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一种微 生物来源的生物 农药的制备方法

阅读：284发布：2023-02-14

专利汇可以提供一种微生物来源的生物农药的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于医药技术领域，涉及一种微生物来源的生物农药的制备方法，其通过一株筛选到的真菌，该真菌为燕麦镰孢菌Fusariumaverenaceum(CordaexFr.)Sacc：保藏日期：2010年5月11号；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCCNo.3823。利用本发明所涉及的种子培养基、发酵培养基和本发明所使用的工艺流程生产微生物农药，制备的农药具有广谱的预防与治疗农作物病害的作用，对番茄晚疫病、辣椒晚疫病、甘蓝枯萎病有特效。产品质量稳定、高效、无毒、对人体安全，无污染，保护生态环境，能取代化学农药用于农业生产，适应“绿色农业”的发展要求。，下面是一种微生物来源的生物农药的制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种生物来源的微生物农药的制备方法，包括原始菌种的活化、摇瓶种子培养、罐上种子培养、发酵培养、终止发酵、离心、浓缩、添加辅料、可湿性粉剂制备，其特征在于，所使用的原始菌种CGMCC No.3823.的GB-2-8为Fusarium averenaceum(CordaexFr.) Sacc（燕麦镰孢菌），属半知茵亚门（Deuteromycotina）、丝孢纲（Hyphomycetes）、瘤座孢目（Tuberculariales）、瘤座孢科（Tuberculariaceae）、镰孢菌属真菌，菌丝为洋红色，无厚垣孢子，分生孢子只有大孢子，镰刀状，无色，3-4隔，大小为30～54×3～5um，所述的农药用于防治番茄晚疫病、辣椒晚疫病、甘蓝枯萎病、番茄早疫病、甘蓝核盘病、番茄叶霉病、小麦白粉病、茄子黄萎病、黄瓜枯萎病、甜菜立枯病、大豆根腐病、大豆灰斑病、果树腐烂病、果树白粉病、棉花立枯病、棉花枯萎病、玉米小斑病、玉米大斑病。
2.根据权利要求1所述的一种生物来源的微生物农药的制备方法，其特征在于，所述的种子培养和发酵培养的培养基，其单位容积所含有的各种原料干物质重量如下：
种子培养基：葡萄糖 15-30g/L，花生饼粉 1-5g/L， NH4Cl 1-5g/L，KH2PO4 1-5g/L， MgSO4.7H2O 1-5g/L ， CH3COONa 1-5g/L，CaCO3 1-5g/L，常水配制；
发酵培养基：葡萄糖 5-20g/L，花生饼粉 5-20g/L，黄豆饼粉 5-20g/L，玉米淀粉
20-40g/L，鱼粉 2-10g/L， KH2PO4 1-5g/L，MgSO4.7H2O 1-5g/L ， NH4NO3 1-5g/L ，CH3COONa 1-5g/L，常水配制。
3.根据权利要求1或2 所述的一种生物来源的微生物农药的制备方法，其特征在于，罐上种子培养生产工艺为：灭菌前培养基pH=6.0-6.5，通风量为1：0.8-1.2，操作罐压力为
2
0.5公斤/厘米，搅拌转数150-200rpm, 温度为25-28℃，培养时间为20-26小时。
4.根据权利要求1或2 所述的一种生物来源的微生物农药的制备方法，其特征在于，发酵培养生产工艺为：灭菌前培养基pH=6.8-7.2，接种后通风量为1：1.0-1.5，操作罐压力
2
为0.5公斤/厘米，搅拌转数180-220rpm, 温度为25-28℃，培养时间为110-130小时。
5.根据权利要求1所述的一种生物来源的微生物农药的制备方法，其特征在于，离心获得的发酵上清液，经过浓缩、添加辅料、喷雾干燥即得微生物农药原药，所述的辅料为防腐剂、乳化剂及紫外保护剂。
6.根据权利要求5所述的一种生物来源的微生物农药的制备方法，其特征在于，所得微生物农药原药经325目超微气流粉碎，并加入同样细度的农药助剂，制得微生物农药GB-2-8可湿性粉剂。
7.根据权利要求6所述的一种生物来源的微生物农药的制备方法，其特征在于，所用农药助剂包括崩解剂、粘结剂、润湿剂、分散剂、填充剂，所述的崩解剂为微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠中的一种或两种；粘结剂为工业淀粉，羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，润湿剂为月桂醇基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠或十二烷基硫酸钠，分散剂为木质素磺酸钠、羟基萘甲醛聚合物、二丁基萘磺酸钠中的一种或两种，填充剂为乳糖、硫酸钙、蔗糖、滑石粉或轻质碳酸钙。
8.根据权利要求1所述的一种生物来源的微生物农药的制备方法，其特征在于，先斜面培养真菌CGMCC No.3823，再经过对该菌株进行种子培养和发酵阶段的培养，获得发酵代谢产物，以及对发酵液的浓缩处理，和可湿性粉剂的制备。
9.根据权利要求1所述的一种生物来源的微生物农药的制备方法，其特征在于：所制备的生物农药具有如下特点：
形状：固体粉末；
溶解性：溶于水，微溶于乙醇、甲醇、氯仿等有机溶剂；
温度的影响：取样品，溶解于水中，100℃作用30分钟，杀菌活性消失；60℃作用30分钟，杀菌活性降低20%；样品溶液在室温下放置3天、7天、15天、30天其杀菌效果与未经放置的样品比较，变化不显著；
抗紫外线能力：样品于阳光下照射3天、7天、15天，30天其杀菌效果与未经紫外照射的样品比较，变化不显著；
酸碱度影响：样品溶液在pH=5.5-8范围内稳定，杀菌效果无显著变化；
使用方法：微生物农药GB-2-8可湿性粉剂可直接投入盛水的喷雾器中对水喷雾使用。

说明书全文

一种微 生物来源的生物 农药的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物农药领域，涉及一种微生物来源的生物农药的制备方法，具体涉及一种微生物农药的菌种筛选、菌液及其制剂的制备方法。

背景技术

[0002] 农作物病虫害是造成农作物减产的主要原因之一，病虫害严重的可导致大幅度减产，甚至颗粒无收。据联合国粮农组织调查，全世界每年被病虫害夺去的谷物收成为20％～40％，由此造成的经济损失达1200亿美元。因此农药在农业生产过程中具有重要地位。当前国内外农药年生产200多万吨，化学农药占绝对主导地位，但是化学农药造成环境污染、生态失衡、致畸、致癌、中毒身亡等恶果越来越突出。因此早在1992年召开的“世界环境与发展大会”明确指出，“要在全球范围内控制化学农药的销售和使用，生物农药的用量应达
60％以上”。

[0003] 目前西方许多国家已逐渐减少化学农药的使用，而改用生物防治和生物农药来取代化学农药。生物农药的最大优点就是对人畜安全，无毒害，无残留，不污染环境，只杀病虫害，不易产生抗性，是发展绿色农业的唯一选择。随着我国经济实力的增长和人民健康意识和环保意识的加强，公众对绿色食品的要求也与日俱增。同时，我国加入世界贸易组织之后，在国际农产品和食品贸易中，将面对苛刻的农药残留标准，这些都在呼唤无公害生物农药。

[0004] 当前，国际上生物农药占全部农药的市场份额仅2.5％左右，其中仅Bt 杀虫剂就占了90％。在我国，Bt杀虫剂只占市场的2％，棉铃虫病毒杀虫剂占0.2％，农用抗生素占9％。根据国内外专家较为一致的看法，今后10年内，生物农药将取代20％以上的化学农药。因此，生物农药发展潜力是巨大的。

发明内容

[0005] 本发明提供一种微生物农药的生产方法。

[0006] 本发明生产所用菌种GB-2-8是从自然界中分离出来的2200个菌种中筛选出来的Fusarium averenaceum(CordaexFr.)Sacc(燕麦镰孢菌)。该菌株已经于2010年5月11号送交位于北京中关村的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.3823。该菌在PDA培养基上呈现砖红色菌丝，无厚垣孢子，分生孢子只有大孢子，镰刀状，无色，3～4隔，大小为30～54*3～5um。经过考察培养特征、菌丝形态学、以及从遗传学角度考察其ITS序列，确定该菌株为Fusarium averenaceum(CordaexFr.)Sacc(燕麦镰孢菌)，属半知茵亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycetes)、瘤座孢目(Tuberculariales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)、镰孢菌属真菌。

[0007] 本发明提供一种微生物农药的生产方法，包括原始菌种的活化、摇瓶种子培养、罐上种子培养、发酵培养、终止发酵、离心、浓缩、添加辅料、可湿性粉剂制备。其生产工艺是：

[0008] 脱脂牛奶冻干管菌种→斜面活化→摇瓶种子培养→种子罐培养→发酵罐发酵→离心获得上清液→添加适量的防腐剂、乳化剂及紫外保护剂→喷雾干燥→加入各种助剂→过325目筛→袋混→检测→包装

[0009] 所述的种子培养和发酵培养的培养基，其单位容积所含有的各种原料干物质重量如下：

[0010] 种子培养基：葡萄糖15-30g/L，花生饼粉1-5g/L，NH4Cl 1-5g/L，KH2PO4[0011] 1-5g/L，MgSO4.7H2O 1-5g/L，CH3COONa 1-5g/L，CaCO3[0012] 1-5g/L，常水配制；

[0013] 发酵培养基：葡萄糖5-20g/L，花生饼粉5-20g/L，黄豆饼粉5-20g/L，玉[0014] 米淀粉20-40g/L，鱼粉2-10g/L，KH2PO41-5g/L，

[0015] MgSO4.7H2O 1-5g/L，NH4NO31-5g/L，CH3COONa

[0016] 1-5g/L，常水配制。

[0017] 本发明所述的脱脂牛奶冻干管菌种，是指生产菌种的一种保存方式。它是在培养好的斜面试管中加入所需要比例的无菌脱脂牛奶溶液，使用接菌环轻轻刮下菌丝体并尽量打散，使之均匀分散成悬浮液。用无菌长滴管将悬浮液分装入无菌洁净安瓿管底部(0.9毫升/每支)。然后将分装好的安瓿管在-25至-40℃之间的干冰酒精中预冻1小时之后，将安瓿管放入真空器中，开动真空泵进行干燥，最后封管。

[0018] 本发明所述的菌种斜面活化是指打开保存的冻干管，挑取菌种后均匀涂布在斜面培养基上，于28℃培养7天。

[0019] 本发明所述的摇瓶种子培养是指采用菌株生长所需要的碳源、氮源、无机盐等，经过灭菌后，挖取适量斜面菌丝体，转移到种子摇瓶中，种子摇瓶中在自动旋转摇瓶机上震荡培养，获得摇瓶种子。

[0020] 本发明所述的种子罐培养是指采用菌株生长所需要的碳源、氮源、无机盐、消泡剂等，经过灭菌后，按照一定的接种量比例(8-16％)，加入摇瓶种子，继续搅拌培养一段时间，获得种子罐种子。

[0021] 罐上种子培养生产工艺为：灭菌前培养基pH＝6.0-6.5，通风量为1∶0.8-1.2，2
操作罐压力为0.5公斤/厘米，搅拌转数150-200rpm，温度为25-28℃，培养时间为20-26小时。

[0022] 本发明所述的发酵罐培养是指采用菌株生长所需要的碳源、氮源、无机盐、消泡剂等，经过灭菌后，按照一定的接种量比例(10-15％)，加入发酵罐种子，继续搅拌培养一段时间，获得发酵代谢产物。

[0023] 发酵培养生产工艺为：灭菌前培养基pH＝6.8-7.2，接种后通风量为2
1∶1.0-1.5，操作罐压力为0.5公斤/厘米，搅拌转数180-220rpm，温度为25-28℃，培养时间为110-130小时。

[0024] 本发明所述的培养过程中使用的消泡剂是指有机硅、聚醚、豆油或者它们的混合物。

[0025] 本发明所述的发酵液的浓缩方法是指在室温、常压下，使用转速为4000rpm的离心机分离发酵液，收集上清液，应用真空泵进行抽滤，在40-50℃进行水分的蒸发和浓缩。

[0026] 离心获得的发酵上清液，经过浓缩、添加辅料、喷雾干燥即得微生物农药原药。

[0027] 本发明所述的添加适量的防腐剂、乳化剂及紫外保护剂是指常使用于农药中的各种制剂辅料，包括硅酸土、粘土、防腐剂和助剂。

[0028] 所得微生物农药原药经325目超微气流粉碎，并加入同样细度的农药助剂，制得微生物农药GB-2-8可湿性粉剂。

[0029] 所用农药助剂包括崩解剂、粘结剂、润湿剂、分散剂、填充剂，所述的崩解剂为微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠中的一种或两种；粘结剂为工业淀粉，羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，润湿剂为月桂醇基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠或十二烷基硫酸钠，分散剂为木质素磺酸钠、羟基萘甲醛聚合物、二丁基萘磺酸钠中的一种或两种，填充剂为乳糖、硫酸钙、蔗糖、滑石粉或轻质碳酸钙。

[0030] 本发明所制备的农药具有如下理化性质：

[0031] A、形状：固体粉末

[0032] B、溶解性：溶于水，微溶于乙醇、甲醇、氯仿等有机溶剂

[0033] C、温度的影响：取样品，溶解于水中，100℃作用30分钟，杀菌活性消失；60℃作用30分钟，杀菌活性降低20％；样品溶液在室温下放置3天、7天、15天、30天其杀菌效果与未经放置的样品比较，变化不显著。

[0034] D、抗紫外线能力：样品于阳光下照射3天、7天、15天，30天其杀菌效果与未经紫外照射的样品比较，变化不显著。

[0035] 酸碱度影响：样品溶液在pH＝5.5-8范围内稳定，杀菌效果无显著变化。

[0036] E、使用方法：微生物农药GB-2-8可湿性粉剂可直接投入盛水的喷雾器中对水喷雾使用。

[0037] 本发明的特点

[0038] 1、广谱与特效

[0039] 通过近几年室内秧苗和田间试验表明，本发明提供的生物农药对多种农作物的多种真菌病害有显著的预防与治疗效果，如蔬菜立枯病、水稻立枯病、纹枯病、番茄早疫病、晚疫病、灰霉病、叶霉病、小麦白粉病、花卉白粉病、韭菜白粉病、茄子黄萎病、黄瓜枯萎病、西瓜蔓葛病、甜菜立枯病、大豆根腐病、灰斑病、烟草星病、黑霉病、黑茎病、果树腐烂病、白粉病、棉花立枯病、枯萎、黄蔫病等，防效在70％以上，见表1-表4。尤其对番茄晚疫病、辣椒晚疫病、甘蓝枯萎病具有特效，防效达90％以上。

[0040] 2、无毒无害，使用安全

[0041] 小鼠致死试验结果表明，本发明提供的生物制剂系微生物的发酵代谢产物，对农作物真菌病害有较强的抑制作用，但是对人、畜、农作物无毒害，在使用过程中，毋须防毒措施，使用方便、安全。

[0042] 3、无毒物残留

[0043] 使用化学农药，有毒害的物质通过表层渗透进入细胞内部，因此不能透过表面冲洗而除去，直接危害人类的身体健康。另外，在水质、土壤、空气中，尤其是土壤中，有大量有毒物质积累，不能分解，可存留很长时间，造成长期的环境污染。而本发明所提供的产品，无毒无害无残留，不存在毒素积累的问题，有利于生态保护，可用于“绿色作物”的生产。

[0044] 4、生产成本低

[0045] 原料成本低，生产工艺先进，适于大规模工业化生产，而且生产设备可与其他微生物产品通用。

[0046] 5、无污染

[0047] 本产品的生产过程中没有有害物质的排放，对周围环境无污染、无公害、符合环保要求。

[0048] 生物材料保藏说明

[0049] 燕麦镰孢菌Fusarium averenaceum(CordaexFr.)Sacc：保藏日期：2010年5月11号；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.3823。附图说明：

[0050] 附图1为本发明的生产工艺图

具体实施方式

[0051] 实施例1：本发明微生物农药的生产工艺

[0052] 一、培养基

[0053] 1、斜面培养基：

[0054] 葡萄糖10g/L，马铃薯(去皮)200g/L，琼脂15g/L，用蒸馏水配置，pH7.2-7.4，121℃ 30min。

[0055] 马铃薯浸汁的制备：取200g去皮马铃薯，切成小块，置于1000ml水中煮一个小时后过滤，用冷开水将滤液补足1000ml。

[0056] 2、摇瓶种子培养基

[0057] 葡萄糖 20g/L，花生饼粉 3.0g/L，NH4Cl 3.0g/L，

[0058] KH2PO4 3.0g/L，MgSO47H2O 3.0g/L，CaCO3 4.0g/L，

[0059] NaAC·3H2O 1.0g/L，常水配置。

[0060] 灭菌前PH 6.0，121℃ 30min。

[0061] 3、种子罐培养基

[0062] 葡萄糖 20g/L，花生饼粉 3.0g/L，NH4Cl 3.0g/L，

[0063] KH2PO4 3.0g/L，MgSO47H2O 3.0g/L，CaCO3 4.0g/L，

[0064] NaAC·3H2O 1.0g/L，常水配置。灭菌前PH 6.0。

[0065] 4、发酵罐培养基

[0066] 葡萄糖 10g/L，花生饼粉 10g/L，黄豆饼粉 10g/L，

[0067] 玉米淀粉 30g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O

[0068] 3.0g/L，NH4NO3 1.0g/L，NaAC·3H2O 1.0g/L，

[0069] 常水配置。灭菌前PH 7.0。

[0070] 以上组成中花生饼粉、黄豆饼粉、玉米淀粉要求新鲜不发霉且过120目筛。

[0071] 二、发酵生产

[0072] 1、菌种的斜面活化：打开菌种脱脂牛奶冻干管，挑取少量粉末均匀涂布在上述灭过菌的斜面上，在28℃温度下培养5-7天，待菌苔生长到砖红色、致密、丰满、无杂菌，冰箱4℃保存。

[0073] 2、摇瓶种子培养：将活化好的斜面菌种挖块1*1cm2接种到每个种子培养瓶中，培养基装量为分装40ml/250ml三角瓶，在28℃温度下恒温震荡培养，200rpm，22-26小时，镜检菌丝生长舒展、染色深、无杂菌即可。

[0074] 3、种子罐培养：种子罐培养基配方如上，灭菌后，将培养好的摇瓶种子，按照10％2
的接种量，接种到1吨发酵罐中，通风量为1∶0.8-1.2，操作罐压力为0.5公斤/厘米，搅拌转数150-200rpm，温度为25-28℃，培养时间为20-26小时。镜检菌丝生长舒展且无杂菌即可转入发酵罐。

[0075] 4、发酵罐培养：发酵罐培养基配方如上，灭菌后，将培养好的种子，按照10％的接种量，接种到10吨发酵罐中，接种后通风量为1∶1.0-1.5，操作罐压力为0.5公斤/厘米2
，搅拌转数180-220rpm，温度为25-28℃，培养时间为110-130小时。

[0076] 5、终止发酵后，将发酵液在室温下，常压下，使用转速为4000rpm离心分离发酵液，收集上清液，弃掉菌体，应用真空泵进行抽滤，在40-50℃进行水分的蒸发和浓缩至原发酵液体积的10％。

[0077] 6、在浓缩液中添加适量的防腐剂、乳化剂及紫外保护剂，包括硅酸土、粘土、防腐剂和助剂等，喷雾干燥即得到产品。

[0078] 三、制剂

[0079] 将所得微生物农药原药经325目超微气流粉碎，并加入同样细度的农药助剂，袋混，制得微生物农药GB-2-8可湿性粉剂。

[0080] 实施例2本发明产品(发酵液)的最低抑菌浓度的考察

[0081] 本发明产品在PDA培养基上，使用管碟法对很多农业上的致病真菌作抑菌试验，结果表明抑菌效果显著，见表1。故本发明产品具有良好的广谱杀菌效果。

[0082] 表1本发明产品的抗菌谱

[0083]病原菌最低抑菌浓度(PPM)
番茄晚疫病 20
辣椒晚疫病 20
甘蓝枯萎病 20
番茄早疫病 50
甘蓝核盘病 50
番茄叶霉病 50
小麦白粉病 50
茄子黄萎病 50
黄瓜枯萎病 50
甜菜立枯病 50
大豆根腐病 50
大豆灰斑病 50
果树腐烂病 50
果树白粉病 50
棉花立枯病 50
棉花枯萎病 50
玉米小斑病 50
玉米大斑病 50

[0084] 实施例3本发明产品与化学农药防治效果的考察

[0085] 本发明产品与化学农药治疗白粉病、番茄晚疫病、辣椒晚疫病、甘蓝枯萎病、玉米小斑病、玉米大斑病的效果比较

[0086] 表2本发明产品与化学农药治疗效果比较

[0087]

[0088] 实施例4小鼠致死实验

[0089] 以昆明种小鼠为试验动物，观察一次灌胃或腹腔注射给予不同剂量的本发明产品，小鼠所产生的毒性反应和死亡情况。结果显示，灌胃给予本发明产品的LD50为＞10g/kg；腹腔注射本发明产品的LD50为5493.7mg/kg，95％可信限为5135.0～5877.5mg/kg。

[0090] 一、试验动物

[0091] 本实验所用动物为40-50天龄昆明种小白鼠，动物合格证号：辽实合字033，体重18-22g，雌雄兼用。试验前受试动物在饲养观察室内观察三天，删除不合格动物，饲养观察室温度20±2℃，相对湿度30-70％。食饵为动物料块，饮自来水。

[0092] 二、受试药物

[0093] 本发明可湿性粉剂产品，用前以生理盐水配制成所需浓度的溶液。本发明可湿性粉剂产品于生理盐水中呈淡黄色混悬溶液。

[0094] 三、试验方法及观察项目

[0095] 取200只小鼠，按性别、体重分10个层次后，每层动物再随机抽样分到各组去，共10组，每组20只，雌雄各半。采用灌胃(ig)或腹腔注射(ip)两种途径给药，每种给药途径各设5个剂量组。ig(剂距1∶0.8)剂量分别为12000mg/kg、9600mg/kg、7680mg/kg、
6144mg/kg、4915.2mg/kg；ip(剂距1∶0.8)剂量分别为8500mg/kg、6800mg/kg、5400mg/kg、4352mg/kg、3482mg/kg。每种动物给药容量(容积/体重)ig 或ip分别为0.4ml/kg和0.4ml/kg。动物禁食12小时后，于上午8时各组动物分别按所设剂量ig或ip一次性给药，然后连续观察7天，记录小鼠毒性反应及死亡数，死亡小鼠立即进行尸检，存活动物七天后再处死进行尸检。用Bliss法计算小鼠的半数致死量。

[0096] 四、试验结果

[0097] 灌胃给药各剂量组小鼠喂养7天均无死亡。结果显示(见表3)，灌胃给本发明产品的LD50为＞10g/kg。腹腔注射高剂量组给药后在2小时动物开始有死亡，死亡高峰时间均在2～5小时内，死亡时间均在10小时内。小鼠中毒体征为活动减少和死亡。10小时后动物均恢复正常，被毛光泽、肤色正常，口、鼻、眼未见有分泌物，粪便无异常变化。结果显示(见表4)，腹腔注射本发明产品的LD50为5493.7mg/kg，95％可信限为5135.5～5877.5mg/k。

[0098] 动物尸检动物心、肝、肺、脾、肾、胃等脏器未见出血、渗出、充血、坏死等变化。

[0099] 五、结论

[0100] 灌胃给本发明产品粉剂的LD50为10g/kg；腹腔注射本发明产品粉剂的LD50为5493.7mg/kg，95％可信限为5135.0～5877.5mg/kg。

[0101] 表3.灌胃本发明产品可湿性粉剂的剂量、反应数值表

[0102]

[0103] 表4.腹腔本发明产品可湿性粉剂剂量、反应数值表

[0104]

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