaA.H272F水解羧基荧光素- C10H21NO2-Cl的产物的HPLC分离。
图8B显示了DhaA.WT和DhaA.H272F水解羧基荧光素- C10H21NO2-Cl随时间变化产生的产物(以底物百分比表示)的HPLC分 析。
图9显示了DhaA.WT(图A中的泳道1、3和5以及图B中的 泳道1-8)和DhaA.H272F(图A中的泳道2、4和6以及图B中的泳 道9-14)与羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl(图A中的泳道1和2)、 羧基-X-罗丹明-C10H21NO2-Cl(图A中的泳道3和4)、羧基荧光素- C10H21NO2-Cl(图A中的泳道5和6)或生物素-C10H21NO2-Cl(图B)结 合的SDS-PAGE分析。图B中生物素-C10H21NO2-Cl的浓度为：0μM(泳 道1和8)、125μM(泳道2和9)、25μM(泳道3和10)、5μM(泳道 4和11)、1μM(泳道5和12)、0.2μM(泳道6和13)和0.04μM(泳 道7和14)。
图10图示用底物生物素-C10H21NO2-Cl预处理突变DhaA阻断了 与另一种底物的结合。DhaA.WT：泳道1和2；DhaA.H272突变体： F，泳道3和4；G，泳道5和6；A，泳道7和8；Q，泳道9和10。 样品2、4、6、8和10用生物素-C10H21NO2-Cl预处理。
图11A-B显示了酶底物复合物的MALDI-TOF分析。与羧基荧 光素-C10H21NO2-Cl温育的DhaA.WT(图A)或DhaA.H272F(图B)GST 融合蛋白的质谱。
图12图解了在残基106具有置换的DhaA突变体和在残基106 与残基272具有置换的DhaA突变体与羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2- Cl结合特性的SDS-PAGE分析。将2μg蛋白和25μM羧基四甲基 罗丹明-C10H21NO2-Cl的32μl溶液于室温温育1小时。将10μl的各 反应物加至每个泳道。泳道1：DhaA.D106C；泳道2： DhaA.D106C:H272F；泳道 3：DhaA.D106E；泳道4： DhaA.D106E:H272F；泳道 5：DhaA.D106Q；泳道6： DhaA.D106Q:H272F；泳道7：DhaA.WT和泳道8：DhaA.H272F。 用570nm滤光片对凝胶成像。
图13图示了含萤光素酶和DhaA.H272融合体的样品中被束缚 至固相支持体(链霉抗生物素蛋白包被平板)上的海肾萤光素酶(Renilla lucifease)活性的分析。使用DhaA底物(即生物素-C10H21NO2-Cl)实现 对融合体的捕获。在具有海肾萤光素酶和DhaA.WT融合体的级分中 未观察到活性。
图14显示了用生物素-C10H21NO2-Cl(图A)或羧基四甲基罗丹明- C10H21NO2-Cl(图B)体内处理的大肠杆菌两倍连续稀释液的SDS- PAGE分析，所述大肠杆菌表达DhaA.WT(各图的泳道1-4)或 DhaA.H272F(各图的泳道5-7)。箭头标示其Mr对应于DhaA的Mr 的蛋白。
图15显示了羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl与真核细胞蛋白的 体内结合。用羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl处理CHO-K1细胞蛋 白的两倍连续稀释液，所述CHO-K1细胞表达DhaA.WT-Flag(泳道 1-4)或DhaA.H272F-Flag(泳道5-8)。箭头标示其Mr对应于DhaA-Flag 的Mr的蛋白。
图16A-C图示了羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl对CHO-K1细 胞的透过性。用羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl(25μM，37℃，5 分钟)处理CHO-K1细胞(图A，亮视野图象)，并用PBS快速清洗(图 B)。图C显示了清洗步骤后的细胞。
图17显示了GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag或GFP-连接基团- DhaA.H272F-Flag转染细胞的图像。用GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag (图A-C)或GFP-连接基团-DhaA.H272F-Flag(图D-F)编码DNA转染 CHO-K1细胞，并用羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl处理。图A、D： 亮视野；图B、E：GFP滤光片组；和图C、F：羧基四甲基罗丹明 滤光片组。
图18显示了GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag(泳道1-4)或GFP-连 接基团-DhaA.H272F-Flag(泳道5-8)转染细胞的蛋白的蛋白质印迹分 析。用GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag或GFP-连接基团-DhaA.H272F- Flag转染CHO-K1细胞，然后用羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl(25 μM)处理0、5、15或60分钟，用PBS(4×1.0ml)清洗，并用SDS- 样品缓冲液收集。用SDS-PAGE分离样品，用荧光成像仪分析。泳 道1-4，GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag，分别处理0、5、15或60分 钟。泳道5-8，GFP-连接基团-DhaA.H272F-Flag，分别处理0、5、15、 60分钟。箭头标示Mr对应于GFP-连接基团-DhaA.H272F-Flag的Mr 的蛋白。
图19A-B图示了所选择的底物(图A，羧基四甲基罗丹明和图B， 羧基-X-罗丹明)对CHO-K1细胞的毒性。
图20图示了丝氨酸β-内酰胺酶的反应流程。反应以形成共价前 遭遇络合物(precovalent encounter complex)开始(图19A)，并通过高能 酰化四面体中间体(图19B)移动形成瞬时稳定酰基-酶中间体，通过催 化残基Ser70形成酯(图19C)。随后，酰基-酶受到水解性水攻击(图 19D)，形成高能脱酰化中间体(图19E)(Minasov等，2002)，其崩溃形 成水解产物(图19F)。然后排出产物，再生游离酶。
图21显示了GST-BlaZ水解FAP随时间的变化。
图22显示了bocellin与GST和BlaZ.E166D、BlaZ.N170Q或 BlaZ.E166D:N170Q的融合体的结合。泳道1：染料/无BlaZ；泳道2： BlaZ.WT；泳道3：BlaZ.E166D；泳道4：BlaZ.N170Q；和泳道5： BlaZ.E166D:N170Q。
图23显示了CCF2与GST和BlaZ.E166D、BlaZ.N170Q或 BlaZ.E166D:N170Q的融合体的结合。泳道1：染料/无BlaZ；泳道2： GST-BlaZ.WT；泳道3：GST-BlaZ.E166D；泳道4：GST-BlaZ.N170Q 和泳道5：GST-BlaZ.E166D:N170Q。
图24提供了用GFP-连接基团-DhaA.H272F-NLS3编码构建物转 染并用羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl染色的活CHO-K1细胞的荧 光和DIC图像。羧基四甲基罗丹明滤光片：顶部左侧；GFP滤光片： 顶部右侧；“A”和“B”重叠：底部左侧；图像“C”和细胞DIC图像的重 叠：底部右侧。NLS3＝SV40 T抗原核定位序列的串联重复。
图25显示了用GFP-β-抑制蛋白2编码构建物转染(左侧)和用 DhaA.H272F-β-抑制蛋白2编码构建物转染并用羧基四甲基罗丹明- C10H21NO2-Cl染色(右侧)的活CHO-K1细胞的荧光图像。
图26显示了大肠杆菌中DhaA表达的SDS-PAGE分析。泳道1： 分子量标准；2：DhaA.WT粗裂解物；3：DhaA.WT无细胞裂解物； 4：DhaA.H272F粗裂解物；5：DhaA.H272F无细胞裂解物；6：载体 对照粗裂解物；7：载体对照无细胞裂解物；8：DhaA.E130Q C1粗 裂解物；9：DhaA.E130Q C1无细胞裂解物；10：DhaA.E130L A5粗 裂解物；11：DhaA.E130L A5无细胞裂解物；12：DhaA.E130A A12 粗裂解物；13：DhaA.E130A A12无细胞裂解物；14：分子量标准。 箭头表示DhaA蛋白的位置。-s：离心前的裂解物；+s：离心后的裂 解物。
图27显示了含DhaA裂解物的免疫印迹分析。泳道1：DhaA.WT 粗裂解物；2：DhaA.WT无细胞裂解物；3：DhaA.H272F粗裂解物； 4：DhaA.H272F无细胞裂解物；5：载体对照粗裂解物；6：载体对 照无细胞裂解物；7：分子量标准；8：DhaA.E130Q C1粗裂解物；9： DhaA.E130Q C1无细胞裂解物；10：DhaA.E130L A5粗裂解物；11： DhaA.E130L A5无细胞裂解物；12：DhaA.E130A A12粗裂解物；13： DhaA.E130A A12无细胞裂解物；14：分子量标准。箭头表示DhaA 蛋白的位置。
图28提供了体外共价烷基-酶形成的荧光成像分析。泳道1：荧 光分子量标准；2：DhaA.WT；3：DhaA.H272F突变体；4：DhaA-(仅 作为对照的载体)；5：DhaA.E130Q突变体；6：DhaA.E130L突变体； 7：DhaA.E130A突变体。箭头指示荧光酶-烷基共价中间体的位置。
图29提供了全细胞中共价烷基-酶形成的荧光成像分析。泳道1： 荧光分子量标准；2：DhaA.WT；3：DhaA.H272F；4：DhaA-(仅作 为对照的载体)；5：DhaA.E130Q；6：DhaA.E130L；7：DhaA.E130A； 8：荧光分子量标准。箭头指示荧光酶-烷基共价中间体的位置。
图30A-B显示了链霉抗生物素蛋白(SA)包被珠上捕获的DhaA- Flag的蛋白质印迹分析。用(A)或不用(B)生物素-C10H21NO2-Cl(25 μM、0.1％DMSO、60分钟、37℃)处理瞬时表达DhaA.H272F-Flag 的CHO-K1细胞。洗去过量的生物素-C10H21N1O2-Cl，裂解细胞，将 10μl细胞裂解物与5μl SA包被珠(Pierce)于室温(RT)温育60分钟。 以SDS-PAGE分离细胞裂解物(泳道1)、未结合珠的蛋白(泳道2)和 结合珠的蛋白(泳道3)，将其转移至硝酸纤维素膜，用抗Flag抗体 (Sigma)探测。
图30C-D图示了SA包被珠上捕获的hR.Luc-DhaA的分析。用 或不用生物素-C10H21N1O2-Cl(25μM、0.1％DMSO、60分钟、37℃) 处理瞬时表达hR.Luc-连接基团-DhaA.H272F-Flag的CHO-K1细胞。 裂解细胞，将10μl细胞裂解物与5μl SA包被珠(Pierce)于室温温育 60分钟。洗去未结合的物质，使用Promega的“海肾荧光素酶测定 系统”(C)测定hR.Luc活性，或通过蛋白质印迹(D)分析捕获的 hR.Luc。C)柱1：用生物素-C10H21NO2-Cl处理细胞，洗去过量的生物 素-C10H21NO2-Cl；柱2：未处理的细胞；柱3：用生物素-C10H21NO2- Cl处理细胞，但没有洗去过量生物素-C10H21N1O2-Cl。D)以SDS-PAGE 分离细胞裂解物(泳道1)、未结合珠的蛋白(泳道2)和结合珠的蛋白(泳 道3)，将其转移至硝酸纤维素膜，用抗R.Luc抗体(Chemicon)探测。
图31A-B显示了使用体内羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl标记 筛选实验(图A)鉴别DhaA.H272F K175/C176文库的潜在改进和使用 抗FLAG固定化蛋白实验(图B)鉴别DhaA.H272F K175/C176文库的 潜在改进。图A中的箭头标识为H272F亲代(水平线)两倍高活性的 DhaA突变体。图B鉴别出具有DhaA.H272F的3-4倍高信号的DhaA 突变体。DhaA.H272F亲代和DhaA-对照(一式三份)分别位于孔12C- E和12F-H中。
图32图示了为使用羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl高通量筛选 DhaA文库而开发的MagneGSTTM测定的概要。
图33A-B显示了突变DhaA蛋白文库潜在改进(即命中结果)的鉴 别结果。显示了得自DhaA.H272F C176(图A)和DhaA.D106C K175/C176 NNK(图B)文库的代表性筛选平板。箭头指示潜在改进的 克隆。
图34A-B显示了突变DhaA蛋白文库潜在改进(即命中结果)的鉴 别结果。显示了使用基于MagneGSTTM的筛选实验筛选DhaA.H272F Y273(NNK)文库获得的两个代表性平板。箭头指示潜在改进的克隆。
图35A-B显示了在DhaA.H272F的175、176和273位的命中序 列(图A)和在DhaA.D106C的175和176位的命中序列(图B)。
图36A-B图解了相比于在第二个实验中的亲代蛋白鉴别的DhaA 命中结果的相对活性。A).使用MagneGSTTM实验和羧基四甲基罗丹 明-C10H21NO2-Cl(n＝3)再检测所示的DhaA突变体。B).使用蛋白固 定化实验和生物素-PEG4-14-Cl分析所示的DhaA突变体。
图37A-C表明了羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl对纯化的DhaA 突变体的相对标记速率。A).标记时程的SDS-PAGE和凝胶荧光成像 分析。泳道1和2：DhaA.D106 30H4；泳道3和4：H272F；泳道5 和6：DhaA.H272F ES；泳道7和8：DhaA.H272F H11；泳道9和10： DhaA.H272F A7；泳道11和12：DhaA.272F A7；泳道13和14： DhaA.H272F A7YM；泳道15和16：DhaA.H272F YL；泳道17和18： DhaA.H272F 2G7；泳道19和20，DhaA.H272F 3A7；泳道21和22， DhaA.H272F H11YL。在奇数和偶数泳道中的反应物分别于室温温育 2和30分钟。B).第一代DhaA.H272F A7以及第二代DhaA.H272F H11YL和DhaA.H272F A7YM突变体的标记时程的SDS-PAGE和凝 胶荧光成像分析。泳道1：20秒；泳道2：40秒；泳道3：1分钟； 泳道4：2分钟；泳道5：7分钟。箭头指示荧光标记的DhaA融合蛋 白的存在。C).用羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl标记DhaA的速率。 对示于图B的荧光产物定量并对时间作图。
图38A-B图示了DhaA.H272F H11YL的标记时程。A).使用羧基 四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl的纯化DhaA.H272 F H11 YL的SDS-PAGE 和凝胶荧光成像分析。标示的时间以秒计。箭头指示标记的 DhaA.H272F H11YL的位置。B).DhaA.H272F H11YL标记的速率。 对示于图A的荧光产物定量并对时间作图。
图39A-B显示了使用(A)羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl和(B) 羧基荧光素-C10H21NO2-Cl进行的DhaA突变体的荧光偏振分析。
图40显示了通过荧光偏振(FP)测定的亲代(DhaA.H272F和 DhaA.D106C)与第一代和第二代DhaA突变体的二级速率常数(M-1 秒-1)。
图41图解了使用荧光偏振进行的DhaA.H272F H11YL (“HaloTag”)对羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl的标记速率与羧基 四甲基罗丹明偶联的生物素对链霉抗生物素蛋白的标记速率的对 比。
图42图示了没有(图A和C)或有(图B和D)羧基四甲基罗丹明 偶联底物的DhaA.H272F和DhaA.H272F H11YL底物隧道的结构模 型。
图43显示了纯化的DhaA蛋白的热稳定性研究结果。A). DhaA.H272F亲代和选择的第一代DhaA突变体的分析。B).基于 DhaA.H272F的第二代DhaA突变体的分析。
图44表明了低温对DhaA.H272F H11YL反应速率的作用。在于 4℃或23℃温育后，将10μL等份的反应混合物快速加入到于95℃预 温育的等量加载SDS的染料中。获得的SDS-PAGE凝胶通过荧光成 像分析检验。
图45图解了DhaA于固相支持体上的固定化。A).DhaA.H272F 突变体和固定化生物素-氯烷烃之间的通用反应流程。B).选定的DhaA 突变体对固定化生物素-PEG-14-Cl的滴定。
图46A-B显示了在CHO-K1细胞中表达的亲代和第一代DhaA 突变体的体内标记。A).用羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl(5μM)体 内标记后的DhaA突变体的SDS-PAGE凝胶荧光成像分析。泳道1-4： DhaA.H272F；泳道5-8：DhaA.H272F A7；泳道9-12：DhaA.H272F H11；泳道13-16，DhaA.D106C。所述系列中的各个泳道代表5、15、 30和120分钟时间点。箭头指示标记DhaA的位置。B).羧基四甲基 罗丹明-C10H21NO2-Cl与DhaA突变体结合的定量。
图46C-D表明在CHO-K1细胞中表达的第一代和第二代DhaA 突变体的体内标记。C).用羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl(5μM)体 内标记后的DhaA突变体的SDS-PAGE凝胶荧光成像分析。泳道1-4： DhaA.H272F A7；泳道5-8：DhaA.H272F H11YL；泳道9-12： DhaA.D106C 30H4。所述系列中的各个泳道代表5、15、30和120 分钟时间点。D).羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl与DhaA突变体结 合的定量。
图47A-C显示了用不同浓度的羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl 标记哺乳动物细胞裂解物中的DhaA.H272F A7和DhaA.H272F H11YL。
图48A-B显示了亲代和第一代DhaA突变体的体内稳定性。A). 羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl标记的DhaA突变体的凝胶荧光成 像分析。泳道1-3：DhaA.H272F；泳道4-6：DhaA.D106C；泳道7-9， DhaA.H272F A7；泳道10-12：DhaA.H272F H11；泳道13：标准品。 泳道1、4、7和10代表转染后12小时所取的样品。泳道2、5、8 和11代表转染后24小时所取的样品。泳道3、5、9和12代表转染 后48小时所取的样品。箭头指示标记DhaA突变体的位置。B).荧光 成像凝胶的定量。
图48C-D显示了DhaA.H272突变体的体内稳定性的对比。A). 羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl标记的DhaA突变体的凝胶荧光成 像分析。泳道1-3：DhaA.H272F A7；泳道4-6：DhaA.H272F H11YL； 泳道7，标准品。泳道1和4代表转染后12小时所取的样品。泳道 2和5代表转染后24小时所取的样品。泳道3和6代表转染后48小 时所取的样品。箭头指示DhaA变体的位置。B).荧光成像凝胶的定 量。
图49显示了pHT2中的DhaA.H272 H11YL的核苷酸序列(SEQ ID NO：80)和氨基酸序列(SEQ ID NO：81)。掺入所列出的限制性位点， 以促进功能性N-和C-末端融合体的产生。
图50A-B提供了用DhaA.H272F H11YL编码载体转染、并用羧 基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl染色以及用MitoTrackerR Green FM复 染色(左图)或者用DiAc-羧基荧光素-C10H21NO2-Cl染色以及用 MitoTrackerR Orange CMTMRos复染色(右图)的活Hela细胞的荧光和 DIC图像。羧基荧光素滤光片：顶部左侧；羧基四甲基罗丹明滤光 片：顶部右侧；羧基荧光素和羧基四甲基罗丹明重叠图像：底部右 侧；细胞DIC图像：底部左侧。
图50C-D提供了用编码DhaA.H272F H11YL HT2的载体质粒 pHT2(参见图49)或携带DhaA.H272F的pCIneo转染，用0.2、1.0或 5.0μM羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl染色并用3.7％多聚甲醛固定 的活CHO-K1细胞的荧光和DIC图象。羧基四甲基罗丹明滤光片： 各个图中左侧的图象；羧基四甲基罗丹明和DIC重叠图象：各个图 中右侧的图象。
图50E-F图示了β-抑制蛋白2-DhaA.H272F H11YLHT2蛋白融合 体在HeLa细胞中的定位。显示了DiAc-羧基荧光素-C10H21NO2-Cl(E) 和羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl(F)标记细胞的显微照片。
图51A-B显示了在瞬时转染的CHO-K1细胞中表达的hRLuc- DhaA.H272F H11YLHT2融合蛋白的捕获。在链霉抗生物素蛋白包被 的96孔板(A)和链霉抗生物素蛋-MagneSphere顺磁性粒子(B)上捕 获hRLuc活性。
图52A-C显示了羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl、羧基四甲基 罗丹明-对苯乙基-Cl和羧基四甲基罗丹明-呋喃基-丙基-Cl对纯化的 DhaA.H272F H11YL的相对标记速率和产物累积。A).荧光偏振(FP) 分析。B).SDS-PAGE和凝胶荧光成像分析。C).荧光产物累积的定量。
图53A-C显示了羧基荧光素-C10H21NO2-Cl、羧基荧光素-对苯乙 基-Cl和羧基荧光素-呋喃基-丙基-Cl对纯化的DhaA.H272F H11YL的 相对标记速率和产物累积。A).荧光偏振(FP)分析。B).SDS-PAGE和 凝胶荧光成像分析。C).荧光产物累积的定量。
图54A-B表明了用不同的羧基四甲基罗丹明氯烷烃对 DhaA.H272F H11YL的体内标记。A).凝胶荧光成像分析。泳道1-3： 羧基四甲基罗丹明-14-Cl，分别为5、15和60分钟；泳道4-6：羧基 四甲基罗丹明-呋喃基-丙基-Cl，分别为5、15和60分钟；泳道7-9， 羧基四甲基罗丹明-对苯乙基-Cl，分别为5、15和60分钟。B).使用 1、5和20μM底物的DhaA.H11Y273L体内标记速率定量。
图55A-B表明了固定化DhaA.H272F H11YL与生物素偶联的氯 烷烃底物的反应性。A).通用反应和检测流程。B).生物素-PEG4-14-Cl、 生物素-14-Cl和生物素-对苯乙基-14-Cl与固定化DhaA.H272F H11Y273L蛋白的反应性。
图56显示了具有环状结构的示例性底物。
图57图解了本发明的水解酶底物和本发明的突变水解酶在目标 蛋白固定化和捕捉方面的应用。
图58是本发明水解酶底物和本发明的突变水解酶用于免疫沉淀 的示意图。
图59A-B图解了本发明的水解酶底物和本发明的突变水解酶检 测cAMP的应用。
图60A是细胞型蛋白酶检测系统的示意图。
图60B是细胞型蛋白酶检测系统的示意图。
图60C是应用短寿命报告分子检测目标蛋白酶的示意图。
发明详述
定义
“亲核体”是提供电子的分子。
“选择标记蛋白”所编码的酶活性赋予细胞在缺乏在其它情况 下作为必需营养素之物质的培养基中生长的能力(例如酵母细胞中的 TRP1基因)，或在具有抗生素或其它药物的培养基中生长的能力，即 在细胞中表达选择标记蛋白编码基因相比于对应的无该基因的细 胞，赋予该细胞对抗生素或药物的抗性。当宿主细胞必须表达选择 标记以在选择性培养基中生长时，所述标记称为正选择标记(例如赋 予在适当抗生素存在下生长能力的抗生素抗性基因)。选择标记还可 用于反选含特定基因(例如sacB基因，如果其表达，将杀死在含5％ 蔗糖的培养基中生长的细菌宿主细胞)的宿主细胞；以此方式应用的 选择标记称为负选择标记或反选择标记。常用的选择标记基因序列 包括抗生素抗性序列，所述抗生素例如为氨苄青霉素、四环素、卡 那霉素、嘌呤霉素、博来霉素、链霉素、潮霉素、新霉素、ZeocinTM 等。选择性营养缺陷型基因序列包括例如在组氨醇存在下允许在无 组氨酸培养基中生长的hisD。合适的选择标记基因包括博来霉素抗 性基因、金属硫蛋白基因、潮霉素B-磷酸转移酶基因、AURI基因、 腺苷脱氨酶基因、氨基糖苷磷酸转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、 胸苷激酶基因、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因等。
本文使用的“核酸”是共价连接的核苷酸序列，其中一个核苷 酸戊糖的3′位通过磷酸二酯基团与下一个核苷酸戊糖的5′位相接， 其中核苷酸残基(碱基)以特定的顺序即核苷酸的线性顺序连接，也包 括其类似物，例如具有一个或多个修饰碱基、糖和/或磷酸骨架的类 似物。本文使用的“多核苷酸”是所含序列长度超过约100个核苷 酸的核酸。本文使用的“寡核苷酸”或“引物”是短多核苷酸或多 核苷酸的一部分。本文使用的术语“寡核苷酸”或“寡”定义为由2 个或多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的分子，优选由多于3 个、通常超过10个但少于250个、优选少于200个脱氧核糖核苷酸 或核糖核苷酸组成。所述寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合 成、DNA复制、扩增如聚合酶链式反应(PCR)、逆转录(RT)或其组合。 “引物”是指在置于启动引物延伸的条件下能够作为核酸合成起点 的寡核苷酸。选择引物以在其3′末端具有与靶序列(模板)的特定序列 大致互补的区域。为使引物延伸，引物必须互补得足以和靶杂交。 引物序列不需要反映出靶序列的确切序列。例如，可将非互补的核 苷酸片段连接至引物的5′末端，引物序列的剩余部分与靶序列大致 互补。可将非互补碱基或较长序列散布在引物中，前提是引物序列 与靶序列的互补性足够杂交，由此形成复合物用于合成引物的延伸 产物。与基因序列匹配或互补的引物可用于扩增反应、RT-PCT等。
一般认为核酸分子具有“5′-末端”和“3′-末端”，因为核酸磷 酸二酯键出现在取代单核苷酸戊糖环的5′碳和3′碳上。新键在此应 连至5′碳的多核苷酸末端为其5′末端核苷酸。新键在此应连至3′碳 的多核苷酸末端为其3′末端核苷酸。本文使用的末端核苷酸为3′-或 5′-末端终点位置的核苷酸。
一般认为DNA分子具有“5′末端”和“3′末端”，因为单核苷 酸以下述方式反应生成寡核苷酸：一个单核苷酸戊糖环的5′磷酸通 过磷酸二酯键以一个方向连接至其相邻核苷酸的3′氧。因此，如果 寡核苷酸末端的5′磷酸未连接至单核苷酸戊糖环的3′氧，则称其为 “5′末端”，同样，如果寡核苷酸末端的3′氧未连接至后一单核苷酸 戊糖环的5′磷酸，则称其为“3′末端”。
本文使用的核酸序列即使在较大的寡核苷酸或多核苷酸的内 部，也可以认为具有5′和3′末端。在线性或环状DNA分子中，离散 元件称为位于“下游”元件或3′元件的“上游”或5′。该术语反映 出转录沿着DNA链以5′至3′方式进行的事实。通常，控制所连基因 (例如可读框或编码区)转录的启动子和增强子元件一般位于编码区的 5′或上游。但是，增强子元件甚至在位于启动子元件和编码区的3′时 也可发挥其作用。转录终止和多腺苷酸化信号位于编码区的3′或下 游。
本文使用的术语“密码子”是基本遗传编码单位，由三个核苷 酸序列组成，指定待掺入多肽链的具体氨基酸或起始或终止信号。 术语“编码区”当用于结构基因时，指编码存在于mRNA分子翻译 所得新生多肽中的氨基酸的核苷酸序列。通常，编码区在5′侧以编 码起始密码子甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”为界，在3′侧以终 止密码子(例如TAA、TAG、TGA)为界。在某些情况下，已知编码 区还由核苷酸三联体“TTG”开始。
本文使用的术语“分离的和/或纯化的”是指核酸分子、多肽、 肽或蛋白的体外制备、分离和/或纯化，使其与体内物质不相结合。 因此，术语“分离的”当用于核酸时，同在“分离的寡核苷酸”或 “分离的多核苷酸”中一样，指鉴定并与在其来源中与其通常相结 合的至少一种污染物分离的核酸序列。分离的核酸以不同于其天然 存在的形式或状态存在。相反，非分离核酸(例如DNA和RNA)被发 现为其天然存在的状态。例如，给定的DNA序列(例如基因)发现于 宿主细胞染色体上接近于邻近基因的位置；RNA序列(例如编码具体 蛋白的具体mRNA序列)作为和编码多种蛋白的众多其它mRNA一 起的混合物发现于细胞中。因此，关于“包括基因组多核苷酸、cDNA 或合成起点或其某些组合的分离的核酸分子”，“分离的核酸分子” (1)与“分离的核酸分子”天然存在之处的全部或部分多核苷酸的不 相结合，(2)有效连接至天然不与其连接的多核苷酸，或(3)不以较大 序列的部分天然存在。分离的核酸分子可以单链或双链形式存在。 当核酸分子用于表达蛋白时，核酸分子至少含有义链或编码链(即核 酸可为单链)，但可同时含有义链和反义链(即核酸可为双链)。
本文使用的术语“野生型”是指具有分离自天然来源的该基因 或基因产物特征的基因或基因产物。野生型基因是最常见于群体中 的基因，因此任意命名为该基因的“野生型”。相反，术语“突变 体”是指与野生型基因或基因产物相比表现出序列和/或功能特性改 变(即改变的特征)的基因或基因产物。要注意的是，可分离出天然存 在的突变体；它们是根据与野生型基因或基因产物相比具有改变特 征的事实而被鉴别出的。
术语“重组DNA分子”是指含至少两个通常天然不一起发现的 核苷酸序列的杂种DNA序列。术语“载体”用于指DNA片段可插 入或克隆入其中、可用于将DNA区段转移入细胞中并能够在细胞中 复制的核酸分子。载体可来源于质粒、噬菌体、病毒、粘粒等。
本文使用的术语“重组载体”、“表达载体”或“构建物”是 指DNA或RNA序列，其含所需编码序列，以及在具体宿主生物中 表达有效连接的编码序列所必需的合适DNA或RNA序列。原核表 达载体包含启动子、核糖体结合位点、在宿主细胞中自主复制的复 制起点和可能的其它序列，例如任选的操纵基因序列、任选的限制 酶位点。启动子定义为指导RNA聚合酶结合DNA并启动RNA合成 的DNA序列。真核表达载体包含启动子、任选的聚腺苷酸化信号和 任选的增强子序列。
具有“编码肽、蛋白或多肽”的核苷酸序列的多核苷酸是指含 基因编码区的核酸序列或其片段，所述片段编码的基因产物与对应 的全长肽、蛋白或多肽相比具有大致相同的活性。编码区可以cDNA、 基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸可 为单链(即有义链)或双链。如果需要使转录正确启动和/或初级RNA 转录物正确加工，可将合适的控制元件如增强子/启动子、剪接点、 聚腺苷酸化信号等置于接近基因编码区的位置。或者，用于本发明 表达载体的编码区可包含内源增强子/启动子、剪接点、间插序列、 聚腺苷酸化信号等。在进一步的实施方案中，所述编码区可包含内 源和外源控制元件的组合。
术语“转录调节元件”或“转录调节序列”是指控制核酸序列 表达的某些方面的遗传元件或序列。例如，启动子是促进有效连接 的编码区转录开始的调节元件。其它的调节元件包括但不限于转录 因子结合位点、剪接信号、聚腺苷酸化信号、终止信号和增强子元 件，并包括例如在反式作用元件存在下增加或降低所连序列转录的 元件。
真核细胞中的转录控制信号包括“启动子”和“增强子”元件。 启动子和增强子由与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用的短列 DNA序列组成。已从各种真核生物来源(包括酵母、昆虫和哺乳动物 细胞基因)中分离出启动子和增强子元件。还从病毒中分离出启动子 和增强子元件，而类似的控制元件如启动子也存在于原核生物中。 具体启动子和增强子的选择取决于用于表达目标蛋白的细胞类型。 某些真核启动子和增强子具有广宿主范围，而另一些则在有限的细 胞亚类中有功能。例如，SV40早期基因增强子在许多哺乳动物物种 的众多细胞类型中非常有效，并广泛用于在哺乳动物细胞中表达蛋 白。在大范围哺乳动物细胞类型中有效的两个其它启动子/增强子元 件实例是来自人延伸因子1基因和劳斯肉瘤病毒长末端重复序列以 及人巨细胞病毒的启动子/增强子元件。
术语“启动子/增强子”表示含能够同时提供启动子和增强子功 能(即由上述的启动子元件和增强子元件提供的功能)的序列的DNA 区段。例如，逆转录病毒的长末端重复序列同时具有启动子和增强 子功能。启动子/增强子可为“内源”或“外源”或“异源”。“内 源”启动子/增强子与基因组中的给定基因天然连接。“外源”或“异 源”启动子/增强子通过遗传操作方法(即分子生物学技术)与基因并列 放置，以使该基因转录受控于所连接的启动子/增强子。
表达载体上存在“剪接信号”经常使真核宿主细胞中的重组转 录物以较高水平表达。剪接信号介导由初级RNA转录物中去除内含 子，由剪接供体和受体位点组成(Sambrook等，1989)。常用的剪接供 体和受体位点是SV40 16S RNA的剪接点。
重组DNA序列在真核细胞中的有效表达需要控制所获转录物有 效终止和聚腺苷酸化的信号表达。转录终止信号一般发现于聚腺苷 酸化信号下游，长度为数百个核苷酸。本文使用的术语“聚腺苷酸 化位点”或“聚腺苷酸化序列”表示同时控制新生RNA转录物终止 和聚腺苷酸化的DNA序列。期望重组转录物有效聚腺苷酸化，因为 没有聚腺苷酸尾的转录物不稳定且被快速降解。用于表达载体的聚 腺苷酸化信号可为“异源”或“内源”。内源聚腺苷酸化信号是天 然存在于基因组中给定基因编码区3′末端的聚腺苷酸化信号。异源 聚腺苷酸化信号是已经自一个基因分离出并定位于另一基因的3′的 聚腺苷酸化信号。常用的异源聚腺苷酸化信号是SV40聚腺苷酸化信 号。SV40聚腺苷酸化信号包含在237bp的BamHI/BclI限制性片段 中，同时控制终止和聚腺苷酸化(Sambrook等，1989)。
真核表达载体也可以含有“病毒复制子”或“病毒复制起点”。 病毒复制子是允许载体在表达合适复制因子的宿主细胞中染色体外 复制的病毒DNA序列。含SV40或多瘤病毒复制起点的载体在表达 合适病毒T抗原的细胞中复制到高拷贝数(高达104拷贝/细胞)。相反， 含牛乳头瘤病毒或EB病毒复制子的载体以低拷贝数(约100拷贝/细 胞)在染色体外复制。
术语“体外”是指人工环境和人工环境中发生的过程或反应。 体外环境包括但不限于试管和细胞裂解物。术语“原位”指细胞培 养物。术语“体内”指天然环境(例如动物或细胞)和天然环境中发生 的过程或反应。
术语“表达系统”指任何测定(例如检测)目的基因表达用的试验 或系统。分子生物学领域的技术人员应当理解，可使用各种表达系 统中的任一种。大范围的合适哺乳动物细胞可得自广泛来源(例如 American Type Culture Colletion(美国典型培养物保藏中心)，Rockland， MD)。转化或转染方法和表达载体的选择取决于选择的宿主系统。转 化或转染方法描述于例如Sambrook等，1989。表达系统包括体外基 因表达测定，在该测定中目的基因(例如报告基因)连接至调节序列， 在用抑制或诱导该基因表达的物质处理后监测基因表达。可通过任 何合适的方法检测基因表达，这些方法包括但不限于检测表达的 mRNA或蛋白(例如可检测的报告基因产物)，或者通过表达目标基因 的细胞表型的可检测变化检测基因表达。表达系统还可以包括检测 裂解事件或其它核酸或细胞变化的测定。
术语“基因”指DNA序列，其含有由该DNA序列生产多肽所 必需的编码序列和任选的控制序列。所述多肽可由全长编码序列或 任何部分编码序列编码，只要所述部分编码的基因产物和全长多肽 具有大致相同的活性。
已知核酸包含不同类型的突变。“点”突变是指在核苷酸序列 中单个碱基位置上对野生型序列的改变。突变还可以指一个或多个 碱基的插入或缺失，使核酸序列不同于参比序列，例如野生型序列。
本文使用的术语“杂交”是指互补序列退火至靶核酸上，即两 种含互补序列的核酸聚合物(多核苷酸)通过碱基配对退火的能力。术 语“退火”和“杂交”在全文中可互换使用，包括互补序列和靶核 酸之间的任何特异性、可重复的相互作用，包括仅具部分互补性的 区域结合。本发明的核酸可包含某些通常不存在于天然核酸中的碱 基，包括例如肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。核酸技术领域的技术人员可根 据经验考虑一系列变量确定双链体的稳定性，这些变量包括例如互 补序列长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对 的发生率。核酸双链体的稳定性可通过解链温度或“Tm”测量。在 具体条件下具体核酸双链体的Tm是平均一半的碱基对解离的温度。
术语“严格性”用于指进行核酸杂交的温度、离子强度和存在 其它化合物的条件。在“高严格性”条件下，核酸碱基配对仅在具 有高频率互补碱基序列的核酸片段之间发生。因此，想让互相之间 不完全互补的核酸杂交或一起退火，经常要求“中”和“低”严格 条件。本领域周知可使用众多等同条件以构成中或低严格条件。杂 交条件的选择对本领域技术人员来说一般是显而易见的，通常以杂 交目的、杂交类型(DNA-DNA或DNA-RNA)、序列之间期望的相关 性水平为指引(例如Sambrook等，1989；Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington D.C.，1985对所述方法的一 般性论述)。
已知核酸双链体的稳定性随着错配碱基数的增加而降低，此外， 降低程度的大或小取决于在杂种双链体中错配的相对位置。因此， 杂交严格性可用于最大化或最小化此类双链体的稳定性。可通过调 节杂交温度、调节杂交混合物中螺旋去稳定物质(例如甲酰胺)的百分 比以及调节漂洗溶液的温度和/或盐浓度而改变杂交严格性。对于滤 膜杂交，经常以用于杂交后漂洗的盐浓度和/或温度来确定最终的杂 交严格性。
“高严格条件”当用于指核酸杂交时，包括等同于以下的条件： 当使用的探针长度为约500个核苷酸时，在由5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4 H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调节 至7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/ml变性鲑精DNA组 成的溶液中于42℃结合或杂交，接着用含0.1×SSPE、1.0％SDS的 溶液于42℃漂洗。
“中严格条件”当用于指核酸杂交时，包括等同于以下的条件： 当使用的探针长度为约500个核苷酸时，在由5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4 H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调节 至7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/ml变性鲑精DNA组 成的溶液中于42℃结合或杂交，接着用含1.0×SSPE、1.0％SDS的 溶液于42℃漂洗。
“低严格条件”包括等同于以下的条件：当使用的探针长度为 约500个核苷酸时，在由5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O 和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调节至7.4)、0.1％SDS、5×Denhardt 试剂[50×Denhardt每500ml含有：5g Ficoll(400型，Pharmacia)、5g BSA(Fraction V；Sigma)]和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中 于42℃结合或杂交，接着用含5×SSPE、0.1％SDS的溶液于42℃漂 洗。
所述“肽”、“蛋白”和“多肽”是指任意氨基酸链，与长度 或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)无关。除非另有说明，否则所述 术语可互换使用。本发明的核酸分子编码天然(野生型)蛋白或其片段 的变异体(突变体)，所述片段与全长突变蛋白具有大致相同活性。优 选这种突变蛋白的氨基酸序列与对应野生型蛋白氨基酸序列的同一 性至少85％，优选90％，最优选95％或99％。
一般认为多肽分子具有“氨基末端”(N-末端)和“羧基末端”(C- 末端)，因为在第一个氨基酸残基的氨基骨架和第二个氨基酸残基的 骨架羧基之间存在肽键。术语“N-末端”和“C-末端”用于多肽序 列时分别指包括多肽N-末端区和C-末端区一部分的多肽区域。包括 多肽N-末端区一部分的序列包括主要来自多肽链N-末端一半的氨基 酸，但不限于这种序列。例如，N-末端序列可包括多肽序列内部部 分，包括多肽N-末端和C-末端一半的碱基。这同样也适用于C-末端 区域。N-末端和C-末端区域可以但不是必须包括分别确定多肽的最 终N-末端和C-末端的氨基酸。
术语“分离的”当用于指多肽时，同“分离的蛋白”或“分离 的多肽”一样，是指经鉴定并与在其来源中通常与其结合的至少一 种污染物分离的多肽。因此，分离的多肽(1)与天然发现的蛋白不相 结合，(2)无相同来源的其它蛋白，例如无人类蛋白；(3)由不同物种 的细胞表达；或(4)天然不存在。相反，非分离多肽(例如蛋白和酶)以 其天然存在的状态发现。术语“分离的多肽”、“分离的肽”或“分 离的蛋白”包括由cDNA或重组RNA(包括合成来源)或其某些组合 编码的多肽、肽或蛋白。
本文使用的术语“重组蛋白”或“重组多肽”指由重组DNA分 子表达的蛋白分子。相反，本文使用的术语“天然蛋白质”表示分 离自天然(例如非重组)来源的蛋白质。可使用分子生物学技术生产重 组形式的蛋白，其与天然形式的该蛋白相比具有相同特性。
本文使用的术语“融合多肽”是指含与不同蛋白(例如突变水解 酶)相连的目标蛋白(例如萤光素酶、亲和标记或靶向序列)的嵌合蛋 白。
本文使用的术语“抗体”是指具有基本上由免疫球蛋白基因或 免疫球蛋白基因片段编码的一种或多种多肽的蛋白。公认的免疫球 蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球 蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ型。重链分为γ、μ、α、δ或ε型，它 们再分别确定免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
已知基本的免疫球蛋白(抗体)结构单位包含四聚体。每种四聚体 都由两对相同的多肽链组成，每对都具有一条“轻”链(约25kD)和 一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N-末端确定了约100-110或更 多氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变 重链(VH)分别指这些轻链和重链。
抗体可作为完整的免疫球蛋白存在，或者以各种修饰形式存在， 包括例如FabFc2、Fab、Fv、Fd、(Fab′)2、仅含轻链和重链可变区的 Fv片段、含可变区和部分恒定区的Fab或(Fab′)2片段、单链抗体(例 如scFv)、CDR-移植抗体等。Fv的重链和轻链可得自相同或不同的 抗体，由此产生嵌合Fv区。抗体可以为动物(尤其是小鼠或大鼠)或 人类来源，或者可以为嵌合或人源化的。本文使用的术语“抗体”包括 这些不同形式。
本文使用的术语“细胞”、“细胞系”、“宿主细胞”可互换 使用，所有这种名称都包括这些名称的后代或潜在后代。所述“转 化细胞”指已将本发明的核酸分子导入其中(或其祖先中)的细胞。任 选可将本发明核酸分子导入合适细胞系中，以产生能够生产所述核 酸分子所编码蛋白或多肽的稳定转染细胞系。载体、细胞和构建这 些细胞系的方法在本领域众所周知。术语“转化体”或“转化细胞” 包括衍生自原始转化细胞的初级转化细胞，而不考虑传代数。所有 后代在DNA含量方面可能不完全相同，原因是有意或无意的突变。 尽管如此，具有与原始转化细胞筛选所用功能相同的功能的突变后 代还是包含在转化体定义中。
术语“同源性”是指互补程度。可以存在部分同源性或完全同源 性(即同一性)。同源性经常使用序列分析软件(例如威斯康星大学生 物技术中心遗传学计算机工作组的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computor Group.University of Wisconsin Biotechnilogy Center)，1710 University Avenue.Madison，WI 53705)测量。该软件通过对各种置换、缺失、插入和其它修饰的同源 性程度赋值，匹配相似序列。保守置换通常包括以下各组内的置换： 甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、 天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯 丙氨酸、酪氨酸。
术语“纯化的”或“纯化”指由目的组分(例如蛋白或核酸)中去除某 些杂质的任何过程的结果。样品中纯化组分的百分比因此得以增加。
本文使用的术语“有效连接”指核酸序列以下述方式连接：产 生能够控制给定基因转录和/或所需蛋白分子合成的核酸分子。该术 语还指氨基酸编码序列以下述方式连接：产生功能性(例如酶活性、 能够结合结合配偶体、能够抑制等)蛋白或多肽或其前体(例如蛋白或 多肽的前-或前原形式)。
本文鉴别的所有氨基酸残基都是天然L-构型。为与标准多肽命 名法保持一致，氨基酸残基的缩写如以下的对应表所示。
对应表
单字母     三字母     氨基酸
Y          Tyr        L-酪氨酸
G          Gly        L-甘氨酸
F          Phe        L-苯丙氨酸
M          Met        L-甲硫氨酸
A          Ala        L-丙氨酸
S          Ser        L-丝氨酸
I          Ile        L-异亮氨酸
L          Leu        L-亮氨酸
T    Thr   L-苏氨酸
V    Val   L-缬氨酸
P    Pro   L-脯氨酸
K    Lys   L-赖氨酸
H    His   L-组氨酸
Q    Gln   L-谷氨酰胺
E    Glu   L-谷氨酸
W    Trp   L-色氨酸
R    Arg   L-精氨酸
D    Asp   L-天冬氨酸
N    Asn   L-天冬酰胺
C    Cys   L-半胱氨酸
本文使用的术语“聚组氨酸序列段”或(His标签)指含2-10个组 氨酸残基的分子，例如5-10个残基的聚组氨酸序列段。聚组氨酸序 列段使得可以在固定化金属(例如镍、锌、钴或铜)螯合柱上或通过与 另一种分子(例如与His标签反应的抗体)的相互作用来亲和纯化共价 连接的分子。
本文使用的“纯”表示目标种类为主要存在种类(即以摩尔浓度 为基准，在组合物中其比任何其它单个种类都更丰富)，优选大致纯 的级分是其中目标种类占存在全部大分子种类的至少约50％(以摩尔 浓度为基准)的组合物。一般来说，“大致纯”的组合物超过组合物 中存在的全部大分子种类的约80％，更优选约85％、约90％、约95％ 和约99％以上。最优选目标种类纯化至基本同质(不能通过常规检测 方法检测出组合物中的杂质种类)，其中组合物基本上由单一大分子 种类组成。
“量子点”是超小的、明亮的、高度光稳定性的、激发谱带广 和发射谱带窄的半导体晶体，即其为荧光晶体纳颗粒。
本文使用的“上转换(upcoverting)纳颗粒”指由红外线(IR)光激 发的吸收体和在晶体晶格中的发射离子组成的纳颗粒，其将IR光转 换成可见光。
本文使用的“三重态感光剂”是基本上化学惰性的分子或基团， 其可在底物不吸收或仅微弱吸收的波长吸收光。然后“感光剂”可 释放能量，该能量导致底物或化合物中的氧原子被激发为单线态氧 状态。具有单线态氧状态氧原子的底物可破坏分子，例如其附近的 蛋白。三重态感光剂的实例包括例如曙红或孔雀绿。
用于诊断用途的放射性核素包括例如金属放射性核素(即金属放 射性同位素或金属顺磁离子)，包括锑-124、锑-125、砷-74、钡-1 03、 钡-140、铍-7、铋-206、铋-207、镉-109、镉-115m、钙-45、铈-139、 铈-141、铈-144、铯-137、铬-51、钴-55、钴-56、钴-57、钴-58、钴- 60、钴-64、铜-67、铒-169、铕-152、镓-64、镓-68、钆-153、钆-157、 金-195、金-199、铪-175、铪-175-181、钬-166、铟-110、铟-111、铱 -192、铁-55、铁-59、氪-85、铅-210、锰-54、汞-197、汞-203、钼-99、 钕-147、镎-237、镍-63、铌-95、锇-185+191、钯-103、铂-195m、 镨-143、钷-147、镤-233、镭-226、铼-186、铼-188、铷-86、钌-103、 钌-106、钪-44、钪-46、硒-75、银-110m、银-1 11、钠-22、锶-85、锶 -89、锶-90、硫-35、钽-182、锝-99m、碲-125、碲-132、铊-204、钍- 228、钍-232、铊-170、锡-113、锡-114、锡-117m、钛-44、钨-185、 钒-48、钒-49、镱-169、钇-86、钇-88、钇-90、钇-91、锌-65和锆-95。 用于造影的放射性核素包括铜(Cu)、镓(Ga)、铟(In)、铼(Rh)和锝(Tc) 的放射性同位素，包括同位素64Cu、67Cu、111In、99mTc、67Ga或68Ga。 用于X射线造影剂的金属包括Re、Sm、Ho、Lu、Yt、Pm、Bi、Pd、 Gd、La、Au、Yb、Dy、Cu、Rh、Ag和Ir的放射性同位素。
“蛋白去稳定序列”或“蛋白去稳定结构域”包括一个或多个 氨基酸残基，当其存在于蛋白的N末端或C末端时，相比于没有蛋 白去稳定序列或结构域的对应蛋白，其将所连接蛋白的半寿期降低 或减少至少80％，优选至少90％，更优选至少95％或更多，例如99％。 蛋白去稳定序列包括但不限于：PEST序列，例如得自细胞周期蛋白(例 如有丝分裂细胞周期蛋白)、尿嘧啶透性酶或ODC的PEST序列；得 自以下物质的C末端区的序列：短寿命蛋白如ODC；早期响应蛋白 例如细胞因子、淋巴因子、原癌基因如c-myc或c-fos、MyoD；HMG CoA还原酶；S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶；CL序列；细胞周期蛋白破坏 作用框(destruction box)；N降解决定子(N-degron)或在体内遍在化的 蛋白或其片段。
“目标蛋白”包括但不限于选择标记蛋白、膜蛋白、胞质蛋白、 核内蛋白、结构蛋白、酶、酶底物、受体蛋白、转运蛋白、转录因 子、通道蛋白、磷-蛋白、激酶、信号蛋白、代谢蛋白、线粒体蛋白、 受体相关蛋白、核酸结合蛋白、胞外基质蛋白、分泌蛋白、受体配 体、血清蛋白、免疫原性蛋白、荧光蛋白或具有反应性半胱氨酸的 蛋白。例如，目标蛋白可将突变水解酶靶向细胞膜或内质网，例如 目标蛋白是整联蛋白或其结构域，在一个实施方案中，突变水解酶 融合至将突变水解酶靶向内质网的序列和融合至糖基磷脂酰肌醇(GPI) 信号序列。
I.突变水解酶及其融合体
本发明范围内的突变水解酶包括但不限于经重组技术(例如定点 诱变或循环诱变(rcursive mutagenesis))制备的突变水解酶，其包含一 个或多个使突变水解酶能够与对应非突变(野生型)水解酶的底物(例 如经修饰含一个或多个官能团的底物)形成稳定(例如共价)键(该键比 对应野生型水解酶和底物形成的键更稳定)的氨基酸置换。本发明范 围内的水解酶包括但不限于肽酶、酯酶(例如胆固醇酯酶)、糖苷酶(例 如葡糖淀粉酶(glucosamylase))、磷酸酶(例如碱性磷酸酶)等。例如， 水解酶包括但不限于作用于酯键的酶，如羧酸酯水解酶、硫酯水解 酶、磷酸单酯水解酶、磷酸二酯水解酶、三磷酸单酯水解酶、硫酸 酯水解酶、二磷酸单酯水解酶、磷酸三酯水解酶、产生5′-磷酸单酯 的外切脱氧核糖核酸酶、产生5′-磷酸单酯的外切核糖核酸酶、产生 3′-磷酸单酯的外切核糖核酸酶、作用于核糖核酸或脱氧核糖核酸的 外切核酸酶、产生5′-磷酸单酯的内切脱氧核糖核酸酶、产生非5′-磷 酸单酯的内切脱氧核糖核酸酶、对改变碱基特异性的位点特异性内 切脱氧核糖核酸酶、产生5′-磷酸单酯的内切核糖核酸酶、产生非5′- 磷酸单酯的内切核糖核酸酶、作用于核糖核酸或脱氧核糖核酸的内 切核糖核酸酶、作用于核糖核酸或脱氧核糖核酸糖基化酶的内切核 糖核酸酶；糖苷酶，例如水解O-和S-糖基以及水解N-糖基化合物的 酶；作用于醚键的酶如三烷基锍水解酶或醚水解酶；作用于肽键的 酶(肽水解酶)，如氨肽酶、二肽酶、二肽基肽酶和三肽基肽酶、肽基 二肽酶、丝氨酸型羧肽酶、金属羧肽酶、半胱氨酸型羧肽酶、ω肽酶、 丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、天冬氨酸内肽酶、金属内肽酶、 苏氨酸内肽酶和催化机制未知的内肽酶；作用于肽键以外的碳-氮键 (例如线性酰胺、环酰胺、线性脒、环脒、腈或其它化合物中的碳-氮 键)的酶；作用于酸酐(如含磷酐和含磺酰酐中的酸酐)的酶；作用于 酸酐的酶(催化跨膜移动)；作用于酸酐或参与细胞和亚细胞移动的 酶；作用于碳-碳键(例如酮物质中的碳-碳键)的酶；作用于卤化物键(例 如C-卤化合物中的卤化物键)的酶；作用于磷-氮键的酶；作用于硫- 氮键的酶；作用于碳-磷键的酶；以及作用于硫-硫键的酶。作用于卤 化物键的示例性水解酶包括但不限于卤烷酶、2-卤代酸脱卤素酶、卤 乙酸脱卤素酶、甲状腺素脱碘酶、卤代烷脱卤素酶、4-氯苯甲酸脱卤 素酶、4-氯苯甲酰-辅酶A脱卤素酶和莠去津氯水解酶。作用于环酰 胺中碳-氮键的典型水解酶包括但不限于巴比妥酸酶、二氢嘧啶酶、 二氢乳清酸酶、羧甲基乙内酰脲酶、尿囊素酶、β-内酰胺酶、咪唑啉 酮丙酸酶、5-氧代脯氨酸酶(ATP-水解)、肌酸酐酶、L-赖氨酸-内酰 胺酶、6-氨基己酸-环-二聚体水解酶、2，5-二氧代哌嗪水解酶、N-甲 基乙内酰脲酶(ATP-水解)、氰尿酸氨基水解酶、顺丁烯二酰亚胺水解 酶。本文使用的“β-内酰胺酶”包括A类、B类、C类和D类β-内 酰胺酶，以及D-丙氨酸羧肽酶/转肽酶、酯酶EstB、青霉素结合蛋白 2X、青霉素结合蛋白5和D-氨基酸肽酶。所述β-内酰胺酶优选为丝 氨酸β-内酰胺酶，例如在对应于金黄色葡萄球菌(S.aureus)PC1丝氨 酸β-内酰胺酶残基70的位置上具有催化性丝氨酸残基、在对应于金 黄色葡萄球菌(S.aureus)PC1丝氨酸β-内酰胺酶残基166的位置上具 有谷氨酸残基、任选在对应于金黄色葡萄球菌(S.aureus)PC1 β-内酰 胺酶残基73的位置上具有赖氨酸残基以及还任选在对应于金黄色葡 萄球菌(S.aureus)PC1 β-内酰胺酶残基234的位置上具有赖氨酸残基 的丝氨酸β-内酰胺酶。
在一个实施方案中，本发明的突变水解酶在野生型水解酶中与 水分子活化相关的残基处包含至少一个氨基酸置换，所述残基例如 为在催化三联体或辅助残基中的残基，其中活化的水分子裂解在野 生型水解酶的催化残基和该水解酶底物之间形成的键。本文使用的 “辅助残基”是改变另一个残基活性的残基，例如其增强活化水分 子的残基的活性。属于本发明范围的活化水的残基包括但不限于参 与酸碱催化作用的残基，例如组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。在另一 个实施方案中，本发明的突变水解酶包含至少一个在野生型水解酶 中通过对水解酶底物的亲核攻击而形成酯中间体的残基处的氨基酸 置换。用于本发明突变水解酶的底物是突变水解酶特异性结合的底 物，其优选与突变水解酶的氨基酸如活性残基形成一种键，该键比 所述底物和对应的野生型水解之酶氨基酸形成的键更稳定。尽管突 变水解酶特异性地结合可被对应野生型水解酶特异性结合的底物， 但在对应的野生型水解酶和底物反应形成产物的条件下，突变水解 酶和底物相互作用没有形成产物或所形成产物大为降低，例如为1/2、 1/10、1/100或1/1000。突变水解酶未形成产物或形成的产物量减少 的原因是突变水解酶中至少有一个置换，该置换导致突变水解酶与 底物形成的键比对应的野生型水解酶和底物形成的键更稳定。在对 应的野生型水解酶形成产物的条件下，突变水解酶和本发明底物所 形成键的半寿期(即t1/2)优选是对应的野生型水解酶和该底物所形成 键的t1/2的至少2倍，更优选至少4倍或甚至10倍，直到100、1000 或10,000倍或更高。优选突变水解酶和底物形成的键其t1/2为至少30 分钟，优选至少4小时，直到至少10小时，并抗清洗、蛋白变性剂 和/或高温的破坏，例如该键对在SDS中煮沸稳定。
在又一个实施方案中，本发明的突变水解酶包含至少两个氨基 酸置换，一个置换位于野生型水解酶中与水分子活化有关的残基处， 或位于野生型水解酶中通过对水解酶底物的亲核攻击而形成酯中间 体的残基处，另一个置换位于野生型水解酶中处于或邻近水解酶底 物结合位点的残基处，例如在结合野生型水解酶的水解酶底物的3-5 内的残基处，但不在对应野生型水解酶中与水分子活化有关的残基 处或与底物形成酯中间体的残基处。在一个实施方案中，第二个置 换位于野生型水解酶中嵌入供底物进入水解酶催化袋的位点的残基 处，例如，所述残基位于活性位点空穴内并在结合野生型水解酶的 水解酶底物的3-5内，例如位于底物隧道中的并不是对应野生型水 解酶中与水分子活化有关之残基或与底物形成酯中间体之残基的残 基，。其他的置换优选增加所述突变体与对应野生型水解酶底物形 成稳定共价键的速率。在一个实施方案中，一个置换位于野生型水 解酶中活化水分子的残基处，例如组氨酸残基，以及在对应于紫红 红球菌(Rhodococcus rhodochrous)脱卤素酶的氨基酸残基272的位置 上，例如在对应于氨基酸残基272的位置上的置换后氨基酸为苯丙 氨酸或甘氨酸。在另一个实施方案中，一个置换位于野生型水解酶 中与底物形成酯中间体的残基处，例如天冬氨酸残基，以及在对应 于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)脱卤素酶的氨基酸残基106 的位置上。在一个实施方案中，第二个置换位于对应于紫红红球菌 (Rhodococcus rhodochrous)脱卤素酶的175、176或273位的氨基酸残 基处，例如在对应于氨基酸残基175位置上的置换后氨基酸为甲硫 氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸或 半胱氨酸，在对应于氨基酸残基176位置上的置换后氨基酸为丝氨 酸、甘氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸或精氨酸，和/ 或在对应于氨基酸残基273位置上的置换后氨基酸为亮氨酸、甲硫 氨酸或半胱氨酸。在又一个实施方案中，突变水解酶进一步包含第 三个和任选的第四个置换，其位于野生型水解酶中处于活性位点空 穴中并在结合野生型水解酶的水解酶底物的3-5内的氨基酸残基 处，例如第三个置换在对应于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous) 脱卤素酶的氨基酸残基175、176或273的位置上，第四个置换在对 应于紫红红球菌Rhodococcus rhodochrous)脱卤素酶的氨基酸残基 175、176或273的位置上。突变水解酶可包含其它置换，例如导入 以促进对应基因或其部分克隆的置换，和/或包括位于或邻近N-和/或 C-末端的其他残基，例如导入以促进对应基因或其部分克隆但不必 具有活性(例如不可单独检测)的其他残基。
例如，野生型脱卤素酶DhaA裂解卤代烃(卤代C3-卤代C10)中的 碳-卤键。DhaA的催化中心是典型的催化三联体，包含亲核残基、 酸性残基和组氨酸残基。三联体中的氨基酸位于DhaA催化袋(长约 10，横截面约202)内的深部。DhaA卤化底物中的卤素原子，例 如Cl-烷烃底物中的氯原子，位于DhaA催化中心附近。DhaA结合 底物，可能形成ES复合物，DhaA的Asp106(编号基于DhaA的蛋 白序列)亲核攻击底物而形成酯中间体(图1A-B)。DhaA的His272随 后活化水，活化的水水解中间体，由催化中心释放出产物。如本文 所述，突变DhaA，例如可能保留野生型DhaA(DhaA.WT)三维结构(根 据计算机建模研究)和基本物理化学特征的DhaA.H272F突变体，不 能水解野生型酶的一种或多种底物，例如就Cl-烷烃而言，不能释放 出野生型酶释放的对应醇。如本文进一步描述，突变丝氨酸β-内酰胺 酶，例如BlaZ.E166D突变体、BlaZ.N170Q突变体和 BlaZ.E166D:N170Q突变体，不能水解野生型丝氨酸β-内酰胺酶的一 种或多种底物。
因此，在本发明的一个实施方案中，突变水解酶是含有至少一 个氨基酸置换的突变脱卤素酶，所述置换位于野生型脱卤素酶中与 活化水分子相关的残基上，例如催化三联体中的残基或辅助残基， 其中所述活化的水分子裂解野生型脱卤素酶中催化残基与脱卤素酶 底物形成的键。在一个实施方案中，至少一个置换所在的残基对应 于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA的残基272。“对应 残基”是指在一种野生型蛋白中相对参比野生型蛋白具有相同活性(功 能)的残基，在对这两种蛋白的一级序列比对时任选在相同的相对位 置。例如，在一种酶中构成催化三联体的部分并活化水分子的残基 可能是该酶的残基272，此残基272对应于另一种酶的残基73，其 中残基73构成催化三联体的部分并活化水分子。因此，在一个实施 方案中，本发明的突变脱卤素酶在对应于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA残基272的位置具有非组氨酸的残基，例如苯丙 氨酸残基。在本发明的另一个实施方案中，突变水解酶为在对应于 紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA残基106的残基中含至 少一个氨基酸置换的突变脱卤素酶，例如置换为非天冬氨酸的残基。 例如，本发明的突变脱卤素酶在对应于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA残基106的位置具有半胱氨酸或谷氨酸残基。在 再一个实施方案中，突变水解酶为含至少两个氨基酸置换的突变脱 卤素酶，一个置换位于对应于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous) DhaA残基106的残基处，一个置换位于对应于紫红红球菌 (Rhodococcus rhodochrous)DhaA残基272的残基处。在一个实施方 案中，突变水解酶为含至少两个氨基酸置换的突变脱卤素酶，一个 置换位于对应于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA残基272 的残基处，另一个置换位于对应于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA残基175、176、245和/或273的残基处。在又一 个实施方案中，突变水解酶为突变丝氨酸β-内酰胺酶，其在对应于金 黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)PC1的丝氨酸β内酰胺酶残基 166或残基170的残基中含至少一个氨基酸置换。
在一个实施方案中，所述突变水解酶为卤代烷脱卤素酶，例如 发现于利用卤代烷的革兰氏阴性(Keuning等，1985)和革兰氏阳性 (Keuning等，1985；Yokota等，1987；Scholtz等，1987；Sallis等，1990) 细菌中的卤代烷脱卤素酶。卤代烷脱卤素酶，包括自养黄色杆菌 (Xanthobacter autotrophicus)GJ10的DhlA(Janssen等，1988，1989)、 紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA和少动鞘氨醇单胞菌 (Spingomonas paucimobilis)UT26的LinB(Nagata等，1997)，是催化 对应的烃水解脱卤素化的酶。经历转化的卤化脂肪烃包括C2-C10饱 和脂肪烃，它们具有一个或多个连接的卤素基团，其中至少两个卤 素在相邻碳原子上。这种脂肪烃包括挥发性氯化脂肪(VCA)烃。VCA 烃包括例如二氯乙烷、1，2-二氯丙烷、1，2-二氯丁烷和1，2，3-三氯丙烷 等脂肪烃。本文使用的术语“卤化烃”是指卤化脂肪烃。本文使用 的术语“卤素”包括氯、溴、碘、氟、砹等。优选的卤素是氯。
在一个实施方案中，突变水解酶是热稳定水解酶，例如在对应 于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)脱卤素酶的氨基酸残基117 和/或175的位置含至少一个置换的热稳定水解酶，所述置换与增强 热稳定性有关联。在一个实施方案中，热稳定水解酶能够于低温(例 如0℃至约25℃)结合水解酶底物。在一个实施方案中，热稳定水解 酶是热稳定突变水解酶，即除了在对应于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)脱卤素酶的氨基酸残基117和/或175位置的置换之外还 具有一个或多个置换的热稳定突变水解酶。在一个实施方案中，热 稳定突变水解酶具有导致带电残基(例如赖氨酸)被去除的置换。在一 个实施方案中，热稳定突变水解酶在对应于紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)DhaA的残基117和/或175位置具有丝氨酸或甲硫氨 酸。
本发明还提供含突变水解酶和目标蛋白或肽的氨基酸序列的融 合蛋白，所述氨基酸序列例如为以下蛋白的序列：标记蛋白(例如选 择标记蛋白)、亲和标记物(例如聚组氨酸序列)、目标酶(例如萤光素 酶、RNA酶蛋白抑制剂、RNA酶和/或GFP)核酸结合蛋白、胞外 基质蛋白、分泌性蛋白、抗体或其部分(例如Fc)、生物发光蛋白、受 体配体、调节蛋白、血清蛋白、免疫原性蛋白、荧光蛋白、具有活 性半胱氨酸的蛋白、受体蛋白(如NMDA受体)、通道蛋白(例如离子 通道蛋白，如钠、钾或钙敏性通道蛋白，包括HERG通道蛋白)、膜 蛋白、胞质蛋白、核内蛋白、结构蛋白、磷蛋白、激酶、信号蛋白、 代谢蛋白、线粒体蛋白、受体相关蛋白、荧光蛋白、酶底物(例如蛋 白酶底物)、转录因子、蛋白去稳定序列或转运蛋白(如EAAT1-4谷 氨酸转运蛋白)，以及将突变水解酶导向特定位置的靶向信号(如质体 靶向信号(例如线粒体定位序列)、核定位信号或肉豆蔻酸化序列)。
融合蛋白可由编码突变水解酶和至少一种目标蛋白的重组DNA 表达，或通过化学合成形成。目标蛋白可融合至突变水解酶的N-末 端或C-末端。在一个实施方案中，所述融合蛋白在突变水解酶的N- 末端包含目标蛋白，而在突变水解酶的C-末端包含另一种蛋白，例 如不同的蛋白。例如，目标蛋白可为荧光蛋白或抗体。任选地，融 合体中的蛋白以连接序列分隔，所述连接序列例如优选具有至少2 个氨基酸残基，例如具有13-17个氨基酸残基。相比于各个体蛋白的 功能，在本发明融合蛋白中存在连接序列基本不改变融合体中任一 个蛋白的功能。因此，对于突变脱卤素酶和海肾萤光素酶的融合体 而言，存在连接序列基本不改变突变脱卤素酶及其底物之间所形成 键的稳定性或萤光素酶活性。对于融合体中任意的具体蛋白组合， 可使用各种各样的连接序列。在一个实施方案中，所述连接序列为 酶识别的序列，例如可裂解序列。例如，连接序列可为胱天蛋白酶 识别的序列，例如DEVD(SEQ ID NO：17)，或者为可光裂解序列。
在一个实施方案中，所述融合蛋白可在突变水解酶的N末端包 含目标蛋白，并任选地可在突变水解酶的C末端包含不同的目标蛋 白。如本文所述，突变DhaA与GST(在N末端)、Flag序列(在C末 端)和海肾萤光素酶(在N末端或C末端)的融合体对突变DhaA和具 官能团的野生型DhaA底物之间形成的键没有可检测的作用。而且， Flag序列和DhaA.H272F的融合体能够经链霉抗生物素蛋白-生物素- C10H21N1O2-Cl-DhaA.H272F桥连接至固相支持体(SFlag-ELISA实 验)。
在一个实施方案中，融合蛋白包含突变水解酶和与膜或其部分 连接的蛋白，例如靶向蛋白(如用于内质网靶向的蛋白)、细胞膜结合 蛋白(例如整联蛋白)或其结构域(例如整联蛋白的胞质结构域、跨膜 结构域和/或胞外茎结构域)和/或将突变水解酶连接至细胞表面的蛋白 (例如糖基磷脂酰肌醇信号序列)。
II.优化的水解酶序列，以及编码该水解酶的载体和宿主细胞
本发明还提供含编码水解酶或其融合体的核酸序列的分离的核 酸分子(多核苷酸)。在一个实施方案中，所述分离的核酸分子包含为 在至少一种选定宿主中表达而优化的核酸序列。优化序列包括密码 子优化(即在一种生物中比在另一种生物(例如远缘生物)中更经常使 用的密码子)的序列，以及用以加入或修饰Kozak序列和/或内含子和 /或去除不需要的序列(例如潜在的转录因子结合位点)的修饰。在一个 实施方案中，所述多核苷酸包括编码脱卤素酶的核酸序列，该核酸 序列为在选定宿主细胞中表达进行了优化。在一个实施方案中，优 化多核苷酸不再与对应的非优化序列杂交，例如在中等或高严格条 件下不与非优化序列杂交。在另一个实施方案中，所述多核苷酸与 对应的非优化序列的核酸序列同一性低于90％，例如低于80％，任 选其编码多肽与非优化序列所编码多肽的氨基酸序列同一性至少为 80％，例如至少85％、90％或更高。本发明还提供包含所述分离核酸 分子的构建物(例如表达盒)和载体以及含所述分离的核酸分子、构建 物或载体的试剂盒。
任选优化含具有水解酶的融合体之编码核酸序列的核酸分子， 以在特定宿主细胞中表达，还任选与转录调节序列(例如一个或多个 增强子、启动子、转录终止序列或其组合)有效连接，以形成表达盒。
在一个实施方案中，通过用在具体(选定)细胞中优先使用的密码 子替换野生型或突变水解酶序列中的密码子，优化编码水解酶或其 融合体的核酸序列。优选的密码子在选定细胞中具有较高密码子使 用频率，优选其导入导致导入较少的在选定宿主细胞中存在的转录 因子的转录因子结合位点以及较少的其他不需要的结构特征。因此， 优化的核酸产物由于提高了密码子使用频率而使表达水平提高，并 由于不需要的转录调节序列数量下降而降低了不适宜转录行为的风 险。
本发明分离和优化核酸分子的密码子组成与对应野生型核酸序 列的密码子组成可有超过30％、35％、40％或超过45％如50％、55％、 60％或以上的密码子差异。用于本发明的优选密码子是在具体生物中 比相同氨基酸的至少一种其它密码子更经常使用的密码子，更优选 在该生物和用于克隆或筛选核酸分子表达的生物中也不是使用低的 密码子。而且，某些氨基酸(即具有三个以上密码子的氨基酸)的优选 密码子可包括比其它(非优选)密码子更经常使用的两个或更多密码 子。所述核酸分子中存在在一种生物中比在另一种生物中更经常使 用的密码子，可导致核酸分子在导入更经常使用这些密码子的生物 细胞时，其在这些细胞中的表达水平比这些细胞中野生型或亲代核 酸序列的表达水平高。
在本发明的一个实施方案中，不同的密码子是在哺乳动物中更 经常使用的密码子，而在另一个实施方案中，不同的密码子是在植 物中更经常使用的密码子。不同生物的优选密码子是本领域已知的， 参见例如www.kazusa.or.jp./codon/。具体类型的哺乳动物，例如人， 可具有不同于另一类型哺乳动物的优选密码子组。同样，具体类型 的植物可具有不同于另一类型植物的优选密码子组。在本发明的一 个实施方案中，大部分不同的密码子是所需宿主细胞中优选的密码 子。包括哺乳动物(例如人)和植物在内的生物的优选密码子是本领域 已知的(例如Wada等，1990；Ausubel等，1997)。例如，优选的人密 码子包括但不限于CGC(Arg)、CTG(Leu)、TCT(Ser)、AGC(Ser)、 ACC(Thr)、CCA(Pro)、CCT(Pro)、GCC(Ala)、GGC(Gly)、GTG(Val)、 ATC(Ile)、ATT(Ile)、AAG(Lys)、AAC(Asn)、CAG(Gln)、CAC(His)、 GAG(Glu)、GAC(Asp)、TAC(Tyr)、TGC(Cys)和TTC(Phe)(Wada 等，1990)。因此，在一个实施方案中，本发明合成核酸分子由于具有 增加数量的优选人密码子如CGC、CTG、TCT、AGC、ACC、CCA、 CCT、GCC、GGC、GTG、ATC、ATT、AAG、AAC、CAG、CAC、 GAG、GAC、TAC、TGC、TTC或其任意组合，而具有不同于野生 型核酸序列的密码子组成。例如，相对于野生型核酸序列而言，本 发明的核酸分子可具有增加数量的CTG或TTG亮氨酸编码密码子、 GTG或GTC缬氨酸编码密码子、GGC或GGT甘氨酸编码密码子、 ATC或ATT异亮氨酸编码密码子、CCA或CCT脯氨酸编码密码子、 CGC或CGT精氨酸编码密码子、AGC或TCT丝氨酸编码密码子、 ACC或ACT苏氨酸编码密码子、GCC或GCT丙氨酸编码密码子， 或其任意组合。在另一个实施方案中，优选的秀丽隐杆线虫(C.elegans) 密码子包括但不限于UUC(Phe)、UUU(Phe)、CUU(Leu)、UUG(Leu)、 AUU(Ile)、GUU(Val)、GUG(Val)、UCA(Ser)、UCU(Ser)、CCA(Pro)、 ACA(Thr)、ACU(Thr)、GCU(Ala)、GCA(Ala)、UAU(Tyr)、CAU (His)、CAA(Gln)、AAU(Asn)、AAA(Lys)、GAU(Asp)、GAA(Glu)、 UGU(Cys)、AGA(Arg)、CGA(Arg)、CGU(Arg)、GGA(Gly)，或 其任意组合。在又一个实施方案中，优选的果蝇(Drosophilia)密码子 包括但不限于UUC(Phe)、CUG(Leu)、CUC(Leu)、AUC(Ile)、AUU (Ile)、GUG(Val)、GUC(Val)、AGC(Ser)、UCC(Ser)、CCC(Pro)、 CCG(Pro)、ACC(Thr)、ACG(Thr)、GCC(Ala)、GCU(Ala)、UAC (Tyr)、CAC(His)、CAG(Gln)、AAC(Asn)、AAG(Lys)、GAU(Asp)、 GAG(Glu)、UGC(Cys)、CGC(Arg)、GGC(Gly)、GGA(gly)，或其 任意组合。优选的酵母密码子包括但不限于UUU(Phe)、UUG(Leu)、 UUA(Leu)、CCU(Leu)、AUU(Ile)、GUU(Val)、UCU(Ser)、UCA (Ser)、CCA(Pro)、CCU(Pro)、ACU(Thr)、ACA(Thr)、GCU(Ala)、 GCA(Ala)、UAU(Tyr)、UAC(Tyr)、CAU(His)、CAA(Gln)、AAU (Asn)、AAC(Asn)、AAA(Lys)、AAG(Lys)、GAU(Asp)、GAA(Glu)、 GAG(Glu)、UGU(Cys)、CGU(Trp)、AGA(Arg)、CGU(Arg)、GGU (Gly)、GGA(Gly)，或其任意组合。同样，具有增加数量的在植物中 更经常使用的密码子的核酸分子，由于具有增加数量的植物密码子， 而具有与野生型或亲代核酸序列不同的密码子组成，所述植物密码 子包括但不限于CGC(Arg)、CTT(Leu)、TCT(Ser)、TCC(Ser)、ACC (Thr)、CCA(Pro)、CCT(Pro)、GCT(Ser)、GGA(Gly)、GTG(Val)、 ATC(Ile)、ATT(Ile)、AAG(Lys)、AAC(Asn)、CAA(Gln)、CAC(His)、 GAG(Glu)、GAC(Asp)、TAC(Tyr)、TGC(Cys)、TTC(Phe)，或其 任意组合(Murray等，1989)。不同类型植物的优选密码子可以不同 (Wada等，1990)。
在一个实施方案中，编码水解酶或其融合体的优化核酸序列与 编码对应水解酶或其融合体的非优化核酸序列的核酸序列同一性低 于100％，例如低于90％或低于80％。例如，编码DhaA的优化核酸 序列与编码对应DhaA的非优化(野生型)核酸序列的核酸序列同一性 低于约80％，由优化核酸序列编码的DhaA与对应野生型DhaA的氨 基酸序列同一性任选至少为85％。在一个实施方案中，由优化核酸 序列编码的DhaA的活性是非优化序列编码的DhaA活性的至少 10％，例如50％或更高，例如，由优化核酸序列编码的突变DhaA结 合底物的效力与由非优化核酸序列编码的突变DhaA结合相同底物的 效力大致相同，即至少50％、80％、100％或更高。
示例性的优化DhaA基因具有以下序列：
hDhaA.v2.1-6F(FINAL，具有侧翼序列)
NNNNGCTAGCCAGCTGGCgcgGATATCGCCACCATGGGATCCGAGATT
GGGACAGGGTTcCCTTTTGATCCTCAcTATGTtGAaGTGCTGGGgGAaAG
AATGCAcTAcGTGGATGTGGGGCCTAGAGATGGGACcCCaGTGCTGTTc
CTcCAcGGGAAcCCTACATCTagcTAcCTGTGGAGaAAtATTATaCCTCAT
GTtGCTCCTagtCATAGgTGcATTGCTCCTGATCTGATcGGGATGGGGAA
GTCTGATAAGCCTGActtaGAcTAcTTTTTTGATGAtCATGTtcGATActTGG
ATGCTTTcATTGAGGCTCTGGGGCTGGAGGAGGTGGTGCTGGTGATaC
AcGAcTGGGGGTCTGCTCTGGGGTTTCAcTGGGCTAAaAGgAATCCgGA
GAGAGTGAAGGGGATTGCTTGcATGGAgTTTATTcGACCTATTCCTACt
TGGGAtGAaTGGCCaGAGTTTGCcAGAGAGACATTTCAaGCcTTTAGAA
CtGCcGATGTGGGcAGgGAGCTGATTATaGAcCAGAATGCTTTcATcGAG
GGGGCTCTGCCTAAaTGTGTaGTcAGACCTCTcACtGAaGTaGAGATGGA
cCATTATAGAGAGCCcTTTCTGAAGCCTGTGGATcGcGAGCCTCTGTGG
AGgTTtCCaAATGAGCTGCCTATTGCTGGGGAGCCTGCTAATATTGTGG
CTCTGGTGGAaGCcTATATGAAcTGGCTGCATCAGagTCCaGTGCCcAAG
CTaCTcTTTTGGGGGACtCCgGGaGTtCTGATTCCTCCTGCcGAGGCTGCT
AGACTGGCTGAaTCcCTGCCcAAtTGTAAGACcGTGGAcATcGGcCCtGGg
CTGTTTTAcCTcCAaGAGGAcAAcCCTGATCTcATcGGGTCTGAGATcGCa
cGgTGGCTGCCCGGGCTGGCCGGCTAATAGTTAATTAAGTAgGCGGCC
GCNNNN(SEQ ID NO：50)
可将所述核酸分子或表达盒导入任选包含选择标记基因的载体 中，例如质粒或病毒载体，并将载体导入目的细胞中，例如原核细 胞，如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces spp.)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)、 葡萄球菌(Staphylococcus spp.)等，以及真核细胞，包括植物(双子叶 或单子叶植物)、真菌、酵母(如毕赤酵母属(pichia)、酵母属 (Saccharomyces)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces))或哺乳动物细 胞。优选的哺乳动物细胞包括牛、山羊、绵羊、犬、猫、非人灵长 类如猿以及人细胞。优选的哺乳动物细胞系包括但不限于CHO、 COS、293、Hela、CV-1、SH-SY5Y(人成神经细胞瘤细胞)、HEK293 和NIH3T3细胞。
可通过任何能够在原核细胞或真核细胞中表达的启动子控制所 编码突变水解酶的表达。优选的原核启动子包括但不限于SP6、T7、 T5、tac、bla、trp、gal、lac或麦芽糖启动子。优选的真核启动子包 括但不限于组成型启动子，例如病毒启动子如CMV、SV40和RSV 启动子，以及可调节启动子，例如可诱导或可抑制的启动子，如tet 启动子、hsp70启动子和CRE调节的合成启动子。优选的细菌表达 载体包括pGEX-5X-3，优选的真核表达载体包括pCIneo-CMV。
本发明的核酸分子、表达盒和/或载体可通过任何方法导入细胞 中，所述方法包括但不限于钙介导转化、电穿孔、微注射、脂转染、 粒子轰击等。
III.官能团
用于本发明底物和方法的官能团是可检测或能够检测的分子。 本发明范围内的官能团能够共价连接至双功能连接基团或水解酶底 物的一个活性取代基，并且作为本发明底物的一部分，与未连接至 天然底物的官能团具有大致相同的活性，并能够与突变水解酶形成 稳定复合物。因此，官能团具有一种或多种特性，这些特性有利于 检测和任选分离具有该官能团的底物和突变水解酶形成的稳定复合 物。例如，官能团包括具有以下特性的官能团：特征性电磁光谱特 性如发射或吸收、磁力、电子自旋共振、电容、介电常数或电导率， 以及包括具铁磁性、顺磁性、反磁性、发光性、电化学发光性、荧 光性、磷光性、发色性、抗原性或不同质量的官能团。官能团包括 但不限于核酸分子，即DNA或RNA，例如寡核苷酸或核苷酸，例 如具有核苷酸类似物的寡核苷酸或核苷酸、能够结合蛋白的DNA、 对应于目标基因的单链DNA、对应于目标基因的RNA、没有终止密 码子的mRNA、氨酰化起始密码子tRNA、氨酰化琥珀抑制基因tRNA 或用于RNAi的双链RNA；蛋白，例如发光蛋白；肽；肽核酸；配 体识别的表位，如生物素或链霉抗生物素蛋白；半抗原；氨基酸； 脂质；脂质双层；固相支持体；荧光团；发色团；报告分子；放射 性核素，例如用于放射性检测的放射性同位素或用于同位素编码的 亲和标签(ICAT)等方法的稳定同位素；电子不透明分子；X射线造 影剂；MRI造影剂，例如锰、钆(III)或氧化铁颗粒；等等。在一个实 施方案中，所述官能团是氨基酸、蛋白、糖蛋白、多糖、三重态感 光剂(例如CALI)、核酸分子、药物、毒素、脂质、生物素或固相支 持体(例如自组装单层(参见例如Kwon等，2004))，其结合Ca2+、结合 K+、结合Na+、pH敏感、电子不透明，为发色团、MRI造影剂，在 NO存在下有荧光或对活性氧敏感，为纳颗粒、酶、酶底物、酶抑制 剂如自杀底物(参见例如Kwon等，2004)，辅因子如NADP、辅酶、 琥珀酰亚胺酯或醛、萤光素、谷胱甘肽、NTA、生物素、cAMP、磷 脂酰肌醇、cAMP配体、金属、用作自旋阱(spin trap)的硝基氧或硝 酮(通过电子自旋共振(ESR)检测)、金属鳌合剂(例如用作造影剂、用 于时间分辨荧光或捕获金属)、光笼蔽化合物(例如在照射释放笼蔽化 合物如荧光团的情况下)、嵌入剂(例如补骨脂素)或另一种用于结合 DNA或用作可光活化分子的嵌入剂、三磷酸或亚磷酰胺(例如以允许 底物掺入到DNA或RNA中)、抗体或异种双功能交联剂，例如用于 缀合蛋白或其它分子的交联剂，交联剂包括但不限于酰肼、芳基叠 氮化物、顺丁烯二酰亚胺、碘乙酰胺/溴乙酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺 酯、混合的二硫化物(例如吡啶基二硫化物)、乙二醛/苯基乙二醛、乙 烯砜/乙烯磺酰胺、丙烯酰胺、硼酯、异羟肟酸、亚胺酸酯、异氰酸 酯/异硫氰酸酯或氯三嗪/二氯三嗪。
例如，官能团包括但不限于：一个或多个氨基酸(例如天然氨基 酸或非天然氨基酸)；肽或多肽(蛋白)(包括抗体或其片段)；His-标签、 FLAG标签、Strep标签；酶；辅因子；辅酶；酶的肽或蛋白底物， 例如分支肽底物(例如Z-氨基苯甲酰(Abz)-Gly-Pro-Ala-Leu-Ala-4-硝 基苄基酰胺(NBA))；自杀底物；或受体；一种或多种核苷酸(例如ATP、 ADP、AMP、GTP或GDP)，包括其类似物，例如对应于基因或其部 分的寡核苷酸、双链或单链DNA，例如能够结合蛋白如转录因子的 DNA、对应于基因的RNA，例如没有终止密码子的mRNA或其部分、 用于RNAi的双链RNA或其载体；糖蛋白；多糖；肽-核酸(PNA)； 脂质，包括脂质双层；或为固相支持体，例如沉积粒子(如磁性粒子、 Sepharose或纤维素珠)、膜、玻璃(例如载玻片)、纤维素、藻酸盐、 塑料或其它合成制备的聚合物(例如Eppendorf管或多孔板的孔)、自 组装单层、表面等离振子共振芯片或具有导电表面的固相支持体， 并包括药物，例如化疗剂，如多柔比素、5-氟尿嘧啶或伊立替康 (CPT-11；Irinotecan)；氨酰化tRNA，例如氨酰化起始密码子tRNA 或氨酰化琥珀抑制基因tRNA；结合Ca2+的分子、结合K+的分子、结 合Na+的分子、pH敏感的分子、放射性核素、电子不透明分子；造 影剂，例如钡、碘或其它MRI或X-射线造影剂；在NO存在下有荧 光的分子或对活性氧敏感的分子；纳颗粒，例如免疫金颗粒、顺磁 纳颗粒、上转换纳颗粒或量子点；酶的非蛋白底物；或者为可逆抑 制剂或者不可逆抑制剂的酶抑制剂；螯合剂；交联基团，例如琥珀 酰亚胺酯或醛；谷胱甘肽；生物素或其它抗生物素蛋白结合分子、 抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白；cAMP；磷脂酰肌醇；血红素； cAMP配体；金属；NTA，在一个实施方案中，包括一种或多种染料， 例如呫吨染料、钙敏染料如1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羟基-3-氧基-9-呫 吨基)-苯氧基]-2-(2′-氨基-5′-甲基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(Fluo- 3)、钠敏染料如1，3-苯二羧酸、4，4′-[1，4，10，13-四氧杂-7，16-二氮杂环 十八烷-7，1 6-二基双(5-甲氧基-6，2-苯并呋喃二基)]双(PBFI)、NO敏染 料如4-氨基-5-甲基氨基-2′，7′-双荧光素或其它荧光团。在一个实施方 案中，所述官能团是半抗原或免疫原性分子，即由对该分子特异性 的抗体结合的分子。在一个实施方案中，所述官能团不是放射性核 素。在另一个实施方案中，所述官能团是放射性核素，例如3H、14C、 35S、125I、131I，包括用于诊断方法的分子。
检测具体官能团的方法是本领域已知的。例如，可通过杂交、 扩增、结合对核酸分子特异性的核酸结合蛋白、酶测定(例如如果核 酸分子是核酶的话)检测核酸分子，或者如果核酸分子自身含有可检 测或能够检测的分子，例如放射性标记或生物素，则可通过适于该 分子的测定对其进行检测。
示例性官能团：包括半抗原，例如用于增强免疫原性的分子如 匙孔血蓝蛋白(KLH)；可裂解标记物，例如可光裂解生物素；以及 荧光标记，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)修饰的香豆素和琥珀酰亚 胺或磺酰琥珀酰亚胺修饰的BODIPY(其可通过UV和/或可见光激发 的荧光检测测定)、罗丹明如R110、对甲氨基酚、CRG6、Texas Methyl Red(德克萨斯甲基红)(羧基四甲基罗丹明)、5-羧基-X-罗丹明或荧光 素、香豆素衍生物如7-氨基香豆素和7-羟基香豆素、2-氨基-4-甲氧 基萘、1-羟基芘、试卤灵、phenalenone或benzphenalenone(美国专利 第4,812,409号)、吖啶酮(美国专利第4,810,636号)、蒽和α-和β-萘酚 衍生物、氟化呫吨衍生物，包括氟化荧光素和对甲氨基酚(例如美国 专利第6,612,931号)，生物发光分子，例如萤光素、腔肠素、萤光素 酶、化学发光分子如稳定化二氧环丁烷和电化学发光分子。借助于 连接至对应野生型水解酶底物而连接至突变水解酶的荧光(或发光)官 能团，可用于实时感知系统变化，例如磷酸化。而且，本发明底物 中的荧光分子，例如金属离子化学传感器，如用于Cu2+的9-羰基蒽 修饰的甘氨酰．组氨酰．赖氨酸(GHK)，可用于标记结合底物的蛋白。 发光或荧光官能团如BODIPY、罗丹明绿、GFP或红外染料，也可 用作官能团，并可例如用于使用例如BRET、FRET、LRET或电泳 的相互作用研究。
另一类官能团是与含接受基团的分子选择性相互作用的分子 (“亲和”分子)。因此，由于亲和分子和另一种生物或非生物来源的 分子(例如接受分子)的选择性相互作用，所以含所述亲和分子的水解 酶底物可促进具有所述底物和突变水解酶的复合物分离。例如，与 亲和分子相互作用的具体分子(称为接受分子)可以为小有机分子、化 学基团如巯基(-SH)或大生物分子如抗体或亲和分子的其它天然配 体。结合一般为化学性质，可能涉及共价键或非共价键的形成或如 离子键或氢键键合之类的相互作用。接受分子在溶液中可以是游离 的，或者其自身结合于固体或半固体表面、聚合物基质，或者存在 于固体或半固体底物的表面上。所述相互作用还可以通过外部因子 如光、温度、压力或加入起催化剂作用的化学或生物分子触发。由 于亲和分子和接受分子之间的相互作用(一般是某类结合)，所以可从 反应混合物中检测和/或分离复合物。
亲和分子的实例包括例如以下的分子：免疫原性分子，如蛋白、 肽、糖或脂质表位，即可用于制备该分子特异性抗体的任何分子； 生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白及其衍生物；金属结合 分子；以及这些分子的片段或组合。典型的亲和分子包括His5 (HHHHH)(SEQ ID NO：19)、HisX6(HHHHHH)(SEQ ID NO：20)、C- myc(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO：21)、Flag(DYKDDDDK)(SEQ ID NO：22)、SteptTag(WSHPQFEK)(SEQ ID NO：23)、HA Tag (YPYDVPDYA)(SEQ ID NO：24)、硫氧还蛋白、纤维素结合域、几丁 质结合域、S-肽、T7肽、钙调蛋白结合肽、C-末端RNA标记物、金 属结合域、金属结合反应基、氨基酸反应基、内含肽、生物素、链 霉抗生物素蛋白和麦芽糖结合蛋白。例如，使含生物素的水解酶底 物与突变水解酶接触。突变水解酶和底物的复合物中存在生物素， 使得该复合物可选择性结合抗生物素蛋白分子，例如包被在如珠、 微孔、硝酸纤维素等表面上的链霉抗生物素蛋白分子。合适的表面 包括用于色谱分离的树脂、塑料如组织培养表面或结合平板、微量 滴定碟和珠、陶瓷和玻璃、颗粒包括磁性颗粒、聚合物和其它基质。 用例如磷酸缓冲盐水(PBS)漂洗处理的表面，以去除无生物素的分子， 并分离含生物素的复合物。在某些情况下，这些材料可以是生物分 子感应装置(例如光学纤维、化学敏感场效应管(chemfet)和等离振子 检测器)的一部分。
亲和分子的另一个实例是丹磺酰赖氨酸。与丹磺酰环相互作用 的抗体有市售(Sigma Chemical；St.Louis，MO)，或者可使用如 Antibodies：A Laboratory Manual(Harlow and Lane，1988)中描述的已 知方法制备。例如，将抗丹磺酰基抗体固定在色谱柱填料上。该亲 和柱层析法实现分离的原因是：由于突变水解酶和本发明底物的复 合物与固定化抗体相互作用，所以其保留在柱上，而其它分子则穿 过柱。然后，通过破坏抗体-抗原相互作用释放复合物。具体的层析 柱填料如离子交换或亲和Sepharose、Sephacryl、Sephadex和其它层 析树脂有市售(Sigma Chemical；St.Louis，MO；Pharmacia Biotech； Piscataway，N.J.)。丹磺酰赖氨酸因其荧光特性而可以方便地检测。
当使用抗体作为接受分子时，可通过其它生化分离方法进行分 离，例如免疫沉淀和将抗体固定在滤膜或其它表面上，如珠、平板 或树脂表面上。例如，可用亲和分子特异性抗体或水解酶特异性抗 体包被的磁珠，分离突变水解酶和本发明底物的复合物。可使用磁 场反复地将珠由混合物中分离出来。
另一类功能分子包括使用电磁辐射可检测的分子，包括但不限 于呫吨荧光团、丹磺酰基荧光团、香豆素和香豆素衍生物、荧光吖 啶部分、基于苯并芘的荧光团以及7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑和 3-N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)-2，3-二氨基-丙酸。所述荧光分 子优选在不同于天然氨基酸的波长上具有高量子产率荧光，更优选 具有可在光谱的可见光部分或者UV和可见光两个部分中激发的高量 子产率荧光。在预先选择的波长激发时，所述分子于低浓度即可目 测或者使用常规的荧光检测法检测出。可在费摩尔浓度及以下范围 检测出电化学发光分子，如钌螯合物及其衍生物，或硝基氧氨基酸 及其衍生物。
在一个实施方案中，任选地可检测官能团包括以下官能团中的 一种：

其中R1是C1-C8。
除了荧光分子以外，可使用其物理特性基于分子与电磁场和辐 射的相互作用和反应的各种分子，检测突变水解酶和本发明底物的 复合物。这些特性包括在电磁谱的UV、可见以及红外区域有吸收、 存在具Raman活性并可通过共振Raman波谱学进一步增强的发色 团、电子自旋共振活性和核磁共振以及分子量，例如通过质谱测定。
检测和/或分离具有亲和分子的复合物的方法包括层析技术，包 括凝胶过滤层析、中低压(fast-pressure)或高压液相层析、反相层析、 亲和层析和离子交换层析。其它的蛋白质分离方法也可用于突变水 解酶和本发明底物复合物的检测以及随后的分离，例如电泳、等电 聚焦和质谱。
IV连接基团
术语“连接基团”也用符号‘L’表示，表示将一个或多个官能 团共价连接至反应基或含反应基的底物的一个或多个基团。本文使 用的连接基团不是单个共价键。连接基团的结构不是至关重要的， 只要生成底物可结合其靶酶。在一个实施方案中，所述连接基团可 为使官能团(R)和反应基隔开约5埃至约1000埃(包含5埃和1000埃) 长度的二价基团。其它合适的连接基团包括使R和反应基隔开约5 埃至约100埃的连接基团，以及使R和底物隔开约5埃至约50埃、 约5埃至约25埃、约5埃至约500埃或约30埃至约100埃的连接 基团。
在一个实施方案中，所述连接基团为氨基酸。
在另一个实施方案中，所述连接基团为肽。
在另一个实施方案中，所述连接基团为含约2至约30个碳原子 的二价直链或支链碳链，该链任选包含一个或多个(例如1、2、3或 4个)双键或三键，该链任选由一个或多个(例如2、3或4个)羟基或 氧代基(＝O)取代，其中所述链上的一个或多个(例如1、2、3或4个) 碳原子任选由非过氧化物-O-、-S-或-NH-替换，其中所述链上的一个 或多个(例如1、2、3或4个)碳原子由芳环或杂芳环替换。
在另一个实施方案中，所述连接基团为含约2至约30个碳原子 的二价直链或支链碳链，该链任选包含一个或多个(例如1、2、3或 4个)双键或三键，该链任选由一个或多个(例如2、3或4个)羟基或 氧代基(＝O)取代，其中所述链上的一个或多个(例如1、2、3或4个) 碳原子任选由非过氧化物-O-、-S-或-NH-替换，其中所述链上的一个 或多个(例如1、2、3或4个)碳原子由一个或多个(例如1、2、3或4 个)芳环或杂芳环替换。
在另一个实施方案中，所述连接基团为含约2至约30个碳原子 的二价直链或支链碳链，该链任选包含一个或多个(例如1、2、3或 4个)双键或三键，该链任选由一个或多个(例如2、3或4个)羟基或 氧代基(＝O)取代，其中所述链上的一个或多个(例如1、2、3或4个) 碳原子任选由非过氧化物-O-、-S-或-NH-替换，其中所述链上的一个 或多个(例如1、2、3或4个)碳原子由一个或多个(例如1、2、3或4 个)杂芳环替换。
在另一个实施方案中，所述连接基团为含约2至约30个碳原子 的二价直链或支链碳链，该链任选包含一个或多个(例如1、2、3或 4个)双键或三键，该链任选由一个或多个(例如2、3或4个)羟基或 氧代基(＝O)取代，其中所述链上的一个或多个(例如1、2、3或4个) 碳原子任选由非过氧化物-O-、-S-或-NH-替换。
在另一个实施方案中，所述连接基团为式-W-F-W-的二价基团， 其中F是(C1-C30)烷基、(C2-C30)烯基、(C2-C30)炔基、(C3-C8)环烷基或 (C6-C10)，其中W是-N(Q)C(＝O)-、-C(＝O)N(Q)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、 -O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(Q)-、-C(＝O)-，或为直接键合；其中 每个Q都独立地为H或(C1-C6)烷基。
在另一个实施方案中，所述连接基团为含约2至约30个碳原子 的二价直链或支链碳链，该链任选包含一个或多个(例如1、2、3或 4个)双键或三键，该链任选由一个或多个(例如2、3或4个)羟基或 氧代基(＝O)取代。
在另一个实施方案中，所述连接基团为含约2至约30个碳原子 的二价直链或支链碳链，该链任选包含一个或多个(例如1、2、3或 4个)双键或三键。
在另一个实施方案中，所述连接基团为含约2至约30个碳原子 的二价直链或支链碳链。
在另一个实施方案中，所述连接基团为含约2至约20个碳原子 的二价直链或支链碳链，该链任选包含一个或多个(例如1、2、3或 4个)双键或三键，并且该链任选由一个或多个(例如2、3或4个)羟 基或氧代基(＝O)取代。
在另一个实施方案中，所述连接基团为含约2至约20个碳原子 的二价直链或支链碳链，该链任选包含一个或多个(例如1、2、3或 4个)双键或三键。
在另一个实施方案中，所述连接基团为含约2至约20个碳原子 的二价直链或支链碳链。
在另一个实施方案中，所述连接基团为-(CH2CH2O)-1-10。
在另一个实施方案中，所述连接基团为-C(＝O)NH(CH2)3-、
-C(＝O)NH(CH2)5C(＝O)NH(CH2)-、
-CH2OC(＝O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)-、
-C(＝O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3-、
-CH2OC(＝O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3-、
-(CH2)4C(＝O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3-、
-C(＝O)NH(CH2)5C(＝O)NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)3-。
在另一个实施方案中，所述连接基团包含一个或多个二价杂芳 基。
具体地说，(C1-C30)烷基可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁 基、异丁基、仲丁基、戊基、3-戊基、己基、庚基、辛基、壬基或癸 基；(C3-C8)环烷基可以是环丙基、环丁基、环戊基或环己基；(C2-C30) 烯基可以是乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁 烯基、3-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-己 烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、庚烯基、辛烯基、 壬烯基或癸烯基；(C2-C30)炔基可以是乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、 1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4- 戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基、庚 炔基、辛炔基、壬炔基或癸炔基；(C6-C10)芳基可以是苯基、茚基或 萘基；而杂芳基可为呋喃基、咪唑基、三唑基、三嗪基、唑基、 异唑基、噻唑基、异噻唑基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、四唑基、 吡啶基、(或其N-氧化物)、噻吩基、嘧啶基(或其N-氧化物)、吲哚基、 异喹啉基(或其N-氧化物)或其喹啉基(或其N-氧化物)。
术语芳族包括芳基和杂芳基。
芳基表示苯基或具有约9-10个环原子的邻位稠合双环碳环基， 其中至少一个环是芳环。
杂芳基包括经单环芳环环碳连接的基团，芳环含5或6个环原 子，由碳和1-4个杂原子组成，杂原子分别选自非过氧化物O、S或 N(X)，其中X不存在或为H、O、(C1-C4)烷基、苯基或苄基，以及包 括由其衍生的约8-10个环原子的邻位稠合双环杂环基团，特别是苯 并衍生物或通过将丙烯、1，3-亚丙基或1，4-亚丁基双自由基稠合于其 上而衍生的基团。
术语“氨基酸”当用于指连接基团时，包含D或L型天然氨基 酸(例如Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Hyl、Hyp、 Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)残基， 以及非天然氨基酸(例如磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、羟 脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、马尿酸、八氢吲哚-2-甲酸、抑胃酶氨酸、1，2，3，4- 四氢异喹啉-3-甲酸、青霉胺、鸟氨酸、瓜氨酸、α-甲基-丙氨酸、对 苯甲酰苯丙氨酸、苯基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、肌氨酸和四丁基甘 氨酸)残基。该术语还包括携带常规氨基保护基(例如乙酰基或苄氧羰 基)的天然和非天然氨基酸，以及在羧基末端保护(例如为(C1-C6)烷 基、苯基或苄基酯或酰胺)的天然和非天然氨基酸。其它合适的氨基 和羧基保护基是本领域技术人员已知的(参见例如Greene，Protecting Groups In Organic Synthesis；Wiley：New York，1981以及其中引用的 参考文献)。氨基酸可通过羧基末端、氨基末端或任何其它方便的连 接点(例如通过半胱氨酸的硫)连接至另一个分子。
术语“肽”当用于指连接基团时，描述的是2-25个氨基酸(例如 以上定义的氨基酸)或肽基残基的序列。所述序列可为线性或环状。 例如，可制备环肽，或者可由序列中两个半胱氨酸残基形成二硫键 获得环肽。肽可通过羧基末端、氨基末端或任何其它方便的连接点(例 如通过半胱氨酸的硫)连接至另一个分子。肽优选含有3-25或5-21 个氨基酸。可根据美国专利号4,612,302、4,853,371和4,684,620的 公开内容制备肽衍生物。对于本文具体记载的肽序列，氨基末端写 在左侧，而羧基末端写在右侧。
在一个实施方案中，本发明具有连接基团的脱卤素酶底物具有 式(I)结构：
R-连接基团-A-X    (I)
其中，R是一个或多个官能团(例如荧光团、生物素、发光团，或荧 光或发光分子，或者是固相支持体，包括微球、膜、聚合物平板、 玻璃珠、载玻片等)，其中所述连接基团是含C、N、S或O的多原 子直链或支链，其中A-X是脱卤素酶底物，其中X是卤素。在一个 实施方案中，A-X是脱卤素酶的卤代脂肪族底物或卤代芳香族底物。 在一个实施方案中，所述连接基团是含约12至约30个碳原子的二 价直链或支链碳链，该链任选包含一个或多个(例如1、2、3或4个) 双键或三键，并且该链任选由一个或多个(例如2、3或4个)羟基或 氧代基(＝O)取代，其中所述链上的一个或多个(例如1、2、3或4个) 碳原子任选由非过氧化物-O-、-S-或-NH-替换。在一个实施方案中， 所述连接基团含3-30个原子，例如11-30个原子。在一个实施方案 中，所述连接基团含(CH2CH2O)y，而y为2-8。在一个实施方案中， A是(CH2)n，而n为2-10，例如4-10。在一个实施方案中，A是CH2CH2 或CH2CH2CH2。在另一个实施方案中，A包含芳基或杂芳基。在一 个实施方案中，脱卤素酶如红球菌(Rhodococcus)脱卤素酶底物中的 连接基团是含C、N、S或O的多原子直链或支链，当官能团R含芳 环体系或是固相支持体时，优选连接基团含11-30个原子。
在另一个实施方案中，本发明具有连接基团的脱卤素酶底物具 有式(II)结构：
R-连接基团-CH2-CH2-CH2-X    (II)
其中X是卤素，优选为氯。在一个实施方案中，R是一个或多个官 能团，例如荧光团、生物素、发光团，或荧光或发光分子，或者是 固相支持体，包括微球、膜、玻璃珠等。当R为放射性标记物或可 检测小原子如光谱活性同位素时，所述连接基团可为0-30个原子。
V.示例性底物的合成
[2-(2-羟基-乙氧基)-乙基]-氨基甲酸蒽-9-基甲酯。
向9-蒽甲醇(10g，48mmol)和氯甲酸4-硝基苯酯(13.6g，67.5 mmol)的200ml CH2Cl2搅拌淤浆中加入三乙胺(6.7ml，0.19mol)。于 室温搅拌获得的金色溶液16小时。此时加入2-(2-氨基乙氧基)乙醇 (14.4ml，0.144mol)，再继续搅拌24小时。然后用2％氢氧化钠(重 量/重量)溶液清洗CH2Cl2反应混合物，直至在有机层观测不到对硝基 苯酚。用硫酸钠干燥二氯甲烷，过滤，减压蒸发。
用硅胶60通过柱层析进一步纯化粗产物，用含1％-3％甲醇的二 氯甲烷溶液渐进梯度洗脱。分离出7.6g(58％收率)黄色固体：1H NMR (CDCl3)δ8.38(s，H-10)，8.28(d，H-1，8)，7.94(d，H-4，5)，7.44(m，H-2， 3，6，7)，6.06(s，CH2-anth)，5.47(t，可交换，NH)，3.53(bs，CH2-OH)3.33 (m，3-CH2-)。质谱：m/e C20H22NO4+理论值：340.15。实测值：340.23。 C20H21NNaO4+理论值：340.15。实测值：340.23。

            式III的化合物
{2-[2-(6-氯-己氧基)-乙氧基]-乙基}-氨基甲酸蒽-9-基甲酯。
在惰性气氛下，向100ml圆底烧瓶中装入[2-(2-羟基-乙氧基)-乙 基]-氨基甲酸蒽-9-基甲酯(1.12g，3mmol)和新鲜氢化钠的60％矿物 油分散液(360mg，9mmol)。加入20ml无水THF，搅拌反应物30 分钟。然后通过冰/NaCl浴将烧瓶冷却至-10至-20℃。达到温度时通 过注射器加入1-氯-6-碘己烷(1ml，6mmol)。将反应物保持在冰/NaCl 温度2小时，然后缓慢温至室温过夜。此时将硅胶60共吸附到反应 混合物上，减压去除溶剂。首先用庚烷作为洗脱剂，接着用10％、20％ 和25％乙酸乙酯，开始硅胶层析。由合适级分中分离出总共0.57 g 产物(41％收率)：1HNMR(CDCl3)δ8.48(s，H-10)，8.38(d，H-1，8)，8.01 (d，H-4，5)，7.52(dt，H-2，3，6，7)，6.13(s，CH2-anth)，5.29(bs，可交换， NH)，3.74(m，4H)，3.55-3.15(m，8H)，1.84(m，4H)，1.61(m，1H)，1.43 (m，1H)，1.25(m，2H)。质谱：m/e C26H32ClNO4·H2O理论值：475.21 (100％)、476.22(29.6％)。实测值：475.21、476.52。

                     式IV的化合物
三氟乙酸2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基-铵。
将{2-[2-(6-氯-己氧基)-乙氧基]-乙基}-氨基甲酸蒽-9-基甲酯(0.56 g，1.2mmol)溶解在4ml二氯甲烷中，向其中加入2滴苯甲醚。用 冰/NaCl浴冷却反应混合物。10分钟后加入三氟乙酸(2ml)。一加入 反应混合物就转为黑褐色，对其搅拌30分钟。在减压下去除所有挥 发物。残余物再溶解在CH2Cl2中，用水清洗两次。冷冻水性组分， 并过夜冻干。留下油性残余物，并溶解在无水DMF中，在下一步反 应中用作母液。质谱：m/e C10H23ClNO2+理论值：224.14(100％)、226.14 (32％)。实测值：224.2、226.2。

          式V的化合物
报告基团缀合2-[2-(6-氯-己氧基)-乙氧基]-乙胺的一般方法学。
向1当量报告基团琥珀酰亚胺酯的DMF溶液中加入3当量三氟 乙酸2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基-铵母液，接着加入二异丙基乙 胺。于室温搅拌反应物8-16小时。以制备规模HPLC或硅胶层析完 成纯化。
N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-荧光素-5-酰胺。
使用以上方法学制备标题化合物。用制备规模HPLC完成纯化。 质谱：m/e C31H31ClNO8-理论值：580.17(100％)、581.18(32％)。实测 值：580.18、581.31。

           式VI的化合物
N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-生物素-酰胺。
使用以上方法学制备标题化合物。用硅胶层析(2％-5％甲醇的二 氯甲烷溶液)完成纯化。质谱：m/e C20H37ClN3O4S+理论值：450.22 (100％)、452.22(32％)。实测值：449.95、451.89。

          式VII的化合物
N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-四甲基罗丹明-5-(和-6)-酰胺。
使用以上方法学制备标题化合物。用制备规模HPLC完成纯化。 实现了对结构异构体的分离。质谱：m/e C35H43ClN3O6+理论值：636.28 (100％)、637.29(39.8％)、638.28(32.4％)。实测值：636.14、637.15、 638.14。

          式VIII的化合物                                    式IX的化合物
N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-罗丹明R110-5-(和-6)-酰胺。
使用以上方法学制备标题化合物。用制备规模HPLC完成纯化。 实现了结构异构体的分离。质谱：m/e C31H35ClN3O6+理论值：580.2 (100％)、581.2(35.6％)、582.2(32.4％)。实测值：580.4、581.4、582.2。

          式X的化合物                                      式XI的化合物
6-({4-[4，4-二氟-5-(噻吩-2-基)-4-硼杂-3a-4a-二氮杂-s-引达省 (indacene)-3-基]-苯氧基}-乙酰氨基)-己酸{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]- 乙基}-酰胺。
使用以上方法学制备标题化合物。用硅胶层析(3％-5％甲醇的二 氯甲烷溶液)完成纯化。质谱：m/e C37H47BClF2N4O5S+理论值：743.3 (100％)。实测值：743.4。

                         式XII的化合物
6-{4-[4，4二氟-5-(噻吩-2-基)-4-硼杂-3a-4a-二氮杂-s-引达省-3-基]-苯 乙烯基氧基}-乙酰氨基)-己酸{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-酰 胺。
使用以上方法学制备标题化合物。用硅胶层析(3％甲醇的二氯甲 烷溶液)完成纯化。质谱：m/e C39H48BClF2N4NaO5S+理论值：791.3 (100％)。实测值：791.3。

                            式XIII的化合物
三乙铵3-[5-[2-(4-叔丁基-7-二乙基氨基-亚色烯-2-基)-亚乙基]-3-(5-{2- [2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基氨甲酰基}-戊基)-2，4，6-三氧代-四氢-嘧 啶-1-基]-丙烷-1-磺酸阴离子。
使用以上方法学制备标题化合物。用制备规模HPLC完成纯化。 质谱：m/e C42H62ClN4O10S-理论值：849.4(100％)、850.4(48.8％)、851.4 (36.4％)。实测值：849.6、850.5、851.5。

                  式XIV的化合物
氯化2-叔丁基-4-{3-[1-(5-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基氨甲酰基}- 戊基)-3，3-二甲基-5-磺酸根-1，3-二氢-亚吲哚-2-基]-丙烯基}-7-二乙基 氨基-色烯。
使用以上方法学制备标题化合物。用制备规模HPLC完成纯化。 质谱：m/e C46H67ClN3O7S-理论值：840.4(100％)、841.4(54.4％)。实 测值：840.5、841.5。

                  式XV的化合物
N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-3-{4-[5-(4-二甲基氨基-苯基)- 唑-2-基]-苯磺酰基氨基}-丙酰胺。
使用以上方法学制备标题化合物。用制备规模HPLC完成纯化。 质谱：m/e C30H40ClN4O6S-理论值：619.2(100％)、620.2(35％)。实测 值：619.5、620.7。

               式XVI的化合物
N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-9′-氯半萘并荧光素-5-(和-6)-酰 胺。
使用以上方法学制备标题化合物。用制备规模HPLC完成纯化。 实现了结构异构体的分离。质谱：m/e C35H34Cl2NO8+理论值：666.17 (100％)、668.16(64％)、667.17(39.8％)。实测值：666.46、668.44、 667.51。

                式XVII的化合物                                   式XVIII的化合物
N-{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}-半萘并二甲基罗丹明-5-(和-6)-酰 胺。
使用以上方法学制备标题化合物。用制备规模HPLC完成纯化。 质谱：m/e C37H38ClN2O7-理论值：657.24(100％)、658.24(42％)、659.23 (32％)。实测值：657.46、658.47、659.45。

             式XIX的化合物                                   式XX的化合物
6-(3′，6′-二新戊酰荧光素-5-(和6-)-甲酰氨基)己酸{2-[2-(6-氯己氧基)- 乙氧基]-乙基}-酰胺。
向含6-(3′，6′-二新戊酰荧光素-5-(和6-)-甲酰氨基)己酸琥珀酰亚 胺酯(0.195g，0.26mmol)的100ml圆底烧瓶中加入2-[2-(6-氯己氧基)- 乙氧基]-乙胺(约0.44mmol)的25ml Et2O溶液，接着加入2ml吡啶。 将反应混合物搅拌过夜。减压蒸发后，将残余物上硅胶60柱层析， 使用2％-5％甲醇的二氯甲烷溶液作为洗脱剂渐进梯度洗脱。收集合 适的级分，真空干燥(0.186g，0.216mmol，84％收率)。质谱：m/e C47H60ClN2O11+理论值：863.39(100％)、864.39(54.4％)、865.39 (34.6％)。实测值：862.94、864.07、864.94。

             式XXI的化合物                                  式XXII的化合物
6-(荧光素-5-(和6-)-甲酰氨基)己酸{2-[2-(6-氯己氧基)-乙氧基]-乙基}- 酰胺。
将6-(3′，6′-二新戊酰荧光素-5-(和6-)-甲酰氨基)己酸{2-[2-(6-氯己 氧基)-乙氧基]-乙基}-酰胺(0.186g，0.216mmol)溶解在5ml甲醇中， 并加入0.5ml 2M碳酸钠(水溶液)。反应混合物搅拌16小时，然后 过滤。使用制备规模HPLC完成纯化。实现了结构异构体的分离。 质谱：m/e C37H44ClN2O9+理论值：695.27(100.0％)、696.28(42.2％)、 697.27(32.3％)。实测值：

      式XXIII的化合物                         式XXIV的化合物
{2-[2-(4-氯丁氧基)-乙氧基]-乙基}-氨基甲酸蒽-9-基甲酯。
在惰性气氛下，用50ml圆底烧瓶盛装[2-(2-羟基乙氧基)-乙基]- 氨基甲酸蒽-9-基甲酯(0.25g，0.74mmol)和新鲜氢化钠的60％矿物油 分散液(150mg，3.75mmol)。加入10ml无水THF，搅拌反应物5 分钟。在此之后用注射器加入1-氯-4-碘丁烷(180μl，1.5mmol)。将 反应物于室温搅拌24小时。将硅胶60共吸附到反应混合物上，减 压去除溶剂。首先用庚烷作为洗脱剂，接着用10％、20％和30％乙 酸乙酯，进行硅胶柱层析。由合适级分中分离出总共0.1g产物(32％ 收率)：1H NMR(CDCl3)δ8.50(s，H-10)，8.40(d，H-1，8)，8.03(d，H-4， 5)，7.53(dt，H-2，3，6，7)，6.15(s，CH2-anth)，5.19(m，可交换，NH)，3.93- 3.32(m，12H)1.69-1.25(m，4H)。质谱：m/e C24H28ClNO4·H2O理论值： 447.18(100.0％)、448.18(27.1％)。实测值：447.17、448.41。

                      式XXV的化合物
2-(2-{2-[2-(2-氯乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基)-异吲哚-1，3-二酮。
用Nielsen，J.和Janda，K.D.(Methods：A Companion to Methods in Enzymology 6，361-371(1994))的方法制备2-(2-{2-[2-(2-羟基-乙氧基)- 乙氧基]-乙氧基}-乙基)-异吲哚-1，3-二酮(0.5g，1.55mmol)。向配有 回流冷凝器的25ml圆底烧瓶中加入该试剂，并加入约3mmol P/g (0.67g，2mmol)聚苯乙烯载的三苯基膦和6ml四氯化碳。用氩气喷 射反应体系，然后加热回流2小时。冷却后，再加入聚苯乙烯载的 三苯基膦(0.1g，0.3mmol)，反应物再回流1小时。过滤冷却的溶液， 再用四氯化碳清洗树脂。蒸发溶剂，获得0.4g(75.5％收率)的纯标题 化合物：1H NMR(CDCl3)δ7.82(dd，2H)，7.69(dd，2H)，3.88(t，2H)， 3.71(q，4H)，3.63-3.56(m，12H)。质谱：m/e C16H21ClNO5+理论值：342.11 (100.0％)、344.11(32.0％)。实测值：341.65、343.64。

         式XXVI的化合物
2-[2-(2-{2-[2-(2-氯乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙基]-异吲哚- 1，3-二酮。
按照前述实例制备标题化合物，收率89％：1H NMR(CDCl3)δ7.77 (dd，2H)，δ 7.64(dd，2H)，3.83(t，2H)，3.67(m，4H)，3.60-3.52(m， 14H)。质谱：m/e C18H25ClNO6+理论值：386.14(100.0％)、388.13 (32.0％)。实测值：385.88、387.83。

             式XXVII的化合物
2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氯乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙 基}-异吲哚-1，3-二酮。
按照2-(2-{2-[2-(2-氯-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙基)-异吲哚- 1，3-二酮的合成制备标题化合物，收率92％：1H NMR(CDCl3)δ7.84 (dd，2H)，7.71(dd，2H)，3.90(t，2H)，3.74(q，4H)，3.67-3.58(m，18H)。 质谱：m/e C20H29ClNO7+理论值：430.16(100.0％)。实测值：429.85。

            式XXVIII的化合物
可如下文阐述和如以下步骤a-c的描述制备可用于制备本发明底 物的中间体化合物氯化2-{2-[4-(2-氯乙基)苯氧基]-乙氧基}乙铵。

a.2-{2-[4-(2-羟乙基)苯氧基]乙氧基}-乙基氨基甲酸叔丁酯。
将4-羟基苯乙醇(1.14g，8.2mmol)、碳酸铯(4.02g，12.4mmol)和 2-(2-“(4-甲基苯氧基)磺酰基]氧基}乙氧基)-乙基氨基甲酸叔丁酯(2.96 g，8.2mmol)(使用标准化学方法制备)装入100ml圆底烧瓶。用10ml DMF将该反应混合物制成淤浆，并通过使用油浴加热至60℃。反应 继续进行19小时，此时冷却，并减压去除DMF。在加入二氯甲烷后， 通过Celite短柱过滤反应混合物，然后去除溶剂。获得的固体在高真 空下干燥。分离差不多定量收率的产物：1H NMR(CDCl3)δ7.11(d，2H， Ar)，6.98(d，2H，Ar)，4.97(bs，可交换，NH)，4.07(dd，CH2-O)，3.79(t， CH2-OH)，3.78(dd，CH2-O)，3.57(t，CH2-O)，3.30(bm，CH2-NH)，2.78(t， CH2-Ar)，1.82(bs，可交换，OH)1.41(s，9H，CH3)。质谱：m/e C17H28NO5+ 理论值：326.20(100％)、327.20(19.5％)。实测值：326.56、327.57。
b.2-{2-[4-(2-氯乙基)苯氧基]乙氧基}-乙基氨基甲酸叔丁酯。
向溶解在10ml四氯化碳中的2-{2-[4-(2-羟乙基)苯氧基]乙氧基} 乙基氨基甲酸叔丁酯(0.56g，1.7mmol)加入结合在苯乙烯上的三苯膦 (861mg，2.6mmol，约3mmol/g树脂)。将反应混合物加热回流2小 时。在所需时间后，冷却反应物并过滤。在干燥后分离出定量收率 的产物。1H NMR(CDCl3)δ7.11(d，2H，Ar)，6.86(d，2H，Ar)，4.95(bs， 可交换，NH)，4.08(dd，CH2-O)，3.79(dd，CH2-O)，3.65(t，CH2-Cl)，3.59 (t，CH2-O)，3.32(bm，CH2-NH)，2.99(t，CH2-Ar)，1.70(bs，可交换，OH) 1.42(s，9H，CH3)。质谱：m/e C17H27ClNO4+理论值：344.16(100％)、 346.16(32％)。实测值：344.57、346.55。
c.氯化2-{2-[4-(2-氯乙基)苯氧基]乙氧基}乙铵。
将2-{2-[4-(2-氯乙基)苯氧基]乙氧基}乙基氨基甲酸叔丁酯(1.7 mmol)溶解在5ml二氯甲烷中，并加入三乙硅烷(0.5ml，5％体积/体 积)。此时于室温向溶液中滴加三氟乙酸(5ml)。加入时反应混合物转 为金褐色，使反应混合物搅拌1小时。在减压下去除所有挥发物， 残余物再溶解在CH2Cl2中，用稀HCl清洗两次。过夜冻干水性组分。 将残留的油性残余物溶解在无水DMF中，在下一步反应中用作母液。
可如下文阐述和如以下步骤d-g的描述制备可用于制备本发明 底物的中间体化合物2-(2-{[5-(3-氯丙基)-2-呋喃基]甲氧基}乙氧基)乙 胺。

d.2-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基甲基)呋喃。
向含二甲基甲酰胺(150mL)的1L烧瓶中加入糠醇(17.7mL，0.20 mol)、叔丁基二甲基甲硅烷基氯(33.7g，0.22mol)和咪唑(15.3g，0.22 mol)。在于室温搅拌22小时后，过滤反应物，并真空去除挥发物。 将所获物质分配在乙醚(500mL)和柠檬酸饱和水溶液(100mL)中。另 外，以2×100mL饱和柠檬酸洗涤醚层。混合的水层用1×50mL乙醚 反萃取。混合的有机层用1×100mL水洗涤，接着用1×100mL盐水 洗涤。醚层经无水硫酸钠干燥、过滤并蒸发，得到28.1g(65％收率)。 1H NMR：(DMSO-d6)δ0.01(s，6H)，0.82(s，9H)，4.55(s，2H)，6.29(d， 1H)，6.36(dd，1H)，7.58(d，1H)。
e.2-(3-氯丙基)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基甲基)呋喃。
经3分子筛干燥2-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基甲基)呋喃(5g， 0.023mol)的THF(48mL)溶液。在去除所述分子筛之后，加入另外 的10mL THF连同TMEDA(3.47mL，0.023mol)，在冰浴中将溶液冷 却至0℃。在25分钟内滴加BuLi溶液(10.1mL的2.5M己烷溶液， 0.025mol)。使混合物搅拌1小时。快速注入1-Cl-3-碘丙烷(5.64g，0.028 mol)。在2小时后TLC指示完成。蒸发溶剂，将物质分配在乙醚(100 mL)和5％柠檬酸(100mL)之间。乙醚层用水(50mL)洗涤，然后用盐 水(50mL)洗涤。乙醚溶液用硫酸钠干燥、过滤和蒸发。使用20/1庚 烷/EtOAc将所获物质在二氧化硅上闪蒸。合并合适的级分并蒸发， 获得4.9g(75％收率)。TLC：Rf 0.6(庚烷/EtOAc 5/1)1H NMR：(CDCl3) δ0.00(s，6H)，0.83(s，9H)，2.01(p，2H)，2.71(t，2H)，3.48(t，2H)，4.51(s， 2H)，5.88(d，1H)，6.04(d，IH)
f.[5-(3-氯丙基)-2-呋喃基]甲醇。
将2-(3-氯丙基)-5-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基甲基)呋喃(4.88g， 0.017mol)的THF(50mL)溶液冷却至0℃。向上述溶液中加入冷却的 氟化四丁基铵溶液(1M的THF溶液，18.2mL，0.018mol)。20分钟 后，TLC指示反应完成。向溶液中加入乙酸(2mL)。蒸发溶液。将所 获淤浆分配在乙醚(150mL)和饱和柠檬酸(100mL)之间。另外，乙醚 层用饱和碳酸氢盐(60mL)洗涤，然后用水(60mL)洗涤。混合的水层 用乙醚(50mL)反萃取。混合的乙醚层用硫酸钠干燥、过滤并蒸发， 获得3.4g黄色浆状物(99％粗收率)。所述物质在二氧化硅上进一步 纯化，用庚烷/EtOAc(5/1)洗脱，获得1.6g(47％收率)。TLC：Rf 0.5(庚 烷/EtOAc 1/1)1H NMR：(CDCl3)δ2.05(p，2H)，2.74(t，2H)，3.21(bs， 1H)，3.51(t，2H)，4.45(s，2H)，5.94(d，1H)，6.11(d，1H)。
g.2-(2-{[5-(3-氯丙基)-2-呋喃基]甲氧基}乙氧基)乙胺。
经3分子筛干燥[5-(3-氯丙基)-2-呋喃基]甲醇(500mg，2.5mmol) 的乙醚(6mL)溶液。在去除所述分子筛之后，向溶液中加入吡啶(245 μL，3.0mmol)。向溶液中滴加亚硫酰溴(215μL，2.9mmol)。搅拌7小 时后，将该溶液快速注入到2-[2-氨基乙氧基]乙醇钠(534mg，4.2mmol) 的DMF(3mL)溶液中。(2-[2-氨基乙氧基]乙醇钠如下预先制备：加 入60％NaH分散液(2.85g，0.07mol)，随后用庚烷清洗至2-氨基乙氧 基乙醇(5g，0.04mol)的二甘醇二甲醚(10mL)溶液中，搅拌5小时， 并蒸发)。在2小时后，将反应物置于冰箱中。18小时后，将反应物 分配在二氯甲烷(DCM)(50mL)和水(50mL)之间。用另外的30mL DCM萃取水层。用水(30mL)洗涤混合的DCM层。DCM层用稀HCl (1N，30mL)萃取，之后用水(20mL)萃取。用稀NaOH将酸性水溶液 调节至pH＝10，并用2×20ml DCM反萃取。用盐水洗涤DCM，用 硫酸钠干燥，过滤并蒸发，获得380mg(58％收率)。直接使用而不 需要进一步纯化。TLC：Rf 0.5(IPA/NH4OH/水8/1/1，茚三酮溶液显 色)。质谱：m/e C12H21ClNO3+理论值：262.1(100％)、264.1(32％)。 实测值：262.6、264.6。
报告基团缀合2-{2-[4-(2-氯乙基)苯氧基]乙氧基}乙胺或2-(2-{[5-(3-氯 丙基)-2-呋喃基]甲氧基}乙氧基)乙胺的一般方法学。
向1当量报告基团琥珀酰亚胺酯的DMF溶液加入1.5当量底物 母液，接着加入二异丙基乙胺。于室温搅拌反应物8-16小时。以制 备规模HPLC或硅胶层析完成纯化。
使用上述一般方法制备本发明底物(XXIX-XXXIV)。
2-{2-[4-(2-氯乙基)苯氧基]乙氧基}乙基-四甲基罗丹明-6-甲酰胺。
使用所述一般方法学，以6-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯起 始，制备标题化合物。使用制备规模HPLC完成纯化。实现了结构 异构体的分离。UV/Vis(MeOH)：544(最大)质谱：m/e C37H39ClN3O6+ 理论值：656.25(100％)、658.25(32.4％)。实测值：656.37、658.37。 该化合物在本文被称为羧基四甲基罗丹明-对-苯乙基-Cl。

                        式XXIX的化合物
2-{2-[4-(2-氯乙基)苯氧基]乙氧基}乙基-荧光素-5-(和-6)-甲酰胺。
使用所述一般方法学，以5(6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯起始， 制备标题化合物。使用制备规模HPLC纯化和分离异构体。质谱：m/e C33H27ClN3O8-理论值：600.14(100％)、601.15(37.4％)、602.14 (32.1％)。实测值：600.18、601.24、602.21。该化合物在本文被称为 羧基荧光素-对-苯乙基-Cl。

                       式XXX的化合物
2-{2-[4-(2-氯乙基)苯氧基]乙氧基}乙基-生物素-甲酰胺。
使用所述一般方法学，以D-生物素琥珀酰亚胺酯起始，制备标 题化合物。使用制备规模HPLC完成纯化。质谱：m/e C22H33ClN3O4S+ 理论值：470.19(100％)。实测值：470.19。该化合物在本文被称为生 物素-对-苯乙基-14-Cl。

                          式XXXI的化合物
2-{2-[4-(2-氯乙基)苯氧基]乙氧基}乙基-3′，6′-二乙酰基荧光素-6-甲酰 胺。
向含N-{2-[4-(2-氯乙基)-1-乙氧基苯基]乙基}-荧光素-6-甲酰胺 (12.3mg，)的10ml圆底烧瓶中加入2ml乙酸酐，接着加入0.25ml 吡啶。使反应混合物静置1小时。减压蒸发后将残余物与甲苯共蒸 发两次。然后在真空下干燥固体(0.186g，0.216mmol，84％收率)。质 谱：m/e C37H33ClNO10+理论值：686.18(100％)、687.18(41.9％)、688.18 (34.1％)。实测值：686.55、687.61、688.60。

                         式XXXII的化合物
N-[2-(2-{[5-(3-氯丙基)-2-呋喃基]甲氧基}乙氧基)乙基]四甲基罗丹明- 6-甲酰胺。
使用所述一般方法学，以6-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯起 始，制备标题化合物。使用制备规模HPLC完成纯化。1H NMR：(CD3OD) d 2.04(p，2H)，2.75(t，2H)，3.26(s，12H)，3.60(m，10H)，4.38(s，2H)， 5.97(d，1H)，6.20(d，1H)6.99(d，2H)，7.08(dd，2H)，7.15(d，2H)，7.81(s， 1H)，8.19(d，1H)，8.39(d，1H)，8.73(bt，1H)。质谱：m/e C37H41ClN3O7+ 理论值：674.26(100.0％)、675.27(42.0％)、676.26(32.4％)。实测值： 674.5、675.5、676.5。该化合物在本文被称为羧基四甲基罗丹明-呋 喃基-丙基-Cl。

                           式XXXIII的化合物
N-[2-(2-{[5-(3-氯丙基)-2-呋喃基]甲氧基}乙氧基)乙基]-荧光素-6-甲酰 胺。
使用所述一般方法学，以5(6)-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯起始， 制备标题化合物。使用制备规模HPLC完成了异构体的纯化和分离。 质谱：m/e C33H31ClNO9+理论值：620.17(100％)、602.17(32.1％)。实 测值：620.47、622.49。该化合物在本文被称为羧基荧光素-呋喃基- 丙基-Cl。

                      式XXXIV的化合物
VI.典型应用方法
本发明提供监测细胞中分子表达、定位和/或运输以及监测细胞 内微环境变化和分离、成像、鉴别、定位、展示或检测可存在于样 品(例如细胞)中的一种或多种分子的方法，所述方法使用本发明的水 解酶底物和/或突变水解酶。本发明底物优选可溶于水性或大体水性 的溶液，包括水和pH约大于或等于6的水溶液。但是，本发明底物 的母液在稀释入水溶液或缓冲液之前可溶解在有机溶剂中。优选的 有机溶剂为非质子极性溶剂，例如DMSO、DMF、N-甲基吡咯烷酮、 丙酮、乙腈、二烷、四氢呋喃和其它可与水完全混溶的非羟基溶 剂。本发明底物和对应突变水解酶的使用浓度取决于实验条件和需 要的结果，例如在合理时间内、在最小背景或不想要标记的情况下 所获得结果。本发明底物的浓度通常在纳摩尔浓度至微摩尔浓度的 范围内。通过底物的系统变化测定本发明底物和对应突变水解酶所 需要的浓度，直至实现令人满意的标记。根据本领域已知方法可容 易测定起始范围。
在一个实施方案中，使用含光学特性官能团的底物和突变水解 酶标记样品。所述底物与含突变水解酶的目的样品混合一段时间， 使突变水解酶足以结合底物，此后以选择用于激发官能团光学反应 的波长照射样品。任选清洗样品，以去除残余、过量或未结合的底 物。在一个实施方案中，通过进一步与标准反应或预期反应比较光 学反应，使用所述标记测定样品的具体特征。例如，使用结合了突 变水解酶的底物监测样品具体组分在样品中的空间和时间分布。或 者，使用突变水解酶结合底物测定或检测某些分子的存在情况或量。 在另一个实施方案中，使用突变水解酶结合底物分析样品中特异性 响应官能团的分子的存在情况。
与固有荧光蛋白如GFP相反，结合了荧光底物的突变水解酶不 需要天然蛋白结构来保留荧光。在荧光底物结合后，可例如在变性 电泳凝胶如SDS-PAGE中，或在以有机溶剂如多聚甲醛固定的细胞 中，检测突变水解酶。还可通过结合的荧光团检测含反应性亲核氨 基酸的突变水解酶片段，例如以监测蛋白水解过程。
可检测的光学反应是指测试系统中通过直接观察或借助仪器能 够感知的参数变化或出现。这种可检测反应包括颜色、荧光、反射、 化学发光、光偏振、光散射或X-射线散射的变化或出现。可检测的 反应通常是荧光变化，例如荧光强度、激发或散射波长分布、荧光 寿命、荧光极化或其组合的变化。可检测的光学反应可发生在含突 变水解酶或其融合体的样品的所有部分，或者发生在含突变水解酶 或其融合体的样品的局部部分。与标准反应或预期反应对比光学反 应程度，运用该对比测定含突变水解酶或其融合体的样品是否具有 给定特征以及达到何种程度。
在另一个实施方案中，官能团是接受分子的配体。在底物包含 作为特异性结合对一员(配体)的官能团时，可将互补成员(接受体)或 底物固定在固体或半固体表面上，例如聚合物、聚合膜或聚合颗粒(例 如聚合珠)，或二者均可在溶液中。在一个实施方案中，可使用导电 底物包被的表面检测蛋白-蛋白相互作用。代表性的特异性结合对包 括生物素和抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白或抗生物素)、IgG和 A蛋白或G蛋白、药物和药物受体、毒素和毒素受体、糖和凝集素 或糖受体、肽或蛋白和肽或蛋白受体、两种或多种相互作用的蛋白(例 如蛋白激酶A(PKA)调节亚基和PKA催化亚基)、酶及其底物(例如 蛋白酶、激酶或萤光素酶及其底物)、酶的辅因子和酶、有义DNA 或RNA和反义(互补)DNA或RNA、激素和激素受体，以及离子和 螯合剂，等等。存在天然受体的配体包括天然和合成蛋白，包括抗 生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白、抗体、酶和激素；核苷酸和天然 或合成寡核苷酸，包括RNA以及单链和双链DNA的引物；脂质； 多糖和糖；以及各种药物，包括治疗性药物及滥用药物和杀虫剂。 当官能团为钙、钠、镁、钾或其它生物学重要的金属离子的螯合剂 时，含这种官能团的底物起离子指示剂作用。或者，这种底物可起pH 指示剂作用。优选离子指示剂的可检测光学反应是荧光变化。
含突变水解酶或其融合体的样品通常以被动方法标记，即与底 物温育。但是，任何将底物引入到含突变水解酶或其融合体的样品 中的方法，例如将底物微注射入细胞或细胞器中，都可用于将底物 引入到含突变水解酶或其融合体的样品中。本发明底物在使用浓度 范围内一般来说对活细胞和其它生物组分无毒。
含突变水解酶或其融合体的样品可在与本发明底物接触后立即 观测。含突变水解酶或其融合体的样品在标记过程中任选与其它溶 液混合，包括清洗溶液、透化和/或固定溶液以及其它含另外的检测 试剂的溶液。在与底物接触后进行清洗一般可改善对光学反应的检 测，因为在清洗后非特异性本底下降。使用较低标记浓度而不清洗 有可能获得令人满意的显现。许多固定剂和固定条件是本领域已知 的，包括甲醛、多聚甲醛、福尔马林、戊二醛、冷甲醇和3∶1的甲醇∶ 乙酸。固定通常用于保存细胞形态学，并在使用病原样品的工作中 降低生物危害。所选实施方案的底物完好地保留在细胞中。按照本 领域周知的方法，固定任选在透化之后或和透化一起，所述透化例 如用丙酮、乙醇、DMSO或其它变性剂，以使大量本发明底物穿越 细胞膜。底物的使用任选与其它检测试剂的使用组合，所述其它检 测试剂由于在含突变水解酶或其融合体的样品中存在特定细胞组 分、胞内物质或细胞环境而产生可检测反应。在所述其它检测试剂 和底物的波谱特性不同时，有可能进行多色应用。
在与含光学特性官能团的底物接触之后或过程中的任何时间， 用产生可检测光学反应的波长的光照射含突变水解酶或其融合体的 样品，并用检测光学反应的方法观测。尽管某些底物可使用环境光 以比色法检测，但其它底物通过母体荧光团的荧光特性检测。在用 例如紫外或可见波长发射灯、弧光灯、激光乃至日光或普通室内光 照射时，包括结合有特异性结合对互补成员的底物在内的底物，表 现出强烈的可见吸收以及荧光发射。选择用于照射本发明底物的设 备包括但不限于手持式紫外灯、汞弧光灯、氙灯、氩激光器、激光 器二极管和YAG激光器。这些发光源任选整合到激光扫描器、荧光 微量培养板读数器、标准或小型荧光计或色谱检测器中。任选通过 目测、或应用任一种以下设备：CCD照相机、摄影机、感光胶片、 激光扫描仪、荧光计、光电二极管、量子计数器、落射荧光显微镜、 扫描显微镜、流式细胞仪、荧光微量培养板读数器、或通过放大信 号的装置如光电倍增管，检测该比色吸收或荧光发射。在使用流式 细胞仪、荧光显微镜或荧光计检测含突变水解酶或其融合体的样品 时，所述设备任选用于辨别和区分含官能团(为荧光团)的底物和具有 可检测的不同光学特征的第二荧光团，通常通过辨别底物和第二荧 光团的荧光反应。在使用流式细胞仪检测含突变水解酶或其融合体 的样品时，含突变水解酶或其融合体的样品的检测任选包括使用分 选仪，根据底物荧光反应分离样品中含突变水解酶或其融合体的微 粒。
在一个实施方案中，使用突变水解酶和含官能团的对应底物来 标记细胞，例如生物体中的细胞，如转基因动物中的细胞、给予了 含突变水解酶和/或本发明底物的细胞的动物中的细胞、或培养物中 的细胞或细胞组分。例如，使细胞与突变水解酶编码载体接触，例 如编码突变水解酶和核定位信号融合体的载体。载体在转基因动物 中的细胞或给予动物的细胞中的表达可为瞬时的、可调节的或稳定 的。然后使该细胞或含该细胞的动物与突变水解所酶识别的本发明 底物接触。或者，使细胞与载体和底物同时接触。然后检测或测定 官能团在动物、细胞、其裂解物或其亚细胞组分中的存在或定位。 在另一个实施方案中，使用突变水解酶和含包含三重态感光剂的官 能团的对应底物，选择性失活或破坏例如细胞中的分子和/或细胞活 性。在该实施方案中，在含突变水解酶或其融合体的样品与含三重 态感光剂的底物接触后，使样品对UV光曝光。
为在体外或体内标记蛋白，可将水解酶底物连接至氨基酸或 tRNA，例如氨酰化tRNA，如用于体外合成蛋白N末端修饰的氨酰 化起始密码子甲硫氨酰tRNA，连接至用于蛋白质C-末端标记的琥珀 抑制基因tRNA，包括使用突变tRNA合成酶将氨基酸连接至tRNA。 还可通过内含肽介导法将水解酶底物连接至蛋白。目标蛋白作为与 羧基末端内含肽结构域的融合蛋白表达，优选作为与缺乏归巢内切 核酸酶结构域的“微型内含肽”的融合蛋白表达，更优选作为与蟾 分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)(Mxe)GyrA微型内含肽的融合蛋白 表达。在半胱氨酸-水解酶底物如半胱氨酸-卤代烷存在下，用还原性 硫醇试剂如还原型2-巯基乙磺酸钠或2-巯基乙醇处理融合蛋白，导 致融合蛋白在融合体内含肽部分的氨基末端半胱氨酸残基处裂解， 以及半胱氨酸-水解酶底物如半胱氨酸-卤代烷与目标蛋白羧基末端共 价连接。
因此，蛋白质可由cDNA或mRNA表达，而不需要制备融合蛋 白，这些蛋白可使用突变水解酶纯化。而且，例如使用固定化突变 水解酶，可由体外翻译蛋白制备蛋白微阵列，而不需要融合标签， 分离这些蛋白以及与这些蛋白相互作用的蛋白。此外，使用含荧光 团的底物允许快速检测以及纯化所表达的蛋白。为在细胞中体内标 记蛋白，可使用含甲硫氨酸或其它天然或非天然氨基酸的底物，可 任选使用固定化突变水解酶纯化新合成的蛋白以及与这些蛋白相互 作用的蛋白，而不需要融合标签。该方法还可用于分离用于差示蛋 白表达分析的标记蛋白，也可用于质谱。还有可能使用具有不同荧 光团的底物进行多重应用。
本发明的底物和突变水解酶尤其可用于分离、展示或检测样品 中的分子。在一个实施方案中，可制备蛋白微阵列，其中突变水解 酶固定在固相支持体表面上，为了固定蛋白，修饰本发明底物使其 包含一个或多个能结合信号蛋白、功能或结构类蛋白或通常的蛋白 的官能团(图57)。例如，使用融合蛋白系统如硫氧还蛋白斑块(patch)、 内含肽型方法或其它方法将突变水解酶固定在固体表面上。然后加 入修饰底物以固定蛋白。可用琥珀酰亚胺酯/醛(用于蛋白的一般固定 化)、谷胱甘肽(用于固定GST融合蛋白)、NTA或金属(用于固定His- 标记蛋白)或用于固定特定类型蛋白的特异性配体来修饰底物。例如， 可使用酶底物或连接至水解酶底物的酶抑制剂固定特定类型的酶， 例如胱天蛋白酶或逆转录酶，或者可使用结合连接有水解酶底物的 蛋白的DNA，制备用于DNA结合蛋白的蛋白微阵列，例如用于开 发芯片型检测。同样，为研究蛋白-蛋白相互作用、包括分离蛋白复 合物，可将突变水解酶固定在磁性或非磁性粒子上，例如MagneSil 粒子。这些方法可避免制备新融合蛋白，例如新文库，因为仅需要 制备目标蛋白的底物，例如GST融合体文库的底物。
或者，可将底物固定在表面上，以允许突变水解酶或其融合体 稳定连接在表面上。突变水解酶可得自活细胞或通过无细胞方法获 得，例如在细胞裂解物中的偶联性转录和翻译。结合的蛋白可用于 分析结合其它分子或酶活性等特征。其还可用于稳定固定用于生物 转化或检测能力的酶活性。其还可用于稳定固定用于纯化或选择性 吸附能力的特异性结合活性。多种底物可在不同位置或作为混合物 固定在所述表面上，以允许多种底物水解酶的连接。底物还可用其 它结合分子如生物素或对位取代苄基鸟嘌呤来固定。
在一个实施方案中，可使用突变水解酶融合体鉴别结合该融合 体的蛋白。可通过将突变水解酶与固定在表面上的底物结合，分离 结合所述融合蛋白的蛋白和其它未结合蛋白。凭借此方法，可由固 定的结合蛋白中洗去溶液中未结合的蛋白。还可通过该方法鉴别结 合所述融合蛋白的其它分子，例如核酸或小分子。为增加结合有突 变水解酶的分子的结合稳定性，可使用各种化学交联法共价互连所 述结合分子。优选可逆性交联剂，以使结合的分子随后可去结合， 用于例如鉴别和/或分离的分析。
在混合突变水解酶和底物之后，可能必须失活混合物中剩余的 未反应底物。这可通过向混合物中加入野生型水解酶以将未反应底 物转变为产物来进行。例如，可通过加入野生型或其它有催化能力 的脱卤素酶将未反应氯代烷底物转变为对应醇。未反应底物在溶液 中可为游离的，或结合至表面。如果结合至表面，则应加入有催化 能力的脱卤素酶使所述底物转变为其对应产物，由此防止突变水解 酶与表面的进一步结合。
本发明的底物和突变水解酶还可用于串联亲和纯化(TAP)，这是 一种纯化蛋白或蛋白复合物的方法，使用两个连续的亲和纯化步骤。 各个纯化步骤均使用融合至目标蛋白的亲和标签配体，所述亲和标 签例如为His-标签、GST-标签、Strep-标签、生物素标签、免疫球蛋 白结合域(例如IgG结合域)、钙调蛋白结合肽等。本发明的突变水解 酶可用作亲和标签。例如，可通过将钙调蛋白连接至固相，接着将 水解酶底物连接至固相，纯化含突变水解酶和钙调蛋白结合肽(CBP) 或其蛋白复合物的融合体。然后通过蛋白质印迹分析或质谱来分析 纯化的蛋白或复合物。使用TAP，可由各种类型的宿主细胞如细菌、 果蝇、植物、哺乳动物细胞以及无细胞蛋白表达系统纯化蛋白或蛋 白复合物，并可鉴别蛋白-蛋白相互作用。在TAP中应用突变水解酶 和水解酶底物，例如用于最终的亲和纯化步骤，使得可以实时分析 蛋白，接着在各个时间点或在各种药物治疗后进行TAP。因为突变 水解酶融合体共价连接至底物，所以纯化的蛋白复合物不含水解酶。
在另一个实施方案中，生物素化底物与抗生物素蛋白标记的结 合抗原的抗体结合。该复合物可进行免疫沉淀，例如通过使用含固 定化突变水解酶的Eppendorff管(图58)。
为检测某些分子，可使用溶液(游离)或固定化系统。在一个实施 方案中，用小分子或化合物修饰的水解酶底物可用于检测所连接的 小分子或化合物的修饰。例如，为检测激酶如磷脂酰肌醇3(PI3)激 酶，使例如磷脂酰肌醇的脂质修饰的水解酶底物与含使磷脂酰肌醇 磷酸化的PI3激酶的样品接触。然后将获得的修饰水解酶底物共价连 接至所述水解酶。通过电泳或荧光方法检测磷酸化的磷脂酰肌醇。 电泳检测方法包括使用放射性标记的核苷酸如γ32PATP进行标准激酶 检测，接着进行放射自显影，或使用与Ga3+或Fe3+络合的荧光标记NTA 进行荧光检测。Ga3+或Fe3+给合的NTA与磷酸基团的特异性结合，使 得可以电泳检测磷酸化的磷脂酰肌醇。还可使用FRET或荧光偏振(FP) 在游离溶液中检测PI3激酶活性。为此，可使用含荧光标记磷脂酰肌 醇的水解酶底物。使用与Ga3+或Fe3+络合的不同荧光标记的NTA检 测磷酸化的磷脂酰肌醇。对于荧光偏振(FP)，将含非荧光磷脂酰肌醇 的水解酶底物加入到待测样品中，接着加入Ga3+或Fe3+。加入所获得 的水解酶底物，以固定或游离突变水解酶。使用可结合Ga3+或Fe3+的 荧光标记NTA检测荧光偏振。
为检测磷酸二酯酶，可使用含荧光标记的cAMP和不同荧光团 的水解酶底物。cAMP水解指示磷酸二酯酶活性。可在用游离或固定 化脱卤素酶(例如以蛋白微阵列形式)捕获底物后，使用FRET检测磷 酸二酯酶活性。
可使用连接至水解酶底物的核酸分子，纯化或展示其它核酸分 子、蛋白或基于蛋白的复合物。对于核糖体展示或纯化，例如用于 定向进化，可将水解酶底物结合至无终止密码子的mRNA的3′末端。 将底物加入到体外翻译混合物中，并使用固定化突变水解酶纯化获 得的蛋白-DNA-mRNA复合物。同样，为分离、检测或展示特定基 因，使用基于荧光的方法如FRET，使用水解酶底物分离、检测或展 示复杂混合物中的该基因，其中所述水解酶底物含可结合目标基因 的荧光团标记的DNA或RNA(例如荧光团标记的单链DNA)以及不 同的荧光团或猝灭剂。这样的方法可用于诊断学以及生物武器检测。
本发明的底物和突变水解酶可以各种形式用于检测cAMP(图 59A-B)。在一个实施方案中，荧光猝灭以两种融合蛋白和两种底物 的形式使用。一种底物包括荧光团，而另一种底物包含该荧光团的 猝灭染料。一种融合蛋白包含突变水解酶和PKA调节亚基，而另一 种融合蛋白包含突变水解酶和PKA催化亚基(图59A)。使各个融合 蛋白与其中一种底物接触，然后将复合物混合在一起。在cAMP存 在下，猝灭染料不再接近荧光团。因此，通过检测荧光来检测cAMP。 在另一个实施方案中，使用各自具有不同荧光团的两种水解酶底物， 通过检测FRET来检测cAMP。
在另一个实施方案中，一种融合蛋白包含第一种突变水解酶和 PKA调节亚基，另一种融合蛋白包含与第一种突变水解酶不同并结 合第二种底物的蛋白(第二种蛋白)和PKA催化亚基。所述突变水解 酶结合含至少一个荧光团的水解酶底物。第二种蛋白结合用所述至 少一个荧光团的猝灭剂修饰的第二种底物，所述猝灭剂不影响底物 与第二种蛋白的结合。第二种蛋白可为GST、硫氧还蛋白、AGT、 不同于第一种突变水解酶的对不同底物特异性的突变水解酶、能够 结合与第一种突变水解酶相同的底物的突变水解酶或其它底物结合 蛋白。使各种融合蛋白与各自底物接触，将复合物混合在一起，通 过检测荧光来检测cAMP。在cAMP存在下，猝灭剂染料不再接近 荧光团。在另一个实施方案中，第二种蛋白结合用与连接水解酶底 物的荧光团不同的荧光团修饰的第二种底物，所述不同的荧光团不 影响第二种底物与第二种蛋白的结合。使各种融合蛋白与各自底物 接触，将复合物混合在一起，使用FRET来检测cAMP。在cAMP存 在下，两种荧光团不再接近。在又一个实施方案中，一种融合蛋白 含突变水解酶和PKA调节亚基，另一种融合蛋白含荧光蛋白和PKA 催化亚基。荧光蛋白包括但不限于GFP、YFP、EGFP和DsRed。使 各种融合蛋白与各自底物接触，然后将复合物混合在一起。在cAMP 存在下，荧光蛋白和结合了含荧光团底物的突变水解酶不再接近。 在另一个实施方案中，使用BRET检测cAMP。使一种含荧光团的底 物与含突变水解酶和PKA调节亚基的融合蛋白以及含萤光素酶和 PKA调节亚基的另一种融合蛋白接触。当各种融合蛋白的调节亚基 二聚化时，观测BRET。BRET在cAMP存在下被破坏(参见图59B)。
突变水解酶和底物可用于分子印迹，分子印迹是一种设计用于 产生为分析物特异性的聚合材料的技术。分子印迹是一种制备对特 定化合物(印刷分子)具有选择性的聚合物的方法(Arshady等，1981)。 该技术包括：(1)预排列印刷分子和单体，使得可发生互补相互作用(非 共价或可逆共价)；(2)在印刷分子-单体复合物周围进行聚合，和(3) 通过萃取由聚合物中去除印刷分子。聚合作用由此保留了与印刷分 子的互补性，聚合物将选择性地吸附印刷分子。具有水解酶底物的 分子印迹聚合物(MIPS)结合水解酶及其融合体，可用于纯化融合蛋 白、制备蛋白微阵列、研究蛋白-蛋白相互作用和TAP。
底物的官能团可以可逆或共价结合另一种蛋白。可逆结合蛋白 的官能团的实例为结合抗体如单链抗体(scFv)的半抗原。共价结合另 一种蛋白的官能团的实例为结合突变脱卤素酶的氯代烷，或为可结 合O-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)的对位取代的苄基鸟嘌呤。 含突变水解酶的第一种融合蛋白可结合至作为执行或调节生物化学 或生物学过程的工具的第二种蛋白。例如，可通过融合至与转录活 化物(例如VP16)结合的突变水解酶的DNA结合蛋白来调节基因转 录。在此实例中，通过加入底物使突变水解酶融合至DNA结合蛋白 以结合转录活化物，而增加基因转录。在另一个实例中，可利用其 在细胞中的定位调节细胞中的蛋白活性。例如，可通过使蛋白与融 合至第二种蛋白的突变水解酶结合，其中所述突变水解酶在结合时 将所述蛋白再引导或优选再分配至不同的亚细胞区室，从而改变蛋 白活性。实例可为主要位于细胞的非核内部分的转录因子，其在结 合至与核靶向序列融合的突变水解酶时导致转录因子向细胞核移 动。在此实例中，加入底物引起转录因子与突变水解酶结合，可由 此调节由所述转录因子介导的基因表达。
底物可具有多个反应基团，以允许和突变水解酶互连。当融合 至具有结合活性的蛋白时，突变水解酶的互连可产生多价结合复合 物。这样的多价复合物可具有有用的特性，例如较高的表观结合效 力(例如较高亲和力)。例如，互连两个或多个单链抗体可导致与对应 抗原的更有效结合。在另一个实例中，当加入底物以互连突变水解 酶时，融合至突变水解酶的λ噬菌体阻抑蛋白的DNA结合域可更有 效地结合DNA。具有融合至突变水解酶的不同结合蛋白的多价复合 物可允许不同的分子如抗原经复合物结合在一起。
使突变水解酶融合在一起，可使多个底物结合于单个蛋白上。 这些底物可相同或不同。凭借此方法，融合的突变水解酶可用作底 物之间的桥接分子。这可用于使分子，例如官能团、表面或其它分 子共价互连。例如，结合于表面的底物可通过使用双价融合突变水 解酶共价连接至结合于底物的多核苷酸。可通过融合不同的突变水 解酶或将突变水解酶融合至能够产生稳定共价键的其它蛋白如 AGT，制备杂多价分子。
在一个实施方案中，底物包含不止一个官能团，例如光学可检 测分子和接受分子的配体；两种不同的蛋白，例如AGT和荧光蛋白 或萤光素酶；光学可检测分子和蛋白酶识别位点；或光学可检测分 子子和蛋白酶识别位点以及光学可检测分子的猝灭剂。例如，本发 明底物可包含荧光团、蛋白酶识别位点和猝灭剂分子。底物可被表 达突变水解酶的细胞吸收。在蛋白酶存在下，猝灭剂由底物中去除， 产生荧光信号。使用此底物可获得对蛋白酶的实时检测。所述突变 体还可用于检测传染物，因此可用于临床诊断用途以及检测生物武 器。
可使用其它形式来检测蛋白酶，例如胱天蛋白酶或蛋白体，例 如可用分支肽底物检测(或分离)20S蛋白体。在一个实施方案中，在 哺乳动物细胞型表达系统中使用突变水解酶或另一种报告蛋白如萤 光素酶的基因。在一个实施方案中，将蛋白酶(如胱天蛋白酶)识别位 点导入到作为转录阻抑蛋白(例如tet阻抑蛋白或lac阻抑蛋白)的蛋白 中。在一个实施方案中，将蛋白酶识别位点导入到阻抑蛋白的环状 区中或不抑制蛋白的阻抑功能的另一个区中。将含连接至DNA的启 动子的载体导入含修饰型转录阻抑蛋白的细胞中，其中所述DNA结 合连接至报告基因的转录阻抑蛋白。在没有蛋白酶时，修饰型转录 阻抑蛋白抑制报告基因的表达。在存在蛋白酶时，修饰型转录阻抑 蛋白由于蛋白酶位点的蛋白酶剪切而失活。结果，修饰型转录阻抑 蛋白不能阻抑转录，这导致报告基因表达(图60A)。在一个实施方案 中，将修饰型转录阻抑蛋白基因和/或报告基因稳定转染入细胞中。 这样的检测可与其它检测联合使用，所述其它检测包括使用不同报 告基因的检测和/或用于检测不同分子(例如不同蛋白酶)的检测以供用 于多重化。所述检测还可用于检测传染物，例如用于临床诊断用途 以及检测生物武器。
在一个实施方案中，突变水解酶和另一种蛋白的融合体用于染 色质免疫沉淀。含突变水解酶和DNA结合蛋白的融合体在细胞中表 达。在一段时间的温育之后，固定、超声处理细胞，并用具有水解 酶底物的固相支持体分离染色质-杂种蛋白复合物，或通过超声裂解 细胞，通过使用连接至固相支持体的水解酶底物分离染色质复合物。 通过洗涤，去除未结合的复合物或蛋白，接着使融合蛋白与染色质 交联，或将含官能团如生物素的水解酶底物加入到细胞中，并温育 一定时间段。然后对细胞进行固定、超声，用例如连接有链霉抗生 物素蛋白的固相支持体分离染色质复合物。使用扩增反应表征分离 的染色质。
在又一个实施方案中，突变水解酶与核酸结合蛋白的融合体用 于体外核酸结合实验。所述融合体固定在含水解酶底物的固相支持 体上。温育细胞裂解物或纯化的核酸，通过凝胶电泳或聚合酶反应 检测固定化融合蛋白和结合的核酸。或者，将所述融合体固定在含 水解酶底物的电化学敏感表面上。通过电化学改变测定核酸结合。 这些方法可用于对两种或多种核酸结合蛋白的高通量检测以及多重 检测。
在另一个实施方案中，使用3种载体：一种载体表达GAL4、蛋 白酶识别位点和VP16融合体；第二种载体包含连接至与转录阻抑蛋 白基因相连的GAL4结合位点的启动子；第三种载体包含连接至与 报告基因连接的转录阻抑蛋白结合位点的启动子(图60B)。GAL4融 合体与GAL4结合位点的结合导致RNA聚合酶组成型转录活化。当 转录阻抑蛋白组成型表达时，报告基因的表达受到抑制。但是，在 蛋白酶存在下，GAL4和VP16分开，转录阻抑蛋白未合成。这导致 报告基因表达。在其它实施方案中，可使用分裂泛素(split ubiquitin)(参 见美国专利第5,503,977号)或腺苷酸环化酶、鸟苷酸环化酶和/或其 调节物(参见美国专利第6,333,154号)系统。这样的系统可用于使用 两种或多种不同报告蛋白组合(例如萤光素酶和GFP，或萤光素酶和 突变水解酶)的多重检测、用于蛋白酶多重检测(例如使用两种或多种 蛋白酶识别位点的组合)、用于蛋白酶(例如胱天蛋白酶)抑制剂筛选 检测。所述检测可用于检测传染物，例如用于临床诊断实验以及检 测生物武器。
在又一个实施方案中，使用细胞型实验检测一种或多种蛋白酶 (图60C)，其中所述细胞型实验使用由于存在降解/不稳定结构域(“蛋 白去稳定序列”)而具有短或缩短的半寿期的报告蛋白，例如突变水 解酶或萤光素酶。将蛋白酶(例如胱天蛋白酶)位点导入到报告蛋白和 蛋白去稳定结构域之间。在没有蛋白酶时，报告蛋白被快速降解。 在有蛋白酶时，去稳定序列被去除，导致报告蛋白具有较长半寿期。 这样的系统可用于使用两种或多种不同报告蛋白组合(例如萤光素酶 和GFP，或萤光素酶和突变水解酶)的多重检测、使用两种或多种蛋 白酶组合的多重检测或用于蛋白酶或胱天蛋白酶抑制剂筛选检测。
在一个实施方案中，可使用本发明突变水解酶的融合体监测胞 内移动。例如，β-抑制蛋白是G蛋白偶联受体的调节剂，其在被活 化时由胞质向细胞膜移动。含突变水解酶和β-抑制蛋白的融合体的细 胞和本发明底物允许检测β-抑制蛋白由胞质向细胞膜的移动，因为β- 抑制蛋白与活化的G蛋白偶联受体相结合。该实验可用于检测传染 物，因此可用于临床诊断用途以及检测生物武器。
可使用其它形式来检测蛋白酶，例如胱天蛋白酶。在一个实施 方案中，通过将蛋白酶位点掺入到融合体接合处，构建突变水解酶 和另一种报告蛋白(例如萤光素酶)的融合体。将此融合蛋白固定在固 相支持体上，并用于检测样品中的蛋白酶。将具有融合蛋白的固相 支持体与测试样品裂解物和/或分离的蛋白酶温育。在温育一定时间 段后，取出裂解物，分析其报告蛋白的存在情况。在存在蛋白酶时， 报告蛋白如萤光素酶由固相支持体释放入溶液中。该实验可以蛋白 微阵列或多孔形式使用，并可与其它检测联用，其中所述其它检测 包括使用不同报告基因的检测和/或用于检测不同分子(例如不同蛋白 酶)的检测以供多重化。所述方法还可用于检测传染物，因此可用于 临床诊断用途以及生物武器检测。
在另一个实施方案中，FRET可与突变水解酶和荧光蛋白(例如 GFP)的融合体一起使用，或与突变水解酶和荧光分子结合蛋白(例如 O-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT))的融合体一起使用(Keppler等， 2003)。或者，可使用突变水解酶和目标蛋白的融合体以及荧光蛋白 和推测与目标蛋白相互作用的分子的第二种融合体，研究目标蛋白 与所述分子的相互作用，例如使用FRET。一种细胞可包含突变水解 酶和目标蛋白的融合体，而另一种细胞可包含荧光蛋白和推测与目 标蛋白相互作用的分子的第二种融合体。具有这两种细胞的群体可 与底物和物质(例如药物)接触，此后监测细胞，以检测物质给予对两 个群体的影响。在一个实施方案中，可使用突变水解酶与目标蛋白(所 述目标蛋白与第二种蛋白相互作用)的融合体以及含第二种蛋白和突 变水解酶的第二种融合体，研究目标蛋白与第二种蛋白的相互作用， 或检测与一种或两种蛋白相互作用并改变其相互作用(例如PKA调节 亚基、PKA催化亚基和cAMP)的分子。在此实施方案中，可使用具 有至少一种不同官能团的两种底物。
在又一个实施方案中，突变水解酶融合至荧光蛋白。因此，可 通过检测荧光蛋白或通过使细胞与本发明底物接触并检测底物中的 官能团，检测细胞中的融合蛋白。可在检测官能团之前进行荧光蛋 白的检测。或者，可在检测荧光蛋白之前进行官能团的检测。而且， 这些细胞可与另外的底物接触，例如与具有不同官能团的底物接触， 检测细胞中的不同官能团，所述官能团共价连接至第一种底物先前 不结合的突变水解酶。
在又一个实施方案中，可使用突变水解酶和转录因子的融合体 监测转录活化途径的活化。例如，突变水解酶与胞质中存在的无活 性形式但在活化时被转运至细胞核的转录因子(例如NFκβ)的融合 体，可监测转录活化途径。
在另一个实施方案中，使用生物素作为底物中的官能团，融合 体包含融合至推测与细胞中另一种分子(例如蛋白)相互作用的目标蛋 白的突变水解酶。使用这种试剂使得可以捕获在细胞中与融合至突 变水解酶的蛋白相互作用的另一种分子，由此鉴定和/或捕获(分离)相 互作用分子。
在一个实施方案中，突变水解酶融合至分泌性蛋白。使用该融 合体和本发明底物可检测和/或监测所述分泌性蛋白。同样，当突变 水解酶融合至在不同囊泡区室之间转运的膜蛋白时，在底物存在的 情况下，可检测这些区室中的蛋白加工。在又一个实施方案中，当 突变水解酶融合至离子通道或转运蛋白或紧密结合通道或转运蛋白 的蛋白时，在含离子敏感型荧光团的本发明底物存在的情况下，可 监测离子穿越细胞膜或细胞器膜的移动。同样，当突变水解酶融合 至与囊泡或细胞骨架结合的蛋白时，在底物存在的情况下，可容易 地检测蛋白或囊泡沿着细胞骨架结构的转运。
在另一个实施方案中，所述官能团为药物或毒素。通过混合具 有所述官能团的底物和突变水解酶与靶向分子(如抗体，例如结合具 体肿瘤细胞相关抗原的抗体)的融合体，可将药物或毒素靶向细胞或 动物中。或者，所述官能团可为荧光团，当其存在于底物中并与突 变水解酶和靶向分子(如单链抗体)的融合体混合时，标记该靶向分 子，例如用于体外应用如ELISA的标记抗体。
在又一个实施方案中，当与细胞表面上表达的蛋白融合时，细 胞表面上的突变水解酶在其与本发明底物(例如含荧光团的底物)混合 时，可用于监测体内或体外的细胞迁移(例如癌细胞迁移)。在一个实 施方案中，本发明底物对细胞膜的透过性低或没有透过性。或者， 可使用这种体系监测不同物质(例如药物)对不同细胞群的作用。在又 一个实施方案中，突变水解酶融合至HERG通道。在含K+敏感型荧 光团的本发明底物存在时，可使用表达这种融合体的细胞监测HERG 通道活性，例如监测药物毒性。在又一个实施方案中，这样的融合 体可在血细胞表面上表达，例如导入到动物中的外源细胞或其基因 组经过修饰从而表达此融合蛋白的转基因动物中的内源细胞。
在另一个实施方案中，本发明底物包含用于监测细胞或生物体 中疏水区的官能团，例如Nile Red。
因此，本发明的突变水解酶和底物可用于各种测定，例如噬菌 体展示、淘选、ELISA、质谱、蛋白质印迹、荧光微量测定技术(FMAT)、 全动物成像、X射线成像以及细胞和亚细胞染色，或作为生物传感 器。例如，将表达或含突变水解酶或含突变水解酶的融合蛋白的细 胞导入(例如植入或注射入)动物中，例如人或非人动物，包括非人哺 乳动物或非人灵长类动物。细胞可被瞬时转染，或稳定表达突变水 解酶或其融合体，或另与突变水解酶或其融合体接触，以便突变水 解酶或其融合体与细胞结合。可使用不同的细胞类型，包括但不限 于细胞系、初级培养物或干细胞(例如胚胎或成体干细胞)。在一个实 施方案中，使表达或包含突变水解酶的细胞与本发明的水解酶底物 接触，然后导入到动物中。在另一个实施方案中，在表达或含突变 水解酶的细胞导入到动物之前或之后将本发明水解酶底物导入到动 物中。检测或测定全动物或组织制备物(包括但不限于组织活检样品 或切片、分离自生理样品的细胞或匀浆组织)或生理性液体样品(例如 血样等)中的水解酶底物官能团的存在、位置或量。突变水解酶、含 突变水解酶的融合体和/或本发明的一种或多种底物可单独或与其它 光学或核报告系统(例如荧光蛋白、萤光素酶、放射性核素等)一起用 于例如使生物过程成像、使内源基因的转录调节成像以及使细胞(骨 髓衍生细胞、血细胞等)转移成像。光学成像系统包括用于显微分辨(例 如落射显微分辨、共焦显微分辨和双光子、介观分辨)的光成像系统， 例如光学投影层析、光学相干断层扫描或激光散斑成像；以及用于 具有固有对比度或分子对比度的宏观分辨的光学成像系统，例如高 光谱成像、内窥镜、偏振成像、荧光反射成像、扩散光层析(diffuse opticaltomography)、荧光共振成像、荧光分子成像或发光成像。
本发明的突变水解酶、含突变水解酶的融合体和/或一种或多种 底物还可与不同光学密度剂/造影剂结合使用，所述试剂可用作单独 的药剂或化学连接至水解酶底物。在一个实施方案中，将含造影剂 的水解酶底物导入到含表达突变水解酶或其融合体的细胞的动物(例 如具有突变水解酶或其融合体编码基因的转基因动物)中。在另一个 实施方案中，将含造影剂的水解酶底物导入到表达突变水解酶或其 融合体的细胞中，并将这些细胞导入到动物中。然后可使用X-射线、 MRI或其它技术检测造影剂。
在一个实施方案中，使用突变水解酶与另一种蛋白的融合体以 及结合至电化学敏感表面的水解酶底物来检测例如生理分子的分 子，即它们用作生物传感器。例如，所述表面包含固定化水解酶底 物，通过电化学改变测定待测溶液中目标分子的存在情况。例如， 将含突变水解酶和葡糖氧化酶的融合体固定在具有水解酶底物的铂 电极、金表面、金纳颗粒或碳纳管上。加入待测样品，测定待测样 品中葡萄糖的存在情况或量。同样，可使用固定在电化学敏感表面 上的突变水解酶-胆固醇氧化酶融合体，测定待测样品中的胆固醇。
在另一个实施方案中，突变水解酶可用作检测蛋白酶、蛋白酶 抑制剂、激酶或激酶抑制剂等用的生物传感器。例如，将蛋白酶位 点融合至突变水解酶蛋白，将获得的融合体固定在具有水解酶底物 的电化学敏感表面上，例如电极、金表面、金纳颗粒或碳纳管。在 存在例如蛋白酶或激酶的分子时，分子量有变化，此变化可通过电 化学改变来检测。这些变化的抑制剂包括与突变水解酶融合的蛋白 的抑制剂，例如蛋白酶抑制剂，其也可使用此方法检测。
在另一个实施方案中，突变水解酶例如在突变水解酶的C末端 缀合至非水解酶底物的底物，和/或突变水解酶和蛋白的融合体缀合 至非水解酶底物的底物。生物传感器表面包含固定化水解酶底物。 通过电化学改变，测定测试溶液中生物分子的存在情况。所述方法 可用于捕获、结合某些分子或提供检测某些分子的工具，并可用于 检测杀虫剂、工业毒性化合物、临床诊断剂、传染物和生物武器。 在一个实施方案中，该方法可用于检测包括但不限于蛋白酶、蛋白 酶抑制剂、激酶、激酶抑制剂的分子，以及检测蛋白的翻译后修饰。
本发明将通过以下的非限制性实施例进一步描述。
实施例I
一般方法学
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语都和分子 生物学以及细胞信号转导和建模领域一般技术人员通常理解的含义 相同。一般来说，本文使用的术语和下述波谱学、药物开发、细胞 培养、分子遗传学、塑料生产、聚合物化学、诊断学、氨基酸和核 酸化学以及烷烃化学中的实验室步骤在本领域众所周知并经常使 用。标准技术通常用于塑料制备、信号检测、重组核酸方法、多核 苷酸合成以及微生物培养和转化(例如电穿孔、脂转染)。
所述技术和步骤一般按照本领域的常规方法和各种一般参考文 献(一般参见Sambrook等，Molecular Cloning：A laboratory manual，第 2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor， N.Y.，和有关于荧光技术的Lakowicz，J.R.Principles of Fluorescence Spectroscopy，New York：Plenum Press(1983)，这些文献在此引入作为 参考)以及本文中提供的参考文献进行。标准技术用于化学合成、化 学分析和生物测定。
材料
所有的寡核苷酸都由Promega Corporation(Madison，WI)或衣阿 华大学DNA实验室(University of Iowa DNA Facility，Iowa City，Iowa) 合成、纯化和测序。限制酶和DNA修饰酶得自Promega Corporation (Madison，WI)、New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)或Stratagene Cloning Systems(La Jolla，CA)，并按照生产商的方法使用。感受态大 肠杆菌JM109由Promega Corporation提供，或购自Stratagene Cloning Systems。使用Qiagen Plasmid Mini Kit(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA) 进行小规模的质粒DNA分离。用购自Stratagene Cloning Systems的 预试验试剂盒进行DNA连接。用购自Qiagen Inc的QIAquick凝胶 提取试剂盒或QIAquick PCR纯化试剂盒纯化DNA片段。
用于产生DhaA突变体及其融合体的载体如下：pET21(Invitrogen， Carlsbad，CA)、pRL-null (Promega，Madison，WI)、 pGEX-5x-3 (Amersham Biosciences；Piscataway，NJ)以及EGFP和DsRED2(都得 自CLONTECH，Palo Alto，CA)。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶和相关的缓冲液和染色剂，以及电印迹转 移缓冲液，都得自Bio Whittaker Molecular Applications(Rockland， ME)。蛋白分子量标准品购自Invitrogen。
Anti FlagR单克隆抗体抗体(抗FLAGR M2单克隆抗体(小 鼠)(F3165))、Anti FlagR M2 HRP缀合物和Anti FlagRM2 FITC缀合物 (分别为A8592和F4049)来自Sigma-Aldrich。抗海肾萤光素酶单克隆 抗体(MAB4410)来自Chemicon(Temecula，CA)。HRP缀合山羊抗小 鼠IgG和HRP缀合链霉抗生物素蛋白(分别为W4021和G714)来自 Promega Corporation。
1-Cl-丁烷、1-Cl-己烷、1-Cl-辛烷、1-Cl-癸烷、1-Cl-丁醇、1-Cl- 己醇、1-Cl-辛醇和1-Cl-癸醇得自Aldrich或Fluka(USA)。所有的盐、 磷酸二氢钾、磷酸一氢钾、咪唑、HEPES、EDTA钠、硫酸铵和Tris 游离碱得自Fisher(Biotech Grade)。
谷胱甘肽Sepharose 4 FF、谷胱甘肽、MonoQ和Sephadex G-25 预填装柱得自Amersham Biosciences。
Luria-Broth(“LB”)由Promega Corporation提供。
方法
PCR反应。使用Promega Corp.提供的标准聚合酶链式反应缓冲 液进行DNA扩增。通常，50μl反应物包含1x浓度的生产商提供的 缓冲液、1.5mM MgCl2、125μM dATP、125μM dCTP、125μM dGTP、 125μM dTTP、0.10-1.0μM正向和反向引物、5U AmpliTaqDNA 聚合酶和＜1ng靶DNA。除非另有说明，否则DNA扩增的热程序 是：94℃0.5分钟；55℃1分钟以及72℃1分钟，35个循环。
DNA测序。使用双脱氧末端循环测序法(Sanger等，1977)和 Perkin-Elmer 310型DNA测序仪(Foster City，CA)，通过DNA测序验 证所有克隆。
SDS-PAGE。将蛋白溶解在样品缓冲液(1％SDS、10％甘油和1.0 mM β-巯基乙醇，pH 6.8；Promega Corporation)中，煮沸5分钟，并 在SDS-PAGE(4-20％梯度凝胶；Bio Whittaker Molecular Applications) 上分离。凝胶用考马斯蓝(Promega Corp.)染色以进行蛋白质印迹分 析，或者用荧光成像仪(Hitachi，Japan)以适于每种待评价荧光团的 Eex/Eem(E激发/E发射)分析凝胶。
蛋白质印迹分析。用Xcell II Blot模块(Invitrogen)，以80mA恒 定电流(于4℃)持续2.0小时，在25mM Tris碱/188mM甘氨酸(pH 8.3)、20％(体积/体积)甲醇中将蛋白电泳转移至硝酸纤维素膜(0.2 μm，Scheicher & Schuell，Germany)上。用TBST缓冲液(10mM Tris- HCl、150mM NaCl，pH 7.6，含0.05％Tween 20)淋洗所述膜，并于 室温30分钟或4℃过夜在封闭溶液(3％奶粉或1％BSA的TBST缓冲 液)中温育。然后用50ml TBST缓冲液漂洗膜，并与抗FlagR单克隆 抗体M2(稀释度1∶5,000)、抗海肾萤光素酶单克隆抗体(稀释度1∶5,000) 或HRP缀合链霉抗生物素蛋白(稀释度1∶1,000)于室温温育45分钟。 接着用TBST缓冲液(50ml，5分钟，3次)漂洗膜。然后，将已用抗 体探测的膜与HRP缀合驴抗小鼠IgG温育(30分钟，室温)，接着重 复漂洗步骤。用增强的化学发光(ECL)系统(Pharmacia-Amersham)按 照生产商的说明显示蛋白。使用计算机辅助光密度分析法定量蛋白 水平。
蛋白浓度。通过Pierce BCA蛋白测定(Pierce Rockford IL)的微 量滴定方法，使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准品，测量蛋白。
统计学分析。数据以一式四份进行的实验的平均值+/-S.E.M值 表示，代表至少3个具有相似结果的独立实验。通过student氏t检 验评价统计显著性，当p＜0.05时认为显著。
细菌细胞。含带有紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)(DhaA) 的pET-3a的Dh5α细胞原液由Clifford J.Unkefer博士(Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，NM)惠赠(Schindler等，1999；Newman 等，1999)。使用Promega Corp.提供的预混合试剂在LB中培养细菌。 使用大肠杆菌BL21(λDE3)pET-3a的冷冻母液(储存在10％甘油中， -80℃)接种补加氨苄青霉素(50μg/ml)的Luria-Bertani琼脂平板 (Sambrook等，1989)。选择单菌落，用其接种两个10ml含50μg/ml 氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基。于37℃振荡(220rpm)培养细胞8 小时，此后各使用2ml接种两个50ml含50μg/ml氨苄青霉素的 Luria-Bertani培养基，于37℃过夜振荡培养。使用各10ml该培养物 接种两个0.5L含氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基。当培养物的A600 达到0.6时，加入异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度 为0.5mM，将培养物于30℃再振荡保持4小时。然后离心收集细胞， 用10mM Tris-SO4、1mM EDTA、pH 7.5清洗。在裂解细胞之前将 细胞沉淀储存于-70℃。
哺乳动物细胞。用Ham F12营养物和补加10％胎牛血清(FBS)、 100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的Dulbecco改良型极限必需培 养基的1∶1混合物，在95％空气和5％CO2气氛下于37℃培养CHO- K1细胞(ATCC-CCL61)。
如下所述分离大鼠海马(E18)初级神经元。简而言之，分离得自 Brewer博士(Southern Illinois University)的在HibemateTM E培养基 (GIBCO，Invitrogen，Carlsbad，CA)中的胚胎(E18)大鼠海马碎片，将其 接种在聚-D-溶素包被(0.28mg/cm2；Sigma)的玻璃/塑料器皿上，用具 有B27添加物(NB27，GIBCO)的无血清NeurobasalTM培养基培养。 每2-3天更换全部培养基。
转染。为研究不同蛋白的瞬时表达，将细胞接种在35mm培养 皿或24孔板上。约80-90％铺满时，按照生产商(GIBCO)的说明使细 胞接触脂转染胺试剂/DNA/无抗生素培养基的混合物。第二天，用新 鲜培养基更换培养基，使细胞生长不同的时间长度。
荧光。用荧光平板读数器CytoFluorII(Beckman)，以适于具体荧 光团的Eex/Eem(例如羧基四甲基罗丹明的Eex/Eem为540/575nm)检测 96孔板中细胞的荧光。
实施例II
基于DhaA的束缚系统
A.野生型和突变DhaA蛋白及其融合体
紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)的卤代烷脱卤素酶基因 dhaA编码一种33kDa的单体酶，该酶催化各种卤代烷的不可逆水解 (Kulakova等，1997)，例如裂解脂肪族和芳族卤化化合物(例如卤代C3- 卤代C10)中的碳-卤键。可获得关于卤代烷脱卤素酶的大量机制和结 构信息。DhaA酶含293个氨基酸，是含α/β水解酶折叠的蛋白超家 族一员(图2A)。红球菌(Rhodococcus)、黄色杆菌(Xanthobacter)和鞘 氨醇单胞菌(Sphingomonas)的卤代烷脱卤素酶的整体结构类似，均含 有参与卤-碳键裂解的催化残基三联体。就DhaA而言，这些残基为 Asp106、E130和His272(Newman等，1999；图2B)。图1A-B显示 了DhaA酶的整体催化机制。在底物结合后，Asp残基的羧酸对底物 的亲核攻击引起卤-碳键裂解，形成烷基-酯中间体(图1A)。脱卤素酶 反应途径中的下一步是被活性位点His残基活化的水分子水解中间体 酯(图1B)。尽管催化性组氨酸残基为共价中间体去烷基化的碱性催 化剂，但其不是活性位点Asp的初始亲核攻击所必需的。已经表明， 没有关键性催化组氨酸残基的蛋白突变体进行烷基化半反应 (alkylation half reaction)，由此产生稳定的共价酯中间体(Pries等， 1995)。
很可能是底物结合DhaA形成E.S复合物，此后Asp106的亲核 攻击形成酯中间体，然后His272活化H2O，该H2O水解所述中间体 的，由催化中心释放出产物。为测定催化性His272残基的点突变是 否损害酶的酶活性，以便能够将官能团(FG)共价束缚至该蛋白，制备 突变DhaA。
材料和方法
为制备突变DhaA载体，使用基于四引物重叠-延伸法的Promega 体外诱变试剂盒(Ho等，1989)生产突变为F、A、G或H的DhaA.H272。 外部引物是寡核苷酸 5′-GCTTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCA-3′(SEQ ID NO：1) 和5′-GCTTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCA-3′(SEQ ID NO：2)，内部诱变引物如下：H272F(5′- CCGGGATTGTTCTACCTCCAGGAAGAC-3′，SEQ ID NO：3)、H272A (5′-CCGGGATTGGCCTACCTCCAGGAAGAC-3′；SEQ ID NO：4)、 H272G(5′-CCGGGATTGCAGTACCTCCAGGAAGAC-3′；SEQ ID NO：5)和H272Q(5′-CCGGGATTGGGCTACCTCCAGGAAGAC-3′； SEQ ID NO：6)(突变密码子加下划线)。将突变脱卤素酶基因亚克隆入 pET-3a载体。为过表达突变脱卤素酶，将pET-3a载体转化入感受态 大肠杆菌BL21(DE3)中。通过DNA测序验证克隆中的DhaA序列。 除非另有说明，否则DhaA.WT和DhaA.H272F蛋白一般在N-末端包 含GST，在C-末端包含FLAG表位。
通过将合适的DhaA编码区克隆入pGEX5x3载体的SalI/NotI位 点，构建GST-DhaA(野生型或H272F/A/G/H突变体)融合表达盒。 设计两种引物(5′-ACGCGTCGACGCCGCCATGTCAGAAATCG GTACAGGC-3′和5′-ATAAGAATGCGGCCGCTCAAGCGCTTCAAC CGGTGAGTGCGGGGAGCCAGCGCGC-3′；分别为SEQ ID NO：7和 8)，以将SalI位点和Kozak共有序列加入到DhaA的5′编码区，将NotI、 EcoR47III和AgeI限制性位点和终止密码子加入到DhaA的3′编码区， 并由DhaA(野生型或突变型)模板扩增897bp的片段。将获得的片段 插入到pGEX-5X-3的SalI/NotI位点中，pGEX-5X-3载体含谷胱甘肽 S-转移酶(GST)基因、Xa因子裂解位点编码序列和多克隆位点 (MCS)，后接终止密码子。
然后将Flag编码序列插入到pGEX5X-3载体的AgeI/EcoR47III 限制位点中。与6核苷酸AgeI位点读框相符的是11个氨基酸肽的序 列，其最后的八肽对应于Flag肽(Kodak Imaging Systems，Rochester， NY)。编码Flag肽(Kodak Imaging Systems，Rochester，NY)的两种互 补寡核苷酸(5′-CCGGTGACTACAAGGACGATGACGACAAGTGAA GC-3′，有义，SEQ ID NO：9，和5′-GCTTCACTTGTCGTCATCGTC CTTGTAGTCA3′，反义，SEQ ID NO：10)退火。退火DNA在5′末端 具有AgeI位点，在3′末端具有EcoR47III位点。用AgeI和EcoR47III 消化退火DNA，然后将其亚克隆入GST-DhaA.WT或GST- DhaA.H272F突变体构建物的AgeI和EcoR47III位点。通过DNA测 序检验所有的基因融合构建物。除非另有说明，否则DhaA.WT和 DhaA.H272F蛋白一般在N-末端包含GST，在C-末端包含FLAG表 位。
为生产GST融合蛋白，当培养物600nm光密度达到0.6时加入 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(终浓度为0.5mM)诱导酶表达。将细 胞收集在缓冲液A(10mM Tris-SO4、1mM EDTA、1mMβ-巯基乙 醇和10％甘油，pH 7.5)中，并使用Vibra CellTM超声波仪(Sonics & Materials，Danbury，CT，USA)超声破碎。以19,800×g离心1小时去 除细胞碎片。用GSS-Sepharose 4快速柱(fast flow column)(Amersham Biosciences；Piscataway，NJ)按照生产商的说明对粗提物进一步纯化。 合并含GST-DhaA融合蛋白的洗脱级分，对10mM Tris-SO4缓冲液(含 20mM Na2SO4和1mM EDTA-Na2)于4℃过夜透析，并储存于-20℃， 直至使用。为生产DhaA(野生型或突变型)，用Xa因子由融合蛋白 上切下GST，用GSS-Sepharose 4(Amersham Biosciences；Piscataway， NJ)按照生产商的说明纯化产物。蛋白的均一性通过SDS-PAGE检 验。在某些实验中，如Newman等(1999)所述使用45-70％饱和硫酸 铵分级分离无细胞提取物。
结果
图3显示的浓条带为IPTG诱导产生的DhaA.WT(泳道1)和 DhaA.H272F(泳道2)融合蛋白。而且，所述蛋白是可溶的，可用 GSS-Sepharose 4FF有效纯化(泳道5-10，单数泳道对应于DhaA.WT， 而双数泳道对应于DhaA.H272F)。用Xa因子处理融合蛋白导致形成 GST和DhaA(野生型或H272F突变型，分别为泳道11和12)两种蛋 白，用谷胱甘肽-Sepharose 4FF有效去除GST(野生型或突变型，分 别为泳道13和14)。另外，所有蛋白都具有预计分子量。
B.H272突变损害DhaA水解Cl-烷烃的能力
酶不能将酶反应产物释放到周围介质中是束缚系统所必需的。 可通过酶水解能力的显著降低检测此无能力。    
为研究点突变对DhaA(野生型或突变型)水解Cl-烷烃活性的影 响，使用Holloway等(1998)所述的pH指示剂染料系统。
材料和方法
pH指示剂染料系统的反应缓冲液由1mM HEPES-SO4(pH 8.2)、 20mM Na2SO4和1mM EDTA组成。加入酚红至终浓度为25μg/ml。 加入卤化化合物至表观浓度可确保溶解的底物组分足以满足脱卤素 反应的最大速度。通过涡旋剧烈混合底物-缓冲溶液30秒，封盖以防 止底物显著挥发，在1-2小时内使用。在每次动力学测定之前，用HCl 标准溶液滴定酚红，以获得表观消光系数。于室温用Beckman Du640 分光光度计(Beckman Coulter，Fullerton，CA)以558nm测定DhaA的 稳态动力学常数。使用计算机程序SigmaPlot由初速度计算动力学常 数。1单位酶活性定义为在特定条件下1.0mM底物/分钟脱卤素化所 需要的量。
结果
如图4所示，使用pH 7.0-8.2的0.1mg/ml酶和10mM底物， 用4种突变体中的任一种都没有发现催化活性。在这些条件下，野 生型酶对1-Cl-丁烷的活性为5单位/mg蛋白。因此，突变体的活性 至少降低至1/700。
用浓度递增的(NH4)2SO4处理得自表达DhaA(野生型或其中一种 突变体)的大肠杆菌的等份上清液。使蛋白与各种浓度的(NH4)2SO4接 触2小时(4℃)，离心获得沉淀，对缓冲液A过夜透析，并用SDS-PAGE 分离。
如图5所示，45-70％的(NH4)2SO4沉淀了大部分的DhaA.WT和 DhaA.H272F突变体级分。在低(NH4)2SO4浓度时未观测到这些蛋白 沉淀。相比之下，DhaA.H272Q、DhaA.H272G和DhaA.H272A突变 体可被10％NH4)2SO4沉淀。这强有力地表明，DhaA.H272Q、 DhaA.H272G和DhaA.H272A突变体的物理化学特性明显改变。同 时，DhaA.H272F突变对这些参数没有明显影响。这些数据与突变对 DhaA三维结构影响的计算机建模结果良好吻合，表明在所测试的全 部突变体中，只有DhaA.H272F突变对预测的三维模型没有显著影响 (参见图2)。根据这些结果，选择DhaA.H272F进行下一步的实验。
为形成共价加合物，Cl-烷烃的氯原子很可能定位在DhaA(野生 型或突变体)的催化氨基酸附近(图2A-B)。DhaA的晶体结构(Newman 等，1999)表明，这些氨基酸位于DhaA催化袋(约10长，横截面约 202)的深部。为使含官能团的DhaA底物中的反应基进入DhaA催 化袋内部，设计连接基团以连接含氯底物和官能团，以使官能团位 于催化袋外部，即不扰乱/损坏DhaA的三维结构。
为测定DhaA是否能够水解具长疏水碳链的Cl-烷烃，使 DhaA.WT接触各种Cl-烷醇。如图6所示，DhaA.WT可水解4-10个 碳原子的1-Cl-烷醇。而且，Cl-烷烃的水解初速度(IRH)与碳链长度 负相关，尽管长链Cl-烷烃在水性缓冲液中的溶解性差可能影响酶-底 物相互作用的效力。实际上，如图6所示，1-Cl-烷-10-癸醇的IRH 远高于1-Cl-癸烷的IRH。更重要的是，这些数据表明，DhaA可水 解含相对极性基团(例如HO-基团)的Cl-烷烃。
制备具有不同长度和/或疏水性连接基团的羧基荧光素修饰Cl-烷 烃(图7)。如果连接基团长为12个以上原子，则DhaA.WT有效水解 具有较大体积官能团(羧基荧光素)的Cl-烷烃。用任一种测试的Cl-烷 烃都未检测到DhaA.H272F/AG/Q突变体的活性(未列出数据)。另外， 修饰邻近Cl-原子的(CH2)6区导致DhaA.WT对14个原子连接基团的 IRH显著降低。尽管如此，如果连接基团的长度和结构与水解酶催 化位点相匹配，那么在本发明底物中存在连接基团则对反应基本没 有影响。
用自动化HPLC(Hewlett-Packard 1050型)系统分析某些样品。 设置DAD检测器来记录200-600nm范围内的UV-可见光谱。对于 羧基荧光素修饰底物和羧基四甲基罗丹明修饰底物，以分别等于 480/520nm和540/575nm的Eex/Eem检测荧光。使用分析型反相C18 柱(Adsorbosphere HS，5μ，150×4.6mm；Hewlett-Packard，Clifton，NJ)， 在30分钟内用10mM乙酸铵(pH 7.0)：ACN(乙腈)由25∶75至1∶99(体 积/体积)的线性梯度，以1.0ml/分钟分析Cl-烷烃或Cl-烷烃水解产物 的乙醇提取物。根据收集峰的积分面积定量所分离的化合物。
图8A表明底物和反应产物完全分离。图8B表明DhaA.WT非 常有效地水解羧基荧光素-C10H22NO2-Cl。使用羧基四甲基罗丹明- C10H21NO2-Cl或5-羧基-X-罗丹明-C10H21NO2-Cl作为底物时获得相似 的结果(未列出数据)。总之，这些数据证实了基于pH指示剂染料的 测定的结果，所述结果表明DhaA.H272F突变使DhaA催化活性完全 失活。
C.官能团与DhaA突变体在体外的共价束缚
材料和方法
在威斯康星大学生物技术中心(Wiscosin Biotechnology Center)使 用基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪Bruker Biflex III(Bruker，USA)对蛋白进行MALDI分析。为制备样品，在有 或没有底物(羧基荧光素-C10H21NO2-Cl，1.0mM终浓度)时，将100μg 纯化DhaA(野生型或H272F突变体)或GST-DhaA(野生型或H272F 突变体)融合蛋白(纯化至约90％均一度)的200μl缓冲液(1mM HEPES-SO4(pH 7.4)、20mM Na2SO4和1mM EDTA)于室温温育15 分钟。然后将反应混合物对20mM CH3COONH4(pH 7.0)于4℃过夜 透析，测定蛋白和蛋白底物复合物的M/Z值。
用于制备DhaA.D106突变体的寡核苷酸包括：
用于DhaA.D106C的寡核苷酸：
5′-CTTGGGTTTGGAAGAGGTCGTCCTGGTCATCCACTGCTGGGGC-3′
(SEQ ID NO：13)和5′-
TGAGCCCCAGCAGTGGATGACCAGGACGACCTCTTCCAAACC-3′(SEQ
ID NO：14)；
用于DhaA.D106Q的寡核苷酸：
5′-CTTGGGTTTGGAAGAGGTCGTCCTGGTCATCCACCAGTGGGGC-3′
(SEQ ID NO：34)和5′-
TGAGCCCCACTGGTGGATGACCAGGACGACCTCTTCCAAACC-3′(SEQ
ID NO：35)；
用于DhaA.D106E的寡核苷酸：
5′-CTTGGGTTTGGAAGAGGTCGTCCTGGTCATCCACGAATGGGGC-3′
(SEQIDNO：52)和5′-
TGAGCCCCATTCGTGGATGACCAGGACGACCTCTTCCAAACC-3′(SEQ
ID NO：53)；
以及用于DhaA.D106Y的寡核苷酸：
5′-CTTGGGTTTGGAAGAGGTCGTCCTGGTCATCCACTACTGGGGC-3′
(SEQ ID NO：54)和5′-
TGAGCCCCAGTAGTGGATGACCAGGACGACCTCTTCCAAACC-3′(SEQ
ID NO：55).
退火寡核苷酸在5′末端含StyI位点，在3′末端含BlpI位点。用StyI 和BlpI消化退火的寡核苷酸，将其亚克隆入DhaA.WT或DhaA.H272F 的StyI和BlpI位点。通过DNA测序检验所有突变体。
结果
为证实DhaA.H272突变体能够结合具官能团的Cl-烷烃，将这 些突变体或其GST-融合体以及对应的野生型蛋白或融合体与羧基荧 光素-C10H21NO2-Cl、羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl、5-羧基-X-罗 丹明-C10H21NO2-Cl或生物素-C10H21NO2-Cl于室温下接触15分钟。然 后用SDS-PAGE分离蛋白。将含蛋白的凝胶与羧基荧光素- C10H21NO2-Cl、羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl或5-羧基-X-罗丹明- C10H21NO2-Cl温育，用荧光成像仪(Hitachi，Japan)以适于各个荧光团 的Eex/Eem进行分析。将与生物素-C10H21NO2-Cl温育的含蛋白凝胶转 移至硝酸纤维素膜，用缀合HRP的链霉抗生物素蛋白探测。
如图9所示，羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl(图A中的泳道1 和2)、羧基荧光素-C10H21NO2-Cl(图A中的泳道3和4)和5-羧基-X- 罗丹明-C10H21NO2-Cl(图A中的泳道5和6)结合DhaA.H272F(图A 中的泳道2、4和6)，但不结合DhaA.WT(图A中的泳道1、3和5)。 生物素-C10H21NO2-Cl结合DhaA.H272F(图B中的泳道9-14)，但不 结合DhaA.WT(图B中的泳道1-8)。而且，生物素-C10H21NO2-Cl与 DhaA.H272F的结合(图B中的泳道9-14)是剂量依赖性的，可在0.2μM 时检测到。另外，底物和DhaA.H272F之间的键非常强，因为用SDS 煮沸没有破坏该键。
所有测试的DhaA.H272突变体，即H272F/G/A/Q，都结合羧基 四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl(图10)。此外，DhaA.H272突变体以高 度特异性方式结合底物，因为用其中一种底物(生物素-C10H21NO2-Cl) 预处理突变体完全阻断了与另一种底物(羧基四甲基罗丹明- C10H21NO2-Cl)的结合(图10)。
为测定Cl-烷烃和DhaA.H272F突变体(或GST-DhaA.H272F突 变体融合蛋白)之间键的特性，在有和没有羧基荧光素-C10H21NO2-Cl 时温育这些蛋白，并用MALDI分析。如图11所示，DhaA.H272F突 变体和羧基荧光素-C10H21NO2-Cl之间的键很强。而且，对E*S复合 物的分析表明，底物(例如羧基荧光素-C10H21NO2-Cl)和DhaA.H272F 之间的键为共价性质。MALDI-TOF分析也证实，底物/蛋白加合物 以1∶1的关系形成。
制备在催化三联体中的另一个残基-残基106突变的DhaA突 变体。野生型DhaA的106位残基为D，D是已知的亲核氨基酸残基 之一。用非D亲核氨基酸残基如C、Y和E置换DhaA中残基106 的D，它们与底物形成的键可比野生型DhaA和底物形成的键更稳 定。特别是，半胱氨酸在基于半胱氨酸的酶中是已知的亲核体，而 这些酶已知不活化水。
分析对照突变体DhaA.D106Q、单突变体DhaA.D106C、 DhaA.D106Y和DhaA.D106E以及双突变体DhaA.D106C:H272F、 DhaA.D106E:H272F、DhaA.D106Q:H272F和DhaA.D106Y:H272F与 羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl的结合情况(图12)。如图12所示， 羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl结合DhaA.D1 06C、 DhaA.D106C:H272F、DhaA.D106E和DhaA.H272F。因此，羧基四 甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl和突变DhaA残基106的半胱氨酸或谷氨 酸形成的键，比羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl和DhaA.WT形成的 键稳定。单独或与DhaA中其它残基置换组合的106位上的其它置换 可获得相似的结果。此外，单独或与DhaA中其它残基置换组合的106 上位的某些置换可导致突变DhaA仅与某些底物形成键。
实施例III
萤光素酶经突变DhaA和本发明底物束缚至固相支持体
材料和方法
通过将phRLuc编码区克隆入含豆蔻酸附着肽编码序列(MAS)的 pCIneo载体中的NheI/SalI位点，构建phRLuc-连接基团-DhaA.WT- Flag和phRLuc-连接基团-DhaA.H272F-Flag融合表达盒。设计两种引 物(5′-GCTTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCA-3′；SEQ ID NO：11和5′-GCTTCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCA-3′；SEQ ID NO：12)，以分别将NheI和SalI位点加入到phRLuc的5′和3′编码 区，并由phRLuc模板(pGL3载体，Promega)扩增900bp的片段。然 后，用NheI和SalI限制酶切去豆蔻酸附着肽编码序列，将含phRLuc 的扩增片段插入到pCIneo.DhaA.(野生型或H272F)-Flag载体的 NheI/SalI限制位点。通过DNA测序检验每种构建物的序列。然后使 用Promega的TNTT7Quick系统体外生产融合蛋白。
结果
为证明蛋白经DhaA.H272F-Cl-烷烃桥束缚至固相支持体，制备 编码海肾萤光素酶(hRLuc，融合体的N-末端)、蛋白连接基团(17个 氨基酸，参见表I)和DhaA(野生型或H272F突变体)的融合蛋白的载 体。然后将Flag表位融合至DhaA的C-末端。
表I
融合体  序列 肽连接基团 GST-DhaA  atcgaaggtcgtgggatccccaggaattcccgggtcgacgccgcc  (SEQ ID NO：26) iegrgiprnsrvdaa (SEQ ID NO：27) GFP-DhaA  tccggatcaagcttgggcgacgaggtggacggcgggccctctagagcc  acc(SEQ ID NO：28) sgsslgdevdggpsrat (SEQ ID NO：29) DhaA-Rluc  accggttccggatcaagcttgcggtaccgcgggccctctagagcc  (SEQ ID NO：30) tgsgsslryrgpsra (SEQ ID NO：31) Rluc-DhaA  tccggatcaagcttgcggtaccgcgggccctctagagccgtcgacgccg  cc(SEQ ID NO：32) sgsslryrgpsravdaa (SEQ ID NO：33) DhaA-Flag  Accggt Tg
SDS-PAGE后进行蛋白质印迹分析的结果显示，所述蛋白具有 其预测分子量，被抗R.Luc和抗FlagR M2抗体识别。另外，所有的 融合蛋白都具有海肾萤光素酶活性(用Promega的海肾萤光素酶测定 系统在PBS pH 7.4缓冲液中测定)。
使用生物素-C10H21N1O2-Cl作为底物，链霉抗生物素蛋白(SA)包 被的96孔平板(Pierce，USA)作为固相支持体，显示蛋白经 DhaA.H272F-Cl-烷烃桥束缚至固相支持体。使所翻译蛋白与25μM(终 浓度)的生物素-C10H21N1O2-Cl底物于室温接触60分钟。用Sephadex G-25预填装柱(Amersham Biosciences)通过凝胶过滤去除未结合的生 物素-C10H21N1O2-Cl。将收集的R.Luc-连接基团-DhaA融合体级分在 SA-包被的96孔平板上于室温放置1小时，洗去未结合的蛋白，检 测萤光素酶活性。
图13A显示了捕获在平板上的海肾萤光素酶活性。分析这些数 据表明，仅捕获了含突变DhaA的融合体。捕获的效力非常高(加到 板上的海肾萤光素酶活性被捕获了50％以上)。相比之下，对含 DhaA.WT以及海肾萤光素酶的融合体的捕获效力小得可以忽略不计 (＜0.1％)。用非生物素化底物(羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl)预处理 R.Luc-连接基团-DhaA.H272F降低捕获效力约80％。而且，非生物素 化底物预处理对捕获R.Luc-连接基团-DhaA.WT或海肾萤光素酶没有 影响。
总之，这些数据证明，活性酶(例如海肾萤光素酶)可被束缚至构 成本发明底物(Cl-烷烃-DhaA.H272F-桥)一部分的固相支持体，并保 持酶活性。
实施例IV
体内突变DhaA和底物系统
A.官能团与DhaA突变体的体内共价束缚：原核生物和真核生物中
材料和方法
为研究本发明底物与原核生物中表达的突变水解酶的结合，用 pGEX-5X-3.DhaA.WT-Flag或pGEX-5X-3.DhaA.H272F-Flag转化大肠 杆菌细胞BL21(λDE3)pLys65，在液体培养基中生长，用IPTG诱导。 向诱导细胞中加入羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl或生物素- C10H21NO2-Cl(终浓度25μM)。1小时后收获细胞，用冷PBS(pH 7.3) 清洗，超声破碎，以19,800×g离心1小时分离。可溶性组分进行 SDS-PAGE。用荧光成像仪分析具有分离自羧基四甲基罗丹明- C10H21NO2-Cl处理细胞的蛋白的凝胶，而将生物素-C10H21NO2-Cl处 理细胞的蛋白转移至硝酸纤维素膜，用HRP缀合的链霉抗生物素蛋 白探测。
为研究羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl在哺乳动物细胞中的结 合，分别从pGEX-5X-3.DhaA.WT-Flag或pGEX-5X-3.DhaA.H272F- Flag切下DhaA.WT-Flag和DhaA.H272F-Flag编码区，凝胶过滤，并 插入至pCIneo.CMV载体(Promega)的SalI/NotI限制性位点。通过DNA 测序验证所述构建物。
将CHO-K1细胞放置在24孔板(Labsystems)上，用pCIneo- CMV.DhaA.WT-Flag或pCIneo-CMV.DhaA.H272F-Flag载体转染。24 小时后，用含25μM羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl的新鲜培养基 置换培养基，将细胞放置于CO2培养箱中60分钟。在此温育后，去 除培养基，用PBS(pH 7.4；4次连续清洗：1.0ml/cm2；每次5秒)快 速清洗细胞，用相同缓冲液(1％SDS、10％甘油等；250μl/孔)溶解细 胞。用SDS-PAGE(4-20％梯度凝胶)分离蛋白(10μl/泳道)，用荧光成 像仪(Hitachi，Japan)以等于540/575nm的Eex/Eem检测羧基四甲基罗丹 明-C10H21NO2-Cl的结合。
结果
图14A和B显示生物素-C10H21NO2-Cl(A)和羧基四甲基罗丹明- C10H21NO2-Cl(B)与大肠杆菌蛋白的体内结合。图14A上的低分子量 条带是HRP-SA识别的大肠杆菌蛋白，而图B底部检测的荧光是游 离羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl的荧光。图15显示羧基四甲基罗 丹明-C10H21NO2-Cl与真核细胞蛋白的体内结合。
图14和图15的分析显示，是DhaA.H272F-Flag突变体而不是 DhaA.WT-Flag体内结合羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl或生物素- C10H21N1O2-Cl。而且，DhaA.H272F-Flag和底物之间的键非常强(可 能是共价键)，因为与SDS煮沸接着进行SDS-PAGE并没有破坏突变 酶和底物之间的键。
B.细胞膜对本发明底物的通透性
材料和方法
以Ham F12营养物和补加10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉 素和100mg/ml链霉素的Dulbecco改良型极限必需培养基的1∶1混 合物，在95％空气和5％CO2气氛下于37℃培养CHO-K1细胞 (ATCC-CCL61)。
为研究不同底物的摄取，将细胞以30,000细胞/cm2的密度接种 在LT-II室(Nunc)或96孔板(Labsystems)中。第二天，用含不同浓度 底物的培养基置换培养基，将细胞放置回CO2培养箱中2、5或15 分钟。在温育结束时，去除含底物的培养基，用PBS(pH 7.4；4次 连续清洗：1.0ml/cm2；每次5秒)快速清洗细胞。然后向细胞中加入 新鲜培养基，将细胞放回37℃的CO2培养箱中。用荧光平板读数器 CytoFluor II(Beckman)以分别等于480/520nm和540/575nm的Eex/Eem (用于羧基荧光素修饰底物和羧基四甲基罗丹明修饰底物)检测96孔 板中的细胞荧光水平。用配有适于检测FITC和羧基四甲基罗丹明的 滤光片组的倒置落射荧光显微镜Axiovert-100(Carl Zeiss)获取细胞的 荧光图像。
结果
如图16所示，羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl(25μM，37℃， 5分钟)处理的CHO-K1细胞可快速有效地加载羧基四甲基罗丹明- C10H21NO2-Cl。图像分析表明，荧光染料穿透了细胞膜。图16还显 示羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl可被有效地洗出细胞。总之，这 些数据表明，羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl可穿透CHO-K1细胞 的质膜。
相比之下，即使细胞用高浓度(即100μM)的羧基荧光素- C10H21NO2-Cl和更长的时间(60分钟)预处理，羧基荧光素-C10H21NO2- Cl也不能穿透CHO-K1细胞的质膜(未列出数据)。因此，细胞质膜 对本发明各种底物(例如羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl和羧基荧光 素-C10H21NO2-Cl)的不同通透性，提供了用不同荧光团标记细胞表面 和细胞内部所表达蛋白的独特机会，由此使得可以双重标记 (biplexing)。
实施例V
用于体内细胞成像的基于DhaA的束缚
A.GFP和羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl在活体哺乳动物细胞中 的共定位
材料和方法
通过用DhaA.WT-Flag或DhaA.H272F-Flag编码区置换编码 GFP-DEVD-Rluc(h)的Packard载体(Packard#6310066)中的海肾萤光 素酶编码区，构建GFP-连接基团-DhaA融合表达盒。设计两种引物(5′- GGAATGGGCCCTCTAGAGCGACGATGTCA-3′；SEQ ID NO：15，和 5′-CAGTCAGTCACGATGGATCCGCTCAA-3′；SEQ ID NO：16)，以 分别将ApaI和BamHI位点(加下划线)加入到DhaA的5′和3′编码区， 并由pGEX-5X-3.DhaA.WT-Flag或pGEX-5X-3.DhaA.H272F-Flag模 板扩增980bp的片段。用ApaI和BamHI限制酶切出R.Luc编码区。 然后将含DhaA的980bp片段插入到GFP-DEVE-Rluc(h)编码载体的 ApaI/BamHI位点。基因融合构建物的序列通过DNA测序检验。
将瞬时表达GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag或GFP-连接基团- DhaA.H272F-Flag融合蛋白的细胞以30,000细胞/cm2的密度接种在 LT-II室(Nunc)中。第二天，用含25μM羧基四甲基罗丹明- C10H21NO2-Cl的新鲜培养基置换培养基，将细胞放置回CO2培养箱 中60分钟。在温育结束时，去除含底物的培养基，用PBS(pH 7.4； 4次连续清洗：1.0ml/cm2；每次5秒)快速清洗细胞，然后向细胞中 加入新培养基。将细胞放回CO2培养箱中，60分钟后用PBS(pH 7.4； 4次连续清洗：1.0ml/cm2；每次5秒)快速清洗细胞。用配有适于检 测GFP和羧基四甲基罗丹明的滤光片组的倒置落射荧光显微镜 Axiovert-100(Carl Zeiss)获取细胞的荧光图像。
结果
如图17的图象所示，用GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag或GFP- 连接基团-DhaA.H272F-Flag转染的细胞显示出具有GFP光发射特征 的蛋白强烈表达。用羧基四甲基罗丹明-滤光片组获取的相同细胞图 象的分析表明，表达GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag的细胞是暗色的， 无法与不表达该融合蛋白的细胞区分开来。相反，表达GFP-连接基 团-DhaA.H272F-Flag的细胞非常明亮，可清楚识别。
对分离自GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag或GFP-连接基团- DhaA.H272F-Flag载体转染的CHO-K1细胞的蛋白进行蛋白质印迹分 析，结果显示这些细胞表达的蛋白可由抗Flag抗体识别，是具有融 合蛋白的预测分子量(未列出数据)。对含这些蛋白的SDS-PAGE凝胶 进行荧光扫描显示，羧基四甲基罗丹明与GFP-连接基团- DhaA.H272F-Flag强/共价结合，但不与GFP-连接基团-DhaA.WT-Flag 结合(图18)。
B.DhaA.WT-Flag和DhaA.H272F-Flag中DhaA的融合配偶体有功 能
为测定两种蛋白的融合体是否导致一种或两种蛋白活性丢失， 制备了几种在融合体的C-末端或N-末端具有DhaA、并在两种蛋白 之间具有连接序列(如具有13-17个氨基酸的连接序列)的基于DhaA 的融合蛋白(参见表II)。数据显示融合体中两种蛋白的功能活性都得 以保留。
表II
 N-末端蛋白 连接 基团 C-末端蛋白 蛋白#1的功能 蛋白#2的功能  GST + DhaA.H272F 结合GSS柱 结合
GFP + DhaA.H272F 绿色荧光 结合 R.Luc + DhaA.H272F 水解腔肠素 (coelenterazine) 结合 DhaA.H272F + R.Luc 结合 水解腔肠素 DhaA.H272F + Flag 结合 被抗体识别
C.Cl-烷烃的毒性
材料和方法
为研究Cl-烷烃的毒性，将CHO-K1细胞以5,000细胞/孔的密度 接种于96孔板中。第二天，用含0-100μM浓度Cl-烷烃的新鲜培养 基更换培养基，将细胞放回CO2培养箱中放置不同的时间段。用 CellTiter-GloTM发光细胞活力测定(Promega)按照生产商的方法测量细 胞存活率。一般来说，将100μl CellTiter-GloTM试剂直接加入细胞中， 使用DYNEX MLX微量滴定板发光计以10分钟间隔记录发光。在 某些实验中，为防止荧光/发光干扰，去除含荧光Cl-烷烃的培养基， 用PBS(pH 7.4；4次连续清洗：1.0ml/cm2；每次5秒)快速清洗细胞， 然后加入CellTiter-GloTM试剂。对照实验表明，该步骤对CellTiter- GloTM测定的灵敏度或精确度没有影响。
结果
如图19所示，羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl即使在以100μM 浓度(最高测试浓度)处理4小时后也显示出对CHO-K1细胞无毒。处 理24小时后，于6.25μM浓度(“最大无毒浓度”)未检测出毒性。 浓度大于6.25μM时，CHO-K1细胞的相对发光以剂量依赖方式降 低，IC50约为100μM。即使在以100μM处理24小时后也没有观测 到生物素-C10H21NO2-Cl的毒性。相比之下，羧基-X-罗丹明- C10H21NO2-Cl具有显著的毒性作用，因为在处理1小时后可检测出 CHO-K1细胞中RLU降低。该作用的IC50值约为75μM，25μM浓 度时ATP无明显降低。5-羧基-X-罗丹明-C10H21NO2-Cl毒性的IC50值 和5-羧基-X-罗丹明-C10H21NO2-Cl的“最大无毒浓度”以时间依赖方 式降低，分别达到12.5μM和6.25μM。
D.检测与含羧基四甲基罗丹明或DiAc-羧基荧光素的底物和固定剂 接触的CHO细胞中的DhaA.D106C
将CHO细胞(ATCC，第4代)以低密度接种到8孔室形载玻片 (German coverglass system)上的DMEM:F12培养基(Gibco)中，该培养 基含10％FBS和1mM谷氨酰胺(生长培养基)，没有抗生素。2天后， 使用倒置相差显微镜观察细胞。在施用转染试剂前确认两种视觉基 准：1)每个室的细胞融合水平约为60-80％；和2)＞90％的细胞粘附， 并显示出扁平形态。用150μl新鲜预温生长培养基置换培养基，温 育细胞约1小时。
使用TransIt TKO系统(Miris)转染细胞。通过每100μl无血清 DMEM:F12培养基加入7μl脂质来稀释TKO脂质，然后每100μl含 脂质培养基加入1.2μg转染级DhaA.D106C DNA。将混合物于室温 温育15分钟，然后将25μl等份转移入各个培养室中(0.3μg DNA)。 将细胞放回培养箱中5-6小时，用生长培养基清洗两次，加入300μl 新鲜生长培养基，然后再温育细胞24小时。
将转染或未转染的对照细胞与12.5μM羧基四甲基罗丹明- C10H21NO2-Cl或12.5μM DiAc-羧基荧光素-C10H21NO2-Cl的10％ FBS/DMEM溶液在37℃和5％CO2中温育30分钟。用温生长培养基 清洗细胞3次，加入300μl新鲜生长培养基，然后温育细胞1小时。
用温PBS置换生长培养基，用配有罗丹明滤光片组(激发滤光片 ＝540，发射滤光片＝560LP)和荧光滤光片组(激发滤光片＝490，发射 滤光片＝520)以及Spot CCD照相机的Zeiss Axiovert 100倒置显微镜 显示活细胞。以曝光时间0.15-0.60秒、增益调整4或16捕获图像。
分散的特异性标记的转染细胞在羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2- Cl和DiAc-羧基荧光素-C10H21NO2-Cl标记细胞中都很明显。大部分 细胞是非转染细胞，它们没有保留标记。
去除PBS，用3.7％多聚甲醛/0.1％Triton的PBS溶液固定细胞15 分钟。去除固定剂，加入PBS，捕获羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl 和DiAc-羧基荧光素-C10H21NO2-Cl标记细胞的第二组图像。
用50％甲醇的PBS溶液置换PBS，温育细胞15分钟，接着在95％ 甲醇中温育15分钟。捕获第三组图像，然后将等体积的甲醇和丙酮 混合物施加于细胞，温育15分钟。用PBS置换培养基，获得第四组 图像。
结果表明底物与DhaA.D106C突变体的结合在用多聚甲醛固定 以及随后以甲醇和丙酮处理固定细胞样品后稳定。而且，羧基四甲 基罗丹明或羧基荧光素荧光的亮度在这些条件下没有改变。
实施例VI
基于突变β-内酰胺酶(BlaZ)的束缚
丝氨酸-β-内酰胺酶赋予细菌对β-内酰胺抗生素的抗性，其可能 使用丝氨酸残基(在Ambler等(1991)的A类公认编号体系中为Ser70) 上的羟基来降解多种β-内酰胺化合物。反应由形成前共价遭遇络合物 开始(图20A)，经高能酰化四面体中间体(图20B)形成瞬时稳定酰化 酶中间体，通过催化残基Ser70形成酯(图20C)。随后，酰化酶受到 水解水攻击(图20D)，形成高能脱酰化中间体(图20E)(Minasov等， 2002)，其崩解形成水解产物(图20F)。然后排出产物，再生游离酶。 如同在丝氨酸蛋白酶中一样，该机制需要催化碱以活化丝氨酸亲核 体，攻击底物的酰胺键，在形成酰化酶中间体后活化水解水以攻击 加合物的酯中心。
A.突变B-内酰胺酶及其融合体
材料和方法
携带金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)PC1 blaZ基因 (Zawadzke等，1995)的质粒pTS32由O.Herzberg博士(University of Maryland Biotechnology Institute)惠赠。blaZ基因序列如下：
AGCTTACTAT GCCATTATTA ATA ACTTAGC CATTTCAACA
CCTTCTTTCA AATATTTATAATAAACTATT GACACCGATA
TTACAATTGT AATATTATTG ATTTATAAAA
ATTACAACTGTAATATCGGA GGGTTTATTT TGAAAAAGTT
AATATTTTTA ATTGTAATTG CTTTAGTTTTAAGTGCATGT
AATTCAAACA GTTCACATGC CAAAGAGTTA AATGATTTAG
AAAAAAAATATAATGCTCAT ATTGGTGTTT ATGCTTTAGA
TACTAAAAGT GGTAAGGAAG TAAAATTTAATTCAGATAAG
AGATTTGCCT ATGCTTCAAC TTCAAAAGCG ATAAATAGTG
CTATTTTGTTAGAACAAGTA CCTTATAATA AGTTAAATAA
AAAAGTACAT ATTAACAAAG ATGATATAGTTGCTTATTCT
CCTATTTTAG AAAAATATGT AGGAAAAGAT ATCACTTTAA
AAGCACTTATTGAGGCTTCA ATGACATATA GTGATAATAC
AGCAAACAAT AAAATTATAA AAGAAATCGGTGGAATCAAA
AAAGTTAAAC AACGTCTAAA AGAACTAGGA GATAAAGTAA
CAAATCCAGTTAGATATGAG ATAGAATTAA ATTACTATTC
ACCAAAGAGC AAAAAAGATA CTTCAACACCTGCTGCCTTC
GGTAAGACCC TTAATAAACT TATCGCCAAT GGAAAATTAA
GCAAAGAAAACAAAAAATTC TTACTTGATT TAATGTTAAA
TAATAAAAGC GGAGATACTT TAATTAAAGACGGTGTTCCA
AAAGACTATA AGGTTGCTGA TAAAAGTGGT CAAGCAATAA
CATATGCTTCTAGAAATGAT GTTGCTTTTG TTTATCCTAA
GGGCCAATCT GAACCTATTG TTTTAGTCATTTTTACGAAT
AAAGACAATA AAAGTGATAA GCCAAATGAT AAGTTGATAA
GTGAAACCGCCAAGAGTGTA ATGAAGGAAT TTTAATATTC
TAAATGCATA ATAAATACTG ATAACATCTTATATTTTGTA
TTATATTTTG TATTATCGTT GAC(SEQ ID NO：36)
通过将点突变导入balZ基因，并将balZ编码区克隆入pGEX5x3 载体的SalI/AgeI位点，构建GST-blaZ(野生型和E166D、N170Q或 E166D:N170Q突变体)融合表达盒。内部诱变引物如下：E166D(5′- CCAGTTAGATATGACATAGAATTAAATTACTATTCACC-3’，SEQ ID NO：5 6；5’-GGTGAATAGTAATTTAATTCTATGTCATATCTAACT GG-3’，SEQ ID NO：57)；N170Q(5′-CCAGTTAGATATGAGATAGAA TTACAGTACTATTCACC-3’，SEQ ID NO：58；和5’-GGTGAATAGTA CTGTAATTCTATCTCATATCTAACTGG-3’，SEQ ID NO：59)；和 E166D:N170Q (5′CCAGTTAGATATGACATAGAATTACAGTACTA TTCACC-3′；SEQ ID NO：60和5′-GGTGAATAGTACTGTAATTCTA TGTCATATCTAACTGG-3；SEQ ID NO：61)。设计两种外部引物(5′- CAACAGGTCGACGCCGCCATGAAAGAGTTAAATGATTTAG-3’， SEQ ID NO：62；和5’-GTAGTCACCGGTAAATTCCTTCATTACACT CTTGGC-3’，SEQ ID NO：63)，以将N-末端SalI位点和Kozak序列加 入到blaZ的5′编码区，将AgeI位点加入到blaZ的3′编码区，并由 blaZ.WT模板扩增806bp的片段。将获得的片段插入到载体pGEX- 5X-3的SalI/AgeI位点中，载体pGEX-5X-3含谷胱甘肽S-转移酶(GST) 基因、Xa因子切割位点编码序列和多克隆位点(MCS)，后接Flag编 码序列和终止密码子。这些基因融合构建物通过DNA测序检验。
在感受态大肠杆菌BL21(λDE3)细胞中过表达GST-blaZ(野生 型或突变体)融合蛋白，基本如对DhaA和GST-DhaA融合蛋白的描 述进行纯化(除了使用磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 6.8)代替缓冲液A)。 蛋白均一性通过SDS-PAGE验证。
发色底物6-β-[(呋喃基丙烯酰)氨基]青霉烷酸三乙胺盐(FAP)购自 Calbiochem (La Jolla，CA)。用Beckman Du640分光光度计(Beckman Coulter，Fullerton，CA)根据344nm吸光度的损失(ΔE＝1330M-1cm-1)监 测FAP水解。全部检测都在25℃于pH 6.8的0.1M磷酸钾缓冲液中 进行。
在CCF2中，头孢菌素核心将7-羟基香豆素连接至荧光素。对 于完整分子，激发香豆素(Eex-409nm)导致FRET至荧光素，发射绿 光(Eem-520nm)。用β-内酰胺酶裂解CCF2导致两种染料空间分离， 破坏了FRET，使得现在激发香豆素产生蓝色荧光(Eex-477nm)。CCF2 购自Aurora Biosciences Corporation(San Diego，CA)。使用荧光多孔 板读数器CytoFluorII(PerSeptive Biosystems，Framingham，MA，USA) 检测FRET信号的减少和蓝色荧光的增加。
结果
所有的β-内酰胺酶，包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) PC1的β-内酰胺酶，都水解不同化学结构的β-内酰胺。水解效力取决 于酶的类型和底物化学结构。青霉素被认为是金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)PC1β-内酰胺酶的优选底物。
如Zawadzke等(1995)所述研究了点突变对β-内酰胺酶水解青霉 素能力的影响。如图20所示，GST-β-内酰胺酶PC1融合蛋白有效水 解FAP。即使在共温育60分钟后也不能检测到BlaZ.E166D、 BlaZ.N170Q或BlaZ.E166D:N170Q BlaZ突变体水解FAP。因此，这 些突变导致BlaZ显著失活。
为证明BlaZ.E166D、BlaZ.N170Q或BlaZ.E166D:N170Q突变体 结合β-内酰胺，并由此可将不同的官能团经β-内酰胺束缚至这些蛋 白，将这些突变体的GST融合体与荧光青霉素BOCELLINTM FL (Molecular Probes Inc.，Eugene，OR)温育。用SDS-PAGE分离蛋白， 用荧光成像仪(Hitachi，Japan)以适于具体荧光团的Eex/Eem分析。图22 的数据显示，所有的BlaZ突变体都结合BOCELLIN。而且，BlaZ突 变体和荧光底物之间的键非常强，可能是共价键，因为与SDS煮沸 接着进行SDS-PAGE并没有破坏该键。此外，双突变体 BlaZ.E166D:N170Q的结合效力(根据蛋白-结合荧光团的荧光信号强 度判断)远高于任一种单突变体的结合效力，而BlaZ.N170Q的结合 效力高于BlaZ.E166D的结合效力。这些数据结合目前理解的各个氨 基酸在β-内酰胺水解中的作用表明，额外的突变(例如辅助氨基酸的 突变)可提高官能团与突变蛋白束缚的效力。
还使用Zlokarnik等(1998)描述的基于FRET的底物CCF2研究 了点突变对β-内酰胺酶水解头孢菌素能力的影响。如图23所示， GST-β-内酰胺酶PC1融合蛋白有效水解CCF2(泳道2)。单点突变(即 E166D或N170Q)降低了融合蛋白水解CCF2的能力(泳道3和4)。替 换两个氨基酸(BlaZ.E166D:N170Q突变体，泳道5)甚至更显著地影 响CCF2水解。但是，所有的BlaZ突变体都能够水解CCF2。
因此，在166或170位的氨基酸置换，例如Glu166Asp或 Asn170Gly，能使突变β-内酰胺酶捕获底物，因此将底物官能团经稳 定(例如共价)键束缚至突变β-内酰胺酶。而且，对H2O活化具有辅助 作用的氨基酸的突变增加了束缚效力。
实施例VII
将DhaA.H272F靶向活细胞的细胞核和胞质
材料和方法
通过将NLS3编码序列(猿猴病毒大T抗原核定位信号(NLS)的 三个串联重复)插入到pCIneo.GFP-连接基团-DhaA.H272F-Flag载体 的AgeI/BamHI位点，构建GFP-连接基团-DhaA.H272F-NLS3融合表 达盒。退火两种编码NLS3肽的互补寡核苷酸(5′- CCGGTGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGA AGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTATGAG-3′， 有义，SEQ ID NO：37，和5′-GATCCTCATACCTTTCTCTTCTTTTT TGGATCTACCTTTCTCTTCTTTTTTGGATCTACCTTTCTCTTCTTT TTTGGATCA-3′，反义，SEQ ID NO：38)。退火DNA在5′末端具有AgeI 位点，在3′末端具有BamHI位点。将退火DNA亚克隆入GFP-连接 基团-DhaA.H272F-Flag构建物的AgeI/BamHI位点。基因融合构建物 的序列通过DNA测序检验。
通过用DhaA.H272F-Flag编码区替换编码GFP2-β-抑制蛋白2的 Packard载体(Packard#6310176-1F1)中的pGF2编码区，构建 DhaA.H272F-β-抑制蛋白2融合表达盒。设计两种引物(5′- ATTATGCTGAGTGATATCCC-3′；SEQ ID NO：39，和5′-CTCGGTAC CAAGCTCCTTGTAGTCA-3′；SEQ ID NO：40)，以将KpnI位点插入 到DhaA的3′编码区，并由pGEX5X-3.DhaA.H272F-Flag模板扩增930 bp的片段。用NheI和KpnI限制酶切除pGFP2编码区，然后将含 DhaA.H272F编码序列的930bp片段插入到GFp2-β-抑制蛋白2编码 载体的NheI和KpnI位点。融合构建物的序列通过DNA测序检验。
将瞬时表达GFP-连接基团-DhaA.H272F-NLS3、GFP2-β-抑制蛋 白2或DhaA.H272F-β-抑制蛋白2融合蛋白的CHO-K1细胞或3T3 细胞以30,000细胞/cm2的密度接种于LT-II室(Nunc)中。第二天，用 含25μM羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl的新鲜培养基置换培养 基，将细胞放回CO2培养箱中放置60分钟。在温育结束时，去除底 物培养基，用PBS(pH 7.4；4次连续清洗：1.0ml/cm2；每次5秒)快 速清洗细胞，然后向细胞中加入新培养基。将细胞放回CO2培养箱 中，60分钟后用PBS(pH 7.4；1.0ml/cm2)快速清洗细胞。用配有适 于检测GFP和羧基四甲基罗丹明的滤光片组的共焦显微镜Pascal-5 (Carl Zeiss)获得细胞的荧光图像。
结果
如图24的图像所示，GFP和羧基四甲基罗丹明共定位于表达 GFP-连接基团-DhaA.H272F-NLS3，并与羧基四甲基罗丹明- C10H21NO2-Cl接触细胞的细胞核中。
如图25的图像所示，GFP-β-抑制蛋白2表达细胞具有典型的β- 抑制蛋白2胞质定位。DhaA.H272F-β-抑制蛋白2的SDS-PAGE凝胶 的荧光扫描显示，含DhaA底物的羧基四甲基罗丹明与表达 DhaA.H272F-β-抑制蛋白2的细胞强结合。
实施例VIII
定点诱变DhaA催化残基130
卤代烷脱卤素酶使用三步机制裂解碳-卤键(图1A-B)。该反应由 亲核残基、碱性残基和酸性残基组成的氨基酸残基三联体催化，在 自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus)卤代烷脱卤素酶(Dh1A)中， 所述残基分别是残基Asp124、His289和Asp260(Franken等，1991)， 在鞘氨醇单胞菌(Sphinogomonas)和红球菌(Rhodococcus)脱卤素酶 LinB和DhaA中，已分别鉴别出类似的三联体残基为Asp108、His272 和Glu132(Hynkova等，1999)以及Asp106、His272和Glu130(Newman 等，1999)。在底物结合后，Asp残基的羧酸对底物的亲核攻击引起卤 -碳键裂解，形成烷基-酯中间体。针对Dh1A Asp124残基的定点诱变 研究表明，此第一步反应通过共价催化作用并形成烷基-酶中间体而 进行(Pries等，1994)。脱卤素酶反应途径中的下一步是被活性位点His 残基活化的水分子水解中间体酯。尽管催化性组氨酸残基为共价中 间体去烷基化的碱性催化剂，但其不是活性位点Asp的初始亲核攻 击所必需的。已经表明，没有关键性催化组氨酸残基的蛋白突变体 进行烷基化半反应，由此产生稳定的共价酯中间体。例如，先前已 经表明，Dh1A的His289Gln突变体累积共价烷基-酶中间体(Pries等， 1995)。
与卤代烷脱卤素酶亲核残基和碱性残基不同，催化三联体第三 个成员的作用迄今尚未完全了解。催化性酸性残基与催化His残基形 成氢键，可能通过增加咪唑环中氮的碱性而支持His残基的功能。 Krooshof等(1997)使用定点诱变研究Dh1A催化性酸Asp260的作用， 证明D260N突变体无催化活性。而且，该残基显然具有重要的结构 作用，因为突变蛋白主要累积在包含体中。少动鞘氨醇单胞菌 (Sphinogomonas pauciynobilis)卤代烷脱卤素酶(LinB)参与γ-六氯环己 烷降解(Nagata等，1997)。Hynkova等(1999)用谷氨酰胺(Q)残基替换 了LinB的推定催化残基(Glu-132)。但是，即使以非常高的底物浓度 也没有观测到E132Q突变体的活性。
为检测DhaA催化三联体酸性残基Glu130在蛋白生产中的作用 以及突变蛋白与荧光标记的卤代烷底物形成共价烷基-酶中间体的能 力，使用定点诱变以谷氨酰胺、亮氨酸和丙氨酸替换130位的DhaA 谷氨酸(E)残基。
材料和方法
菌株和质粒。在定点诱变反应的转化中使用超感受态大肠杆菌 XL10 Gold(Stratagene；TetrΔ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endAl supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac Hte[′proAB lacIqZΔM15 Tn10(Tetr)Amy Camr])作为宿主。使用大肠杆菌菌株JM109(e14- (McrA-)recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(rK-mK+)supE44 relA1Δ(lac- proAB)[F′traD36 proAB lacIqZΔM15])作为宿主进行基因表达和全细 胞酶标记研究。将GST-DhaA-FLAG基因融合体克隆入质粒pGEX5X3 中，称为pGEX5X3DhaAWT.FLAG，使用其作为E130诱变的起始模 板。在DhaA中含H272F突变、称为pGEX5X3DhaAH272F-FLAG 的突变质粒，用作标记研究中的阳性对照，使用克隆载体pGEX5X3 作为阴性对照。
定点诱变DhaA E130残基。用于诱变的寡核苷酸序列示于下文。 标下划线的核苷酸表示改变密码子的位置。用Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)以100nmol规模合成寡核苷酸，并通过 在5′末端磷酸化进行修饰。
DhaA E130Q 5′
CAA AGGTATTGCATGTATGCAGTTCATCCGGCCTATCCCG 3′(S EQ ID
NO：41)
DhaA E130L 5′
GTCAAAGGTATTGCATGTATGCTGTTCATCCGGCCTATCCCGAC 3′
(SEQ ID NO：42)
DhaA E130A 5′AGGTATTGCATGTATGGCGTTCATCCGGCCTATCCC 3′
(SEQ ID NO：43)
使用QuikChange Multi试剂盒按照生产商的说明(Stratagene，La Jolla，CA)进行定点诱变。将诱变反应物导入到感受态大肠杆菌XL10 Gold细胞中，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上选择转化 体。由于替换了谷氨酸密码子(GAAttc)，初步筛选由单个转化体分离 的质粒DNA以获得缺失EcoRI位点的质粒DNA。选择推测含各反 应所需密码子改变的克隆，对其进行DNA序列分析(SeqWright， Houston，TX)。用于验证pGEX5X3载体中突变体序列的引物如下： 5′GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG 3′(SEQ ID NO：44)。
DhaA突变体分析。将三种DhaA.E130置换突变体与以下构建 物对比：野生型DhaA、DhaA.H272F和DhaA阴性对照(仅有pGEX5X3 载体)。在2ml含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB中于30℃振荡过夜培 养每个克隆。将过夜培养物以1∶50稀释入含50ml新鲜LB培养基和 氨苄青霉素(100μg/ml)的无菌烧瓶中。将培养物于25℃振荡培养， 以使产生的不溶性蛋白物质最少。当培养至对数中期(OD600＝0.6)时， 加入IPTG(0.1mM)，再将培养物于25℃振荡温育22小时。为了用 羧基四甲基罗丹明卤代烷缀合的底物标记全细胞，将每种培养物的 细胞密度调节至OD600＝1，然后加入底物至浓度为15μM。在温和搅 拌的情况下于4℃温育细胞大约18小时。温育后，将20μl每种标记 反应的细胞加入到6μl加载染料的4X SDS中，将样品煮沸约3分钟， 然后上样到4-20％丙烯酰胺凝胶(Tris甘氨酸)。对于体外标记研究， 通过收集3 mL细胞(OD600＝1)，并将所获得的沉淀再悬浮在75μL PBS 中，制备IPTG诱导培养物的粗裂解物。冻/融步骤后，加入含1.25 mg/mL溶菌酶的225μL 1X细胞培养物裂解试剂(Promega Corp.， Madison，WI)以促进细胞裂解。将每种裂解物的20μL样品与25μL1 ×PBS混合。加入羧基四甲基罗丹明标记的卤代烷底物至终浓度为25 μM。于室温温育标记反应物2小时。将25μl各种标记反应的样品 加入至6μl加载染料的4X SDS中，将样品煮沸约3分钟，然后上4-20％ 丙烯酰胺凝胶(Tris甘氨酸)。使用Fluorimager SI设备(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，设定在570nm检测发射，将凝胶成像。
以14,000RPM离心粗裂解物15分钟，产生无细胞裂解物。通 过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析监测蛋白产生。将转移至PVDF膜 的蛋白与缀合碱性磷酸酶(AP)的抗FLAGR抗体(Sigma，St.Louis，MO) 温育。用Western Blue稳定的碱性磷酸酶底物(Promega Corp.，Madison， WI)使印迹显色。
结果
通过定点诱变考察DhaA催化酸性残基在烷基-酶中间体水解中 的作用。用谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)或丙氨酸(A)密码子替换DhaA.WT 密码子E130，因为这些置换对酶结构的破坏可能最小。诱变后，使 用限制性内切核酸酶筛选和DNA序列分析确认所需要的密码子改 变。经过序列确认的DhaA.E130Q、DhaA.E130L和DhaA.E130A克 隆分别称为C1、A5和A12，选择它们进行进一步分析。分析E130 突变体的蛋白表达及其与羧基四甲基罗丹明标记的卤代烷底物形成 共价烷基-酶中间体的能力。在用IPTG诱导后三种E130基因变异体 在大肠杆菌JM109细胞中过表达。粗细胞裂解物的SDS-PAGE分析 结果显示，表达野生型和突变dhaA基因的培养物以大约相同的水平 累积蛋白(图26；泳道2、4、6、8、10和12)。而且，由编码DhaA.WT 和DhaA.H272F的构建物生产的蛋白大部分可溶，因为蛋白量在离心 后没有可察觉的变化(图26；泳道3和5)。出现在仅有载体的泳道的 大量22kDa蛋白条带(图26；泳道6和7)代表GST蛋白。但是，这 些结果与DhaA.E130Q、DhaA.E130L和DhaA.E130A突变体截然相 反，所述突变体似乎主要累积不溶性DhaA蛋白。此结论基于以下观 察结果：离心后存在于无细胞裂解物中的DhaA蛋白量有显著损失(图 26；泳道9、11和13)。尽管如此，在离心后(+s)的每个DhaA.E130 突变体泳道中都能清楚观测到与DhaA共迁移的蛋白条带，这提示存 在可溶性酶。因此使用蛋白质印迹分析，测定离心后在DhaA.E130 突变体中观测到的蛋白条带是否代表可溶性DhaA物质。图27显示 的免疫印迹证实，在每种DhaA.E130突变体无细胞裂解物中都存在 可溶性DhaA蛋白(泳道9、11和13)。
还检查了DhaA.E130突变体产生烷基-酶共价中间体的能力。在 羧基四甲基罗丹明标记底物存在时，温育由各种构建物的IPTG诱导 培养物制备的粗裂解物。图28显示DhaA.H272F突变体(泳道3)生产 该中间体非常有效。用DhaA.WT或阴性对照裂解物未能检测到该产 物。在初始检测时，DhaA.E130突变体似乎没有产生可检测水平的 共价产物。但是，在更严格检查荧光图像时，观测到极微弱的条带， 可能表示微量的共价中间体(图28；泳道5-7)。基于这些结果，研究 了全细胞产生荧光烷基-酶共价中间体的能力。
图29显示了对比每种DhaA.E130突变体和阳性对照 (DhaA.H272F突变体)以及阴性对照(DhaA-)的体内标记实验的结果。 正如所料，由接近DhaA融合体预测分子量的单荧光条带(图29，泳 道3)证实，DhaA.H272F突变体能够产生共价烷基-酶中间体。正如 先前体外标记结果所观测到的一样，用野生型或阴性对照培养物(图 29，泳道2和3)都不能检测到该产物，但全部三种DhaA.E130置换 突变体都再一次检测到迁移到正确位置的非常微弱的荧光条带(图 29，泳道5-7)。这些结果指出，DhaA.E130Q、L和A突变体可能具 有捕获共价烷基-酶中间体的能力。但是，与DhaA.H272F突变体酶 相比，该反应效率似乎急剧降低。
此诱变研究的结果提示，DhaA催化酸性残基DhaA.E130对酶 正确折叠起重要的结构作用。DhaA蛋白明显对该氨基酸位置的置换 敏感，证据是在DhaA.E130Q、DhaA.E130L和DhaA.E130A粗裂解 物中存在大量不溶性蛋白复合物。尽管如此，基于SDS-PAGE和免 疫印迹分析，在全部三种DhaA.E130突变体的无细胞裂解物中都检 测到显著量的可溶性DhaA蛋白。
实施例IX
活哺乳动物细胞中表达的DhaA.H272F-Flag
和DhaA.H272F-Flag海肾萤光素酶融合蛋白的捕获
材料和方法
以30,000细胞/cm2的密度将CHO-K1细胞接种在24孔板 (Labsystems)中，用pCIneo.DhaA.WT-Flag或pCIneo.hRLuc-连接基团 -DhaA.H272F-Flag载体转染。24小时后，用含25μM生物素- C10H21N1O2-Cl和0.1％DMSO的新鲜培养基或仅含0.1％DMSO的新 鲜培养基置换培养基，将细胞放置于CO2培养箱中60分钟。温育结 束时，去除培养基，用PBS(pH 7.4；4次连续清洗：1.0ml/cm2；每 次5秒)快速清洗细胞，将新培养基加入到细胞中。在某些实验中， 没有改变培养基。将细胞放回CO2培养箱中。
60分钟后，去除培养基，将细胞收集在含蛋白酶抑制剂(Sigma #8340)的PBS(pH＝7.4，200μl孔，室温)中。使细胞通过针头(IM1 23GTW)进行研磨而裂解。然后，将细胞裂解物与MagnaBind链霉抗 生物素蛋白包被的珠(Pierce#21344)按照生产商的方法温育。简而言 之，使用转盘将细胞裂解物与珠于室温(RT)温育60分钟。收集未结 合的物质；用PBS(3×500μl，pH＝7.4，室温)清洗珠，并重悬浮在 SDS-样品缓冲液(用于SDS-PAGE分析)或PBS(pH＝7.4，用于测定 R.Luc活性)中。用SDS-PAGE分离蛋白，转移至硝酸纤维素膜，用 抗Flag-Ab或抗R.Luc-Ab分析，通过增强型化学发光(ECL)系统 (Pharmacia-Amersham)检测结合抗体。使用Promega的“海肾萤光素 酶测定系统”按照生产商的方法测定结合于珠上的hR.Luc活性。
结果
捕获活细胞中表达的蛋白使得可以用各种分析方法/技术来分析 这些蛋白。可利用的捕获工具有很多，虽然这些工具大部分需要生 产高度特异性的抗体或需要将目标蛋白和特异性标记肽/蛋白基因融 合(Jarvik和Telmer，1998；Ragaut等，1999)。然而，这些标记物在活 细胞成像方面的应用很有限。为捕获DhaA.H272F和融合至 DhaA.H272F的功能蛋白，使用SA-包被的珠(Savage等，1992)。
生物素-C10H21NO2-Cl被DhaA.WT有效水解，并与DhaA.H272F 和DhaA.H272F融合蛋白在体内和体外共价结合。而且，在大肠杆菌 和哺乳动物细胞中都观测到结合。对照实验表明，处理60分钟后 CHO-K1细胞中表达的DhaA.H272F-Flag蛋白有大约80％被标记。
用生物素-C10H21NO2-Cl处理瞬时表达DhaA.H272F-Flag的 CHO-K1细胞。裂解经生物素-C10H21NO2-Cl处理的细胞，细胞裂解 物与SA-包被珠温育。使用抗FlagR抗体通过蛋白质印迹，分析 DhaA.H272F与珠的结合。如图30D所示，未用生物素-C10H21NO2-Cl 处理时，没有检测到DhaA.H272F-Flag捕获。同时，如果细胞用生 物素-C10H21NO2-Cl处理，则细胞中表达的DhaA.H272F-Flag有超过 50％被捕获在SA包被珠上。
为显示融合至DhaA.H272F-Flag的功能活性蛋白的捕获，用编 码hR.Luc-连接基团-DhaA.H272F-Flag的载体转染细胞，检测捕获在 珠上的萤光素酶活性。如图30C所示，在与生物素-C10H21NO2-Cl处 理细胞裂解物温育的珠上检测到显著的萤光素酶活性。同时，在与 未经生物素-C10H21NO2-Cl处理细胞裂解物温育的珠上没有检测到萤 光素酶活性。而且，在游离生物素-C10H21NO2-Cl未被洗出时，在与 生物素-C10H21NO2-Cl处理细胞裂解物温育的珠上没有检测到hR.Luc 活性。
总之，这些数据显示，使用生物素-C10H21NO2-Cl和SA-包被珠 可有效捕获融合至DhaA.H272F的功能活性蛋白(hR.Luc)。该捕获是 生物素依赖性的，并且可由过量生物素-C10H21NO2-Cl竞争消除 (competed-off)。由于观测到所述珠对hR.Luc活性的显著抑制作用(未 列出数据)，所以使用SDS-PAGE和采用抗R.Luc抗体的蛋白质印迹 分析，估计捕获hR.Luc-连接基团-DhaA.H272F-Flag融合蛋白的效力。 如图30D所示，以生物素依赖性方式可捕获超过50％的hR.Luc-连接 基团-DhaA.H272F-Flag融合蛋白。这与DhaA.H272F-Flag的捕获效 力良好吻合(参见图30A)。
实施例X
其价键形成速率增加的DhaA突变体
苯丙氨酸残基对DhaA催化碱性残基His272的取代与Asp亲核 残基相适，产生称为DhaA.H272F的修饰蛋白，其可累积显著量的共 价烷基-酶中间体(图2C)。没有活化水的His272残基使得可以捕获共 价酯中间体(图2C)。此突变体在结合底物前和后的结构模型分别示 于图2E和2F。而且，含半胱氨酸取代亲核残基Asp160的DhaA突 变体也能够捕获共价中间体。该突变体称为DhaA.D106C(图2D)， 其通过硫醇亲核残基的作用替换卤化物部分。甚至在存在活化水的 H272残基时所获得的硫醚键也对水解稳定(图2D)。
在蛋白和卤代烷配体之间产生稳定共价键的能力提供了一种通 用报告体技术，其可位点特异性标记、定位、固定和/或荧光显现哺 乳动物细胞中的蛋白(参见实施例II-IX)。在一个实施例中，脱卤素 酶(DhaA)的活性位点突变体通过与合成卤代烷缀合底物的稳定共价 键束缚具有这些突变体的融合蛋白。为增强DhaA.H272F和 DhaA.D106C的动力学，在鉴别DhaA和底物之间的有利相互作用的 研究中使用蛋白-配体(蛋白-底物)复合物建模，以便优化共价键形成 速率。
材料和方法
菌株、生长条件和质粒。使用大肠杆菌DH10B(F-mcraA Δ[mrr- hsdRMS-mcrBC]80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR reca1 endA1 araD139 Δ(ara，leu)7691 galU galK rpsL nupG)和JM109(e14-(McrA-)recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(rκ-mκ+)supE44 rela1Δ(lac-proAB)[F′ traD36 proAB lacIqZΔM15])作为宿主，用于基因表达和文库筛选。常 规地在Luria-Bertani(LB)或Terrific broth(TB)培养基中培养大肠杆菌 (Sambrook等，2001)。需要时，以1.5％(重量/体积)向培养基中加入 Difco琼脂。向培养基中加入氨苄青霉素(100μg/mL；Amp)，以选择 重组质粒。将分别含DhaA.H272F和DhaA.D106C的GST融合体的 大肠杆菌表达质粒pGEX5X3DhaA.H272F.FLAG和 pGEX5X3DhaA.D106C.FLAG用作定向诱变的起始模板。使用表达载 体pCI-Neo(Promega Corp.，Madison，WT)检验哺乳动物细胞中DhaA 突变体的表达和标记。
试剂和化学品。所有化学品都购自Sigma-Aldrich(Milwaukee， WI)。除非另有说明，否则所有酶都来自Promega(Madison，WI)。诱 变和PCR引物由Promega Corp.、Seq Wright(Houston，TX)和Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)合成。DhaA诱变使用QuikChange Multi Kit(Stratagene，La Jolla，CA)进行。羧基四甲基罗丹明- C10H21NO2-Cl、羧基荧光素-C10H21NO2-Cl、二乙酰基羧基荧光素- C10H21NO2-Cl和含生物素的氯化卤代烷配体(例如生物素-14-Cl、生物 素-X-14-Cl和生物素-PEG4-14-Cl，参见图7)由Promega Biosciences Inc. (San Luis Abispo，CA)合成。
DNA分析和蛋白质建模。DNA分析使用Vector NTI软件包(第 8版)进行。蛋白质结构得自Protein Data Bank(PDB http://www.rcsb.org/pdb/)。结构分析和建模用含组件Biopolymer、 Discover、Homology和Modeler的InsightII 2000.1 (Accelrys http://www.accelrys.com/)进行。
诱变和文库构建。重组DNA工作使用如Sambrook等(2001)所 述的标准方法进行。在诱变前，使用以下寡核苷酸检验DhaA模板序 列：正向引物“21972”，5′-GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG-3′(SEQ ID NO：64)和反向引物“21973”，5′- CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG-3′(SEQ ID NO：65)。
用于DhaA.H272F或DhaA.D106C残基175(Lys)、175(Cys)和 273(Tyr)位点饱和诱变(site-saturation mutagenesis)的寡核苷酸序列如 下所示：
175 NNK：
5′ATCGAGGGTGCGCT℃CCGNNKTGCGTCGTCCCTCCGCTTACGG 3′
(SEQ ID NO：66)
176NNK：
5′ATCGAGGGTGCGCTCCCGAAANNKGTCGTCCGTCCGCTTACGG 3′
(SEQ ID NO：67)
175/176 NNK/NNK：
5′ATCGAGGGTGCGCTCCCGNNKNNKGTCGTCCGTCCGCTTACGG 3′
(SEQ ID NO：68)
Y273 NNK＝H272F：
5′ATCGGCCCGGGATTGTTCNNKCTCCAGGAAGACAACCCGG 3′(SEQ
ID NO：69)
Y273 NNK＝H272：
5′CGGCCCGGGATTGCACNNKCTCCAGGAAGACAACCCGGA 3′(SEQ
ID NO：70)
V245T：
5′GGGCACACCCGGCACCCTGATCCCCCCGG 3′(SEQ ID NO：83)
标下划线的核苷酸指示改变密码子的位置。使用QuikChange Multi Kit按照生产商的说明(Stratagene，La Jolla，CA)进行定点诱变。 将诱变反应物导入到感受态大肠杆菌中，并在含氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB琼脂平板上选择转化子。通过对各个文库的12-48个随 机选择克隆进行DNA序列分析来评价文库质量。使用Wizard SV Miniprep Kit(Promega Corp.)由大肠杆菌分离用于序列分析的质粒。 DNA序列分析利用Seq Wright DNA Technology Services(Houston，TX 进行。
用于分析175、176和175/176文库的测序引物包括：“175/176”， 5′-GCCTATCCCGACGTGGGACG-3′(SEQ ID NO：71)；“255R”，5′- AGGTCTCGCGGCTTCGGCCGGGGG-3′(SEQ ID NO：72)；“F70”， 5′-AAAATCGGACAAACCAGACCTCG-3′(SEQ ID NO：73)；“F189”， 5′-ATCGCGAGCCCTTCCTCAAGCCTG-3′(SEQ ID NO：74)；和 “R121”，5′-GTTCCGGATTGCGCTTGGCCCAGT-3′(SEQ ID NO：75)。
筛选实验开发
体内检测与DhaA底物的结合
将具有DhaA.H272F或DhaA.D106C编码质粒的大肠杆菌菌落 接种入200μL LB+100μg/ml氨苄青霉素中，并于37℃在平底96孔 板中过夜培养。将过夜培养物以1∶20稀释入200μL TB+100μg/mL 氨苄青霉素+0.1mM IPTG中，并于30℃过夜培养。将用于体内标 记的细胞量对生长(OD600)标准化。将50-100μL诱导细胞转移入U 形底96孔板，沉淀，用50μl PBS+15μM羧基四甲基罗丹明- C10H21NO2-Cl重悬浮，在旋转摇床上于室温标记60分钟。为去除未 结合的配体，以2500rpm离心5分钟收集细胞，废弃上清液，细胞 用100μL 10mM Tris-HCl pH 7.5、0.9％NaCl和0.05％Triton重悬浮， 清洗15分钟。此清洗程序重复3次。使用以下参数用Tecan Safire 平板读数器检测荧光强度：545nm激发；575nm发射。将DhaA突 变体的荧光强度与DhaA-、DhaA.H272F和DhaA.D106C对照细胞对 比。
使用固定化DhaA进行底物捕获
使用先前用抗Flag M2 IgG(Sigma)包被的96孔微量滴定板(平 底；Nunc MaxiSorp)固定纯化的DhaA.H272F或DhaA.D106C突变蛋 白(纯化的，50ng，由使用FastBreakTM细胞裂解剂产生的大肠杆菌裂 解物获得，Promega Corp.)。使用100μL抗Flag(5μg/mL)的0.1M NaHCO3溶液pH 9.6于4℃过夜进行包被。第二天，排空平板，用含 3％BSA的300μL PBS于25℃封闭1小时。排空平板，用含0.1％Tween 20的PBS(PBST)洗涤4次，将生物素化底物(变化浓度的生物素-14- Cl、生物素-X-14-Cl或生物素-PEG4-14-Cl)加入到各孔的100μL PBS +0.05％Tween 20+0.5％BSA (PBSTB)中，并于25℃温育不同的时 间。通过排空平板并用PBST洗涤4次，终止固定化DhaA和底物之 间的反应。然后将100μL链霉抗生物素蛋白(SA)-HRP(1∶5,000的 PBSTB溶液；Prozyme)加入到各个孔中，并于25℃温育1小时。排 空平板，用PBST洗涤8次，以100μL体积加入TMB。15分钟后， 通过加入等体积的0.2M H2SO4终止显色，通过检测450nm的吸光 度定量信号。
使用MagneGSTTM顺磁粒子(PMP)进行蛋白捕获。将细菌菌落拣 选入含LB+氨苄青霉素的96孔平板中，并于30℃振荡温育。将培 养物以1∶20稀释入含新鲜TB培养基、氨苄青霉素和0.1mM IPTG 的96孔平板中。将平板于30℃过夜振荡温育。离心含IPTG诱导培 养物的96孔平板，去除上清液。通过饱和MagneGSTTM PMP上的蛋 白捕获将DhaA突变体对蛋白浓度标准化。将含MagneGSTTM细胞裂 解剂、MagneGSTTM PMP和羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl(15μM) 的混合物吸取入含细胞沉淀的96孔平板中。将平板于室温以约900 rpm振摇10分钟。使用MagnaBot96磁性分离装置，用PBST洗 涤粒子3次。去除洗涤溶液，加入MagneGSTTM洗脱溶液，使平板于 室温振摇(约900rpm，5分钟)。将上清液转移至新的平底透明96孔 平板，使用550nm的激发波长和580nm的发射波长检测荧光强度。
自动化文库筛选  用MagneGSTTM型检测于定制Tecan Freedom 机器人工作站上筛选DhaA突变体文库。检测参数使用FACTS调度 软件自动化，并允许平行处理多个96孔平板。将细胞沉淀储存于冷 冻Storex培养箱(4℃)中，直至自动取回平板进行下一步处理。使用 TeMo液体处理系统(Tecan US)将试剂转移至平板。用Tecan Te- ShakeTM于室温以约900rpm振摇平板10分钟。使用MagnaBot96 磁性分离装置用PBST洗涤粒子，所述装置适用于TeMo液体分配系 统，并与FACTS调度软件相适。使用Tecan Satire荧光分光计进行 荧光强度测量。将原始荧光强度数据输入到Excel电子表格中进行分 析。检查筛选数据中强度高于亲代对照的孔，这些孔表明可能存在 改进的DhaA克隆。
次级文库筛选。在初始筛选之后，将相对于亲代克隆(即 DhaA.H272F或DhaA.D106C)表现出至少20％改进的所有克隆都在补 加氨苄青霉素的LB平板上划线。将鉴别出的各个命中结果的任意4 个菌落接种入200μL LB+氨苄青霉素中，并于30℃在平底96孔板 中过夜培养。将过夜培养物以1∶50稀释入补加0.1mM IPTG的200μL TB氨苄青霉素中，并于30℃和37℃过夜培养。使用MagneGSTTM型 筛选再次检测诱导培养物。所有改进的克隆都进行测序和保存。使 用Qiagen小型制备试剂盒制备用于测序的质粒DNA。在1％DMSO 存在下，将所有改进克隆的2ml培养物保存于-70℃。
DhaA蛋白纯化。使用MagneGSTTM蛋白纯化系统(Promega， Madison，WI)以小规模纯化蛋白。对于蛋白纯化，将菌落接种入1ml LB+100μg/ml氨苄青霉素中，并于30℃过夜培养。将过夜培养物以 1∶50稀释入10mL新鲜LB+100μg/mL氨苄青霉素中。培养这些培 养物，直至A600＝0.6，此时用0.1mM IPTG诱导培养物，并于25℃ 过夜培养。将诱导培养物的细胞沉淀于-70℃冷冻15分钟。为产生细 胞裂解物，在1X蛋白酶抑制剂混合物(Becton-Dickinson Biosciences) 存在下用2mL裂解缓冲液(含1mM DTT+20μL RQ DNase)重悬浮 沉淀，并在旋转摇床上温育30分钟。在使用前，用MagneGST结合/ 洗涤缓冲液平衡4mL MagneGST粒子的25％淤浆3次。在最终洗涤 后，将粒子在1X体积的结合/洗涤缓冲液中重悬浮。将粒子直接加 入到裂解物中，在旋转摇床上于室温温育混合物30分钟，以使 GST-DhaA融合蛋白与磁性粒子结合。在用2.5X体积的洗涤结合缓 冲液+1mM DTT洗涤粒子3次后，通过与洗脱缓冲液(100mM谷胱 甘肽、50mM Tris HCl pH 8.1、1mM DTT和1X BD蛋白酶抑制混合 物)温育15分钟洗脱GST-DhaA蛋白。洗脱的蛋白对储存缓冲液(50 mM Tris HCl pH 7.5、200mM NaCl、1mM DTT、1mM EDTA、20％ 甘油)透析2次。
使用谷胱甘肽Sepharose 4Fast Flow树脂(Amersham Biosciences) 实现DhaA蛋白融合体的大规模纯化。简而言之，将500ml诱导细 胞培养物的沉淀重悬浮在含1mM DTT的20mL 1X磷酸缓冲盐水 (PBS)(缓冲液A)中。在加入溶菌酶(10mg/mL)之后，使混合物于4℃ 温育30分钟。加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度2mM，之后立即 超声处理。将澄清的裂解物加入到树脂中，并在混合下于4℃温育2 小时至过夜。在用缓冲液A进行两次40mL分批洗涤后，将树脂加 入至Wizard Maxi柱(Promega Corp.)。用含0.3M NaCl的10ml缓冲 液A洗涤柱内容物2次。将融合蛋白以2mL含20mM谷胱甘肽的 缓冲液A级分洗脱。将含蛋白的级分对含20％甘油的1L缓冲液A 透析2次。
纯化DhaA突变体的体外标记。通过凝胶荧光成像分析，检测 荧光底物与DhaA突变体的共价束缚。将GST-DhaA融合体(9nM)与 不同浓度和温度的羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl、羧基荧光素- C10H21NO2-Cl或罗丹明绿-C10H21NO2-Cl的50mM Tris HCl(pH 7.5)溶 液温育。通过加入底物启动反应，对于时程实验，将18μL等份的反 应物移至含6μL SDS凝胶上样缓冲液的试管中，煮沸5分钟，在预 浇注的4-20％梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的Tris-甘氨酸(Invitrogen， Carlsbad，CA)中分离。凝胶使用Hitachi FM Bio II(535nm激发，580nm 发射)荧光成像，通过光密度分析法或ImageQuant(Amersham)定量条 带。由以下的二级速率公式(Cornish-Bowden，1995)计算速率常数：
kt＝(1/B0-A0)ln[(B0-x)A0/(A0-x)B0]
其中k＝速率常数；B0＝时间为0时的[反应物B]，mol/L(M)； A0＝时间为0时的[反应物A]，mol/L(M)；B0-x＝时间等于t时的[反 应物B]，mol/L(M)；A0-x＝时间等于t时的[反应物A]，mol/L(M)。 ln[(B0-x)A0/(A0-x)B0]对时间的作图应当是线性的，k可由线k(B0-A0) 的斜率确定。
荧光偏振(FP)。使用荧光偏振，分析DhaA突变体的反应动力学。 测量在Beacon 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)上进行，或以96孔形 式使用Ultra平板读数器(Tecan，Research Triangle Park，NC)进行。将 羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl或羧基荧光素-C10H21NO2-Cl底物 (7.5-10nM)与过量的纯化GST-DhaA蛋白温育。对于羧基四甲基罗 丹明-C10H21NO2-Cl标记研究，使用以下浓度的蛋白：亲代蛋白，15 μM；第一代DhaA突变体，1.5-0.15μM；第二代DhaA突变体，0.035 μM。对于羧基荧光素-C10H21NO2-Cl标记研究，使用以下浓度的蛋白： 亲代蛋白，15μM；第一代克隆，1.5-0.15μM；第二代克隆，0.15μM。 通过加入蛋白至底物开始反应。在0.5-12小时内以10-30秒的间隔进 行荧光偏振和荧光强度的测量。使用2级速率公式计算速率常数。
热稳定性分析。在4、22、30、37、42、50或60℃温育15、30 或60分钟之后，通过测量纯化蛋白的剩余活性，测定DhaA突变体 的热稳定谱。于室温(约25℃)进行FP检测。对于这些研究，用羧基 四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl标记15μM的亲代或1.5-0.15nM的第一 代克隆，用羧基荧光素-C10H21NO2-Cl标记0.15nM的第二代克隆。 对于各个克隆，计算各种条件的标记速率(线性范围的斜率)。随意地 将在4℃温育15分钟后观测到的速率指定为100％活性。计算每种条 件的剩余活性(％)。为测定稳定性，对于各个温育时间，将剩余活性 的百分率对温育温度作图。为计算各个温育温度的半寿期，将剩余 活性的百分率对温育时间作图。由图外推损失50％活性的时间。
用固定化DhaA捕获氯烷基化分子。如上使用抗Flag M2 IgG包 被的微量滴定板来固定突变DhaA(50ng)。将变化浓度的氯烷烃与目 标模型分子的溶液(BSTB)于25℃温育。就生物素化氯烷烃而言， 目标分子是SA-HRP。就羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl而言，目 标分子是抗TMR IgG(Probes)。氯烷基化反应进行1小时，然后加入 (以100μl体积)至含固定化DhaA的洗涤板。这些温育于25℃持续1- 2小时，通过排空板并用PBST洗涤4次终止。对于SA-HRP反应， 以100μL体积向平板加入TMB。显色15分钟，然后通过加入等体 积的0.2M H2SO4终止显色。通过测量450nm的吸光度对信号定量。 对于羧基四甲基罗丹明反应，使用抗兔IgG-HRP缀合物二抗(100μL， 1∶5,000的PBSTB稀释液；25℃，1小时)检测结合的抗羧基四甲基罗 丹明IgG。用PBST洗涤板8次，用TMB显色，如上定量。
使用固定化氯烷烃底物进行DhaA捕获。使用链霉抗生物素蛋 白高结合量包被的96孔微量滴定板(平底，Pierce)固定生物素化氯烷 烃底物：生物素-14-Cl、生物素-X-14-Cl和生物素-PEG4-14-Cl。在使 用过量底物(约2μmol)的情况下，所述板每孔可结合约75 pmol生物 素。在含100μL PBS+0.05％Tween 20+0.5％BSA(PBSTB)的缓冲 液中于25℃固定底物1小时后，排空板，用含0.1％Tween 20的PBS (PBST)洗涤板4次。固定化底物和突变DhaA之间的反应使用纯化的 GST-DhaA-Flag融合体进行。将不同浓度的蛋白(100μL；在PBSTB 中稀释)与固定化底物于25℃温育不同时间，通过排空板并用PBST 洗涤4次终止反应。为检测结合的DhaA，以1∶10,000稀释度(以PBSTB 稀释)向每个孔加入100μL抗GST-HRP(Amersham)，将平板于25℃ 温育1小时。排空板，用PBST洗涤8次，然后加入100μL体积的 TMB。15分钟后，通过加入等体积的0.2M H2SO4终止显色，通过 测量450nm的吸光度定量信号。
哺乳动物细胞中DhaA突变体的表征。如下将所鉴别出的DhaA 突变体的选定序列克隆入哺乳动物表达载体pCI-neo：用SalI和NotI 限制性内切核酸酶由pGEX5X3中取出突变基因的DhaA-FLAG部 分。通过在1％琼脂糖(1XTAE)中电泳分离片段，切出片段并使用 QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化。还用SalI和NotI消化 pCI-neo载体骨架，分离并以相同方式纯化。使用Promega的LigaFast System以约5∶1的插入片段∶载体比率进行连接。将DNA转化入化学 感受态JM109细胞中，并接种至含氨苄青霉素的LB琼脂平板上。 将转化菌落拣选入含1mL LB+氨苄青霉素的96孔检测封闭液(Fisher Scientific)中，于37℃过夜振摇。收获细胞，使用Wizard 96质粒纯 化试剂盒(Promega Corp.)纯化质粒。通过SalI-NotI限制性消化筛选存 在DhaA插入片段的质粒，并通过在1％琼脂糖(1XTAE)中电泳进行 筛选。通过DNA序列分析证实阳性克隆。
建立质粒pHT2，以改进哺乳动物细胞中的蛋白生产，促进融合 蛋白的产生。用寡核苷酸10055643(5′CTA TAG GCT AGC CAG CTG GCG CGG ATA TCG CCA CCA TGG GAT CCG AAA TCG GTA CAG GCT TCC CCT TCG 3′；SEQ ID NO：84)和10055644(5′AGG GAA GCG GCC GCC TAC TTA ATT AAC TAT TAG CCG GCC AGC CCG GGG AGC CAG CGC GCG ATC TCA CTG C 3′；SEQ ID NO：85)，由 含DhaA.H272F YL-FLAG的pCIneo扩增DhaA.H272F YL。PCR产 物和目标载体均用EcoRV/NotI切割、凝胶纯化、连接和转化入JM 109 中。由pHT2编码的DhaA蛋白称为HT2，其含对DhaA.H272F YL 氨基酸序列的其它改变。除了H272F、K175M、C176G和Y273L置 换以外，其它改变包括：1)在位置2插入甘氨酸，以产生更好的Koazak 序列；2)用于建立SmaI/XmaI/AvaI位点的Ala292Gly置换；以及将丙 氨酸和甘氨酸(AlaGly)插入C末端，以产生NaeI位点(图49)。
哺乳动物细胞培养物。在Ham F12营养物或补加10％胎牛血清 (FBS)、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的Dulbecco改良型极限 必需培养基(纯正地(respectably))中，在95％空气和5％CO2气氛下于 37℃培养CHO-K1细胞(ATCC-CCL61)或HeLa细胞(ATCC-CCL2)。
哺乳动物细胞转染。为研究不同蛋白的瞬时表达，将细胞以 30，000细胞/cm2的密度接种在24孔板(Labsystems)或8孔LT盖玻片 Chamber Slide(Nunc)中。在约80-90％铺满时，按时生产商(Invitrogen) 的说明使细胞接触脂转染胺试剂/DNA/无抗生素培养基的混合物。第 二天，用新鲜培养基更换培养基，使细胞生长不同的时间长度。
细胞到凝胶分析。将CHO-K1细胞接种在24孔板(Labsystems) 中，并用pCIneo-CMV.DhaA突变体-Flag载体转染。24小时(在某些 实验中为12、24或48小时)后，用含0.2-25.0μM羧基四甲基罗丹明 -C10H21NO2-Cl或DiAc羧基荧光素-C10H21NO2-Cl的新鲜培养基置换 培养基，将细胞放置于CO2培养箱中达1、5、15或60分钟。在此 温育后，去除培养基，用PBS(pH 7.4；2次连续清洗：1.0ml/cm2； 每次5秒)快速洗涤细胞，将细胞溶解在样品缓冲液(1％SDS、10％甘 油等；200μl/孔)中。蛋白(2-10μl/泳道)在SDS-PAGE(4-20％梯度凝 胶)上分离。用荧光成像仪(Hitachi，Japan)以等于540/575nm的Eex/Eem 定量羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl与蛋白的结合。
细胞成像。将HeLa细胞接种在8孔LT盖玻片Chamber Slide (Nunc)中，用pCIneo-CMV.DhaA突变体或β-抑制蛋白2-连接基团- DhaA.H11YL载体转染。24小时后，用含不同浓度(0.2-10.0μM)的羧 基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl或DiAc羧基荧光素-C10H21NO2-Cl的 新鲜培养基置换培养基，将细胞放置于CO2培养箱中达15分钟。在 此温育后，去除培养基，用PBS(pH 7.4；2次连续清洗：1.0ml/cm2； 每次5秒)快速洗涤细胞。对于活细胞成像实验，将新培养基加入到 细胞中。将细胞放回到CO2培养箱中，60分钟后用新鲜培养基置换 培养基。用配有适于检测羧基荧光素和羧基四甲基罗丹明的滤光片 组的共焦显微镜FluorView500(Olympus)对细胞进行荧光成像。为固 定细胞，将含0.1％Triton-X100的200ml 3.7％多聚甲醛的PBS溶液 (pH 7.4)加入到细胞中。在室温(RT)15分钟后，用含0.1％Triton-X100 的PBS(pH 7.4)洗涤细胞(10分钟，RT)。用PBS(pH 7.4)替换去垢剂 溶液，用共焦显微镜FluorView500(Olympus)对细胞进行荧光成像。 在某些实验中，用100nM MitoTrackerR Green FM(Invitrogen，M-7514) 或MitoTrackerR Orange CMTMRos(Invitrogen，M-7510)于37℃对细胞 复染色15分钟。
DhaA融合体的生产。通过将β-抑制蛋白2(参见实施例VII)亚 克隆入pHT2载体(Promega)的NheI/BamHI限制位点，构建β-抑制蛋 白2-连接基团-HT2融合表达盒。设计两种引物(5′- CTATAGGCTAGCCAGCTGGCGCGGATATCGCCACCATGGGGGA GAAACCCGGGACCAGGG-3′，SEQ ID NO：76 ；和 5′- GATTTCGGATCCCATTCTAGAGGGCCCGCGGTACCGCAAGCTTG ATCCGGAGCAGAGTTGATCATCATAGTCGTCATCC-3′，SEQ ID NO：77)，以将连接基团编码序列和BamHI位点加入到β-抑制蛋白2 编码区的3′末端，并由β-抑制蛋白2-连接基团-DhaA.H272F模板扩增 该片段。
通过用HT2编码区替换phRLuc-连接基团-DhaA.H272F-Flag编 码载体中的DhaA.H272F编码区(参见实施例IX)，构建phRLuc-连接 基团-HT2-Flag  融合表达盒。设计两种引物(5′- GCCCTCTAGAGCCGTCGACGCTGCCATGGGATCCGAAATCG-3′， SEQ ID NO：7 8；和5′-GTAGTCACCGGTGCCGGCCAGCCCGGGGA GCCAGCGCGCG-3′，SEQ ID NO：79)，以将XbaI位点加入到HT2编 码区的5′末端，将AgeI位点加入到HT2编码区的3′末端，并由pHT2 模板扩增925bp的片段。用XbaI和AgeI限制酶切下DhaA.H272F 编码区，然后将编码HT2的925bp片段插入到phRLuc-连接基团- DhaA.H272F-Flag编码载体的XbaI和AgeI位点中。所有融合构建物 的序列都通过DNA测序证实。
在活哺乳动物细胞中表达的海肾萤光素酶-HT2-Flag融合蛋白。 将CHO-K1细胞接种在24孔板(Labsystems)中，并用pCIneo.hRLuc- 连接基团-HT2-Flag载体转染。24小时后，用含25μM生物素-X-14- Cl和0.1％DMSO的新鲜培养基或仅含0.1％DMSO的新鲜培养基置 换培养基，将细胞在CO2培养箱中放置60分钟。温育结束时，去除 培养基，用PBS(pH 7.4；2次连续清洗：1.0ml/cm2；每次5秒)快速 清洗细胞，将新培养基加入到细胞中。在某些实验中，没有改变培 养基。将细胞放回CO2培养箱中。
60分钟后，去除培养基，将细胞收集在含蛋白酶抑制剂(Sigma #P8340)的PBS(pH＝7.4，200μl/孔，室温)中。使细胞通过针头(IM1 23GTW)研磨而裂解细胞。然后，将细胞裂解物与链霉抗生物素蛋白 Magnasphere顺磁颗粒(Promega#Z5481)按照生产商的方法温育。简 而言之，使用转盘将细胞裂解物与珠于室温温育60分钟。收集未结 合的物质；用含0.5％Triton-X100的PBS(3×500ml，pH＝7.4，室温) 清洗珠，并重悬浮在SDS-样品缓冲液(用于SDS-PAGE分析)或PBS (pH＝7.4，用于测定海肾萤光素酶(R.Luc)活性)中。用SDS-PAGE分 离蛋白，转移至硝酸纤维素膜，用抗Flag-Ab分析，通过增强型化学 发光(ECL)系统(Pharmacia-Amersham)检测结合抗体。使用Promega 的“海肾萤光素酶测定系统”按照生产商的方法测定结合于珠上的 hR.Luc活性。
结果
产生DhaA.H272F的结构模型
使用InsightII Modeler建立DhaA.H272F的结构模型。用于模型 计算的参比结构是1BN6.pdb(红球菌(Rhodococcus species)DhaA)。 计算5个高优化模型，基于结构参数的整体最低能量和最低违例选 择一个最佳模型。然后将最佳模型与参比结构1BN6.pdb进行结构比 对，以获得其整体和成对差异的检测结果，检测结果以比对的Cα原 子的均方根差(以为单位)表示(图2A)。
底物隧道的鉴别
无底物时的DhaA结构业已公开，显示出在催化三联体附近活 性位点空穴(图2A；Newman等，1999)。但是，它并没有揭示出底物 进入活性位点空穴的方向(本文称为“底物隧道”或“配体隧道”)。 通过分析与不同底物复合的相关卤代烷脱卤素酶(Protein Database)的 结构鉴别底物隧道的可能位置。在这些复合物中，没有一个底物能 填充完整的配体隧道，但结构叠加表明底物位于略微不同的位置， 将这些位置合在一起考虑可推断底物隧道可能的大体位置。然后， 无底物DhaA结构(1BN6.pdb)的叠加使得可以鉴别DhaA.H272F中的 对应底物隧道位置。
DhaA-底物模型的产生
产生具有共价连接底物的DhaA.H272F的结构模型(“DhaA-底 物模型”)。首先，将羧基荧光素-C10H21NO2-Cl人工对接入DhaA.H272F 底物隧道中。然后，在DhaA亲核残基天冬氨酸的其中一个羧基氧和 在去除氯之后变成可用的底物末端碳之间建立共价键(图2E)。将该 共价键的长度限制为约3，以接近过渡态。先单独地，然后与底物 附近的DhaA.H272F残基合在一起，使共价连接底物能量最小化。能 量最小化用使用CFF91力场的Discover-3进行。
诱变用残基的鉴别
残基编号基于DhaA的一级序列，其与公开的晶体结构(1BN6.pdb) 中的编号不同。使用DhaA底物模型，鉴别在结合底物的3-5内 的脱卤素酶残基。这些残基代表诱变用的第一潜在靶。由该清单选 择残基，所述残基当被置换时应可能除去位阻或不利的相互作用， 或导入有利的电荷、极性或其它相互作用。例如，175位的Lys残基 位于DhaA表面上的底物隧道入口处：去除这一大的带电侧链可能对 底物进入隧道有改善(图2F)。176位的Cys残基嵌入底物隧道中，其 大体积侧链导致隧道收窄：去除该侧链可能打开隧道，改善底物进 入(图2F)。245位的Val残基嵌入底物隧道中，其紧邻结合底物的两 个氧：用苏氨酸置换该残基可增加氢键键合的机会，这可能改善底 物结合(图2F)。最后，Bosma等(2002)报告了具有氨基酸置换 Tyr273Phe的DhaA强力催化突变体的分离。该突变与Cys176Tyr置 换重组产生的酶将1，2，3-三氯丙烷(TCP)脱卤素化的效力接近野生型 脱卤素酶的8倍。基于这些结构分析，除了产生定点诱变的V245T 突变以外，还将175、176和273位的密码子随机化。筛选所获突变 体中与偶联荧光(例如式VI或VIII的化合物)和生物素(图7)的DhaA 底物形成共价键的速率提升的突变体。
文库产生和筛选
所有文库和突变构建物的起始材料都是含DhaA.H272F和 DhaA.D106C(图2B)编码基因的pGEX5X3型质粒(图3A)。这些质粒 携带编码能够与卤代烷配体形成稳定共价键的亲代DhaA突变体的基 因。使用NNK位点饱和诱变策略随机化DhaA.H272F和DhaA.D106C 模板中175、176和273位的密码子。除了在这些位置的单位点文库 以外，还构建组合175/176 NNK文库。但是，这些文库的随机克隆 的序列分析揭示，存在具有未改变的野生型序列的高(50％)频率克 隆。通过改变模板浓度并延长DpnI处理的次数和时间长度对 QuickChange Multi解决方案进行故障检修，对该频率无显著作用。 因此，在确定由各个文库筛选的克隆数时，考虑文库中野生型序列 污染的速率。例如，单位点NNK文库编码全部20种氨基酸的密码 子多样性为32种。为覆盖99％的可能序列变体(L＝-Vln0.01)，需 要对文库进行约5倍的过量取样。此过量取样转换为筛选至少160 种单个克隆的需要量。但是，因为文库被野生型序列污染至相当的 程度(约50％)，所以通常检验各个单位点文库的约400个克隆。对于 组合175/176 NNK NNK文库而言，编码400种不同氨基酸组合的理 论密码子多样性为1024种。检验各个双位点文库的约3,000-4,000种 克隆。因此，选择总共约10,000种克隆进行筛选。
对作为DhaA突变体文库的初级筛选工具的3种检测进行评价。 第一种-体内标记实验基于以下假设：大肠杆菌中的改良DhaA突变 体应具有优良的标记特性。在采用羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl 的简短标记阶段和细胞清洗之后，优良的克隆在575nm应具有更高 水平的荧光强度。图31A表明，仅一个DhaA.H272F 175/176文库的 96孔板筛选就成功鉴别了几个潜在的改进(即命中结果)。4个克隆具 有的强度水平是亲代克隆的2倍。但是，尽管该检测潜在有用，但 没有选择其作为初级筛选，因为自动化程序有难度以及由于以下事 实：活性DhaA突变体的简单过表达可能产生假阳性。
被看作是初级筛选的第二种检测是体外实验，其通过在96孔形 式的固定化抗FLAG抗体上捕获饱和量的DhaA突变体，对蛋白浓 度有效标准化。图31B显示了使用蛋白捕获实验由DhaA.H272F 175/176组合文库的一个平板获得的筛选结果。和体内检测一样，该 检测还能够由亲代活性的大背景中明确鉴别潜在改良的DhaA突变 体。几个克隆产生的信号是亲代DhaA.H272F的4倍。但是，该检测 由于试剂昂贵和检测准备时间以及多个温育和清洗步骤的自动化而 成本高昂。另外，该检测不能捕获某些先前分离并表征为优良的突 变体。
最终用作DhaA初级筛选的检测是基于MagneGSTTM蛋白纯化树 脂(Promega Corp.)。此体外筛选检测的概览示于图32。简而言之， 将在96孔板中培养的培养物的细胞沉淀重悬浮在含裂解缓冲液、标 记试剂(底物羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl)和MagneGST树脂的试 剂混合物中。这通过将裂解、标记和蛋白捕获组合在一个步骤中使 所述检测显著流线化。在伴随振摇树脂的简短温育期(在该过程中蛋 白被磁性捕获)之后，清洗各孔，然后洗脱标记的DhaA突变体。于 580nm检测洗脱物的荧光强度。这种流线化筛选检测易于应用到自 动化Tecan机器人平台上，该平台可在6.5小时周期中检测约20个96 孔平板。
使用自动化MagneGSTM-型检测筛选DhaA突变蛋白文库。对 基于DhaA.H272F和DhaA.D106C的175单位点文库的筛选未能显示 出显著好于亲代克隆的命中结果(未列出数据)。图33A-B分别显示了 176单位点文库和175/176组合文库的筛选结果。所述筛选鉴别出几 个具有比亲代对照优良的标记特性的克隆。图34显示了DhaA.H272F Y273 NNK文库的两个代表性筛选平板。3个具有显著较高标记特性 的克隆可与含DhaA.H272F亲代的背景明显区分开。对于活性比 DhaA.H272F亲代高至少50％的克隆，所检测文库的整体命中率在1- 3％之间变化。对于DhaA.D106C文库获得了相似的筛选结果(未列出 数据)。初始的初级筛选所鉴别出的命中结果位于主平板中，将其合 并、再培养和使用MagneGSTM检测再分析。仅选择在再分析时信号 为亲代对照至少2倍的DhaA突变体进行序列分析。
DhaA命中结果的序列分析
图35A显示了在筛选DhaA.H272F文库后鉴别的DhaA突变体 密码子。该分析鉴别了7个单个176氨基酸置换(C176G、C176N、 C176S、C176D、C176T、C176A和C176R)。令人感兴趣的是，分离 出3个不同的丝氨酸密码子。还鉴别出在175和176位的众多双氨 基酸置换(175E/C176S、K175C/C176G、K175M/C176G、 K175L/C176G、K175S/C176G、K175V/C176N、K175A/C176S和 K175M/C176N)。尽管在这些双突变体中的175位发现了7个不同的 氨基酸，但在176位仅鉴别出3个不同的氨基酸(Ser、Gly和Asn)。 将在文库质量评价中鉴别的单个K175M突变纳入分析中。另外，还 鉴别出几个优良的单个Y273置换(Y273C、Y273M、Y273L)。
图35B显示了在DhaA.D105C文库中鉴别的DhaA突变体的突 变密码子。除了单个C176G突变以外，所鉴别出的大部分克隆含双 175/176突变。在175位总共鉴别出11个不同的氨基酸。相比之下， 在176位仅鉴别出3个氨基酸(Gly、Ala和Gln)，Gly在几乎3/4的 D106C双突变体中出现。
DhaA突变体的表征
通过筛选方法鉴别出的几个基于DhaA.H272F和DhaA.D106C 的突变体在MagneGSTTM检测中产生显著高于亲代克隆的信号。图 36A表明，基于DhaA.H272F的突变体A7和H11以及基于 DhaA.D106C的突变体D9与羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl产生的 信号显著高于其各自亲代。另外，使用生物素-PEG4-14-Cl底物在273 位鉴别出的基于DhaA.H272F的所有突变体(Y273L“YL”、Y273M “YM”和Y273C“YC”)明显比亲代克隆改善(图36B)。这些分析 的结果与使用SDS-PAGE凝胶荧光成像分析进行的蛋白标记研究(数 据未列出)一致。在测定于DhaA.H272F背景中鉴别的最佳突变的组 合是否为加合性的研究中，将残基273处的3个突变与DhaA.H272F A7和DhaA.H272F H11突变重组。为了区分这些重组蛋白突变体与 在第一轮筛选中鉴别的突变体(第一代)，将其称为“第二代”DhaA 突变体。
为利于对比动力学研究，选择几个改良的DhaA突变体，使用 谷胱甘肽Sepharose 4B树脂纯化。一般来说，基于DhaA.H272F和 DhaA.D1016C的融合体在大肠杆菌中大量生产，尽管单个氨基酸变 化可能对DhaA生产具有负作用(未列出数据)。由于在蛋白生产中的 这种变化性，DhaA突变体的总收率变化也相当大(1-15mg/ml)。使 用几个DhaA.272F衍生突变体进行初步动力学标记研究。图37A表 明，许多(如果不是全部的话)选择用于分析的突变体具有快于H272F 亲代的标记动力学。实际上，在密切观察时程时，包括第一代突变 体YL(泳道15)和两个第二代突变体A7YM和H11YL(分别为泳道13 和21)突变体在内的几个DhaA突变体的标记似乎在2分钟时完成。 对DhaA.272F A7和两个第二代DhaA.272F突变体A7YM和H11YL 进行更延伸的时程分析。以图37B为证，两个第二代克隆的标记反 应至第一个时间点(20秒)时大部分完成。另一方面，A7突变体似乎 到最后一个时间点(7分钟)才达到完成。对凝胶上的荧光条带定量， 产物形成的相对速率示于图37C。为了测定标记速率，将H11YL浓 度由50ng降至10ng，进行更精确的时程研究。图38A显示的结果 表明，在这些标记条件下，可检测线性初速度。凝胶荧光成像数据 的定量可计算二级速率常数(图38B)。基于观测的斜率，羧基四甲基 罗丹明-C10H21NO2-Cl标记DhaA.H272F H11YL的二级速率常数为5.0 ×105M-1秒-1。
荧光偏振(FP)对研究小荧光配体与蛋白的结合最为理想。其在用 于分析分子结合的方法中是独一无二的，因为其直接给出底物结合/ 游离比率检测结果。因此，将FP检测开发为纯化DhaA突变体凝胶 荧光成像分析的替代方法。图39A显示了与A7和H11YL突变体相 比H272F亲代的相对标记速率。在用于该实验的标记条件下，第二 代突变体DhaA.H272F H11YL明显快于其A7和H272F对应物。为 正确地排列此速率，在反应中分别需要约42倍和420倍A7和亲代(即 DhaA.H272F)蛋白，以获得可检测速率。图39B显示了使用羧基荧光 素-C10H21NO2-Cl的FP结果。在该实验使用的标记条件下使用荧光型 底物，显然H11YL突变体也远快于的A7和亲代DhaA.H272F蛋白。 但是，似乎用羧基荧光素-C10H21NO2-Cl标记H11YL显著慢于用对应 的羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl底物标记。相对于羧基四甲基罗 丹明-C10H21NO2-Cl反应(35nM)，在羧基荧光素-C10H21NO2-Cl反应中 使用4倍的H11YL蛋白(150nM)，但在图39B中观测到的速率定性 地看似乎慢于图39A所示的羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl观测速 率。
基于该检测的灵敏度和真正均一的特性，使用FP表征荧光偶联 底物对纯化的DhaA突变体的标记特性。然后，使用这些研究的数据 计算各个DhaA突变体-底物对的二级速率常数。这些分析的结果示 于图40。发现对于羧基四甲基罗丹明和羧基荧光素型底物，用于该 研究的两个亲代蛋白DhaA.H272F和DhaA.D106C具有相当的速率。 但是，在每种情况下使用羧基荧光素-C10H21NO2-Cl底物时标记都慢 些。通过FP表征的所有第一代DhaA突变体都具有为对应亲代蛋白 7-3555倍的速率。迄今为止，单个氨基酸置换对标记速率的最大影 响出现在DhaA.H272F背景中273位的3个置换(Y273L、Y273M和 Y273C)。不过，在所测试的各个第一代DhaA.H272F突变体中，用 羧基荧光素-C10H21NO2-Cl底物标记总是以较慢速率发生(慢1.6-46 倍)。大部分第二代DhaA.H272F突变体甚至显著快于最高改良的第 一代突变体。一个突变体H11YL计算出的与羧基四甲基罗丹明- C10H21NO2-Cl的二级速率常数比DhaA.H272F亲代高4个数量级以 上。H11YL速率常数2.2×106M-1秒-1近似等于由羧基四甲基罗丹明 偶联的生物素/链霉抗生物素蛋白相互作用计算出的速率常数(图 41)。该值与使用表面等离振子共振分析(Qureshi等，2001)测定的生物 素/链霉抗生物素蛋白相互作用速率5×106M-1秒-1相吻合。几个第 二代突变体还具有与羧基荧光素-C10H21NO2-Cl底物的改良速率，但 是，如前所示，这些速率总是慢于与羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl 底物的速率。例如，DhaA.H272F H11YL的羧基荧光素-C10H21NO2-Cl 标记速率是羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl标记速率的1/100。
改良的DhaA H272F H11YL突变体的结构分析
使用InsightII Modeler建立用于DhaA.H272F和DhaA.H272F H11YL的结构模型。用于模型计算的参比结构是1BN6.pdb(红球菌 (Rhodococcus species)DhaA)。将两个另外的相关卤代烷脱卤素酶的 参比结构纳入到DhaA.H272F H11YL模型计算中：1CV2.pdb(少动鞘 氨醇单胞菌(Spingomonas paucimobilis))和2DHD.pdb(自养黄色杆菌 (Xanthobacter autotrophicus))。对于每个序列，计算5个高优化模型， 基于结构参数的整体最低能量和最低违例选择一个最佳模型。然后 将这些最佳模型与参比结构1BN6.pdb进行结构比对，以获得其整体 和成对差异的检测结果，该检测结果以比对的Cα原子的均方根差(以 为单位)表示。
将底物羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl共价连接至DhaA.H272F 和DhaA.H272F H11YL的最佳结构模型。首先，将底物人工对接入 底物隧道中，然后，在蛋白的亲核残基天冬氨酸的其中一个羧基氧 和在去除氯之后变成可用的底物末端碳之间建立共价键。底物构象 被调整得与两个模型尽可能相似。然后制作没有或有共价连接底物 的DhaA.H272F和DhaA.H272F H11YL的初始模型，以便通过于pH 7.0加入氢和使用CFF91力场分配电位使能量最小化。两个模型都使 用Discover-3进行能量最小化，使用具有基于基团或基于原子的截止 值的非键合相互作用、距离依赖性电介质1.0和最终最小化步骤的最 终会聚(convergence)0.01。对无底物模型使用以下的最小化级联：a) 将整个系统的氢最小化并固定其它原子，b)使在底物约8内的残基 侧链最小化并固定其它原子，c)使底物约8内具有调和Cα限制的 残基最小化并固定其它原子。对于有底物模型使用此最小化级联：a) 使整个系统的氢最小化并固定其它原子，b)使底物最小化和固定其它 原子，c)使底物加上底物约8内的残基侧链最小化并固定其它原 子，d)使底物加底物约8内具有调和Cα限制的残基最小化并固定 其它原子。对于所有最小化模型，在底物和底物约8内的残基之 间进行冲击检查(bump check)，以测定位阻。通过用底物约5内残 基的默认探测半径1.4计算Connolly表面，显现底物隧道形状和尺 寸。所有模型在结构上叠加，以评价特定残基位置的变化。
相关残基的位置。在两个突变体中当羧基四甲基罗丹明- C10H21NO2-Cl结合时，亲核残基Asp 106向隧道稍微移近一些。位于 亲核残基下一个残基并负责保持底物以对亲核攻击正确的方向结合 活性位点的W107，其没有明显改变其位置。在DhaA.H272F中，F272 侧链在没有底物时插入隧道中，在底物存在时旋转约45°离开隧道。 在DhaA.H272F H11YL中，F272侧链并未插入隧道中，在底物存在 时仅稍微调整其位置。这应当有利于DhaA.H272F H11YL中的底物 结合。Glu130在所有结构中都显示出相似的方向，有底物时的 DhaA.H272F是个例外，在该状态下由于容纳底物所必需的F272侧 链旋转，Glu130侧链被推离隧道。
底物整体拟合入底物隧道中。对经最小化的蛋白-底物结构进行 冲击检查，以显示底物中哪些原子“冲击”入蛋白的哪些原子中。 当两个原子与其范德华半径重叠至少10％时则存在冲击。羧基四甲 基罗丹明-C10H21NO2-Cl显示出对DhaA.H272F中的Lys175和Cys176 有冲击，但对DhaA.H272 H1 1YL中的任何残基都无冲击。这提示在 DhaA.H272F H11YL中导入的突变在某种程度上加宽了隧道。
底物隧道的形状和尺寸。使用默认检测半径1.4，底物空穴作 为Connolly表面而显现。在没有底物时，DhaA.H272F显示出不同隧 道入口和催化三联体附近的大空穴，其由隧道中Cys176周围并延伸 至Tyr273的强缢缩(constriction)或间断分开(图42A)。此缢缩在底物 结合时被推开(图42B)。突变DhaA.H272F H11YL在176和273位未 显示任何隧道缢缩，但在没有(图42C)和有(图42D)底物时具有连续 宽广开敞的隧道，提示非常易于底物进入。DhaA.H272F H11YL中 的K175M突变似乎对敞开隧道没有显著作用。
DhaA突变体的热稳定性研究。通过于不同温度温育60分钟后 检测纯化蛋白的剩余活性，测定选定的第一代和第二代DhaA.H272F 突变体的热稳定谱。图43A显示了第一代DhaA.H272F突变体和对 应亲代的热稳定谱。活性最强的第一代突变体(DhaA.H272F YL、 DhaA.H272F YC和DhaA.H272F YM)在30℃以上的温度相对不稳 定。这与一直到40℃的温度都稳定的DhaA.H272F亲代和DhaA.H272F A7突变蛋白相反。一个突变体-DhaA.H272F H11在高至50℃(50 ℃的半寿期为58分钟)温育后保留显著标记活性。在第二代 DhaA.H272F突变体中，DhaA.H272F H11YL在于42℃温育后保留最 多活性(图43B)，但是，当然没有达到DhaA.H272F H11的程度(图 43A)。赋予DhaA.H272F H11热稳定性的相同突变(即K175M和C176G) 也有可能有助于DhaA.H272FYL突变体稳定。
温度对DhaA.H272F H11YL反应动力学的作用。为研究温度对 反应速率的作用，于室温和冰上(0℃)进行标记时程实验。凝胶荧光 成像分析表明，较低温度没有削弱采用羧基四甲基罗丹明- C10H21NO2-Cl的标记速率(图44)。实际上，较低反应温度时的速率似 乎以更快速率进行。0℃反应的二级速率常数的计算揭示速率为 3.1×106M-1秒-1，相比之下25℃温育反应的速率为5×105M-1秒-1。
DhaA突变体和固定化生物素氯烷烃底物之间的反应。
为了研究改良的DhaA突变体与固定化底物的反应有多好，使 用利用预包被链霉抗生物素蛋白平板的ELISA型实验(图45A)。对3 种不同的含生物素底物(图7)滴定8个DhaA.H272F突变体(A7、H11、 YL、YM、H11YL、H11YM、A7YL和A7YM)。示于图45B的生物 素-PEG4-14-Cl结果表明，DhaA.H272F YL和DhaA.H272F YM突变 蛋白均更有效地与该底物反应。另外，DhaA.H272F A7YL和 DhaA.H272F A7YM均比DhaA.H272F H11YL和DhaA.H272F H11YM 更有效。与生物素-PEG4-14-Cl底物结合最佳的克隆中没有一个同样 结合其它两个生物素底物，这提示生物素-PEG4-14-Cl是优选底物(未 列出数据)。第一代DhaA突变体DhaA.H272F A7和H11与所有测试 的生物素底物的反应都很差。
DhaA突变体在哺乳动物细胞中的特征。
DhaA突变体的体内和体外标记。某些DhaA突变蛋白在大肠杆 菌中的生产于37℃受损，而其它改良的DhaA突变体在提升的温度 培养和诱导时保留了相当的活性。这些克隆可能在较高温度具有选 择性折叠优势，结果，由此能够更好地耐受哺乳动物细胞培养条件。 基于其优良的动力学和/或生产效能，将突变蛋白DhaA.H272F A7和 H11(连同两个亲代DhaA.H272F和DhaA.D106C)的编码基因克隆入 哺乳动物表达载体pCI-neo中，并转染入CHO细胞中。动力学体内 标记研究表明，两个第一代突变体DhaA.H272F A7和H11在5μM 底物浓度时显示出优于亲代DhaA.H272F的性能特征(图46A和B)。 因此，DhaA.H272F突变体A7和H11在大肠杆菌中于37℃保留显著 活性/产量的能力与其在哺乳动物细胞中的优良性能良好相关。
测试3个另外的DhaA突变体在瞬时表达的CHO-K1细胞中的 羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl标记效率。图46C-D显示了比较 DhaA.H272F A7、DhaA.H272F H11YL和DhaA.D106C 30H4的标记 结果。在5μM羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl底物浓度时，第二代 DhaA.H272F H11YL在15分钟内标记完成。这是DhaA.H272F A7完 成标记所需时间的一半。相比之下，DhaA.D106C 30H4(在 DhaA.D106C背景中的DhaA.H272F H11等同物)达到相同标记程度 则需要2小时以上。
还研究了DhaA.H272F A7和H11YL的标记效率对底物浓度的 依赖性。图46A-C显示了DhaA.H11YL在哺乳动物细胞裂解物中的 优良标记特性，尤其是在低羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl底物浓 度(即0.1和1.0μM)时。该发现与使用纯化的DhaA蛋白的体外动力 学研究结果一致。体内观察到DhaA.H272F H11YL对羧基四甲基罗 丹明-C10H21NO2-Cl的结合动力学稍微慢一些，这提示哺乳动物细胞 膜可能限制荧光配体运输入细胞中(未列出数据)。
DhaA突变体的体内稳定性。研究选定的DhaA突变体在瞬时转 染的哺乳动物细胞中的稳定性。图48A显示了在转染后12、24和48 小时用羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl标记细胞后，由亲代和两个 第一代突变体DhaA.H272F A7和DhaA.H272F H11获得的荧光信号。 凝胶荧光成像的定量表明，全部4个测试克隆的活性蛋白产量在转 染后24小时达到峰值，然后下降至于48小时观测到的水平(图48B)。 但是，用H272F衍生的突变体A7和H11编码构建物转染的CHO-K1 细胞保留了在48小时后比两个亲代突变体中的任一个生产更多活性 蛋白的能力。这可由羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl标记后产生的 强荧光信号得到明确证实。该结果提示，DhaA.H272F A7和H11突 变体在体内明显更稳定。图47C-D显示了对比DhaA.H272F A7和第 二代突变体DhaA.H272F H11YL的相似稳定性分析。用DhaA.H272F H11YL突变体编码构建物转染的CHO-K1细胞在48小时时也保留 了显著的标记潜能。实际上，在24-48小时的时期内，DhaA.H272F H11YL产生的信号基本没有或没有可检测的降低。
DhaA.H272F H11YL在活的经固定的哺乳动物细胞中的图像。
如图50A-B的图像所示，羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl或 DiAc-羧基荧光素-C10H21NO2-Cl可有效标记在哺乳动物细胞中表达的 DhaA.H272F H11YL。图像明亮，显示出极佳信噪比。如图50C-D中 的图像所示，DhaA.H272F H11YL HT2(图49)和DhaA.H272F可用 TAMRA-C11H21N1O3-Cl有效标记，并用3.7％多聚甲醛固定。表达 DhaA.H11YL HT2并用0.2、1.0或5.0μM TAMRA-C11H21N1O3-Cl染 色5分钟的细胞图像比表达DhaA.H272F并用5.0μM羧基四甲基罗 丹明-C10H21NO2-Cl染色30分钟的细胞影像明亮。这强有力地表明， 在哺乳动物细胞中，羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl标记 DhaA.H272F H11YL HT2的效率高于DhaA.H272F。
在活哺乳动物细胞中表达的β-抑制蛋白2-连接基团-DhaA H272F H11 YL HT2融合蛋白的成像。
如图50E-F中的图像所示，使用顶DiAc-羧基荧光素-C10H21NO2-Cl 或羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl中的任一个标记蛋白融合体，β- 抑制蛋白2-连接基团-DhaA.H272F H11YL HT2表达细胞具有典型的 β-抑制蛋白2胞质定位。
捕获在活哺乳动物细胞中表达的DhaA.H272F H11YL-海肾萤光 素酶融合蛋白。
如图51A-B所示，在与用生物素-X-14-Cl处理的细胞裂解物温 育并洗去过量的生物素-X-14-Cl的珠上，检测到显著萤光素酶活性。 在与未用生物素-X-14-Cl处理的细胞裂解物温育的珠上未检测到萤光 素酶活性。而且，当未洗出游离生物素-X-14-Cl时，在与用生物素- X-14-Cl处理的细胞裂解物温育的珠上未检测到hR.Luc活性。综合 这些数据表明，使用生物素-X-14-Cl和SA包被珠可有效捕获融合至 DhaA.H272F H11YL HT2的功能活性蛋白(hR.Luc)。所述捕获是生物 素依赖性的，并可由过量生物素-X-14-Cl竞争消除。由于观察到所述 珠对hR.Luc活性的显著抑制作用(未列出数据)，所以使用SDS-PAGE 和采用抗R.Luc抗体的蛋白质印迹分析来评价hR.Luc-连接基团- DhaA.H272F H11YL HT2融合蛋白的捕获效力。如图51B所示，超 过50％的hR.Luc-连接基团-DhaA.H272F H11YL HT2融合蛋白可以 生物素依赖性方式被捕获。
DhaA.H272F H11YL与含修饰型连接基团的卤代烷底物的反应 性。红球菌(Rhodococcus)脱卤素酶(DhaA)蛋白的底物空穴在长度和 呼吸上都明显大于黄色杆菌(Xanthobacter)DhlA蛋白的底物隧道 (Newman等，1999)。作为标记技术的结果，DhaA突变体应当能够容 纳一系列含不同连接基团结构的底物。替代性底物的一些实例包括 对苯乙基和呋喃基丙基衍生物，例如图56所示的那些化合物。用纯 化的DhaA.H272F H11YL蛋白测试这些修饰的卤代烷底物的反应 性。
图52A显示了使用FP分析测定的各种羧基四甲基罗丹明型底 物的结合速率。所测定的羧基四甲基罗丹明-对苯乙基-Cl底物与 DhaA.H272F H11YL相互作用的表观结合速率常数，仅是所测定的 羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl速率的1/3。但是，在这些反应条件 下未检测到对羧基四甲基罗丹明-呋喃基丙基底物的结合。使用凝胶 荧光成像分析证实羧基四甲基罗丹明型底物的相对标记速率。在所 用反应条件下，发现全部3种羧基四甲基罗丹明底物都与所述蛋白 反应(图52B)。定量凝胶上的荧光条带，以测定产物形成的相对速率。 产物累积斜率的对比表明，羧基四甲基罗丹明-对苯乙基-Cl底物在标 记DhaA.H272F H11YL方面显著慢于羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl 底物(图52C)。羧基四甲基罗丹明-呋喃基丙基-Cl底物的速率是羧基 四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl底物的1/100以上。
使用羧基荧光素修饰的对苯乙基和呋喃基底物进行相似的体外 标记实验。图53显示了使用FP分析获得的各种羧基荧光素型底物 的相对结合速率。所测定的羧基荧光素-对苯乙基-Cl底物的表观结合 速率常数(5.6×103M-1秒-1)约是羧基荧光素-14-Cl的1/5(图53A)。 和先前用羧基四甲基罗丹明氯烷烃结合实验观察到的一样，在这些 反应条件下未检测到对羧基荧光素-呋喃基底物的结合。还使用凝胶 荧光成像分析测定羧基荧光素型底物的相对标记速率。图53B显示 了在20分钟过程中形成的荧光产物量。在所用反应条件下，发现全 部3种羧基荧光素底物都与所述蛋白反应(图53B)。这些产物条带的 定量揭示，羧基荧光素-对苯乙基-Cl底物标记DhaA.H272F H11YL 的速率是羧基荧光素-C10H21NO2-Cl底物的约1/3(图53C)。但是，羧 基荧光素-呋喃基丙基-Cl底物的标记速率比羧基荧光素-C10H21NO2-Cl 底物的1/100以下。
在哺乳动物细胞中测定各种羧基四甲基罗丹明型底物的体内标 记速率。用不同浓度的羧基四甲基罗丹明-Cl-烷烃在60分钟时程内 标记用pHT2载体(DhaA.H272F H11YL)瞬时转染的CHO-K1。于不 同时间收集细胞，裂解，在SDS-PAGE上分离蛋白。用荧光成像仪 检测标记蛋白的存在情况。图54A显示了于1、5和20μM的不同底 物浓度下累积的标记产物随时间变化的情况。荧光产物累积的定量 表明，用羧基四甲基罗丹明-对苯乙基-Cl底物标记DhaA.H272F H11YL在所有测试浓度都与羧基四甲基罗丹明-C10H21NO2-Cl相当(图 54B)。但是，羧基四甲基罗丹明-呋喃基-丙基-Cl底物对DhaA.H272F H11YL突变体的标记速率在1和5μM底物浓度时明显较慢。
测试生物素-对苯乙基-Cl底物与固定化DhaA蛋白反应的能力。 用于所实施的ELISA型检测的通用反应流程示于图55A。使用抗 FLAG抗体将2pmol DhaA.H272F H11YL固定在微量滴定板的孔上。 在与卤代烷底物(17μM)温育并洗涤后，使用链霉抗生物素蛋白-HRP 缀合物检测结合的底物。显色后的颜色量指示各种生物素卤代烷底 物的反应性。图55B表明，生物素-对苯乙基底物与固定化DhaA蛋 白反应，但程度不及生物素-14-Cl和生物素-PEG4-14-Cl底物中的任 一个。
实施例XI
用于细胞表面展示的代表性DhaA融合蛋白
许多膜酶、受体、分化抗原和其它生物活性蛋白都通过翻译后 加工结合脂肪酸、类异戊二烯、二酰甘油和糖基磷脂酰肌醇(GPI)， 并通过这些脂质锚定至膜。GPI连接的蛋白在各种各样的细胞类型上 表达，并具有多种功能，范围由控制细胞粘附(例如CD48、CD58、 Thy-1/CD90)延伸至抗补体(CD55、CD59)和酶活性(碱性磷酸酶)的保 护作用。这些分子的独特性在于其仅锚定在质膜的外小叶，因此不 伸入细胞质中。GPI锚毫无例外地共价连接至蛋白的羧基末端。真核 生物中的GPI锚核心结构由磷酸乙醇胺、三甘露糖苷、葡糖胺和磷 脂肌醇按所述顺序组成。所有已知的GPI-锚定蛋白都用C末端可裂 解肽合成(综述于Stevens，1995；Tiede等，1999；Sevelever等，2000)。 C末端肽(a)由15-30个通常为疏水性的氨基酸组成，(b)不含下游胞 质结构域(Medof和Tykocinski，(1990))，和(c)建立由“裂解-连接”位 点周围的某些氨基酸组界定的样式。已将该位点称为ω氨基酸，其是 去除C末端信号和GPI锚连接后余下的氨基酸。
通过向内质网(ER)的磷脂酰肌醇中序贯加入糖和磷酸乙醇胺来 合成GPI(Udenfriend和Kodukula，1995；Kinoshita和Inoue，2000)。 GPI的骨架结构在不同物种中是相同的。将预制的GPI连接至ER中 的蛋白。用GPI修饰的前体蛋白具有两个信号。一个信号在N-末端， 是穿过ER膜运输必需的信号。另一个信号在C-末端，是GPI连接 信号。GPI连接信号肽由GPI转酰胺酶识别，GPI转酰胺酶裂解信号 肽，并用GPI替换其。
为产生GPI-锚定DhaA突变体，可使用由De Angelis等(1998)提 出的用于产生GPI锚定的GFP的策略。该策略需要另外的N-末端前 导肽，用于引导新生多肽通入ER膜中，并需要加入用于GPI连接的 C末端序列，例如PNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFTLT GLLGTLVTMG LLT(SEQ ID NO：18)。使用该策略，Hiscox等(2002)在CHO细胞表 面上成功表达了GFP。所述作者使用3步PCR将GFP连接在人CD59 信号肽(氨基酸-25至1，例如 MGIQGGSVLFGLLLVLAVFCHSGHSL；SEQ ID NO：25)的下游和人 CD59氨基酸67-102(例如FEHCNFNDVTTRLRENELTYYCCK KDLCNFNEQLEN(SEQ ID NO：44)，其在残基77包含GPI连接位点) 的上游。
GFP和DhaA具有完全不同的结构。因此，为产生用于哺乳动 物细胞的GPI-锚定DhaA突变融合体，可使用不同GPI锚定蛋白的 信号序列和GPI连接序列，所述蛋白例如为5′-核苷酸酶(CD73)、 CAMPATH(CD52)、衰变加速因子(DAF或DC55)、活性裂解的膜抑 制剂(CD59)、白细胞功能相关蛋白-3(LFA-3或CD90)、胎盘碱性磷 酸酶(PLAP)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、Thy-1(CD90)、朊病毒等。为提 升底物对催化袋的可接近性，可在DhaA和GPI连接序列之间导入 肽连接基团。
整联蛋白是联系细胞与周围的胞外基质的主要受体(Danen和 Yamada，2001；Hohesnester和Engel，2002)。它们不仅支持细胞连接， 而且与调节存活、分化和增殖的可溶性因子受体合作。在体外，整 联蛋白α5β1介导的细胞与纤连蛋白的粘附对于支持成纤维细胞、上 皮细胞和内皮细胞的有丝分裂原依赖性增殖特别有效。整联蛋白是 经支架蛋白连接至皮质肌动蛋白细胞骨架的异二聚跨膜受体。α和β 亚基的胞外区非共价连接，形成球形头结构域，其结合特定的胞外 基质(ECM)，结合特异性由特定的α和β亚基组合决定。人基因组测 序已鉴别出多达24个α亚基和9个β亚基，目前已知在哺乳动物中存 在24种不同的功能性整联蛋白。
为在细胞表面上表达DhaA突变体，使用DhaA突变体和整联蛋 白(例如α或β整联蛋白)的融合体。这样的融合蛋白包含整联蛋白的跨 膜结构域、胞质结构域和/或胞外茎结构域以及DhaA突变体。整联 蛋白的胞质结构域可为截短型结构域，整联蛋白的胞外茎结构域可 用另一种蛋白(例如CXXXC趋化分子)的胞外茎结构域、茎结构域的 一部分和/或基因工程肽如合成肽替换。还设想了整联蛋白与其它目 标蛋白(例如报告蛋白如GFP或酶如萤光素酶)的融合体，例如用于 目标蛋白的细胞表面展示。
钙粘着蛋白包含钙依赖性细胞粘附分子家族，所述分子形成和 保持固体组织间细胞的粘附接触(Takeichi等，1981；Hatta和Takeichi， 1986；Hatta等，1998)。钙粘着蛋白是一步(single-psaa)跨膜蛋白，特 征在于在其胞外区段中存在特别的钙粘着蛋白重复序列(Patel等， 2003)。这些重复序列的每一个均由110个氨基酸组成，形成β-夹心 结构域。钙粘着蛋白通常具有几个在其胞外区段中串联重复的此“钙 粘着蛋白结构域”。这些结构域之间的连接由各个连续结构域对之 间的3个Ca2+离子的特异性结合而刚性化。钙粘着蛋白可分类为几 个亚家族(Nollet等，2000)：I型(经典)钙粘着蛋白和II型钙粘着蛋白， 其最终连接至肌动蛋白细胞骨架；桥粒钙粘着蛋白(桥粒芯胶蛋白和 桥粒芯糖蛋白)，其连接至中间丝；和原钙粘着蛋白，其主要在神经 系统表达。另外，还已描述了几个“非典型”钙粘着蛋白-含一个 或多个钙粘着蛋白重复序列、但不具有其它的钙粘着蛋白特点的蛋 白。
为在细胞表面上表达DhaA突变体，使用DhaA突变体与钙粘着 蛋白(例如I型钙粘着蛋白、II型钙粘着蛋白或非典型钙粘着蛋白)的 融合体。这样的融合蛋白包含跨膜结构域、胞质结构域、一个或多 个胞外钙粘着蛋白结构域和DhaA突变体。钙粘着蛋白的胞质结构域 可为截短型结构域，胞外钙粘着蛋白结构域可去除或用另一种蛋白 的胞外茎结构域或基因工程肽替换。截短的钙粘着蛋白-T-钙粘着蛋 白是一类不常见的钙粘着蛋白，因为其没有跨膜区段和保守的W2， 但具有GPI锚。
为在细胞表面上表达DhaA或DhaA融合体，需要N-末端前导 肽来引导新生多肽通过膜(例如ER膜)的磷脂双层。N-末端前导肽可 为DhaA融合多肽中融合配偶体的前导肽，或者可为另一种多肽的前 导肽。在一个实施方案中，可在DhaA和N-末端前导肽之间、DhaA 和融合配偶体的跨膜结构域之间和/或DhaA和融合配偶体的胞外结 构域之间插入另外的肽，例如连接基团。
一般而言，为在细胞表面上表达DhaA突变体，可使用DhaA突 变体和具有已确定的N-末端胞外结构域的任意膜蛋白(例如配体门控 离子通道如n-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体、5-甲基-4-异唑丙酸 (AMPA)受体、甘氨酸受体、烟碱性乙酰胆碱受体(nAChR)、P2X受 体、5-羟色胺3(5-HT3)受体)(综述参见Galligan，2002)的融合体。在 一个实施方案中，使用DhaA突变体和具有胞外C末端结构域的任 意膜蛋白(例如抑制性甘氨酸受体，综述参见Breitinger和Becker，2002) 的融合体。将DhaA连接至或插入到蛋白的C-末端结构域中。为改 进融合体的性能(例如Cl-烷烃配体对DhaA催化袋的可接近性)，可 将肽连接基团插入到DhaA和蛋白C-末端结构域之间。在另一个实 施方案中，使用DhaA突变体和具有胞外环结构域(连接蛋白跨膜结 构域的肽链，例如在HERG通道的α亚基中连接S1和S2、S3和S4、 S5和S6跨膜结构域的肽链(Blaustein和Miller，2004))的任意膜蛋白 的融合体。为改进融合体的性能，可将肽连接基团导入DhaA和所述 环的N-和/或C-末端片段之间。
在又一个实施方案中，当与细胞表面上表达的蛋白融合时，细 胞表面上的突变水解酶当与本发明配体(例如含荧光团的本发明配体) 组合时，可用于监测膜蛋白的内在化。如果本发明的配体对微环境 敏感，则可使用所述系统监测膜蛋白周围环境的变化。在一个实施 方案中，本发明配体对细胞膜具有低通透性或无通透性。在一个实 施方案中，可用非透过性配体来标记细胞表面上表达的DhaA，接着 用细胞透过性配体处理细胞，来同时监测膜蛋白表面和内部区域的 重定位。或者，可使用这样的系统监测不同物质(例如药物)对膜蛋白 不同区域的作用。
在又一个实施方案中，当与细胞表面上表达的蛋白融合时，细 胞表面上的突变水解酶当与本发明配体(例如含可检测官能团的本发 明配体)组合时，可用于监测膜蛋白的修饰(例如蛋白水解、糖基化 等)。或者，可使用这样的系统监测不同物质(例如药物)对膜蛋白修 饰的作用。
在又一个实施方案中，当与离子通道融合时，细胞表面上的突 变水解酶当与本发明配体(例如含微环境敏感性官能团的本发明配体) 组合时，可用于监测所述通道的功能活性。或者，可使用这样的系 统监测不同物质(和/或条件)(例如药物(和/或温度变化、细胞膜伸展、 细胞与固体表面、其它细胞、蛋白的相互作用))对离子通道活性的作 用。
所有的出版物、专利和专利申请都通过引用结合到本文中。尽 管在本发明前述说明书中已就其某些优选实施方案描述了本发明， 并为了说明目的阐述了很多细节，但对本领域技术人员显而易见的 是，本发明允许其它的实施方案，本文描述的某些细节可在不背离 本发明基本原则的情况下进行相当程度的改变。
相关申请的交叉参考
本申请要求保护2004年12月6日提交的美国申请序号 11/006,031和2004年7月30日提交的美国申请序号60/592,499的申 请日权益。
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序  列  表
<110>Promega Corporation
Darzins，Al
Encell，Lance
Johnson，Tonny
Klaubert，Dieter
Los，Georgyi V.
McDougall，Mark
Wood，Keith V.
Wood，Monika G.
Zimprich，Chad
<120>官能团与蛋白质及其底物的共价束缚
<130>341.032WO1
<160>85
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>1
gcttcacttg tcgtcatcgt ccttgtagtc a                                    31
<210>2
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>2
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<210>3
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<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>3
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<210>4
<211>27
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<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>4
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<210>5
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<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>5
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<210>6
<211>27
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<400>6
ccgggattgg gctacctcca ggaagac                                          27
<210>7
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<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>7
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<210>8
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<210>9
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<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>9
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<210>10
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<210>11
<211>31
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<220>
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<400>11
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<210>12
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<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>12
gcttcacttg tcgtcatcgt ccttgtagtc a                                     31
<210>13
<211>43
<212>DNA
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<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>13
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<210>14
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>14
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<210>15
<211>29
<212>DNA
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<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>15
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<210>16
<211>26
<212>DNA
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<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>16
cagtcagtca cgatggatcc gctcaa                                           26
<210>17
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>A synthetic connector amino acid sequence
<400>17
Asp Glu Val Asp
 1
<210>18
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>18
Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser
 1               5                  10                  15
Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr
            20                  25                  30
Met Gly Leu Leu Thr
        35
<210>19
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>19
His His His His His
 1               5
<210>20
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>20
His His His His His His
 1               5
<210>21
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>21
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
 1               5                  10
<210>22
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>22
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
 1               5
<210>23
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>23
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
 1               5
<210>24
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>24
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
 1               5
<210>25
<211>26
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>25
Met Gly Ile Gln Gly Gly Ser Val Leu Phe Gly Leu Leu Leu Val Leu
 1               5                  10                  15
Ala Val Phe Cys His Ser Gly His Ser Leu
            20                  25
<210>26
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>26
atcgaaggtc gtgggatccc caggaattcc cgggtcgacg ccgcc                      45
<210>27
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>27
Ile Glu Gly Arg Gly Ile Pro Arg Asn Ser Arg Val Asp Ala Ala
 1                   5              10                  15
<210>28
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>28
tccggatcaa gcttgggcga cgaggtggac ggcgggccct ctagagccac c               51
<210>29
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>29
Ser Gly Ser Ser Leu Gly Asp Glu Val Asp Gly Gly Pro Ser Arg Ala
 1               5                  10                  15
Thr
<210>30
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>30
accggttccg gatcaagctt gcggtaccgc gggccctcta gagcc                      45
<210>31
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>31
Thr Gly Ser Gly Ser Ser Leu Arg Tyr Arg Gly Pro Ser Arg Ala
 1               5                  10                  15
<210>32
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>32
tccggatcaa gcttgcggta ccgcgggccc tctagagccg tcgacgccgc c               51
<210>33
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>33
Ser Gly Ser Ser Leu Arg Tyr Arg Gly Pro Ser Arg Ala Val Asp Ala
 1               5                  10                  15
Ala
<210>34
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>34
cttgggtttg gaagaggtcg tcctggtcat ccaccagtgg ggc                        43
<210>35
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>35
tgagccccac tggtggatga ccaggacgac ctcttccaaa cc                          42
<210>36
<211>1053
<212>DNA
<213>Staphylococcus aureus
<400>36
agcttactat gccattatta ataacttagc catttcaaca ccttctttca aatatttata       60
ataaactatt gacaccgata ttacaattgt aatattattg atttataaaa attacaactg      120
taatatcgga gggtttattt tgaaaaagtt aatattttta attgtaattg ctttagtttt      180
aagtgcatgt aattcaaaca gttcacatgc caaagagtta aatgatttag aaaaaaaata      240
taatgctcat attggtgttt atgctttaga tactaaaagt ggtaaggaag taaaatttaa      300
ttcagataag agatttgcct atgcttcaac ttcaaaagcg ataaatagtg ctattttgtt      360
agaacaagta ccttataata agttaaataa aaaagtacat attaacaaag atgatatagt      420
tgcttattct cctattttag aaaaatatgt aggaaaagat atcactttaa aagcacttat      480
tgaggcttca atgacatata gtgataatac agcaaacaat aaaattataa aagaaatcgg      540
tggaatcaaa aaagttaaac aacgtctaaa agaactagga gataaagtaa caaatccagt      600
tagatatgag atagaattaa attactattc accaaagagc aaaaaagata cttcaacacc      660
tgctgccttc ggtaagaccc ttaataaact tatcgccaat ggaaaattaa gcaaagaaaa      720
caaaaaattc ttacttgatt taatgttaaa taataaaagc ggagatactt taattaaaga      780
cggtgttcca aaagactata aggttgctga taaaagtggt caagcaataa catatgcttc      840
tagaaatgat gttgcttttg tttatcctaa gggccaatct gaacctattg ttttagtcat      900
ttttacgaat aaagacaata aaagtgataa gccaaatgat aagttgataa gtgaaaccgc      960
caagagtgta atgaaggaat tttaatattc taaatgcata ataaatactg ataacatctt     1020
atattttgta ttatattttg tattatcgtt gac                                  1053
<210>37
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>37
ccggtgatcc aaaaaagaag agaaaggtag atccaaaaaa gaagagaaag gtagatccaa       60
aaaagaagag aaaggtatga g                                                 81
<210>38
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>38
gatcctcata cctttctctt cttttttgga tctacctttc tcttcttttt tggatctacc      60
tttctcttct tttttggatc a                                                81
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>39
attatgctga gtgatatccc                                                  20
<210>40
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>40
ctcggtacca agctccttgt agtca                                            25
<210>41
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>41
caaaggtatt gcatgtatgc agttcatccg gcctatcccg                            40
<210>42
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>42
gtcaaaggta ttgcatgtat gctgttcatc cggcctatcc cgac                       44
<210>43
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>43
aggtattgca tgtatggcgt tcatccggcc tatccc                                36
<210>44
<211>36
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>44
Phe Glu His Cys Asn Phe Asn Asp Val Thr Thr Arg Leu Arg Glu Asn
 1               5                      10              15
Glu Leu Thr Tyr Tyr Cys Cys Lys Lys Asp Leu Cys Asn Phe Asn Glu
            20                  25                  30
Gln Leu Glu Asn
        35
<210>45
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的改进型Kozak序列
<400>45
gccaccatgg                                                            10
<210>46
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>1-36
<223>n＝A、T、G或C
<400>46
nnnngctagc cagctggcga tatcgccacc atggga                                36
<210>47
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>1-34
<223>n＝A、T、G或C
<400>47
taatagttaa ttaagtaagc ggccgcnnnn                                       30
<210>48
<211>296
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>48
Met Gly Ser Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val
 1               5                  10                  15
Glu Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp
            20                  25                  30
Gly Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Leu
        35                  40                  45
Trp Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Ser His Arg Cys Ile Ala
    50                  55                  60
Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Asp Tyr
65                  70                  75                  80
Phe Phe Asp Asp His Val Arg Tyr Leu Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu
                85                  90                  95
Gly Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu
            100                 105                 110
Gly Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala
        115                 120                 125
Cys Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu
    130                 135                 140
Phe Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Ala Asp Val Gly Arg
145                 150                 155                 160
Glu Leu Ile Ile Asp Gln Asn Ala Phe Ile Glu Gly Ala Leu Pro Lys
                165                 170                 175
Cys Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu
            180                 185                 190
Pro Phe Leu Lys Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn
        195                 200                 205
Glu Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu
    210                 215                 220
Ala Tyr Met Asn Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe
225                 230                 235                 240
Trp Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu
                 245                 250                 255
 Ala Glu Ser Leu Pro Asn Cys Lys Thr Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu
             260                 265                 270
 Phe Tyr Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala
         275                 280                 285
 Arg Trp Leu Pro Gly Leu Ala Gly
     290                 295
<210>49
<211>948
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>1-948
<223>n＝A、C、T或G
<400>49
nnnngctagc cagctggcga tatcgccacc atgggatccg agattgggac agggtttcct      60
tttgatcctc attatgtgga ggtgctgggg gagagaatgc attatgtgga tgtggggcct     120
agagatggga cacctgtgct gtttctgcat gggaatccta catcttctta tctgtggaga     180
aatattattc ctcatgtggc tccttctcat agatgtattg ctcctgatct gattgggatg     240
gggaagtctg ataagcctga tctggattat ttttttgatg atcatgtgag atatctggat     300
gcttttattg aggctctggg gctggaggag gtggtgctgg tgattcatga ttgggggtct     360
gctctggggt ttcattgggc taagagaaat cctgagagag tgaaggggat tgcttgtatg     420
gagtttatta gacctattcc tacatgggat gagtggcctg agtttgctag agagacattt     480
caggctttta gaacagctga tgtggggaga gagctgatta ttgatcagaa tgcttttatt     540
gagggggctc tgcctaagtg tgtggtgaga cctctgacag aggtggagat ggatcattat     600
agagagcctt ttctgaagcc tgtggataga gagcctctgt ggagatttcc taatgagctg     660
cctattgctg gggagcctgc taatattgtg gctctggtgg aggcttatat gaattggctg     720
catcagtctc ctgtgcctaa gctgctgttt tgggggacac ctggggtgct gattcctcct     780
gctgaggctg ctagactggc tgagtctctg cctaattgta agacagtgga tattgggcct     840
gggctgtttt atctgcagga ggataatcct gatctgattg ggtctgagat tgctagatgg     900
ctgcccgggc tggccggcta atagttaatt aagtaagcgg ccgcnnnn                  948
<210>50
<211>951
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的优化DhaA基因
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(951)
<223>n＝A、T、G或C
<400>50
nnnngctagc cagctggcgc ggatatcgcc accatgggat ccgagattgg gacagggttc      60
ccttttgatc ctcactatgt tgaagtgctg ggggaaagaa tgcactacgt ggatgtgggg     120
cctagagatg ggaccccagt gctgttcctc cacgggaacc ctacatctag ctacctgtgg     180
agaaatatta tacctcatgt tgctcctagt cataggtgca ttgctcctga tctgatcggg     240
atggggaagt ctgataagcc tgacttagac tacttttttg atgatcatgt tcgatacttg     300
gatgctttca ttgaggctct ggggctggag gaggtggtgc tggtgataca cgactggggg     360
tctgctctgg ggtttcactg ggctaaaagg aatccggaga gagtgaaggg gattgcttgc     420
atggagttta ttcgacctat tcctacttgg gatgaatggc cagagtttgc cagagagaca     480
tttcaagcct ttagaactgc cgatgtgggc agggagctga ttatagacca gaatgctttc     540
atcgaggggg ctctgcctaa atgtgtagtc agacctctca ctgaagtaga gatggaccat     600
tatagagagc cctttctgaa gcctgtggat cgcgagcctc tgtggaggtt tccaaatgag     660
ctgcctattg ctggggagcc tgctaatatt gtggctctgg tggaagccta tatgaactgg     720
ctgcatcaga gtccagtgcc caagctactc ttttggggga ctccgggagt tctgattcct     780
cctgccgagg ctgctagact ggctgaatcc ctgcccaatt gtaagaccgt ggacatcggc     840
cctgggctgt tttacctcca agaggacaac cctgatctca tcgggtctga gatcgcacgg     900
tggctgcccg ggctggccgg ctaatagtta attaagtagg cggccgcnnn n              951
<210>51
<211>882
<212>DNA
<213>Rhodococcus rhodochrous
<400>51
atgtcagaaa tcggtacagg cttccccttc gacccccatt atgtggaagt cctgggcgag      60
cgtatgcact acgtcgatgt tggaccgcgg gatggcacgc ctgtgctgtt cctgcacggt     120
aacccgacct cgtcctacct gtggcgcaac atcatcccgc atgtagcacc gagtcatcgg     180
tgcattgctc cagacctgat cgggatggga aaatcggaca aaccagacct cgattatttc     240
ttcgacgacc acgtccgcta cctcgatgcc ttcatcgaag ccttgggttt ggaagaggtc     300
gtcctggtca tccacgactg gggctcagct ctcggattcc actgggccaa gcgcaatccg     360
gaacgggtca aaggtattgc atgtatggaa ttcatccggc ctatcccgac gtgggacgaa     420
tggccggaat tcgcccgtga gaccttccag gccttccgga ccgccgacgt cggccgagag     480
ttgatcatcg atcagaacgc tttcatcgag ggtgcgctcc cgaaatgcgt cgtccgtccg     540
cttacggagg tcgagatgga ccactatcgc gagcccttcc tcaagcctgt tgaccgagag     600
ccactgtggc gattccccaa cgagctgccc atcgccggtg agcccgcgaa catcgtcgcg     660
ctcgtcgagg catacatgaa ctggctgcac cagtcacctg tcccgaagtt gttgttctgg     720
ggcacacccg gcgtactgat ccccccggcc gaagccgcga gacttgccga aagcctcccc     780
aactgcaaga cagtggacat cggcccggga ttgcactacc tccaggaaga caacccggac     840
cttatcggca gtgagatcgc gcgctggctc cccgcactct ag                        882
<210>52
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>52
cttgggtttg gaagaggtcg tcctggtcat ccacgaatgg ggc                        43
<210>53
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>53
tgagccccat tcgtggatga ccaggacgac ctcttccaaa cc                         42
<210>54
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>54
cttgggtttg gaagaggtcg tcctggtcat ccactactgg ggc                        43
<210>55
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>55
tgagccccag tagtggatga ccaggacgac ctcttccaaa cc                        42
<210>56
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>56
ccagttagat atgacataga attaaattac tattcacc                             38
<210>57
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>57
ggtgaatagt aatttaattc tatgtcatat ctaactgg                             38
<210>58
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>58
ccagttagat atgagataga attacagtac tattcacc                             38
<210>59
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>59
ggtgaatagt actgtaattc tatctcatat ctaactgg                             38
<210>60
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>60
ccagttagat atgacataga attacagtac tattcacc                             38
<210>61
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>61
ggtgaatagt actgtaattc tatgtcatat ctaactgg                             38
<210>62
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>62
caacaggtcg acgccgccat gaaagagtta aatgatttag                           40
<210>63
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>63
gtagtcaccg gtaaattcct tcattacact cttggc                               36
<210>64
<211>23
<212>DNA
<213>Rhodococcus
<400>64
gggctggcaa gccacgtttg gtg                                             23
<210>65
<211>23
<212>DNA
<213>Rhodococcus
<400>65
ccgggagctg catgtgtcag agg                                             23
<210>66
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(43)
<223>n＝A、T、G或C
<400>66
atcgagggtg cgctcccgnn ktgcgtcgtc cgtccgctta cgg                       43
<210>67
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(43)
<223>n＝A、T、G或C
<400>67
atcgagggtg cgctcccgaa annkgtcgtc cgtccgctta cgg                       43
<210>68
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(43)
<223>n＝A、T、G或C
<400>68
atcgagggtg cgctcccgnn knnkgtcgtc cgtccgctta cgg                       43
<210>69
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)(40)
<223>n＝A、T、G或C
<400>69
atcggcccgg gattgttcnn kctccaggaa gacaacccgg                           40
<210>70
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)...(39)
<223>n＝A、T、G或C
<400>70
cggcccggga ttgcacnnkc tccaggaaga caacccgga                            39
<210>71
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>71
gcctatcccg acgtgggacg                                                 20
<210>72
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>72
 aggtctcgcg gcttcggccg gggg                                           24
<210>73
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>73
aaaatcggac aaaccagacc tcg                                             23
<210>74
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>74    
atcgcgagcc cttcctcaag cctg                                            24
<210>75
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>75
gttccggatt gcgcttggcc cagt                                            24
<210>76
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>76
ctataggcta gccagctggc gcggatatcg ccaccatggg ggagaaaccc gggaccaggg    60
<210>77
<211>79
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>77
gatttcggat cccattctag agggcccgcg gtaccgcaag cttgatccgg agcagagttg    60
atcatcatag tcgtcatcc                                                 79
<210>78
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>78
gccctctaga gccgtcgacg ctgccatggg atccgaaatc g                        41
<210>79
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>79
gtagtcaccg gtgccggcca gcccggggag ccagcgcgcg                           40
<210>80
<211>943
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DhaA.H272 H11YL核苷酸序列
<400>80
gctagccagc tggcgcggat atcgccacca tgggatccga aatcggtaca ggcttcccct     60
tcgaccccca ttatgtggaa gtcctgggcg agcgtatgca ctacgtcgat gttggaccgc    120
gggatggcac gcctgtgctg ttcctgcacg gtaacccgac ctcgtcctac ctgtggcgca    180
acatcatccc gcatgtagca ccgagtcatc ggtgcattgc tccagacctg atcgggatgg    240
gaaaatcgga caaaccagac ctcgattatt tcttcgacga ccacgtccgc tacctcgatg    300
ccttcatcga agccttgggt ttggaagagg tcgtcctggt catccacgac tggggctcag    360
ctctcggatt ccactgggcc aagcgcaatc cggaacgggt caaaggtatt gcatgtatgg    420
aattcatccg gcctatcccg acgtgggacg aatggccaga attcgcccgt gagaccttcc    480
aggccttccg gaccgccgac gtcggccgag agttgatcat cgatcagaac gctttcatcg    540
agggtgcgct cccgatgggg gtcgtccgtc cgcttacgga ggtcgagatg gaccactatc    600
gcgagccctt cctcaagcct gttgaccgag agccactgtg gcgattcccc aacgagctgc    660
ccatcgccgg tgagcccgcg aacatcgtcg cgctcgtcga ggcatacatg aactggctgc    720
accagtcacc tgtcccgaag ttgttgttct ggggcacacc cggcgtactg atccccccgg    780
ccgaagccgc gagacttgcc gaaagcctcc ccaactgcaa gacagtggac atcggcccgg    840
gattgttctt gctccaggaa gacaacccgg accttatcgg cagtgagatc gcgcgctggc    900
tccccgggct ggccggctaa tagttaatta agtaggcggc cgc                      943
<210>81
<211>298
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成DhaA.H272 H11YL氨基酸序列
<400>81
Met Gly Ser Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val
 1               5                  10                  15
Glu Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp
            20                  25                  30
Gly Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Leu
        35                  40                  45
Trp Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Ser His Arg Cys Ile Ala
    50                  55                  60
Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Ala Lys Pro Asp Leu Asp
65                  70                  75                  80
Tyr Phe Phe Asp Asp His Val Arg Tyr Leu Asp Ala Phe Ile Glu Ala
                85                  90                  95
Leu Gly Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala
            100                 105                 110
Leu Gly Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Val Lys Gly
        115                 120                 125
Ile Ala Cys Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp
    130                 135                 140
Pro Glu Phe Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Ala Asp Val
145                 150                 155                 160
Gly Arg Glu Leu Ile Ile Asp Gln Asn Ala Phe Ile Glu Gly Ala Leu
                165                 170                 175
Pro Met Gly Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr
            180                 185                 190
Arg Glu Pro Phe Leu Lys Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe
        195                 200                 205
Pro Asn Glu Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu
    210                 215                 220
Val Glu Ala Tyr Met Asn Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu
225                 230                 235                 240
Leu Phe Trp Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala
                245                 250                 255
Arg Leu Ala Glu Ser Leu Pro Asn Cys Lys Thr Val Asp Ile Gly Pro
            260                 265                 270
Gly Leu Phe Leu Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu
        275                 280                 285
Ile Ala Arg Trp Leu Pro Gly Leu Ala Gly
    290                 295
<210>82
<211>293
<212>PRT
<213>Rhodococcus rhodochrous
<400>82
Met Ser Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val Glu
 1               5                  10                  15
Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp Gly
            20                  25                  30
Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Leu Trp
        35                  40                  45
Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Ser His Arg CysIle Ala Pro
    50                  55                  60
Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Asp Tyr Phe
65                  70                  75                  80
Phe Asp Asp His Val Arg Tyr Leu Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly
                85                  90                  95
Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly
            100                  105                  110
Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala Cys
        115                 120                 125
Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe
    130                 135                 140
Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Ala Asp Val Gly Arg Glu
145                 150                 155                 160
Leu Ile Ile Asp Gln Asn Ala Phe Ile Glu Gly Ala Leu Pro Lys Cys
                165                 170                 175
Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu Pro
            180                 185                 190
Phe Leu Lys Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu
        195                 200                 205
Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu Ala
    210                 215                 220
Tyr Met Asn Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp
225                 230                 235                 240
Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala
                245                 250                 255
Glu Ser Leu Pro Asn Cys Lys Thr Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu His
            260                 265                 270
Tyr Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg
        275                 280                 285
Trp Leu Pro Ala Leu
    290
<210>83
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>83
gggcacaccc ggcaccctga tccccccgg                                      29
<210>84
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>84
ctataggcta gccagctggc gcggatatcg ccaccatggg atccgaaatc ggtacaggct    60
tccccttcg                                                            69
<210>85
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>85
agggaagcgg ccgcctactt aattaactat tagccggcca gcccggggag ccagcgcgcg    60
atctcactgc                                                           70
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