AAGIGILTV肽衍生自由大多数黑色素瘤新鲜样品和约60％黑色素瘤细胞系 以及正常黑色素细胞所表达的Melan-A(Mart-1)蛋白(Coulie等，(1994)J.Exp. Med.180：(1)1-4和Kawakami等，(1994)PNAS USA 91：3515)。这些癌性细胞 的I类HLA分子呈递含有AAGIGILTV(SEQ ID NO：43)(Melan-A27-35)的来自该 蛋白的肽。AAGIGILTV-HLA-A*0201复合物看来是黑色素瘤特异性T细胞的 免疫显性靶标(Kawakami等，(1994)PNAS USA 91：3515)和(Rivoltini等，(1995) J.Immunol 154：2257)。因此，例如为向癌细胞递送细胞毒性或免疫刺激性药物， 该肽-HLA复合物提供了TCR所能靶向的一种癌症标记。然而，对于该目的， 如果与对肽-HLA复合物具有特异的天然TCR相比，该TCR对该复合物具有更 高亲和力和/或更慢的解离速率则更理想。
发明简述
本发明首次利用了与AAGIGILTV-HLA-A*0201复合物相互作用具有小于或 等于3μM的高亲和力(KD)和/或对该复合物的解离速率(koff)为1×10-3S-1或更慢 的TCR。这种TCR可单用或与治疗性药物联用来靶向呈递该复合物的癌细胞。
发明详述
本发明提供具有结合AAGIGILTV-HLA-A*0201特性并含有至少一个TCRα 链可变区和/或至少一个TCRβ链可变区的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述 TCR对所述AAGIGILTV-HLA-A*0201复合物的KD小于或等于3μM和/或对 AAGIGILTV-HLA-A*0201复合物的解离速率(off-rate)(koff)为1×10-3 S-1或更 慢。
在本发明的另一实施方式中，所述TCR对AAGIGILTV-HLA-A*0201复合 物的KD小于或等于1μM。
可通过任何已知的方法测定KD。优选方法是实施例4的表面等离振子共 振(Biacore)方法。
为了比较，通过实施例4的Biacore方法测定天然MEL TCR(TCRα链见SEQ ID NO：9和TCRβ链见SEQ ID NO：10)的二硫键连接的可溶性变体与 AAGIGILTV-HLA-A*0201复合物相互作用的KD约为4μM。
AAGIGILTV-HLA-A*0201复合物的特异性天然MEL TCR具有以下Vα链 和Vβ链基因应用(gene usage)(使用T cell receptor Factsbook(《T细胞受体手 册》)，(2001)LeFranc和LeFranc，Academic Press，ISBN 0-12-441352-8中的 术语，参见下文)：
α链-TRAV 12-2
β链：-TRBV 30。
天然MEL TCR可用作模板在其中引入各种突变从而使得本发明TCR和 AAGIGILTV-HLA-A*0201复合物之间相互作用的亲和力高和/或解离速率慢。因 此，与天然MEL TCR α链可变区(见附图1a和SEQ ID No：1)和/或β链可变区(见 附图1b和SEQ ID NO：2)相比，本发明包括的TCR在其至少一个互补决定区(CDR) 和/或可变区框架区中发生突变。还考虑了本发明TCR可变区中的其它超变区，例 如超变4(HV4)区，可发生突变从而能产生高亲和力的突变体。
天然TCR以异二聚体αβ或γδ形式存在。然而，由一条TCR α链或TCR β链 构成的重组TCR已显示能与肽MHC分子结合。
在一个实施方案中，本发明TCR同时包含α链可变区和TCR β链可变区。
本领域技术人员明显可知TCR α链序列和/或TCR β链序列中的突变可以是一 个或多个取代、缺失或插入。可用任何合适的方法来产生这些突变，包括但不限于： 基于聚合酶链式反应(PCR)、基于限制性内切酶克隆或不依赖于连接反应的克隆 (LIC)方法。这些方法详述于许多标准的分子生物学教材中。关于聚合酶链式反应 (PCR)诱变和基于限制性内切酶克隆的其它细节可见(Sambrook和Russell，(2001)， Molecular Cloning-A Laboratory Manual(《分子克隆-实验室手册》)，(第三版)， CSHL Press)。LIC方法的其它信息可见(Rashtchian，(1995)，Curr Opin Biotechnol， 6(1)：30-6)。噬菌体展示为产生TCR变体文库提供了一种手段。(Li等，(2005) Nature Biotech 23(3)：349-354)和WO 2004/04404详述了适于噬菌体展示和随 后的TCR变体文库筛选的方法，所述各TCR变体均含有非天然链间二硫键。
应注意含有与天然MEL TCR相似的Vα和Vβ基因应用和因此相同的氨基酸 序列的任何αβTCR可用作方便的模板TCR。然后可能将产生本发明突变的高 亲和力TCR所需的改变引入编码模板αβ TCR的一个或两个可变区的DNA中。 本领域技术人员显然知道可通过许多方法，例如定点诱变，来引入所需的突变。
除非有相反陈述，本文的TCR氨基酸序列一般含有N-末端甲硫氨酸(Met或 M)残基。本领域技术人员可知该残基可在重组蛋白的产生过程中除去。本领域技 术人员也显然知道，可将其C-末端和/或N-末端的序列截短1、2、3、4、5或更多 个残基，而基本上不影响该TCR的pMHC结合性能，本发明包括所有这些变化细 微的变体。
本文所用的术语“可变区”应理解为包括某给定TCR中不包含在由TCRα链 的TRAC基因或TCR β链的TRBC1或TRBC2基因所编码的恒定区内的所有氨基 酸。(T cell receptor Factsbook(《T细胞受体手册》)，(2001)，LeFranc和LeFranc， 科学出版社，ISBN 0-12-441352-8)。
本文所用的术语“可变域”应理解为包括某给定TCR中由TCRα链的TRAC 基因或TCRβ链的TRBV基因所编码的所有氨基酸。(T cell receptor Factsbook(《T 细胞受体手册》)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科学出版社，ISBN 0-12-441352-8)。
本发明的实施方式包括含有对应于以下的一个或多个α链可变区氨基酸发生 突变的突变TCR：28D、29R、30G、31S、49M、51I、53S、54N、72Y、94V、 95A、96G、97K、98S和99T，例如对应于以下的突变：
28D→F，28D→Y，28D→S，28D→N，
29R→Q，29R→L，29R→I，29R→F，
30G→H，
31S→A，
49M→I，
51I→T，
53S→R，
54N→E，
72Y→H，
94V→D，94V→P，94V→S，94V→L，94V→N，95A→G，
95A→S，95A→E，
96G→N，96G→P，96G→V，96G→M，96G→L，96G→R，
97K→R，97K→Y，97K→V，97K→L，97K→H，97K→G，97K→I，97K→P，
98S→L，98S→M，98S→R，
99T→L或99T→R
以上采用的编号与图1a和SEQ ID No：1所示相同。
本发明实施方式包括含有对应于以下的一个或多个TCR β链可变区氨基酸发 生突变的突变TCR：45L、51S、52V、53G、54I、76I、100G、101T、102G、 103E、104L和105F，所采用的编号如SEQ ID NO：2所示，例如对应于以下的 突变：
45L→P，
51S→Y，51S→F，51S→W，
52V→G，
53G→P，
54I→F，54→Y，
76I→V，
100G→N，
101T→M，101T→L，101T→V，
102G→S，102G→N，102G→T，
103E→G，
104L→W，
105F→S，105F→A，105F→Q，105F→D或105F→E
以上采用的编号与图1b和SEQ ID No：2所示相同。
本发明的其它优选实施方式是含有图6(SEQ ID No：11-24)或图20(SEQ ID NO：47-53)所示突变的α链可变区氨基酸序列的TCR。这种TCR的表型沉默 (phenotypically silent)变体也构成本发明一部分。
本发明的其它优选实施方式是含有图21(SEQ ID No：54-67)所示突变的β 链可变区氨基酸序列之一的TCR。这种TCR的表型沉默变体也构成本发明一 部分。
天然TCR以异二聚体αβ或γδ形式存在。然而，由αα或ββ同质二聚体构成 的重组TCR已显示能与肽MHC分子结合。因此，本发明的一个实施方式是TCRαα 或TCRββ同质二聚体。
本发明的其它优选实施方式是含有下列α链可变区氨基酸序列和β链可变 区氨基酸序列组合的TCR，这种TCR的表型沉默变体也构成本发明一部分：
α链可变区序列，     SEQ ID NO： β链可变区序列，     SEQ ID NO：     11     2     12     2     13     2     14     2     15     2     16     2     17     2     18     2     19     2     20     2     21     2     22     2     23     2     24     2     47     2     48     2     49     2     50     2     51     2     52     2     53     2     11     54     11     55     11     56     11     57     11     58     11     59
    11     60     11     61     11     62     11     63     11     64     11     65     11     66     11     67
优选实施方式提供含有以下部分的本发明TCR：
SEQ ID NO：11所示的α链可变区和SEQ ID NO：2所示的β链可变区。
SEQ ID NO：47所示的α链可变区和SEQ ID NO：2所示的β链可变区。
SEQ ID NO：48所示的α链可变区和SEQ ID NO：2所示的β链可变区。
SEQ ID NO：53所示的α链可变区和SEQ ID NO：2所示的β链可变区。
SEQ ID NO：11所示的α链可变区和SEQ ID NO：54所示的β链可变区。
SEQ ID NO：11所示的α链可变区和SEQ ID NO：55所示的β链可变区。
SEQ ID NO：11所示的α链可变区和SEQ ID NO：56所示的β链可变区。
SEQ ID NO：11所示的α链可变区和SEQ ID NO：57所示的β链可变区。
SEQ ID NO：11所示的α链可变区和SEQ ID NO：58所示的β链可变区。
SEQ ID NO：11所示的α链可变区和SEQ ID NO：62所示的β链可变区。
SEQ ID NO：11所示的α链可变区和SEQ ID NO：65所示的β链可变区。
SEQ ID NO：11所示的α链可变区和SEQ ID NO：66所示的β链可变区。
或以上任一TCR的表型沉默变体。
在另一优选实施方式中，含有以上详述的可变区组合的本发明TCR还含 有图7a所示α链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO：25)和图7b和7c所示β链氨 基酸恒定区序列之一(SEQ ID NO：26和27)或其表型沉默变体。
本文所用的术语“表型沉默变体”应理解为指对所述AAGIGILTV-HLA -A*0201复合物的KD小于或等于3μM的那些TCR。例如，与以上详述的那些 TCR相比，本领域技术人员已知可能产生在其恒定和/或可变区中掺入了微小变 化但不改变与AAGIGILTV-HLA-A*0201复合物相互作用的亲和力和/或解离速 率的TCR。本发明范围包括这类变化细微的变体。其中含有一个或多个保守取代 的那些TCR也构成本发明一部分。
就广义而言，本发明TCR可以采取如WO 04/033685和WO 03/020763所 述的单链TCR(scTCR)或二聚体TCR(dTCR)形式。
合适的scTCR形式包括：由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成的第一 区段，由对应于TCRβ链可变区序列并与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的氨基 酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成的第二区段，和连接该第一区段C末端 与该第二区段N末端的接头序列。
或者，所述第一区段可由对应于TCRβ链可变区的氨基酸序列构成；所述第 二区段可由对应于TCRα链可变区序列并与对应于TCRα链恒定区胞外序列的氨 基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成。
以上scTCR在第一和第二链之间还可含有二硫键，所述二硫键在天然αβT细 胞受体中没有等价键，其中该接头序列的长度和该二硫键的位置应使第一和第二区 段的可变区序列的相互取向基本上如天然αβT细胞受体中的那样。
更具体地说，第一区段可由对应于TCRα链可变区序列并与对应于TCRα链 恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成，第二区段可由 对应于TCRβ链可变区序列并与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的氨基酸序列的 N末端相融合的氨基酸序列构成，和在第一和第二链之间可以存在天然αβT细胞 受体中没有等价键的二硫键。
在以上scTCR形式中，接头序列可连接第一区段C末端和第二区段N末端， 其可如式-PGGG-(SGGGG)n-P-所示，其中n是5或6，P是脯氨酸，G是甘氨酸， S是丝氨酸。
-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P(SEQ ID NO：41) -PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P(SEQ ID NO：42)
本发明TCR的合适dTCR形式含有：第一多肽，其中对应于TCRα链可变区 序列的序列与对应于TCRα链恒定区胞外序列的序列的N末端相融合；和第二多 肽，其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的 序列的N末端相融合；该第一和第二多肽通过在天然αβT细胞受体中没有等价键 的二硫键相连。
所述第一多肽可含有与对应于TCRα链恒定区胞外序列的序列的N末端相融 合的TCRα链可变区序列，而第二多肽中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对 应于TCRβ链恒定区胞外序列的序列的N末端相融合，该第一和第二多肽通过取 代TRAC*01外显子1的Thr 48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser 57 的半胱氨酸残基之间的二硫键或其非人等价键相连。(“TRAC”等在本文根据T cell receptor Factsbook(《T细胞受体手册》)，(2001)，LeFranc和LeFranc，Academic Press，ISBN 0-12-441352-8命名)。
本发明TCR的dTCR或scTCR形式可具有对应于人αβTCR胞外恒定和可变 区序列的氨基酸序列，和在天然TCR中没有等价键的二硫键可连接所述恒定区序 列的氨基酸残基。与在天然TCR中其β碳原子距离小于0.6nm的氨基酸残基相对 应的半胱氨酸残基之间存在二硫键，例如在取代TRAC*01外显子1的Thr 48和取 代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser 57的半胱氨酸残基或其非人等价物之 间。就TCRα链而言，可引入半胱氨酸形成二硫键的其它位点是TRAC*01外显子 1中的以下残基，就TCRβ链而言，是TRBC1*01或TRBC2*01外显子1中的以 下残基：
TCRα链 TCR β链 天然β碳距离(nm)     Thr 45     Tyr 10     Thr 45     Ser 15     Ser 77     Ser 17     Asp 59     Glu 15     0.533     0.359     0.560     0.59
本发明的具体实施方式提供的本发明TCR是dTCR，其含有
第一多肽，其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区 胞外序列的序列的N末端相融合；和
第二多肽，其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区 胞外序列的序列的N末端相融合；
该第一和第二多肽通过取代TRAC*01外显子1的Thr 48和取代TRBC1*01 或TRBC2*01外显子1的Ser 57的半胱氨酸残基之间的二硫键或其非人等价键相 连，所述二硫键在天然αβT细胞受体中没有等价键。
除了以上提及的非天然二硫键外，本发明TCR的dTCR或scTCR形式可在对 应于天然TCR中通过二硫键连接的那些残基的残基之间含有二硫键。
本发明TCR的dTCR或scTCR形式优选不含有对应于天然TCR的跨膜或细 胞质序列的序列。
目前本发明优选实施方式提供包含以下部分的可溶性TCR：
SEQ ID NO：29所示α链氨基酸序列和SEQ ID NO：10所示β链氨基酸序 列；
SEQ ID NO：68所示α链氨基酸序列和SEQ ID NO：10所示β链氨基酸序 列；
SEQ ID NO：69所示α链氨基酸序列和SEQ ID NO：10所示β链氨基酸序 列；
SEQ ID NO：70所示α链氨基酸序列和SEQ ID NO：10所示β链氨基酸序 列；
SEQ ID NO：29所示α链氨基酸序列和SEQ ID NO：71所示β链氨基酸序 列；
SEQ ID NO：29所示α链氨基酸序列和SEQ ID NO：72所示β链氨基酸序 列；
SEQ ID NO：29所示α链氨基酸序列和SEQ ID NO：73所示β链氨基酸序 列；
SEQ ID NO：29所示α链氨基酸序列和SEQ ID NO：74所示β链氨基酸序 列；
SEQ ID NO：29所示α链氨基酸序列和SEQ ID NO：75所示β链氨基酸序 列；
SEQ ID NO：29所示α链氨基酸序列和SEQ ID NO：76所示β链氨基酸序 列；
SEQ ID NO：29所示α链氨基酸序列和SEQ ID NO：77所示β链氨基酸序 列；
SEQ ID NO：29所示α链氨基酸序列和SEQ ID NO：78所示β链氨基酸序 列。
还提供了编码本发明TCR的一种或多种核酸。所述一种或多种核酸可以经改 造而以适合于在原核或真核宿主细胞中表达的形式提供。合适的宿主细胞包括但不 限于：细菌、酵母菌、哺乳动物或昆虫细胞。例如，宿主细胞可以是人T细胞或 人造血干细胞。
使这种经改造的一种或多种核酸发生突变，从而反映了引入其中的宿主细胞 的密码子偏爱。引入的突变是不影响所编码的一种或多种多肽的氨基酸序列的沉默 突变。GeneArt(Regensburg，德国)提供合适的核酸优化服务(GeneOptimizerTM)。 GeneArt拥有的WO 2004/059556进一步提供了该优化方法的细节。
目前优选的本发明其它实施方式提供了由SEQ ID No：33、35或37(分别是 图12a、13a或14a)所示全长TCRα链DNA序列之一和SEQ ID No：39(图15a 所示)所示全长TCRβ链DNA序列构成的核酸。与上述核酸互补的核酸或相应的 RNA序列也构成本发明一部分。此外，本领域技术人员明显知道编码本发明TCR 的所述一种或多种核酸也可含有非编码(内含子)序列。
SEQ ID No：31、33、35、37和39所示的全长野生型和高亲和力MEL TCR 链DNA序列分别编码SEQ ID No：32、34、36、38和40所示的氨基酸序列。(分 别是图11b、12b、13b、14b和15b)。
SEQ ID No：33、35和37所示的氨基酸序列分别包含SEQ ID No：11、15 和23所示的高亲和力MEL TCRα链可变区。
本领域技术人员明显知道这种全长TCR链DNA序列编码以下序列：
前导序列和胞外、跨膜和胞质TCR序列。
本文提供的全长DNA序列还包含限制性内切酶识别序列以促进连接入所选 择的载体中。
PEG化的TCR单体
在一具体实施方式中，本发明TCR与至少一条聚亚烷基二醇链结合。本领域 技术人员已知有许多方法可产生这种结合。在一优选实施方式中，一条或多条所述 聚亚烷基二醇链与TCR共价相连。在另一实施方式中，本发明该方面的聚乙二醇 链含有至少两个聚乙烯重复单位。
多价TCR复合物
本发明一方面提供含有至少两个本发明TCR的多价TCR复合物。在该方面 的一个实施方式中，至少两个TCR分子经接头部分相连形成多价复合物。这些复 合物优选为水溶性的，所以应照此选择接头部分。此外，接头部分优选能与TCR 分子上确定的位置相连，从而尽可能降低所形成复合物的结构多样性。该方面的一 个实施方式所提供的本发明TCR复合物中聚合物链或肽接头序列延伸于各TCR中 不位于该TCR可变区序列中的氨基酸残基之间。
由于本发明复合物可用作药物，接头部分的选择应考虑它们的药学适用性， 例如它们的免疫原性。
本领域已知能满足以上所需标准的接头部分的例子，例如连接抗体片段的技 术。
两类接头优选用于产生本发明的多价TCR分子。其中的TCR通过聚亚烷基 二醇链相连的本发明TCR复合物提供了该方面的一个实施方式。
第一类是亲水性聚合物，例如聚亚烷基二醇。此类中最常用的基于聚乙二醇 或PEG，其结构如下式所示。
HOCH2CH2O(CH2CH2O)n-CH2CH2OH
其中n大于2。然而，其它聚合物可以是基于其它合适的、任选取代的聚亚烷 基二醇，包括聚丙二醇，和乙二醇与丙二醇的共聚物。
这种聚合物可用于处理或偶联治疗剂，特别是多肽或蛋白质治疗剂来有益地 改变该治疗剂的PK分布，例如降低肾廓清率、延长血浆半衰期、降低免疫原性和 改善溶解性。据信，一个或多个PEG分子围绕治疗剂形成的“外壳”能在立体上 阻碍此治疗剂与免疫系统反应并降低蛋白水解降解，从而改善PEG-治疗剂偶联物 的PK分布。(Casey等，(2000)，Tumor Targetting，4 235-244)。所用亲水性聚合物 的大小可根据TCR复合物预定的治疗应用来具体选择。因此，例如当要该产品离 开循环(系统)渗入组织时，如用于治疗肿瘤时，宜使用5 KDa级的低分子量聚合物。 已有许多综述文章和书籍详细描述了PEG和类似分子在药物制剂中的应用。例如， 参见Harris，(1992)，Polyethylene Glycol Chemistry-Biotechnical and Biomedical Applications(《聚乙二醇化学-生物技术和生物医药应用》)，Plenum，纽约，纽约 州或Harris和Zalipsky，(1997)，Chemistry and Biological Applications of Polythylene Glycol ACS Books(《聚乙二醇化学和生物学应用ACS手册》)，华盛顿，哥伦比亚 特区。
所用的聚合物可具有线形或分支构型。可通过加入分支部分，包括甘油和甘 油寡聚物、季戊四醇、山梨醇和赖氨酸来诱生分支PEG分子或其衍生物。
该聚合物一般在其结构中，例如在其一端或两端，和/或骨架的支链处具有化 学反应活性基团，从而使该聚合物能与TCR中的靶位点相连。如下所示，所述一 个或多个化学反应活性基团可与亲水性聚合物直接相连，或者在亲水性聚合物和反 应活性化学(基团)之间可以具有间隔基团/部分：
反应活性化学(基团)-亲水性聚合物-反应活性化学(基团)
反应活性化学(基团)-间隔物-亲水性聚合物-间隔物-反应活性化学(基团)
用于形成以上概述类型的构建物的间隔物可以是无反应活性、化学稳定的、 链状的任何有机部分。这种间隔物包括但不限于以下基团：
-(CH2)n-，其中n＝2到5
-(CH2)3NHCO(CH2)2
其中二价亚烷基间隔基团位于聚亚烷基二醇链和其与该复合物的TCR连接点 之间的本发明TCR复合物是该方面的另一种实施方式。
其中聚亚烷基二醇链含有至少两个聚乙二醇重复单位的本发明TCR复合物是 该方面的另一实施方式。
本发明可用的直接或经间隔物与反应活性化学(基团)相连的亲水性聚合物有 许多商业供应商。这些供应商包括Nektar Therapeutics(加利福尼亚州，美国)、NOF Corporation(日本)、Sunbio(韩国)和Enzon Pharmaceuticals(新泽西州，美国)。
本发明所用直接或经间隔物与反应活性化学(基团)相连的可市售购得的亲水 性聚合物包括但不限于以下聚合物：
    PEG接头描述     PEG来源     目录号 TCR单体连接 5K线形(马来酰亚胺) Nektar  2D2MOHO1 20K线形(马来酰亚胺) Nektar  2D2MOPO1 20K线形(马来酰亚胺) NOF Corporation  SUNBRIGHT  ME-200MA 20K支链(马来酰亚胺) NOF Corporation  SUNBRIGHT  GL2-200MA 30K线形(马来酰亚胺) NOF Corporation  SUNBRIGHT  ME-300MA 40K支链PEG(马来酰亚胺) Nektar  2D3XOTO1 5K-NP线形(用于Lys连接) NOF Corporation  SUNBRIGHT  MENP-50H 10K-NP线形(用于Lys连接) NOF Corporation  SUNBRIGHT  MENP-10T 20K-NP线形(用于Lys连接) NOF Corporation  SUNBRIGHT  MENP-20T TCR二聚体接头
 3.4K线形(马来酰亚胺) Nektar  2D2DOFO2  5K分叉的(马来酰亚胺) Nektar  2D2DOHOF  10K线形(用正吡啶基ds-接头  取代马来酰亚胺) Sunbio  20K分叉的(马来酰亚胺) Nektar  2D2DOPOF  20K线形(马来酰亚胺) NOF Corporation  40K分叉的(马来酰亚胺) Nektar  2D3XOTOF  高级TCR多聚体  15K，3臂，Mal3(用于三聚体) Nektar  OJOONO3  20K，4臂，Mal4(用于四聚体) Nektar  OJOOPO4  40K，8臂，Mal8(用于八聚体) Nektar  OJOOTO8
可利用各种偶联化学(基团)将聚合物分子偶联于蛋白质和肽疗剂。选择最合适 的偶联化学(基团)在很大程度上取决于所需的偶联部位。例如，以下偶联化学(基团) 已用于连接PEG分子(来源：Nektar分子工程目录2003(Nektar Molecular Engineering Catalogue 2003))的一个或多个末端：
N-马来酰亚胺
乙烯基砜
苯并三唑碳酸酯
琥珀酰亚胺丙酸酯(Succinimidyl proprionate)
琥珀酰亚胺丁酸酯(Succinimidyl butanoate)
硫代酯
乙醛
丙烯酸酯
生物素
伯胺
如上所述，非PEG基聚合物也可为本发明TCR的多聚化提供合适接头。例如， 可用含有通过脂族链相连的马来酰亚胺末端的部分，例如BMH和BMOE(Pierce， 产品号22330和22323)。
肽接头是另一类TCR接头。这些接头由氨基酸链组成，其作用是在要连接的 TCR分子上产生简单的接头或多聚化结构域。已采用生物素/链霉亲和素系统来产 生体外结合研究用的TCR四聚体(参见WO/99/60119)。然而，链霉亲和素是微生 物来源的多肽，因此用于治疗剂中并不理想。
其中的TCR通过源自人多聚化结构域的肽接头连接的本发明TCR复合物提 供了该方面的另一种实施方式。
有许多含多聚化结构域的人蛋白质可用于产生多价TCR复合物。例如，p53 的四聚化结构域已用于产生scFv抗体片段的四聚体，与单体scFV片段相比，该四 聚体显示血清存留期增加和解离速率明显降低。(Willuda等，(2001)J.Biol.Chem. 276(17)14385-14392)。血红蛋白的四聚化结构域也可能用于该类应用。
含有至少两个TCR的本发明多价TCR复合物提供了该方面的最后一个实施 方式，其中至少一个所述TCR与治疗剂结合。
一方面，本发明TCR(或其多价复合物)可选地或者额外地可在其α或β链的 C-末端或N-末端包含反应活性半胱氨酸。
诊断和治疗应用
一方面，本发明TCR可以与治疗剂或可检测部分结合。例如，所述治疗剂或 可检测部分可与TCR共价相连。
在本发明的一个实施方式中，所述治疗剂或可检测部分与一条或两条TCR链 的C-末端共价相连。
一方面，可用可检测部分，例如适用于诊断目的的标记物，来标记本发明TCR 的scTCR或一条或两条dTCR链。这种标记的TCR可用于检测 AAGIGILTV-HLA-A*0201复合物的方法中，该方法包括使TCR配体与该TCR 配体的特异性TCR(或多聚高亲合力TCR复合物)接触；和检测与该TCR配体的结 合情况。在例如利用生物素化的异二聚体形成的四聚体TCR复合物中，可利用荧 光链霉亲和素提供可检测标记。这种荧光标记的TCR四聚体适用于FACS分析， 例如检测携带这些高亲和力TCR的特异性AAGIGILTV-HLA-A*0201复合物的抗 原呈递细胞。
可检测本发明可溶性TCR的另一种方法是利用TCR特异性抗体，特别是单 克隆抗体。有许多可市售购得的抗-TCR抗体，例如αF1和βF1可分别识别α和β链 的恒定区。
在另一方面，本发明TCR(或其多价复合物)可选或者额外地可与治疗剂结合 (例如，共价或其它方式相连)，所述治疗剂可以是，例如用于杀伤细胞的毒性部分， 或免疫效应分子，如白介素或细胞因子。与非多聚野生型或本发明的T细胞受体 异二聚体相比，本发明多价TCR复合物对TCR配体的结合能力提高。因此，本发 明多价TCR复合物特别可用于在体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，也 可用作中间体来产生具有这种用途的其它多价TCR复合物。因此，这些TCR或多 价TCR复合物可以体内应用的药学上可接受的制剂提供。
本发明也提供将治疗剂递送至靶细胞的方法，该方法包括在允许潜在的靶细 胞与本发明TCR或多价TCR复合物结合的条件下使二者接触，所述TCR或多价 TCR复合物对AAGIGILTV-HLA-A*0201复合物具有特异性并结合有治疗剂。
具体地说，本发明的可溶性TCR或多价TCR复合物可用于将治疗剂递送至 呈递特定抗原的细胞部位。这可用于许多情况，特别是对付肿瘤。递送的治疗剂应 可在局部施加其作用而不只对与其结合的细胞起作用。因此，一种具体方案设想可 将抗肿瘤分子与肿瘤抗原特异性的本发明TCR或多价TCR复合物相连。
为此应用，可利用许多治疗剂，例如放射性化合物，酶(例如，穿孔素)或化疗 剂(例如，顺铂)。为保证只在所需部位发挥毒性作用，可将毒素包裹在与链霉亲和 素相连的脂质体内从而缓慢释放该化合物。这防止了毒素在体内转运期间的破坏作 用并且保证了TCR与相关的抗原呈递细胞结合后毒素具有最大作用。
其它合适的治疗剂包括：
·小分子细胞毒性药物，即分子量小于700道尔顿，能杀伤哺乳动物细胞的化 合物。这种化合物也可包含具有细胞毒性作用的毒性金属。此外，应该理解这些小 分子细胞毒性药物也包括药物前体，即能在生理条件下分解或转变从而释放细胞毒 性药物的化合物。这种药物的例子包括顺铂、美登素衍生物、拉奇霉素 (rachelmycin)、刺孢霉素、多西他赛、鬼臼亚乙苷、吉西他滨、异环磷酰胺、依利 替康、苯丙氨酸氮芥、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠II(sorfimer sodium photofrin II)、 替莫唑胺、托泊替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreate glucuronate)、奥利斯他汀 E(auristatin E)、长春新碱和阿霉素；
·肽类细胞毒素，即能杀伤哺乳动物细胞的蛋白质或其片段。包括但不限于： 蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；
·放射性核素，即一些元素的不稳定同位素，其衰减时发射一种或多种α或β 粒子，或γ射线。包括但不限于：碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、 锕225和砹213；也可利用螯合剂来促进这些放射性核素与高亲和力TCR或其多 聚体结合；
·药物前体，包括但不限于：抗体定向的酶药物前体；
·免疫刺激剂，即能激活免疫应答的部分。包括但不限于：细胞因子，例如 IL-2和IFN；超抗原及其突变体；pHLA复合物和趋化因子，例如IL-8、血小板因 子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段；补体激活剂；异种蛋白结构域； 同种蛋白结构域；病毒/细菌蛋白结构域；病毒/细菌肽和抗T细胞决定簇抗体例 如，抗-CD3或抗-CD28)。
功能性抗体片段和变体
适用于本文所述组合物和方法的抗体片段和变体/类似物包括但不限于以下。
抗体片段
本领域技术人员已知可能产生基本上保留了亲代抗体相同结合特性的某给定 抗体的片段。下文提供了这种片段的细节：
微型抗体(minibody)——这些构建物由具有截短的Fc部分的抗体组成。同样， 它们保留了其所衍生自抗体的完整结合结构域。
Fab片段——这些(构建物)包含与免疫球蛋白重链的一部分共价相连的一条免 疫球蛋白轻链。因此，Fab片段包含一个抗原结合位点。Fab片段定义为可用木瓜 蛋白酶处理IgG而释放的那部分。这种片段一般可用重组DNA技术生产。(Reeves 等，(2000)，Lecture Notes on Immunology(《免疫学讲稿》)，(第四版)，Blackwell Science 出版)。
F(ab’)2片段——这些(构建物)同时包含一种抗体的抗原结合位点和绞链区。 F(ab’)2片段定义为可用胃蛋白酶处理IgG而释放的部分。这种片段一般可用重组 DNA技术生产。(Reeves等，(2000)，Lecture Notes on Immunology(《免疫学讲稿》)， (第四版)，Blackwell Science出版)。
Fv片段——这些(构建物)包含与免疫球蛋白轻(链)可变区共价相连的免疫球 蛋白重(链)可变区。已作出了许多Fv设计。这些(构建物)包括通过引入二硫键来增 强两结构域之间缔合的dsFv。或者，可利用肽接头将两个结构域结合到一起成为 一条多肽来形成scFv。还产生了含有免疫球蛋白重链或轻链的可变区，与相应的 免疫球蛋白重链或轻链的可变或恒定区相结合的Fv构建物。Fv也可多聚化形成双 抗体或三抗体(Maynard等，(2000)，Annu Rev Biomed Eng，2 339-376)。
NanobodiesTM——由Ablynx(比利时)投入市场的这些构建物包含衍生自骆驼 科(camelid)(例如，骆驼或美洲驼)抗体的一个合成的免疫球蛋白重(链)可变区。
结构域抗体——由Domantis(比利时)投入市场的这些构建物包含亲和力成熟 的一个免疫球蛋白重(链)可变区或免疫球蛋白轻(链)可变区。
抗体变体和类似物
本发明抗体的明确功能特性是它们能特异性结合靶配体。本领域技术人员已 知可能将这种结合特性工程改造加入到许多其它蛋白质中。适用于本发明组合物和 方法的抗体变体和类似物的例子包括但不限于以下。
基于蛋白质支架的结合多肽——该结合构建物家族包括含天然结合环的蛋白 质的突变类似物。例子包括由Affibody(瑞典)投入市场的Affibodies，其是基于衍 生自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A的—个IgG结合结构域的三螺 旋基序。另一例子是由EvoGenix(澳大利亚)投入市场的Evibodies，其是基于 CTLA-4胞外结构域，在该结构域中移植了类似于抗体结合环的结构域。最后一个 例子是由Regeneron Pharmaceuticals(美国)投入市场的Cytokine Traps，其将细胞因 子受体结构域移植入抗体支架中。(Nygren等，(2000)Current Opinion in Structural biology，7 463-469)是利用支架来工程改造蛋白质中新结合位点的综述。该综述提 及以下蛋白质作为支架来源：CP1锌指(结构)、淀粉酶抑制肽(Tendamistat)、Z结 构域(蛋白A类似物)、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1和细胞色素b562。其它蛋白质 支架研究报道采用纤连蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)和锚蛋白重复(单位)。
本领域技术人员已知可以产生能与某给定蛋白配体不同部分结合的抗体或其 片段，变体或类似物。例如，可产生针对形成该复合物的任一多肽链(即，γ、δ、ε、 ζ和ηCD3链)的抗-CD3抗体。能与εCD3链结合的抗体是本发明组合物和方法所 用的优选抗-CD3抗体。
本发明的可溶性TCR或多价TCR复合物可与能将药物前体转化为药物的酶 相连。这可使药物前体只在所需部位转变为药物(即，通过sTCR靶向)。
预计本文披露的高亲和力AAGIGILTV(SEQ ID NO：43)-HLA-A*0201特异 性TCR可用于癌症的诊断和治疗方法。
对于癌症治疗，将毒素或免疫刺激剂定位在肿瘤或转移(性肿瘤)附近可提高其 效力。对于疫苗递送，将疫苗抗原定位在抗原呈递细胞附近可提高该抗原的效力。 该方法也可应用于成像目的。
一个实施方式提供了呈递本发明TCR的分离的细胞。例如，所述细胞可以是 人T细胞或人造血干细胞。本发明的其它实施方式提供了含有以下组分的药物组 合物：
本发明的TCR或多价TCR复合物(任选与治疗剂结合)，或多个呈递至少一种 本发明TCR的细胞，或编码本发明TCR的一种或多种核酸，及药学上可接受的载 体。
本发明也提供一种癌症治疗方法，包括给予患这种癌症的对象有效量的本发 明TCR或多价TCR复合物(任选与治疗剂结合)，或能呈递至少一种本发明TCR的 多个细胞，或编码本发明TCR的一种或多种核酸。在一相关实施方式中，本发明 提供本发明的TCR或多价TCR复合物(任选与治疗剂结合)，或能呈递至少一种本 发明ICR的多个细胞，或编码本发明TCR的一种或多种核酸在制备治疗癌症的组 合物中的应用。
本领域技术人员明显知道适合用包含本发明TCR的组合物治疗的癌症是 Melan-A+癌症。
本发明的治疗性或成像TCR一般可作为通常含有药学上可接受的载体的无菌 药物组合物的一部分提供。该药物组合物可采用任何合适的形式(取决于给予患者 的所需方法)。该药物组合物可以单位剂型提供，一般装在密封容器中或作为试剂 盒的一部分提供。这种试剂盒通常(虽然不是必须)装有使用说明书。其可装有多个 所述单位剂型。
该药物组合物适于用任何合适的途径给药，例如胃肠外、透皮或通过吸入给 药，优选经胃肠外途径(包括皮下、肌肉内或最优选静脉内给药)。可用药学领域中 已知的任何方法制备该组合物，例如在无菌条件下混合活性成分与一种或多种载体 或赋形剂。
本发明物质的剂量可根据待治疗的疾病或病症、待治疗个体的年龄和情况等 而在较大范围内变动，医师可最终确定所用的合适剂量。
其它方面
本发明的scTCR或dTCR(优选由对应于人序列的恒定区或可变区序列构 成)可以是基本纯形式、或作为纯化或分离的制品提供。例如，可以基本上不含 其它蛋白质的形式提供。
本发明也提供鉴定具有结合AAGIGILTV-HLA-A*0201特性的高亲合力 TCR的方法，其特征在于，该TCR(i)含有至少一个TCRα链可变区和/或至少 一个TCRβ链可变区和(ii)对所述AAGIGILTV-HLA-A*0201复合物的KD小于 或等于3μM：所述方法包括：
(a)制备含有MEL TCR的α和β链可变区的TCR的多样性文库，其中所 述α和β链可变区之一或二者含有一个或多个突变；
(b)在适合于TCR与AAGIGILTV-HLA-A*0201结合的条件下使所述TCR 的多样性文库与AAGIGILTV-HLA-A*0201接触；和
(c)测定该相互作用的KD。
本发明各方面的优选特征与已作了必要修正的其它各方面的一样。本文提 及的现有技术文件按照法律所允许的最大程度纳入。
实施例
以下实施例进一步描述了本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。
下文参考了附图，其中：
图1a和1b分别提供了天然MEL TCR的α链可变区氨基酸序列和β链可变区 氨基酸序列。
图2a和2b分别提供了可溶形式的天然MEL TCRα链和β链的DNA序列。
图3a和3b分别提供了从图2a和2b所示DNA序列产生的MEL TCRα和β链 胞外氨基酸序列。
图4a和4b分别提供了可溶形式的MEL TCRα链和β链的DNA序列，其经 突变而包含了额外的半胱氨酸残基从而形成非天然二硫键。阴影表示各链中突变的 密码子，引入的限制性内切酶识别位点以下划线标出。
图5a和5b分别显示了从图4a和4b所示DNA序列产生的MEL TCRα链和β 链胞外氨基酸序列。阴影表示各链中引入的半胱氨酸。
图6提供了高亲和力MEL TCR变体的α链可变区氨基酸序列。突变的残基以 下划线标出。
图7a提供了截短形式的TRAC的氨基酸序列。
图7b提供了截短形式的TRBC1的氨基酸序列。
图7c提供了截短形式的TRBC2的氨基酸序列。
图8a提供述了pEX202质粒的质粒图谱。
图8b提供述了pEX202质粒的DNA序列。
图9a详细描述了优选的可溶性高亲和力MEL TCR变体的α链氨基酸序列。
图9b详细描述野生型可溶性MEL TCR的β链氨基酸序列，其采用了经肽接 头与野生型人IL-2融合的TRBC2编码的恒定区。接头和IL-2序列以斜体字表示。
图10提供了野生型二硫键连接的可溶性MEL TCR与 HLA-AAGIGILTV-HLA-A*0201相互作用产生的Biacore响应曲线。
图11a和11b分别提供了全长野生型MEL TCRα链DNA序列及其编码的氨 基酸序列，所述DNA序列经突变从而提高了在人细胞中的表达。
图12a和12b分别提供了全长高亲和力c1 MEL TCRα链DNA序列及其编码 的氨基酸序列，所述DNA序列经突变从而提高了在人细胞中的表达。
图13a和13b分别提供了全长高亲和力c1d MEL TCRα链DNA序列及其编码 的氨基酸序列，所述DNA序列经突变从而提高了在人细胞中的表达。
图14a和14b分别提供了全长高亲和力c9 MEL TCR α链序列及其编码的氨基 酸序列，所述α链序列经突变从而提高了在人细胞中的表达。
图15a和15b分别提供了全长c9 MEL TCRα链序列及其编码的氨基酸序列， 所述α链序列经突变从而提高了在人细胞中的表达。
图16提供的ELISPOT试验证明可溶性二硫键连接形式的高亲和力c1 WT Mel TCR抑制MEL特异性CTL克隆激活的能力。
图17a和17b分别提供了编码全长野生型MEL TCRα链ORF的DNA序列和 编码野生型MEL TCRβ链ORF的DNA序列。
图18提供了编码全长c1 MEL TCRα链ORF的DNA序列，其含有野生型DNA 密码子而不含编码突变氨基酸的那些密码子。
图19a提供了通过用未进行密码子优化的DNA转染Jurkat细胞获得的TCR 表达水平的FACS数据，所述DNA编码c1α/WTβ MEL TCR。
图19b提供了通过用进行密码子优化的DNA转染Jurkat细胞获得的TCR表 达水平的FACS数据，所述DNA编码c1α/WTβ MEL TCR。
图20提供其它高亲和力MEL TCRα链的可变区氨基酸序列。突变的残基以 下划线标出。
图21提供高亲和力MEL TCRβ链的可变区氨基酸序列。突变的残基以下划 线标出。
图22提供了可溶性高亲和力MEL TCRα链的氨基酸序列，其含有非天然半 胱氨酸残基。该非天然半胱氨酸突出表示，突变的残基以下划线标出。
图23提供了可溶性高亲和力MEL TCRβ链的氨基酸序列，其含有非天然半 胱氨酸残基。该非天然半胱氨酸突出表示，突变的残基以下划线标出。
实施例1-制备包含天然MEL可变区的二硫键连接的可溶性TCR
图4a和4b提供了野生型MEL TCR的可溶性二硫键连接的α和β链的DNA 序列，该TCR对AAGIGILTV-HLA-A*0201复合物具有特异性。可由多个承包 研究公司(contract research company)，例如GeneArt(德国雷根斯堡)从头合成这 些DNA序列。还可在这些DNA序列中加入限制性内切酶识别位点，从而使得 这些DNA序列易于连接入基于pGMT7的表达质粒，该质粒含有能在大肠杆菌 菌株BL21-DE3(pLysS)中高水平表达的T7启动子(Pan等，Biotechniques(2000) 29(6)：1234-8)。
将用NdeI和HindIII切割的编码各TCR链的DNA序列连接入也用NdeI 和HindIII切割的不同pEX202基于pGMT7的载体(pEX202的质粒图谱见图8a， 该载体的DNA序列见图8b(SEQ ID NO：28))。
在编码可溶性野生型MEL TCR链的DNA中导入限制性内切酶识别位点
NdeI-  CATATG
HindIII-  AAGCTT
连接
将连接的质粒转化入感受态大肠杆菌菌株XL1-蓝细胞，接种于含100 mg/ml氨苄西林的LB/琼脂平板。37℃培育过夜后，挑取单菌落，用含100mg/ml 氨苄西林的10ml LB于37℃摇动培养过夜。用Miniprep试剂盒(Qiagen)纯化克 隆的质粒，用自动化DNA测序仪(Lark Technologies)测序插入物。
图5a和5b分别显示了由图4a和4b所示DNA序列产生的可溶性二硫键 连接的野生型MEL TCRα和β链胞外氨基酸序列。这些DNA序列中的限制性 内切酶识别序列以下划线标出。
实施例2-制备二硫键连接的可溶性MEL TCR的高亲和力变体
可将如实施例1所述制备的二硫键连接的可溶性天然MEL TCR用作模板， 从该模板制备对AAGIGILTV(SEQ ID NO：43)-HLA-A*0201复合物的亲和力 提高的本发明TCR。
噬菌体展示是制备HIV Gag TCR变体文库从而能鉴定高亲和力突变体的 一种方法。例如，可修改Li等((2005)Nature Biotech 23(3)：349-354)描述的 TCR噬菌体展示和筛选方法，将其用于HIV Gag TCR。
图6列出了与野生型MELβ可变区结合时，对AAGIGILTV-HLA-A*0201 复合物显示高亲和力的突变TCRα链可变区的氨基酸序列(SEQ ID No：11-24)。 本领域技术人员已知可通过定点诱变将产生这些突变链所需的必需密码子变 化导入编码这些链的DNA中(QuickChangeTM，Stratagene的定点诱变试剂盒)。
简言之，可通过用能掺入所需一个或多个密码子变化的引物和含相关MEL TCR链DNA的pEX202质粒作为诱变模板来实现：
采用以下条件进行诱变：50ng质粒模板、1μl的10mM dNTP、由厂商提 供的5μl的10×Pfu DNA聚合酶缓冲液、25pmol的正向引物、25pmol的反 向引物、1μl的pfu DNA聚合酶，总体积为50μl。95℃进行2分钟的初始变 性后，进行25轮如下反应：变性(95℃，10秒)、退火(55℃，10秒)和延伸(72 ℃，8分钟)。用DpnI限制性内切酶消化所得产物以去除模板质粒，将得到的 产物转化入大肠杆菌菌株XL1-蓝中。通过测序验证诱变结果。
实施例3-可溶性TCR的表达、重折叠和纯化
将实施例1或2制备的含有MEL TCRα链和MEL TCRβ链的pEX202表 达质粒分别转化入大肠杆菌菌株BL21pLysS，37℃用TYP培养基(含100μg/ml 氨苄西林)培养具有氨苄西林抗性的单菌落至OD600为0.4，然后用0.5mM IPTG 诱导蛋白质表达。诱导后3小时用Beckman J-6B以4000 rpm离心30分钟收集 细胞。将细胞沉淀物重悬在含有50mM Tris-HCl、25％(w/v)蔗糖、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、10mM DTT，pH 8.0的缓冲液中。经冻融过夜步 骤后，在Milsonix XL2020超声波仪中用标准的12mm直径探头超声破碎重悬 的细胞1分钟，总共脉冲式超声约10分钟。用Beckman J2-21离心机以13000 rpm离心30分钟回收包涵体沉淀物。然后用洗涤剂洗涤三次以去除细胞碎片和 膜组分。每次用Triton缓冲液(50mM Tris-HCl、0.5％Triton-X100、200mM NaCl、 10mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT，pH 8.0)匀浆包涵体沉淀物， 然后用Beckman J2-21以13000rpm离心15分钟使其沉淀。然后用如下缓冲液 进行类似洗涤以去除洗涤剂和盐：50mM Tris-HCl、1mM NaEDTA、0.1％(w/v) 叠氮钠、2mM DTT，pH 8.0。最后，将包涵体分成30mg等分，-70℃冷冻。 用6M盐酸胍溶解并通过Bradford染料结合测试(PerBio)定量测定包涵体蛋白 产量。
融化溶有约30mg TCRβ链和60mg TCRα链的包涵体的冷冻储备物，然 后混合样品，用15ml胍溶液(6M盐酸胍、10mM醋酸钠、10mM EDTA)稀释 该混合物以确保链完全变性。然后将含有完全还原并变性的TCR链的胍溶液注 入1升以下重折叠缓冲液中：100mM Tris pH 8.5、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM还原谷胱甘肽、0.5mM氧化谷胱甘肽、5M尿素、0.2mM PMSF。 加入氧化还原对(2-巯乙胺和胱胺(其终浓度分别为6.6mM和3.7mM)，约5分 钟后加入变性的TCR链。溶液静置5小时±15分钟。5℃±3℃，在Spectrapor 1 膜(Spectrum；产品编号：132670)中用10 L 10mM Tris pH 8.1透析重折叠的TCR 18-20小时。然后将透析缓冲液换为新鲜的10mM Tris pH 8.1(10L)，在5℃±3 ℃下继续透析20-22小时。
将透析的重折叠物加样于POROS 50HQ阴离子交换柱上，用Akta纯化仪 (Pharmacia)以50倍以上柱体积的0-500mM NaCl梯度液洗脱结合的蛋白质从 而将sTCR与降解产物和杂质分开。将诸峰组分保存于4℃，用考马斯染色 SDS-PAGE分析，然后合并与浓缩。最后，用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，3.5mM EDTA，0.05％乙基苯基聚乙二醇(nonidet p40))预平 衡的Superdex 200HR凝胶过滤柱纯化和表征sTCR。合并与浓缩相对分子量约 50kDa的洗脱峰后通过BIAcore表面等离振子共振分析来表征。
实施例4-Biacore表面等离子共振表征结合于特异性pMHC的sTCR
用表面等离振子共振生物传感器(Biacore 3000TM)分析可溶性MEL TCR与 同源肽-MHC配体的结合情况。制备以半定向方式固定在链霉亲和素包被结合 表面上的单种pMHC复合物(描述于下文)有助于该项分析，从而能同时有效测 试可溶性T-细胞受体与多达4种不同pMHC(固定在不同的流动小室上)的结合 情况。手动注入HLA复合物易于操控固定的I类分子的精确水平。
体外重折叠来自含有组成型亚单位蛋白和合成肽的细菌表达的包涵体中 的生物素化的I类HLA-A*0201分子，然后纯化并在体外进行酶促生物素化 (O’Callaghan等(1999)Anal.Biochem.266：9-15)。所表达的HLA-A*0201-重链 的C末端具有生物素化标签，其以合适的结构替代了该蛋白质的跨膜和胞质结 构域。获得的包涵体表达水平约75mg/升细菌培养物。还在大肠杆菌中从合适 构建物表达了作为包涵体的MHC轻链或β2-微球蛋白，其水平约为500mg/升细 菌培养物。
裂解大肠杆菌细胞，纯化包涵体至约80％纯度。用6M盐酸胍、50mM Tris pH 8.1、100mM NaCl、10mM DTT、10mM EDTA使包涵体的蛋白质变性， 通过在低于5℃将变性蛋白一次脉冲加入重折叠缓冲液：0.4M L-精氨酸-HCl、 100mM Tris pH 8.1、3.7mM胱胺、6.6mM β-半胱胺，负载于HLA-A*0201分 子所需的4mg/ml AAGIGILTV肽，以30mg/升重链、30mg/升β2m的浓度进 行重折叠。重折叠在4℃进行至少1小时方能完成。
用10倍体积的10mM Tris pH 8.1透析更换缓冲液。为充分降低溶液的离 子强度，缓冲液需更换两次。然后将蛋白质溶液通过1.5μm乙酸纤维素滤膜过 滤，加样于POROS 50HQ阴离子交换柱上(床体积8ml)。用0-500mM NaCl线 性梯度液洗脱蛋白。HLA-A*0201-肽复合物大约在250mM NaCl处洗脱，收集 诸峰组分，加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)，将各组分冷藏于冰上。
用以相同缓冲液平衡的Pharmacia快速脱盐柱将含生物素化标签的pMHC 分子的缓冲液更换为10mM Tris pH 8.1、5mM NaCl。洗脱后立即将含有蛋白 质的组分冷藏于冰上，加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)。然后加入生物 素化试剂：1mM生物素、5mM ATP(缓冲至pH 8)、7.5mM MgCl2和5μg/ml BirA酶(按照O’Callaghan等，(1999)，Anal.Biochem.266：9-15纯化)。然后室 温培育混合物过夜。
采用凝胶过滤层析纯化生物素化的pHLA-A*0201分子。用已过滤的PBS 预平衡Pharmacia Superdex 75 HR 10/30柱，加载1ml生物素化反应混合物， 用PBS以0.5ml/分钟展开。生物素化pHLA-A*0201分子在约15ml时作为单 峰洗脱。合并含有蛋白质的组分，在冰上冷藏，加入蛋白酶抑制剂混合物。采 用考马斯结合试验(PerBio)测定蛋白质浓度，将生物素化的pHLA-A*0201分子 等份试样冷冻保存在-20℃。采用标准的胺偶联方法(amine coupling method)固 定链霉亲和素。
这种固定的复合物能结合T-细胞受体和辅助受体CD8αα，可将二者注射 入溶解相。即使在低浓度(至少40μg/ml)也能获得TCR的特异性结合，提示该 TCR较稳定。如果采用溶解相或固定相的sTCR，观察到sTCR的pMHC结合 特性在质量和数量上相似。这是对可溶性物质的部分活性至关重要的控制，也 提示生物素化的pMHC复合物与非生物素化的复合物的生物活性相同。
在Biacore 3000TM表面等离振子共振(SPR)生物传感器上分析含有新的链 间键的可溶性MEL TCR与其同源pMHC或无关的pMHC混合物(制备方法如 上所述)之间的相互作用。在一流动小室中，用SPR检测传感器表面附近以响 应单位(RU)表示的折光率变化，该原理可用于检测受体配体相互作用和分析它 们的亲和力以及动力学参数。所述探针流动小室如下制备：通过交联到β2m上 的生物素与已化学交联到流动小室的活化表面上的链霉亲和素之间的结合，将 各HLA-肽复合物固定在不同的流动小室中。然后使sTCR以恒定流速通过不同 流动小室的表面，并测定该情况下的SPR响应以进行测试。
检测平衡结合常数
制备野生型或突变的MEL sTCR的系列稀释液，以5μl/分钟的恒定流速注 入两个不同的流动小室；一个流动小室用约1000 RU的特异性 AAGIGILTV-HLA-A*0201复合物包被，第二个用约1000 RU的非特异性 HLA-A2-肽复合物包被。用对照小室的测定值对各浓度的响应进行标准化。制 作标准化数据响应与TCR样品浓度相关图，拟合成双曲线(hyperbola)以计算平 衡结合常数，KD。(Price & Dwek，Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists(2nd Edition)，《生物化学家的物理化学原理和问题》第二版， 1979，Clarendon Press，牛津)。
检测动力学参数
通过试验检测解离速率常数kd和结合速率常数ka来确定高亲和力TCR 的KD。平衡常数KD计算为kd/ka。
注射TCR流过两个不同小室，一个用约300RU的特异性 HLA-A2-AAGIGILTV复合物包被，第二个用约300RU的非特异性HLA-A2- 肽复合物包被。流速设置为50μl/分钟。通常注入约3μM浓度的250μl TCR。 然后使缓冲液流过直到响应回复到基线。用Biaevaluation软件计算动力学参数。 也将解离相拟合为单指数衰变方程式从而能计算半衰期。
结果
采用上述方法分析二硫键连接的可溶性野生型MEL TCR(由SEQ ID NO：9 和10分别详述的α和βTCR链组成)与AAGIGILTV-HLA-A*0201复合物之间 的相互作用，显示KD为4μM。(Biacore响应曲线见图12)。
含有下表所述可变区应用的TCR的KD小于或等于3μM。根据对高亲和 力TCR而非本文MEL TCR的经验(参见例如Li等，Nature Biotech 2005 23(3)： 349-354)，预计下表所述一些或所有TCR的koff为1×10-3S-1或更慢，实际 上通过制备含有这些可变区的可溶性TCR已显示是这样的情况(参见下表1)。
α链可变区序列，     SEQ ID NO： β链可变区序列，     SEQ ID NO：     11     2     12     2     13     2     14     2     15     2     16     2     17     2     18     2     19     2     20     2     21     2     22     2     23     2
    24     2     47     2     48     2     49     2     50     2     51     2     52     2     53     2     11     54     11     55     11     56     11     57     11     58     11     59     11     60     11     61     11     62     11     63     11     64     11     65     11     66     11     67
 α链可变区序列，     SEQ ID NO：   β链可变区序列，     SEQ ID NO：     亲合力     (KD)nM     解离速率     (Koff)1/s     11     2     6.4     3.26×10-3     47     2     6.1     1.21×10-3     48     2     3.2     6.56×10-4     53     2     10.6     1.8×10-3     11     54     0.42     2.3×10-4     11     55     0.52     2.04×10-3     11     56     0.82     2.2×10-4     11     57     0.61     1.73×10-4     11     58     0.40     1.55×10-4     11     62     0.57     2.06×10-4     11     65     1.0     1.14×10-4     11     66     1.9     1.62×10-4
表1-含有所述可变区的可溶性二硫键连接的高亲和力MEL TCR与同源 AAGIGILTV-HLA-A*0201肽-MHC相互作用的Biacore数据
实施例5-制备可溶性高亲和力MEL TCR-野生型人IL-2融合蛋白
可用基本上如实施例1-3中所述的方法制备可溶性高亲和力MEL TCR-野 生型(WT)人IL-2融合蛋白。简言之，将编码所需接头和WT人IL-2的DNA加 到二硫键连接的可溶性野生型MEL TCR β链DNA序列的3′端，直接位于 TAA(“终止”)密码子之前。图9b提供了融合蛋白的氨基酸序列，该融合蛋白 包含通过接头序列融合到WT人IL-2的二硫键连接的野生型MEL TCR β链 (SEQ ID NO：30)。该融合蛋白的接头和IL-2部分用斜体表示。然后可将编码 该构建物的DNA连接入pEX202。然后可采用基本上如实施例3所述的方法， 使该β链融合蛋白与含有图6详述的任何可变区(SEQ ID NO：11-24)的二硫键连 接的可溶性高亲和力MEL TCRα链相结合，从而表达此可溶性高亲和力MEL TCR-IL-2融合蛋白。例如，图9a(SEQ ID NO：29)提供了含有SEQ ID NO：11 详述的可变区的二硫键连接的可溶性高亲和力MEL TCR α链的氨基酸序列。
实施例6-体外评估可溶性高亲和力Mel C1c WT Mel TCR抑制细胞毒性T细胞 (CTL)活化的ELISPOT试验
以下方法提供了评估Mel c1 cWT高亲和力Mel TCR抑制 AAGIGILTV-HLA-A*0201反应性T细胞克隆活化的能力的一种手段。
该实验所用的可溶性Mel c1 cWT高亲和力Mel TCR含有分别如(SEQ ID NO：11)和(SEQ ID NO：2)所示的Mel TCRα链可变区和WT Mel TCRβ链可变 区。图9a(SEQ ID NO：29)和图5b(SEQ ID NO：10)分别提供了该二硫键连接的 可溶性TCR的TCR α和β链的全部氨基酸序列。
试剂：
试验培养基：10％FCS(热灭活的，Gibco，目录号10108-165)，88％RPMI 1640(Gibco，目录号42401-018)，1％谷氨酰胺(Gibco，目录号25030-024)和 1％青霉素/链霉素(Gibco，目录号15070-063)。
洗涤缓冲液：0.01 M PBS/0.05％吐温20(将Sigma，目录号P-3563的1包 含吐温20的磷酸缓冲盐水，pH7.4溶解于1升蒸馏水得到最终组合物0.01M PBS、0.138M NaCl、0.0027M KCl、0.05％吐温20)。
PBS(Gibco，目录号10010-015)
Diaclone EliSpot试剂盒(IDS)，EliSpot试剂盒装有所需的所有其它试剂， 即捕捉和检测抗体，脱脂奶粉、BSA、链霉亲和素-碱性磷酸酶、BCIP/NBT溶 液(人IFN-γPVDF Eli-spot 20×96孔板(IDS目录号DC-856.051.020， DC-856.000.000)。
以下方法依据各试剂盒所装的生产商使用说明书，但有些改进。
方法
每平板用10ml无菌PBS稀释100μl捕捉抗体。将100μl稀释的捕捉抗体 等份加入各孔，4℃静置过夜，或在室温静置2小时。然后使用450μl洗涤缓 冲液，Ultrawash 96-孔板洗涤仪(Thermo Life Sciences)洗涤各平板三次以除去 多余的捕捉抗体。然后将100μl 2％脱脂奶加入各孔。(将ELISPOT试剂盒提供 的一小瓶脱脂奶粉溶解于50ml无菌PBS中)。然后在室温培育各平板2小时， 再用450μl洗涤缓冲液，Ultrawash 96-孔板洗涤仪(Thermo Life Sciences)洗涤 各板三次。
用胰蛋白酶将Mel 624和Mel 526靶癌细胞与它们的组织培养瓶分离，用 试验培养基通过离心(280×g，10分钟)洗涤一次，以1×106/ml重悬在相同 培养基中。然后将50ul该悬液加入试验平板得到的靶细胞总数为50,000个细 胞/孔。
ELAGIGILTV-脉冲的T2靶细胞也用作对照。由于该类似肽对HLA-A*0201 的亲和力高于野生型肽而使用该类似肽。
用试验培养基通过离心(280×g，10分钟)洗涤这些肽脉冲的细胞一次， 以1×106/ml重悬在相同培养基中。然后将50ul该悬液加入试验平板得到的靶 细胞总数为50,000个细胞/孔。
通过离心(280×g，10分钟)收集用ELAGIGILTV肽进行自体刺激产生 的T细胞克隆(KA/C5)(效应细胞)，将其以1×105个细胞/ml重悬在试验培养 基中，将50μl加入试验平板时得到5000个细胞/孔。
用试验培养基以3×浓度稀释可溶性Mel c1 cWT高亲和力Mel TCR，当将 50ul加入平板时得到1×终(浓度)，终体积为150μl。所测试的高亲和力Mel TCR 的浓度范围是1μM-1nM。
然后制备含有以下物质的各孔，(各孔中最终反应体积为100μl)：
测试样品(按顺序加入)
50μl Mel 624或Mel 526靶细胞
50ul所需浓度的可溶性高亲和力Mel c1 cWT TCR
50ul KA/C5 T细胞克隆效应细胞
阴性对照
50μl靶细胞
50ul最高浓度的可溶性高亲和力Mel c1 cWT TCR
50μl试验培养基
和
50μl效应细胞
50μl最高浓度的可溶性高亲和力Mel c1 cWT TCR
50μl试验培养基
和
50μl效应细胞
50μl靶细胞
50μl最高浓度的可溶性无关(HLA-A*0201-Tax-特异性)高亲和力mTCR
50μl试验培养基
阳性对照
50μl Mel 624、Mel 526或肽脉冲的T2靶细胞
50μl效应细胞
50μl试验培养基
然后将各板在37℃/5％CO2下培育过夜。再用洗涤缓冲液洗涤各板6次， 随后轻拍出多余的缓冲液。然后向ELISPOT试剂盒提供的各小瓶检测抗体中 加入550μl蒸馏水以制备稀释溶液。再用每平板10ml PBS/1％BSA稀释100μl 稀释的检测抗体溶液，将100μl稀释的检测抗体溶液等份加入各孔。然后在室 温培育各平板90分钟。
然后用450μl洗涤缓冲液，Ultrawash 96-孔板洗涤仪(Thermo Life Sciences) 洗涤各板三次，轻拍至干。
然后每平板用10ml PBS/1％BSA稀释10μl链霉亲和素-碱性磷酸酶，将 100μl稀释的链霉亲和素加入各孔，室温下培育1小时。然后用450μl洗涤缓 冲液再洗涤各平板3次，轻拍至干。
向各孔中加入100μl BCIP/NBT补充溶液，用箔片覆盖各平板，静置显影 5-15分钟。在此期间，有规律地检查各平板的斑点形成以决定何时终止反应。
然后用自来水彻底洗涤各平板，振荡，然后分开，静置于工作台上干燥。
干燥后，用ELISPOT读数计(Autoimmun Diagnotistika，德国)对平板读数。
各孔中的斑点数目与激活的T细胞成比例。因此，含有高亲和力Mel TCR 的各孔中斑点数目的任何降低表明抑制了KA/C5 CTL克隆活化。
结果
如图16所示，可溶性c1 cWT高亲和力Mel TCR能有效抑制KA/C5 CTL 克隆活化。这些数据表明利用1μM可溶性c1 cWT高亲和力Mel TCR能100％ 抑制CTL活化。
实施例7-用编码高亲和力(c1αWTβ)MEL TCR的密码子优化和密码子未优化的 DNA转染Jurkat细胞的TCR表达水平比较
将培养于含10％热灭活胎牛血清RMPI培养基的4×106个培养Jurkat 细胞用无血清的培养基洗涤并用以下质粒转染：
a)5μg无内毒素的质粒pCIneo(其含有编码MELαc1突变型全长TCRα链 的密码子未优化的序列)加上5μg无内毒素的质粒pCI(其含有编码MELβ野生 型全长TCR链的密码子未优化的序列)(这些序列的ORF分别见图18(SEQ ID NO：46)和图17b(SEQ ID NO：45))；或
b)5μg无内毒素的质粒pCIneo(其含有ORF密码子优化的MELαc1突变 型全长TCRα链)加上5μg无内毒素的质粒pCI(其含有ORF密码子优化的MEL β野生型全长TCR链)(这些序列的ORF分别见图12a(SEQ ID NO：33)和图15a (SEQ ID NO：39))。
用BioRad Genepulser装置，以0.27kV和975μF的条件，用0.4cm小杯 进行电穿孔转染。
37℃，将细胞置于6ml含20％热灭活胎牛血清的RPMI中72小时。
在体积为100μl的PBS中用1μl(0.54μg)PE-标记的链霉亲和素p/HLA-A2 四聚体染色细胞(肽是变态(heteroclytic)MEL肽ELAGIGILTV或阴性对照 NY-ESO肽SLLMWITQC)。
室温下静置20分钟后，用5ml RPMI洗涤细胞一次，将其重悬在800μl RPMI中，用FC500 Beckman Coulter仪器分析。
结果
图19a和图19b所示的FACs染色数据是用编码c1α/WTβ MEL TCR的密 码子未优化和密码子优化的DNA转染Jurkat细胞获得的同源pMHC四聚体染 色水平。这些数据证明与使用相应的密码子未优化DNA达到的TCR表面表达 水平相比，用密码子优化的DNA达到高表达水平。