爱帕琳融合蛋白和其用途
阅读：987发布：2020-11-17
专利汇可以提供爱帕琳融合蛋白和其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供包含融合至多聚组分的爱帕琳肽的融合蛋白或多肽。本发明还提供包含融合至Fc结构域、Fc结构域的 片段 或Fc结构域的变体的爱帕琳肽的融合蛋白或多肽。爱帕琳Fc融合多肽能够结合于爱帕琳受体(APLNR)。爱帕琳Fc融合多肽能够激活APLNR并且与未融合于Fc或Fc片段的爱帕琳肽相比具有改进的药物动 力 学特性。爱帕琳Fc融合多肽适用于与心血管功能相关的 疾病 和病况、糖尿病、癌症、肥胖以及其它爱帕琳相关病况。，下面是爱帕琳融合蛋白和其用途专利的具体信息内容。
1.一种多肽，其包含融合至Fc结构域、Fc结构域的片段或Fc结构域的变体的爱帕琳肽。
2.如权利要求1所述的多肽，其中所述爱帕琳肽选自由爱帕琳42-77(爱帕琳-36)、爱帕琳61-77(爱帕琳-17)、爱帕琳63-77(爱帕琳-15)、爱帕琳64-77(爱帕琳-14)、爱帕琳65-77(爱帕琳-13)、爱帕琳66-77(爱帕琳-12)、爱帕琳67-77(爱帕琳-11)、爱帕琳68-77(爱帕琳-10)、爱帕琳73-77(爱帕琳-5)、爱帕琳61-76(爱帕琳-K16P)、爱帕琳
61-75(爱帕琳-K15M)、爱帕琳61-74(爱帕琳-K14P)、爱帕琳-F13A、爱帕琳65-76、爱帕琳
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65-75、爱帕琳66-76、爱帕琳67-76、爱帕琳66-75、爱帕琳67-75以及[Pyr]爱帕琳-13或其片段或衍生物组成的组。
3.如权利要求1或2所述的多肽，其中所述爱帕琳肽是爱帕琳-13或其片段或衍生物。
4.如权利要求2所述的多肽，其中所述爱帕琳肽衍生物包含选自由SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43以及SEQ ID NO：44组成的组的氨基酸序列。
5.如权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述爱帕琳肽经由一个或多个肽连接体融合至所述Fc结构域或其片段。
6.如权利要求4所述的多肽，其中所述爱帕琳肽经由一个或多个Gly-Ser连接体融合至所述Fc结构域或其片段。
7.如权利要求5所述的多肽，其中所述爱帕琳肽经由一个或多个Gly-Ser连接体融合至所述Fc结构域或其片段的C端。
8.如权利要求5所述的多肽，其中所述爱帕琳肽经由一个或多个Gly-Ser连接体融合至所述Fc结构域或其片段的N端。
9.如权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中所述Fc结构域选自由IgG1 CH2结构域和IgG1 CH3结构域；IgG4 CH2结构域和IgG4 CH3结构域；IgG1 CH2结构域和IgG4 CH3结构域；以及IgG4 CH2结构域和IgG1 CH3结构域组成的组。
10.如权利要求1至8中任一项所述的多肽，其中所述Fc结构域包含IgG铰链结构域或其片段或变体。
11.如权利要求1至9中任一项所述的多肽，其中所述Fc结构域包含包含SEQ ID NO：
14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22的IgG铰链结构域。
12.如权利要求1至10中任一项所述的多肽，其中所述多肽与第二多肽形成至少一个二硫键。
13.如权利要求1至11中任一项所述的多肽，其中所述多肽是能够形成二聚体的单体融合多肽。
14.如权利要求1至12中任一项所述的多肽，其中所述多肽具有与包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列95％或更大的序列同一性。
15.如权利要求13所述的多肽，其包含包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
16.如权利要求1至12中任一项所述的多肽，其中所述多肽具有与包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列95％或更大的序列同一性。
17.如权利要求15所述的多肽，其包含包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
18.一种编码权利要求1至16中任一项所述的多肽的核酸。
19.一种包含权利要求1至16中任一项所述的多肽的蛋白。
20.一种爱帕琳受体(APNLR)结合分子，其包含：
a.爱帕琳肽组分，
b.人类IgG Fc结构域，以及
c.至少一种连接体组分。
21.如权利要求20所述的受体结合分子，其中所述爱帕琳肽选自由爱帕琳42-77(爱帕琳-36)、爱帕琳61-77(爱帕琳-17)、爱帕琳63-77(爱帕琳-15)、爱帕琳64-77(爱帕琳-14)、爱帕琳65-77(爱帕琳-13)、爱帕琳66-77(爱帕琳-12)、爱帕琳67-77(爱帕琳-11)、爱帕琳68-77(爱帕琳-10)、爱帕琳73-77(爱帕琳-5)、爱帕琳61-76(爱帕琳-K16P)、爱帕琳61-75(爱帕琳-K15M)、爱帕琳61-74(爱帕琳-K14P)、爱帕琳-F13A、爱帕琳65-76、爱帕琳65-75、爱帕琳66-76、爱帕琳67-76、爱帕琳66-75、爱帕琳67-75以及
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[Pyr]爱帕琳-13或其片段或衍生物组成的组。
22.如权利要求20或21所述的受体结合分子，其中所述爱帕琳肽是爱帕琳-13(SEQ ID NO：6)或其片段或衍生物。
23.如权利要求21所述的受体结合分子，其中所述爱帕琳肽衍生物包含选自由SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43以及SEQ ID NO：44组成的组的氨基酸序列。
24.如权利要求20至23中任一项所述的受体结合分子，其中所述Fc结构域选自由IgG1 CH2结构域和IgG1 CH3结构域；IgG4 CH2结构域和IgG4 CH3结构域；IgG1 CH2结构域和IgG4 CH3结构域；以及IgG4 CH2结构域和IgG1 CH3结构域；或其片段或变体组成的组。
25.如权利要求20至24中任一项所述的受体结合分子，其中所述Fc结构域包含IgG铰链结构域或其片段或变体。
26.如权利要求20至25中任一项所述的受体结合分子，其中所述Fc结构域包含选自由SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21以及SEQ ID NO：22组成的组的IgG铰链结构域。
27.如权利要求20至27中任一项所述的受体结合分子，其中所述受体结合分子是展示小于约50nM或小于约25nM或小于约10nM或小于约1nM的EC50的APLNR激动剂。
28.如权利要求20至27中任一项所述的受体结合分子，其中所述受体结合分子具有至少约1小时或至少约2、3、4、5、6、7、8、9或10小时的体内半衰期。
29.如权利要求20至28中任一项所述的受体结合分子，其中所述爱帕琳肽融合至所述Fc结构域的C端。
30.如权利要求29所述的受体结合分子，其包含多肽，其中所述多肽具有与包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列95％或更大的氨基酸序列同一性。
31.如权利要求30所述的受体结合分子，其包含包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
32.如权利要求29所述的受体结合分子，其包含多肽，其中所述多肽具有与包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列95％或更大的氨基酸序列同一性。
33.如权利要求32所述的受体结合分子，其包含包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。
34.如权利要求29所述的受体结合分子，其包含多肽，其中所述多肽具有与包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列95％或更大的氨基酸序列同一性。
35.如权利要求34所述的受体结合分子，其包含包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。
36.如权利要求29所述的受体结合分子，其包含多肽，其中所述多肽具有与包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列95％或更大的氨基酸序列同一性。
37.如权利要求36所述的受体结合分子，其包含包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列。
38.如权利要求20至28中任一项所述的受体结合分子，其中所述爱帕琳肽融合至所述Fc结构域的N端。
39.如权利要求38所述的受体结合分子，其包含多肽，其中所述多肽具有与包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列95％或更大的氨基酸序列同一性。
40.如权利要求39所述的受体结合分子，其包含包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
41.如权利要求20至28中任一项所述的受体结合分子，其中所述爱帕琳肽经由一个或多个Gly-Ser连接体融合至所述Fc结构域的C端或所述Fc结构域的N端。
42.一种组合物，其包含权利要求20至41中任一项的受体结合分子。
43.一种编码权利要求20至41中任一项所述的爱帕琳受体结合分子的核酸分子。
44.如权利要求43所述的核酸分子，其连接至编码信号肽的核苷酸序列。
45.如权利要求44所述的核酸分子，其包含选自由SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26组成的组的核苷酸序列。
46.一种包含权利要求43至45中任一项所述的核酸分子的载体。
47.如权利要求46所述的载体，其中所述核酸分子可操作地连接至适合在宿主细胞中表达的表达控制序列。
48.如权利要求47所述的载体，其中所述表达控制序列包含选自由SV40、CMV、CMV-IE、CMV-MIE、UbC、RSV、SL3-3、MMTV、Ubi以及HIV LTR组成的组的启动子。
49.如权利要求46或权利要求47所述的载体，其中所述表达控制序列包含选自由CMV-MIE启动子驱动的TetR-ERLBDT2融合基因、SV40启动子驱动的杀稻瘟菌素抗性基因以及CMV-MIE启动子驱动的Arc-ERLBDT2融合基因组成的组的表达盒。
50.如权利要求48或权利要求49所述的载体，其中所述启动子是CMV-MIE/TetO或CMV-MIE/Arc杂合启动子。
51.如权利要求46至50中任一项所述的载体，其包含一种或多种选自由bla、bls、BSD、bsr、Sh ble、hpt、tetR、tetM、npt、kanR以及pac组成的组的可选择标志物基因。
52.一种包含权利要求43至45中任一项的核酸分子的细胞。
53.如权利要求52所述的细胞，其包含权利要求46至51中任一项的载体。
54.如权利要求52或53所述的细胞，其中所述核酸整合至所述细胞的基因组中。
55.如权利要求52至54中任一项所述的细胞，其包含编码蛋白表达增强子的核酸。
56.如权利要求52至56中任一项所述的细胞，其包含编码XBP多肽的核酸。
57.如权利要求52至56中任一项所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
58.如权利要求52至57中任一项所述的细胞，其中所述宿主细胞选自由CHO、COS、视网膜细胞、Vero、CV1、293、MDCK、HaK、BHK、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT细胞、肿瘤细胞、源于任何上述细胞的细胞系以及 细胞组成的组。
59.如权利要求52至58中任一项所述的细胞，其中所述细胞是动物细胞。
60.如权利要求52至59中任一项所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
61.如权利要求52至60中任一项所述的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
62.如权利要求52至61中任一项所述的细胞，其中所述细胞是CHO-K1细胞。
63.一种用于确定APLN受体(APLNR)的激活的方法，所述方法包括
a.使表达APLNR的细胞与测试分子在允许所述APLNR的激活的条件下接触，
b.测量APLNR活性，
c.单独地使表达APLNR的细胞与爱帕琳Fc融合蛋白在与步骤(a)中相同的条件下接触，以及
d.以与步骤(b)相同的方式测量步骤(c)中的所述细胞的APLNR活性，以及
其中与步骤(d)中APLNR活性的测量相比步骤(b)中APLNR活性的测量确定所述测试分子激活所述APLNR。
64.如权利要求63所述的方法，其中与步骤(d)相比步骤(b)中APLNR活性的较高测量值指示所述测试分子是APLNR激动剂。
65.如权利要求64所述的方法，其中步骤(b)中活性的所述较高测量值是小于约50nM的EC50。
66.如权利要求65所述的方法，其中步骤(b)中活性的所述较高测量值是小于约1nM的EC50。
67.如权利要求63所述的方法，其中步骤(a)包括使细胞与所述测试分子和所述爱帕琳Fc融合蛋白均接触，并且其中与步骤(d)相比步骤(b)中APLNR活性的较低测量值指示所述测试分子是APLNR拮抗剂。
68.一种重组多肽，其中所述多肽包含N’-P1m-X1n-X2-X3-P2-A1-C’，其中：
(a)N’是所述多肽的N端并且C’是所述多肽的C端，
(b)P1是肽连接体，
(c)X1包含IgG铰链结构域或其片段或变体，
(d)X2包含IgG CH2结构域或其片段或变体，
(e)X3包含IgG CH3结构域或其片段或变体，
(f)P2是肽连接体，以及
(g)A1是包含人类爱帕琳肽或其片段或衍生物的氨基酸序列，
其中m＝0或1，并且n＝0或1。
69.一种重组多肽，其中所述多肽包含N’-A1-P2-X1n-X2-X3-C’，其中：
(a)N’是所述多肽的N端并且C’是所述多肽的C端，
(b)A1是包含人类爱帕琳肽或其片段或衍生物的氨基酸序列，
(c)P2是肽连接体，
(d)X1包含IgG铰链结构域或其片段或变体，
(e)X2包含IgG CH2结构域或其片段或变体，以及
(f)X3包含IgG CH3结构域或其片段或变体，
其中n＝0或1。
70.如权利要求68所述的重组多肽，其中m＝0。
71.如权利要求68所述的重组多肽，其中m＝1并且P1包含RSTGSPGSG(SEQ ID NO：
12)。
72.如权利要求68或69所述的重组多肽，其中P2包含一个或多个GlySer连接体。
73.如权利要求72所述的重组多肽，其中所述GlySer连接体包含SEQ ID NO：11。
74.如权利要求72或73所述的重组多肽，其中A1选自由爱帕琳42-77(爱帕琳-36)、爱帕琳61-77(爱帕琳-17)、爱帕琳63-77(爱帕琳-15)、爱帕琳64-77(爱帕琳-14)、爱帕琳65-77(爱帕琳-13)、爱帕琳66-77(爱帕琳-12)、爱帕琳67-77(爱帕琳-11)、爱帕琳68-77(爱帕琳-10)、爱帕琳73-77(爱帕琳-5)、爱帕琳61-76(爱帕琳-K16P)、爱帕琳
61-75(爱帕琳-K15M)、爱帕琳61-74(爱帕琳-K14P)、爱帕琳-F13A、爱帕琳65-76、爱帕琳
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65-75、爱帕琳66-76、爱帕琳67-76、爱帕琳66-75、爱帕琳67-75以及[Pyr]爱帕琳-13或其片段或衍生物组成的组。
75.如权利要求68至74中任一项所述的重组多肽，其中X1包含包含人类IgG重链铰链结构域的片段的氨基酸序列。
76.如权利要求68至75中任一项所述的重组多肽，其中X1包含选自由SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21以及SEQ ID NO：22组成的组的氨基酸序列。
77.如权利要求68至76中任一项所述的重组多肽，其中X2包含人类IgG1 CH2结构域或人类IgG4 CH2结构域的位置238至340(EU编号)。
78.如权利要求68至77中任一项所述的重组多肽，其中X3包含人类IgG1 CH3结构域或人类IgG4 CH3结构域的位置341至447(EU编号)。
79.如权利要求68至78中任一项所述的重组多肽，其中X2包含氨基酸序列SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：23。
80.如权利要求68至79中任一项所述的重组多肽，其中X3包含氨基酸序列SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：24。
81.如权利要求68所述的重组多肽，其中所述多肽包含与选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40以及SEQ ID NO：41组成的组的多肽至少99％同一的氨基酸序列。
82.如权利要求69所述的重组多肽，其中所述多肽包含与氨基酸序列SEQ ID NO：4至少99％同一的氨基酸序列。
83.一种包含权利要求68至82中任一项的重组多肽的组合物。
84.一种编码权利要求68至82中任一项的重组多肽的核酸分子。
85.如权利要求84所述的核酸分子，其编码包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的重组多肽。
86.如权利要求84或85所述的核酸分子，其包含具有与核苷酸序列SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28大于99％序列同一性的核苷酸序列。
87.如权利要求84至86中任一项所述的核酸分子，其编码能够形成二聚体的单体多肽。
88.如权利要求84至87中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码包含信号肽的氨基酸序列。
89.如权利要求88所述的核酸分子，其中所述重组多肽在能够分泌所述多肽的宿主细胞中表达。
90.如权利要求84至89中任一项所述的核酸分子，其包含核苷酸序列SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26。
91.一种包含权利要求84至90中任一项的核酸分子的载体。
92.如权利要求91所述的载体，其中所述核酸分子可操作地连接至适合在宿主细胞中表达的表达控制序列。
93.如权利要求92所述的载体，其中所述表达控制序列包含选自由SV40、CMV、CMV-IE、CMV-MIE、UbC、RSV、SL3-3、MMTV、Ubi以及HIV LTR组成的组的启动子。
94.如权利要求93所述的载体，其中所述表达控制序列包含选自由CMV-MIE启动子驱动的TetR-ERLBDT2融合基因、SV40启动子驱动的杀稻瘟菌素抗性基因以及CMV-MIE启动子驱动的Arc-ERLBDT2融合基因组成的组的表达盒。
95.如权利要求92或93所述的载体，其中所述启动子是CMV-MIE/TetO或CMV-MIE/Arc杂合启动子。
96.如权利要求91至95中任一项所述的载体，其包含一种或多种选自由bla、bls、BSD、bsr、Sh ble、hpt、tetR、tetM、npt、kanR以及pac组成的组的可选择标志物基因。
97.一种包含权利要求84至90中任一项的核酸分子的细胞。
98.如权利要求97所述的细胞，其包含权利要求91至96中任一项的载体。
99.如权利要求97或98所述的细胞，其中所述核酸整合至所述细胞的基因组中。
100.如权利要求97至99中任一项所述的细胞，其包含编码蛋白表达增强子的核酸。
101.如权利要求97至100中任一项所述的细胞，其包含编码XBP多肽的核酸。
102.如权利要求97至102中任一项所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
103.如权利要求97至102中任一项所述的细胞，其中所述宿主细胞选自由CHO、COS、视网膜细胞、Vero、CV1、293、MDCK、HaK、BHK、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT细胞、肿瘤细胞、源于任何上述细胞的细胞系以及 细胞组成的组。
104.如权利要求97至103中任一项所述的细胞，其中所述细胞是动物细胞。
105.如权利要求97至104中任一项所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
106.如权利要求97至105中任一项所述的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
107.如权利要求97至106中任一项所述的细胞，其中所述细胞是CHO-K1细胞。
108.如权利要求97至107中任一项所述的细胞，其中所述重组多肽能够被分泌。
109.一种制造包含爱帕琳肽的分离的融合蛋白的方法，所述方法包括：
a.用编码所述融合蛋白的核酸分子转染宿主细胞，其中所述核酸分子包含编码信号肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列融合至
i)在爱帕琳肽的N端连接至编码所述爱帕琳肽的核苷酸序列的编码人类IgG的Fc结构域的核苷酸序列，或
ii)在Fc结构域的N端连接至编码人类IgG的所述Fc结构域的核苷酸序列的编码爱帕琳肽的核苷酸序列，
以及
b.通过在所述宿主细胞中表达(a)的所述核酸分子来制造所述融合蛋白。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述信号肽包含SEQ ID NO：9。
111.如权利要求109或110所述的方法，其中所述融合蛋白任选地包含编码肽连接体的核苷酸序列，所述核苷酸序列融合至所述信号肽的C端。
112.如权利要求109至111中任一项所述的方法，其进一步包括如下步骤：培养步骤(b)的所述宿主细胞，其中所述宿主细胞分泌所述融合蛋白至细胞培养基中；以及从所述细胞培养基分离所述融合蛋白。
113.如权利要求109至112中任一项所述的方法，其中所述分离的融合蛋白包含多肽，所述多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：
39、SEQ ID NO.40以及SEQ ID NO；41。
114.如权利要求109至113中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白包含能够形成二聚体的单体融合多肽。
115.如权利要求109至114中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞选自由CHO、COS、视网膜细胞、Vero、CV1、293、MDCK、HaK、BHK、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT细胞、肿瘤细胞、源于任何上述细胞的细胞系以及 细胞组成的组。
116.一种用于治疗有需要的受试者中与爱帕琳有关的疾病或病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1所述的多肽。
117.如权利要求116所述的方法，其中所述疾病或病况选自由心血管疾病、急性失代偿性心力衰竭、充血性心力衰竭、心肌梗塞、心肌病、缺血、缺血/再灌注损伤、肺动脉高血压、糖尿病、肥胖、癌症、转移性疾病、流体稳态、潮热症状、病理性血管生成、视网膜病、纤维化以及HIV感染组成的组。
118.一种试剂盒，其包括一个或多个填充有至少一种前述权利要求任一项的爱帕琳融合蛋白或多肽的容器。
119.一种包含融合至多聚组分的爱帕琳肽的多肽。
120.如权利要求119所述的多肽，其中所述多聚组分包含亮氨酸拉链、螺旋-环基序、卷曲螺旋基序、Fc结构域、Fc结构域的片段或Fc结构域的变体。
121.如权利要求119或120所述的多肽，其中所述爱帕琳肽选自由爱帕琳42-77(爱帕琳-36)、爱帕琳61-77(爱帕琳-17)、爱帕琳63-77(爱帕琳-15)、爱帕琳64-77(爱帕琳-14)、爱帕琳65-77(爱帕琳-13)、爱帕琳66-77(爱帕琳-12)、爱帕琳67-77(爱帕琳-11)、爱帕琳68-77(爱帕琳-10)、爱帕琳73-77(爱帕琳-5)、爱帕琳61-76(爱帕琳-K16P)、爱帕琳61-75(爱帕琳-K15M)、爱帕琳61-74(爱帕琳-K14P)、爱帕琳-F13A、爱帕琳65-76、爱帕琳65-75、爱帕琳66-76、爱帕琳67-76、爱帕琳66-75、爱帕琳67-75以及
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[Pyr]爱帕琳-13或其片段或衍生物组成的组。
122.如权利要求119至121中任一项所述的多肽，其中所述爱帕琳肽是爱帕琳-13。
123.如权利要求119至122中任一项所述的多肽，其中所述爱帕琳肽经由一个或多个肽连接体融合至所述多聚结构域。
124.如权利要求123所述的多肽，其中所述多聚结构域是Fc结构域或其片段，并且其中所述爱帕琳肽经由一个或多个Gly-Ser连接体融合至Fc结构域或Fc结构域片段。
125.如权利要求124所述的多肽，其中所述爱帕琳肽经由一个或多个Gly-Ser连接体融合至所述Fc结构域或其片段的C端。
126.如权利要求125所述的多肽，其中所述爱帕琳肽经由一个或多个Gly-Ser连接体融合至所述Fc结构域或其片段的N端。
127.如权利要求119至126中任一项所述的多肽，其中所述多聚结构域选自由IgG1 CH2结构域和IgG1 CH3结构域；IgG4 CH2结构域和IgG4 CH3结构域；IgG1 CH2结构域和IgG4 CH3结构域；以及IgG4 CH2结构域和IgG1 CH3结构域组成的组的Fc结构域。
128.如权利要求119至127中任一项所述的多肽，其中所述Fc结构域包含IgG铰链结构域或其片段或变体。
129.如权利要求128中任一项所述的多肽，其中所述Fc结构域包含包含SEQ ID NO：
14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22的IgG铰链结构域。
130.如权利要求119至129中任一项所述的多肽，其中所述多肽与第二多肽形成至少一个二硫键。
131.一种编码权利要求119至130中任一项所述的多肽的核酸。
132.一种包含权利要求119至131中任一项所述的多肽的多聚蛋白。
爱帕琳融合蛋白和其用途
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请根据35USC§119(e)要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请号61/786,172的权益，并且根据35USC§119(e)要求2013年11月20日提交的美国临时专利申请号61/906,567的权益，所述申请各自明确以引用的方式整体并入本文。
[0004] 本申请以引用的方式并入以计算机可读形式递交的序列表，即2014年3月13日创建的文件8050WO_ST25.txt(43,420字节)。发明领域
[0005] 本发明涉及用融合至爱帕琳(apelin)肽的N端或C端的多聚组分(如人类免疫球蛋白Fc结构域)工程改造的融合蛋白。本发明的重组蛋白和其组合物适用于治疗心血管疾病、缺血-再灌注、糖尿病以及其它爱帕琳相关疗法。
[0006] 发明背景
[0007] 爱帕琳前体肽原是在人类CNS和外周组织(例如，肺、心脏以及乳腺)中表达的77氨基酸蛋白。包含变化大小的爱帕琳肽的C端片段的肽已显示激活G蛋白偶联受体APJ受体(Habata等人，1999，Biochem Biophys Acta 1452：25-35；Hosoya等人，2000，JBC，275(28)：21061-67；Lee等人，2000，J Neurochem 74：34-41；Medhurst等人，2003，J Neurochem 84：1162-1172)。多项研究指出，爱帕琳肽和类似物通过其与APJ受体(也称为APLNR)的相互作用传达心血管作用，如内皮依赖性血管舒张(Tatemoto等人，2001，Regul Pept 99：87-92)、正性肌力作用(Szokodi等人，2002，Circ Res 91：434-440；Maguire等人，2009，Hypertension 54：598-604，2009年7月13日在印刷版之前电子出版)以及心肌局部缺血和再灌注(Pisarenko等人，2013，J Pharmacol Pharmacother.“Effects of structural analogues of apelin-12 in acute myocardial infarction in rats”，印刷版之前的电子版)。具体说来，爱帕琳-13是可能通过增加心脏收缩性来提供心力衰竭的治疗的有效肌力剂(Dai等人，2006，Eur J Pharmacol 553(1-3)：222-228；Maquire等人，2009，Hypertension.54：598-604)。
[0008] 人类患者中手术前和手术后心室组织的转录表达谱披露APLNR是最显著上调-/-的基因(Chen等人，2003，Circulation，108：1432-39)。小鼠中的爱帕琳(爱帕琳 )-/-
和APJ(APJ )基因敲除研究表明，内源性爱帕琳-APJ途径的缺乏导致响应心血管应激(如锻炼)的能力降低(Charo等人，2009，Am J Physiol.Heart Circ.Physiol.，297：
H1904-1913)。
和APJ(APJ )基因敲除研究表明，内源性爱帕琳-APJ途径的缺乏导致响应心血管应激(如锻炼)的能力降低(Charo等人，2009，Am J Physiol.Heart Circ.Physiol.，297：
H1904-1913)。
[0009] 爱帕琳也已经在糖尿病和肥胖相关病症的胰岛素调节和机理中有所报道。在肥胖的小鼠模型中，爱帕琳是从脂肪细胞释放并且直接地通过胰岛素上调(Boucher等人，2005，Endocrinol 146：1764-71)。爱帕琳基因敲除小鼠证明减弱的胰岛素敏感性(Yue等人，2010，Am J Physiol Endocrinol Metab 298：E59-E67)。
[0010] APLNR调节剂也在HIV治疗中发现效用，因为合成爱帕琳肽抑制HIV-1进入CD4-APLNR表达细胞中(Cayabyab，M.等人，2000，J.Virol.74：11972-11976)。此外，APLNR抑制剂(即，能够阻断病理性血管生成)可适用于抑制视网膜中的肿瘤生长或血管形成(Kojima，Y.和Quertermous，T.，2008，Arterioscler Thromb Vasc Biol；28；1687-1 688；Rayalam，S.等人2011，Recent Pat Anticancer Drug Discov 6(3)：367-72)。爱帕琳神经保护也在其中爱帕琳-13、爱帕琳-17以及爱帕琳-36通过信号传导途径起作用之处可见以促进神经元存活(Cheng，B等人，2012，Peptides 37(1)：171-3)。
[0011] 在其它爱帕琳相关疾病中，APLNR结合剂适用于改善心血管疾病，以及癌症和糖尿病。因为爱帕琳肽快速地从循环中清除并且具有不超过八分钟的短血浆半衰期(Japp等人，2008，J of Amer College Cardiolog，52(11)：908-13)，所以爱帕琳目前是持续地给予以可见治疗效果。
[0012] 本领域中需要作为治疗剂的改进的爱帕琳结合剂，尤其是具有延长的半衰期同时维持APLNR结合活性的那些。
[0013] 发明概述
[0014] 本发明提供经过工程改造以递送生物学活性爱帕琳肽的爱帕琳融合蛋白，如融合至Fc结构域的爱帕琳。具体说来，爱帕琳融合蛋白与野生型爱帕琳肽相比具有改进的药物动力学特性，同时维持APLNR活性。
[0015] 本发明的一方面提供一种包含融合至多聚组分的爱帕琳肽的多肽。在一个实施方案中，所述多聚组分包含含有至少一个半胱氨酸残基的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述多聚组分包含含有亮氨酸拉链、螺旋-环基序、卷曲螺旋基序或免疫球蛋白源性结构域的氨基酸序列。在另一实施方案中，所述多聚组分包含含有Fc结构域的氨基酸序列。
[0016] 在一个相关方面，本发明提供包含融合至Fc结构域、Fc结构域的片段或Fc结构域的变体的爱帕琳肽的多肽。在一些情况下，所述多肽可为高阶结构(如蛋白或多聚复合物)的一部分。在一些实施方案中，所述爱帕琳肽经由一个或多个肽连接体融合至所述Fc结构域或其片段。在其它实施方案中，所述爱帕琳肽融合至所述Fc结构域或其片段的C端，或所述爱帕琳肽融合至所述Fc结构域或其片段的N端。
[0017] 在一个实施方案中，任何本文所述的爱帕琳融合蛋白的Fc结构域均包含免疫球蛋白CH2结构域或免疫球蛋白CH3结构域。在另一实施方案中，所述Fc结构域包含免疫球蛋白CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，所述Fc结构域选自由IgG1 CH2和CH3结构域、IgG4 CH2和CH3结构域、IgG1 CH2和IgG4 CH3结构域以及IgG4 CH2和IgG1 CH3结构域组成的组。在其它实施方案中，所述Fc结构域包含IgG铰链结构域。在其它实施方案中，所述Fc结构域包含选自由SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21以及SEQ ID NO：22组成的组的IgG铰链结构域。
[0018] 在另一实施方案中，所述多肽包含能够形成二聚体的单体融合多肽。在一些实施方案中，所述融合多肽与第二多肽形成至少一个二硫键。
[0019] 在另一相关方面，本发明提供爱帕琳受体(APNLR)结合分子，所述分子包含：爱帕琳肽组分、人类IgG Fc结构域以及至少一种连接体组分。在一些实施方案中，所述爱帕琳受体(APNLR)结合分子是APLNR激动剂，并且在其它情况下所述爱帕琳受体(APNLR)结合分子是APLNR拮抗剂。
[0020] 在本发明的另一方面，提供具有至少约1小时或至少约2、3、4、5、6、7、8、9或10小时或更长小时的血浆或血清体内半衰期的爱帕琳融合多肽或爱帕琳受体结合分子。
[0021] 在一些实施方案中，本发明的爱帕琳融合多肽或受体结合分子包含选自由爱帕琳42-77(爱帕琳-36)、爱帕琳61-77(爱帕琳-17)、爱帕琳63-77(爱帕琳-15)、爱帕琳64-77(爱帕琳-14)、爱帕琳65-77(爱帕琳-13)、爱帕琳66-77(爱帕琳-12)、爱帕琳67-77(爱帕琳-11)、爱帕琳68-77(爱帕琳-10)、爱帕琳73-77(爱帕琳-5)、爱帕琳61-76(爱帕琳-K16P)、爱帕琳61-75(爱帕琳-K15M)、爱帕琳61-74(爱帕琳-K14P)、爱帕琳-F13A、爱帕琳65-76、爱帕琳65-75、爱帕琳66-76、爱帕琳67-76、爱帕琳66-75、爱帕琳
1
67-75以及[Pyr]爱帕琳-13组成的组的爱帕琳肽。
1
67-75以及[Pyr]爱帕琳-13组成的组的爱帕琳肽。
[0022] 在某些方面，所述爱帕琳融合多肽或爱帕琳受体结合分子是血清稳定蛋白。在一些实施方案中，所述多肽具有与包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列95％或96％或97％或98％或99％或更大的序列同一性。在其它方面，所述多肽包含与SEQ ID NO：
2或SEQ ID NO：4至少99％同一的氨基酸序列。在其它方面，所述多肽具有包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在其它方面，所述多肽具有选自由SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40以及SEQ ID NO：41组成的组的氨基酸序列。
2或SEQ ID NO：4至少99％同一的氨基酸序列。在其它方面，所述多肽具有包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列。在其它方面，所述多肽具有选自由SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40以及SEQ ID NO：41组成的组的氨基酸序列。
[0023] 在 某 些 方 面，本 发 明 提 供 一 种 重 组 多 肽，其 中 所 述多 肽 包 含N’-P1m-X1n-X2-X3-P2-A1-C’，其中：N’是所述多肽的N端并且C’是所述多肽的C端；P1是肽连接体；X1包含IgG铰链结构域；X2包含IgG CH2结构域；X3包含IgG CH3结构域；P2是肽连接体；并且A1是包含人类爱帕琳肽或其片段或衍生物的氨基酸序列；其中m＝0或1，并且n＝0或1。
[0024] 在 某 些 方 面，本 发 明 提 供 一 种 重 组 多 肽，其 中 所 述多 肽 包 含N’-A1-P2-X1n-X2-X3-C’，其中：N’是所述多肽的N端并且C’是所述多肽的C端；A1是包含人类爱帕琳肽或其片段或衍生物的氨基酸序列；P2是肽连接体；X1包含IgG铰链结构域；X2包含IgG CH2结构域；并且X3包含IgG CH3结构域；其中n＝0或1。
[0025] 在第二方面，本发明提供编码本发明的任何爱帕琳融合多肽或爱帕琳受体结合分子的核酸分子。在一个实施方案中，所述核酸分子具有选自由SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28组成的组的序列。在其它实施方案中，所述核酸分子编码选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40以及SEQ ID NO：41组成的组的氨基酸序列。
[0026] 在第三方面，本发明提供包含编码本发明的爱帕琳融合多肽或爱帕琳受体结合分子的核酸分子的载体和细胞。在一个实施方案中，所述载体编码连接至信号肽序列的核酸分子。
[0027] 本发明还提供编码包含编码信号肽的核苷酸序列的爱帕琳融合蛋白的载体。本发明进一步提供编码爱帕琳融合蛋白的载体，所述融合蛋白包含编码肽连接体的核苷酸序列，所述核苷酸序列融合至位于所述融合蛋白的上游的信号肽的C端。
[0028] 在第四方面，本发明提供一种用于确定测试分子的APLNR活性的方法，使表达APLNR的细胞与本发明的爱帕琳融合蛋白在与所述测试分子相同的测试条件下接触，以确定所述测试分子是APLNR激动剂或APLNR拮抗剂。
[0029] 在一个实施方案中，本发明提供一种用于确定APLN受体(APLNR)的激活的方法，所述方法包括：(a)使表达APLNR的细胞与测试分子在允许所述APLNR的激活的条件下接触，(b)测量APLNR活性，(c)单独地使表达APLNR的细胞与本发明的爱帕琳融合蛋白在与步骤(a)中相同的条件下接触，(d)以与步骤(b)相同的方式测量步骤(c)中的所述细胞的APLNR活性，其中与步骤(d)中APLNR活性的测量相比步骤(b)中APLNR活性的测量确定所述测试分子激活所述APLNR。
[0030] 本发明的另一方面提供一种制造包含爱帕琳的融合蛋白的方法，所述方法包括：(a)用编码所述融合蛋白的核酸分子转染宿主细胞，其中所述核酸分子包含编码信号肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列融合至i)在爱帕琳肽的N端连接至编码所述爱帕琳肽的核苷酸序列的编码人类IgG的Fc结构域的核苷酸序列，或ii)在Fc结构域的N端连接至编码人类IgG的所述Fc结构域的核苷酸序列的编码爱帕琳肽的核苷酸序列，以及(b)通过在所述宿主细胞中表达(a)的所述核酸分子来制造所述融合蛋白。本发明提供分泌本发明的融合蛋白至细胞培养基中的宿主细胞。
[0031] 另一方面，本发明提供一种用于治疗有需要的受试者中与爱帕琳有关的疾病或病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的爱帕琳融合蛋白。本发明还提供一种用于治疗选自由心血管疾病、急性失代偿性心力衰竭、充血性心力衰竭、心肌梗塞、心肌病、缺血、缺血/再灌注损伤、肺动脉高血压、糖尿病、肥胖、癌症、转移性疾病、流体稳态、病理性血管生成、视网膜病、纤维化以及HIV感染组成的组的疾病或病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的爱帕琳融合蛋白。
[0034] 图1A描绘hFc-爱帕琳融合蛋白的组分，如氨基酸序列SEQ ID NO：2。所述序列SEQ ID NO：2是由(从N端至C端)人类IgG1 Fc(加下划线)、G4S重复肽连接体(斜体)以及爱帕琳-13(加双下划线)组成。
[0035] 图1B表示呈均二聚体形式的分泌的Fc-爱帕琳融合蛋白和其组分。
[0036] 图2A描绘爱帕琳-hFc融合蛋白的组分，如氨基酸序列SEQ ID NO：4。所述序列SEQ ID NO：4是由(从N端至C端)爱帕琳-13(加双下划线)、G4S重复肽连接体(斜体)以及人类IgG1 Fc(加下划线)组成。
[0037] 图2B表示呈均二聚体形式的分泌的爱帕琳-Fc融合蛋白和其组分。
[0038] 图3A说明SDS-PAGE凝胶上爱帕琳Fc融合蛋白的迁移和蛋白阶梯控制。泳道1＝蛋白标志物测量值(31和38kD)；泳道2＝hFc-爱帕琳-13(SEQ ID NO：2)；泳道3＝爱帕琳13-hFc蛋白(SEQ ID NO：4)；泳道4＝仅hFc。
[0040] 图4表示在CRE-luc测定中通过测量表达APJ(APNLR)的细胞中毛喉素诱导的cAMP反应所获得的以下配体中每一者的剂量反应曲线和半最大浓度(EC50)：爱帕琳-13(-●-)、hFc-爱帕琳13(-■-)或爱帕琳13-hFc(-◆-)。
[0041] 图5表示在β-抑制蛋白测定中以下配体中每一者的剂量反应曲线和半最大浓度(EC50)：爱帕琳-13(-●-)、hFc-爱帕琳13(-■-)、爱帕琳13-hFc(-▲-)或仅hFc
[0042] 图6表示与hFc(-▲-)相比，hFc-爱帕琳13(-●-)或爱帕琳13-hFc(-■-)的标准化p-ERK测定剂量反应曲线和半最大浓度(EC50)，显示两种配体均激活APNLR表达细胞。
[0043] 图7A显示在皮下给予的C57/B16小鼠的血清中2.8mg/kg爱帕琳13-hFc(-■-)的稳定性，与单独hFc(-●-)的含量相比，所述爱帕琳13-hFc在长达48小时内达到约10μg/mL的含量。
[0044] 图7B显示在皮下给予的C57/B16小鼠的血清中5mg/kg hFc-爱帕琳13(-●-)的稳定性，所述hFc-爱帕琳13在24小时之时达到3μg/mL并且在约14天时逐渐降低至1μg/mL。
[0045] 发明详述
[0046] 应了解，本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为所述方法和条件可改变。还应了解，本说明书中所用的术语是出于仅描述特定实施方案的目的，且不意图为限制性的，因为本发明的范围是由权利要求书限定。
[0047] 如本说明书和随附权利要求书中所用，除非上下文另外清楚指示，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”以及“所述(the)”包括多个提及物。因此，举例来说，对“一种方法”的提及包括一种或多种方法，和/或本文所述的类型和/或所述方法的步骤在本领域技术人员阅读本公开后将变得显而易知。
[0048] 除非另外定义，否则本申请中所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管类似于或等效于本说明书中所述的方法和材料的任何方法和材料均可用于实践本发明，但现在描述特定方法和材料。本文所提及的所有公布均以引用的方式整体并入本文。
[0049] 融合蛋白
[0050] 术语“免疫球蛋白”(Ig)是指一类结构上相关的糖蛋白，所述糖蛋白是由两对多肽链组成，即一对轻(L)链和一对重(H)链，所述链可四者均由二硫键互连。免疫球蛋白的结构已经得到充分表征。参见例如Fundamental Immunology第7章(Paul，W.编，第2版Raven Press，N.Y.(1989))。各重链典型地包含重链可变区(本文中缩写为VH或VH)和重链恒定区(CH或CH)。重链恒定区典型地包含三个结构域CH1、CH2以及CH3。所述CH1和CH2结构域是由铰链连接。Fc部分至少包含CH2和CH3结构域。
[0051] 典型地，免疫球蛋白的氨基酸残基的编号是根据IMGT，Sequenc es of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Serv ice，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)，或依据Ka bat的EU编号系统(还称作“EU编号”或“EU索引”)，例如在Kabat，E.A.等人Sequences of Proteins of Immunological interest.第5版US Department of Health and Human Services，NIH公布号91-3242(1991)中。
[0052] 如本说明书中所用，“多聚组分”是具有与相同或相似结构或构造的第二多聚组分缔合的能力的任何大分子、蛋白、多肽、肽或氨基酸。例如，多聚组分可为包含免疫球蛋白CH3结构域的多肽。多聚组分的非限制性实例是免疫球蛋白的Fc部分，例如选自同种型IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4的IgG的Fc结构域，以及在各同种型群组内的任何同种异型。在某些实施方案中，所述多聚组分是含有至少一个半胱氨酸残基的1至约500个氨基酸长的Fc片段或氨基酸序列。在其它实施方案中，所述多聚组分是半胱氨酸残基，或短的含半胱氨酸的肽。其它多聚结构域包括包含亮氨酸拉链、螺旋-环基序或卷曲螺旋基序或由亮氨酸拉链、螺旋-环基序或卷曲螺旋基序组成的肽或多肽。
[0053] 术语“Fc”是指重链恒定区中至少包含CH2和CH3结构域的一部分，所述部分典型地结合于Fc受体，例如FcγR，即FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)或FcRn(即新生儿Fc受体)。如果所述CH2和CH3区含有使其不能结合任何Fc受体的缺失、取代和/或插入或其它修饰，那么所述CH2和CH3区在其典型生物功能方面被视为非功能性的。
[0054] 措词“融合蛋白”和具体说来“爱帕琳融合蛋白”包括衍生自爱帕琳的重组多肽和蛋白，其已经过工程改造以含有如本文所述的多聚组分。
[0055] 措词“Fc融合蛋白”和具体说来“爱帕琳-Fc”或“Fc-爱帕琳”融合蛋白包括衍生自爱帕琳的重组多肽和蛋白，其已经过工程改造以含有如本文所述的Fc片段。例如，“爱帕琳Fc融合蛋白”包括包含爱帕琳肽或类似物的氨基酸序列的嵌合蛋白，所述氨基酸序列融合至Ig的Fc结构域的氨基酸序列的N端或C端，具有或不具有肽连接体。用于融合蛋白的肽的实例为本领域中已知的(参见例如Dumont等人，2006，Biodrugs 20(3)：150-160)。Fc融合蛋白在本领域中还称作免疫粘合素。
[0056] 如本文所用的措词“融合至”意指(但不限于)通过表达通过组合超过一个序列，典型地通过将一种基因与第二基因同框架克隆至表达载体中，使得所述两种基因编码一种连续多肽而制造的嵌合基因所形成的多肽。除了通过重组技术制造，多肽的部分还可借助于化学反应，或本领域中已知用于制造定制多肽的其它方式“融合至”彼此。
[0057] 术语“蛋白”意在包括由至少一种多肽构成的四级结构、三级结构以及其它复合大分子。术语“蛋白”包括多肽。
[0058] 如本文所用，“多肽”是通过相邻氨基酸残基的羧基与氨基之间的肽键键结在一起的氨基酸的单一线性聚合物链。术语“蛋白”也可用于描述大的多肽，如七跨膜结构域蛋白。
[0059] 本发明多肽包含源自免疫球蛋白结构域的氨基酸序列。“源自”指定蛋白或多肽的多肽或氨基酸序列是指所述多肽的起源。如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别或子类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)。
[0060] 如本文所用的措词“重链”或“免疫球蛋白(Ig)重链”包括来自任何生物体的Ig重链恒定区序列，并且除非另外规定，否则包括重链可变结构域。除非另外规定，否则重链可变结构域包括三个重链互补决定区(CDR)和四个构架区(FR)。重链可变结构域的片段包括CDR，或CDR和FR。典型重链恒定区(CH)具有(在所述可变结构域后，从N端至C端)：CH1结构域、铰链、CH2结构域以及CH3结构域。重链(例如，在抗原结合蛋白中)的功能片段包括能够特异性识别抗原(例如，以在微摩尔、纳摩尔或皮摩尔范围内的KD识别所述抗原)，能够在细胞中表达并且由细胞分泌，以及包含至少一个CDR的片段。
[0061] 基于流式细胞术的自体分泌陷阱(FASTR)方法可用于快速地分离表达或分泌抗体或Fc融合蛋白的高表达克隆，所述方法利用膜结合人类Fcγ受体(hFcγR)来捕捉共同分泌的蛋白。(参见US20090137416 A1，其以引用的方式并入本文。)所述高表达克隆可用于分离表达包含如本文所述的Fc融合蛋白的蛋白的细胞。FASTR方法可用于直接筛选并分离表达本发明的任何重组多肽或Fc融合蛋白的细胞。
[0062] 如本文所用的术语“铰链”意图包括连接免疫球蛋白的CH1的C端至CH2结构域的N端的连续氨基酸残基的区域。CH2结构域的N端由CH2外显子编码的若干氨基酸也被视为“下部铰链”的一部分。不受任何一种理论束缚，IgG1、IgG2以及IgG4的铰链区的氨基酸已经表征为包含由独特铰链外显子编码的12-15个连续氨基酸，和CH2结构域的若干N端氨基酸(由CH2外显子编码)(Brekke，O.H.等人，1995，Immunology Today 16(2)：85-90)。另一方面，IgG3包含由四个区段组成的铰链区：类似IgG1的铰链区的一个上部区段，和IgG3所独有的3个区段，所述3个区段是同一氨基酸重复序列。
[0063] 源自Ig结构域(如人类IgG)的氨基酸残基在本文中是由Kabat的EU编号系统(还称作“EU编号”或“EU索引”)(根据Kabat，E.A.等人Sequences of Proteins of Immunological interest.第5版US Depart ment of Health and Human Services，NIH公布号91-3242，1991，并且根据以下更新： Scientific Chart， the
international ImMunoGeneTics information http：//www.imgt.org/IMGTS
cientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html，创建：2001年5月17日，最近一次更新：
2013年1月10日)鉴定。
international ImMunoGeneTics information http：//www.imgt.org/IMGTS
cientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html，创建：2001年5月17日，最近一次更新：
2013年1月10日)鉴定。
[0064] 举例来说，用于人类IgG1铰链氨基酸的EU编号和相应的IMGT独特编号惯例以及Kabat编号惯例(根据Kabat，E.A.等人，1991，和 Scientific Chart，同上)列于表1中。
[0065] 表1：IgG1铰链编号
[0066]
[0067]
[0068] 表2：IgG1 C结构域铰链编号
[0069]
[0070] 由外显子剪接产生的氨基酸显示于括号中。
[0071] a根据最近一次更新的IMGT Scientific Chart编号
[0072] b根据最初在Kabat，EA等人1991中报道的EU索引编号
[0073] 还参见例如Lefranc，M.-P.等人，Devel Comp Immunol，29，185-203(2005)；和Edelman，G.M.等人PNAS USA，63：78-85(1969)。
[0074] 在一个实施方案中，本发明的Fc融合蛋白包含Fc结构域或任何Fc结构域片段或任何Fc结构域变体。在一些实施方案中，所述Fc结构域包含Ig CH2和Ig CH3结构域，或其片段或变体。在其它实施方案中，所述Fc结构域包含Ig铰链结构域或其片段或变体、Ig CH2结构域或其片段或变体以及Ig CH3结构域或其片段或变体。在其它实施方案中，所述Fc结构域包含Ig CH1结构域或其片段或变体、Ig铰链结构域或其片段或变体、Ig CH2结构域、其片段或变体以及Ig CH3结构域、其片段或变体。
[0075] 如本文所用的术语“嵌合”意指由不同起源的部分构成。措词“嵌合蛋白”涵盖“嵌合多肽”，其包括连接至实际上通常不连接的第二氨基酸多肽的第一氨基酸多肽。所述氨基酸序列通常可作为个别多肽存在或以不同布置存在于同一多肽或蛋白上，并且在呈新的布置的融合多肽中组合。
[0076] 所述Fc结构域可为嵌合的，从而组合源自超过一种免疫球蛋白同种型的Fc序列。例如，嵌合Fc结构域可包含源自人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4 CH2区的CH2序列的一部分或全部，和源自人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4的CH3序列的一部分或全部。嵌合Fc结构域也可含有嵌合铰链区。例如，嵌合铰链可包含源自人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4铰链区的“上部铰链”序列，所述序列与源自人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4铰链区的“下部铰链”序列组合。嵌合Fc结构域可具有改变的Fc受体结合，其又影响Fc效应功能。
[0077] 关于某些疗法，所述Fc结构域可经过工程改造以实现正常Fc效应功能的全部、一些或不实现正常Fc效应功能，而不影响所需的Fc融合蛋白的药物动力学特性。因此，具有改变的Fc受体结合的经过工程改造的Fc结构域可具有减少的副作用。因此，在一个实施方案中，所述蛋白包含嵌合或在其它方面修饰的Fc结构域。关于嵌合Fc结构域的实例，参见2013年2月1日提交的美国临时申请号61/759,578，其整体并入本文。
[0078] 本发明还提供包含变体Fc结构域序列的爱帕琳Fc融合蛋白。所述“变体”Fc结构域和Fc结构域片段在与野生型序列比较时包含一个或多个氨基酸添加、缺失或取代，但基本上视需要起作用，例如展现APLNR活性并且延长如本说明书中所述的融合蛋白的半衰期。
[0079] 在一些实施方案中，所述Fc结构域包含IgG CH2和CH3结构域。在其它实施方案中，所述Fc结构域包含IgG1 CH2和CH3结构域、IgG4 CH2和CH3结构域、IgG1 CH2结构域和IgG4 CH3结构域或IgG4 CH2结构域和IgG1 CH3结构域。在一些实施方案中，所述Fc结构域是包含选自由CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域以及CH3结构域组成的组的片段的嵌合Fc结构域，其中所述片段是源自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM。在一些实施方案中，所述嵌合Fc结构域包含选自由SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19以及SEQ ID NO：23组成的组的CH2结构域。在一些实施方案中，所述嵌合Fc结构域包含选自由SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：20以及SEQ ID NO：24组成的组的CH3结构域。在另一实施方案中，所述Fc结构域包含嵌合IgG CH2-CH3结构域。因此，所述Fc结构域的变体和片段也是本发明的一部分。
[0080] 在一个实施方案中，所述Fc结构域包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4铰链结构域。在一个实施方案中，所述铰链结构域包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22。在另一实施方案中，所述Fc结构域包含嵌合铰链结构域。在另一实施方案中，所述Fc结构域包含包含选自由SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18以及SEQ ID NO：22组成的组的铰链片段的嵌合铰链结构域。
[0081] 根据本发明的某些实施方案，提供包含Fc结构域的Fc融合蛋白，所述Fc结构域包含一种或多种突变，所述突变增强或减弱蛋白结合于FcRn受体，例如在酸性pH下与中性pH相比。例如，本发明包括在Fc结构域的CH2或CH3区中包含突变的Fc融合蛋白，其中所述突变在酸性环境中(例如，在其中pH介于约5.5至约6.0范围内的核内体中)增加所述Fc结构域对FcRn的亲和力。当施用于动物时，所述突变可引起抗体的血清半衰期增加。所述Fc修饰的非限制性实例包括例如在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；
252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)以及256(例如S/R/Q/E/D或T)处的修饰；或在位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)处的修饰；或
在位置250和/或428处的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)以及434处的修饰。在一个实施方案中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、
259I(例如V259I)以及308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254以及256(例如252Y、254T以及256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)。
252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)以及256(例如S/R/Q/E/D或T)处的修饰；或在位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)处的修饰；或
在位置250和/或428处的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)以及434处的修饰。在一个实施方案中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、
259I(例如V259I)以及308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254以及256(例如252Y、254T以及256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)。
[0082] 例如，本发明包括包含Fc结构域的Fc融合蛋白，所述Fc结构域包含一或多对或一组或多组选自由以下组成的组的突变：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T以及256E(例如M252Y、S254T以及T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；以及433K和434F(例如H433K和N434F)。前述Fc结构域突变的所有可能组合和在本文所公开的融合蛋白内的其它突变涵盖于本发明的范围内。
[0083] Fc融合蛋白的Fc结构域的修饰可赋予增强的稳定性，如对降解的抗性。融合蛋白可使用普通分子生物学技术和合成化学来修饰以便改进其对蛋白水解裂解的抗性或对金属离子相关裂解的抗性。所述多肽的类似物包括通过将一种氨基酸交换成另一氨基酸或用除天然存在的L-氨基酸外的残基(例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸)进行取代所制造的取代变体。
[0084] 在一个实施方案中，本发明的Fc融合蛋白包含融合至如本文所述的Fc结构域的爱帕琳肽。
[0085] 在一些实施方案中，本发明的Fc融合蛋白激活APLNR受体并且具有比未融合至Fc结构域的爱帕琳肽的半衰期长的半衰期，如超过八分钟的较长半衰期。
[0086] 爱帕琳配体和爱帕琳受体
[0087] 爱帕琳是作为77个氨基酸的前体肽原内源产生，所述前体肽原裂解生成若干较短的生物学活性片段或爱帕琳肽。
[0088] 在一些实施方案中，本发明的Fc融合蛋白包含如本文所述的爱帕琳肽。
[0089] 在一些实施方案中，所述爱帕琳肽包含爱帕琳前体肽原多肽(SEQ ID NO：5)的片段或衍生物。
[0090] “爱帕琳肽”包括本领域中已知的特定爱帕琳片段和衍生物，例如包含爱帕琳前体肽原多肽(SEQ ID NO：5)的氨基酸6-77、40-77、42-77、43-77、47-77、59-77、61-77、63-77、64-77、65-77、66-77、67-77、73-77、1-25、6-25、42-64、61-64、61-74、61-75、61-76、65-76、
65-75、66-76、67-76、66-75、67-75、42-58、42-57、42-56、42-55、42-54、42-53或焦谷氨酸化
1
爱帕琳65-77([Pyr]爱帕琳-13)的爱帕琳肽。参见例如2002年12月10日发布的美国专利号6492324，和El Messari等人2004，J Neurochem，90：1290-1301，其均以引用的方式并入本文。在一个实施方案中，所述爱帕琳肽包含SEQ ID NO：5的氨基酸65-76、65-75、
61-77、63-77、64-77、65-77、66-77、67-77、66-76、67-76、66-75、67-75或42-77。
65-75、66-76、67-76、66-75、67-75、42-58、42-57、42-56、42-55、42-54、42-53或焦谷氨酸化
1
爱帕琳65-77([Pyr]爱帕琳-13)的爱帕琳肽。参见例如2002年12月10日发布的美国专利号6492324，和El Messari等人2004，J Neurochem，90：1290-1301，其均以引用的方式并入本文。在一个实施方案中，所述爱帕琳肽包含SEQ ID NO：5的氨基酸65-76、65-75、
61-77、63-77、64-77、65-77、66-77、67-77、66-76、67-76、66-75、67-75或42-77。
[0091] 本文中已经证明爱帕琳肽的片段(例如具有C端缺失的肽)保留其细胞活性(还参见El Messari等人2004，J Neurochem，90：1290-1301)。某些爱帕琳肽衍生物在本文中显示保留其细胞活性，如具有额外一个或多个C端氨基酸的爱帕琳肽和融合物。因而，本说明书中所述的爱帕琳肽的片段和衍生物包括于本发明中。爱帕琳肽的其它片段和衍生物可由熟练技术人员通过重组技术制造。
[0092] 在其它实施方案中，所述爱帕琳肽选自由爱帕琳40-77(爱帕琳-38)、爱帕琳42-77(爱帕琳-36)、爱帕琳43-77(爱帕琳-35)、爱帕琳47-77(爱帕琳-31)、爱帕琳59-77(爱帕琳-19)、爱帕琳61-77(爱帕琳-17)、爱帕琳63-77(爱帕琳-15)、爱帕琳64-77(爱帕琳-14)、爱帕琳65-77(爱帕琳-13)、爱帕琳66-77(爱帕琳-12或A12)、爱帕琳67-77(爱帕琳-11)、爱帕琳68-77(爱帕琳-10)、爱帕琳73-77(爱帕琳-5)、爱帕琳
61-76(爱帕琳-K16P)、爱帕琳61-75(爱帕琳-K15M)、爱帕琳61-74(爱帕琳-K14P)以及
1
[Pyr]爱帕琳-13组成的组。
61-76(爱帕琳-K16P)、爱帕琳61-75(爱帕琳-K15M)、爱帕琳61-74(爱帕琳-K14P)以及
1
[Pyr]爱帕琳-13组成的组。
[0093] 在其它实施方案中，所述爱帕琳肽选自由爱帕琳61-77(爱帕琳-17；SEQ ID NO：7)、爱帕琳65-77(爱帕琳-13；SEQ ID NO：6)、爱帕琳-F13A(SEQ ID NO：29)、爱帕琳
66-77(爱帕琳-12或A12，SEQ ID NO：32)、爱帕琳67-77(爱帕琳-11；SEQ ID NO：33)、爱帕琳65-76(SEQ ID NO：30)、爱帕琳65-75SEQ ID NO：31)、爱帕琳67-77(SEQ ID NO：6)、爱帕琳66-76(SEQ ID NO：34)、爱帕琳67-76(SEQ ID NO：35)、爱帕琳66-75(SEQ ID NO：36)、
1
爱帕琳67-75(SEQ ID NO：37)以及[Pyr]爱帕琳-13组成的组。
66-77(爱帕琳-12或A12，SEQ ID NO：32)、爱帕琳67-77(爱帕琳-11；SEQ ID NO：33)、爱帕琳65-76(SEQ ID NO：30)、爱帕琳65-75SEQ ID NO：31)、爱帕琳67-77(SEQ ID NO：6)、爱帕琳66-76(SEQ ID NO：34)、爱帕琳67-76(SEQ ID NO：35)、爱帕琳66-75(SEQ ID NO：36)、
1
爱帕琳67-75(SEQ ID NO：37)以及[Pyr]爱帕琳-13组成的组。
[0094] 在一些实施方案中，所述爱帕琳肽是经过修饰以使降解减至最少并且增强血清稳定性。在某些实施方案中，经过修饰的爱帕琳肽选自由SEQ ID NO：38(爱帕琳-13+5G)、SEQ ID NO：42(爱帕琳-13+R)、SEQ ID NO：43(爱帕琳-13+S)以及SEQ ID NO：44(爱帕琳-13+H)组成的组。
[0095] 在一个实施方案中，所述爱帕琳肽选自由爱帕琳-36(SEQ ID NO：8)、爱帕1
琳-17(SEQ ID NO：7)、爱帕琳-13(SEQ ID NO：6)以及[Pyr]爱帕琳-13组成的组。在另一实施方案中，所述爱帕琳肽包含爱帕琳-13(SEQ ID NO：6)或其片段。
琳-17(SEQ ID NO：7)、爱帕琳-13(SEQ ID NO：6)以及[Pyr]爱帕琳-13组成的组。在另一实施方案中，所述爱帕琳肽包含爱帕琳-13(SEQ ID NO：6)或其片段。
[0096] 爱帕琳肽快速地从循环中清除并且具有不超过八分钟的短血浆半衰期(Japp等人，2008，J of Amer College Cardiolog，52(11)：908-13)。本发明的爱帕琳融合蛋白与爱帕琳肽相比具有增加的半衰期。
[0097] 本发明中包括经过修饰以包括非标准氨基酸或经过修饰的氨基酸的爱帕琳类似物。所述含有非天然或天然但非编码的氨基酸的肽可通过人工修饰的遗传密码来合成，在所述遗传密码中一个或多个密码子被指派为编码并非标准氨基酸之一的氨基酸。举例来说，所述遗传密码编码20种标准氨基酸，但三种额外蛋白氨基酸在特定情况下实际上存在：硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸以及N-甲酰基-甲硫氨酸(Ambrogelly等人2007，Nature Chemical Biology，3：29-35； A.等人，1991，TIBS，16(12)：463-467；以及Théobald-Dietrich，A.等人，2005，Biochimie，87(9-10)：813-817)。还包括翻译后修饰的氨基酸，如羧基谷氨酸(γ-羧基谷氨酸)、羟基脯氨酸以及(4-氨基-2-羟丁基)-L-赖氨酸(hypusine)。其它非标准氨基酸包括但不限于瓜氨酸、4-苯甲酰基苯丙氨酸、氨基苯甲α酸、氨基己酸、N -甲基精氨酸、α-氨基-正丁酸、正缬氨酸、正亮氨酸、别异亮氨酸、叔亮氨酸、α-氨基-正庚酸、哌可酸、α，β-二氨基丙酸、α，γ-二氨基丁酸、鸟氨酸、别苏氨酸、高丙氨酸、高精氨酸、高天冬酰胺、高天冬氨酸、高半胱氨酸、高谷氨酸、高谷氨酰胺、高异亮氨酸、高亮氨酸、高甲硫氨酸、高苯丙氨酸、高丝氨酸、高酪氨酸、高缬氨酸、异哌啶酸、β-丙氨酸、β-氨基-正丁酸、β-氨基异丁酸、γ-氨基丁酸、α-氨基异丁酸、异缬氨酸、肌氨酸、萘基丙氨酸、哌啶甲酸、N-乙基甘氨酸、N-丙基甘氨酸、N-异丙基甘氨酸、N-甲基丙氨酸、N-乙基丙氨酸、N-甲基β-丙氨酸、N-乙基β-丙氨酸、八氢吲哚-2-甲酸、青霉胺、焦谷氨酸、肌氨酸、叔丁基甘氨酸、四氢-异喹啉-3-甲酸、异丝氨酸以及α-羟基-γ-氨基丁酸。扩展遗传密码的多种形式为本领域中已知的并且可用于实践本发明。(参见例如Wolfson，W.，2006，Chem Biol，13(10)：1011-12。)
[0098] 并入所述非标准氨基酸或翻译后修饰的爱帕琳类似物可通过已知方法合成。示α 75例性爱帕琳类似物包括N -甲基精氨酸-爱帕琳-A12类似物、[Nle ，Tyr]爱帕琳-36、
65 75 77 1 1
[Glp Nle ，Tyr ]爱帕琳-13、(Pyr)[Met(O)11]-爱帕琳-13、(Pyr)-爱帕琳-13、
12
[d-Ala ]-A12以及N-α-乙酰基-九-D-精氨酰胺乙酸盐。
65 75 77 1 1
[Glp Nle ，Tyr ]爱帕琳-13、(Pyr)[Met(O)11]-爱帕琳-13、(Pyr)-爱帕琳-13、
12
[d-Ala ]-A12以及N-α-乙酰基-九-D-精氨酰胺乙酸盐。
[0099] 本发明中还包括爱帕琳融合蛋白的爱帕琳组分的类似物，所述类似物经过修饰以抵抗裂解，例如由血管紧张素转化酶2(ACE2)引起的裂解。所述爱帕琳类似物已经显示在对缺血的心肌反应的体内模型中与未修饰的爱帕琳配体相比具有显著增加的疗效(Wang等人2013年7月1日，J Am Heart Assoc.2：e000249)。
[0100] 所述免于裂解的爱帕琳融合蛋白包含经过修饰以包括取代变体(即通过在蛋白内的一个或多个裂解位点处将一种氨基酸交换为另一氨基酸所制造的变体)的爱帕琳肽。设想所述氨基酸取代赋予增强的稳定性而无蛋白的其它功能或特性的损失。其它免于裂解的爱帕琳融合蛋白包含经过修饰以包括末端酰胺或乙酰基的爱帕琳肽。在一些实施方案中，免于裂解的爱帕琳融合蛋白包含蛋白氨基酸、非标准氨基酸或翻译后修饰的氨基酸。其它免于裂解或抵抗裂解的爱帕琳融合蛋白包含包括一个或多个额外N端氨基酸的经过修饰的爱帕琳肽。可需要所述经过修饰的爱帕琳肽不改变所述肽激活APLNR的能力。激活APLNR的本发明示例性经过修饰的爱帕琳肽和融合蛋白包括SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43以及SEQ ID NO：44。
[0101] 已知如上文所提及的爱帕琳是APLNR(G蛋白偶联受体)的配体。如本文所用的术语“配体”意指结合于另一分子(如受体)的分子。能够结合于G蛋白偶联受体(GPCR)的配体分子选自由离子、小有机分子、肽、多肽、抗体、双特异性抗体、抗体片段、蛋白以及大有机分子组成的组。配体可进一步表征为例如激动剂、部分激动剂、反向激动剂、拮抗剂、竞争性拮抗剂、正性别构调节剂或负性别构调节剂，视其通过其结合的受体赋予的活性的状态而定。例如，对于结合于GPCR的激动剂，使所述GPCR保持非活性状态的其它分子相互作用受到破坏。
[0102] 如本文所用的术语“激动剂”包括与(直接地或间接地结合)受体(如APLNR受体)相互作用并且激活所述受体的部分，并且所述部分启动所述受体特有的生理学或药理学反应，如在结合于其内源配体时。例如，在结合于GPCR后，部分可激活细胞内反应，增强GTP结合于细胞膜，或内化所述受体。所述激动剂部分可例如为蛋白、多肽、肽、抗体、抗体片段、大分子或小分子。
[0103] 如本文所用的术语“拮抗剂”意图意指与激动剂竞争性结合于受体的相同位点(例如内源配体)，但不激活由所述受体的活性形式启动的细胞内反应并且由此抑制由激动剂或部分激动剂引起的细胞内反应的部分。在一些情况下，拮抗剂在激动剂或部分激动剂不存在下不会减弱基线细胞内反应。拮抗剂不一定必须用作竞争性结合抑制剂，而是可通过隐蔽激动剂或间接地调节下游效应起作用。
[0104] G蛋白偶联受体(GPCR)是七跨膜结构域受体，其典型地经由异源三聚鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)转导其细胞信号，所述蛋白是由α(alpha)、β(beta)以及γ(gamma)亚单位组成，而所述α亚单位含有针对GTP/GDP的结合位点，并且βγ二聚体是以非活性状态结合于所述α亚单位。G蛋白天然地存在于质膜的细胞质侧。细胞外配体的结合导致受体蛋白的构象变化，从而允许其与鸟嘌呤-核苷酸结合蛋白(G蛋白)接触，并且因此增强GTP交换为GDP。在交换后，所述βγ二聚体从所述α亚单位解离。所述激活的α亚单位和所述βγ二聚体均可影响细胞内效应蛋白。
[0105] 一般说来，GPCR激活特定的Gα蛋白亚单位家族，从而导致特定信号转导途径的激活或失活。所述爱帕琳受体(APLNR)是GPCR。
[0106] 在与配体或结合分子相互作用后，所述爱帕琳受体(APLNR)触发若干细胞内信号传导级联中的一者或多者，包括通过以下启动的信号传导：1)抑制G蛋白亚单位Gαi/o，2)通过PKC激活ERK，或3)GPCR的内化。换句话说，APLNR在其活性状态下的药理学和/或生理学反应是通过Gαi亚单位(其例如抑制腺苷酰基环化酶)、磷酸化ERK或内化的APLNR的下游作用来确定。应理解，其它细胞内效应子可由激活的APLNR接合。
[0107] 最初命名为APJ受体(O’Dowd等人，1993，Gene 136(1-2)：355-360)的爱帕琳受体(APLNR)是作为380个氨基酸的7跨膜结构域孤儿受体从人类基因组DNA分离的。(参见NCBI RefSeq No.NP_005152，其以引用的方式并入本文。)当来自牛胃的组织提取物展现在表达0.1-100nM范围内的APLNR(APJ)的CHO细胞中刺激酸化速率的爱帕琳肽时，爱帕琳显示为APLNR(APJ)的内源配体(Tatemoto等人，1998，Biochem Biophys Res Comm 251：471-476)。
[0108] 爱帕琳与APLNR之间的相互作用和因此爱帕琳融合蛋白与APLNR之间的相互作用可通过相关领域的技术人员已知的多种体外(例如，如在试管或板中)、离体(例如，如在来自活动物的细胞培养物中)以及体内(例如，如在活动物中)生物测定来测量。
[0109] 在一些实施方案中，APLNR激动剂选自由爱帕琳-36、爱帕琳-19、爱帕琳-17、爱α 75帕琳-13、爱帕琳-12、N -甲基精氨酸-爱帕琳-A12类似物、[Nle ，Tyr]爱帕琳-36、
65 75 77 1 1
[Glp Nle ，Tyr ]爱帕琳-13、(Pyr)[Met(O)11]-爱帕琳-13以及(Pyr)-爱帕琳-13组成的组。
65 75 77 1 1
[Glp Nle ，Tyr ]爱帕琳-13、(Pyr)[Met(O)11]-爱帕琳-13以及(Pyr)-爱帕琳-13组成的组。
[0110] 在一个实施方案中，所述爱帕琳融合多肽选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40以及SEQ ID NO：41组成的组的APLNR激动剂。
[0111] 已知所述受体的拮抗剂阻断APLNR的低血压作用。通过将爱帕琳-13的C端苯丙氨酸(F)修饰为丙氨酸(A)(爱帕琳-13(F13A)；SEQ ID NO：29)所制造的爱帕琳肽衍生物是由Lee等人2005(Endocrinol 146(1)：231-236)描述为功能拮抗剂。另外，据报道所述APLNR拮抗剂F13A改进肝硬化动物的循环和肾功能，指示所述拮抗剂可能已经介导病原性疾病(如肝脏的纤维化)中上调的爱帕琳系统的过度活性效应(Principe，A.等人2008，Hepatology，48(4)：1193-1201)。在一些实施方案中，APLNR拮抗剂选自由爱帕12
琳-13(F13A)(SEQ ID NO：29)、[d-Ala ]-A12、环(1-6)CRPRLC-KH-环(9-14)CRPRLC以及N-α-乙酰基-九-D-精氨酰胺乙酸盐(ALX40-4C；CAS登记号153127-49-2)组成的组。
琳-13(F13A)(SEQ ID NO：29)、[d-Ala ]-A12、环(1-6)CRPRLC-KH-环(9-14)CRPRLC以及N-α-乙酰基-九-D-精氨酰胺乙酸盐(ALX40-4C；CAS登记号153127-49-2)组成的组。
[0112] 在另一实施方案中，所述爱帕琳融合蛋白或多肽包含APLNR结合分子。在其它实施方案中，所述爱帕琳融合蛋白或多肽包含APLNR激动剂。在一些实施方案中，本发明的融合多肽包含APLNR拮抗剂。
[0113] 受体测定
[0114] 应理解，受体筛选测定不仅用于本发明的主题爱帕琳融合蛋白，而且用于包括APLNR的激动剂和拮抗剂在内的任何测试化合物。确定APLNR的激活或失活的多种受体筛选测定是本领域中众所周知的，并且以下实施例并不意图限制被本发明人视为其发明的内容的范围。
[0115] GPCR介导的鸟嘌呤核苷酸交换是通过测量与由表达所关注的GPCR的细胞制备的35 35
质膜的[ S]GTPγS结合来监测。[ S]GTPγS测定一般适用于Gi/o偶联受体，因为Gi/o是大多数细胞中的最丰富G蛋白并且具有比其他G蛋白快的GDP-GTP交换速率(Milligan TM
G.，2003，Trends Pharmacol Sci，2003，24：87-90)。市面上可获得的闪烁接近测定(SPA )
35
试剂盒允许测量所需的[ S]GTPγS结合的α亚单位(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)。
质膜的[ S]GTPγS结合来监测。[ S]GTPγS测定一般适用于Gi/o偶联受体，因为Gi/o是大多数细胞中的最丰富G蛋白并且具有比其他G蛋白快的GDP-GTP交换速率(Milligan TM
G.，2003，Trends Pharmacol Sci，2003，24：87-90)。市面上可获得的闪烁接近测定(SPA )
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试剂盒允许测量所需的[ S]GTPγS结合的α亚单位(PerkinElmer，Waltham，MA，USA)。
[0116] Gi/o偶联受体经由Gα亚单位Gi或Go的激活导致降低的腺苷酰基环化酶活性并且因此导致细胞中的cAMP的抑制。为了使抑制信号增至最大，典型地使用毛喉素(腺苷酸环化酶的直接激活剂)来刺激测定中的腺苷酰基环化酶并且因此刺激cAMP，TM
由此使抑制信号更容易检测到。辐射测量GE Healthcare SPA (Piscataway，NJ，USA)TM
和Perkin Elmer Flash-Plate cAMP测定以及基于荧光或发光的均质测定(例如
TM TM
PerkinElmer AlphaScreen 、DiscoveRx HitHunter (Fremont，CA，USA)以及Molecular Devices (Sunnyvale，CA，USA))可用于测量细胞内cAMP的积聚。
由此使抑制信号更容易检测到。辐射测量GE Healthcare SPA (Piscataway，NJ，USA)TM
和Perkin Elmer Flash-Plate cAMP测定以及基于荧光或发光的均质测定(例如
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PerkinElmer AlphaScreen 、DiscoveRx HitHunter (Fremont，CA，USA)以及Molecular Devices (Sunnyvale，CA，USA))可用于测量细胞内cAMP的积聚。
[0117] 调节cAMP含量的GPCR(如APLNR)的作用可与细胞中由cAMP反应元件(CRE)所致的荧光素酶转录有关。CRE-luc构建体(CRE反应性荧光素酶)在启动子和CRE转录反应元件(TRE)的串联重复序列的控制下编码萤光素酶报道基因。在所述受体的激活后，通过在添加化学发光检测试剂后在细胞中表达的萤光素酶的量来测量细胞中的cAMP积聚。对于APLNR和其它Gi偶联受体，添加毛喉素来诱导cAMP并且CRE活性(化学发光)的降低指示GPCR激活。可获得多种商业试剂盒，如来自Promega(Madison，WI，USA)、SABiosciences(A Qiagen Company，Valencia，CA，USA)等。
[0118] 在一些情况下，激动剂结合于受体可启动抑制蛋白介导的信号传导，而不触发G蛋白介导的信号传导，或减慢G蛋白介导的信号传导。β-抑制蛋白(Beta-arrestin)与细胞表面的GPCR的相互作用可使异源三聚G蛋白与所述受体解偶联并且引起其它细胞信号传导级联。已知β-抑制蛋白触发内吞作用和ERK途径的激活。在一种实例测定中，生物发光共振能量转移或BRET已经用于研究融合至海肾荧光素酶(Rlu)的GPCR与融合至绿色荧光蛋白(GFP)的β-抑制蛋白的相互作用。在这个实例中，BRET是基于在添加萤光素酶底物腔肠素后当重组表达的GPCR-Rlu与β-抑制蛋白-GFP紧密接近时其间的能量转移，因此允许测量全细胞中这些蛋白-蛋白相互作用的实时评估。
[0119] 已经开发其它测定，如通过检测β-抑制蛋白与激活的GPCR的相互作用直接测量GPCR活性的 GPCR测定(DiscoveRx Corp.，Fremont，CA，USA)。简单地说，所述GPCR是与小的酶片段ProLinkTM同框架融合，并且在稳定表达β-抑制蛋白与β-半乳糖苷酶(即β-gal，一种酶受体，或EA)的缺失突变体的融合蛋白的细胞中共同表达。所述GPCR的激活刺激β-抑制蛋白结合于ProLink标记的GPCR并且这两种酶片段的互补导致活性β-gal酶的形成。酶活性(即，GPCR激活)的增加可使用化学发光检测试剂来测量。
[0120] β-抑制蛋白分子已经显示在GPCR(如APLNR)的激活后调节GPCR内化(即内吞作用)。GPCR的激动剂激活导致构象变化、受体磷酸化以及β-抑制蛋白的激活或其它途径，以介导细胞表面的受体隐蔽。隐蔽机理可为一种减敏(即，受体在内化后降解)或复敏(即，受体再循环返回细胞表面)的方式。参见例如Claing，A.等人2002，Progress in Neurobiology 66：61-79，用于回顾。
[0121] APLNR拮抗剂可阻断受体的内化。APLNR激动剂可诱导APLNR的内化和/或复敏(Lee，DK等人2010，BBRC，395：185-189)。在一些实施方案中，APLNR激动剂展现或诱导增强的APLNR复敏，如通过内化测定所测量。在其它实施方案中，APLNR激动剂展现或诱导APLNR的增加的细胞表面受体拷贝，如在内化测定中所测量。在任何内化测定中测量受体内化的程度(如增加)是通过在所述测定中确定非内化的测量值(即，未先前暴露于激动剂的细胞)与用激动剂获得的测量值之间的差异来进行。
[0122] 爱帕琳受体隐蔽和因此爱帕琳受体拷贝可通过本领域中众所周知的多种方法来测量。APLNR激动剂刺激可导致特定细胞的表面上增加或减少的受体拷贝。例如，诱导APLNR内化的爱帕琳受体激动剂可对血压具有影响。受体内化测定常规地使用例如荧光标记或放射性标记的配体或免疫荧光标记(荧光标记的抗受体抗体)，接着使用显微术和数字成象技术(参见例如El Messari等人2004，J Neurochem，90：1290-1301；和Evans，N.，2004，Methods of Measuring Internalization of G Protein-Coupled Receptors.Current Protocols in Pharmacology.24：12.6.1-12.6.22)来进行。
[0123] 磷酸化ERK(p-ERK)可在来自表达APLNR受体的细胞的细胞溶解产物中测量以确定APLNR激活。内源性细胞外信号调节的激酶1和2(ERK1和ERK2)属于保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族并且牵涉与多种刺激物相关的细胞信号传导事件。ERK蛋白的激酶活性是通过在ERK1中的苏氨酸202/酪氨酸204处和在ERK2中的苏氨酸185/酪氨酸187处的双重磷酸化来调节。MEK1和MEK2是这一途径中对ERK 1/2负责的主要上游激酶。已经鉴定ERK 1/2的多种下游靶标，包括其它激酶和转录因子。在一个实例中，p-ERK 1/2测定使用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法来测量在表达重组或内源受体的细胞培养物的细胞溶解产物中ERK 1的特异性磷酸化。在另一实例中，p-ERK 1/2测定使用识别ERK1中的磷酸化Thr202/Tyr204或ERK2中的phos-Thr185/Tyr187的一级(非结合)抗体和识别所述一级抗体的二级缀合抗体，而所述二级结合mAb提供检测方法，如缀合物与外源添TM加的底物反应。可获得多种商业试剂盒，如 SureFire (PerkinElmer)、
ThermoScientific(Waltham，MA，USA)、Sigma Aldrich(St.Louis，MO，USA)、ELISAOne(TGR BioSciences(South Australia，Australia)等)。
ThermoScientific(Waltham，MA，USA)、Sigma Aldrich(St.Louis，MO，USA)、ELISAOne(TGR BioSciences(South Australia，Australia)等)。
[0124] 如本文所用，术语“结合”(如在配体结合于受体(例如GPCR)的情况下，或如抗体结合于抗原)典型地是指最少两个实体或分子结构之间的相互作用或缔合，如受体-配体相互作用或抗体-抗原相互作用。因此，“受体结合分子”是指结合于受体(即，与受体相互作用)的配体或其它部分，如蛋白。
[0125] 例如，配体(例如爱帕琳融合蛋白)与受体(例如APLNR或APLNR的配体结合片-7 -8 -9段)之间的结合亲和力典型地对应于约10 M或更小的KD值，如约10 M或更小，如约10 M或更小。结合亲和力可通过若干方法中的任何一种或多种，如通过表面等离子体共振(SPR)使用BIAcore 3000仪器确定。因此，配体结合于受体的亲和力对应于比受体针对结合于非特异性配体(例如BSA、酪蛋白)的亲和力低至少10倍，如至少100倍，例如至少1,000倍，如至少10,000倍，例如至少100,000倍的KD值。
[0126] 如本文所用的术语“KD”(M)是指特定的配体-受体相互作用的解离平衡常数。在KD与结合亲和力之间存在反向关系，因此KD值越小，亲和力越大。因此，术语“较低亲和力”与较低的形成相互作用的能力有关并且因此与有关较大的KD值有关。
[0127] 如本文所用的术语“kd”(sec-1或1/s)是指特定的配体-受体相互作用的解离速率常数。所述值还称作k解离值。
[0128] 如本文所用的术语“ka”(M-1x sec-1或1/M)是指特定的配体-受体相互作用的缔合速率常数。
[0129] 如本文所用的术语“KA”(M-1或1/M)是指特定的配体-受体相互作用的缔合平衡常数，或抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数。所述缔合平衡常数是通过ka除以kd获得。
[0130] 如本文所用的术语“EC50”或“EC50”是指半数最大有效浓度，其包括规定的暴露时间后诱导在基线与最大值中间的反应(例如细胞反应)的配体浓度。EC50基本上表示观察到配体的最大效应的50％时的配体浓度。因此，关于细胞信号传导，在降低的EC50值，即半数最大有效浓度值(需要较少配体来实现较大反应)下观察到增加的活性。
[0131] 在一个实施方案中，降低的结合是指增加的EC50蛋白浓度，所述浓度使得能够半数最大结合于靶标受体或受体表达细胞。
[0132] 在一个实施方案中，降低的活性是指增加的EC50蛋白浓度，所述浓度使得能够半数最大细胞激活靶标受体或受体表达细胞。
[0133] 如本文所用的术语“IC50”或“IC50”是指细胞反应的半数最大抑制浓度。换句话说，特定部分(例如蛋白、化合物或分子)抑制生物或生物化学功能的有效性的量度，其中一种测定定量抑制给定的生物过程所需的所述部分的量。因此，关于细胞信号传导，在降低的IC50或半数最大抑制浓度值下观察到较大抑制活性。
[0134] 在一个实施方案中，所述爱帕琳融合蛋白是APLNR的激动剂，所述激动剂在测量APLNR的激活的体外测定中具有小于约100nM或小于约50nM或小于约25nM或小于约10nM或小于约1nM的EC50。在一个实施方案中，所述爱帕琳融合蛋白包含连接至爱帕琳肽的N端的Fc结构域，并且展现小于约1nM或小于约500ρM的EC50。
[0135] 本发明的爱帕琳融合蛋白
[0136] 所属领域中已知制造融合蛋白的方法。在一种所述方法中，DNA表达载体经过工程改造以含有同框架连接至编码Fc的核酸序列的编码爱帕琳的核酸序列，使得所述DNA表达载体表达一种邻接融合多肽。爱帕琳肽可连接至含有Fc的多肽的C端或N端。预期本发明的爱帕琳融合蛋白比单独爱帕琳肽更稳定。血清稳定蛋白包括赋予降解抗性或具有减少的循环清除的蛋白。本发明的示例性血清稳定爱帕琳融合蛋白包括SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40以及SEQ ID NO：41。
[0137] 在构建融合蛋白的情况下，措词“同框架接合”意指各组分以使得其完全翻译、使用或操作是可能的并且因此未受到破坏的方式连接在一起。例如，包含至少两种多肽的融合蛋白可在所述多肽之间具有或可不具有连接体或间隔区序列，并且因此所述多肽同框架接合为一种连续多肽，其中各多肽维持其可操作性。在融合蛋白中连接或融合在一起的两种或更多种多肽典型地源自两种或更多种独立来源，并且因此融合蛋白包含两种或更多种实际上通常未发现连接的连接多肽。此外，编码所述融合蛋白的DNA可含有连接体序列，所述序列维持编码所述多肽的转录mRNA分子的可操作同框架(例如，三联体密码子)翻译。
[0138] 措词“可操作地连接”(如在DNA表达载体构建体的情况下)意指，控制序列(例如启动子或操作子)适当地位于相对于编码序列的位置处，使得所述控制序列引导由所述编码序列编码的多肽的产生。
[0139] 术语“信号肽”或“信号肽序列”在本文中定义为通常存在于新合成的分泌或膜多肽的N端末端处的肽序列，所述序列引导所述多肽通过或进入细胞的细胞膜中(原核生物中的质膜和真核生物中的内质网膜)。其通常随后通过酶裂解来去除。在一些实施方案中，所述信号肽可能够引导所述多肽进入细胞的分泌途径中。在一些实施方案中，所述信号肽包含来自小鼠ROR1的1-29的氨基酸序列，GenBank登录号BAA75480(SEQ ID NO：10)。在其它实施方案中，所述信号肽具有与SEQ ID NO：9中所示的信号肽氨基酸序列至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％同源性。在其它实施方案中，所述信号肽是由具有与SEQ ID NO：9中所示的信号肽核酸序列至少约96％，或至少约97％，或至少约98％，或至少约99％同源性的核苷酸编码。
[0140] 在一些实施方案中，Fc融合蛋白的组分或肽是由连接体(或“间隔区”)肽分离。所述肽连接体为本领域中众所周知的(例如聚甘氨酸)并且典型地允许所述融合蛋白的一种或两种组分的适当折叠。所述连接体提供所述融合蛋白的组分的柔性接合区，从而允许分子的两个末端独立地移动，并且可在保留这两个部分的适当功能中的每一者方面发挥重要作用。因此，所述接合区在一些情况下用作连接体，其将两个部分组合在一起，并且用作间隔区，其允许两个部分中的每一者形成其自身生物结构并且不干扰另一部分。此外，所述接合区应产生将不由受试者的免疫系统识别为外来的，换句话说将不被视为免疫原性的表位。连接体选择也可对融合分子的结合活性具有影响。(参见Huston等人，1988，PNAS，85：16：5879-83；Robinson和Bates，1998，PNAS 95(11)：5929-34；Arai等人2001，PEDS，14(8)：529-32；以及Chen，X.等人，2013，Advanced Drug Delivery Reviews 65：
1357-1369。)在一个实施方案中，所述爱帕琳肽经由一个或多个肽连接体连接至所述含有Fc的多肽或其片段的C端或N端。
1357-1369。)在一个实施方案中，所述爱帕琳肽经由一个或多个肽连接体连接至所述含有Fc的多肽或其片段的C端或N端。
[0141] 连接体链的长度可为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个氨基酸残基，但典型地在5个与25个残基之间。连接体的实例包括聚甘氨酸连接体，如 Gly-Gly、Gly-Gly-Gly(3Gly)、4Gly、5Gly、6Gly、7Gly、8Gly 或 9Gly。 连 接 体 的实例 还包括 Gly-Ser肽连 接体，如 Ser-Gly、Gly-Ser、Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n以及(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n，其中n＝1至10。(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n和(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n还分别称作(G4S)n和(S4G)n。
[0142] 在本发明的一个所述实施方案中，所述爱帕琳肽经由一个或多个Gly-Ser肽连接体连接至所述含有Fc的多肽或其片段的C端或N端。
[0143] 在 一 个 实 施 方 案 中，所 述 肽 连 接 体 是 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)1、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3或(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)4。在一个实施方案中，所述肽连接体包含(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(SEQ ID NO：11)。
[0144] 在一些实施方案中，所述信号肽经由一个或多个肽连接体或间隔区连接至所述Fc融合多肽的N端。在一些实施方案中，所述信号肽在表达载体中在所述Fc融合蛋白的上游编码并且间隔区在所述信号肽与所述Fc融合蛋白的N端之间同框架编码。在另一实施方案中，所述肽连接体或间隔区包含RSTGSPGSG(SEQ ID NO：12)。
[0145] 经过修饰的爱帕琳融合多肽
[0146] 在其它实施方案中，本发明的任何Fc融合蛋白的序列均可经过修饰以使得其不包含任何受体位点用于N连接糖基化。在其它实施方案中，本发明的任何Fc融合蛋白的序列均可经过修饰以增强或减弱抗体结合于FcRn受体，例如在酸性pH下与中性pH相比。在其它实施方案中，本发明的任何Fc融合蛋白的序列均可经过修饰以抵抗裂解或降解。因而，向爱帕琳-Fc融合蛋白的爱帕琳肽中添加一个或多个C端氨基酸可赋予增强的稳定性，如降解抗性。不受一种理论束缚，额外C端氨基酸可消除对所述肽或融合蛋白内的裂解位点的敏感性。稳定性的赋予可归因于减少或减慢的循环清除(即，肾排泄或清除)。对爱帕琳肽的所述修饰不会改变其激活APLNR的能力。示例性经过修饰的爱帕琳肽包括于表3和表4中，例如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43以及SEQ ID NO：44。本发明的示例性爱帕琳融合蛋白包括SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40以及SEQ ID NO：41。
[0147] 一般来说，包括本文所述的Fc融合蛋白在内的蛋白可通过纳入任何适合数目的所述经过修饰的氨基酸(包括上文论述的非标准氨基酸)和/或与结合的取代基缔合而经过修饰。在这种情况下的适合性一般是通过至少实质上保留Fc融合蛋白的缔合选择性和/或特异性(例如结合于APLNR)的能力来确定。所述经过修饰的氨基酸可例如选自糖基化氨基酸、PEG化氨基酸、法尼基化氨基酸、香叶基-香叶基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、缀合于脂质部分的氨基酸或结合于有机衍生剂的氨基酸等。纳入一种或多种经过修饰的氨基酸可有利于例如进一步增加多肽血清半衰期、降低多肽抗原性或增加多肽存储稳定性。氨基酸可例如在重组产生期间以共同翻译方式或以翻译后方式进行修饰(例如，在哺乳动物细胞中表达期间在N-X-S/T基序处的N连接糖基化)，或通过合成方式进行修饰。经过修饰的氨基酸的非限制性实例包括糖基化氨基酸、硫酸化氨基酸、异戊烯基化(例如，法尼基化、香叶基-香叶基化)氨基酸、乙酰化氨基酸、酰化氨基酸、脂肪酰化氨基酸、PEG化氨基酸、生物素化氨基酸、羧化氨基酸、磷酸化氨基酸等。适于指导氨基酸修饰方面的技术人员的参考文献在本文献中较多。实施例方案发现于Walker，1998，Protein Protocols On CD-Rom，Humana Press，Totowa，NJ中。
[0148] 包括本发明的Fc融合蛋白在内的蛋白也可通过共价缀合于聚合物来进行化学修饰以例如进一步增加其循环半衰期。示例性聚合物和将其连接于肽的方法说明于例如US4,766,106、US 4,179,337、US 4,495,285以及US 4,609,546中。额外说明性聚合物包括聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG)(例如，具有在约1,000与约40,000之间，如在约2,000与约20,000之间，例如约3,000-12,000g/mol的分子量的PEG)。参见例如WO2012/125408，其描述PEG-爱帕琳-36，这是一种在大鼠中具有长期肌力作用的多肽。
[0149] 在一个实施方案中，提供包含一种或多种放射性标记的氨基酸的蛋白，包括Fc融合蛋白。放射性标记的抗体可用于诊断和治疗目的。在另一实施方案中，包括本发明的Fc融合蛋白在内的蛋白可缀合于作为治疗剂或可检测标志物的分子。在一个实施方案中，所述治疗剂是细胞毒性剂，如放射性同位素。用于多肽的放射性同位素的实例包括但不限3 14 15 35 90 99 125 131 186 225
于 H、C、N、S、y、Tc和 I、 I、Re以及 Ac。用于制备放射性标记的氨基酸和相关肽衍生物的方法是本领域中已知的(参见例如Junghans等人，Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686(第2版，Chafner和Longo编，Lippincott Raven(1996))和US
4,681,581、US 4,735,210、US 5,101,827、US 5,102,990(US RE35,500)、US 5,648,471以及US 5,697,902。例如，放射性同位素可通过氯胺T方法结合。在其它实施方案中，可检测标志物可为放射性标记、酶、发色团或荧光标记。
于 H、C、N、S、y、Tc和 I、 I、Re以及 Ac。用于制备放射性标记的氨基酸和相关肽衍生物的方法是本领域中已知的(参见例如Junghans等人，Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686(第2版，Chafner和Longo编，Lippincott Raven(1996))和US
4,681,581、US 4,735,210、US 5,101,827、US 5,102,990(US RE35,500)、US 5,648,471以及US 5,697,902。例如，放射性同位素可通过氯胺T方法结合。在其它实施方案中，可检测标志物可为放射性标记、酶、发色团或荧光标记。
[0150] 表达系统
[0151] 本发明提供编码多肽(例如，本发明的爱帕琳Fc融合蛋白)的表达载体。所述表达载体可用于本发明多肽的重组产生。
[0152] 在本发明的上下文中的表达载体可为任何适合载体，包括染色体、非染色体以及合成核酸载体(包含一组适合的表达控制元件的核酸序列)。所述载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体以及病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施方案中，Fc融合蛋白或编码多肽的核酸分子是包含于裸DNA或RNA载体中，所述载体包括例如线性表达元件(如例如Sykes和Johnston，Nat Biotech 12，355-59(1997)中所述)、紧密核酸载体(如例如US 6,077,835和/或WO00/70087中所述)或质粒载体(如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119)。所述核酸载体和其用法是本领域中众所周知的(参见例如US 5,589,466和US 5,973,972)。
[0153] 在另一实施方案中，所述载体包含编码本发明多肽的核酸分子，包括包含所述核酸分子的表达载体，其中所述核酸分子是可操作性连接于表达控制序列。
[0154] 在一个实施方案中，所述载体适用于细菌细胞中本发明多肽的表达。所述载体的实例包括表达载体，如BlueScript(Stratagene)、pIN载体(Van Heeke和Schuster，1989，J Biol Chem 264，5503-5509)、pET载体(Novagen，Madison，WI)等。
[0155] 表达载体也可为或可选地为适用于酵母系统中的表达的载体。可使用适用于酵母系统中的表达的任何载体。适合的载体包括例如包含组成性或诱导性启动子(如酵母α因子、醇氧化酶以及PGH)的载体(于以下文献中综述：F.Ausubel等人编，1987，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley InterScience New York；和Grant等人，1987，Methods in Enzymol 153，516-544)。
[0156] 在其它实施方案中，所述表达载体适用于杆状病毒感染的昆虫细胞中的表达。(Kost，T和Condreay，JP，1999，Current Opinion in Biotechnology 10(5)：428-33。)[0157] 提供包含本发明核酸分子的载体，其中所述核酸分子是可操作性连接于适用于哺乳动物宿主细胞中的表达的表达控制序列。
[0158] 表达控制序列经过工程改造以控制和驱动所关注的基因的转录，和各种细胞系统中蛋白的后续表达。质粒使可表达的所关注的基因与包含如启动子、增强子、可选择标志物、操作子等所需元件的表达控制序列(即，表达盒)组合。在本发明的表达载体中，Fc融合蛋白或编码抗体的核酸分子可包含任何适合的启动子、增强子、可选择标志物、操作子、阻遏蛋白、polyA终止序列以及其它表达促进元件或与其缔合。
[0159] 如本文所用的“启动子”指示DNA序列，当适当信号存在时，所述序列足以引导其可操作性连接(即，以允许所述Fc融合蛋白或编码抗体的核苷酸序列转录的方式连接)的DNA序列的转录。Fc融合蛋白或编码抗体的核苷酸序列的表达可处于本领域中已知的任何启动子或增强子元件的控制下。所述元件的实例包括强表达启动子(例如人类CMV IE启动子/增强子或CMV主要IE(CMV-MIE)启动子，以及RSV、SV40晚期启动子、SL3-3、MMTV、泛素(Ubi)、泛素C(UbC)以及HIV LTR启动子)。
[0160] 在一些实施方案中，所述载体包含选自由SV40、CMV、CMV-IE、CMV-MIE、RSV、SL3-3、MMTV、Ubi、UbC以及HIV LTR组成的组的启动子。
[0161] 本发明的核酸分子还可以可操作性连接于有效poly(A)终止序列、用于大肠杆菌中的质粒产物的复制起点、作为可选择标志物的抗生素抗性基因和/或便利克隆位点(例如聚连接体)。核酸还可包含如与组成性启动子(如CMV IE)相对的可调节的诱导性启动子(诱导性、可阻遏、发育调节的)(熟练技术人员应了解所述术语实际上是某些条件下基因表达程度的描述词)。
[0162] 可选择标志物是本领域中众所周知的元件。在选择性条件下，仅表达适当可选择标志物的细胞可存活。一般地，可选择标志物基因表达赋予对细胞培养物中的各种抗生素的抗性的蛋白，通常是酶。在其它选择性条件下，表达荧光蛋白标志物的细胞被制成可见的，并且因此是可选择的。实施方案包括β-内酰胺酶(bla)(β-内酰胺抗生素抗性或氨苄西林抗性基因或ampR)、bls(杀稻瘟菌素抗性乙酰基转移酶基因)、bsd(杀稻瘟菌素-S脱氨酶抗性基因)、bsr(杀稻瘟菌素-S抗性基因)、Sh ble( 抗性基因)、潮霉素磷酸转移酶(hpt)(潮霉素抗性基因)、tetM(四环素抗性基因或tetR)、新霉素磷酸转移酶II(npt)(新霉素抗性基因或neoR)、kanR(卡那霉素抗性基因)以及pac(嘌呤霉素抗性基因)。
[0163] 在某些实施方案中，所述载体包含一种或多种选自由bla、bls、BSD、bsr、Sh ble、hpt、tetR、tetM、npt、kanR以及pac组成的组的可选择标志物基因。在其它实施方案中，所述载体包含一种或多种编码绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、氰基荧光蛋白(CFP)、增强型氰基荧光蛋白(eCFP)或黄色荧光蛋白(YFP)的可选择标志物基因。
[0164] 出于本发明的目的，真核细胞中的基因表达可使用强启动子紧密地调节，所述启动子由操作子控制，所述操作子又由调节蛋白调节，所述调节蛋白可为重组“调节融合蛋白”(RFP)。所述RFP基本上由转录阻断结构域和调节其活性的配体结合结构域组成。所述表达系统的实例描述于US20090162901A1中，该案以引用的方式整体并入本文。
[0165] 如本文所用，“操作子”指示DNA序列，所述序列被引入基因中或基因附近，其引入方式使得所述基因可通过使RFP结合于所述操作子来调节，并且所述序列因此防止或允许所关注的基因(即，编码本发明多肽的核苷酸)的转录。原核细胞和噬菌体中的多种操作子已经得到充分表征(Neidhardt编，Escherichia coli and Salmonella；Cellular and Molecular Biology 2d.第2卷ASM Press，Washington D.C.1996)。这些操作子包括但不限于大肠杆菌的LexA基因的操作子区，其结合LexA肽；和乳糖和色氨酸操作子，其结合由大肠杆菌的LacI和trpR基因编码的阻遏蛋白。这些操作子还包括来自λPR和噬菌体P22ant/mnt基因的噬菌体操作子，其结合由λcI和P22 arc编码的阻遏蛋白。在一些实施方案中，当所述RFP的转录阻断结构域是限制酶(如NotI)时，所述操作子是所述酶的识别序列。本领域技术人员应了解所述操作子必须位于邻近所述启动子处或所述启动子的3′处，使得其能够通过所述启动子控制转录。例如，以引用的方式并入本文的美国专利号
5,972,650规定tetO序列在距TATA盒的特定距离内。在特定实施方案中，所述操作子优选地直接位于所述启动子的下游。在其它实施方案中，所述操作子是位于所述启动子的10个碱基对内。
5,972,650规定tetO序列在距TATA盒的特定距离内。在特定实施方案中，所述操作子优选地直接位于所述启动子的下游。在其它实施方案中，所述操作子是位于所述启动子的10个碱基对内。
[0166] 在某些实施方案中，所述操作子选自由tet操作子(tetO)、NotI识别序列(对这种序列不熟悉；知道NotI为限制酶)、LexA操作子、乳糖操作子、色氨酸操作子以及Arc操作子(AO)组成的组。在一些实施方案中，所述阻遏蛋白选自由TetR、LexA、LacI、TrpR、Arc、λC1以及GAL4组成的组。在其它实施方案中，所述转录阻断结构域是源自真核生物阻遏蛋白，例如源自GAL4的阻遏结构域。细菌操作子可用于哺乳动物和其它宿主细胞系统中(参见例如US 20090162901A1，其以引用的方式并入本文)。
[0167] 在示例性细胞表达系统中，细胞经过工程改造以表达四环素阻遏蛋白(TetR)并且所关注的蛋白是处于启动子的转录控制下，所述启动子的活性是由TetR调节。两个串联TetR操作子(tetO)是直接位于载体中CMV-MIE启动子/增强子的下游。由所述载体中的CMV-MIE启动子引导的编码所关注的蛋白的基因的转录可在四环素或一些其它适合的诱导物(例如强力霉素)不存在下由TetR阻断。在诱导物存在下，TetR蛋白不能结合tetO，因此发生所关注的蛋白的转录、接着翻译(表达)。(参见例如美国专利号7,435,553，其以引用的方式整体并入本文。)
[0168] 另一示例性细胞表达系统包括调节融合蛋白，如TetR-ERLBDT2融合蛋白，其中所述融合蛋白的转录阻断结构域是TetR并且配体结合结构域是具有T2突变的雌激素受体配体结合结构域(ERLBD)(ERLBDT2；Feil等人，1997，Biochem.Biophys.Res.Commun.237：752-757)。当tetO序列位于强CMV-MIE启动子的下游和近端时，来自所述CMV-MIE/tetO启动子的所关注的核苷酸序列的转录在他莫西芬存在下被阻断并且通过去除他莫西芬来解除阻断。在另一实施例中，融合蛋白Arc2-ERLBDT2(由单链二聚体和所述ERLBDT2(上述)组成的融合蛋白，所述二聚体是由通过15个氨基酸的连接体连接的两个Arc蛋白组成)的使用涉及Arc操作子(AO)，更具体说来直接在所述CMV-MIE启动子/增强子下游的两个串联arc操作子。细胞系可由Arc2-ERLBDT2调节，其中表达所关注的蛋白的细胞是由CMV-MIE/ArcO2启动子驱动并且在去除他莫西芬的情况下为诱导性的。(参见例如US 20090162901A1，其以引用的方式并入本文。)
[0169] 在一些实施方案中，本发明的载体包含CMV-MIE/TetO或CMV-MIE/AO2杂合启动子。
[0170] 本发明的载体还可使用Cre-lox重组工具来促进所关注的基因整合至宿主基因组中。Cre-lox策略需要至少两种组分：1)Cre重组酶，即催化两个loxP位点之间的重组的酶；和2)loxP位点(例如由其中发生重组的8-bp核心序列和两个侧接的13-bp反向重复序列组成的特异性34碱基对bp序列)或突变型lox位点。(参见例如Araki等人，1995，PNAS 92：160-4；Nagy，A.等人，2000，Genesis 26：99-109；Araki等人，2002，Nuc Acids Res 30(19)：e103；以及US20100291626A1，其均以引用的方式并入本文)。在另一重组策略中，酵母源性FLP重组酶可与共有序列FRT一起使用(还参见例如Dymecki，S.M.，1996，PNAS 93(12)：6191-6196)。
[0171] 另一方面，基因(即，编码本发明的重组多肽的核苷酸序列)插入表达盒的表达增强序列内，并且任选地可操作性连接于启动子，其中所述启动子连接的基因的5’处侧接第一重组酶识别位点并且3’处侧接第二重组酶识别位点。所述重组酶识别位点允许所述表达系统的宿主细胞中Cre介导的重组。在一些情况下，第二启动子连接的基因在所述第一基因的下游(3’)并且3’处侧接所述第二重组酶识别位点。在其它情况下，第二启动子连接的基因的5’处侧接所述第二重组酶位点，并且3’处侧接第三重组酶识别位点。在一些实施方案中，所述重组酶识别位点是选自loxP位点、lox511位点、lox2272位点以及FRT位点。在其它实施方案中，所述重组酶识别位点是不同的。在另一实施方案中，所述宿主细胞包含能够表达Cre重组酶的基因。
[0172] 在一些实施方案中，所述载体进一步包含能够通过控制内质网(ER)中的蛋白折叠所涉及的基因的表达来增强蛋白产生/蛋白分泌的X盒结合蛋白1(mXBP1)基因。(参见例如Ron D和Walter P.，2007，Nat Rev Mol Cell Biol.8：519-529)。
[0173] 术语“细胞”包括适用于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括原核生物和真核生物(单细胞或多细胞)的那些细胞、细菌细胞(例如，大肠杆菌、杆菌属、链霉菌属等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母等)、植物细胞、昆虫细胞(例如SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾等)、非人类动物细胞、哺乳动物细胞、人类细胞或细胞融合物(例如杂交瘤细胞或四源杂交瘤细胞)。在某些实施方案中，所述细胞是人类、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在其它实施方案中，所述细胞是真核细胞并且选自以下细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT细胞、肿瘤细胞以及源于上述细胞的细胞系。在一些实施方案中，所述细胞包含一种或多种病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如 细胞)。
[0174] 在一些实施方案中，所述细胞是CHO细胞。在其它实施方案中，所述细胞是CHO K1细胞。
[0175] 例如，在一个实施方案中，本发明提供包含稳定整合至细胞基因组中的核酸的宿主细胞，所述核酸包含针对本发明的重组多肽的表达进行编码的核苷酸序列。在另一实施方案中，本发明提供包含非整合(即，游离型)核酸的细胞，所述核酸如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件，其包含针对本发明的重组多肽的表达进行编码的序列。在其它实施方案中，本发明提供通过用包含本发明的表达载体的质粒稳定转染宿主细胞所制造的细胞系。
[0176] 另一方面，本发明涉及一种用于制造本发明的Fc融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：a)如上文所述培养本发明的宿主细胞，和b)从培养基纯化所述Fc融合蛋白(上述)。
[0177] 本发明的治疗和诊断用途
[0178] 又一方面，本发明涉及一种包含如本文所定义的爱帕琳融合多肽或蛋白的组合物。
[0179] 所述组合物可用药学上可接受的载体或稀释剂以及已知的佐剂和赋形剂根据常规技术并且使用试错实验来配制，所述常规技术如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，Gennaro编，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1995中所公开的那些技术。
[0180] 所述药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其它已知的佐剂和赋形剂应适用于所选的本发明爱帕琳融合或爱帕琳Fc融合蛋白和所选的施用模式。本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可改变以便获得有效实现原料药的适当稳定性、对特定患者、组成以及施用模式的所需治疗反应的活性成分的量。所选的剂量水平将取决于多种药物动力学因素。
[0181] 所述药物组合物可通过任何适合的途径和模式施用。体内施用本发明的爱帕琳融合蛋白的适合途径是本领域中众所周知的并且可由本领域的普通技术人员选择。(Daugherty，AL和Msrny，RJ，2006，Adv Drug Delivery Rev，58(5-6)：686-706)。
[0182] 爱帕琳融合蛋白是针对心血管病况的管理而施用的药剂，如肌力剂，具体说来正性肌力剂。不受特定理论束缚，正性肌力剂增强心肌收缩性，并且用于支持如充血性心力衰竭、心肌梗塞、心肌病等病况中的心脏功能。(参见Dai等人，2006，Eur J Pharmacol553(1-3)：222-228；Maquire 等 人，Hypertension.2009；54：598-604；以 及Berry，M.等人，2004 Circulation，110：II187-II193。)爱帕琳诱导的血管舒张可预防缺血-再灌注损伤。由爱帕琳肽促进血管生成和诱导较大的不泄漏血管可有助于缺血的功能恢复。(Eyries M等人，2008，Circ Res 103：432-440；Kidoya H等人，2010，Blood 115：3166-3174)。
[0183] 爱帕琳受体激动剂被视为促血管生成剂，所述促血管生成剂是为了在心脏或其它组织的缺血或受损区域中增加心输出量、改进心脏功能、稳定化心脏功能、限制心脏功能的降低或促进新的血管生长而施用。因此，本发明的爱帕琳受体激动剂适用于促进血管生成并且因此治疗缺血、恢复缺血器官和组织的血流，例如以治疗肢体缺血、外周缺血、肾缺血、眼缺血、脑缺血或任何缺血疾病。
[0184] 本发明的爱帕琳融合蛋白是为了增加血流或增强心脏收缩性，如治疗或缓解缺血和心力衰竭而施用的药剂。
[0185] 爱帕琳融合蛋白是为了治疗或缓解缺血和再灌注损伤，如为了限制缺血/再灌注(I/R)损伤或延迟心脏组织坏死的发作，或为了提供预防性治疗，例如为了保护心脏免受缺血/再灌注(I/R)损伤、改进心脏功能或限制心肌梗塞发展而施用的药剂。
[0186] 爱帕琳融合蛋白是针对与糖尿病和肥胖有关的代谢病况的管理而施用的药剂。在肥胖的胰岛素抗性小鼠中，爱帕琳改进葡萄糖耐量并且增强肌肉组织的葡萄糖利用(Dray等人，2008，Cell Metab 8：437-445)。爱帕琳KO小鼠具有减弱的胰岛素敏感性(Yue等人，2010，Am J Physiol Endocrinol Metab 298：E59-E67)。因而，爱帕琳融合蛋白是为了在胰岛素抗性糖尿病的治疗中改进葡萄糖耐量而施用的药剂。
[0187] 肌肉爱帕琳mRNA含量的变化也可与全身胰岛素敏感性改进有关(Besse-Patin，A.等人，2013年8月27日，Iht J Obes(Lond).doi：10.1038/ijo.2013.158，印刷版之前的电子版)。由于肌肉组织中的所述代谢改进，和爱帕琳诱导的血管舒张，也可施用激动剂爱帕琳融合蛋白来刺激肌肉生长和耐力。
[0188] 已经显示原代HIV-1分离株也可使用APLNR作为共受体并且合成爱帕琳肽抑制HIV-1进入CD4-APLNR表达细胞中(Cayabyab，M.等人，2000，J.Virol.，74：11972-11976)。施用爱帕琳融合蛋白来治疗HIV感染。
[0189] 爱帕琳神经保护也在其中爱帕琳肽通过信号传导途径起作用之处可见以促进神经元存活(Cheng，B等人，2012，Peptides，37(1)：171-3)。施用爱帕琳融合蛋白来促进或增加神经元存活。
[0190] 爱帕琳受体激动剂也被描述为潮热抑制剂。(参见2012年10月4日公开的WO2012/133825。)也可施用本发明的爱帕琳融合蛋白来治疗、改进或抑制受试者中的潮热症状。
[0191] 爱帕琳肽可通过脂肪组织扩张促进肥胖。爱帕琳是通过低氧诱导的并且在扩张的脂肪组织的低氧内部中驱动血管生成。(Kunduzova O等人，2008，FASEB J，22：4146-4153)。然而，一些爱帕琳融合蛋白是APLNR的拮抗剂，其以组织特异性方式充当这种机理的抑制剂，以促进重量损失或治疗肥胖。因此，爱帕琳融合蛋白是为了治疗肥胖和促进重量损失而施用的阻断剂。
[0192] 涉及促进视网膜中的肿瘤生长或新血管形成的病理性血管生成可对爱帕琳或APLNR拮抗剂起反应。(Kojima，Y.和Quertermous，T.，2008，Arterioscler Thromb Vasc Biol，28：1687-1688；Rayalam，S.等人2011，Recent Pat Anticancer Drug Discov 6(3)：367-72)。因而，爱帕琳融合蛋白是为了减慢肿瘤生长或转移或为了治疗癌症和转移性疾病而施用的抑制剂。还施用爱帕琳融合蛋白来治疗视网膜病。
[0193] APLNR拮抗剂也可通过改善由病原性疾病所致的过度活性爱帕琳系统的效应来减少血管生成并且改进功能，如纤维化组织中(Principe等人，2008；Reichenbach等人，2012，JPET340(3)：629-637)。不受任何一种理论束缚，阻断所述爱帕琳系统可以修复或反应方法减慢器官或组织中的过量纤维结缔组织的形成，如病理性病况(如肝硬化)中。
因而，爱帕琳融合蛋白可用作为了减慢或预防纤维化进展或为了治疗纤维化而施用的抑制剂。
因而，爱帕琳融合蛋白可用作为了减慢或预防纤维化进展或为了治疗纤维化而施用的抑制剂。
[0194] 在一些实施方案中，本发明的Fc融合蛋白提供一种用于治疗疾病或病况的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用足以治疗所述疾病或病况的治疗有效量的爱帕琳融合蛋白。
[0195] 在一个实施方案中，本文提供一种用于治疗有需要的受试者中与爱帕琳有关的疾病或病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的爱帕琳融合蛋白。
[0196] 在一些实施方案中，所述爱帕琳融合蛋白包含包含融合至Fc结构域的爱帕琳肽或其片段的多肽。
[0197] 疾病或病况选自由心血管疾病、急性失代偿性心力衰竭、充血性心力衰竭、心肌梗塞、心肌病、缺血、缺血/再灌注损伤、肺动脉高血压、糖尿病、肥胖、癌症、转移性疾病、流体稳态、病理性血管生成、视网膜病以及HIV感染组成的组。
[0198] 在一些实施方案中，所述爱帕琳融合蛋白是适用于治疗选自由心血管疾病、急性失代偿性心力衰竭、充血性心力衰竭、心肌梗塞、心肌病、缺血、缺血/再灌注损伤、肺动脉高血压、糖尿病、潮热症状、流体稳态以及HIV感染组成的组的疾病或病况的APLNR激动剂。在另一实施方案中，所述爱帕琳融合蛋白是促进神经元细胞存活的APLNR激动剂。在另一实施方案中，所述爱帕琳融合蛋白是减少对胰岛素的敏感性的APLNR激动剂。
[0199] 在一些实施方案中，所述爱帕琳融合蛋白是适用于治疗选自由肥胖、癌症、转移性疾病、视网膜病、纤维化以及病理性血管生成组成的组的疾病或病况的APLNR拮抗剂。在一个实施方案中，所述爱帕琳融合蛋白是促进重量损失的APLNR拮抗剂。在一个实施方案中，所述爱帕琳融合蛋白是减少病理性血管生成或新血管形成的APLNR拮抗剂。在其它实施方案中，所述爱帕琳融合蛋白是减少或抑制肿瘤生长的APLNR拮抗剂。
[0200] 如本文所用，Fc融合蛋白的“治疗有效量”意指在包括施用所述蛋白的治疗干预中足以改善、缓解或部分地阻止给定疾病和其并发症的临床表现的量。适于实现这种目的的量被定义为“治疗有效量”。针对每一种目的的有效量将取决于疾病或损伤的严重程度以及受试者的重量和一般状况。
[0201] 在本发明上下文中，术语“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”意指为了对抗病况(如疾病或病症)而对患者进行的管理和护理。所述术语意图包括针对患者所患的给定病况的所有治疗，如施用活性成分(Fc融合蛋白)以缓解或减轻症状和/或并发症，以延迟所述疾病、病症或病况的进展，和/或以医治或消除所述疾病、病症或病况以及以预防所述病况，其中预防应理解成为了停止疾病进展而对患者进行的管理和护理，并且包括施用活性成分以预防所述症状或并发症的发作。尽管如此，预防性、姑息性以及治疗性(治愈性)治疗是本发明的各方面。待治疗的受试者是哺乳动物，尤其是人类。
[0202] 在一些实施方案中，所述治疗是所述疾病或病况的维持治疗、复发预防或稳定化。
[0203] 本发明包括包含与一种或多种额外治疗活性组分组合的任何本文所述的爱帕琳融合蛋白的组合物和治疗制剂，和包括向有需要的受试者施用所述组合的治疗方法。
[0205] 本发明的爱帕琳融合蛋白提供与不具有Fc结构域或Fc结构域的片段的爱帕琳肽相比具有改进的药物动力学特性(如循环血清半衰期和稳定性)的药剂。在一个实施方案中，爱帕琳融合蛋白注射后血清含量增加或提高，持续超过约1小时或超过约2小时或超过约3小时或超过约4小时或超过约5小时或超过约10小时或超过约24小时。在其它实施方案中，所述爱帕琳融合蛋白具有超过约10分钟或超过约1小时或超过约2、3、4、5、6、7、8、9小时或超过约10小时或超过约24小时的血清或血浆半衰期。
[0206] 标记的本发明的爱帕琳融合蛋白可用于诊断目的以检测、诊断或监测疾病或病症。本发明提供疾病或病症的检测或诊断，其包括：(a)使用一种或多种免疫特异性结合于靶标爱帕琳受体(APLNR)的爱帕琳融合蛋白测定受试者的细胞或组织样品中所述APLNR的存在；和(b)比较所述APLNR的含量与对照含量(例如正常组织样品中的含量)，由此与APLNR的对照含量相比所测定的APLNR含量的增加指示所述疾病或病症，或指示所述疾病或病症的严重程度。
[0207] 本发明的爱帕琳融合蛋白可用于使用本领域中众所周知的免疫组织化学方法测定生物样品中的APLNR含量。适用于检测APLNR蛋白的其它基于爱帕琳的方法包括免疫测定，如酶联免疫测定(ELISA)和放射性免疫测定(RIA)。适合的爱帕琳融合蛋白标记可用于所述试剂盒和方法，并且本领域中已知的标记包括酶标记，如碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶；125 131 14 35 3 121 99m
放射性同位素标记，如碘( I、 I)、碳( C)、硫( S)、氚(H)、铟( In)以及锝( Tc)；和发光标记，如鲁米诺和荧光素酶；以及荧光标记，如荧光素和若丹明。
放射性同位素标记，如碘( I、 I)、碳( C)、硫( S)、氚(H)、铟( In)以及锝( Tc)；和发光标记，如鲁米诺和荧光素酶；以及荧光标记，如荧光素和若丹明。
[0208] 标记的爱帕琳融合蛋白的存在可体外检测以用于诊断目的。在一个实施方案中，诊断包括：a)向受试者施用有效量的标记的爱帕琳融合蛋白；b)在施用后等待一段时间间隔以允许标记的爱帕琳融合蛋白集中于其中可检测APLNR的位点处并且允许未结合的标记的爱帕琳融合蛋白清除至背景含量；c)确定背景含量；以及d)检测受试者中的标记的爱帕琳融合蛋白，使得超过背景含量的标记的爱帕琳融合蛋白的检测指示所述受试者具有增加的APLNR蛋白，或具有所述疾病或病症，或增加的APLNR蛋白指示所述疾病或病症的严重程度。根据所述实施方案，所述爱帕琳融合蛋白是使用本领域技术人员已知的特定成象系统用适用于检测的成象部分标记。背景含量可通过本领域中已知的多种方法来确定，所述方法包括比较所检测的标记的爱帕琳融合蛋白的量与先前针对特定成象系统所确定的标准值。可用于本发明的诊断方法的方法和系统包括但不限于计算机断层摄影术(CT)、全身扫描(如正电子发射断层摄影术(PET)、磁共振成象(MRI)以及超声波检查法)。
[0209] 本发明还提供一种包装或试剂盒(例如药物包装或试剂盒)，其包括一个或多个填充有本发明的至少一种激活融合蛋白的容器。本发明的试剂盒可用于任何适用方法，包括例如诊断学方法。所述容器可任选地缔合呈管理药物和生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，所述通知反映(a)所述机构批准针对人类施用的制造、使用或销售，(b)使用说明书，或(c)批准制造和使用说明书。
[0210] 离体和体内测定
[0211] 本发明的爱帕琳Fc融合蛋白维持关于APLNR的实质活性，同时延长血清半衰期。APLNR信号转导提供爱帕琳Fc融合蛋白与爱帕琳的已知治疗和生物效应之间的联系。因此，体外、离体或体内爱帕琳Fc融合蛋白对APLNR活性的影响的任何证明均提供患者或动物中所述爱帕琳Fc融合蛋白的体内生物或医学效应的合理证据。在其它研究中，已经证明爱帕琳/APLNR是免于心肌缺血/再灌注(I/R)损伤的内源保护系统并且爱帕琳/APLNR激活的抗细胞凋亡效应(具体说来是pERK)使得免于所述损伤(Zeng等人2009，Peptides，
30(6)：1144-52，2009年2月24日电子出版)。
30(6)：1144-52，2009年2月24日电子出版)。
[0212] APLNR的激动剂(包括内源爱帕琳肽、爱帕琳类似物以及经过修饰的爱帕琳肽)在多种体内测定中证明治疗活性(例如，如WO2012125408中的PEG-爱帕琳-36，和如Iturrioz，X.等人2010，EASEB J，24(5)：1506-17.2009年12月29日电子出版中的非肽爱帕琳激动剂)。
[0213] 已经证明APLNR激动作用导致增加的心率和心脏收缩性(Ashley，EA等人2005，Cardiovasc Res.65(1)：73-82)。另外，已经证明爱帕琳肽改变心肌细胞的电生理学。全细胞膜片钳技术是用于研究施用爱帕琳之前和之后在分离的兔左房(LA)肌细胞中的动作电位(AP)和离子电流(参见例如Farkasfalvi，K.等人，2007，Biochem Biophys Res Commun.357(4)：889-95.2007年4月12日电子出版；和Cheng，CC等人，2013，Eur J Clin Invest.43(1)：34-40.2012年10月28日电子出版；其均以引用的方式并入本文)。由爱帕琳激动作用诱导的各向同性也可通过测量从小鼠或大鼠分离的心脏中的ECG参数使用Langendorf或Working Heart系统来分析。所述电生理学和体内技术(如微超声波或超声波心动描记术)是用于分析本发明多肽的治疗作用。
[0214] 爱帕琳Fc融合多肽的保护效应可在分离的大鼠或小鼠心脏中如在Langendorf系统中在心肌缺血/再灌注(I/R)损伤或低氧/再氧化(H/R)之后进行评估(参见例如Zeng等人2009，Peptides，30(6)：1144-52，2009年2月24日电子出版；Pisarenko等 人 2010，Kardiologiia，50(10)：44-9；以 及 Pisarenko 等 人，2013，J Pharmacol Pharmacother.“Effects of structural analogues of apelin-12 in acute myocardial infarction in rats”，印刷版之前的电子版)。
[0215] 也可执行短暂LAD接合，其中爱帕琳激动剂在再灌注之前施用。(参见Pisarenko等人2011，Bull Exp Biol Med.152(1)：79-82；Li，L.等人，2012，Am J Physiol Heart Circ Physiol，303(5)：H605-18，2012年6月29日电子出版；以及Tao，J.等人，2011，Am J Physiol Heart Circ Physiol，301(4)：H1471-86，2011年7月29日电子出版。)在心脏损伤后，微超声波参数可用于测量心脏功能的改进，以及梗塞大小的分析。
[0216] 提供以下实施例以对本领域的普通技术人员描述如何制造和使用本发明的方法和组合物，并且所述实施例并不意图限制被本发明人视为其发明的内容的范围。已经努力确保关于所用数字(例如量、浓度、温度等)的精确性，但一些实验误差和偏差应加以说明。实施例
[0217] 实施例1-表达构建体的克隆
[0218] 使用合成基因片段来产生具有爱帕琳-13的N端和C端hFc融合物。使用标准分子克隆技术将编码所得融合物hFc-爱帕琳13(SEQ ID NO：1)和爱帕琳13-hFc(SEQ ID NO：3)的DNA插入在CMV启动子下游的表达载体中。产生CHO稳定细胞系并且所述细胞系用于产生融合蛋白，所述融合蛋白接着通过亲和方法纯化。N端hFc-爱帕琳13和C端爱帕琳13-hFc融合蛋白在SDS-PAGE凝胶上迁移，与其预测的质量一致。(参见图3A。)用抗爱帕琳抗体(Abcam，#ab59469)执行的蛋白印迹分析是用于确认hFc-爱帕琳13和爱帕琳
13-hFc上爱帕琳的存在。(参见图3B。)
13-hFc上爱帕琳的存在。(参见图3B。)
[0219] 实施例2-在cAMP-报道基因测定中爱帕琳Fc融合蛋白的效能和疗效
[0220] 使用为了检测hAPLNR的激活而开发的生物测定来评估未修饰的爱帕琳肽(Bachem，#H-4568.0001)和本发明的爱琳帕13融合蛋白对细胞内cAMP含量的调节。HEK293细胞系连同荧光素酶报道基因[cAMP反应元件(CRE，4X)-荧光素酶]一起转染以稳定表达全长人类hAPLNR(登录号NP_005152.1的氨基酸1-380)。所得细胞系HEK293/CRE-luc/hAPLNR维持于含有10％FBS、NEAA、青霉素/链霉素以及100μg/mL潮霉素B的DMEM中。
关于所述生物测定，HEK293/CRE-luc/hAPLNR细胞在补充有0.1％FBS和青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的80μL OPTIMEM中以20,000个细胞/孔接种于96孔测定板上并且在37℃下在5％CO2中孵育16小时。次日早晨，为了测量经由hAPLNR激活对毛喉素诱导的cAMP产生的抑制，连续稀释(1∶3)未修饰的爱帕琳肽和爱帕琳13融合蛋白，接着在测定缓冲液中与毛喉素(Sigma，#F6886)混合(5μM最终毛喉素浓度)，并且添加至细胞中。在37℃下在5％CO2中孵育5小时之后，在添加One Glo试剂(Promega，#E6051)后使用Victor X仪器(Perkin Elmer)测量发光。用Prism 5软件(GraphPad)使数据通过非线性回归与4参数逻辑方程拟合。
关于所述生物测定，HEK293/CRE-luc/hAPLNR细胞在补充有0.1％FBS和青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺的80μL OPTIMEM中以20,000个细胞/孔接种于96孔测定板上并且在37℃下在5％CO2中孵育16小时。次日早晨，为了测量经由hAPLNR激活对毛喉素诱导的cAMP产生的抑制，连续稀释(1∶3)未修饰的爱帕琳肽和爱帕琳13融合蛋白，接着在测定缓冲液中与毛喉素(Sigma，#F6886)混合(5μM最终毛喉素浓度)，并且添加至细胞中。在37℃下在5％CO2中孵育5小时之后，在添加One Glo试剂(Promega，#E6051)后使用Victor X仪器(Perkin Elmer)测量发光。用Prism 5软件(GraphPad)使数据通过非线性回归与4参数逻辑方程拟合。
[0221] 所述hFc-爱帕琳13融合蛋白以174ρM的EC50值促进来自毛喉素刺激的HEK293/CRE-luc/hAPLNR细胞的cAMP释放的抑制，并且爱帕琳13-hFc以22.1nM的EC50值进行激活。在这种测定中，爱帕琳-13以36.5ρM的EC50值进行激活。(参见图4。)
[0222] 实施例3-在β-抑制蛋白测定中Fc融合蛋白的效能和疗效
[0223] DiscoverX 平台是基于响应于相关配体的治疗，β-抑制蛋白募集至GPCR。在这种测定形式中，β-抑制蛋白融合于β-半乳糖苷酶(β-gal)的N端缺失突变体并且在细胞中稳定表达，而所述GPCR融合于较小(42个氨基酸)、微弱互补的β-gal片段。在这种测定中所述GPCR的配体刺激导致β-抑制蛋白募集至GPCR，促使所述两种β-gal片段互补并且导致形成功能酶，所述功能膜将底物转化为可检测信号(DiscoverX Corporation，Fremont，CA，USA)。
[0224] 关于所述测定，CHO-K1/hAPLNR DiscoverX细胞在测定培养基(DiscoverX Corporation；#93-0250E2)中以10,000个细胞/孔涂板并且在37℃下在5％CO2中孵育48小时。细胞接着用未修饰的爱帕琳-13肽或所述爱帕琳-13融合蛋白的1∶10连续稀释液处理。在37℃下孵育1.5小时之后，根据制造商的说明书添加检测试剂并且在RT下孵育1小时，随后使用Victor仪器(Perkin-Elmer)进行发光测量。
[0225] 所述hFc-爱帕琳13、爱帕琳-13以及爱帕琳13-hFc蛋白分别以992ρM、17.6ρM以及44.2nM(外推值)的EC50值以剂量依赖性方式激活CHO-K1/hAPLNR DiscoverX细胞(图5)。
[0226] 实施例4-在pERK测定中Fc融合蛋白的效能和疗效
[0227] 为了测量本发明的爱帕琳-13融合蛋白对APLNR信号传导途径的影响，使用一种测定来定量来自表达APLNR的细胞系的磷酸化ERK1/2(pERK1/2)和总ERK的量。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系在强力霉素-诱导性CMV启动子的控制下转染以稳定表达全长人类APLNR(hAPLNR；登录号NP_005152.1的氨基酸1-380)。所得细胞系CHO/hAPLNR维持于含有10％FBS、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺以及250ug/mL潮霉素B的Ham’s F12培养基中。
[0228] 关于所述测定，CHO/hAPLNR细胞在含有10％FBS、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素的200μL Ham′s F12中以10,000个细胞/孔接种于96孔测定板上并且在37℃下在5％CO2中孵育24小时。次日，为了诱导所述APLNR的表达并且准备用于pERK测定的细胞，首先用
250μl 1x PBS(Life Technologies；#20012-043)洗涤细胞一次，接着在含有0.1％FBS、
1％BSA、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、0.5μg/mL强力霉素的Ham′s F12中血清饥饿持续
24小时。在测定当天，细胞在37℃下在5％CO2中在补充有1％BSA、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺的Ham′s F12中用未修饰的爱帕琳肽或融合蛋白的1∶10连续稀释液处理持续
15分钟。在孵育结束时，细胞用200μL PBS洗涤并且随后用100uL ELISAone溶解缓冲液(TGR BioSciences；#EBF001)溶解。萃取物接着根据制造商的说明书(TGR Biosciences，#EKT001)针对磷酸化ERK(pERK1/2)和总ERK含量进行分析。接着使用Spectramax板式读数器(Molecular Devices)测量荧光信号。计算测量的pERK1/2与测量的总ERK的比率并且使用GraphPad Prism分析结果。
250μl 1x PBS(Life Technologies；#20012-043)洗涤细胞一次，接着在含有0.1％FBS、
1％BSA、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、0.5μg/mL强力霉素的Ham′s F12中血清饥饿持续
24小时。在测定当天，细胞在37℃下在5％CO2中在补充有1％BSA、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺的Ham′s F12中用未修饰的爱帕琳肽或融合蛋白的1∶10连续稀释液处理持续
15分钟。在孵育结束时，细胞用200μL PBS洗涤并且随后用100uL ELISAone溶解缓冲液(TGR BioSciences；#EBF001)溶解。萃取物接着根据制造商的说明书(TGR Biosciences，#EKT001)针对磷酸化ERK(pERK1/2)和总ERK含量进行分析。接着使用Spectramax板式读数器(Molecular Devices)测量荧光信号。计算测量的pERK1/2与测量的总ERK的比率并且使用GraphPad Prism分析结果。
[0229] 在所述pERK测定中，hFc-爱帕琳13和爱帕琳13-hFc分别以216pM和33nM的EC50值以剂量依赖性方式增加CHO/hAPLNR细胞中pERK1/2与总ERK1/2的比率(图6)。
[0230] 实施例6-评估Fc融合物的血清稳定性的药物动力学研究
[0231] C57/B16小 鼠 (n＝ 3/ 组) 皮 下(s.c.) 给 予 hFc(2.5mg/kg)或 爱 帕 琳13-hFc(2.8mg/kg)(图7A)并且在1、4、24以及48小时之时收集血浆。在独立实验中，在C57/B16小鼠(n＝3/组)中以5mg/kg皮下注射hFc-爱帕琳13并且在0、1、2、4、5、6、24小时和2、3、7、14、21天收集血清(图7B)。
[0232] 为了评估所施用的蛋白的血清/血浆含量，在4℃下用PBS中浓度为1μg/mL的山羊抗人类IgG抗体(Jackson ImmunoLab；109-005-098)以每孔100μL涂布96孔ELISA板持续18小时。所述板随后在室温(RT)下用每孔300μL的1X牛奶稀释剂/阻断溶液(KPL；#100108)阻断1小时。hFc(用于标准曲线)和血清样品在100μL稀释剂中的稀释液接着添加至所述板中。在RT下孵育2小时之后，接着洗涤孔并且通过在RT下向所述板中添加辣根过氧化物酶结合的抗人类IgG抗体(Jackson ImmuLab；#109-035-098)持续7分钟来检测板结合的人类Fc。用TMB溶液(MP Biomedical；#152346)使样品显影7分钟以产生比色反应并且接着用每孔100μL 2.0N H2SO4(Mallinckrodt；#H381-05)中和，接着在Spectramax板式读数器(Molecular Devices)上在450nm波长下测量吸光度。使用SoftMax软件分析数据以确定血清中所述样品的浓度。
[0233] 爱帕琳13-hFc血清含量在约4小时之时达到最大值10μg/mL(380nM)并且在48小时后保持可与hFc的那些含量相当(图7A)。hFc-爱帕琳13血清含量在24小时之时达到最大值3μg/mL(100nM)并且在第14天时逐渐降低至1μg/mL(38nM)(图7B)。
[0234] 实施例7-在CRE测定中爱帕琳肽的效能和疗效
[0235] 具有拴系至其N端的Fc的爱帕琳-13(hFc-爱帕琳13)呈现优于具有具有拴系至其C端的Fc的爱帕琳-13(爱帕琳-hFc)的效能，如以上实施例2至实施例6中所见。测试经过修饰的爱帕琳-13肽关于APLNR激活的相对效能，如N端或C端缺失或添加有一种或多种氨基酸的爱帕琳-13肽。
[0236] 使用为了检测hAPLNR的激活而开发的生物测定根据实施例2的方法(上述)来评估未修饰的爱帕琳-13肽(Bachem，#H-4568.0001)和本发明的经过修饰的爱帕琳肽对cAMP含量的调节。用Prism 5软件(GraphPad)使用非线性回归(4参数逻辑方程)分析结果。
[0237] 如表3中所示，爱帕琳-13可耐受N端和C端的氨基酸缺失，同时仍保留完全疗效，并且呈现与爱帕琳-13相比不同程度的效能降低。此外，爱帕琳-13可耐受其C端的氨基酸残基添加，如5个甘氨酸残基，并且仍保留完全疗效，但具有相对于爱帕琳-13降低的效能。预想Fc-爱帕琳融合蛋白的相似变化形式将维持其疗效。
[0238] 表3：爱帕琳肽和衍生物在CRE测定中维持疗效
[0239]
[0240] 实施例8-在CRE测定中修饰的爱帕琳融合蛋白的效能和疗效
[0241] 类似于实施例1制造多种爱帕琳-Fc融合蛋白，除了具有融合至hFc的经过修饰的爱帕琳肽，如SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43以及SEQ ID NO：44。所述hFc-爱帕琳13融合蛋白在爱帕琳肽组分的C端具有额外C端氨基酸。使用类似于实施例2和实施例7的方法(上述)的CRE生物测定评估与具有拴系至各肽的N端(hFc-爱帕琳13+)的hFc的经过修饰的爱帕琳-13肽相比爱帕琳-13肽对cAMP含量的调节。用Prism 5软件(GraphPad)使用非线性回归(4参数逻辑方程)分析结果。
[0242] 如表4中所示，经过修饰的爱帕琳融合蛋白(在爱帕琳肽组分的N端具有Fc并且在C端具有额外胺基酸)在所述APLNR处展现类似于未修饰的爱帕琳-13的活性的活性。在C端具有额外精氨酸的hFc-爱帕琳13融合蛋白以60ρM的EC50值激活HEK293/CRE-luc/hAPL NR细胞。在C端具有额外丝氨酸的hFc-爱帕琳13融合蛋白和在C端具有额外组氨酸的hFc-爱帕琳13融合蛋白各自分别以96ρM和203ρM的EC50值激活APLNR。在这种测定中，爱帕琳-13以56ρM的EC50值进行激活。
[0243] 表4：经过修饰的爱帕琳融合蛋白在CRE测定中维持疗效
[0244]
[0245] 实施例9-爱帕琳Fc融合物的心血管评估
[0246] 本发明的爱帕琳Fc融合蛋白的效应是通过在麻醉的小鼠和大鼠中进行心电描记术来分析，尤其是对RR间期(心率的指数)以及作为离子通道活性的指数的QT间期的效应。
[0247] 关于本发明的爱帕琳Fc融合蛋白，分析APLNR激动剂对通过在小鼠和大鼠中进行无线电遥测所获得的血压、心率以及活性的效应。这种方法涉及在颈动脉中植入压力传感器以测量主动脉血压、心率以及活性，同时进行持续数据监测。
[0248] 心脏功能也是通过确定APLNR激动剂体内所致的心脏收缩性的变化来分析。一种方法在小鼠或大鼠中使用微超声波或超声波心动描记术(ECG)。在小鼠或大鼠中应用爱帕琳Fc融合蛋白后，使用左心室舒张期末容积和收缩期末容积(EDV和ESV)的测量来监测左心室心脏功能的改变。也记录其它参数，如心室直径和心率，以便从微超声波扫描的所记录图象计算心输出量(CO)、射血分数(EF)、每搏量(SV)、缩短分数(FS)。
[0249] 由APNLR激动剂诱导或由拮抗剂阻断的各向同性也是通过在从小鼠或大鼠分离的心脏中利用ECG测量左心室压力和dP/dT(压力随时间的变化)、心率以及心脏传导使用Langendorf或Working Heart系统来分析。
[0250] 心肌缺血/再灌注：爱帕琳Fc融合多肽的效应可在心肌缺血/再灌注(I/R)损伤或低氧/再氧化(H/R)之后在分离的大鼠或小鼠心脏中用Langendorf系统分析(参见例如Zeng等人2009，Peptides，30(6)：1144-52，2009年2月24日电子出版)。执行短暂LAD接合，其中爱帕琳Fc融合多肽在再灌注之前施用。(参见例如Pisarenko等人2011，Bull Exp Biol Med.152(1)：79-82。)应用心脏功能的微超声波测量(上文所述)以确定在这方面的改进。梗塞大小是通过标准组织学技术来分析。
[0251] 预收缩的主动脉环的舒张如下进行分析：通过连接至力传感器的钛线悬挂来自小鼠或大鼠的胸主动脉的离体制剂。环用血管收缩剂(如苯肾上腺素、去甲肾上腺素(nor-epinephrine)或去甲肾上腺素(nor-adrenaline)、内皮素或血管紧张素II)预收缩。直径的增加和如通过所述力传感器所测量的力的减小指示诱导血管舒张的能力。(参见Iturrioz，X.等人2010，FASEB J，24(5)：1506-17，2009年12月29日电子出版；以及如Zhong等人，2007，Cardiovasc Res 74(3)：388-395中的Multi Myograph系统。)
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