虫草素在制备防治骨质疏松的药物中的应用
阅读：1030发布：2020-07-03
专利汇可以提供虫草素在制备防治骨质疏松的药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了虫草素在制备防治骨质疏松的药物中的应用，利用虫草素能够抑制破骨 细胞增殖 、多核成熟破骨细胞形成、破骨细胞噬骨能 力 、破骨细胞分化基因表达和清除破骨细胞内 活性 氧 (ROS)，稳定骨生理稳态，防止骨流失，保持骨 密度 ，为骨质疏松的防治提供了新的药物。，下面是虫草素在制备防治骨质疏松的药物中的应用专利的具体信息内容。
1.虫草素在制备防治骨质疏松的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述虫草素在制备抑制破骨细胞增殖的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述虫草素在制备抑制多核成熟破骨细胞形成的药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述虫草素在制备抑制破骨细胞噬骨能力的药物中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述虫草素在制备清除破骨细胞内活性氧的药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述虫草素在制备抑制破骨细胞分化基因表达的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述破骨细胞分化基因为c-fos、MAPK、NFATc1或NFKB基因。
虫草素在制备防治骨质疏松的药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及虫草素在制备防治骨质疏松的药物中的应用。
背景技术
[0002] 骨质疏松症(osteoporosis，OP)是由全身骨量减少，骨密度降低为标志的全身性、进行性骨病。在OP患者中，骨矿密度(BMD)降低，骨微结构遭到破坏，蛋白量及种类均发生改变，容易导致骨折。在绝经后妇女和75岁以上老年人中极为常见，是威胁老年人健康和降低生活质量的重要因素。
[0003] 破骨细胞(Osteoclast，OC)由造血干细胞系髓系单核细胞分化而来，是人体骨骼系统中唯一具有吸收和重塑骨骼形态的生理性多核巨细胞。破骨细胞的活性与数量与人体正常生理稳态电解质平衡中的钙磷平衡以及诸多内分泌疾病包括骨质疏松症密切相关。OP患者中破骨细胞活性明显提高，噬骨活动增加，破骨细胞与成骨细胞偶联作用下降，最终导致骨吸收大于骨形成，骨生理稳态遭到破坏，骨密度下降。
[0004] 氧化应激(oxidative stress)是指机体内产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)或者其他高活性氧化物的的速率大于机体清除能力和修复能力导致失衡的状态。ROS在正常生理状态下起着调控细胞凋亡、分化等作用。然而当机体处于氧化应激状态时，过多的ROS会导致细胞中的重要成分受损，包括蛋白质，核酸以及脂类。同时，正常的细胞信号通路会受到干扰是多类病理变化的基础。ROS在破骨细胞分化、成熟的过程中发挥了重要作用。破骨细胞线粒体内的过氧化氢参与其分化和融合的重要信号通路，促进破骨细胞活化，发挥噬骨功能。
[0005] 虫草素(cordycepin or 3'-deoxyadenosine)是一种核苷类腺苷的衍生物，是冬虫夏草(Cordyceps)中的有效活性物质。由于其化学结构与腺苷的类似性，生物酶有时难以将其两者区分，因此其在生物体内可以发挥重要的生物学作用。虫草素目前已被证实具有抗炎、抗氧化、清除自由基以及促进肿瘤细胞凋亡等功能。另外，虫草素被证实具有神经保护作用，改善大鼠心肌缺血再灌注损伤，通过抑制integrin/FAK通路阻止肝细胞肝癌表皮间细胞转移，并参与促进肿瘤细胞的自噬。近来有文献报道虫草素能够影响小鼠的学习认知功能，可一定程度的阻止基因毒性导致的老化。总之虫草素因其独特的生物学活性在生物体各个系统中均有可能起到一定的药理学作用，而在骨骼系统中未见虫草素有相关报道或应用。
发明内容
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供虫草素在制备防治骨质疏松的药物中的应用，提供了虫草素的新用途，也为骨质疏松的防治提供了新的药物。
[0007] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0008] 虫草素在制备防治骨质疏松的药物中的应用。
[0009] 进一步，所述虫草素在制备抑制破骨细胞增殖的药物中的应用。
[0010] 进一步，所述虫草素在制备抑制多核成熟破骨细胞形成的药物中的应用。
[0011] 进一步，所述虫草素在制备抑制破骨细胞噬骨能力的药物中的应用。
[0012] 进一步，所述虫草素在制备清除破骨细胞内活性氧的药物中的应用。
[0013] 进一步，所述虫草素在制备抑制破骨细胞分化基因表达的药物中的应用。
[0014] 进一步，所述破骨细胞分化基因为c-fos、MAPK、NFATc1或NFKB基因。
[0015] 本发明的有益效果在于：本发明公开了虫草素在制备防治骨质疏松的药物中的应用，有效剂量内能够抑制RANKL诱导的RAW264.7向破骨细胞的分化成熟、抑制RANKL诱导的RAW264.7分化成熟的破骨细胞的噬骨能力、清除RANKL刺激产生的细胞内ROS存积、显著降低NFATc1、c-fos、p38\MAPK及NFκB等破骨细胞分化特异基因的表达，抑制骨吸收，促进骨形成，最终起到防治骨质疏松的作用；并且虫草素为纯天然物质，用药较安全，毒副作用小，可用于骨质疏松的防治。附图说明
[0016] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0017] 图1为虫草素对RNAKL和M-CSF诱导下RAW264.7细胞增殖作用的影响(A：虫草素的化学式；B：培养24h不同浓度虫草素对RAW264.7细胞增殖的影响；C：培养72小时不同浓度虫草素对RAW264.7细胞增殖的影响，其中横坐标为不同浓度的虫草素给药剂量，纵坐标为以各组的吸光度OD值同空白对照组的OD值比较百分数表述的细胞活力值)。
[0018] 图2为不同浓度虫草素对RANKL诱导的破骨细胞形成的TRAP染色和不同细胞核数量破骨细胞计数统计结果(A：TRAP染色；B：TRAP阳性总细胞数；C：TRAP阳性单个核细胞数量；D：TRAP阳性2-3核细胞数量；E：TRAP阳性3核以上细胞数量)。
[0019] 图3为不同浓度虫草素对RANKL诱导的破骨细胞形成的影响(A：FAK免疫荧光染色；B：破骨细胞数量；C：多核破骨细胞数量)。
[0020] 图4为不同浓度虫草素对破骨细胞噬骨能力的影响和骨表面吸收统计(A：不同浓度虫草素对破骨细胞噬骨能力的影响；B：骨表面吸收统计)。
[0021] 图5为不同浓度虫草素在RANKL刺激下清除自由基的能力和细胞内ROS荧光强度分析(A：不同浓度虫草素在RANKL刺激下清除自由基的能力；B：细胞内ROS荧光强度分析)。
[0022] 图6为不同浓度虫草素对RANKL诱导的破骨细胞分化的基因表达的影响(A：TRAP基因；B：Ctsk基因；C：c-fos基因；D：MAPK基因；E：NFATc1基因；F：NFκB基因)。
[0023] 图7为虫草素对OVX小鼠骨质疏松的影响(A：骨密度；B：骨体积分数；C：骨代谢标志物S-PINP)。
具体实施方式
[0024] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0025] RAW264.7是小鼠单核巨噬细胞系，在核因子κB受体活化因子配体(RANKL)以及人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的刺激诱导下可以向破骨细胞分化，是研究破骨细胞分化、融合、成熟、噬骨等生物学行为的常用的细胞模型。同时破骨细胞与成骨细胞、骨细胞、基质细胞等都有密切的关联和耦合作用，是体内骨稳态及电解质稳态的重要调控元素。骨质疏松往往由过多的骨吸收导致，是破骨细胞过度活化的结果。故选择RAW264.7作为细胞模型，研究虫草素对RANKL诱导的破骨细胞生成的影响十分适宜。观察虫草素清除ROS的能力，是否抑制破骨细胞特异相关基因的表达及其对破骨细胞噬骨能力的影响，从而阐述虫草素在制备用于防治骨质疏松的药物中的应用及机制。
[0026] 一、虫草素对破骨细胞前体增殖的影响
[0027] 将RAW264.7细胞以1×103个/well接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+10％(v/v)胎牛血清+1％(wt)双抗(青霉素和链霉素各0.5％)，分别以终浓度为0(空白对照组)、0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL将虫草素加入各新鲜培养基中，然后加入96孔板中，同时以RANKL(50ng/mL)、M-CSF(50ng/mL)诱导RAW264.7细胞向破骨细胞分化。分别培养24h和72h，利用CCK-8法对细胞活性进行检测，观察虫草素对RNAKL和M-CSF诱导下RAW264.7细胞增殖作用的影响，结果如图1所示。由图1可知，在培养24h和72h组中，低浓度的虫草素(小于1μg/mL)对破骨细胞分化过程中的细胞增殖无明显影响，高浓度的虫草素(大于5μg/mL)对破骨细胞分化过程中的细胞增殖具有明显的抑制效应，*P＜0.05，#P＜0.05，*为组内比较，#为组间比较。
[0028] 二、虫草素对RANKL诱导的TRAP阳性细胞(破骨细胞)产生的影响
[0029] 将RAW264.7细胞以1×103个/well接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+10％(v/v)胎牛血清+1％(wt)双抗(青霉素和链霉素各0.5％)，然后按以下分组诱导培养：
[0030] 组1：RANKL(50ng/mL)诱导，无虫草素对照组；
[0031] 组2：RANKL(50ng/mL)诱导，0.01μg/mL虫草素实验组；
[0032] 组3：RANKL(50ng/mL)诱导，0.05μg/mL虫草素实验组；
[0033] 组4：RANKL(50ng/mL)诱导，0.1μg/mL虫草素实验组；
[0034] 组5：RANKL(50ng/mL)诱导，0.5μg/mL虫草素实验组；
[0035] 组6：RANKL(50ng/mL)诱导，1μg/mL虫草素实验组；
[0036] 组7：RANKL(50ng/mL)诱导，5μg/mL虫草素实验组；
[0037] 组8：RANKL(50ng/mL)诱导，10μg/mL虫草素实验组。
[0038] 诱导培养72h后，进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色，具体为：弃置培养基后用PBS清洗3次，每次3min，然后用质量分数为4％的多聚甲醛固定20min，再用PBS清洗3次，每次3min，接着用抗酒石酸酸性磷酸酶染液(0.1mg/ml of naphthol AS-MX phosphate，0.3mg/ml of Fast Red Violet LB复染)避光染色1h，弃置染液。PBS漂洗3次后每孔加入100μL PBS观察，结果如图2所示。图2中A从光镜下可见TRAP阳性细胞被染成紫红色；然后根据细胞核统计TRAP阳性细胞数，其中B为TRAP阳性总细胞数，C为TRAP阳性单个核细胞数量，D为TRAP阳性2-3核细胞数量，E为TRAP阳性3核以上(成熟破骨细胞)细胞数量。从统计结果可以看出，TRAP阳性总细胞数量在毒性浓度范围内随着虫草素给药剂量的增加而降低，单核、2-3核、3核以上成熟破骨细胞的数量具有相同的变化趋势。证明虫草素具有浓度依赖性抑制破骨细胞的生成。并且，当虫草素给药剂量浓度为临界毒性浓度1μg/mL时，抑制效果最明显(**P＜0.01)。
[0039] 三、虫草素对RANKL诱导的多核成熟破骨细胞形成的影响
[0040] 将RAW264.7细胞以1×103个/well接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+10％(v/v)胎牛血清+1％(wt)双抗(青霉素和链霉素各0.5％)，然后按以下分组诱导培养：
[0041] 组1：RANKL(50ng/mL)诱导，无虫草素对照组；
[0042] 组2：RANKL(50ng/mL)诱导，0.01μg/mL虫草素实验组；
[0043] 组3：RANKL(50ng/mL)诱导，0.05μg/mL虫草素实验组；
[0044] 组4：RANKL(50ng/mL)诱导，0.1μg/mL虫草素实验组；
[0045] 组5：RANKL(50ng/mL)诱导，0.5μg/mL虫草素实验组；
[0046] 组6：RANKL(50ng/mL)诱导，1μg/mL虫草素实验组；
[0047] 组7：RANKL(50ng/mL)诱导，5μg/mL虫草素实验组；
[0048] 组8：RANKL(50ng/mL)诱导，10μg/mL虫草素实验组。
[0049] 诱导培养72h后行FAK(Actin Cytoskeleton and Focal Adhesion Staining)免疫荧光染色，具体为：细胞取出后弃置培养基，1×PBS洗两遍，然后用质量分数为4％的多聚甲醛室温(18～25℃)下固定20min，再用1×PBS洗两遍，接着用质量分数为0.1％的Triton X-100穿透细胞5min，再用1×PBS洗两遍，用含质量分数1％BSA的1×PBS封闭缓冲液固定30min；然后用封闭缓冲液稀释一抗(Anti-Vinculin)至工作浓度(1：300)，室温孵育细胞1h；1×冲洗缓冲液(含质量分数0.05％Tween-20的1×PBS)洗三遍，每次5-10min，再将二抗(Alexa Fluor 488Goat Anti-Mouse IgG(H+L)抗体，Invitrogen)稀释至工作浓度(1：500)，同时加入TRITC标记的鬼笔环肽(TRITC标记的鬼笔环肽与1×PBS的质量体积比为1:500)。室温(18～25℃)下共同孵育1h，1×冲洗缓冲液洗三遍，每次
5-10min，室温(18～25℃)下用DAPI复染核5min，1×冲洗缓冲液洗三遍，每次5-10min。
荧光显微镜观察细胞，统计视野下破骨细胞数量，以及破骨细胞平均核数，结果如图3所示。结果显示，当虫草素剂量浓度超过0.1μg/mL时，破骨细胞的形成收到了明显的抑制，***P＜0.001(图3中B)。当虫草素剂量浓度超过0.1μg/mL时，多核破骨细胞(核数量大于3)的形成显著降低，***P＜0.001(图3中C)。
5-10min，室温(18～25℃)下用DAPI复染核5min，1×冲洗缓冲液洗三遍，每次5-10min。
荧光显微镜观察细胞，统计视野下破骨细胞数量，以及破骨细胞平均核数，结果如图3所示。结果显示，当虫草素剂量浓度超过0.1μg/mL时，破骨细胞的形成收到了明显的抑制，***P＜0.001(图3中B)。当虫草素剂量浓度超过0.1μg/mL时，多核破骨细胞(核数量大于3)的形成显著降低，***P＜0.001(图3中C)。
[0050] 四、虫草素抑制破骨细胞骨吸收能力
[0051] 将RAW264.7细胞以4×103个/well接种于铺200μm小牛骨片的48孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+10％(v/v)胎牛血清+1％(wt)双抗(青霉素和链霉素各0.5％)，然后按以下分组诱导培养：
[0052] 组1：无RANKL诱导，无虫草素空白对照组；
[0053] 组2：RANKL(50ng/mL)诱导，无虫草素对照组；
[0054] 组3：RANKL(50ng/mL)诱导，0.1μg/mL虫草素实验组；
[0055] 组4：RANKL(50ng/mL)诱导，0.5μg/mL虫草素实验组；
[0056] 组5：RANKL(50ng/mL)诱导，1μg/mL虫草素实验组；
[0057] 组6：RANKL(50ng/mL)诱导，5μg/mL虫草素实验组。
[0058] 培养96小时后取出含小牛骨片的48孔板，弃置培养基，用含质量分数10％漂白剂(HClO)室温(18～25℃)漂白5min，双蒸水清洗3遍，每次5min。室温(18～25℃)下放置至干燥(3-5小时)，最后用甲苯胺蓝染液染色5min，染色后双蒸水漂洗3-5遍，每次5min。每孔加入200μl双蒸水或1×PBS，光镜下观察，结果如图4所示。结果显示，骨表面经破骨细胞吸收后可被甲苯胺蓝染成蓝色，因此可以根据蓝色噬骨面积的大小和占总骨面的百分比评价破骨细胞的噬骨能力。结果可见未加入RANKL诱导的空白对照组无骨吸收；加入RANKL(50ng/mL)诱导，无虫草素对照组骨吸收表面比例与实验组相比最大(**P<0.01)；各实验组随着虫草素给药剂量浓度的提高，破骨细胞骨吸收能力显著下降，毒性剂量内最明显的虫草素剂量浓度为1μg/mL(***P<0.001)。
[0059] 五、虫草素清除破骨细胞内ROS累积抑制破骨细胞形成
[0060] 将RAW264.7细胞以1×103个/well接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+10％(v/v)胎牛血清+1％(wt)双抗(青霉素和链霉素各0.5％)，然后按以下分组诱导培养：
[0061] 组1：RANKL(50ng/mL)诱导，无虫草素，ROS阳性对照组；
[0062] 组2：RANKL(50ng/mL)诱导，无虫草素对照组；
[0063] 组3：RANKL(50ng/mL)诱导，0.1μg/mL虫草素实验组；
[0064] 组4：RANKL(50ng/mL)诱导，0.5μg/mL虫草素实验组；
[0065] 组5：RANKL(50ng/mL)诱导，1μg/mL虫草素实验组；
[0066] 组6：RANKL(50ng/mL)诱导，5μg/mL虫草素实验组。
[0067] 诱导培养72h后取出，弃置培养基，加入荧光探针DCFH-DA对细胞内的活性氧进行检测，组1加入ROS阳性对照solution，孵育20min，用无血清DMEM培养基洗3遍，充分去除未进入细胞的探针，荧光显微镜下观察细胞内荧光强度及荧光阳性细胞数量，结果如图5所示。结果显示，ROS阳性对照组荧光阳性细胞数量远大于其余各组(***P<0.001)。同时，RANKL诱导无虫草素对照组可见细胞内ROS活性较加入虫草素各组相比ROS活性较强(*P<0.05)。随着虫草素给药浓度剂量的增加，细胞内ROS活性随之下降，体现出虫草素具有浓度依赖性清除细胞内ROS及自由基的能力。
[0068] 6、虫草素抑制破骨细胞分化特异基因的表达
[0069] 将RAW264.7细胞以1×103个/well接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+10％(v/v)胎牛血清+1％(wt)双抗(青霉素和链霉素各0.5％)，然后按以下分组进行诱导培养：
[0070] 组1：RANKL(50ng/mL)诱导，无虫草素对照组；
[0071] 组2：RANKL(50ng/mL)诱导，0.01μg/mL虫草素实验组；
[0072] 组3：RANKL(50ng/mL)诱导，0.05μg/mL虫草素实验组；
[0073] 组4：RANKL(50ng/mL)诱导，0.1μg/mL虫草素实验组；
[0074] 组5：RANKL(50ng/mL)诱导，0.5μg/mL虫草素实验组；
[0075] 组6：RANKL(50ng/mL)诱导，1μg/mL虫草素实验组；
[0076] 组7：RANKL(50ng/mL)诱导，5μg/mL虫草素实验组；
[0077] 组8：RANKL(50ng/mL)诱导，10μg/mL虫草素实验组。
[0078] 诱导培养72h后取出，弃置培养基，用Trizol裂解细胞，提取细胞内的总RNA，实时定量RT-PCR对目的基因TRAP、Ctsk、c-fos、MAPK、NFATc1、NFKB进行定量检测。定量检测引物如下：
[0079] Ctsk：正 向 引 物：5'-gcggcattaccaacat-3'(SEQ ID NO.1)；反 向 引 物：5'-ctggaagcaccaacga-3'(SEQ ID NO.2)；
[0080] TRAP：正向引物：5'-ttgcacattcagtgtttttgg-3'(SEQ ID NO.3)；反向引物：5'-tgcaagtgtcgtgccaag-3'(SEQ ID NO.4)；
[0081] c-fos：正 向 引 物：5‘-aggcagaaccctttga-3’(SEQ ID NO.5)；反 向 引 物：5’-ggtgaccacgggagta-3‘(SEQ ID NO.6)；
[0082] Nfkb2：正向引物：5'-agcctcagggccttacaga-3'(SEQ ID NO.7)；反向引物：5'-ccgtacaatgctcagatcca-3'(SEQ ID NO.8)；
[0083] NFATc1：正向 引物：5'-gaggagttggctcagtg-3'(SEQ ID NO.9)；反向 引 物：5'-tagcgttccgttcgtt-3'(SEQ ID NO.10)；
[0084] MAPK：正向引物：5'-gacagagtacgtagccacacgtt-3'(SEQ ID NO.11)；反向引物：5'-agcccacagaccaaatatcaa-3'(SEQ ID NO.12)，每组做独立实验5复孔，并以GAPDH和actin为双内参，具体引物为：
[0085] GAPDH：正 向 引 物：5'-agatggagatttct-3'(SEQ ID NO.13)；反 向 引 物：5'-cttgcttagtttcttgtctggtg t-3'(SEQ ID NO.14)；
[0086] Actin：正 向 引 物：5'-tccctgtatgcctctg-3'(SEQ ID NO.15)；反 向 引 物：5'-atgtcacgcacgattt-3'(SEQ ID NO.16)。
[0087] 定量检测结果如图6所示。结果显示，虫草素浓度为0.1μg/mL时能够抑制破骨细胞标志物Ctsk和TRAP的表达(***P<0.001)，并且呈浓度依赖性，当虫草素剂量浓度升高至1μg/mL时抑制作用进一步加强(**P<0.01)；同时，破骨细胞分化特异相关基因c-fos、MAPK、NFATc1、NFKB表达呈显著变化，其中，NFKB，c-fos、MAPK、NFATc1基因均在虫草素浓度剂量为0.1μg/mL时表达显著降低(**P<0.01)。NFKB基因在虫草素浓度剂量为0.5μg/mL时表达显著降低(***P<0.001)。可得出结论虫草素通过抑制破骨细胞分化特异性基因c-fos、MAPK、NFATc1、NFKB的表达进而抑制破骨细胞的分化，形成，成熟和骨吸收能力。
[0088] 七、虫草素明显改善OVX小鼠骨质疏松
[0089] 1、OVX骨质疏松小鼠模型建立
[0090] 取48只8周龄C57BL/6J雌性小鼠，体重为18-22g。戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，手术组(OVX)背侧入路切除小鼠双侧卵巢，对照组(Sham)进行假手术，暴露卵巢后缝合关闭切口。术后一周开始给药，给药持续8周，每周2次，给药方法为将虫草素溶解于无菌生理盐水中腹腔注射给药，按照10mg/kg的剂量浓度给药，对照组则给予同等剂量的生理盐水。小鼠被随机分为四组，手术组+给药(n＝12)，手术组+对照(n＝12)，对照组+给药(n＝12)，对照组+对照(n＝12)。
[0091] 2、平均骨密度检测与骨代谢标志物检测
[0092] 完成8周给药后每只小鼠分离左侧股骨，去除多余软组织，固定。心脏采血获得血液样本。通过小动物microCT检测骨微结构进行分析。管电压为50kV，管电流为0.1mA，分辨率为8mm。股骨扫描区域限定为远端干垢端，向近端的初级松质近末端区域延伸2mm。选定的感兴趣区(ROI)的3D参数用于数据分析，包括：骨矿物质密度、连接密度、结构模型指数、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分离度和相对骨体积分数。血液样本用于分析骨代谢产物包括：PINP，CTX-I和TRACP 5b，分析结果如图7所示。
[0093] 结果显示，相对于假手术组(Sham)，OVX小鼠的骨密度和骨体积分数明显下降，同时连接密度、骨小梁数量、骨小梁厚度也有所降低。然而，通过虫草素给药后，OVX组小鼠的骨密度、骨体积分数、连接密度、骨小梁数量和骨小梁厚度相对OVX组都显著提高，结果具有统计学差异(P<0.05)。因此得出结论虫草素能够对雌激素缺乏导致的骨质疏松起到保护作用。
[0094] 综上所述，虫草素对破骨细胞的分化、形成、成熟以及骨吸收能力均有显著的抑制作用。基于该功能，虫草素可应用于骨质疏松的防治，尤其是破骨细胞活跃相关的骨质疏松症中。
[0095] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
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分析报告
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