一种重组腺病毒及其在心肌缺血治疗中的应用
专利汇可以提供一种重组腺病毒及其在心肌缺血治疗中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且携带 肝细胞 生长因子基因的重组腺病毒用于心肌缺血的 基因 治疗 ，心脏 局部用药 不产生全身性的影响，这样可以减小肝细胞生长因子的 副作用 。，下面是一种重组腺病毒及其在心肌缺血治疗中的应用专利的具体信息内容。
一种重组腺病毒及其在心肌缺血治疗中的应用
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒及其在心肌缺血治疗中的应用。
缺血性心脏病是流行性广且危害严重的心脏病，在西方国家它是成年人死亡的首位病因。我国相对而言，目前尚属冠心病低发病国家，然而严重的是患病率逐年上升。从流行病学的研究来看，冠心病的主要危险因子如高血压、高血脂、糖尿病等患病率都在上升，吸烟率居高不下，预计未来十年中冠心病的患病率仍会呈上升趋势。虽然冠心病诊断手段的进步已能对患病冠状动脉的病变部位，管腔狭窄程度作出准确的判断，对管壁病变的程度也有所了解；并且各种有效的治疗手段也产生了，如抗凝治疗、溶栓治疗、经皮下腔内冠状动脉成型术和冠状动脉搭桥术等。但是对一部分弥散性心肌缺血和手术后再狭窄的病人来说，就不再宜于进行手术治疗了；并且突然地供血能引起再灌注损伤。所以基因治疗为我们提供了一种新的思路，虽然还处于试验阶段，但已经发展了多种载体和应用几种促血管生成因子。肝细胞生长因子(HGF)具有促进血管生成和抑制血管内皮细胞凋亡的作用。近几年来应用促血管生成的生长因子治疗缺血性疾病在动物模型和临床实验方面，国内外都开展了不少工作。但应用腺病毒载体介导肝细胞生长因子对心肌缺血的基因治疗还未见报道。
本发明的目的在于提供一种用于心肌缺血基因治疗的重组腺病毒。该重组腺病毒携带人肝细胞生长因子基因，具有促进血管生成的作用。
本发明的具体实施方案如下：1.将人肝细胞生长因子基因插入到腺病毒载体上，获得重组腺病毒。2.证明重组腺病毒可以有效地转染心肌细胞。3.证明重组腺病毒介导的人肝细胞生长因子基因可以在心肌细胞中表达，并且是有活性的。4.证明人肝细胞生长因子能促进血管生成，即可实现心肌缺血的基因治疗。结合附图进一步说明本发明：图1 携带人肝细胞生长因子基因的穿梭质粒pXCJL1-CMV/HGF/P的构建示意图。1.polyA；2.人肝细胞生长因子基因(hHGF)基因；3.CMV启动子图2为携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒Ad-HGF的结构示意图。1 代表腺病毒基因组2 代表人肝细胞生长因子基因，此基因具有促进血管生成的作用，即可实现心肌缺血的基因治疗。图3.通过Ad-GPF(携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒)对乳大鼠原代心肌细胞的转染测定腺病毒载体对心肌细胞的转染率。图4.当MOI＝50pfu/cell时，Ad-GFP对乳大鼠原代心肌细胞的转染情况。
1.光镜下的心肌细胞；2.同一视野荧光下的观察结果图5.转染Ad-HGF的乳大鼠心肌细胞培养上清对内皮细胞系ECV304生长的促进作用。图6.大鼠心肌注射109pfu Ad-GFP后三天，GFP在心肌中的表达情况。
1.光镜下看到的心脏冰冻切片；2.同一视野荧光下的观察结果图7.ELISA方法测定不同时间各组大鼠血清中的HGF水平。图8.大鼠心肌注射109pfu Ad-HGF 14天时，缺血区血管的生成情况。
1.对照组(Ad-GFP)；2.实验组(Ad-HGF)图9.大鼠心室注射109pfu Ad-HGF 14天时，缺血区血管的生成情况。
1.对照组(Ad-GFP)；2.实验组(Ad-HGF)图10.新西兰大白兔心肌缺血模型的实验结果携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(Ad-GFP)由美国百特医疗用品公司基因治疗部(Gene Therapy Unit，Baxter Healthcare Company，USA)惠赠，293细胞系购自ATCC。2.病毒扩增与纯化将293细胞接种于150mm平皿中，待细胞生长至90％汇合状态时，加入病毒，感染强度(multiplicity of infection，MOI)约为10个空白形成单位(plaque forming unit，pfu)/细胞，36-48h后，细胞出现完全CPE时，收集细胞，冻存于-80℃，待累计到50-60个平皿时，统一纯化病毒。
将出现CPE的293细胞于-80℃和37℃水浴间反复冻融三次，2500rpm离心10min以除去细胞碎片；配制1.5g/ml CsCl溶液(取30g CsCl，加PBS至终体积42.5ml)、1.35g/ml CsCl溶液(取15ml 1.5g/ml的CsCl液，加PBS至终体积21ml)和1.25g/ml CsCl溶液(取11ml 1.5g/ml的CsCl液，加PBS至终体积20ml)；制备CsCl密度梯度：依次将0.5ml 1.5g/ml CsCl溶液、2.5ml 1.35g/ml CsCl溶液和2.5ml 1.25g/ml CsCl溶液加入12ml超速离心管中；将冻融后的待纯化病毒液加于各管的CsCl梯度液之上；150,000g，10℃离心1h，于1.35g/ml CsCl溶液和1.25g/ml CsCl溶液之间出现白色雾状病毒带；收集病毒带，并与1.35g/ml CsCl溶液混和；150,000g，10℃离心18h，进一步纯化病毒；吸出病毒带，以1-2倍体积的Hanks液稀释病毒，以Hanks液为透析液于4℃透析病毒，每2h更换一次透析液，共换液5次；取出纯化的病毒液，加无菌甘油至终浓度为10％，分装，-80℃冻存。3.腺病毒载体对乳大鼠原代心肌细胞的转染率把原代培养的心肌细胞消化后，制成细胞悬液，均匀接种到96孔培养板中，每孔加200μl，培养24小时等细胞贴壁之后，换一次培养液，把未贴壁的死细胞除去，继续培养至80-90％汇合，消化3个孔的细胞进行计数，以确定转染的MOI值。
转染之前把培养液吸出，用DMEM洗一遍，加入不同MOI的Ad-GFP(用DMEM稀释)，MOI分别为10，20，50，100pfu/细胞，以DMEM为对照。1-2小时后吸出病毒液，每孔加200μl培养液，此后每12小时在荧光显微镜下观察一次GFP的表达情况，感染48小时后计数GFP表达阳性的细胞数，同时计数该视野内的全部细胞数，并计算转染率：结果如图3和图4所示。4.转染Ad-HGF的原代心肌细胞上清对内皮细胞系ECV304生长的促进作用ELISA方法检测到HGF在原代心肌细胞中有表达，用MTT方法进一步证明其是有活性的。
用0.125％的胰酶和0.2％的EDTA溶液消化ECV304细胞，计数，接种96孔培养板，100μl/孔，3000个细胞；再加入转染Ad-HGF后的心肌细胞的培养上清，100μl/孔，以转染Ad-GFP的心肌细胞上清作为对照；培养72小时后加入5mg/ml的噻唑兰20μl，再培养4小时，弃上清，加入150μlDMSO，在振荡器上混匀，以570nm波长检测。结果如图5所示。5.大鼠心肌缺血模型的建立Wistar大鼠，雄性，体重350-400g，用1％戊巴比妥钠溶液麻醉(30mg/kg)；剪去左侧胸部的毛，用碘伏消毒，再以75％酒精脱碘；沿肋骨走向在左侧第四肋间切开皮肤，钝性分离胸大肌，先接上呼吸机，再剪开胸膜，垫高大鼠背部，以手挤压其腹部暴露心脏；结扎冠状动脉前降支。结扎之后分五组进行实验，后四组每只大鼠注射重组腺病毒1×109pfu(plaque forming unit)：(1)空白对照组，(2)心肌内注射Ad-GFP组，(3)心肌内注射Ad-HGF组，(4)心室内注射Ad-GFP组，(5)心室内注射Ad-HGF组。进行心室注射时要阻断主动脉40秒，以增加转染的机会。6.大鼠体内Ad-GFP的表达时间及分布分别在结扎后第3天、7天、14天、21天和30天各杀一组大鼠，取心、肝、肺、脾、肾、脑和睾丸及眼球，做冰冻切片观察GFP的表达情况；由腹主动脉取血检测血清中HGF的水平。结果显示：GFP只在心脏中表达和分布，其它器官内无GFP的表达和分布。第3天是GFP表达高峰，第7天开始减弱，第14天消失。并且心肌内注射比心室内注射观察到的荧光强。心肌内注射第3天的结果如图6所示。7.大鼠体内Ad-HGF的表达水平及分布分别在结扎后第3天、7天、14天、21天和30天各杀一组大鼠，由腹主动脉取血检测血清中HGF水平。没有发现实验组和对照组血清中HGF水平的差异，说明局部应用重组腺病毒不会造成全身性的影响。检测结果如图8所示。8.大鼠心肌缺血的治疗效果分别在结扎后第3天、7天、14天、21天和30天各杀一组大鼠，取心脏，用4％甲醛溶液固定制作石蜡切片，进行HE(苏木素-伊红)染色，观察血管的分布密度。第3天时，实验组与对照组无差异；第7天时实验组缺血区开始有小血管生成；14天是差异已经很明显；21天时，实验组缺血区明显减小。并且心肌内注射和心室内注射，效果基本一致。血管分布情况如图8和图9所示。9.新西兰大白兔心肌缺血模型的建立用2％的戊巴比妥钠溶液，经耳缘静脉麻醉(30mg/kg)后，剪去左侧胸部的毛，用碘伏消毒，再以75％酒精脱碘，纵行开胸，打开心包，结扎冠状动脉左旋支；同时进行心电图观察，发现T波上升，表明发生了心肌缺血。对照组在心肌注射Ad-GFP，实验组心肌注射Ad-HGF，然后分层关胸，肌肉注射青霉素以预防感染。10.兔心肌缺血的治疗效果30天后取兔心脏，均匀切成0.5cm厚的薄片，用含1％TTC和4％ Monatral Blue的PBS溶液在37℃染色20分钟，然后用4％甲醛溶液固定，缺血区不着色，非缺血区染为砖红色。结果如图10所示。
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