本发明涉及细胞活性的调节、特别是在人体中使用透明质酸形 式(包括特定分子量和级份的如透明质酸钠)和透明质酸形式的模 拟分子的细胞活性调节。

细胞粘连分子，起初只被看作将组织中细胞维系在一起的胶粘 物。如今人们认识到其对人体的功能有更广泛的作用。请见 BIOTECH GETS A GRIP ON CELL ADHESION，SCIENCE，Volume 260 (1993年5月14日)。

人们基于这些细胞粘连分子提出了新的治疗方案。涉及到的一 类内皮粘连分子包含内皮粘连分子ICAM—1。此分子(ICAM—1)能 携带人类鼻病毒(其能诱发50％的感冒)进入人体细胞。通过附着 在粘连分子ICAM—1上，鼻病毒进入人体细胞。

用水溶性ICAM—1作诱铒，细胞感染有可能被阻断。但是，水 溶性ICAM粘性不很强、故上述设想未能进入市场。

人们采用基因工程技术将抗体片段融合到ICAM—1的鼻病毒 结合部位，试图发现防止普通感冒的方法。

另一粘连分子CD44，通常存在于淋巴细胞。CD44粘连分子也嵌 在转移性的胰腺肿瘤细胞的表面。CD44分子能非特异地掩蔽癌细胞 并使其自由地循环于血流中。

现已发现，粘连分子ICAM—1是透明质酸(hyaluronan)的细胞 表面受体。ICAM—1表达(产生并附于细胞表面)于肝内皮细胞和 角膜上皮细胞。在炎症、癌症和感染中ICAM—1过分表达。

HARLEC(透明质酸[Hyaluronan]受体肝内皮细胞)也是透明 质酸(Hyaluronan)的细胞表面受体，且也表达于(产生并附于细胞 表面)肝内皮细胞及角膜上皮细胞。(本发明人相信此二者为一个且 相同的粘连分子，或至少二者的内在联系紧密到二者被视为同一 物。)

CD44分子和RHAMM(HA介导的能动性受体)也是透明质酸 (hyaluronan)的细胞表面受体。RHAMM为调节分子。CD44为粘连 分子。

因而，本发明的目的是提供治疗疾病维护健康的新的方法，提 供透明质酸(hyaluronan)(HA)形式的新用途，提供药物组合物的 新剂量单位以及适合应用于这种治疗和HA形式之用途的新的药物 组合物。

本发明另一目的是，根据其与透明质酸形式结合同一受体的能 力，例如，对透明质酸的高亲和性细胞表面受体，使用透明质酸的 及其药学上可接受的盐(如透明质酸钠)的模拟分子，从而提供治 疗疾病的新方法，这些透明质酸模拟分子的新用途，含此分子的药 物组合物的新剂量单位，以及适合应用于此治疗及模拟分子用途的 新的药物组合物。

本领域技术人员能够从下面的本发明简要介绍及实施例中，领 会到本发明进一步的其它目的。

按照本发明的内容之一，提供一种对人体组织及细胞的细胞活 性调节的方法，该细胞表达透明质酸的高亲和力细胞表面受体，如 粘连分子(例如，ICAM—1，HARLEC和CD44)、调节分子(如 RHAMM)，本方法包括给人施用非毒性、有效剂量的透明质酸形式 (例如，透明质酸，其药学上可接受的盐，[例如，平均分子量小于 750,000道尔顿，例如，少于50,000道尔顿，在约100,000至150, 000和225,000道尔顿的透明质酸钠，如购自Hyal Pharmaceutical Corporation在150,000—225,000道尔顿之间的及美国专利申请08/ 143983公开的透明质酸钠]，以及透明质明钠形式的分子量级份(例 如，在加拿大获准专利1205031(Fidia)中公开的那些50,000—100, 000道尔顿、250,000—350,000道尔顿及500,000—730,000道 尔顿之间的级份，或者其它如小于50,000道尔顿及在100,000— 150,000道尔顿之间的级份)，或透明质酸的同系物、类似物、衍生 物、复合物、酯、片段和/或亚单位和/或其混合物)，优选分子量小 于750,000道尔顿的透明质酸，其药物可接受的盐(如透明质酸 钠)及其混合物，以及具有与透明质酸形式结合相同受体的能力的、 上述透明质酸形式的模拟分子，其可调节表达诸如透明质酸的高亲 和力细胞表面受体(例如，粘连或调节分子)的组织和/或细胞的细 胞活性，其存在于人可耐受的药物载体以及赋形剂(例如，无菌 水)中。

举例说明，在损伤或创伤区域可能发生炎性反应，反应可以包 括炎性细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞、及其它白细胞)向该区域 迁移。引起炎性反应所造成损伤可能比实际损伤更大。纤维变性也 是如此。使用的透明质酸形式能与分子(如粘连分子或调节分子)的 HA受体(高亲和力细胞表面受体)结合，从而调节人体反应，并随 之而来调节损伤。同样，所用的具有与同一受体结合能力(与透明 质酸形式相比)的模拟透明质酸形式的分子能与HA受体结合。模拟 透明质酸形式的分子的实例，如与受体的活性部位结合的单克隆抗 体，与受体位点匹配的多肽，及与受体位点匹配的合成化学物质。

用以治疗疾病的药物也可伴随透明质酸形式和/或模拟透明质 酸形式给药，其中该药物增强了HA形式及模拟HA活性之分子的 调节作用。

HA形式进一步使药物定向于粘连分子(例如，ICAM-1， HARLEC，及CD44)及调节分子RHAMM。

适当的药物可包括如自由基清除剂(如抗坏血酸(维生素C))抗 癌制药，化疗制剂、抗病毒制剂如非离子表面活性剂如DelfenTM避孕 膏中的壬苯聚醇[壬基苯氧聚乙氧乙醇]，及阴离子表面活性剂(如 氯化十六烷基吡啶鎓)和阳离子表面活性剂(如氯化苯甲烃铵)，非 甾类抗炎药(NSAID)如消炎痛、萘普生、双氯芬酸及(+/-)酮 咯酸缓血酸胺盐(商标为ToadolTM)，甾类抗炎药、抗真菌剂，解毒 剂(如灌肠剂直肠给药)、止痛药，支气管扩张药、抗细菌剂，抗生 素，治疗血管局部缺血(如糖尿病及贝格尔疾病)药，抗体单克隆 试剂，体表使用以利头发生长的长压定，利尿剂如速尿(商标为 LasixTM)、免疫抑制剂(如环孢菌素)，淋巴因子(如细胞介素2等)， α及β-干扰素，等等。

按照本发明的另一方面，提供透明质酸形式，例如，透明质酸， 其盐(如分子量小于750,000道尔顿如225,000道尔顿的透明质 酸钠)，其分子级份[例如，Hyal Pharmaceutical Corporation公开的 150,000—225,000道尔顿之间的，加拿大专利1205031(FIDIA) 公开的50,000—100,000道尔顿，250,000—350,000道尔顿及 500,000—730,000道尔顿之间的，或其它级份]，透明质酸的同系 物、类似物、衍生物、复合物、酯、片段和/或亚单位和/或其混合 物，以及与透明质酸形式结合同一受体的透明质酸模拟分子的用途， 以调节表达高亲和力细胞表面受体的人体组织和/或细胞的细胞活 性。透明质酸形式可与药物可接受的赋形剂或载体(如灭菌水)一 同使用，同样，病人体内组织或细胞调节得以加强。HA和/或HA模 拟分子与分子的HA受体(如对透明质酸形式具高亲和力的细胞表 面受体)结合，例如，粘连或调节分子的HA受体。同样，HA形式 及HA模拟分子可与适当药物同时使用(如前所述)，HA形式HA模 拟分子及药物都使用有效的无毒剂量。

HA形式及HA模拟分子也可用以预防某种疾病(如感冒)。HA 形式和/或HA模拟分子与ICAM—1粘连分子结合(替代了鼻病毒 的结合或附着)，便防止了人鼻病毒进入人体细胞。

因此，按照本发明的另一项内容，本申请人提供了预防疾病和 /或病症的新方法，本方法包括给人施用有效的、非毒性剂量的透明 质酸形式(例如，透明质酸，其药物可接受的盐如分子量小于750, 000道尔顿如225,000道尔顿的透明质酸钠，又如得自Hyal Pharma- ceutical Corporation的150,000—225,000道尔顿之间的及美国专利 申请08/143983公开的透明质酸钠，以及透明质酸钠形式的分子量 级份[例如，加拿大专利125031(Fidia)公开的50,000—100,000 道尔顿，250,000—350,000道尔顿及500,000—730,000道尔顿 的级份或其它级份]，透明质酸的同系物、类似物、衍生物、复合物、 酯、片段和/或亚单位/或其混合物，和/或与透明质酸形式结合同一 受体的透明质酸形式的模拟分子，调节组织和/或细胞的细胞活性， 该组织或细胞表达透明质酸形式的高亲和力细胞表面受体的分子， 例如，人体的粘连或调节分子，因而可预防疾病或病症。HA形式或 模拟分子用药优选在药物可接受的赋形剂载体(例如，无菌水)中。 例如可预防普通感冒。有助于预防疾病或病症的药物可与透明质酸 (HA)形式和/或HA模拟分子一同给药。例如，乙酰水杨酸可与HA 形式和/或模拟分子同时给药来防止中风。

透明质酸形式(HA)及HA模拟分子用药例如会抑制人体细胞 粘连和/或调节细胞活性，HA及模拟分子与分子的HA受体结合，结 合在透明质酸形式的高亲和力细胞表面受体，例如，粘连分子(如 1CAM—1，HARLEC及CD44)和/或调节分子(如Rhamm)。于是， 透明质酸形式及模拟分子用药后将结合到分子的HA受体部位，因 而防止疾病或病症(例如，防止鼻病毒与粘连分子ICAM—1结合，便 会防止鼻病毒附着于粘连分子1CAM—1进入人体细胞)。

正如上面讨论的，用以防止疾病和/或病症的药物，可与透明质 酸形式伴随使用以防止疾病或病症。例如，中风的预防，今天人们 服用有效剂量的乙酰水杨酸(阿斯匹林)，此药物可与有效、非毒性 剂量合适的透明质酸形式(例如，分子量小于750,000道尔顿的透 明质酸钠)和/或有效剂量的模拟分子伴随用药。因而，可确信二者 同时使用比单独使用阿斯匹林更能降低中风的危险。当HA形式与 细胞和/或组织表达的透明质酸形式的高亲和力细胞表面受体结合 时，例如与粘连分子(如ICAM—1，HARLEC及CD44)及调节其活 性的调节分子(如RHAMM)，HA形式进一步使药物定向于需要治疗 的区域。

给药方式可有静脉内、心房内、腹膜内、胸膜内、经皮给药、皮 内—到皮肤内(如表皮定向)给药，通过有效剂量表皮用药及通过 粘膜表面给药，例如，鼻内、直肠内(例如，通过对直肠特定区域 表面给药或某种灌肠剂)，以及通过直接注射给药。

透明质酸形式用药，可使用变化的有效剂量，例如，10至 1000mg/70kg的人，最佳剂量范围在50至500mg/70kg的人。因其对 人体无毒性，显然透明质酸可以过量给药(如3000mg/70kg个体)而 无任何副作用。

表面(如用于皮肤或粘膜)用药，每cm2(平方厘米)皮肤或暴 露组织(包括粘膜)可使用透明质酸形式高于5mg。

对于疼痛的治疗，可表面使用HA组分，优选至少10mg/cm2。

本领域技术人员使用时，可推出HA模拟分子的有效剂量。

因此，如非表面用药，则有效剂量可含至少10mg透明质酸形式 每70kg个体至超过1000mg每70kg个体。当某种NSAID，例如，消 炎痛(溶于n-甲基葡萄糖胺中)或其它NSAID伴随大于200mg的 透明质酸如透明质酸钠对70kg个体每公斤体重1—2mg给药时，对 于NSAID(例如消炎痛和NMG)，无严重毒副作用诸如胃肠紊乱、神 经异常，抑郁等发生。即使提高消炎痛剂量(若需要)也是如此。如 果透明质酸低于上述剂量，就会复发常见的副作用。若表面给药，则 每cm2皮肤、粘膜或组织所用透明质酸剂量至少约5mg。

伴随透明质酸组分和/或HA模拟分子的药物依治疗方式调整 至有效的、非毒性剂量。

适用于本发明的一种透明质酸形式和/或其药物可接受盐(例如 钠盐)及透明质酸的类似物、衍生物、复合物、酯、片段及亚单位， 优选透明质酸及其盐，是由Hyal pharmaceutical Corporation提供。这 种形式为15ml瓶装20mg/ml的透明质酸钠(300mg/瓶—Lot2F3)，此 透明质酸钠为2％溶液，其平均分子量为约225,000道尔顿。瓶中 还含有三蒸、灭菌水，其符合U.S.P注射制剂的要求。透明质酸和 /或其盐可装于1型硼硅酸盐玻璃瓶中，瓶子用不与瓶内容物反应的 丁基橡胶塞封闭。

透明质酸和/或其药物可接受的盐(如钠盐)的级份/量及透明 质酸钠同系物、类似物、衍生物、复合物、酯、片段及亚单位，优 选透明质酸及其药物可接受的盐，可以包含具有以下特征的透明质 酸和/或其盐：

纯化的基本无热原成分具有选自以下的一个特征的自然来源的 透明质酸：

i)分子量在150,000—225,000范围内；

ii)硫酸粘多糖占总重量约1.25％以下；

iii)总重量中蛋白含量少于0.6％；

iv)铁离子占总重量的约150ppm以下；

v)总重量中含铅量少于15ppm；

vi)葡萄糖胺含量少于0.0025％；

vii)葡萄糖醛酸含量小于0.025％；

viii)N-乙酰葡萄糖胺含量小于0.025％；

ix)氨基酸含量小于0.0025％；

x)257nm处紫外吸收值小于约0.275；

xi)280nm处紫外吸收值小于约0.25；及

xii)pH值7.3—7.9范围内。

优选透明质酸与水混合，且透明质酸级份的平均分子量在150, 000—225,000范围内。更优选至少有以下特征之一的透明质酸级 份：

i)硫酸粘多糖含量(占总重量)小于约1％；

ii)总重量中蛋白的含量小于约0.4％；

iii)总重量中铁含量小于约100ppm；

iv)总重量中铅含量小于约10ppm；

v)葡糖胺少于0.00166％；    

vi)葡糖醛酸少于0.0166％；

vii)N-乙酰葡糖胺少于0.0166％；

viii)氨基酸少于0.00166％；

ix)257nm处紫外吸收值小于约0.23；

x)280nm处紫外吸收值小于0.19；及

xi)pH在7.5—7.7范围内。

此外，申请人成功地使用了LifeCoreTM Biodmedical lnc生产并提 供的透明质酸钠，其有下述规格： 特征                      规格 外观                      白色霜状至有色颗粒 嗅味                      无味 粘均分子量                ＜750，000道尔顿 UV/Vis扫描，190—820nm    符合标准 OD，260nm                 ＜0.25 OD单位 透明质酸酶敏感性          阳性反应 IR扫描                    符合标准 pH，10mg/g溶液            6.2—7.8 水                   最大值8％ 蛋白质               ＜0.3mcg/mgNaHy 乙酸盐               ＜10.3mcg/mgNaHy 重金属最大含量(ppm) As     Cd     Cr      Co      Cu     Fe     Pb     Hg    Ni 2.0    5.0    5.0    10.0    10.0    25.0   10.0   10    5.0 微生物生物负荷       未观察到 内毒素               ＜0.07EU/mgNaHy 生物安全试验         通过兔眼毒性试验

Skymart Enterprises，lnc.出售的命名为Hyaluronan HA—M5070 的另一形式的透明质酸钠有以下规格：

                   规格试验结果 批号(Lot No.)                HG1004 PH                           6.12 硫酸软骨素                   未测到 蛋白质                       0.05％ 重金属                       不超过20ppm 砷                           不超过2ppm 干燥失重                     2.07％ 灼烧后残余物                 16.69％ 内粘度                       12.75dl/s(xw：679,000) 氮                           3.14％ 测定                  104.1％ 微生物计数            80/g 大肠杆菌              阴性 霉菌和酵母菌          不多于50/g

其它透明质酸形式和/或其盐，及其透明质酸的同系物、衍生物、 复合物、酯、片段及亚单位可选择自其它供应商，如在现有技术中 所述。下述参考文献告诉我们透明质酸，其来源及其制备和回收方 法。

美国专利4,141,973公开的透明质酸级份(包括其钠盐)：

“(a)平均分子量大于约750,000，优选大于约1200,000，即 限制其粘度大于约1400cm3/g，优选大于约2000cm3/g；

(b)蛋白重量含量少于0.5％；

(c)1％透明质酸钠溶液，257nm波长紫外吸光度小于3.0， 280nm波长紫外吸收小于2.0；

(d)1％透明质酸钠生理缓冲溶液的运力学粘度大于1000厘沲， 优选大于10，000厘沲；

(e)0.1—0.2％透明质酸钠生理缓冲溶液的摩尔旋光小于—11 ×103度—cm2/mole(对双糖)，测量于220nm；

(f)当1ml1％透明质酸钠生理缓冲溶液植入玻璃体，置换出约 一半玻璃体液时、鹰猴眼睛的玻璃体腔及前腔无明显细胞侵润，眼 房水无病症突发，玻璃体不模糊或无突发病症，角膜、晶状体、虹 膜、视网膜及脉络膜无病理变化。所说HUA应

(g)灭菌且无热原，并

(h)无抗原性。”

加拿大专利1,205,031(其以美国专利4,141,937为现有技 术)涉及平均分子量50,000至100,000；250,000至350,000； 及500,000至730,000的透明质酸级份，并讨论了它们的制备方 法。

使用高分子量的透明质酸(或其盐或其它有关形式)，必须稀释 至用药允许范围并保证无肌内凝固。

根据本发明的内容之一，提供药物组合物的剂量单位，以调节 人体组织及细胞的细胞活性，所述组织及细胞表达对透明质酸组分 具高亲合力的细胞表面受体的分子，如粘连分子(如，ICAM—1， HARLEC及CD44)以及调节分子(如RHAMM)，此剂量单位包括存 在于人体可耐受的药用载体(如无菌水)中的，非毒性、有效剂量 的透明质酸形式(如，透明质酸，其药物可接受的盐，[例如，透明 质酸钠，其分子量小于750,000道尔顿如225,000道尔顿]，质酸 形式的分子量级份(例如，Hyal pharmaceutical Corporation的150, 000—225,000道尔顿的级份，美国专利申请08/143983及加拿大专 利1205031(Fidia)公开的50,000—100,000道尔顿，250,000— 350,000道尔顿及500,000—730,000道尔顿的级份，或少于50, 000道尔顿及100,000—150,000道尔顿之间的其它级份)，透明 质酸的同系物、类似物、衍生物、复合物、酯、片段或亚单位和/或 其混合物)以及能结合同一受体的HA模拟分子，作用于人体调节组 织和/或细胞的细胞活性，该组织和细胞表达对透明质酸形式具高亲 合力的细胞表面受体的分子，例如人体粘连分子和/或调节分子。

用此剂量单位治疗的结果为，患者的组织和/或细胞调节得以增 强。透明质酸形式(HA)或HA模拟分子的使用结果是，例如，细 胞粘连的抑制和/或细胞活性的调整和/或调节，HA和HA模拟分子 皆结合到分子的HA受体上(例如，粘连分子，调节分子等)。于是， 疾病或病症的预防可以完成。出乎意料的是HA及HA模拟分子对 细胞表面HA受体的亲和力高，这使得可以调节疾病和病症如，炎性 过程、纤维化及致癌基因控制(防止癌症及其转移)。

药物组合物的剂量单位也可包括有效的、非毒性剂量的治疗疾 病和/或病症的药物或治疗剂，同时含有预防疾病或病症的透明质酸 形式或其模拟分子。因而此药物能增强HA形式及HA模拟分子活 性的调节。HA形式进一步使药物定向于分子的细胞表面受体，例 如，ICAM—1，HARLEC、及CD44(粘连分子的实例)及RHAMM (调节分子)。

故此根据本发明的另一内容，药物组合物的剂量单位可包括：

i)以非毒性、治疗有效量治疗疾病或病症的药物和/或治疗剂；

ii)非毒性、治疗有效剂量的透明质酸形式(例如，透明质酸， 其药物可接受的盐[例如，分子量小于750,000道尔顿如225,000 道尔顿的透明质酸钠]、透明质酸钠形式的分子量级份(例如，Hyal Pharmaceutical Corporation的在150,000—225,000道尔顿范围内的 级份，美国专利申请08/143983公开的及加拿大专利120 5031 (Fidia)中公开的级份，如50,000—100,000道尔顿，250,000— 350,000道尔顿、500,000—730,000道尔顿，或者如小于50,000 道尔顿及100,000—150,000道尔顿的其它级份)，透明质酸的同 系物、类似物、衍生物、复合物、酯、片段和/或亚单位和/或其混 合物)，以及结合同一受体的透明质酸形式的模拟分子，作用于人体 调节组织和/或细胞的细胞活性，该组织和细胞表达透明质酸形式的 高亲和力细胞表面受体的分子，例如，人体粘连分子或调节分子；

iii)药物可耐受的赋形剂(如无菌水)；

其中组分(ii)的形式如此，在药物组合物剂量单位给药时，组 分(ii)可调节组织及细胞的细胞活性，该细胞和组织表达如人体粘 连分子(例如，ICAM—1，HARLEC及CD44)及调节分子 (RHAMM)，通过诸如与透明质酸形式和/或HA模拟分子的受体结 合实现上述作用，且组分(ii)如果为透明质酸形式，其便会依情况 将组分(i)立即转运到体内或皮肤内。

适当的药物及治疗剂可包括如自由基清除剂(如抗坏血酸)维 生素C))；抗癌制剂；化疗制剂；抗病毒制剂如非离子表面活性剂， 例如存在于DelfenTM避孕膏中的壬苯聚醇—9[壬基苯氧聚乙氧乙 醇]，及阴离子表面活性剂(如氯化十六烷基吡啶鎓)和阳离子表面 活性剂(如氯化苯甲烃胺)；非甾类抗炎药物(NSAID)如消炎痛、萘 普生及(+/-)Ketorolac的缓血酸铵盐(销售商标为ToadolTM)；甾 类抗炎药；抗真菌制剂；解毒剂(如灌肠剂直肠给药)；止痛药；支 气管扩张药；抗细菌制剂；抗生素；治疗血管局部缺血(如糖尿病 及贝格尔疾病)药；抗体单克隆试剂；体表使用以利头发生长的长 压定，利尿剂如速尿(商标为LasixTM)；免疫抑制剂(如环孢菌素)； 淋巴因子(如细胞介素2等)；α及β—干扰素等等。

药物组合物的剂量单位可以集中于一容器中，以便提供多剂量 形式，从中可取得个体剂量。

本发明以下面实施例说明：

实施例1

多糖hyaluronan(透明质酸；HA或HYA)从循环中被快速清除， 主要由肝脏内皮细胞通过受体介导的细胞摄粒作用。从鼠肝脏内皮 细胞(LEC)中确定并纯化这些细胞上的HYA受体，并制备多克隆 抗体，其它HYA的细胞表面“受体”已被描述，并包括淋巴细胞导 向受体CD44及HYA介导的纤维细胞能动性受体(RHAMM)。已知 很多癌瘤在一些肿瘤衍生细胞上富含HYA及HYA结合位点。先前 的发现表明变态的组织如存在于鼠肥大细胞瘤及人乳腺癌HA受体 染色阳性，而HA受体开始发现于肝内皮细胞。

本工作是为了确定易接近的HYA结合位点是否存在于体内肿 瘤组织，及先前描述的HYA结合蛋白与这可能的位点之间的关系。 最近开发的125I-标记方法可被使用，其并未明显改变多糖的分子量 及其受体结合性质。

材料及方法

多糖

用以标记及摄入并逆向研究的HA，提取自鸟组织，并由Hyal Pharmaceutical Corporation，Toronto，Canada提供。在0.25M NaCl，0. 05％氯丁醇中，用400,1000及2000孔的Sephacryl HR标准层析柱 (Pharmacia，UppSala，Sweden)确定HA的分子量分布，每个部分HA 的含量通过测定214nm吸收值确定，放射性用Packard自动伽马- 伽马计数器(auto—gamma gamma counter)通过γ计数测量(平均分 子量450,000道尔顿左右，由平均分子量500,000—800,000道 尔顿粉末制备)。

HA标记

如前所述，多糖经CNBr活化后，HA用酪氨酸(Sigma Chemical company St Louis，U.S.A)标记，方法见Glabe et at[Glabe CG，Harty P.K.and Rosen S.D.，Preparation and properties of fluorescent polysac- charides.Anal.Biochem.130：287—294(1983)]。简言之，15mg HA 在PH11条件下，用8mg CNBr活化5分钟，用0.2M硼酸盐缓冲液 (PH8.0)平衡的Sephadex G25小柱(pD 10，Pharmacia，Uppsala， Sweden)从反应混合物中分离活化的多糖，活化HA与1mg酪氨酸 (T)孵育过夜。用含NaCl(8g/l)、KCl(0.2g/l)，KH2PO4(0.2g/ 1)及Na2HPO4(1.15g/l)的磷酸盐缓冲生理盐水(PH7.5)(PBS)平 衡的PD10柱将结合T的HYA(T—HA)和未结合T的分离。

在覆盖有10μg1，3，4，6-四氯-3a，6a-二苯基甘代联脲 (Sigma Chemical Company，St.Louis，U.S.A.)薄膜的小玻璃管中， 将100μgT—HA和0.5mCi125I置于一起，使部分T—HA被125I碘化。未 结合的125I用PBS平衡的PD10柱除去，碘化的，T—HA(125I—T— HA)保存于5℃。特定的放射性通常为1500—5000dpm/ng。

凝胶过滤层析的1255I—T—HA有较高分子量，并发现在循环中按 动力学被廓清，及高分子量的生物合成标记HA的器官分布亦被报 道。125I标记的多糖也被体内及体外的分离的鼠肝脏内皮细胞摄取， 这表明标记并不干扰其与这些细胞上的特异细胞表面受体的结合。

免疫染色

所有染色皆用ABC—elite方法(VectastainElite ABC)。6μm的 冰冻切片准备毕，加至玻片上，用明胶—Kromalun包被：0.5g( KCr(SO4)2×12H2O)溶于750ml蒸馏水中，5g明胶溶于250ml蒸馏水中， 加热至56℃，混合。为除去与血清蛋白的非特异结合，抗血清及前 免疫血清用偶联有鼠血清蛋白(6mg蛋白/ml胶)的Sepharose4B gel(Pharmacia LKB Technology，Uppsala)吸收，按制造商说明进行偶 联(亲合层析法；规则及方法(Affinity Chromatography； Princicples&methods)，by pharmacia LKB Biotechnology).血清与凝胶 按相同体积混合，4℃孵育6小时，冷冻切片在冷甲醇中固定10分 钟，干燥10分钟后在磷酸缓冲盐水(PBS)中洗涤。在含0.3％H2O2甲醇中封闭过氧化酶，在PBS中再洗涤切片。为封闭内源生物素及 生物素结合活性，使用抗生物素蛋白/生物素封闭试剂盒(自Vector 实验室)。然后切片在含4％羊血清的PBS中孵育30分钟(Vectastain Elite ABC)。HARLEC抗血清用含4％羊血清的PBS1∶300稀释，并孵 育1小时。在PBS中清洗后，切片与第二羊抗兔抗体(VectatainElite ΔBC)(用PBS 1∶200稀释)孵育30分钟。与第二抗体孵育后、切 片清洗后与ABC—Elite—complex(VectastainElite ABC)孵育。为了 显色，溶于6ml二甲亚砜(DMSO)的10mg 3-氨基-9-乙基咔唑 与45ml 15mM乙酸盐缓冲液(PH5)及4μl强双氧水(Merk)混合， 并将切片在混合物中孵育7.5分钟。清洗后，切片用Aayers苏木精 复染色1.5分钟。玻片置于Kelsers glycerol—gelatin(Merk)中。

切片的透明质酸酶处理

切片用甲醇固定并用PBS清洗后，与5U/ml的链霉菌属透明质 酸酶(Amano Parmacecltical Co，Ltd.Japan)，1mg/ml胃酶抑素 (Sigma)，0.1MN-乙基顺丁烯二酰亚胺、0.1M EDTA(Merck)及 5K1E/ml Trasylol(Bayer)在37℃孵育2小时，然后采用常规染色方 法。

体内摄取研究

重量为200—250g的四只雌性裸(Na/Nu)鼠皮下接种约3×106 细胞(在0.5ml RPMI培养基中)的人细胞株CCL218(American Tissue Type Collection)，接种时用乙醚麻醉、部位在一只后腿，时间在实验 前14—30天。用戊巴比妥(每公斤体重45mg)麻醉，在其尾静脉、 或直接对肿瘤的约1—2cm2范围注射3.4—1500μg的125I—T—HYA (5—15×106cpm)。为降低特异活性并得到较高含量的HA，有时还 添加未标记的HA的0.05—1.0ml 0.15M NaCl、10mM NaH2PO4(pH ＝7.4)的溶液。

研究结束后，处死动物并测其肿瘤及器官的放射性。数据用 Macintosh SE/30或Macintosh llsi计算机(Apple computer lnc.Cu- pertino，CA，U.S.A)处理，用Cricket Graph软件(Version 1. 3，Cricket software，Malvern，PA，U.S.A)及Canvas(version 3、 0、2，Deneba Systems Lnc，Miami，Fl，U.S.A)作图。

闪烁试验

如上所述，麻醉鼠并注射，将鼠置于伽马摄像机的标准介质解 析准直仪上进行注射动态试验。用伽马11系统(philips)的34keV 80％窗口的计算机语言状态的64×64像素矩阵收集图像。15分钟 内，每分钟1个图像观察动态顺序。15分钟后，在注射后的不同时 间收集静态图像。图像然后输后Hermes系统(Nuclear Diagnostics， Hagerstem，Sweden and London，U.K.)并画下感兴趣的区域(ROI： 6)。有时所画ROI的覆盖区域需超出肿瘤或肝脏，这依赖于扩散的 范围。

结果

根据免疫组织化学，人们发现HAR LEC的多克隆抗体能识别裸 鼠体内的人克隆癌细胞株CCL 218的肿瘤结构。染色主要集中在内 皮血管及肿瘤细胞，肿瘤的边缘的染色似乎加重(图1a)。预先免疫 抗体基本不染色(图1b)，这表明本系统内HAR LEC染色是特异的。

图1、a)用HA受体HARLEC的多克隆抗体对CCL 218肿瘤的

免疫组织化学染色，b)预先免疫抗体的对照组，详见材料及方

法。

当静注1251—T—HA示踪物时，放射性迅速由血液至肝脏，几分 钟后血液中几乎不存在放射性(图2)。

图2、鼠静注5μg125I—T—HA后，放射性从血液中消失，插图：

静注5μg125I—T—HA10分钟后，鼠的不同器官回收的放射性。

KC指Kupffer细胞，PC指实质细胞、LEC指肝内皮细胞。

肝脏的结合能力如此之强，以致于血液流经肝脏后示踪物所剩 无几，且到达其它组织的也只是很小的部分。因此，注射剂量要超 过肝脏的结合能力。剂量为1.5mg HA时，24小时后体循环中还有 其存在，在肿瘤部位的放射性蓄积量可通过闪烁图像观察到(图3)， 可以发现主要的放射区域在肝脏，但在背景的肿瘤上也观察到显著 的活性(图3a)，肿瘤区的活性比所预期的仅得自组织增加的体积要 大几倍，用铅板屏蔽肝脏所得的闪烁图像表明50％的最大值与肿瘤 体积相一致(图3b)。

图3，后腿接种人克隆癌细胞CCL 218三周后、及注射含

2.5MBq125I—T—HA的1.5mgHA24小时后，裸鼠的闪烁图像，

在3b中肝脏用铅板屏蔽，箭头指向肿瘤。

实验动物的免疫组织化学分析表明，透明质酸酶处理切片引起 HAR LEC免疫反应性特异性增加(图4a及b)而预先免疫反应不增 加(图4c及d)。受体染色很大程度与HA自身染色同时定位(图4e 及f)。HA染色在区域边缘及在血管内和周围最明显、但其它受体染 色结构对HA也为阳性。

图4、a)静注125I—T—HA后，用HA受体HARLEC的多克隆抗

体对CCL 218肿瘤进行免疫组织化学染色。

b)经透明质酸酶处理后如4a)进行免疫组织化学染色。

c)及d)如4a)及b)对预先免疫(对照)抗体染色。

e)及f)用生物素化HA结合蛋白如4a)—d)对同一肿瘤的HA

染色。

作为降低肝摄取及取得治疗效果的手段，给两只动物肿瘤内注 射单剂量的125I—T—HA，一只鼠用高特异活性(0.25MBq/μg)的标 记HA 3.4μg，结果其90％蓄留在肿瘤内，少量到达体循环并被肝脏 摄取(图5a)，注射15天后，肿瘤中放射性与肝脏中的比率比注射 后直接观察到的小(图5b)，动物的肿瘤在7天后从约2cm2消退到 1cm2。肿瘤逐渐缩小软化，直到14天时已触模不到，在第15天处死 动物进行的组织化学分析表明仍存在体积约0.5cm2的肿瘤，一只接 受仅0.025MBq的250μg HA肿瘤内用药的鼠无反应，且处死时肿瘤 约5cm2(鼠都是同时被处死)。

图5，在拍摄前1天(a)和15天(b)肿瘤内使用3.5μg125I— T—HA(0.75 MBq)的裸鼠的CCL 218派生瘤的闪烁图象。

讨论

不用透明质酸酶处理，肿瘤中HARLEC的免疫组织化学染色很 明显(图1)。这一事实说明某种程度上结合位点未被占领，这为摄 取循环中的HA提供了可能的机会。这与肝脏受体的结果一致。

实施例2

从血流中清除HA(透明质酸及其药物可接受的盐)的主要位点 在肝内皮细胞(LEC)通过受体介导的细胞摄粒作用。LEC上HA受 体(HAR)由HA表面亲合层析确定，125I标记鼠LEC并从鼠LEC细 胞膜中纯化至均一。此受体(命名为HARLEC)的平均分子量为90KD 左右，其范围在85至100KD，其pH值在6.7左右。可抑制HA与 LEC及LEC细胞膜结合的受体的单特异性多克隆抗体(命名为抗 HARLEC)生成。免疫印迹实验发现此抗体也可检查存在于肾、脾、 胸腺及淋巴结的85—90KD的蛋白质。同一组织，与肝脏一道，用抗 HARLEC染色阳性，免疫组织化学染色主要集中在血管区域如肝、脾 及淋巴结的窦状腺及小肠的毛细血管，但也存在于特异结构如胸腺 网状细胞中，角膜与HARLEC特点相同，可被HARLEC特异染色。染 色前HA处理角膜，会抑制CEC染色，而当用透明质酸酶处理后，染 色强度会恢复。

当鼠肝通过一系列亲合层析步骤时，HARLEC从中纯化。最后一 步，基本上所有HA结合至HA—Sepharose并用HA-低聚糖特异性 洗脱。反相层析分离纯HARLEC的胰蛋白酶消化片段得到几种多 肽。其中四种多肽的序列已确定，并发现与细胞内粘连分子-1(I- CAM—1)相同。ICAM—1为80至114KD，中心多肽55KD的糖基 化单链蛋白质。通常其表达为低水平，但已发现其存在于正常肝内 皮的窦状腺、淋巴结、脾的内皮及肾的毛细管，以及角膜内皮细胞， ICAM—1的免疫组织化学定位与已报道的对HARLEC染色的对应 性很好，此定位也与发现HA结合及摄取的组织对应。

HARLEC/ICAM—1表达于鼠肥大细胞瘤的肿瘤内皮中，并能与 静脉给药的标记HA结合(或能结合到)。已发现肿瘤组织的放射性 有明显增加(约比对照组增加5倍)。

免疫组织化学发现，HA也定位于对ICAM—1染色也阳性的区 域，即主要在血管，切片经透明质酸酶处理后，其ICAM—1免疫反 应性紧剧上升。

因此，这更表明HARLEC/ICAM—1是HA的受体，HA也定向 于裸鼠内人肿瘤，且此定向主要是通过与肿瘤内皮上HARLEC/ IACM—1结合完成。

材料及方法

多糖：用以标记、摄取并反复研究的HA提取自鸟的组织。由 Hyal Pharmaceutical Corporation(HPC)，Toronto，Canada供给，其平 均分子量约450,000道尔顿。

HA标记：用DL-酪氨酸(Sigma Chemical company St Louis，U. S.A.)和125I标记HA。

单克隆抗体：鼠ICAM—1单克隆抗体，克隆1A29，由M Miyasa- ka教授，Osaka University，Japan赠送。

内皮细胞培养：用胶原酶灌注鼠肝脏后，分离鼠LEC，并在无血 清的RPMI培养基中培养。

抗体抑制试验：100,000—200,000 LEC培养4—5小时后，与 0.5μg/ml125I—T—HA孵育。在竞争试验中，同时与未标记HA或抗 ICAM—1上清介质(1∶2稀释)一起孵育。因抗ICAM—1中含 115mg/ml HA，故对照组介质也含115ng/mlHA，并做为抗体上清中 HA抑制结合活性的对照。竞争剂在加入放射标记HA前加入。总孵 育时间35—40分钟。孵育完成后，移去介质，清洗细胞并按前面说 明(10)分析放射性。

免疫染色：所有染色皆按ABC—elite方法(VectastainElite ABC)，6μm冷冻切片备好后置于包被有明胶—kromalun的玻片上， 为除去对血清蛋白的非特异结合，用偶联有鼠白清蛋白(6mg蛋白/ ml凝胶)的Sepharose4B凝胶(Pharmacia LKB Technology， Uppsala)吸收HARLEC抗血清。

冷冻切片在冷甲醇中固定10分钟，干燥10分钟后用磷酸缓冲 生理盐水(PBS)清洗。用0.3％H2O2的甲醇液封闭内源过氧化酶。 为了封闭内源生物素及生物素结合活性，使用Vetor实验室的抗生 物素/生物素封闭试剂盒，然后切片在含4％羊血清的PBS(Vectastain Elite ABC)中孵育30分钟，HARLEC抗血清用含4％羊血清的PBS 1∶300稀释后，孵育1小时。在PBS中清洗后，切片与用PBS 1∶ 200稀释的第二HRP偶合的羊抗兔抗体(VectastainElite ABC)孵 育30分钟。

用得自软骨的生物素化透明质酸结合蛋白(b—HABP)对HA染 色，但不经CPC处理。切片经甲醇处理，内源生物素结合活性用抗 生物素/生物素封闭试剂盒(Vector实验室)阻断。

与第二抗体或b—HABP孵育后，切片清洗后与ABC—Elite复合 物(VectastainElite ABC)孵育。为改进着色情况，使用含3，3— 二氨基联苯胺或3-氨基-9-乙基咔唑的过氧化酶酶解物试剂盒 (Vector实验室)，切片与混合物孵育5—10分钟。清洗后，在Mayers 苏木紫复染色1.5分钟，玻片放置在Kaisers甘油—明胶中(Merck)。

切片的透明质酸酶处理：甲醇固定并用PBS清洗后，切片与5U/ ml的链霉菌属透明质酸酶(Aman6 Pharmaceutical Co.，Ltd Japan.)， 1.8μg/ml胃酶抑素(Sigma)、1.8mM EDTA(Merck)、1.8μg/ml大 豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma)、2.0mM碘乙酸(Sigma)、0.18mM— 氨基-n-己酸(Sigma)、及9.0mM苯甲酰胺(Sigma)在37℃孵育 2小时。然后常规染色。

体内摄取试验：重约200g的雌性裸(Rowette Nu/Nu)，在其后 腿皮下接种人细胞系CCL 218(American Tissue Type Colletion)约3 ×106个细胞(在μls—MEM培养基中(Gibco))，此时小鼠在乙醚麻 醉状态，接种时间在实验前14—30天。动物麻醉，并静注2mg125I— T—HYA(2—3×106cpm)。为降低特异活性并使HA的浓度较高，可 添加未标记HA的0.15M NaCl，10mM NaH2PO4(pH7.4)的溶液 0.05—1.0ml。

18—20小时后，处死动物，按前述方法(9)测定肿瘤和器官的 放射性。

结果：

为进一步确定HA与HARLEC/ICAM—1的结合，用分离的鼠 LEC，放射标记HA及具很好特异性的鼠ICAM—1的单克隆抗体 (lalenti A and Di Rosa M.；Hyaluronic acid modulates acute and chronic inflammation，Agents Actions 43：44—47)进行实验。在37℃研究 125I—T—HA与LEC的细胞缔合，证明其被抑制约60％(图6)，但发 现约20％的抑制是由于抗体组织培养基中HA的存在。这在含相同 量HA而无抗体的培养基对对照实验中可观察到这种抑制(图6)。

为了观察表达在鼠其它组织的内质细胞上的HARLEC/IACM— 1与LEC是否有相同的HA结合能力，对一只后腿接种人源克隆癌 细胞的鼠进行重复组织分布试验。发现正如预期的那样，在静注 125I—T—HA(2mg)18—20小时后，放射性绝大部分在肝脏，而在血 液中非常少(未标明)。肿瘤中放射性的恢复率比在对照的肌肉组织 (湿重调节)高三倍，且这种增高在统计学上有显著差异(p＝0.001， n＝3)(图7)。

当通过组织化学分析肿瘤组织时，发现肿瘤中HA主要分布在 肿瘤的基质和血管(图8a)，而ICAM—1也分布在同一区域，主要 在血管(图8b)。然而，透明质酸酶处理后，染色急剧增加(图 8C)。

讨论

鼠ICAM—1的单克隆抗体可抑制培养基中标记HA与鼠LEC 的细胞缔合(图6)，这一发现进一步证明ICAM—1是主要的HA的 细胞表面受体。抑制仅为50％，但这是因为37℃进行细胞缔合试验， 细胞内部不断出现未结合受体，导致抑制不完全，高分子量HA与 LEC上的受体亲合力很高，标记HA对未结合受体位点的结合竞争 力会很强，ICAM—1上其它HA结合位点存在的可能性，不受1A29 结合的影响，也应予以考虑。

本试验所使用的单克隆抗体，正如前所述，可引起白细胞对内 皮细胞粘连的抑制。正如抗体可引起HA结合LEC的抑制，HA在I- CAM—1上的结合位点靠近白细胞结合位点，故HA与内皮细胞的 结合导致白细胞对同一细胞粘连的抑制。系统内使用HA便对炎性 症状产生有益效果。这种效果与观察到的用ICAM—1抗体做系统处 理降低炎性反应相似。这已见于急性及慢性炎症的动物模型中。

肿瘤组织中静注放射标记HA摄取的增高(图7)，表明肿瘤中 存在HA的结合结构。用高特异性生物素化HA结合蛋白对HA染 色，表明HA位于血管内及周围区域(图8a)，正如所述，HARLEC/ ICAM—1染色在血管也有发现，但很弱(图8b)，对角膜EC使用HA 会降低CEC受体的免疫组织化学染色，这可被透明质酸酶处理恢 复。我们也对脉瘤切片作了同样的透明质酸酶处理。这种处理产生 的效果是HARLEC/ICAM—1的染色急剧增加(图8c)。这表明HA结 合HARLEC/1CMA—1导致特异性抗体结合的抑制。

静注HA通过ICAM—1绝大部分结合到内皮细胞上。这表明 HA可做为细胞毒药物的载体用以治疗表达有此类HA受体的肿瘤。

附图说明

图6，37℃培养基中125I—T—HA与LEC的细胞缔合的抑制，结

果为平均值±SD，n＝3(对照培养基)及n＝6(1A29培

养基)，详见材料和方法部分。

图7，静注2mg125I—T—HA 18—20小时后，肿瘤组织及对照肌

肉组织内放射活性的恢复。结果为平均值±SD，n＝3，详

见材料和方法部分。

图8，静注2mg125I—T—HA 18—20小时后，肿瘤组织的冷冻切

片对HA及HARLEC/ICAM—1染色，详见材料及方法部

分。

a)HA染色

b)HARLEC/ICAM—1染色

c)透明质酸酶处理后，HARLEC/ICAM—1染色。

在不背离本发明范围的前提下，本发明的实施例可作很多改变。 因此声明在此，所使用的所材料只是对本发明的说明，而不能视为 对本发明的限制。