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来自 植物的α-甘露糖苷酶以及使用所述α-甘露糖苷酶的方法

阅读：500发布：2020-08-13

专利汇可以提供来自植物的α-甘露糖苷酶以及使用所述α-甘露糖苷酶的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及来自植物的α-甘露糖苷酶序列及其用途，尤其含有调控所述α-甘露糖苷酶序列表达的调节元件、内含子和外显子序列和编码α-甘露糖苷酶的多核苷酸序列的基因组核苷酸序列。具有修饰的α-甘露糖苷酶活性的这类植物可以用于产生糖蛋白，所述糖蛋白具有益处巨大的改变的糖组成。本发明也涉及这些α-甘露糖苷酶用于水解甘露糖的用途。，下面是来自植物的α-甘露糖苷酶以及使用所述α-甘露糖苷酶的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基因修饰的烟草（Nicotiana tabacum）植物细胞或包含所述修饰的植物细胞的烟草（Nicotiana tabacum）植物，其中所述修饰的植物细胞在基因组区域中包含至少对第一靶核苷酸序列的修饰，所述基因组区域包含选自NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4的α-甘露糖苷酶I的编码序列和/或其等位变体，从而(i)α-甘露糖苷酶I在所述修饰的植物细胞中的活性或表达相对于未修饰的植物细胞改变。
2.根据权利要求1所述的修饰的烟草植物细胞或烟草植物，除(a)对第一靶核苷酸序列的修饰之外，其还包含(b)在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中至少对第二靶核苷酸序列的修饰，或(c)在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中至少对第三靶核苷酸序列的修饰，或(d)在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中至少对第四靶核苷酸序列的修饰，或者(a)和(b)、(a)和(c)、(a)和(d)、(b)和(c)、(b)和(d)、或(c)和(d)；或(a)和(b)和(c)、(a)和(b)和(d)、(a)和(c)和(d)、或(b)和(c)和(d)、或(a)和b)和(c)和(d)的组合，其中所述α-甘露糖苷酶I选自NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4，并且其中第一、第二、第三和第四α-甘露糖苷酶I彼此不同。
3.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的烟草植物细胞或烟草植物，其中所述第一、第二、第三和/或第四靶核苷酸序列具有
(i)与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64的至少76%序列同一性；或其部分；
(ii)与SEQ ID NO:30、SEQ ID NQ ID NO:94、SEQ ID NQ ID NO:61、SEQ ID NQ ID NO:96、SEQ ID NQ ID NO:92或SEQ ID NO:98中任一者的至少88%序列同一性；或其部分。
4.根据权利要求3所述的修饰的烟草植物细胞或烟草植物，其中所述第一、第二、第三和/或第四靶核苷酸序列包含、基本上包含以下序列或由其组成
(i)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64；或其部分；
(ii)SEQ ID NO:30、SEQ ID NQ ID NO:94、SEQ ID NQ ID NO:61、SEQ ID NQ ID NO:96、SEQ ID NQ ID NO:92或SEQ ID NO:98；或其部分。
5.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的烟草植物细胞或烟草植物，其中α-甘露糖苷酶I在所述所修饰的植物细胞中的活性或表达相对于未修饰的植物细胞(a)减少或(b)增加。
6.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的烟草植物的子代，其中所述子代植物包含在如前述权利要求的任一者中所限定的靶序列的至少一者中的修饰，其中所述α-甘露糖苷酶I的活性或表达相对于未修饰的植物细胞减少。
7.一种用于产生异源蛋白的方法，所述方法包括：
(a)向如权利要1至6任一项中所定义的修饰的烟草植物细胞或植物导入表达构建体，所述表达构建体包含编码异源糖蛋白、尤其用于制备疫苗的抗原、细胞因子、激素、凝血蛋白、载脂蛋白、用于人类中替代疗法的酶、免疫球蛋白或其片段的核苷酸序列；并且培养包含所述表达构建体的修饰的植物细胞，从而产生所述异源糖蛋白，其中与从未修饰的植物细胞获得的糖蛋白相比，所述糖蛋白基本上在其N-聚糖上缺少α-1,3连接的岩藻糖和β-1,2-连接的木糖，
(b)任选地，从所述植物细胞再生出植物，并且培育所述植物和其子代，以及(c)任选地收获所述糖蛋白。
8.一种多核苷酸，包含这样的核苷酸序列，其
(i)与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64具有至少76%序列同一性；或其部分；
(ii)与SEQ ID NO:30、SEQ ID NQ ID NO:94、SEQ ID NQ ID NO:61、SEQ ID NQ ID NO:96、SEQ ID NQ ID NO:92或SEQ ID NO:98中任一者具有至少88%序列同一性；或其部分；
(iii)编码包含下述序列的多肽，所述序列与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:99或其部分具有至少83%序列同一性；
(iv)互补链与核酸探针杂交，所述核酸探针由(i)-(iii)中任一者或SEQ ID NO:3至
29、SEQ ID NO:34、35、37至41、43至49和51至60；或SEQ ID NO:65至91中任一者的核苷酸序列组成；
(v)因遗传密码的简并性而偏离于(i)-(iii)中任一者限定的核苷酸序列或其部分，其中所述核苷酸序列或其部分编码显示出甘露糖水解活性的多肽。
9.一种具有甘露糖水解活性的多肽，选自：
(i)包含与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:99中所述的任何序列或其部分具有至少83%序列同一性的氨基酸序列的多肽；
(ii)由根据权利要求1的(i)-(v)所述的核苷酸序列表达的多肽；
(iii)由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:98或其部分中所述的核苷酸序列表达的多肽。
10.如权利要求8或9中限定的核苷酸序列或其部分的用途，用于鉴定以下序列中的靶位点进行修饰：
(a)包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中的第一靶核苷酸序列；或(b)a)的第一靶核苷酸序列和在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中的第二靶核苷酸序列；或
(c)a)的第一靶核苷酸序列、b)的第二靶核苷酸序列和在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中的第三靶核苷酸序列；
(d)a)的第一靶核苷酸序列、b)的第二靶核苷酸序列、c)的第三靶核苷酸序列和在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中的第四靶核苷酸序列；
全部靶核苷酸序列a)、b)、c)和d)；
从而α-甘露糖苷酶I在包含所述修饰的修饰植物细胞中的活性或表达相对于未修饰的植物细胞改变，其中所述α-甘露糖苷酶I选自NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2、和NtMan1.4，并且其中第一、第二、第三和第四靶α-甘露糖苷酶I彼此不同。
11.如权利要求10中限定的核苷酸序列的用途，用于产生在如权利要求8或权利要求
9中限定的核苷酸序列内部的位点选择性切割基因组DNA分子的非天然性大范围核酸酶蛋白。
12.如权利要求10中限定的核苷酸序列的用途，用于产生在如权利要求8或权利要求
9中限定的靶核苷酸序列至少之一中引入双链断口的锌指核酸酶。
13.一种植物组合物，其包含从植物可获得的异源糖蛋白，所述植物包含如权利要求
1-6任一项中所定义的修饰的植物细胞，其中与从未修饰的植物细胞获得的糖蛋白相比，所述糖蛋白基本上在其N-聚糖上缺少α-1,3-连接的岩藻糖和β-1,2-连接的木糖。
14.一种用于产生烟草植物细胞或烟草植物的方法，所述烟草植物包含能够产生人源化糖蛋白的修饰植物细胞，所述方法包括：
(i)在烟草植物细胞的基因组中修饰
(a)包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中的第一靶核苷酸序列；或(b)a)的第一靶核苷酸序列和在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中的第二靶核苷酸序列；或
(c)a)的第一靶核苷酸序列、b)的第二靶核苷酸序列和在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中的第三靶核苷酸序列；
(d)a)的第一靶核苷酸序列、b)的第二靶核苷酸序列和c)的第三靶核苷酸序列以及在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中的第四靶核苷酸序列；
全部靶核苷酸序列a)、b)、c)和d)；
(ii)鉴定并且任选地选择在所述靶核苷酸序列中包含所述修饰的修饰植物或植物细胞；
(iii)任选地使所述修饰植物与另一烟草属植物交配，
其中所述α-甘露糖苷酶I选自NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4，并且其中第一、第二、第三和第四靶α-甘露糖苷酶I彼此不同，并且其中α-甘露糖苷酶I在包含所述修饰的修饰植物细胞中的活性或表达相对于未修饰的植物细胞是改变的，从而与从未修饰的植物细胞获得的糖蛋白相比，由所述修饰的植物细胞产生的糖蛋白基本上在其N-聚糖上缺少α-1,3连接的岩藻糖和β-1,2-连接的木糖。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述靶核苷酸序列包含如权利要求8或9中限定的核苷酸序列。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中修饰烟草植物或植物细胞的基因组包括
(a)在烟草植物或植物细胞的靶核苷酸序列中和任选地在其至少一种等位变体中鉴定靶位点，
(b)基于如权利要求8或9中限定的核苷酸序列设计能够识别所述靶位点并且在所述靶位点处或毗邻于所述靶位点结合的致突变寡核苷酸，并且
(c)使所述致突变寡核苷酸与烟草植物或植物细胞的基因组中的靶核苷酸序列在使得所述基因组被修饰的条件下结合。

说明书全文

来自 植物的α-甘露糖苷酶以及使用所述α-甘露糖苷酶

的方法

[0001] 本发明涉及来自植物的α-甘露糖苷酶序列，尤其含有调控所述α-甘露糖苷酶序列表达的调节元件、内含子和外显子序列和编码α-甘露糖苷酶的多核苷酸序列的基因
组核苷酸序列。本发明也涉及这些序列调节植物中一种或多种α-甘露糖苷酶的表达以便
产生α-甘露糖苷酶活性增加或减少的植物的用途。具有修饰的α-甘露糖苷酶活性的这
类植物可以用于产生糖蛋白，所述糖蛋白具有益处巨大的改变的糖组成。本发明也涉及这
些α-甘露糖苷酶酶类用于水解甘露糖的用途。

[0002] 可以治疗性使用(例如，在人类中)的蛋白质的重组表达构成转基因植物的重要应用。然而，在植物中产生糖蛋白的主要困难是在植物产生的糖蛋白N-聚糖上
存在植物特异性β-1,2-木糖和α-1,3-岩藻糖，而这些植物特异性糖已知是高度免
疫原性的。天冬酰胺连接的或N-糖基化涉及添加多糖或N-聚糖至蛋白质，其称作
糖蛋白。N-糖基化过程涉及众多依次酶促步骤并且在植物和哺乳动物中是高度相似
的。N-糖基化始于添加前体Glc3-Man9-GlcNAc2低聚糖到天冬酰胺(Asn或N)残基
上，产生Glc3-Man9-GlcNAc2-AsnN-糖基化蛋白，其中Glc是葡萄糖，Man是甘露糖并且
GlcNAc是N-乙酰葡糖胺。随后依次加工这种前体，首先在内质网中由众多酶加工，始
于三种葡糖苷酶，葡糖苷酶I、II和III，产生Man9-GlcNAc2-AsnN-糖基化蛋白。接着，
一种或多种α-甘露糖苷酶I酶进一步修剪高甘露糖Man9-GlcNAc2-AsnN-聚糖，随后
修剪成Man8-GlcNAc2-Asn-聚糖、Man7-GlcNAc2-Asn、Man6-GlcNAc2-Asn-聚糖并最终
修剪成Man5-GlcNAc2-AsnN-聚糖。在高尔基体网络中，Man5-GlcNAc2-Asn进一步经历
加工和成熟。成熟中的第一步骤涉及通过添加N-乙酰葡糖胺至还原性末端使高甘露糖
Man5-GlcNAc2-AsnN-聚糖转化成杂合型N-聚糖，借助N-乙酰葡糖胺基转移酶I的活性产
生GlcNAc-Man5-GlcNAc2-AsnN-聚糖。成熟中的下一个步骤涉及由一种或多种α-甘露
糖苷酶II酶将GlcNAc-Man5-GlcNAc2-Asn水解成GlcNAc-Man4-GlcNAc2-Asn并最终水解
成GlcNAc-Man3-GlcNAc2-Asn N-聚糖。接着，通过N-乙酰葡糖胺基转移酶II添加额外的
GlcNAc以产生GlcNAc2-Man3-GlcNAc2-Asn N-聚糖。直至这个点，N-糖基化途径在哺乳动
物和植物中是相似的。在哺乳动物中，随后将α-1,6-岩藻糖(Fuc)添加至非还原性末端处
的第一GlcNAc以产生GlcNAc2-Man3-Fuc(α1,6)-GlcNAc2-Asn，并且分别通过β-1,4-半
乳糖基转移酶和α-2,3-唾液酸转移酶的作用添加一个或多个β-1,4-半乳糖(Gal)和
α-2,3-唾液酸(NeuAc)残基，产生NeuAc2-Gal2-GlcNAc2-Man3-Fuc(α1,6)-GlcNAc2-Asn
N-聚糖。在植物中，将木糖(Xyl)添加至β-1,2-键中的核芯甘露糖并且将α-1,3-岩藻
糖添加至非还原性末端处的第一GlcNAc，产生GlcNAc2-Man3-Xyl-Fuc(α1,3)-GlcNAc2-A
sn N-聚糖。

[0003] α-甘露糖苷酶水解寡甘露糖苷N-聚糖结构物并且由内质网驻留的α-甘露糖苷酶和高尔基体驻留的α-甘露糖苷酶组成。α-甘露糖苷酶I(EC3.2.1.113)是在内质网和
顺-高尔基体中水解寡甘露糖苷Man9至Man5N-聚糖的α-1,2-甘露糖苷酶(α(1,2)-甘
露糖苷酶)。α-甘露糖苷酶II(EC3.2.1.114)是完全高尔基体驻留的α-甘露糖苷酶并
且对α-1,3-甘露糖(α1,3-甘露糖)和α-1,6-甘露糖(α1,6-甘露糖)高度特异，并
且将寡甘露糖苷Man5和Man4杂合型N-聚糖水解成Man3N-聚糖。

[0004] 然而，鉴于在植物中产生重组蛋白的潜力，目前不可获得如上文所述的用于防止植物中添加植物特异性糖到糖蛋白上的方法。

[0005] 因此，迫切需要防止在植物中添加这类植物特异性糖到糖蛋白、尤其糖蛋白的N-聚糖上的方法。尤其，想要的是获得能够产生下述糖蛋白的植物和植物细胞，所述糖蛋白在糖蛋白的N-聚糖上基本上缺少α-1,3连接的岩藻糖和β-1,2-连接的木糖残基。通过
提供如独立权利要求的特征所限定的多核苷酸、多肽和方法，这种迫切需要由本发明讨论
并且解决。优选实施方案是从属权利要求的主题。

[0006] 本发明的多核苷酸、多肽和方法现在使得以下情况成为可能：在缺少植物特异性β-1,2-木糖和α-1,3-岩藻糖的植物细胞、植物或其部分中制备在糖蛋白的N-聚糖上含
有可变量甘露糖的异源糖蛋白。尤其，与对照对应物相比，转基因植物细胞、植物或其部分在糖蛋白的N-聚糖上显示出量受调节的甘露糖，并且可以出于产生药物组合物的目的用
于制备异源糖蛋白。包含植物产生的这类糖蛋白的药物组合物因此可以具有用于人受试者
中的有利免疫原性特征和改进功效。

[0007] 定义

[0008] 通常向本申请范围内所用的技术术语和表述给予在植物与分子生物学的相关领域中常适用于它们的含义。以下全部术语定义均适用于本申请的完整内容。词语“包含”不排除其他要素或步骤，并且非限制性冠词“一个”或“一种”不排除复数。单个步骤可以满足权利要求书中所提到的几个特征的功能。与某属性或值相联系的情况下，术语“基本上”、“约”、“大约”等还分别具体地确切限定该属性或确切限定该值。在给定数值或范围的情况下，术语“约”指处于给定值或范围的20%以内、10%以内或5%以内的值或范围。

[0009] 如本文所用的术语“多核苷酸”指核苷酸聚合物，其可以是未修饰或修饰的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。因此，多核苷酸可以是，而不限于基因组DNA、互补性
DNA(cDNA)、mRNA或反义RNA。另外，多核苷酸可以是单链或双链DNA、作为单链区和双链区的混合物的DNA、包含DNA和RNA的杂合分子或存在单链区和双链区混合的杂合分子。此
外，多核苷酸可以由包含DNA、RNA或这两者的三链区组成。一种多核苷酸可以含有一个或
多个修饰的碱基，如硫代磷酸酯，并且可以是肽核酸(PNA)。通常，由本发明提供的多核苷酸可以从分离的、扩增的或克隆的cDNA片段、基因组DNA片段、外显子序列片段、内含子序列片段、寡核苷酸片段或独立核苷酸片段或前述组合中装配出来。虽然本文所述的多核苷
酸序列显示为DNA序列，但是所述序列包括它们的相应RNA序列和它们的互补性DNA或RNA
序列，包括其反向互补物。

[0010] 如本文所用的术语“NtMNS1a多核苷酸”指核苷酸聚合物，其包含、由以下对象组成或基本上由其组成：本文中命名为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:94的分离的NtMNS1a基因、本文中命名为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:29的NtMNS1a外显子序列和本文中命名为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28的NtMNS1a内含子序列。这个术语也包括与SEQ ID
NO:1至SEQ ID NO:30中任一者具有实质同源性或序列相似性或实质同一性的多核苷酸；
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:94的片段，和与其具有实质同源性或序列相似性或实质同一性的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:94
的片段。

[0011] 如本文所述，所述变体可以与分离的NtMNS1a基因的序列具有至少50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、不过具体地至少74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、
85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。虽然本文所述的NtMNS1a多核苷酸序列显示为DNA序列，但是所述序列包括它们的相应RNA序
列和它们的互补性DNA或RNA序列，包括其反向互补物或互补物。

[0012] 如本文所用的术语“NtMNS1b多核苷酸”指核苷酸聚合物，其包含、由以下对象组成或基本上由其组成：本文中命名为SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:96分离的NtMNS1b基因、本文中命名为SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:60的NtMNS1b外显子序列和本文中命名为SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:59的NtMNS1b内含子序列。这个术语也包括与SEQ ID
NO:32至SEQ ID NO:61中任一者具有实质同源性或序列相似性或实质同一性的多核苷酸；
SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:61或SEQ ID NO:96的片段，和与其具有实质同
源性或序列相似性或实质同一性的变体的SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:61及
SEQ ID NO:96的片段。

[0013] 如本文所述，所述变体可以与分离的NtMNS1b基因的序列具有至少50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、不过具体地至少74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、
85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。虽然本文所述的NtMNS1b多核苷酸序列显示为DNA序列，但是所述序列包括它们的相应RNA序
列和它们的互补性DNA或RNA序列，包括其反向互补物或互补物。

[0014] 如本文所用，术语“NtMNS2多核苷酸”指核苷酸聚合物，其包含、由以下对象组成或基本上由其组成：本文中命名为SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:92分离的NtMNS2基因、本文中命名为SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:91的NtMNS2外显子序列和本
文中命名为SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:90的NtMNS2内含子序列。这个术语也包括与SEQID NO:63
至SEQ ID NO:92中任一者具有实质同源性或序列相似性或实质同一性的多核苷酸；SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64或SEQ IDNO:92的片段，和与其具有实质同源性或序列相似性或实质
同一性的SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:92的片段。

[0015] 如本文所述，所述变体可以与分离的NtMNS2基因的序列具有至少50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、不过具体地至少74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、
85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。虽然本文所述的NtMNS2多核苷酸序列显示为DNA序列，但是所述序列包括它们的相应RNA序列和它们的互补性DNA
或RNA序列，包括其反向互补物或互补物。

[0016] 如本文所用，术语“核苷酸序列”指核苷酸(包括但不限于核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)的聚合物的碱基序列。

[0017] 如本文所用，如本文所用的术语“NtMan1.4多核苷酸”指核苷酸聚合物，其包含本文中命名为SEQ ID NO:98的分离的NtMan1.4基因、由其组成或基本上由其组成。

[0018] 如本文所述，所述变体可以与分离的NtMan1.4基因的序列具有至少50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、不过具体地至少74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、
84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性。
虽然本文所述的NtMan1.4多核苷酸序列显示为DNA序列，但是所述序列包括它们的相应
RNA序列和它们的互补性DNA或RNA序列，包括其反向互补物或互补物。

[0019] 如本文所用的术语“分离”涉及从其天然环境取出的实体，但不意味着任何纯化程度。

[0020] 如本文所用，如本文所用的术语“基因序列”指编码多肽或生物活性RNA的核酸分子或多核苷酸的核苷酸序列，并且包括仅编码蛋白质片段的部分编码序列的核苷酸序列。基因序列也可以包括对相对于编码序列位于上游或下游的基因的表达具有调节功能的序
列，例如但不限于基因的非翻译前导序列序列和启动子序列及终止子序列，以及内含子序
列和外显子序列。

[0021] 术语“NtMNS1a多肽”指包含由分离的NtMNS1a基因编码的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的多肽或本文中分别命名为SEQID NO:31和SEQ ID NO:95的多肽。这
个术语也包括与SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:95具有实质同源性或序列相似性或实质同一
性的多肽；SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:95的片段；和与其具有实质同源性或序列相似性或
实质同一性的SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:95的片段。NtMNS1a多肽包含这些序列，所述序
列包含分别与可以水解甘露糖的SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:95足够或相当大的同一性或
相似性程度。NtMNS1a多肽也包括可以人为工程化或天然分离的因以下情况产生的变体或
突变体：导入任何类型的改变，如但不限于氨基酸的插入、缺失、或置换；糖基化状态变化，包括N-糖基化；影响再折叠或异构化、三维结构或自我缔合状态的变化。NtMNS1a多肽可以处于线型形式或使用已知方法环化。如本文所述，所述变体可以与NtMNS1a多肽的序列具
有至少50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、不过具体地至少76%、77%、78%、79%、80%、
81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%同一性或与NtMNS1a多肽的序列具有至少84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、
94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性。

[0022] 术语“NtMNS1b多肽”指包含由分离的NtMNS1a基因编码的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的多肽或本文中分别命名为SEQID NO:62和SEQ ID NO:97的多肽。这
个术语也包括与SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:97具有实质同源性或序列相似性或实质同一
性的多肽；SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:97的片段；和与其具有实质同源性或序列相似性或
实质同一性的SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:97的片段。NtMNS1b多肽包含这些序列，所述序
列包含分别与可以水解甘露糖的SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:97足够或相当大的同一性或
相似性程度。NtMNS1b多肽也包括可以人为工程化或天然分离的因以下情况产生的变体或
突变体：导入任何类型的改变，如但不限于氨基酸的插入、缺失、或置换；糖基化状态变化，包括N-糖基化；影响再折叠或异构化、三维结构或自我缔合状态的变化。NtMNS1b多肽可以处于线型形式或使用已知方法环化。如本文所述，所述变体可以与NtMNS1b多肽的序列具
有至少50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、74%、不过具体地至少75%、76%、77%、78%、79%、80%、
81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%同一性或与NtMNS1b多肽的序列具有至少84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、
94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性。

[0023] 术语“NtMNS2多肽”指包含由分离的NtMNS2基因编码的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的多肽或本文中命名为SEQ ID NO:93的多肽。这个术语也包括与SEQ ID
NO:93具有实质同源性或序列相似性或实质同一性的多肽；SEQ ID NO:93的片段；和与其
具有实质同源性或序列相似性或实质同一性的SEQ ID NO:93的片段。NtMNS2多肽包含这
些序列，所述序列包含与可以水解甘露糖的SEQ ID NO:93足够或相当大的同一性或相似
性程度。NtMNS2多肽也包括可以人为工程化或天然分离的因以下情况产生的变体或突变
体：导入任何类型的改变，如但不限于氨基酸的插入、缺失、或置换；糖基化状态变化，包括N-糖基化；影响再折叠或异构化、三维结构或自我缔合状态的变化。NtMNS2多肽可以处于
线型形式或使用已知方法环化。如本文所述，所述变体可以与NtMNS2多肽的序列具有至
少50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、不过具体地至少74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、
82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或与NtMNS2多肽的序列具有至少83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、
94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性。

[0024] 术语“NtMan1.4多肽”指包含由分离的NtMan1.4基因编码的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的多肽或本文中命名为SEQ ID NO:99的多肽。这个术语也包括与SEQ
ID NO:99具有实质同源性或序列相似性或实质同一性的多肽；SEQ ID NO:99的片段；和与
其具有实质同源性或序列相似性或实质同一性的SEQ ID NO:99的片段。NtMan1.4多肽包
含这些序列，所述序列包含与可以水解甘露糖的SEQ ID NO:99足够或相当大的同一性或相
似性程度。NtMan1.4多肽也包括可以人为工程化或天然分离的因以下情况产生的变体或突
变体：导入任何类型的改变，如但不限于氨基酸的插入、缺失、或置换；糖基化状态变化，包括N-糖基化；影响再折叠或异构化、三维结构或自我缔合状态的变化。NtMan1.4多肽可以
处于线型形式或使用已知方法环化。如本文所述，

[0025] 所述变体可以与NtMan1.4多肽的序列具有至少50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、不过具体地至少74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或与NtMan1.4多肽的序列具有至少83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性。

[0026] 术语“NtMNS1a基因序列”指分别编码SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:95的NtMNS1a多肽或生物活性RNA的核酸分子或多核苷酸的核苷酸序列，并且包括仅编码NtMNS1a多肽
片段的部分编码序列的核苷酸序列。基因序列也可以包括对相对于编码序列位于上游或下
游的基因的表达具有调节功能的序列，如但不限于基因的非翻译前导序列序列和启动子序
列及终止子序列，以及内含子序列和外显子序列。

[0027] 术语“NtMNS1b基因序列”指分别编码SEQ ID NO:62和SEQ IDNO:97的NtMNS1b多肽或生物活性RNA的核酸分子或多核苷酸的核苷酸序列，并且包括仅编码NNtMNS1b多肽
片段的部分编码序列的核苷酸序列。基因序列也可以包括对相对于编码序列位于上游或下
游的基因的表达具有调节功能的序列，如但不限于基因的非翻译前导序列序列和启动子序
列及终止子序列，以及内含子序列和外显子序列。

[0028] 术语“NtMNS2基因序列”指编码SEQ ID NO:93的NtMNS2多肽或生物活性RNA的核酸分子或多核苷酸的核苷酸序列，并且包括仅编码NtMNS2多肽片段的部分编码序列的
核苷酸序列。基因序列也可以包括对相对于编码序列位于上游或下游的基因的表达具有调
节功能的序列，如但不限于基因的非翻译前导序列序列和启动子序列及终止子序列，以及
内含子序列和外显子序列。

[0029] 术语“NtMan1.4基因序列”指编码SEQ ID NO:99的NtMan1.4多肽或生物活性RNA的核酸分子或多核苷酸的核苷酸序列，并且包括仅编码NtMan1.4多肽片段的部分编码序
列的核苷酸序列。基因序列也可以包括对相对于编码序列位于上游或下游的基因的表达具
有调节功能的序列，如但不限于基因的非翻译前导序列序列和启动子序列及终止子序列，
以及内含子序列和外显子序列。

[0030] 如本文所用的术语“载体”指包含使得转运核酸、核酸构建体和核酸缀合物等成为可能的DNA组分组合的核酸载体。合适的载体包括但不限于能够在染色体外复制的附加体(如环状双链DNA质粒)；线性化双链DNA质粒；能够转移T-DNA至植物细胞核的双元载体；
和任何来源的其他载体。

[0031] 如本文所用的术语“表达载体”指包含使得表达核酸、核酸构建体和核酸缀合物等成为可能的DNA组分组合的核酸载体。合适的表达载体包括但不限于能够在染色体外复制的附加体(如环状双链DNA质粒)；线性化双链DNA质粒；能够转移T-DNA至植物细胞胞核
的双元载体；和任何来源的功能上等同的其他表达载体。如下文定义，表达载体包含至少位于核酸、核酸构建体或核酸缀合物上游并与之有效连接的启动子。

[0032] 术语“构建体”指包含NtMNS1a、NtMNS1b、rNtMNS2或NtMan1.4多核苷酸的双链重组DNA片段。该构建体包含与互补性“有义或编码链”碱基配对的“模板链”。可以将给定的构建体以两种可能方向即相对于位于载体(如表达载体和尤其双元表达载体)内部的启动子的方向以相同(或有义)方向或以反(或反义)方向插入载体中。

[0033] 术语“模板链”指包含下述序列的链，其中所述序列互补于DNA双链体，如NtMNS1a、NtMNS1b、rNtMNS2或 NtMan1.4基因组片段、NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2 或NtMan1.4cDNA或NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4构建体，或包含可以由RNA聚合酶
转录的核酸序列的任何DNA片段的“有义或编码链”的序列。在转录期间，RNA聚合酶可以
在新生RNA合成期间沿模板链以3'至5'方向位移。

[0034] 本文中与术语“编码链”可互换使用使用的术语“有义链”指包含与DNA双链体中模板链的序列互补的序列的链。例如，用于鉴定NtMNS1a基因组克隆的有义链的序
列(“有义序列”)命名为SEQ ID NO:1或SEQID NO:2。例如，如果有义链包含假定序列
5'-TAATCCGGT-3'，则在假定性靶mRNA内部基本上相同的相应序列是5'-UAAUCCGGU-3'。

[0035] 术语“反向互补序列”指与“目的有义序列”互补如例如相对于有义序列相同方向以位于相同链内部的外显子序列互补的序列。例如，如果一条链包含假定序列
5'-TAATCCGGT-3'，则反向互补序列5'-ACCGGATTA-3'可以与间隔序列所分隔的有义序列
有效连接。

[0036] 与“NtMNS1a RNA”可互换使用的术语“NtMNS1a RNA转录物”包括目的宿主植物细胞内部产生的多核糖核酸分子，因转录内源NtMNS1a基因例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:94产生。因此，这个术语包括作为转录产物从NtMNS1a产生的任何RNA种类或RNA变体，包括在结构性或功能性水平具有足够相似性的那些RNA种类或RNA变体。例如，NtMNS1a RNA转录物包括：(1)从分离的NtMNS1a基因例如SEQ ID NO:1、SEQ
ID NO:2、SEQ IDNO:30或SEQ ID NO:94的转录中产生的前mRNA和mRNA；(2)从任何基因的
转录中产生的前mRNA和mRNA，所述任何基因与分离的NtMNS1a基因(如与鉴定的NtMNS1a
基因基本上相同并且编码α-甘露糖苷酶I酶的相关同工型的其他不同基因)的序列具
有至少50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、不过具体地至少74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、
81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性；和(3)从NtMNS1a基因的等位基因的转录中产生的前mRNA和mRNA。NtMNS1a
RNA转录物包括因特定NtMNS1a基因的不均一RNA(“hnRNA”)的可变RNA剪接反应而产生
的RNA变体、因这类可变RNA剪接反应产生的mRNA变体和任何中间RNA变体。

[0037] 与“NtMNS1b RNA”可互换使用的术语“NtMNS1b RNA转录物”包括目的宿主植物细胞内部产生的多核糖核酸分子，因转录内源NtMNS1b基因例如SEQ ID NO:32、SEQ ID
NO:33、SEQ ID NO:61或SEQ IDNO:96产生。因此，这个术语包括作为转录产物从NtMNS1b
产生的任何RNA种类或RNA变体，包括在结构性或功能性水平具有足够相似性的那些RNA
种类或RNA变体。例如，NtMNS1b RNA转录物包括：(1)从分离的NtMNS1b基因例如SEQ ID
NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:61或SEQ ID NO:96的转录中产生的前mRNA和mRNA；(2)
从任何基因的转录中产生的前mRNA和mRNA，所述任何基因与分离的NtMNS1b基因(如与
鉴定的NtMNS1b基因基本上相同并且编码α-甘露糖苷酶I酶的相关同工型的其他不同基
因)的序列具有至少50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、不过具体地至少74%、75%、76%、77%、
78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、
97%、98%或99%序列同一性；和(3)从NtMNS1b基因的等位基因的转录中产生的前mRNA和
mRNA。NtMNS1b RNA转录物包括因特定NtMNS1b基因的不均一RNA(“hnRNA”)的可变RNA
剪接反应而产生的RNA变体、因这类可变RNA剪接反应产生的mRNA变体和任何中间RNA变
体。

[0038] 与“NtMNS2RNA”可互换使用的术语“NtMNS2RNA转录物”包括目的宿主植物细胞内部产生的多核糖核酸分子，因转录内源NtMNS2基因例如SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64或
SEQ ID NO:92产生。因此，这个术语包括作为转录产物从NtMNS2产生的任何RNA种类或
RNA变体，包括在结构性或功能性水平具有足够相似性的那些RNA种类或RNA变体。例如，
NtMNS2RNA转录物包括：(1)从分离的NtMNS2基因例如SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64或SEQ
ID NO:92的转录中产生的前mRNA和mRNA；(2)从任何基因的转录中产生的前mRNA和mRNA，
所述任何基因与分离的NtMNS2基因(如与鉴定的NtMNS2基因基本上相同并且编码α-甘
露糖苷酶I酶的相关同工型的其他不同基因)的序列具有至少50%、55%、60%、70%、71%、72%、
73%、不过具体地至少74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、
88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性；和(3)从NtMNS2基因的等位基因的转录中产生的前mRNA和mRNA。NtMNS2RNA转录物包括因特定NtMNS2基因
的不均一RNA(“hnRNA”)的可变RNA剪接反应而产生的RNA变体、因这类可变RNA剪接反
应产生的mRNA变体和任何中间RNA变体。

[0039] 与“NtMan1.4RNA”可互换使用的术语“NtMan1.4RNA转录物”包括目的宿主植物细胞内部产生的多核糖核酸分子，因转录内源NtMan1.4基因例如SEQ ID NO:98产生。因此，这个术语包括作为转录产物从NtMan1.4产生的任何RNA种类或RNA变体，包括在结构性或
功能性水平具有足够相似性的那些RNA种类或RNA变体。例如，NtMan1.4RNA转录物包括：
(1)从分离的NtMan1.4基因例如SEQ ID NO:98的转录中产生的前mRNA和mRNA；(2)从
任何基因的转录中产生的前mRNA和mRNA，所述任何基因与分离的NtMan1.4基因(如与鉴
定的NtMan1.4基因基本上相同并且编码α-甘露糖苷酶I酶的相关同工型的其他不同基
因)的序列具有至少50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、不过具体地至少74%、75%、76%、77%、
78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、
97%、98%或99%序列同一性；和(3)从NtMan1.4基因的等位基因的转录中产生的前mRNA和
mRNA。NtMan1.4RNA转录物包括因特定NtMan1.4基因的不均一RNA(“hnRNA”)的可变RNA
剪接反应而产生的RNA变体、因这类可变RNA剪接反应产生的mRNA变体和任何中间RNA变
体。

[0040] 术语“上游”指沿线型多核苷酸序列相对于参比元件的相对方向或位置，其指示朝向多核苷酸序列5'末端的方向或位置。“上游”可以与“参比元件的5'末端”可互换地使用。

[0041] 术语“有效连接”指接合不同DNA元件、片段或序列以产生有功能的转录单位或有功能的表达载体。

[0042] 术语“启动子”指分别位于双链DNA片段如SEQ ID NO:30、SEQID NO:94、SEQID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92或SEQID NO:98的NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或
NtMan1.4cDNA或RNAi构建体上游并与之有效连接的核酸元件或序列。在后一种构建体的
情况下，合适启动子通过召集包含RNA聚合酶和各种因子的转录复合物以启动RNA合成，使
NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4RNAi构建体的转录激活成为可能。启动子可以完全
源自靠近目的天然基因的区域，或可以由源自不同天然启动子的不同元件或合成性DNA区
段组成。

[0043] 术语“增强子”指可以召集转录调节蛋白如转录激活蛋白以通过增加启动子活性而增强转录激活的核酸分子或核酸序列。合适的增强子可以源自靠近目的天然启动子的
区域(同源来源)或可以源自非天然环境(异源来源)并与NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或
NtMan1.4构建体，如cDNA表达载体或RNAi表达载体内部的任何目的启动子有效连接以增
强启动子的活性或组织特异性。一些增强子可以相对于转录单元的方向以任何方向运转。
例如，增强子可以位于包含启动子和NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4构建体的转录
单位的上游或下游。

[0044] 如本文所用，术语“植物”指处于其生活周期或发育的任何阶段的任何植物及其子代。

[0045] 如本文所用的术语“植物细胞”指植物的结构及生理单元。植物细胞可以处于以下形式：无细胞壁的原生质体、分离的单个细胞或培养的细胞、或作为更高组织化单元(如但不限于植物组织、植物器官或完整植物)的部分。

[0046] 术语“植物细胞培养物”指植物细胞的培养物，如但不限于原生质体、细胞培养细胞、培养的植物组织中的细胞、外植体中的细胞和花粉培养物。

[0047] 术语“植物材料”指任何固体、液体或气态组合物或其组合，其从植物，包括叶、茎、根、花或花部分、果实、花粉、卵细胞、配子、种子、插枝、分泌物、提取物、细胞或组织培养物，或植物的任何其他部分或产物可获得。

[0048] 术语“植物组织”涉及组织成结构单元或功能单元的植物细胞群组。包括在植物中或在培养物中的任何植物组织。这个术语包括，但不限于整个植株、植物器官和种子。

[0049] 术语“植物器官”涉及植物的不同或分化部分，如根、茎、叶、花芽或胚。

[0050] 术语“异源序列”指不天然地在细胞或目的生物中给定基因组的环境(如但不限于核基因组、质体基因组或线粒体基因组)下存在的生物序列。

[0051] 术语“异源蛋白”指由细胞产生但是不天然存在于这种细胞中的蛋白质。例如，在植物细胞中产生的异源蛋白可以是哺乳动物蛋白或人蛋白。异源蛋白可以含有在共翻译或翻译后修饰时与多肽主链共价连接的一个或多个低聚糖链如N-聚糖。

[0052] 术语“N-聚糖”指与作为蛋白质主链中Asn-Xaa-Ser或Asn-Xaa-Thr序列基序的部分的天冬酰胺(Asn或N)残基连接的糖或低聚糖链，其中Xaa可以是除脯氨酸之外的任
何氨基酸，Ser是蛋白质主链上的丝氨酸并且Thr是苏氨酸氨基酸并且Asn是天冬酰胺。

[0053] 术语“N-糖基化”指这样的过程，其始于从内质网膜中的多萜醇部分转移特定多萜醇(Dol)脂质连接的前体低聚糖(Dol-PP-GlcNAc2-Man9-Glc3)到作为蛋白质主链
中Asn-Xaa-Ser或Asn-Xaa-Thr基序的部分的天冬酰胺残基(Asn)的游离氨基上，产生
Glc3-Man9-GlcNAc2-Asn糖基化蛋白。如本文所用，缩写“Man”指甘露糖；“GlcNAc”指N-乙酰葡糖胺；“Glc”指葡萄糖；“Xyl”指木糖；“Fuc”指岩藻糖；“Gal”指半乳糖和“NeuAc”指唾液酸。GlcNAc2中的下标2指存在2个N-乙酰葡糖胺残基；Man3中的下标3指存在3个
甘露糖；并且Man5指5个甘露糖。附加物或α-1,3或α(1,3)指相应糖与N-聚糖上成直
线的下一个糖的连接。

[0054] 术语“N-聚糖的非还原性末端”指与蛋白质主链的天冬酰胺连接的N-聚糖部分。

[0055] 术语“N-聚糖的还原性末端”指与非还原性末端相对并通过水解自由地还原的N-聚糖部分。

[0056] 术语“α-甘露糖苷酶I”指I类α-甘露糖苷酶(EC3.2.1.113)，它们是对α(1,2)-甘露糖残基高度特异的转化糖基水解酶。

[0057] 术语“α-甘露糖苷酶II”指II类α-甘露糖苷酶(EC3.2.1.114)，它们是α(1,3)-和α(1.6)-甘露糖残基高度特异并且一般驻留在高尔基体中等转化糖基水解
酶。

[0058] 术语“β-1,2-木糖基转移酶”或“β(1,2)-木糖基转移酶”指命名为EC2.4.2.38的木糖基转移酶，其将木糖以β-1,2-键(β(1,2)-木糖基)添加到糖蛋白的N-聚糖的三甘露糖基(Man3)芯结构的β-1,4连接的甘露糖(β(1,4)-甘露糖)上。

[0059] 术语“α-1,3-岩藻糖基转移酶”或“α(1,3)-岩藻糖基转移酶”指命名为EC2.4.1.214的岩藻糖基转移酶，其将岩藻糖以α-1,3-键(α(1,3)-岩藻糖)添加在N-聚
糖的非还原性末端处的近端N-乙酰葡糖胺残基上。

[0060] 术语“N-乙酰葡糖胺基转移酶I”指命名为EC2.4.1.101的酶，其将N-乙酰葡糖胺添加至Man5-GlcNAc2-Asn低聚甘露糖基受体的1-3臂上的甘露糖。

[0061] 术语“减少”或“减少的”指减少约10%至约99%或减少至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少
95%、至少98%或直至100%的量或活性，如但不限于酶活性、转录活性、核糖核酸及蛋白质表达。

[0062] 术语“增加”或“增加的”指增加约10%至约1000%或增加至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少75%、至少100%、至少200%、至少250%、至少500%、至少750%或直至1000%的量或活性，如但不限于酶活性、转录活性、核糖核酸及蛋白质表达。

[0063] 术语“抑制”或“抑制的”指减少约95%、至约100%或减少至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、但尤其100%的量或活性，如但不限于酶活性、转录活、核糖核酸及蛋白质表达。

[0064] 如本文所用，术语“基本上抑制”或“基本上抑制的”指减少约80%至约100%或减少至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或高达100%的量或活性，如但不限于酶活性、转录活性、核糖核酸及蛋白质表达。

[0065] 如本文所用，术语“基本上增加”或“基本上增加”指增加约100%至约1000%或增加至少100%、至少200%、至少250%、至少300%、至少400%、至少500%或直至1000%的量或活性，如但不限于酶活性、转录活性、核糖核酸及蛋白质表达。

[0066] 术语“基因组编辑”或“基因组编辑技术”指用于修饰生物基因组中的核苷酸序列的任何方法，如但不限于锌指核酸酶介导的诱变、化学诱变、辐射诱变、或大范围核酸酶介导的诱变。

[0067] 术语“锌指核酸酶”指由锌指DNA结合结构域和DNA-切割结构域组成的蛋白质。锌指DNA结合结构域可以是天然的或经工程化以靶向特定多核苷酸或基因序列。一旦与靶
多核苷酸或核酸结合，锌指核酸酶产生断口，所述断口激活内源DNA修复装置的断口，产生修饰的多核苷酸或核苷酸序列。

[0068] 术语“大范围核酸酶”指具有特异性识别大约12至40碱基对结合位点的内切脱氧核糖核酸酶活性的蛋白质。大范围核酸酶可以经基因修饰以便与特定位点结合。一旦结
合，大范围核酸酶产生可以激活DNA修复、导致同源重组的DNA断口。

[0069] 如本文所用的术语“外显子”指在部分前体RNA(内含子)已经由顺式剪接作用移除后或当两个或更多个前体RNA分子已经由反式剪接作用连接时以成熟RNA分子形式表示
的核苷酸序列。成熟RNA分子可以是信使RNA或非编码性RNA如rRNA或tRNA的功能形式
取决于上下文，外显子可以指DNA或其RNA转录物中的序列。

[0070] 如本文所用的术语“内含子”指基因内部不翻译成蛋白质的核苷酸序列在。这些非编码区段转录成前体mRNA(前mRNA)和一些其他RNA(如非编码长RNA)，并随后在加工期
间由称作剪接的过程移除成为成熟RNA。在内含子剪接后，mRNA仅由翻译成蛋白质的外显
子衍生序列组成。

[0071] 在两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列的情况下，术语“同一性百分数”或“序列同一性”指两个或更多个序列或子序列，其中为最大对应性(如使用以下序列比较算法之一或通过视检所测量)进行比较和比对时，所述序列或子序列是相同的或具有指定百分
数的相同氨基酸残基或核苷酸。术语“同一性”在核苷酸序列或氨基酸序列的情况下本文
中用来描述至少50%、至少55%、至少60%、尤其至少70%、尤其至少71%、尤其至少72%、尤其至少73%、尤其至少74%、尤其至少75%更具体地至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少
97%、至少98%、至少99%或100%彼此相同的两个序列。

[0072] 如果待彼此比较的两个序列在长度上不同，则序列同一性优选地涉及与较长序列的核苷酸残基相同的较短序列的核苷酸残基的百分数。如本文所用，考虑到需要为最佳比
对这两个序列而导入的空位的数目和每个空位的长度，两个序列之间的同一性百分数是所
述序列共有的相同位置的函数(即，％同一性=相同位置#/位置总#x100)。可以使用如
本文以下描述的数学算法，完成序列的比较和两个序列之间同一性百分数的确定。例如，
可以采用计算机程序如Bestfit程序(Wisconsin SequenceAnalysis Package，用于Unix
的第8版，Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive
Madison,WI53711)常规确定序列同一性。Bestfit利用Smith和Waterman,Advances
in AppliedMathematics2(1981),482-489的局部同源性算法，以便找到两个序列之间具
有最高序列同一性的区段。当使用Bestfit或另一种序列比对程序以确定特定序列是
否与本发明的参比序列具有例如95%同一性时，优选地如此调节参数，从而在参比序列
的整个长度范围内计算同一性百分数并且允许至多到参比序列中5%核苷酸总数的同源
性空位。当使用Bestfit时，优选地任由所谓的任选参数处于其预设(“默认”)值。在
给定序列和本发明的上述序列之间比较时出现的偏离可以由例如添加、缺失、置换、插入
或重组引起。这种序列比较也可以优选地用程序“fasta20u66”实施(第2.0u66版，
1998年9月，William R.Pearson和弗吉尼亚大学；见也W.R.Pearson(1990),Methods
in Enzymology183,63-98)。为此目的，可以使用“默认”参数设置。可选地，可以通过
使用EMBOSS needle计算机程序比较序列信息，确定两个序列的同一性百分数(Rice等
人,(2000)Trends in Genetics16:276-277)。EMBOSS needle读入两个输入序列并且将
它们的最佳全序列比对结果写成文件。它使用Needleman-Wunsch比对算法(Needleman
和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453)来沿着整个长度找到两条序列的最佳比对结果
(包含空位)。同一性值是在所报道的比对区域(包括任何长度的空位)范围内两条序列
之间的相同匹配的百分数。

[0073] 如果通过序列比较法待比较的两个核苷酸序列在同一性方面不同，则指较短的序列和较长序列中与较短序列匹配的部分。换句话说，当比较的序列不具有相同的长度时，同一性程度优选地指较短序列中与较长序列内核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分数或指
较长序列中与较短序列内核苷酸序列相同的核苷酸的百分数。在这种情况下，技术人员容
易地在位置方面确定较长序列中“匹配”较短序列的部分。

[0074] 例如，与本文中所述的核苷酸或氨基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、尤其至少70%、尤其至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸或氨基酸序列可以表示这些序列的等位基因、衍生物或变体，它们优选地具有相似的生
物学功能。它们可以是天然存在的变型，例如等位序列、来自其他生态型、品种、物种等的序列，或是突变。所述突变可能已经天然地形成或可能已经通过人为诱变方法(如本发明中
公开的那些)产生。此外，所述变型可以是合成产生的序列。等位变体可以是天然存在的
变体或合成产生的变体或通过重组DNA技术产生的变体。可能已经例如通过缺失、置换、添加、插入或重组或者插入和重组产生距离上述多核苷酸的偏离。术语“添加”指添加至少一个核酸残基或氨基酸至给定序列的末端，而“插入”指在给定序列内部插入至少一个核酸残基或氨基酸。

[0075] 两个核酸序列基本上相同的另一个指标是这两个多核苷酸在严格条件下彼此杂交。短语“特异性杂交”指某分子在严格条件下仅与特定核苷酸序列结合、形成双链体或杂交，此时所述序列存在于复杂混合物(例如，总细胞DNA或RNA)中。“基本上结合”指核酸
探针和靶核酸之间的互补性杂交并且包括可以通过降低杂交介质的严格性而容许的少量
错配以实现所需的对靶核酸序列的检测。

[0076] 能够与本文中提供的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列可以例如从植物的基因组DNA文库或cDNA文库分离。尤其，这类多核苷酸来自植物来源，特别优选来自属于烟草
属(Nicotiana)的植物。可选地，这类核苷酸序列可以通过基因工程或化学合成法制备。

[0077] 可以通过使用本文中描述的多核苷酸序列或其部分或其反向互补物，通过例如根据标准方法的杂交(见例如Sambrook和Russell(2001),Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,CSH Press,Cold SpringHarbor,NY,USA)，鉴定并分离能够发生杂交的这类多核苷酸序列。包含如所列的SEQ ID NO中显示的相同或基本上相同核苷酸序列的核
苷酸序列或其部分或片段可以例如作为杂交探针使用。用作杂交探针的片段也可以是通过
常规合成技术制备的合成片段，所述合成片段的序列与本发明的核苷酸序列基本上相同。

[0078] 在核酸杂交实验如DNA印迹和RNA印迹杂交的背景下，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下不同。较长的序列在较高的
 温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导存在Tijssen(1993)Laboratory Techniques
in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,
第I部分第2章,“Overview of principles of hybridization and the strategy of
nucleicacid probe assays(杂交原理和核酸分析策略概述)”Elsevier,New York中。通
常，选择高度严格杂交和洗涤条件比限定的离子强度和pH下特定序列的热解链温度低约
5°C。一般，在“严格条件”下，探针将与其靶标子序列杂交，而不与其他序列杂交。

[0079] 热解链温度是(在限定的离子强度和pH时)这样的温度，其中50%靶序列在所述温度与完美匹配的探针杂交。选择非常严格的条件等同于特定探针的解链温度(Tm)。用于
DNA印迹法或RNA印迹法中在滤膜上杂交具有多于100个互补残基的互补核酸的严格杂交
条件的例子是在42°C存在1mg肝素时50%甲酰胺，其中所述杂交实施过夜。高度严格的洗
涤条件的例子是在72°C时0.15M NaCl持续约15分钟。严格洗涤条件的例子是在65°C
时0.2倍浓度SSC洗涤液持续15分钟(对于SSC缓冲液的描述，见Sambrook，上文)。经
常地，高严格性洗涤之前是低严格性洗涤以除去背景探针信号。用于例如多于100个核苷
酸的双链体的中等严格性洗涤的例子是在45°C时1倍浓度SSC持续15分钟。用于例如
多于100个核苷酸的双链体的低严格性洗涤的例子是在40°C时4-6倍浓度SSC持续15
分钟。对于短探针(例如，约10至50个核苷酸)，严格条件一般地涉及小于约1.0M钠离子
的盐浓度，一般在pH7.0至8.3约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，并且温度一般是
至少约30°C。也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺实现严格条件。通常，2倍于(或高于)
特定杂交测定法中对不相关探针所观察的信噪比表示检测到特异性杂交。在严格条件下彼
此不杂交的核酸仍是基本上相同，如果它们编码的蛋白质是基本上相同。例如当使用遗传
密码所允许的最大密码子简并性产生核酸复本时，这种情况出现。

[0080] 如本文中公开那样，本发明提供用于修饰植物或植物细胞中的核苷酸序列，产生植物或植物细胞的方法，所述植物显示出甘露糖苷酶的酶活性的降低、抑制或基本上抑或
减少水平的甘露糖苷酶表达。酶活性的降低、抑制或基本上抑或表达水平的变化是相对于
天然存在的植物细胞、未修饰的植物细胞或未经本发明方法经修饰的植物细胞中的情况，
其中可以使用所述植物细胞的任一种作为对照。可以通过本领域已知的任何方法实施酶活
性或表达水平针对这种对照的比较。

[0081] 本领域已知的许多方法可以用来突变本发明α甘露糖苷酶基因的核苷酸序列。在基因序列中随机导入突变的方法可以是，但不限于，化学诱变，例如但不限于EMS诱变和辐射诱变。向基因序列如NtMNS1a、NtMNS1b或NtMSN2基因序列导入靶向突变的方法包括
但不限于各种基因组编辑技术，尤其锌指核酸酶介导的诱变、耕作(tilling，基因组内定向诱导的局部损伤，如McCallum等人,Plant Physiol,2000年6月，第123卷，第439-442页
和Henikoff等人,Plant Physiology135:630-636(2004)中所述)、同源重组、寡核苷酸定
向诱变，和大范围核酸酶介导的诱变。本领域已知的用于筛选突变基因序列的许多方法可
以用来鉴定或证实突变。

[0082] 本发明的方法因此包括通过施加诱变如化学诱变或辐射诱变，修饰植物细胞中编码本发明α甘露糖苷酶的序列。本发明的另一种方法包括通过应用基因组编辑技术，如但
不限于锌指核酸酶介导的诱变、“耕作”(基因组内定向诱导的局部损伤)、同源重组、寡核苷酸定向诱变，和大范围核酸酶介导的诱变，修饰编码本发明α甘露糖苷酶的序列中的靶位
点。

[0083] 鉴于多种α甘露糖苷酶、变体和等位基因可能在植物细胞中有活性，为了实现酶活性的降低、基本上抑制或完全抑制，构思了在植物细胞中修饰编码α甘露糖苷酶的多于
一种基因序列。在本发明的优选实施方案中，通过采用本领域已知的一项或多项基因组编
辑技术产生这种修饰。可以通过众多策略产生本发明的修饰的植物细胞。

[0084] 本发明的修饰的植物细胞或修饰的植物可以因产生突变α甘露糖苷酶而鉴定，所述突变α甘露糖苷酶具有与未修饰的植物或植物细胞中产生的α甘露糖苷酶不同的分
子量。突变α甘露糖苷酶可以是未修饰的植物或植物细胞中产生的α甘露糖苷酶的截
短形式或延长形式，并且可以用作标记以辅助修饰的植物或植物细胞的鉴定。多肽的截短
或延伸一般因以下情况产生：在编码序列中引入终止密码子或移码(shift inthe reading frame)，导致在替代性可读框中使用终止密码子。可选地，这类突变α-甘露糖苷酶可以因内含子-外显子交界或α-甘露糖苷酶基因组序列的交接中的突变产生，所述突变导致相
应内含子-外显子序列的剪接改变。前mRNA的可变剪接可以产生可能被截短或延长的改
变的cDNA。延长可以是在多肽序列中的插入。

[0085] 用于产生包含多于一种修饰的α甘露糖苷酶基因序列的修饰植物或植物细胞的另一种策略涉及使两株不同植物杂交，其中两株植物的每一株包含一个或多个不同的修饰
α甘露糖苷酶基因序列。可以通过如上文所述的本发明方法产生在杂交中所用的修饰植
物。

[0086] 可以通过以下方式鉴定或选择如上文所述用于杂交或基因组修饰中的修饰植物和植物细胞：在修饰的植物或植物细胞中(i)一种或多种α甘露糖苷酶的活性降低或不可
检测到；(ii)一种或多种α甘露糖苷酶的表达降低或不可检测到；(iii)植物蛋白或异源
蛋白的N-聚糖上α-1,3-连接的岩藻糖、β-1,2-连接的木糖或二者或其残基的水平降低
或不可检测到；或(iv)高甘露糖N-聚糖增加或积累。

[0087] 本发明涉及如所附权利要求中所述的多个方面和实施方案。

[0088] 在一个方面，提供一种多核苷酸，其包含具有NtNMS1a、NtMNS1b或NtMNS2的基因组序列或SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64的核苷酸序列或其部分、由其组成或基本上由其组成。在一个实施方案中，本发明涉及一种多核苷酸，其包含与NtNMS1a、NtMNS1b或NtMNS2的基因组序列或SEQ ID NO:1、
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64具有至少76%
序列同一性的核苷酸序列或其部分、由其组成或基本上由其组成。本发明也提供一种多核
苷酸，其包含具有NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4的基因序列或SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:98中任一者的核苷
酸序列或其部分、由其组成或基本上由其组成。在一个实施方案中，本发明涉及一种多核苷酸，其包含与NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4的基因序列或SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:98中任一者具有至少
88%序列同一性的核苷酸序列或其部分、由其组成或基本上由其组成。本发明也提供一种
多核苷酸或其部分，所述多核苷酸包含NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4的一个或多
个编码序列或编码下述多肽的核苷酸序列、由其组成或基本上由其组成，其中所述多肽包
含与SEQ ID NO:31、SEQID NO:95、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:93或SEQID NO:99具有至少76%序列同一性的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。本发明也提
供因遗传密码的简并性而偏离于前述编码序列的核苷酸序列的多核苷酸或其部分。本发明
也提供其互补链与核酸探针杂交的多核苷酸，其中所述核酸探针由(i)-(iii)中任一者或
SEQ ID NO:3至29，SEQ ID NO:34至60；或SEQ ID NO:65至91中任一者的核苷酸序列组
成。优选地，前述多核苷酸编码多肽显示出甘露糖水解活性的多肽。

[0089] 本发明也提供选自以下的多肽：(i)包含下述氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成的多肽或其部分，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:99中所述的序列；(ii)包含下述氨基酸序列、
由其组成或基本上由其组成的多肽或其部分，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:31、SEQ ID
NO:95、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:99中所述的任一序列具有至少76%序列同一性；(iii)由根据根据权利要求1的(i)-(v)的核苷酸序列表达的多
肽；(iv)由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:98中所述的核苷酸序列表达的多肽或其部分。优选地，前述多肽或其部分具有甘露糖水解活性。

[0090] 在又一个方面，提供包含前述序列的多核苷酸或多肽的任一种鉴定分子结合所述核酸分子或多肽的用途。还提供与SEQ ID NO:1至30、32至61、或63至92；或SEQ ID
NO:94、96或98中任一者特异性结合的脱氧核糖核酸寡核苷酸、核糖核酸寡核苷酸、锌指核酸酶或大范围核酸酶。在又一个方面，提供与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:62或SEQID NO:93、或至SEQ ID NO:95、97或99结合的多肽、蛋白质、抗体或抗体片段。

[0091] 锌指核酸酶介导的诱变的一般用途是本领域已知的并且在以下专利出版物如但不限于WO02057293、WO02057294、WO0041566、WO0042219和WO2005084190中描述，所述文献通过引用的方式完整并入本文。大范围核酸酶介导的诱变的一般用途是本领域已知的并且
在以下专利出版物如但不限于WO96/14408、WO2003025183、WO2003078619、WO2004067736、WO2007047859和WO2009059195中描述，所述文献通过引用的方式完整并入本文。

[0092] 在又一个方面，提供一种用于在植物的至少一个部分中降低α-甘露糖苷酶I水平的方法，所述方法包括步骤：与其中未减少NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4的
表达或NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4蛋白或多肽的活性的对照植物相比，减少
NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4或其组合的表达和NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或
NtMan1.4多肽或其组合的活性，或由NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4基因序列或其
组合编码的多肽的活性。

[0093] 在一个方面，提供一种用于在植物的至少一个部分中降低α-甘露糖苷酶I水平的方法，所述方法包括以下步骤：与其中未降低NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4的
表达或NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4的蛋白或多肽的活性的对照植物相比，减少

[0094] a)NtMNS1a和NtMNS1b的表达和NtMNS1a和NtMNS1b多肽的活性；或由NtMNS1a和NtMNS1b基因序列编码的多肽的活性；或

[0095] b)NtMNS1a和NtMNS2的表达和NtMNS1a和NtMNS2多肽的活性；或由NtMNS1a和NtMNS1b基因序列编码的多肽的活性；或

[0096] c)NtMNS1a和NtMan1.4的表达和NtMNS1a和NtMan1.4多肽的活性，或由NtMNS1a和NtMan1.4基因序列编码的多肽的活性；或

[0097] d)NtMNS1b和NtMNS2的表达和NtMNS1b和NtMNS2多肽的活性；或由NtMNS1b和NtMNS2基因序列编码的多肽的活性；或

[0098] e)NtMNS1b和NtMan1.4的表达和NtMNS1b和NtMan1.4多肽的活性，或由NtMNS1b和NtMan1.4基因序列编码的多肽的活性；或

[0099] f)NtMNS2和NtMan1.4的表达和NtMNS2和NtMan1.4多肽的活性，或由NtMNS2和NtMan1.4基因序列编码的多肽的活性。

[0100] 在一个方面，提供一种用于在植物的至少一个部分中降低α-甘露糖苷酶I水平的方法，所述方法包括以下步骤：与其中未降低NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4的
表达或NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4的蛋白或多肽的活性的对照植物相比，减少

[0101] (a)NtMNS1a和NtMNS1b以及NtMNS2的表达和NtMNS1a和NtMNS1b以及NtMNS2多肽的活性；或由NtMNS1a和NtMNS1b以及NtMNS2基因序列编码的多肽的活性；或

[0102] (b)NtMNS1a和NtMNS2以及NtMan1.4的表达和NtMNS1a和NtMNS2以及NtMan1.4多肽的活性，或由NtMNS1a和NtMNS2以及NtMan1.4基因序列编码的多肽的活性；或

[0103] (c)NtMNS1a和NtMNS1b以及 NtMan1.4的表达和NtMNS1a和NtMNS1b 以及NtMan1.4多肽的活性，或由NtMNS1a和NtMNS1b以及NtMan1.4基因序列编码的多肽的活
性；或

[0104] (d)NtMNS1b和NtMNS2以及NtMan1.4的表达和NtMNS1b和NtMNS2以及NtMan1.4多肽的活性，或由NtMNS1b和NtMNS2以及NtMan1.4基因序列编码的多肽的活性。

[0105] 在又一个方面，提供一种用于在植物的至少一个部分中降低α-甘露糖苷酶I水平的方法，所述方法包括步骤：与其中未减少NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4的表达或NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4蛋白或多肽的活性的对照植物相比，减少NtMNS1a和NtMNS1b和NtMNS2和NtMan1.4的表达和NtMNS1a和NtMNS1b和NtMNS2和NtMan1.4多
肽的活性，或由NtMNS1a和NtMNS1b和NtMNS2和NtMan1.4基因序列编码的多肽的活性。

[0106] 在一个具体方面，提供根据本发明和如本文在前述实施方案中描述的一种用于减少植物细胞α-甘露糖苷酶I活性的方法，所述方法包括以下步骤：在植物细胞的基因组中
修饰多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列包含(i)如SEQ ID NO:1至30、32至61或63至
92中所示的核苷酸序列，(ii)与如SEQ ID NO:1至30、32至61或63至92中所示的核苷
酸序列相同至少50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、不过具体地至少74%、75%、76%、77%、78%、
79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、
98%或99%的核苷酸序列；(iii)允许由(i)或(ii)的核苷酸序列或其互补物组成的多核
苷酸探针杂交、尤其在严格条件下杂交的核苷酸序列，并且在植物细胞的核基因组中减少
NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4多肽的活性。在另一个方面，提供一种用于减少植
物细胞α-甘露糖苷酶I活性的方法，所述方法包括步骤：向植物细胞中以可表达表达方式
按有义或反义方向导入SEQ ID NO:1至30、32至61或63至92，或SEQ ID NO:94、96或98
中的任一者的多核苷酸序列或其片段，并且降低NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4多
肽的活性。

[0107] 在另一个方面，提供一种用于减少植物细胞α-甘露糖苷酶I活性的方法，所述方法包括步骤：向植物细胞中导入或在其中表达与SEQ IDNO:1至30、32至61或63至92，
或SEQ ID NO:94、96或98中的任一者互补或部分互补的核糖核酸，并且降低NtMNS1a、
NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4多肽的活性。

[0108] 在另一个方面，提供一种用于减少植物细胞α-甘露糖苷酶I活性的方法，所述方法包括步骤：向植物细胞中导入或在其中表达与SEQ IDNO:1至30、32至61或63至92，
或SEQ ID NO:94、96或98中的任一者互补或部分互补的核糖核酸，并且降低NtMNS1a和
NtMNS1b的活性或NtMNS1a和NtMNS2的活性，或NtMNS1a和NtMan1.4的活性，或NtMNS1b
和NtMNS2的活性，或NtMNS1b和NtMan1.4的活性，或NtMNS2和NtMan1.4多肽的活性。

[0109] 在另一个方面，提供一种用于减少植物细胞α-甘露糖苷酶I活性的方法，所述方法包括步骤：向植物细胞中导入或在其中表达与SEQ IDNO:1至30、32至61或63至92，
或SEQ ID NO:94、96或98中的任一者互补或部分互补的核糖核酸，并且降低NtMNS1a和
NtMNS1b的活性或NtMNS1a和NtMNS2的活性，或NtMNS1a和NtMan1.4的活性，或NtMNS1b
和NtMNS2的活性，或NtMNS1b和NtMan1.4的活性，或NtMNS2和NtMan1.4多肽的活性。

[0110] 在另一个方面，提供一种用于减少植物细胞α-甘露糖苷酶I活性的方法，所述方法包括步骤：向植物细胞中导入或在其中表达与SEQ IDNO:1至30、32至61或63至92，
或SEQ ID NO:94、96或98中的任一者互补或部分互补的核糖核酸，并且降低NtMNS1a和
NtMNS1b和NtMNS2和NtMan1.4多肽的活性。

[0111] 在另一个方面，提供一种用于减少植物细胞α-甘露糖苷酶I活性的方法，所述方法包括步骤向植物细胞中导入与SEQ ID NO:1至99中的任一者特异性结合的分子。

[0112] 在又一个方面，提供一种用于减少植物细胞α-甘露糖苷酶I活性的方法，所述方法包括步骤向植物细胞中导入与SEQ ID NO:1至30、32至61或63至92中任一者或SEQ ID
NO:94、96或98特异性结合的脱氧核糖核酸寡核苷酸、核糖核酸寡核苷酸、多肽、蛋白质、抗体或抗体片段、锌指蛋白或大范围核酸酶或与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:62或SEQID:93或
与SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97或SEQ ID NO:99结合的多肽、蛋白质、抗体或抗体片段，并且降低NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4的活性。

[0113] 在又一个方面，提供一种用于减少植物细胞α-甘露糖苷酶I活性的方法，所述方法包括步骤向植物细胞中导入与SEQ ID NO:1至30、32至61或63至92中任一者或与
SEQ ID NO:94、96或98特异性结合的脱氧核糖核酸寡核苷酸、核糖核酸寡核苷酸、多肽、
蛋白质、抗体或抗体片段、锌指蛋白或大范围核酸酶或与SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:62或
SEQID:93或与SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97或SEQ IDNO:99结合的多肽、蛋白质、抗体或抗体片段，并且降低NtMNS1a和NtMNS1b的活性或NtMNS1a和NtMNS2的活性，或NtMNS1a和
NtMan1.4的活性，或NtMNS1b和NtMNS2的活性，或NtMNS1b和NtMan1.4的活性，或NtMNS2
和NtMan1.4多肽的活性。

[0114] 在又一个方面，提供一种用于减少植物细胞α-甘露糖苷酶I活性的方法，所述方法包括步骤向植物细胞中导入与SEQ ID NO:1至30、32至61或63至92中任一者或
与SEQ ID NO:94、96或98特异性结合的脱氧核糖核酸寡核苷酸、核糖核酸寡核苷酸、多
肽、蛋白质、抗体或抗体片段、锌指蛋白或大范围核酸酶或与SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:62或SEQID:93或与SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97或SEQ IDNO:99结合的多肽、蛋白质、抗体
或抗体片段，并且降低NtMNS1a和NtMNS1b和NtMNS2多肽的活性、或NtMNS1a和NtMNS2
和NtMan1.4多肽的活性、或NtMNS1a和NtMNS1b和NtMan1.4多肽的活性、或NtMNS1b和
NtMNS2和NtMan1.4多肽的活性。

[0115] 在又一个方面，提供一种用于减少植物细胞α-甘露糖苷酶I活性的方法，所述方法包括步骤向植物细胞中导入与SEQ ID NO:1至30、32至61或63至92中任一者或SEQ ID
NO:94、96或98特异性结合的脱氧核糖核酸寡核苷酸、核糖核酸寡核苷酸、多肽、蛋白质、抗体或抗体片段、锌指蛋白或大范围核酸酶或与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:62或SEQID:93或
与SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97或SEQ ID NO:99结合的多肽、蛋白质、抗体或抗体片段，并且降低NtMNS1a和NtMNS1b和NtMNS2和NtMan1.4多肽的活性。

[0116] 在又一个方面，提供一种用于在植物的至少一个部分中增加α-甘露糖苷酶I水平的方法，所述方法包括步骤：与其中改变NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4的表
达以及NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4蛋白或多肽的活性的对照植物相比，增加
NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4或其组合的表达和NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或
NtMan1.4多肽或其组合的活性，或由NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4基因序列或其
组合编码的多肽的活性。

[0117] 在一个方面，提供一种用于在植物的至少一个部分中增加α-甘露糖苷酶I水平的方法，所述方法包括以下步骤：与其中未改变NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4的
表达或NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4的蛋白或多肽的活性的对照植物相比，增加

[0118] a)NtMNS1a和NtMNS1b的表达和NtMNS1a和NtMNS1b多肽的活性；或由NtMNS1a和NtMNS1b基因序列编码的多肽的活性；或

[0119] b)NtMNS1a和NtMNS2的表达和NtMNS1a和NtMNS2多肽的活性；或由NtMNS1a和NtMNS2基因序列编码的多肽的活性；或

[0120] c)NtMNS1a和NtMan1.4的表达和NtMNS1a和NtMan1.4多肽的活性，或由NtMNS1a和NtMan1.4基因序列编码的多肽的活性；或

[0121] d)NtMNS1b和NtMNS2的表达和NtMNS1b和NtMNS2多肽的活性；或由NtMNS1b和NtMNS2基因序列编码的多肽的活性；或

[0122] e)NtMNS1b和NtMan1.4的表达和NtMNS1b和NtMan1.4多肽的活性，或由NtMNS1b和NtMan1.4基因序列编码的多肽的活性；或

[0123] (f)NtMNS2和NtMan1.4的表达和NtMNS2和NtMan1.4多肽的活性，或由NtMNS2和NtMan1.4基因序列编码的多肽的活性。

[0124] 在一个方面，提供一种用于在植物的至少一个部分中增加α-甘露糖苷酶I水平的方法，所述方法包括以下步骤：与其中未改变NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4的
表达或NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4的蛋白或多肽的活性的对照植物相比，增加

[0125] (a)NtMNS1a和NtMNS1b以及NtMNS2的表达和NtMNS1a和NtMNS1b以及NtMNS2多肽的活性；或由NtMNS1a和NtMNS1b以及NtMNS2基因序列编码的多肽的活性；或

[0126] (b)NtMNS1a和NtMNS2以及NtMan1.4的表达和NtMNS1a和NtMNS2以及NtMan1.4多肽的活性，或由NtMNS1a和NtMNS2以及NtMan1.4基因序列编码的多肽的活性；或

[0127] (c)NtMNS1a和NtMNS1b以及 NtMan1.4的表达和NtMNS1a和NtMNS1b 以及NtMan1.4多肽的活性，或由NtMNS1a和NtMNS1b以及NtMan1.4基因序列编码的多肽的活
性；或

[0128] (d)NtMNS1b和NtMNS2以及NtMan1.4的表达和NtMNS1b和NtMNS2以及NtMan1.4多肽的活性，或由NtMNS1b和NtMNS2以及NtMan1.4基因序列编码的多肽的活性。

[0129] 在一个方面，提供一种用于在植物的至少一个部分中增加α-甘露糖苷酶I水平的方法，所述方法包括步骤：与其中未改变NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4的表达或NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4蛋白或多肽的活性的对照植物相比，增加NtMNS1a
和NtMNS1b和NtMNS2和NtMan1.4的表达和NtMNS1a和NtMNS1b和NtMNS2和NtMan1.4多
肽的活性，或由NtMNS1a和NtMNS1b和NtMNS2和NtMan1.4基因序列编码的多肽的活性。

[0130] 在一个具体方面，提供根据本发明和如本文在前述实施方案中描述的一种用于减少植物细胞α-甘露糖苷酶I活性的方法，所述方法包括以下步骤：通过基因组编辑技术
或基因组工程化技术在植物细胞的基因组中修饰多核苷酸序列，所述基因组编辑技术或基
因组工程化技术选自包括锌指核酸酶介导的诱变、化学诱导的诱变、辐射诱变、同源重组、寡核苷酸介导的诱变或大范围核酸酶介导的诱变的列表，其中所述多核苷酸序列包含(i)
如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:63中所示的核苷酸序列，(ii)与如SEQ ID
NO:1、SEQ ID NO:32或SEQ IDNO:63中所示的核苷酸序列相同至少50%、55%、60%、70%、71%、
72%、73%、不过具体地至少74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、
87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸序列；(iii)允许由(i)或(ii)的核苷酸序列或其互补物组成的多核苷酸探针杂交、尤其在严格条件下杂交的
核苷酸序列。

[0131] 在一个方面，本发明涉及如在多种实施方案中本文定义的本发明核苷酸序列或其部分的用途，用于鉴定以下序列中的靶位点：

[0132] a.包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中的第一靶核苷酸序列；或

[0133] b.a)的第一靶核苷酸序列和在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中的第二靶核苷酸序列；或

[0134] c.a)的第一靶核苷酸序列、b)的第二靶核苷酸序列和在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中的第三靶核苷酸序列；

[0135] d.a)的第一靶核苷酸序列、b)的第二靶核苷酸序列、c)的第三靶核苷酸序列和在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中的第四靶核苷酸序列；

[0136] e.全部靶核苷酸序列a)、b)、c)和d)；

[0137] 以便修饰，从而α-甘露糖苷酶I在包含所述修饰的修饰植物细胞中的活性或表达相对于未修饰的植物细胞改变，其中所述α-甘露糖苷酶I选自NtMNS1a、NtMNS1b、
NtMNS2、和NtMan1.4，并且其中第一、第二、第三和第四靶α-甘露糖苷酶I彼此不同。

[0138] 在本发明的一个具体方面，根据本发明和如本文在多种实施方案中所述的修饰烟草植物细胞或烟草植物的第一、第二、第三和/或第四靶核苷酸序列具有

[0139] (i)与SEQ ID NO:1至30、32至61或63至92；或与SEQ ID NO:94、96或98，但是尤其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64的至少76%序列同一性；或其部分；

[0140] (ii)与SEQ ID NO:1至30、32至61或63至92中任一者；或与SEQ ID NO:94、96或98，但是尤其与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:98的至少88%序列同一性；或其部分。

[0141] 在本发明的另一个具体方面，根据本发明和如本文在多种实施方案中所述的修饰烟草植物细胞或烟草植物的第一、第二、第三和/或第四靶核苷酸序列包含、基本上包含以下序列或由其组成：

[0142] (i)SEQ ID NO:1至30、32至61或63至92；或与SEQ ID NO:94、96或98，但是尤其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64；或其部分；

[0143] (ii)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:98；或其部分。

[0144] 在一个具体方面，如本文在多种实施方案中定义的核苷酸序列可以用于产生在如本文定义的核苷酸序列的内部的位点选择性切割基因组DNA分子的非天然性大范围核酸
酶蛋白。

[0145] 在另一个具体方面，在另一个具体方面，如本文在多种实施方案中定义的核苷酸序列可以用于产生在如本文定义的靶核苷酸序列至少之一中引入双链断口的锌指核酸酶。

[0146] 在又一个方面，提供具有改变的α-甘露糖苷酶I活性、尤其具有降低或增加的α-甘露糖苷酶I活性的植物细胞，尤其是因如本文在多种实施方案中所述的本发明方法
产生的植物细胞。

[0147] 具体而言，本发明涉及一种基因修饰的烟草植物细胞或包含所述修饰的植物细胞的烟草植物，其中所述修饰的植物细胞包含在包含选自NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和
NtMan1.4的α-甘露糖苷酶I的编码序列和/或其等位变体的基因组区域中至少对第一靶
核苷酸序列的修饰，从而(i)α-甘露糖苷酶I在所述修饰的植物细胞中的活性或表达相对
于未修饰的植物细胞改变。

[0148] 在一个方面，所述修饰的烟草植物细胞或烟草植物，除(a)对第一靶核苷酸序列的修饰之外，还包含(b)在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中至少对第二靶
核苷酸序列的修饰或(c)在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中至少对第三靶
核苷酸序列的修饰或(d)在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中至少对第四
靶核苷酸序列的修饰、或者(a)和(b)、(a)和(c)、(a)和(d)、(b)和(c)、(b)和(d)、或
(c)和(d)；或(a)和b)和(c)、(a)和b)和(d)、(a)和(c)和(d)、或(b)和(c)和(d)、
或(a)和b)以及(c)和(d)的组合，其中所述α-甘露糖苷酶I选自NtMNS1a、NtMNS1b、
NtMNS2和NtMan1.4，并且其中第一、第二、第三和第四α-甘露糖苷酶I彼此不同。

[0149] 在本发明的一个具体方面，根据本发明和如本文在多种实施方案中所述的修饰烟草植物细胞或烟草植物的第一、第二、第三和/或第四靶核苷酸序列具有

[0150] (i)与SEQ ID NO:1至30、32至61或63至92；或与SEQ ID NO:94、96或98，但是尤其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64的至少76%序列同一性；或其部分；

[0151] (ii)与SEQ ID NO:1至30、32至61或63至92中任一者；或与SEQ ID NO:94、96或98，但是尤其与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:98的至少88%序列同一性；或其部分。

[0152] 在本发明的另一个具体方面，根据本发明和如本文在多种实施方案中所述的修饰烟草植物细胞或烟草植物的第一、第二、第三和/或第四靶核苷酸序列包含、基本上包含以下序列或由其组成：

[0153] (i)SEQ ID NO:1至30、32至61或63至92；或与SEQ ID NO:94、96或98，但是尤其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64；或其部分；

[0154] (ii)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:98；或其部分。

[0155] 在本发明的多种实施方案中，提供根据本发明和如本文在多种实施方案中所述的修饰的烟草植物细胞或烟草植物，其中α-甘露糖苷酶I在所述所修饰的植物细胞中的活
性或表达相对于未修饰的植物细胞(a)减少或(b)增加。

[0156] 本发明中还构思了可以从根据本发明和如本文在多种实施方案中所述的修饰烟草植物中获得的子代植物，其中所述子代植物包含如多种实施方案中限定的靶序列至少之
一中的修饰，其中所述α-甘露糖苷酶I的活性或表达相对于未修饰的植物细胞改变，具体
地增加或减少。

[0157] 与对照植物相比，活性的增加可以是约5%至约100%或增加至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少
95%、至少98%或100%或更多-如200%或300%或更多，这包括转录活性或蛋白质表达或二
者的增加。

[0158] 与对照植物相比，活性的减少可以是约5%至约100%或减少至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少
95%、至少98%或100%，这包括转录活性或蛋白质表达或二者的减少。

[0159] 与对照植物相比，甘露糖含量的增加可以是约5%至约100%或增加至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少
90%、至少95%、至少98%或至多到100%或更多-如200%或300%或更多。

[0160] 与对照植物相比，甘露糖含量的减少可以是约5%至约100%或减少至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少
90%、至少95%、至少98%或至多到100%。

[0161] 在又一个方面，提供非天然或修饰的苜蓿、浮萍、稻、玉米或胡萝卜植物细胞，或属于烟草属、尤其本生烟草(Nicotiana benthamiana)、野烟草(N.sylvestris)、高烟草(N.excelsior)、N.exigua、茸毛烟草(N.tomentosiformis)、黄花烟草(N.rustica)、耳状烟草(N.otophora)或烟草(N.tabacum)或其品种、品系、选择或栽培品种的植物细胞，与对照植物相比具有修饰的α-甘露糖苷酶活性和减少或增加的α-甘露糖苷酶I活性，尤其
因如本文在多种实施方案中所述的本发明方法产生的植物细胞。

[0162] 在一个实施方案中，修饰的即基因修饰的烟草植物细胞，或包含根据本发明和如本文在多种实施方案中所述的修饰植物细胞的烟草植物，包括其子代，是烟草栽培品种
PM132，其种子在2011年1月6日以NCIMB41802登录号保藏于NCIMB Ltd(一家按照布达
佩斯条约的国际保藏机构，位于Ferguson Building,Craibstone Estate,巴克斯本,阿
伯丁市,AB219YA，英国)。在另一个实施方案中，修饰的即基因修饰的烟草植物细胞，或包含根据本发明和如本文在多种实施方案中所述的修饰植物细胞的烟草植物，包括其子代，
是烟草品系PM016，其种子以登录号NCIMB41798保藏；烟草品系PM021，其种子以登录号
NCIMB41799保藏；烟草品系PM092，其种子以登录号NCIMB41800保藏；烟草品系PM102，其
种子以登录号NCIMB41801保藏；烟草品系PM204，其种子在2011年1月6日以NCIMB41803
登录号保藏于NCIMB Ltd；烟草品系PM205，其种子以登录号NCIMB41804保藏；烟草品系
PM215，其种子以登录号NCIMB41805保藏；烟草品系PM216，其种子以登录号NCIMB41806保
藏；和烟草品系PM217，其种子以登录号NCIMB41807保藏。

[0163] 本文中还提供一种用于产生烟草植物细胞或烟草植物的方法，所述烟草植物包含能够产生人源化糖蛋白的修饰植物细胞，所述方法包括：

[0164] (i)在烟草植物细胞的基因组中修饰

[0165] a.在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中的第一靶核苷酸序列；或

[0166] b.a)的第一靶核苷酸序列和在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中的第二靶核苷酸序列；或

[0167] c.a)的第一靶核苷酸序列、b)的第二靶核苷酸序列和在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中的第三靶核苷酸序列；

[0168] d.a)的第一靶核苷酸序列、b)的第二靶核苷酸序列和c)的第三靶核苷酸序列以及在包含α-甘露糖苷酶I编码序列的基因组区域中的第四靶核苷酸序列；

[0169] e.全部靶核苷酸序列a)、b)、c)和d)；

[0170] (ii)鉴定并且任选地选择在所述靶核苷酸序列中包含所述修饰的修饰植物或植物细胞；

[0171] (iii)任选地使所述修饰植物与另一烟草属植物交配，

[0172] 其中所述α-甘露糖苷酶I选自NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4，并且其中第一、第二、第三和第四靶α-甘露糖苷酶I彼此不同，并且其中α-甘露糖苷酶I在包
含所述修饰的修饰植物细胞中的活性或表达对于相未修饰的植物细胞改变，从而与从未修
饰的植物细胞获得的糖蛋白相比，由所述修饰的植物细胞产生的糖蛋白基本上在其N-聚
糖上缺少α-1,3连接的岩藻糖和β-1,2-连接的木糖。

[0173] 在一个具体方面，第一、第二、第三和/或第四靶核苷酸序列具有

[0174] (i)与SEQ ID NO:1至30、32至61或63至92；或与SEQ ID NO:94、96或98，但是尤其与SEQ NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64的至少76%序列同一性；或其部分；

[0175] (ii)与SEQ ID NO:1至30、32至61或63至92中任一者；或与SEQ ID NO:94、96或98，但是尤其与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:98的至少88%序列同一性；或其部分。

[0176] 在另一个具体方面，第一、第二、第三和/或第四靶核苷酸序列包含、基本上包含以下序列或由其组成

[0177] (i)SEQ ID NO:1至30、32至61或63至92；或与SEQ ID NO:94、96或98，但是尤其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64；或其部分；

[0178] (ii)SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:98或其部分。

[0179] 本文中进一步构思了修饰烟草植物或植物细胞的基因组包括步骤：

[0180] a.在烟草植物或植物细胞的靶核苷酸序列中和任选地在其至少一种等位变体中鉴定靶位点，

[0181] b.基于如权利要求8或9中限定的核苷酸序列设计能够识别所述靶位点并且在所述靶位点处或毗邻于所述靶位点结合的致突变寡核苷酸，并且

[0182] c.使所述致突变寡核苷酸与烟草植物或植物细胞的基因组中的靶核苷酸序列在如此条件下结合，从而修饰所述基因组。

[0183] 在又一个方面，提供一种用于产生糖蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：向与对照植物相比具有增加或减少的α-甘露糖苷酶I活性的非天然或修饰的植物细胞、尤其向如本文在多种实施方案中所述的本发明植物细胞导入表达构建体，所述表达构建体包含编
码所述靶糖蛋白的多核苷酸序列，将植物细胞培养一段足以产生所述靶糖蛋白的时间段，
并且任选地，从所述植物细胞再生出植物，或从修饰的植物细胞或包含所述修饰植物细胞
的植物收获所述糖蛋白。

[0184] 在一个具体方面，本发明涉及一种用于产生异源蛋白的方法，所述方法包括：

[0185] (a)向如权利要1至6任一项中所定义的修饰的烟草植物细胞或植物导入表达构建体，所述表达构建体包含编码异源糖蛋白、尤其用于制备疫苗的抗原、细胞因子、激素、凝血蛋白、载脂蛋白、用于人类中替代疗法的酶、免疫球蛋白或其片段的核苷酸序列；并且培养包含所述表达构建体的修饰的植物细胞，从而产生所述异源糖蛋白，其中与从未修饰的
植物细胞获得的糖蛋白相比，所述糖蛋白基本上在其N-聚糖上缺少α-1,3连接的岩藻糖
和β-1,2-连接的木糖，(b)任选地，从所述植物细胞再生出植物，并且培育所述植物和其
子代，以及(c)任选地收获所述糖蛋白。

[0186] 在又一个方面，提供包含糖蛋白的植物组合物，所述糖蛋白从修饰的植物细胞或包含修饰植物细胞的植物、尤其从根据本发明和如本文在多种实施方案中所述的修饰植物
细胞或包含所述修饰植物细胞的植物中获得，特征在于所述糖蛋白与从对照植物获得的相
同糖蛋白相比，具有糖蛋白的N-聚糖上甘露糖的量增加或减少。

[0187] 在一个具体方面，本发明提供一种植物组合物，其包含从植物可获得的异源糖蛋白，所述植物包含如本文在多种实施方案中定义的修饰的植物细胞，其中与从未修饰的植
物细胞获得的糖蛋白相比，所述糖蛋白基本上在其N-聚糖上缺少α-1,3-连接的岩藻糖和
β-1,2-连接的木糖。

[0188] 在又一个方面，提供基本上纯的糖蛋白，所述糖蛋白从包含所述糖蛋白的植物组合物获得并且从修饰的植物细胞或包含修饰植物细胞的植物，尤其从如本文在多种实施方
案中所述的修饰植物细胞或包含所述修饰植物细胞的植物中获得，特征在于所述糖蛋白与
从具有正常水平α-甘露糖苷酶I活性的对照植物中获得的相同糖蛋白相比，具有糖蛋白
的N-聚糖上甘露糖的量增加或减少。

[0189] 在本发明的一个实施方案中，修饰在植物细胞中编码第一α甘露糖苷酶或其片段的第一基因序列，随后鉴定或分离显示出第一α甘露糖苷酶活性减少的修饰植物细胞。
包含修饰的第一α甘露糖苷酶基因的修饰植物细胞随后经历诱变，其中修饰编码第二α
甘露糖苷酶或其片段的第二基因序列。这之后是鉴定或分离显示出第二α甘露糖苷酶活
性减少的修饰植物细胞，或相对于仅携带第一修饰的细胞进一步减少α甘露糖苷酶活性。
可以在鉴定后分离修饰的植物细胞。在这个阶段获得的修饰的植物细胞包含在编码两种α
甘露糖苷酶的两个基因序列中的两种修饰，或α甘露糖苷酶的两种变体或等位基因。

[0190] 在本发明的另一个实施方案中，修饰在植物细胞中编码第一α甘露糖苷酶I或其片段的第一基因序列并且修饰在不同的植物细胞中编码第二α甘露糖苷酶I或其片段的
第二基因序列，随后鉴定或分离显示出第一和第二α-甘露糖苷酶I活性减少的第一和第
二修饰的植物细胞。包含修饰植物细胞(其包含修饰的第一和第二α-甘露糖苷酶I)的
植物可以杂交以获得在编码两种α-甘露糖苷酶I或两种α-甘露糖苷酶I变体或等位基
因的两个α-甘露糖苷酶I基因序列中包含两种修饰的子代。

[0191] 在一个方面，编码第一α甘露糖苷酶和第二α甘露糖苷酶的两个基因序列选自NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4，或是如本文在多种实施方案中所述的变体或其等
位基因。

[0192] 在一个具体方面，这两个基因序列编码NtMNS1a和NtMNS1b或NtMNS1a和NtMNS2，或NtMNS1a和NtMan1.4，或NtMNS1b和NtMNS2，或NtMNS1b和NtMan1.4，或NtMNS2和
NtMan1.4多肽，或如本文在多种实施方案中所述的变体或其等位基因。

[0193] 在一个方面，本发明涉及修饰的植物细胞，其包含在编码三种α甘露糖苷酶的三个基因序列中的三种修饰，或如本文在多种实施方案中所述的α甘露糖苷酶的三种变体
或等位基因。

[0194] 在一个具体方面，这三个基因序列编码NtMNS1a和NtMNS1b和NtMNS2多肽，或NtMNS1a和NtMNS2和NtMan1.4多肽，或NtMNS1a和NtMNS1b和NtMan1.4多肽，或NtMNS1b
和NtMNS2和NtMan1.4多肽，或如本文在多种实施方案中所述的变体或其等位基因。

[0195] 在一个方面，本发明涉及修饰的植物细胞，其包含在编码四种α甘露糖苷酶的四个基因序列中的四种修饰，或如本文在多种实施方案中所述的α甘露糖苷酶的四种变体
或等位基因。

[0196] 在一个具体方面，这四个基因序列编码NtMNS1a和NtMNS1b和NtMNS2和NtMan1.4多肽。

[0197] 在又一个方面，提供一种包含糖蛋白的药物组合物，其中所述糖蛋白与从具有正常水平α-甘露糖苷酶I活性的正常植物中获得的相同糖蛋白相比，在糖蛋白的N-聚糖上
具有增加或减少量的甘露糖，从具有修饰的α-甘露糖苷酶I活性的植物、尤其根据本发明
和如本文在前述实施方案中所述的植物获得。

[0198] 本发明的药物组合物优选地包含可药用载体。“可药用载体”意指任何类型的无毒固体、半固体、液体填料、稀释剂、包囊材料或配制辅料。如本文中所用的术语“肠胃外”指包括静脉内、肌内、腹膜内、鼻内、皮下和关节内注射及输注的施用模式。载体可以是肠胃外载体，更具体地是与接受者血液等渗的溶液。此类载体溶媒的例子包括水、盐水、Ringer溶液和葡萄糖溶液。非水溶媒如固定油和油酸乙酯以及脂质体也可用于本文中。载体适当地含有少量的添加物，如增强等渗性和化学稳定性的物质。此类材料在所用的剂量和浓度对接
受者无毒，并且包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸和其他有机酸或它们的盐；
抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)(多)肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋
白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨糖醇；反离子如钠；非离子表面活性剂如聚山梨醇酯类、泊洛沙姆或PEG；或全部。

[0199] 在又一个方面，提供包含SEQ ID NO:1至30、32至61、或63至92，或SEQ ID NO:94、96或98中任一者的多核苷酸或核酸构建体的表达载体。

[0200] 根据本发明，产生其中改变α-甘露糖苷酶I的量的修饰和非天然存在的植物细胞和植物(包括从中获得的细胞、生物质、种子和叶)提供了众多优点。

[0201] 以举例方式，可以为产生在糖蛋白的N-聚糖上含有可变量甘露糖的异源糖蛋白，栽培或培育包含转基因的植物细胞或植物和非天然存在的烟草植物细胞或植物。

[0202] 以进一步举例方式，与对照对应物相比，转基因和非天然存在的植物(包括从中获得的细胞、生物质、种子和叶)转基因植物细胞、植物或其部分在糖蛋白的N-聚糖上显示出量受调节的甘露糖，并且可以出于产生药物组合物的目的用于制备异源糖蛋白。

[0203] 如本文所用，包含如上文在多种实施方案中提到的甘露糖量受调节的糖蛋白的药物组合物可能更有效，尤其是以在疫苗中使用的抗原，因为抗原呈递细胞可以与高甘露糖
结合，可能导致提高的免疫反应。对于植物中产生的某些抗体，存在的高甘露糖可以导致增加的抗体依赖细胞毒性。可以根据所公开的方法操作的合适植物包括为制备重组蛋白所栽
培的植物，所述植物包括但不限于烟草、烟草近亲和属于烟草属的近亲、玉米、苜蓿、苜蓿、胡萝卜和藓类植物。

[0204] 通过示例性实施方案方式并参考序列信息在上文和下文中更详细地描述本发明的多核苷酸、多肽和方法，在所述序列信息中：

[0205] 序列1(SEQ ID NO:1)显示NtMNS1a多核苷酸，其中5'和3'UTR区以小写体字母和加下划线显示；外显子以大写字母显示；内含子以小写体字母显示；和起始密码子和终
止密码子以大写粗体字母并加下划线显示。

[0206] 序列30(SEQ ID NO:30)显示NtMNS1a cDNA序列。

[0207] 序列31(SEQ ID NO:31)显示NtMNS1a蛋白序列

[0208] 序列32(SEQ ID NO:32)显示NtMNS1b多核苷酸，其中5'和3'UTR区以小写体字母和加下划线显示；外显子以大写字母显示；内含子以小写体字母显示；和起始密码子和
终止密码子以大写粗体字母并加下划线显示。

[0209] 序列61(SEQ ID NO:61)显示NtMNS1b cDNA序列。

[0210] 序列62(SEQ ID NO:62)显示NtMNS1b蛋白序列。

[0211] 序列63(SEQ ID NO:63)显示NtMNS2多核苷酸，其中5'和3'UTR区以小写体字母和加下划线显示；外显子以大写字母显示；内含子以小写体字母显示；和起始密码子和终
止密码子以大写粗体字母并加下划线显示。

[0212] 表1显示使用EMBOSS Needle，与最接近植物序列AtMNS1和AtMNS2相比时所预测的NtMNS蛋白质序列的同一性和相似性百分数。NtMNS1a是SEQ ID NO:30的预测
蛋白质；NtMNS1b是SEQ IDNO:61的预测蛋白质并且NtMNS2是SEQ ID NO:92的预测蛋
白质。AtMNS1是推定性拟南芥(Arabidopsis thaliana)甘露糖基-低聚糖1,2-α-甘
露糖苷酶(At1g51590)的预测蛋白质，并且NtMNS2是如报道的推定性拟南芥甘露糖苷酶
(At3g21160)的预测蛋白质(Kajiura等人,(2010)Glycobiology20:235-247)。

[0213] 表2显示使用局部两两比对法，使用程序EMBOSS water、以碱基对计的序列(SEQ)长度和最佳局部比对中相同碱基的数目时，SEQ(SEQ ID NO:)和数据库条目(最佳匹配)的
同一性(%)。

[0214] 下文详细描述涉及本发明的其他方面和实施方案：

[0215] α-甘露糖苷酶.I类α-甘露糖苷酶或α-甘露糖苷酶I酶(EC3.2.1.113)首先在来自绿豆的微粒体中描述(Forsee(1985)Arch.Biochem.Biophys.242:48-57)。从绿豆
纯化的酶具有特异性α(1,2)-甘露糖苷酶活性但是没有提供序列信息。首个推定性植物
α-甘露糖苷酶I基因，命名为Gm-Man1，在1999年由Nebenführ从大豆(Glycine max)克
隆(Nebenführ等人,(1999)Plant Physiol.121:1127-1142；GenBank登录号AF126550)。
这种推定性α-甘露糖苷酶I和绿色荧光蛋白的融合蛋白揭示出在烟草中过量表达时，该
融合蛋白存在于顺-高尔基体囊中(Nebenführ(1999)，上文)，但是没有报道其酶活性和
在N-聚糖生物合成中的作用。拟南芥基因组测序计划揭示出众多推定性α-甘露糖苷
酶 I序列：MNS1(At1g51590)、MNS2(At3g21160)、MNS3(At1g30000)、MNS4(At5g43710)和
MNS5(At1g27520)。已知这些序列的预测全长cDNA序列并且这种序列信息存储于GenBank。

[0216] MNS1和MNS2似乎是高尔基体驻留的α-甘露糖苷酶，而MNS3定位于内质网中(Liebminger等人,(2009)The Plant Cell21:3850-3867)。在MNS3仅从Man9-GlcNAc2
底物切去一个α(1,2)-甘露糖的情况下，MNS1和MNS2从Man8-GlcNAc2至Man5-GlcNAc
切去三个α(1,2)-甘露糖。在拟南芥中MNS1、MNS2和MNS3及其组合中的突变产生异常
的N-聚糖并且显示这些基因是拟南芥中早期N-聚糖加工、根发育和细胞壁生物合成必需
(Liebminger等人,(2009)，上文)。

[0217] NtMNS烟草α-甘露糖苷酶多核苷酸.如序列信息中所示，具有5'和3'非翻译区的SEQ ID NO:1或不具有5'和3'非翻译区的SEQ IDNO:2的NtMNS1a基因组克隆包含14
个外显子和13个内含子：外显子1(SEQ ID NO:3)、外显子2(SEQ ID NO:5)、外显子3(SEQ
ID NO:7)、外显子4(SEQ ID NO:9)、外显子5(SEQ ID NO:11)、外显子6(SEQID NO:13)、外显子7(SEQ ID NO:15)、外显子8(SEQ ID NO:17)、外显子9(SEQ ID NO:19)、外显子10(SEQ ID NO:21)、外显子11(SEQ IDNO:23)、外显子12(SEQ ID NO:25)、外显子13(SEQ ID NO:27)、外显子14(SEQ ID NO:29)、内含子1(SEQ ID NO:4)、内含子2(SEQ IDNO:6)、内含子3(SEQ ID NO:8)、内含子4(SEQ ID NO:10)、内含子5(SEQ ID NO:12)、内含子6(SEQ ID NO:14)、内含子7(SEQ ID NO:16)、内含子8(SEQ ID NO:18)、内含子9(SEQ ID NO:20)、内含子10(SEQ ID NO:22)、内含子11(SEQ ID NO:24)、内含子12(SEQ ID NO:26)和内含子13(SEQ ID NO:28)。
如序列信息中所示，具有5'和3'非翻译区的SEQ ID NO:32或不具有5'和3'非翻译区
的SEQ ID NO:33的NtMNS1b基因组克隆包含14个外显子和13个内含子：外显子1(SEQ
IDNO:34)、外显子2(SEQ ID NO:36)、外显子3(SEQ ID NO:38)、外显子4(SEQ ID NO:40)、外显子5(SEQ ID NO:42)、外显子6(SEQ ID NO:44)、外显子7(SEQ ID NO:46)、外显子8(SEQ ID NO:48)、外显子9(SEQID NO:50)、外显子10(SEQ ID NO:52)、外显子11(SEQ ID NO:54)、外显子12(SEQ ID NO:56)、外显子13(SEQ ID NO:58)、外显子14(SEQID NO:60)、内含子1(SEQ ID NO:35)、内含子2(SEQ ID NO:37)、内含子3(SEQ ID NO:39)、内含子4(SEQ ID NO:41)、内含子5(SEQ IDNO:43)、内含子6(SEQ ID NO:45)、内含子7(SEQ ID NO:47)、内含子8(SEQ ID NO:49)、内含子9(SEQ ID NO:51)、内含子10(SEQ ID NO:53)、内含子11(SEQ ID NO:55)、内含子12(SEQ ID NO:57)和内含子13(SEQ ID NO:59)。如序列信息中所示，具有5'和3'非
翻译区的SEQ IDNO:63或不具有5'和3'非翻译区的SEQ ID NO:64的NtMNS2基因组克隆
包含14个外显子和13个内含子：外显子1(SEQ ID NO:65)、外显子2(SEQ ID NO:67)、外显
子3(SEQ ID NO:69)、外显子4(SEQ ID NO:71)、外显子5(SEQ ID NO:73)、外显子6(SEQ ID NO:75)、外显子7(SEQID NO:77)、外显子8(SEQ ID NO:79)、外显子9(SEQ ID NO:81)、外显子10(SEQ ID NO:83)、外显子11(SEQ ID NO:85)、外显子12(SEQ IDNO:87)、外显子13(SEQ ID NO:89)、外显子14(SEQ ID NO:91)、内含子1(SEQ ID NO:66)、内含子2(SEQ ID NO:68)、内含子3(SEQ IDNO:70)、内含子4(SEQ ID NO:72)、内含子5(SEQ ID NO:74)、内含子6(SEQ ID NO:76)、内含子7(SEQ ID NO:78)、内含子8(SEQ ID NO:80)、内含子9(SEQ ID NO:82)、内含子10(SEQ ID NO:84)、内含子11(SEQ ID NO:86)、内含子12(SEQ ID NO:88)和内含子
13(SEQ ID NO:90)。

[0218] 多种实施方案涉及多核苷酸，所述多核苷酸独立地包含NtMNS1a、NtMNS1b和NtMNS2基因座，即SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的序列；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQID NO:63或SEQ ID NO:64或其变体的片段的序列或NtMNS1a、NtMNS1b和NtMNS2的内含子或
外显子的序列、包括SEQ ID NO:3至29、34至60和65至91中所述的序列。

[0219] 多种实施方案涉及多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的片段的序列，取决于各个外显子或内含子的大小，所述序列可以各自包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.9kb、0.8kb、
0.7kb、0.6kb、0.5kb、0.4kb、0.3kb、0.2kb或0.1kb的核苷酸序列。在其他实施方案中、所述多核苷酸约10-20、21-50、51-100、101-200、201-400、401-750、751-1000；1001-1250、或
1251-1500个碱基长度。

[0220] 多种实施方案涉及NtMNS1a、NtMNS1b和NtMNS2多核苷酸变体，所述变体包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQID NO:33、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64或与SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63或SEQ IDNO:64的片段至少 50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、
83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

[0221] 多种实施方案涉及NtMNS1a、NtMNS1b或NtMNS2的外显子或内含子的变体，所述变体包含与SEQ ID NO:3至29、34至60或65至91中任一者或其片段至少50%、55%、60%、
70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、
89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。见表2，该表显示SEQ ID NO:1至32、34至63或65至91中每一者的变体的最小序列同一性百分数。

[0222] 多种实施方案涉及具有与NtMNS1a、NtMNS1b或NtMNS2多核苷酸变体互补的序列的多核苷酸，其中所述序列包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64的片段至少50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、74%、
75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、
94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

[0223] 多种实施方案涉及多核苷酸，所述多核苷酸可以在中等至高度严格条件下与包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64，或SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的片段的多核苷酸特异性杂交。

[0224] 多种实施方案涉及代表NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4cDNA序列的多核苷酸或其变体，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:98的片段。

[0225] 多种实施方案涉及了代表编码NtMNS1a、NtMNS1b和NtMNS2的外显子序列的多核苷酸，所述外显子序列包括NtMNS1a外显子1(SEQID NO:3)、外显子2(SEQ ID NO:5)、外显
子3(SEQ ID NO:7)、外显子4(SEQ ID NO:9)、外显子5(SEQ ID NO:11)、外显子6(SEQ ID
NO:13)、外显子7(SEQ ID NO:15)、外显子8(SEQ ID NO:17)、外显子9(SEQID NO:19)、外显子10(SEQ ID NO:21)、外显子11(SEQ ID NO:23)、外显子12(SEQ ID NO:25)、外显子13(SEQ ID NO:27)、外显子14(SEQID NO:29)；NtMNS1b外显子1(SEQ ID NO:34)、外显子2(SEQ ID NO:36)、外显子3(SEQ ID NO:38)、外显子4(SEQ ID NO:40)、外显子5(SEQID NO:42)、外显子6(SEQ ID NO:44)、外显子7(SEQ ID NO:46)、外显子8(SEQ ID NO:48)、外显子9(SEQ ID NO:50)、外显子10(SEQ IDNO:52)、外显子11(SEQ ID NO:54)、外显子12(SEQ ID NO:56)、外显子13(SEQ ID NO:58)、外显子14(SEQ ID NO:60)；和NtMNS2外显子1(SEQ ID NO:65)、外显子2(SEQ ID NO:67)、外显子3(SEQ ID NO:69)、外显子4(SEQ ID NO:71)、外显子5(SEQ ID NO:73)、外显子6(SEQID NO:75)、外显子7(SEQ ID NO:77)、外显子8(SEQ ID NO:79)、外显子9(SEQ ID NO:81)、外显子10(SEQ ID NO:83)、外显子11(SEQ IDNO:85)、外显子12(SEQ ID NO:87)、外显子13(SEQ ID NO:89)和外显子14(SEQ ID NO:91)。

[0226] 如本领域技术人员将理解，线状DNA具有两种可能的方向：5'至3'方向和3'至5'方向。例如，如果参比序列以5'至3'方向排布，并且如果第二序列在相同的多核苷酸
内部以5'至3'方向排布，则所述参比序列与第二序列以相同的方向取向，或具有相同的方
向。一般地，启动子序列和处于给定启动子的调节作用或调节控制下的目的基因以相同方
向排布。然而，相对于以5'至3'方向排布的参比序列，如果第二序列相同的多核苷酸内部
以3'至5'方向排布，则所述参比序列与第二序列以反义方向取向，或具有反义方向。如果
参比序列(5'至3'方向)和参比序列的反向互补序列(以5'至3'方向排布的参比序列)
排布于相同的多核苷酸内部，可以将相对于彼此具有反义方向的两个序列可选地描述为具
有相同方向。本文中所述的序列以5'至3'方向显示。

[0227] NtMNS多肽.NtMNS多肽包括可以人为工程化或天然存在的因引入任何类型的改变而产生的NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4多肽和变体，所述改变例如是氨基酸的
插入、缺失、或置换；糖基化状态变化、影响再折叠或异构化、三维结构或自我缔合状态的变化。NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4多肽包含至少10、至少20、至少30、或至少40
个连续氨基酸。

[0228] 多种实施方案涉及由多核苷酸序列或其变体编码的NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4多肽，所述多核苷酸序列包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:98的片段、尤其组成、基本上其组成。

[0229] 多种实施方案涉及NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4多肽变体，所述变体包含与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:62或SEQ IDNO:93或SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97或
SEQ ID NO:99，或与SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:93或SEQ ID NO:95、SEQ
ID NO:97或SEQ ID NO:99的片段至少50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、
78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、
97%、98%或99%的序列同一性。

[0230] NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4的突变体多肽变体也由权利要求书涵盖并且在本文中公开。

[0231] 与NtMNS多核苷酸结合的锌指蛋白.锌指DNA结合结构域或基序由折叠成β-β-α(ββα)结构的大约30个氨基酸组成，其中所述结构的α-螺旋(α-螺旋)插
入DNA双螺旋中。“α-螺旋”(α-螺旋)指蛋白质二级结构中的基序，其出现左手或右手螺旋，其中氨基酸的每个N-H基团的氢与相对于第一基酸的位置-4处的氨基酸的C=O基团结
合。如本文所用的“β-桶”(β-桶)指包含两条β-链(β-链)的蛋白质的二级结构中
的基序，其中第一链与第二链成氢键以形成封闭结构。如本文所用的“β-β-α”(ββα)结构”指由β-桶组成的蛋白质中的结构，其包含两条反平行β-链和一个α-螺旋。术语
“锌指DNA结合结构域”指包含锌离子并且能够与特定三碱基对DNA序列结合的蛋白质结构
域。术语“非天然的锌指DNA结合结构域”指锌指DNA-结合结构域，其不出现在包含待修
饰的DNA的细胞或生物中。

[0232] 在锌指DNA结合结构域或基序内部结合靶DNA内部三碱基对序列的关键氨基酸，是相对于α-螺旋始点的氨基酸-1、+1、+2、+3、+4、+5和+6。可以修饰在相对于锌指DNA
结合结构域或基序的α-螺旋始点的氨基酸-1、+1、+2、+3、+4、+5和+6位置处的氨基酸。
同时维持β-桶主链，以产生结合不同三碱基对序列的新型DNA结合结构域或基序。这种
新型DNA结合结构域可以是非天然的锌指DNA结合结构域。除了由相对于α-螺旋始点的
氨基酸-1、+1、+2、+3、+4、+5和+6位置处的氨基酸识别的三碱基对序列之外，这些氨基酸中的一些也可以与三碱基对序列识别位点外部的碱基对相互作用。通过组合2、3、4、5、6或更多个锌指DNA结合结构域或基序，可以产生与较长DNA序列特异性结合的锌指蛋白。例
如，包含2个锌指DNA结合结构域或基序的锌指蛋白可以识别特定的6碱基对序列，并且包
含4个锌指DNA结合结构域或基序的锌指蛋白可以识别特定的12碱基对序列。锌指蛋白
可以包含通过截短作用或扩充或与选择方法(例如，但不限于噬菌体展示选择法、细菌双
杂交选择法或细菌单杂交选择法)偶合的位点定向诱变过程或者天然和非天然锌指DNA结
合结构域的任何组合而源自天然或野生型锌指蛋白的两个或更多个天然锌指DNA结合结
构域或基序或两个或更多个非天然锌指DNA结合结构域或基序。如这种情形内部所使用的
“截短”指含有少于天然锌指蛋白中存在的完整数目的锌指DNA结合结构域或基序的锌指蛋白。如这种情形内部所使用的“扩充”指含有多于天然锌指蛋白中存在的完整数目的锌指
DNA结合结构域或基序的锌指蛋白。为锌指蛋白结合而选择基因组序列内部的多核苷酸序
列的技术是本领域已知的并且可以用于本发明中。

[0233] WO98/54311公开了用于设计结合靶基因独有的特定核苷酸序列的锌指蛋白结构域的方法。已经计算出包含18个核苷酸的序列足以规定高等生物基因组中的独特位置。一
般地，因此，锌指蛋白结构域含有6个锌指，每一个具有专门设计的用于与特定三联体相互作用的α螺旋。然而，在一些情况下，较短或较长的核苷酸靶序列可能是合乎需要的。因
此，蛋白质中的锌指结构域可以含有2至12个指状物–如3至8个指状物，5至7个指状
物，或6个指状物。

[0234] 用于设计并鉴定具有所需核酸结合特征的锌指蛋白的方法也包WO98/53060中描述的那些，所述专利报道了一种用于制备能够与靶核酸序列中的核酸四联体结合的
Cys2-His2锌指型核酸结合蛋白的方法。

[0235] 本发明中使用的锌指蛋白可以包含经接头、优选地柔性接头与至少一个第二DNA结合结构域连接的至少一个锌指多肽，所述锌指多肽任选地是第二锌指多肽。这种锌指蛋
白可以含有多于两个DNA结合结构域，以及一个或多个调节结构域。这种锌指多肽可以经
工程化以识别选择的基因中所选定的靶位点。

[0236] 在一个实施方案中，该锌指蛋白包含源自天然存在的锌指蛋白中的框架(或主链)。可以例如食用源自任何天然存在的锌指蛋白中的框架(或主链)，可以使用包含源自
包含C2H2基序的锌指蛋白中的框架(或主链)的锌指蛋白。

[0237] 在另一个具体实施方案中，该锌指蛋白包含源自锌指蛋白的在植物细胞中天然有功能的框架(或主链)。例如，该锌指蛋白可以包含C3H锌指、QALGGH基序、RING-H2锌指
基序、九氨基酸C2H2基序、拟南芥LSD1的锌指基序和BBF的锌指基序/Dof结构域蛋白质。

[0238] 多种实施方案涉及锌指蛋白，所述锌指蛋白特异性结合至NtMNS1a、NtMNS1b和NtMNS2多核苷酸，所述多核苷酸包含即SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的序列；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64或其变体的片段、特异性结合至NtMNS1a、
NtMNS1b和NtMNS2的内含子或外显子，包括SEQ ID NO:3至29、34至60和65至91、特异
性结合至NtMNS1a、NtMNS1b和NtMNS2的内含子和外显子(包括SEQ ID NO:3至29、34至
60和65至91)的组合。如本领域技术人员将理解，在本发明的上下文中，内含子和外显子
的组合指在相应的基因组多核苷酸上彼此直接连接的内含子和外显子，如例如NtMNS1a外
显子3(SEQ ID NO:7)和内含子3(SEQ ID NO:8)或NtMNS1a内含子2(SEQ ID NO:6)和外
显子3(SEQ ID NO:7)。

[0239] 与NtMNS多核苷酸结合的大范围核酸酶.本发明的多个方面还提供了使用基因组工程化或基因组编辑技术调节NtMNS多核苷酸和多肽的表达的方法。因此，在某些实施
方案中，大范围核酸酶，如非天然或重组的大范围核酸酶，用来在编码NtMNS多肽的基因组DNA中在单一位点或在相对少的位点处特异性造成双链断口，以造成NtMNS多核苷酸(如
NtMNS1a、NtMNS1b或NtMNS2)的破坏。大范围核酸酶可以是如WO07/047859中所述的具有
改变的DNA识别特定的工程化大范围核酸酶，所述专利描述了基于结构对源自天然存在性
大范围核酸酶I-CreI的大范围核酸酶工程化的方法。可以使工程化大范围核酸酶识别并
且切割预定的22碱基对DNA序列。大范围核酸酶蛋白可以由本领域已知的多种不同机制
递送至细胞中。

[0240] 多种实施方案涉及大范围核酸酶，所述大范围核酸酶特异性结合至NtMNS1a、NtMNS1b和NtMNS2多核苷酸，所述多核苷酸包含即SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID
NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的序列；SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:64或其变体的片段、特异性结合至NMNS1a、NtMNS1b和NtMNS2的内含子或外显子，包括SEQ ID NO:3至29、34至60和65
至91、特异性结合至NtMNS1a、NtMNS1b和NtMNS2的内含子和外显子(包括SEQ ID NO:3
至29、34至60和65至91)的组合。如本领域技术人员将理解，在本发明的上下文中，内含
子和外显子的组合指在相应的基因组多核苷酸上彼此直接连接的内含子和外显子，如例如
NtMNS1a外显子3(SEQ ID NO:7)和内含子3(SEQ ID NO:8)或NtMNS1a内含子2(SEQ ID
NO:6)和外显子3(SEQ ID NO:7)。

[0241] 与NtMNS多肽结合的抗体.在另一个实施方案中，本文中提供与NtMNS多肽免疫反应的抗体，所述NtMNS多肽包括NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4并且包括SEQ ID
NO:31、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:99。如本文中所述的NtMNS多肽、片段、变体、融合多肽等可以在产生与之发生免疫反应的抗体时用作“免疫原”。这类种抗体借助抗体抗原结合位点与多肽特异性结合。特异性结合抗体是将与NtMNS家族多肽、同源物和变体特异性识别及结合，但不与其他分子特异性识别及结
合的那些。在一个实施方案中，这些抗体对下述多肽特异，所述多肽具有如本文在SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:99中所述的NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2氨基酸序列，并且不与其他多肽交叉反应。

[0242] 这些抗体也可以用于体外或体内检测NtMNS多肽或片段的存在的测定法中。这些抗体也可以用于通过免疫亲和层析纯化多肽或片段系，或用于调节NtMNS多肽的表达。

[0243] 转化.本文描述了具有修饰的α-甘露糖苷酶I活性的转基因和修饰的植物细胞以及包含这类细胞的植物，以及包含一种或多种重组核酸(如异源多核苷酸)的具有修饰
的α-甘露糖苷酶I活性的转基因植物细胞和植物。这种异源多核苷酸可以是本发明的多
核苷酸、嵌合基因、核酸构建体、dsRNA或表达载体。这种异源多核苷酸也可以是编码异源蛋白的在本发明的修饰植物细胞或植物中表达的构建体，所述异源蛋白用于制备本发明的
药物组合物。

[0244] 植物或植物细胞可以通过使得重组核整合至基因组而转化以变成稳定转化。稳定转化的细胞一般随每次细胞分裂保留导入的核酸。也可以将植物或植物细胞瞬时转化，从
而重组核酸不整合至其基因组中。瞬时转化的细胞一般随每次细胞分裂而丢失导入的重组
核酸的全部或某些部分，从而在足够次数的细胞分裂后不能在子代细胞中检测到导入的重
组核酸。

[0245] 用于将核酸导入单子叶和双叶植物和植物细胞中的技术是本领域已知的，并且包括，例如，农杆菌介导的转化和浸润、病毒载体介导的转化，电穿孔和粒子枪转化。例如，美国专利号4,459,355公开一种用于用含有Ti质粒的农杆菌菌株转化易感植物(包括
双子叶植物)的方法；美国专利号4,795,855公开用农杆菌载体转木本植物；美国专利号
4,940,838公开双元农杆菌载体；美国专利号4,945,050；和美国专利号5,015,580。如果使用细胞或培养的组织作为用于转化的受体组织，则如果所需，通过本领域技术人员已知的
技术，可以培育转化的培养细胞或可以从转化的培养物或组织中再生出转化的植物细胞。
为了在植物细胞中制备包含异源蛋白或糖蛋白的药物组合物，将编码所述蛋白质的异源多
核苷酸或基因序列置于在植物细胞中在基因构建体或转化载体内有功能的调节元件控制。

[0246] 调节元件.选择在重组构建体中待包含的调节元件取决于几个因素，包括但不限于效率、可选性、可诱导性、所需的表达水平和细胞偏好性或组织偏好性表达。对于本领域技术人员，通过适当地选择并相对于编码序列排布调节区调节编码序列表达是例行常规。
核酸的转录可以按相似的方式调节。一些合适的调节区仅启动转录或在某些细胞类型中优
势地启动转录。

[0247] 启动子.合适的启动子包括由不同组织或细胞类型中存在的组织特异性因子识别的组织特异性启动子，例如根特异性启动子、苗特异性启动子、木质部特异性启动子、叶特异性启动子，或不同发育阶段期间存在的或应答于不同环境条件而存在的启动子。合适
的启动子包括可以在大部分细胞类型中激活而不需要特定诱导物的组成型启动子。用于调
控NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4RNAi多核苷酸产生的合适启动子的例包括花椰菜
花叶病毒35S启动子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基启动子、章鱼碱合酶启动子、胭
脂碱合酶启动子或遍在蛋白启动子或菜豆蛋白启动子。本领域技术人员能够产生重组启动
子的多个变种。

[0248] 包含NtMNS构建体的RNAi表达载体.RNA干扰(“RNAi”)或RNA沉默是可以藉此导引特定mRNA发生酶降解的进化保守过程。必须导入或由细胞例如由dsRNA病毒或NtMNS
RNAi多核苷酸产生双链RNA(dsRNA)，以启动RNAi途径。dsRNA可以由作为dsRNA特异性核
酸内切酶的RNA酶III转化成21-23bp长度的多个siRNA双链体(“siRNA”)。这些siRNA
随后可以被借助ATP依赖性过程促进siRNA散解的RNA诱导性沉默复合物识别。siRNA的散
解反义链引导激活的RNA诱导性沉默复合物至靶向的mRNA，所述mRNA可以是包含与siRNA
反义链互补的序列的NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4RNA变体。

[0249] 包含编码NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4RNAi多核苷酸的NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4RNAi构建体的NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4RNAi
表达载体，通过以下方式显示出RNA干扰活性：降低NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2和
NtMan1.4mRNA；NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2 或NtMan1.4 前mRNA；或相关的 NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4RNA变体的表达水平。如本文进一步描述，这些表达载体可
以包含排布在NtMNS RNAi构建体上游并与之有效连接的启动子。NtMNS RNAi表达载体可
以包含合适的最小核心启动子、NtMNS RNAi目的构建体、上游(5')调节区、下游(3')调节
区(包括转录终止和多聚腺苷化信号)，和本领域技术人员已知的其他序列，如各种选择标
记。

[0250] 在一个实施方案中，选择满足以上标准中一项或多项的在约14和约30个核苷酸长度之间的靶NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4mRNA序列。在另一个实施方案中，选
择满足以上标准中一项或多项的在约16和约30个核苷酸长度之间的靶序列。在又一个实
施方案中，选择满足以上标准中一项或多项的在约19和约30个核苷酸长度之间的靶序列。
在另一个实施方案中，选择满足以上标准中一项或多项的在约19和约25个核苷酸长度之
间的靶序列。

[0251] 在一个示例性实施方案中，siRNA分子包含与如SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:98中所述的任一序列的至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续核苷酸互补的特定反义序列。

[0252] 由siRNA分子包含的特定反义序列可以与靶序列的互补物相同或与之基本上相同。在本发明的一个实施方案中，由siRNA分子包含的特定反义序列与靶mRNA序列的互
补物相同至少约50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、74%、不过具体地至少75%、76%、77%、78%、
79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、
98%或99%。确定序列同一性的方法是本领域已知的并且可以例如通过使用威斯康星大学
计算机群(GCG)软件或在NCBI网站上提供的BLASTN程序来确定。

[0253] 通过共抑制作用减少NtMNS基因表达的表达载体.提供各种组合物和方法以便通过促进对NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4基因表达的共抑制作用调节(包括减少)
NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4基因的内源表达水平。共抑制现象因将一个转基因
的多个副本导入植物细胞宿主中发生。一个转基因的多个副本的整合可能导致转基因和所
靶向内源基因的表达降低。共抑制的程度依赖于转基因和靶向的内源基因之间序列同一性
的程度。内源基因和转基因二者的沉默可以因沉默的基因座、内源启动子和内源目的基因
的广泛甲基化而发生，所述广泛甲基化可以排除转录。可选地，在一些情况下，对内源基因和转基因的共抑制可以因转录后基因沉默(“PTGS”)而出现，其中转录物可以产生，但是增强的降解速率排除了转录物的积累。认为借助PTGS引起共抑制的机制类似于RNA干扰，在
于RNA在这些过程中似乎既是重要的引发剂，又是靶，并且可以至少部分地由相同分子装
置介导，可能借助RNA引导的mRNA降解。

[0254] 可以通过将SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:98的NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4cDNA或其片段的多个副本作为转基因整合至目的植物基因组中，实现对NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4的共
抑制。宿主植物可以用包含与NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4cDNA或其片段有效连
接的启动子的表达载体转化。多种实施方案涉及用于促进对内源NtMNS基因的共抑制的表
达载体，所述表达载体包含：与NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4有效连接的启动子，例如被鉴定为SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:98或其片段，如SEQ ID NO:5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、34、36、
38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89 或
91中任一者或与之具有至少约50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、不过具体地至少74%、75%、
80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的其变体的cDNA。

[0255] 多种实施方案涉及通过以下方式调节、减少或抑制NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2，和NtMan1.4的表达水平的方法：将被鉴定SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:98的NtMNS1a、NtMNS1b或NtMNS2或其片段，或其与之具有至少50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、不过具体地至少74%、75%、76%、77%、78%、79%、
80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或
99%序列同一性的变体的多个副本整合至植物基因组中，所述方法包括：用表达载体转化
植物细胞宿主，其中所述表达载体包含与SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:98或其片段，或其与之具有至少50%、55%、60%、70%、
71%、72%、73%、不过具体地至少74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、
86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的变体有效连接的启动子。

[0256] 通过反义剂抑制翻译而减少NtMNS基因表达的表达载体.提供各种组合物和方法以便通过抑制NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4mRNA的翻译，降低NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4的内源表达水平。宿主植物细胞可以用表达载体转化，所述表达载
体包含：与相对于启动子以反义方向排布的NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4或其
变体或片段有效连接的启动子，以便使得具有与NtNMS1a NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或
NtMan1.4mRNA的一部分互补的序列的RNA多核苷酸能够表达。

[0257] 抑制NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4mRNA翻译的各种表达载体可以包含：与被鉴定为SEQSEQ ID NO:30、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:92或SEQ ID NO:98的NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4或其片段或者其与之具
有至少50%、55%、60%、70%、71%、72%、73%、不过具体地至少74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、
81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性的变体有效连接的启动子，其中所述序列相对于启动子以反义方向排布。反义
NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2，和NtMan1.4RNA多核苷酸可以变动的长度，并且可以是约15-20个核苷酸、约20-30个核苷酸、约30-50个核苷酸、约50-75核苷酸、约75-100个核苷酸、约
100-150个核苷酸、约150-200个核苷酸和约200-300个核苷酸。

[0258] 用于减少NtMNS表达的其他组合物和方法.用于获得NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4多核苷酸和多肽的保守变体和更趋异性变体的方法是本领域技术人员已知
的。任何目的植物可以通过已知诱导诱变的各种方法进行基因修饰，所述方法包括位点
定向诱变、寡核苷酸介导的诱变、化学诱导的诱变如甲磺酸乙酯、辐射诱导的诱变和其他
等同方法。可选地，可以通过联合高密度点突变与快速灵敏突变检测的称作基因组内定
向诱导的局部损伤的方法(“TILLING”)，瞄准NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4基
因以便失活。通常，使植物种子暴露于一般导致错配的诱变剂，如甲磺酸乙酯(EMS)或
EMS烷基化物鸟嘌呤。合适的试剂和方法是本领域技术人员已知的，如中所述McCallum
等人,(2000),“Targeting Induced Local Lesions INGenomics(TILLING)for Plant
Functional Genomics,”PlantPhysiology123:439-442；McCallum等人,(2000)“Targeted screening forinduced mutations,”Nature Biotechnology18:455-457；和 Colbert
等人 ,(2001)“High-Throughput Screening for Induced Point Mutations,”Plant
Physiology126:480-484。主要产生点突变和短缺失、插入、颠换、转变的诱变剂，包括化学诱变剂或辐射或全部可以用来产生突变。诱变剂包括但不限于甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)、N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)、三乙基蜜胺(TEM)、N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、丙
卡巴肼、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、二乙基硫酸盐、丙烯酰胺单体、美法仓、氮芥、长春新碱、二甲基亚硝胺、N-甲基-N'-硝基-亚硝基胍(MNNG)、亚硝基胍、2-氨基嘌呤、7,12二甲基-苯
并蒽(DMBA)、环氧乙烷、六甲基磷酰胺、bisulfan、二环氧链烷(二环氧辛烷(DEO)、二环氧丁烷(BEB)等)、二盐酸2-甲氧基-6-氯-9[3-(乙基-2-氯-乙基)氨基丙基氨基]吖啶
(ICR-170)和甲醛。

[0259] 对NtMNS多核苷酸的诱变.与本发明的NtMNS多核苷酸结合的一对锌指可以用来产生用于修饰NtMNS多核苷酸的锌指核酸酶。锌指核酸酶介导的诱变的一般用途是本领域
已知的并且在例如WO02/057293、WO02/057294、WO00/041566、WO00/042219和WO05/084190中描述。

[0260] 构思了一种通过锌指核酸酶介导的诱变使基因序列如编码NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4的基因组DNA序列突变的方法，所述方法任选地包括一个或多个以下
步骤：(i)提供在基因序列中选择性结合不同靶位点的至少两种锌指蛋白；(ii)构建与植
物细胞中可运行的表达调控序列有效连接的两种表达构建体，所述表达构建体各自编码不
同的锌指核酸酶，所述锌指核酸酶包含步骤i)的两种不同非天然锌指蛋白之一和核酸酶；
(iii)将这两种表达构建体导入植物细胞，其中产生所述两种不同的锌指核酸酶，从而在植物细胞的基因组中基因组DNA序列内的靶位点至少之一处或其附近导入双链断口。向植物
细胞中导入两个表达构建体可以同时或依次地实现，任选地包括选择摄取第一构建体的细
胞。

[0261] 如本文所用，双链断口(DSB)指DNA或RNA的两条链中的断口。双链断口可以在基因组DNA序列上不多于从靶位点之一移除的5个碱基对至1500个碱基对之间、尤其不多
于5个碱基对和200个碱基对之间，尤其不多于5个碱基对和20个碱基对之间的位点处存
在。双链断口可以促进非同源末端接合，导致在基因组DNA序列中的靶位点处或其附近突
变。如本文所用的“非同源末端接合(NHEJ)”指无需同源模板情况下通过直接连接修复双
链断口的修复机制，并且因此可以在双链断口出现之前相对于该序列具有致突变性。

[0262] 该方法可以任选地还包括步骤：(iv)向植物细胞导入的多核苷酸包含与双链断口上游的核苷酸序列同源的至少第一区域和与双链断口下游的核苷酸序列同源的第二
区域。所述多核苷酸可以包含与含有缺失或异源核苷酸序列插入的NtNMS1a、NtMNS1b、
NtMNS2或NtMan1.4序列对应的核苷酸序列。所述多核苷酸因此可以促进在靶位点处或其
附近的同源重组，导致异源序列插入基因组中或基因组DNA序列从基因组中缺失。植物细
胞中的所得到的基因组DNA序列可以包含破坏所表达的突变NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或
NtMan1.4的酶活性的突变、早期翻译终止密码子、或干扰前mRNA正确加工成mRNA从而导致
基因表达降低或失活的序列基序。通过使编码蛋白质的基因序列突变而破坏蛋白质合成的
方法是本领域技术人员已知的。

[0263] 锌指核酸酶可以通过产生第一多核苷酸和第二多核苷酸的融合物来构建，其中所述第一多核苷酸编码与NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4结合的锌指蛋白，所述第二
多核苷酸编码非特异性核酸内切酶如，但不限于，那些IIS型核酸内切酶。IIS型核酸内切
酶是具有独立识别结构域和核酸内切酶切割结构域的限制性酶，其中所述酶在从识别位点
中移除的位点处切割DNA。IIS型核酸内切酶的非限制性例子可以是但不限于AarI、BaeI、
CdiI、DrdII、EciI、FokI、FauI、GdiII、HgaI、Ksp632I、MboII、Pfl1108I、Rle108I、RleAI、SapI、TspDTI或UbaPI。用于设计和构建融合蛋白的方法、用于从IIS型核酸内切酶的序列
识别结构域中选择并分离核酸内切酶结构域的方法、用于设计和构建包含锌指蛋白和核酸
内切酶的融合蛋白的锌指核酸酶的方法是本领域已知的。在一个具体实施方案中，锌指核
酸酶中的核酸酶结构域是FokI。锌指蛋白和FokI核酸酶之间的融合蛋白可以包含由两个
碱基对组成的间隔序列，或可选地，间隔序列可以由3、4、5、6个或更多个碱基对组成。在一个实施方案中，描述了具有7碱基对间隔序列的融合蛋白，从而一旦与第二锌指核酸酶接
触，第一锌指核酸酶的核酸内切酶可以二聚化，其中构成所述锌指核酸酶的两种锌指蛋白
可以靶DNA序列的上游和下游结合。一旦二聚化，锌指核酸酶可以在靶核苷酸序列中导入
双链断口，随后可以是与外源核苷酸序列的非同源末端接合或同源重组，其中所述外源核
苷酸序列与双链断口两侧的区域具有同源性。

[0264] 在又一个实施方案中，提供一种包含锌指蛋白和增强蛋白质的融合蛋白，从而产生锌指激活蛋白。锌指激活蛋白可以用来上调或激活NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或
NtMan1.4的转录，这包括步骤(i)工程化一种锌指蛋白，所述锌指蛋白结合启动子或与
NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4的编码序列有效连接的序列内部的区域，(ii)在所
述锌指蛋白和转录激活蛋白之间产生融合蛋白，(iii)产生包含多核苷酸序列的表达构建
体，所述多核苷酸序列编码在细胞(如植物细胞)中有活性的启动子调控下的所述锌指激
活蛋白，(iv)将所述基因构建体导这种细胞中，并且(v)培养该细胞并且允许所述锌指激
活蛋白表达，以及(vi)表征具有增加的NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4表达的细
胞。

[0265] 在又一个实施方案中，本发明提供一种包含锌指蛋白和基因阻遏蛋白的融合蛋白，从而产生锌指阻遏蛋白。锌指阻遏蛋白可以用来下调或阻抑NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4的转录，这包括步骤(i)工程化一种锌指蛋白，所述锌指蛋白结合至启动子或
与NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4的编码序列有效连接的序列内部的区域，并且
(ii)在所述锌指蛋白和转录阻遏蛋白之间产生融合蛋白，并且(iii)形成包含多核苷酸序
列的基因构建体，所述多核苷酸序列编码在细胞(如植物细胞)中有活性的启动子调控下
的所述锌指阻遏蛋白，并且(iv)将所述基因构建体导这种细胞中，并且(v)引起所述锌指
阻遏蛋白的表达，并且(vi)表征具有降低的NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4转录的
细胞。

[0266] 在又一个实施方案中，本发明提供一种包含锌指蛋白和基因甲基化酶的融合蛋白，从而产生锌指甲基化酶。锌指甲基化酶可以用来通过甲基化NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4的启动子区内部的区域，下调或抑制NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4
在细胞(如植物细胞)中的表达，这包括步骤(i)工程化一种锌指蛋白，所述锌指蛋白可以
结合至如存在于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:32或SEQ IDNO:63中编码序列上游的NtNMS1a、
NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4的启动子内部的区域，并且(ii)在所述锌指蛋白和甲基化
酶之间产生融合蛋白，并且(iii)形成含有多核苷酸序列的基因构建体，所述多核苷酸序
列编码在所述细胞中有活性的启动子调控下的所述锌指甲基化酶，并且(iv)将所述基
因构建体导这种细胞中，并且(v)允许所述锌指甲基化酶的表达，并且(vi)表征细胞中
NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4表达降低或实质上不表达的细胞。

[0267] 在本发明的多种实施方案中，可以根据本发明的方法选择锌指蛋白以便与NtMNS1a、NtMNS1b或NtMNS2的调节序列结合。更具体地，调节序列可以包括转录起始位点、起始密码子、外显子区域、外显子-内含子交界、终止子或终止密码子。锌指蛋白可以与核酸酶、激活蛋白或阻抑蛋白融合。

[0268] 在本发明的多种实施方案中，锌指核酸酶在NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4的基因组DNA序列的调节区、编码区或非编码区中导入双链断口，并且导致减少、抑制或基本上抑制NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4的表达水平，并减少、抑制或基本上抑制由其所编码的蛋白质的α-甘露糖苷酶I或甘露糖水解活性。

[0269] 本发明也提供一种用于修饰细胞(如植物细胞)的方法，其中通过锌指核酸酶介导的诱变修饰所述植物细胞的基因组，所述方法包括(a)鉴定并且产生在基因组核苷酸序
列中选择性结合用于修饰的不同靶位点的至少两种非天然锌指蛋白；(b)在植物细胞中表
达至少两种融合蛋白，每种融合蛋白包含核酸酶和至少两种非天然锌指蛋白之一，从而在
植物基因组中的基因组核苷酸序列内，尤其在基因组核苷酸序列中的靶位点处或其附近导
入双链断口；并且，任选地(c)向所述细胞导入包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列包含与双链断口上游序列同源的第一区域和与双链断口下游区域同源的第二区域，
从而所述多核苷酸与基因组中的DNA重组。还描述包含一个或多个表达构建体的细胞，所
述表达构建体包含编码一种或多种所述融合蛋白的核苷酸序列。

[0270] 大范围核酸酶介导的诱变的一般用途是本领域已知的并且在以下专利出版物如WO96/14408、WO03/025183、WO03/078619、WO04/067736、WO07/047859 和 WO09/059195 中描述。在某些实施方案中，大范围核酸酶，如重组的大范围核酸酶，用来在植物的基因组
DNA中在单一位点或在相对少的位点处特异性造成双链断口，以造成NtMNS多核苷酸(如
NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4)的破坏。大范围核酸酶可以是如WO07/047859中
所述的具有改变的DNA识别特定的工程化大范围核酸酶，所述专利描述了基于结构对源自
天然存在性大范围核酸酶I-CreI的大范围核酸酶工程化的方法。

[0271] 可以通过本领域已知的任何适合方法向植物细胞提供锌指核酸酶或大范围核酸酶蛋白或一对锌指蛋白。例如，可以将锌指核酸酶外源添加至植物细胞并且将植物细胞在
这样的条件下维持，从而锌指核酸酶的锌指蛋白与靶核苷酸序列结合，并且通过核酸酶的
活性调节靶基因。可选地，可以在植物细胞中表达编码锌指蛋白的核苷酸序列并且将植物
细胞在这样的条件下维持，从而表达的锌指蛋白与靶核苷酸序列结合并且调节植物细胞中
靶基因的表达。可以在植物中使用任何适合的植物表达载体表达锌指核酸酶。可用于高等
植物中表达基因的常见载体是本领域熟知的。

[0272] 用于调节NtMNSα-甘露糖苷酶I活性的组合物和方法.本发明的实施方案涉及用于产生非天然或转基因植物的组合物和方法，其中已经修饰所述的非天然或转基因植
物，以便通过减少或增加所编码蛋白质的活性或编码这类蛋白质的基因的转录，减少或增
加α-甘露糖苷酶I活性。与对照植物相比，NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4RNA转
录物的稳态水平可以减少或增加。因此，可用于水解糖蛋白的N-聚糖的甘露糖的功能活性
NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4α-甘露糖苷酶I酶的数量可以减少或增加，从而植
物细胞中糖蛋白的N-聚糖上的甘露糖水平增加或减少。

[0273] NtNMS1aNtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4表达的减少可以是约5%至约100%或减少至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少
75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至多到100%，这包括转录活性或蛋白质表达的减少。

[0274] NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4活性的减少可以是约5%至约100%或减少至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至多到100%。

[0275] NtMNS1a、NtMNS1b或NtMNS2表达的增加可以是约10%至约1000%或增加至少10%、至少20%、至少25%、至少50%、至少100%、至少200%、至少500%、至少750%或至多到1000%，这包括转录活性或蛋白质表达的增加。

[0276] NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4多肽的活性的增加可以是约10%至约1000%或增加至少10%、至少20%、至少25%、至少50%、至少100%、至少200%、至少500%、至少
750%或至多到1000%。

[0277] 抑制指约98%至约100%的减少或减少至少98%、至少99%、但是尤其100%。

[0278] 构建体和载体

[0279] 本文中提供的重组构建体可以用来转化植物或植物细胞以便表达本发明的多核苷酸。重组核酸构建体可以包含编码如本文所述的异源蛋白的核酸，所述核酸与适于在植
物或细胞中表达异源多肽的调节区有效连接。也提供含有重组核酸构建体的载体，如本文
所述的那些。合适的载体主链包括，例如，本领域常规使用的那些，如质粒、病毒、人工染色体、BAC、YAC或PAC。合适的表达载体包括而不限于质粒和源自例如噬菌体、杆状病毒和逆转录病毒的病毒载体。众多载体和表达系统是可商业获得的。

[0280] 载体也可以包含例如复制起点、骨架附着区(SAR)或标记。标记基因可以对植物细胞赋予可选表型。例如，标记可以赋予杀生物剂抗性，如针对抗生素(例如，卡那霉素、G418、博来霉素或潮霉素)或除草剂(例如，草甘膦、氯磺隆或膦丝菌素)的抗性。此外，表达载体可以包括设计成促进操作或检测(例如，纯化或定位)已表达多肽的标签序列。标
签序列如萤光素酶、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽S-转移酶
(GST)、多组氨酸、c-myc或血凝素序列一般作为与所编码多肽的融合物表达。这类标签可
以在多肽内部任何位置插入，包括在羧基端或氨基端。

[0281] 具有修饰的α-甘露糖苷酶I活性的转基因或非天然植物细胞和植物

[0282] 多种实施方案涉及就α-甘露糖苷酶I活性而言受各种方法修饰的转基因和非天然存在的植物，所述方法可以用于减少或沉默NtMNS基因表达，并且因而产生其中
NtMNSα-甘露糖苷酶I酶的表达水平可以在目的植物组织内部降低的植物。其他实施方案
涉及通过各种方法修饰的植物细胞和植物，所述方法可以用于增加NtMNS表达，导致增加
的α-甘露糖苷酶I活性水平。

[0283] 适合基因修饰的植物包括单子叶和双叶植物和植物细胞系统，包括来自以下科之一的物种：爵床科(Acanthaceae)、葱科(Alliaceae)、六出花科(Alstroemeriaceae)、
石蒜科(Amaryllidaceae)、夹竹桃科 (Apocynaceae)、棕榈科 (Arecaceae)、菊科
(Asteraceae)、小蘖科(Berberidaceae)、红木科(Bixaceae)、十字花科(Brassicaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、大麻科(Cannabaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、三尖
杉科 (Cephalotaxaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、秋水仙科(Colchicaceae)、葫
芦科(Cucurbitaceae)、薯蓣科(Dioscoreaceae)、麻黄科(Ephedraceae)、古柯科
(Erythroxylaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、唇形科(Lamiaceae)、
亚麻科 (Linaceae)、石松科 (Lycopodiaceae)、锦葵科 (Malvaceae)、藜芦科
(Melanthiaceae)、芭蕉科(Musaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、珙桐科(Nyssaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、松科(Pinaceae)、车前科(Plantaginaceae)、禾本科(Poaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、杨柳科(Salicaceae)、无患子科(Sapindaceae)、茄科(Solanaceae)、红豆杉科(Taxaceae)、山茶科(Theaceae)或葡萄科(Vitaceae)。

[0284] 合适的物种可以包括以下属的成员：秋葵属(Abelmoschus)、冷杉属(Abies)、枫属(Acer)、剪股颖属(Agrostis)、葱属(Allium)、六出花属(Alstroemeria)、凤梨属
(Ananas)、穿心莲属(Andrographis)、须芒草属(Andropogon)、蒿属(Artemisia)、芦竹属(Arundo)、颠茄属(Atropa)、小檗属(Berberis)、甜菜属(Beta)、红木属(Bixa)、芸苔属
(Brassica)、金盏花属(Calendula)、山茶属(Camellia)、喜树属(Camptotheca)、大麻属
(Cannabis)、辣椒属(Capsicum)、红蓝花属(Carthamus)、长春花属(Catharanthus)、三尖杉属(Cephalotaxus)、菊属(Chrysanthemum)、金鸡纳属(Cinchona)、西瓜属(Citrullus)、咖啡属(Coffea)、秋水仙属(Colchicum)、鞘蕊花属(Coleus)、黄瓜属(Cucumis)、南
瓜属(Cucurbita)、狗牙根属(Cynodon)、曼陀罗属(Datura)、石竹属(Dianthus)、毛
地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、油棕属(Elaeis)、麻黄属(Ephedra)、蔗茅
属(Erianthus)、古柯属(Erythroxylum)、桉属(Eucalyptus)、羊茅属(Festuca)、草莓
属(Fragaria)、雪花莲属(Galanthus)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属
(Helianthus)、橡胶树属(Hevea)、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、麻风树属
(Jatropha)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、羽扇豆属(Lupinus)、番茄属(Lycopersicon)、石松属(Lycopodium)、木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、薄荷属(Mentha)、芒属(Miscanthus)、芭蕉属(Musa)、烟草属(Nicotiana)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、罂粟属(Papaver)、银胶菊属(Parthenium)、狼尾草属(Pennisetum)、碧冬
茄属(Petunia)、虉草属(Phalaris)、梯牧草属(Phleum)、松属(Pinus)、早熟禾属(Poa)、一品红亚属(Poinsettia)、杨属(Populus)、萝芙木属(Rauwolfia)、蓖麻属(Ricinus)、
蔷薇属(Rosa)、甘蔗属(Saccharum)、柳属(Salix)、血根草属(Sanguinaria)、赛莨菪属
(Scopolia)、黑麦属(Secale)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、米草属(Spartina)、菠菜属(Spinacea)、菊蒿属(Tanacetum)、红豆杉属(Taxus)、可可属(Theobroma)、小黑麦属(Triticosecale)、小麦属(Triticum)、北美穗草属(Uniola)、藜芦属(Veratrum)、蔓长春花属(Vinca)、葡萄属(Vitis)和玉蜀黍属(Zea)。

[0285] 合适的物种可以包括黍属某些物种、高粱某些物种、芒属某些物种、甘蔗属某些物种、蔗茅属某些物种、杨属某些物种、大须芒草(Andropogon gerardii)(big bluestem)、象草(Pennisetumpurpureum)(elephant grass)、虉草 (Phalaris arundinacea)( 草芦(reedcanarygrass))、狗牙根(Cynodon dactylon)(百慕大草(bermudagrass))、
苇状羊茅(Festuca arundinacea)(高羊茅)、草原网茅(Spartinapectinata)(草原
索草(prairie cord-grass))、紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、芦竹(Arundo
donax)(giant reed)、黑麦(Secale cereale)(rye)、柳属某些物种(柳)、桉属某些物
种(桉)、小黑麦属(Triticosecale)(小麦x黑麦)、竹、向日葵(Helianthus annuus)
(sunflower)、红花(Carthamustinctorius)(safflower)、麻风树 (Jatropha curcas)
(jatropha)、蓖麻(Ricinuscommunis)(castor)、油棕(Elaeis guineensis)(棕榈)、
亚麻(Linumusitatissimum)(亚麻)、芥菜(Brassica juncea)、甜菜(Beta vulgaris)
(糖料甜菜(sugarbeet))、甜木薯(Manihot esculenta)(cassaya)、番茄(Lycopersicon
esculentum)(番茄)、莴苣(Lactuca sativa)(lettuce)、大蕉 (Musa paradisiaca)
(香蕉)、马铃薯(Solanum tuberosum)(potato)、甘蓝(Brassica oleracea)(花茎
甘蓝、花椰菜、抱子甘蓝)、茶(Camelliasinensis)(tea)、草莓(Fragaria ananassa)
(strawberry)、可可(Theobromacacao)(cocoa)、小果咖啡(Coffea arabica)(咖啡)、葡
萄(Vitisvinifera)(grape)、凤梨(Ananas comosus)(菠萝)、辣椒(Capsicumannum)(尖
辣椒和甜椒)、洋葱(Allium cepa)(onion)、甜瓜(Cucumismelo)(melon)、黄瓜(Cucumis
sativus)(cucumber)、笋瓜(Cucurbitamaxima)(squash)、南瓜(Cucurbita moschata)
(squash)、菠菜(Spinaceaoleracea)(spinach)、西瓜(Citrullus lanatus)(watermelon)、秋葵(Abelmoschus esculentus)(okra)、茄子(Solanum melongena)(茄子)、蔷薇属某
些物种(玫瑰)、香石竹(Dianthus caryophyllus)(康乃馨)、碧冬茄属某些物种(碧
冬茄)、一品红(Poinsettia pulcherrima)(poinsettia)、羽扇豆(Lupinus albus)
(lupin)、海滨燕麦草(Uniola paniculata)(oats)、翦股颖(剪股颖属某些物种)、美洲山
杨(Populus tremuloides)(aspen)、松属某些物种(松树)、冷杉属某些物种(冷杉)、槭
树属某些物种(槭木)、大麦(Hordeum vulgare)(barley)、草地早熟禾(Poa pratensis)
(蓝草)、黑麦草属某些物种(黑麦草)和梯牧草(Phleum pratense)(timothy)、柳枝
稷(Panicum virgatum)(柳枝稷)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)(高粱，苏丹草)、奇
岗(Miscanthus giganteus)(芒草(miscanthus))、甘蔗属物种(能源甘蔗)、香脂白杨
(Populus balsamifera)(杨)、玉蜀黍(Zea mays)(玉米)、大豆(Glycine max)(大豆)、欧
洲油菜(Brassica napus)(卡诺拉油菜)、普通小麦(Triticum aestivum)(小麦)、陆地棉
(Gossypium hirsutum)(棉花)、稻(Oryza sativa)(水稻)、向日葵(Helianthus annuus)
(sunflower)、紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、甜菜(Beta vulgaris)(糖料甜菜
(sugarbeet))、紫御谷(Pennisetum glaucum)(珍珠稷)。

[0286] 多种实施方案涉及NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4基因表达水平因各种方法而修饰的转基因和非天然存在的烟草植物，并且因而产生其中NtNMS1a、NtMNS1b、
NtMNS2或NtMan1.4α-甘露糖苷酶I酶的表达水平可以在目的植物组织内部减少或增加
的植物，如烟草植物。公开的组合物和方法可以适用于任何目的植物物种，包括烟草属的
植物、烟草属的各个物种，包括黄花烟草和烟草(例如LA B21、LNKY171、TI1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart1000-1、Petico、Delfield、Ottawa、Coker48、Labu、Delhi、TI115、Yellow Mammoth、Havana307、Burley1、Xanthi、Delgold、TI90、Green Briar、TI161、Kentucky16、Maryland201、Havana38、Duquesne、Burley49、CT681、81V9MS、TI170、Judy's Pride、TI164、CT572、TI158、Kentucky10、Cannelle、Bell C、Coker371Gold、Samsun、Turkish Samsun、Samsun NN、TI94、Bell B、CT157、TI75、White Mammoth、Vinica、Kelly、Grande Rouge、Gold Dollar、Belgique3007、White Gold、HicksBroadleaf、
Little Crittenden、Bonanza、Havana425)。其他物种包括N.acaulis、尖形烟草
(N.acuminata)、尖形烟草多花变种(N.acuminatavar.multiflora)、N.africana、花烟
草(N.alata)、N.amplexicaulis、N.arentsii、N.attenuata、N.benavidesii、本生烟草
(N.benthamiana)、印度烟草（N.Bigelovii）、N.bonariensis、N.cavicola、N.clevelandii、N.cordifolia、N.corymbosa、N.debneyi、高烟草（N.Excelsior）、N.forgetiana、
N.fragrans、粉蓝烟草（N.Glauca）、粘毛烟草（N.Glutinosa）、N.goodspeedii、野生烟草（N.Gossei）、N.hybrid、N.ingulba、N.kawakamii、N.knightiana、N.langsdorffii、N.linearis、长花烟草（N.Longiflora）、N.maritima、N.megalosiphon、N.miersii、N.noctiflora、N.nudicaulis、N.obtusifolia、N.occidentalis、N.occidentalis subsp.hesperis、耳状烟草（N.Otophora）、N.paniculata、N.pauciflora、N.petunioides、白花单叶烟草 (N.plumbaginifolia)、N.quadrivalvis、N.raimondii、N.repanda、N.rosulata、N.rosulata subsp.ingulba、N.rotundifolia、N.setchellii、N.simulans、N.solanifolia、N.spegazzinii、N.stocktonii、N.suaveolens、野烟草（N.Sylvestris）、烟草（N.tabacum）、N.thyrsiflora、N.tomentosa、茸毛烟草（N.Tomentosiformis）、沙漠烟草（N.Trigonophylla）、N.umbratica、N.undulata、N.velutina、N.wigandioides 和 N.x sanderae。本文中也构思了使用栽培品种和优良栽培品种。

[0287] 可以由本发明方法修饰的烟草品种、育种系和栽培品种的非限制性例子包括如保藏于苏格兰阿巴丁NCIMB的烟草登录号PM016、PM021、PM92、PM102、PM132、PM204、PM205、PM215、PM216或PM217，或 DAC Mata Fina、PO2、BY-64、AS44、RG17、RG8、HB04P、Basma Xanthi BX2A、Coker319、Hicks、McNair944(MN944)、Burley21、K149、Yaka JB125/3、Kasturi Mawar、NC297、Coker371Gold、PO2、、Simmaba、Turkish Samsun、AA37-1、B13P、来自杂交BU21x Hoja Parado系97的F4、Samsun NN、Izmir、Xanthi NN、Karabalgar、Denizli和PO1。

[0288] 突变堆叠.多种实施方案涉及转基因和非天然存在的植物，所述植物具有修饰的NtNMS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4基因表达水平、并且还经修饰以调节(i)NtMNS1a
和NtMNS1b 或(ii)NtMNS1a和 NtMNS2、或 (iii)NtMNS1a和 NtMan1.4、或 (iv)NtMNS1b
和NtMNS2、或(v)NtMNS1b和NtMan1.4、或(vi)NtMNS2和NtMan1.4或(vii)NtMNS1a和
NtMNS1b和NtMNS2、或(viii)NtMNS1a和NtMNS2和NtMan1.4、或(ix)NtMNS1a和NtMNS1b
和NtMan1.4、或(x)NtMNS1b和NtMNS2和NtMan1.4；或(xi)NtMNS1a和NtMNS1b和NtMNS2
和NtMan1.4；或更多其他目的内源基因的表达。不限制的情况下，其他修饰的例子包括产
生蛋白质的植物，所述蛋白质具有在人类中使用的有利免疫原性特性。例如，可以使用能
够产生蛋白质的植物，所述蛋白质在其N-聚糖上基本上缺少α-1,3连接的岩藻糖残基和
β-1,2-连接的木糖残基。

[0289] 植物育种.根据本发明，携带NtMNS1a、NTMNS1b、NtMNS2或NtMNS1.4的突变等位基因(或如本文在多种实施方案中所述的其任何组合)的烟草植物可以用于植物育种计划
中，以产生有用品系、品种和杂种。具体而言，将突变等位基因向上文描述的品种进行种质渗入。因此，提供用于植物育种的方法，所述方法包括使如本文所述的突变体植物、非天然存在的植物或转基因植物与包含不同遗传特性的植物杂交。该方法还可以包括使子代植株
与另一植株杂交，并且任选地重复杂交直至获得具有合乎需要的遗传性状或遗传背景的子
代。通过这类育种方法实现的一个目的是将合乎需要的遗传性状导入其他品种中，培育品
系、杂种或栽培品种，尤其具有商业意义的那些，如已经含有编码异源蛋白的可表达多核苷酸的那些。另一个目的是促进不同基因的基因修饰堆叠在单个植物品种、品系、杂种或栽培品种中。构思了种内以及种间交配。来自这类杂交的子代植物(也称作育种系)是本发明
的非天然存在植物的例子。

[0290] 在一个实施方案中，提供了用于产生非天然存在的烟草植物的方法，所述方法包括：(a)使突变或转基因烟草植物与第二烟草植物杂交以产生子代烟草种子；(b)在植物生
长条件下培育子代烟草种子以产生非天然存在的烟草植物。该方法还可以包括：(c)使非
天然存在的烟草植株的先前世代与本身或另一烟草植株杂交以产生子代烟草种子；(d)在
植物生长条件下培育步骤(c)的子代烟草种子，以产生额外的非天然存在的烟草植株；和
(e)重复(c)和(d)的杂交和培育步骤多次，以进一步产生非天然存在的烟草植株的世代。
该方法可以任选地在步骤(a)之前包括提供亲本植物的步骤，所述亲本植物包含起到表征
作用但是与突变或转基因植物不相同的遗传特性。在一些实施方案中，根据育种计划，杂交和培育步骤重复0至2次、0至3次、0至4次、0至5次、0至6次、0至7次、0至8次、0至
9次或0至10次，以便产生非天然存在的烟草植株的世代。回交是这种方法的例子，其中
子代与其亲本之一或遗传上与其亲本相似的另一个植株杂交，以便在下一代获得具有与亲
本之一更接近的遗传特性的子代植物。用于植物育种、尤其烟草植物育种的技术是熟知的
并且可以在本发明的方法中使用。本发明还提供通过这些方法产生的非天然存在的烟草植
物。

[0291] 在本文所述方法的一些实施方案中，使用标准田间方法在田间评价因育种和筛选变体基因产生的品系。包含对照基因型，所述对照基因型包括未诱变的原始亲本，并且将选项在田间以随机化完全区组设计或其他适宜田间设计排列。进行数据的统计分析以证实选
择的品系与亲本系的相似性。任选地进行选定植物的细胞遗传分析以证实染色体互补和染
色体配对关系。

[0292] DNA指纹分析、单核苷酸多态性、微卫星标记或类似技术可以用于标记辅助选择(MAS)育种计划中，以便将基因的突变等位基因转移或繁育至其他烟草中，如本文所述。例如，育种人可以从含有突变等位基因的基因型与农艺学合乎需要的基因型的杂交中产生分
离群。使用从基因组序列或其片段开发的标记，使用本文中列出的技术之一，可以筛选F2
代或回交代中的植物。经鉴定拥有突变等位基因的植物可以回交或自我授粉以产生待筛选
的第二群体。取决于预期的遗传模式或所用的MAS技术，可能需要在每个回交循环之前使
选择的植物自我授粉以辅助鉴定所需的个体植物。可以重复回交或其他育种程序直至恢复
所需的复现亲本表型。

[0293] 根据本公开，在育种计划中，成功的杂交产生能育的F1植物。选择的F1植物可以与亲本之一杂交，并且第一回交代植物自我授粉以产生再次针对变异基因表达筛选的群体
(例如，无效形式的基因)。将回交、自我授粉和筛选过程重复，例如，至少4次，直至最终筛选产生能育且与复现性亲本合理相似的植株。如果需要，使这种植株自我授粉并且随后再
次筛选子代以证实该植株显示出变异基因表达。在一些实施方案中，对F2代中的植物群体
筛选变异基因表达，例如，根据标准方法鉴定到因不存在所述基因而不能表达多肽的植物，例如，采用基于所述多核苷酸的核苷酸序列信息的引物，通过使用PCR方法，其中所述多核苷酸包括如本文所述的NtMNS1a、NTMNS1b、NtMNS2或NtMNS1.4多核苷酸(或其任何组合)。

[0294] 可以通过以下方式产生杂交烟草品种：防止第一品种的雌性亲本植物自我授粉(即，种子亲本)，允许来自第二品种的雄性亲本植物的花粉对这种雌性亲本植物受精，并
且允许F1杂交种子在雌性植物上形成。可以通过在花发育早期阶段割除花防止雌性植物
自我授粉。可选地，可以使用雄性不育形式防止雌性亲本植物上的花粉形成。例如，雄性不育可以通过胞质雄性不育(CMS)或其中转基因抑制小孢子发生和/或花粉形成的转基因雄
性不育、或自我不相容性产生。含有CMS的雌性亲本植物特别有用。在其中雌性亲本植物
是CMS的实施方案中，将花粉从雄性能育植物收获并手工施加至CMS雌性亲本植物的柱头，
并且收获所产生的F1种子。

[0295] 本文所述的品种和品系可以用来形成单杂交烟草F1杂种。在这类实施方案中，可以将亲本品种的植株培育为基本上均匀的相邻群体，以促进从雄性亲本植物至雌性亲本植
物的天然交叉授粉。通过常规手段选择性地收获在雌性亲本植物上形成的F1种子。也可
以大批培育两个亲本植物品种并且收获在雌性亲本上形成的F1杂交种子和因自我授粉而
依赖雄性亲本形成的种子的混合物。可选地，可以实施三元杂交，其中使用单杂交F1杂种
作为雌性亲本并且使其与不同的雄性亲本杂交。作为替代，可以产生双杂交杂种，其中两个不同单杂交的F1子代自我杂交。

[0296] 可以对突变体、非天然存在或转基因植物的群体筛选或选择具有所需性状或表型的那些群体成员。例如，可以对单一转化事件的子代的群体筛选具有NtMNS1a、NTMNS1b、
NtMNS2或NtMNS1.4或由其编码的多肽的所需表达或活性水平的那些植物。物理方法和生
物化学方法可以用来鉴定表达或活性水平。这些方法包括用于检测多核苷酸的DNA印迹分
析或PCR扩增；用于检测RNA转录物的RNA印迹、S1RNA酶保护、引物或RT-PCR扩增；用于
检测多肽和多核苷酸的酶活性或核酶活性的酶测定法；和检测多肽的蛋白质凝胶电泳、蛋
白质印迹法、免疫沉淀法和酶联免疫测定法。其他技术如原位杂交、酶染色法和免疫染色法和酶测定法也可以用来检测多肽或多核苷酸的存在或表达或活性。

[0297] 本文中描述了突变、非天然存在或转基因植物细胞和植物，其包含一种或多种重组多核苷酸–如一个或多个分离的NtMNS1a、NTMNS1b、NtMNS2或NtMNS1.4多核苷酸(或
其两个或更多个或三个或更多个的组合)、一种或多种多核苷酸构建体、一种或多种双链
RNA、一种或多种缀合物或一种或多种载体载体。

[0298] 不作限制，本文所述的植物可以为其他目的或在已经根据本发明调节所述表达或活性之前或之后进行修饰。这类修饰的一个例子是向植物中导入编码目的异源蛋白的可表
达多核苷酸。术语“可表达的”在本发明的语境下指基因与调节元件有效连接，所述调节元件指导由植物细胞中、优选地叶内所包含的基因编码的蛋白质或多肽表达。

[0299] 产生甘露糖含量受调节的异源糖蛋白

[0300] 多种实施方案涉及在α-甘露糖苷酶I活性受调节的植物中产生适合用作人类治疗药的异源蛋白。异源蛋白的例子包括但不限于生长因子、受体、配体、信号传导分子；激酶、酶、激素、肿瘤抑制基因、凝血蛋白、细胞周期蛋白、代谢蛋白、神经元蛋白、心肌蛋白、特定疾病状态下缺少的蛋白质、抗体、抗原、提供疾病抵抗力的蛋白质、用于人遗传疾病替代疗法的蛋白质、抗微生物蛋白、干扰素和细胞因子。术语“抗体”和“多种抗体”指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼抗体、嵌合抗体、单链Fvs(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、结构域抗体(VH、VHH、VLA)、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)和上述任一者的表位结合片段。具体而言，抗体包括包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子
(即，含有抗原结合位点的分子)的免疫活性片段。免疫球蛋白分子可以属于任何类型(例
如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。可以产生的抗体或其片段的例包括阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿伦珠单抗(alemtuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝
伐珠单抗(bevaxizumab)、贝伦妥单抗(brentuximab)、卡那单抗(canakinumab)、西
妥昔单抗、赛妥珠单抗(certolizumab)、达克珠单抗、地诺单抗(denosumab)、依库珠
单抗(eculizumab)、依法珠单抗、吉妥珠单抗、戈利木单抗(golimumab)、替伊莫单抗
(ibritumomab)、伊匹木单抗、那他珠单抗、奥法木单抗(ofatumumab)、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、来尼珠单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗、托珠单抗(tocilizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗、和与上文所列单克隆抗体相同的抗原决定簇结合的抗体。可以通过各种方法减少或消除在来自植物的糖蛋白(包括异源糖蛋白)的N-聚糖上
植物特异性免疫原性α-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖的量，而不影响编码这种α-1,3-岩
藻糖和β-1,2-木糖添加过程的基因。一种在植物细胞中减少或消除这类糖添加到糖蛋
白的N-聚糖上的方法包括在植物或植物细胞中减少、抑制或基本上抑制本发明的一种或
多种α-甘露糖苷酶I酶的酶活性，因而防止将N-聚糖从来自高甘露糖型N-聚糖进一步
加工成杂合型N-聚糖和最终加工成复杂型N-聚糖。在植物细胞中，复杂型N-聚糖含有
α-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖。因此，不受理论约束的情况下，NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4基本上被抑制的植物可以用来产生具有改变的免疫原性特性以及改进功效的
糖蛋白。这类植物的用途包括：

[0301] (a)NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2和NtMan1.4基本上受到抑制的植物可以用于制备在其N-聚糖上基本上缺少α-1,3连接的岩藻糖和β-1,2-连接的木糖的异源糖蛋白。由
这类植物产生的糖蛋白将优选地具有高甘露糖N-聚糖。抗原上的高甘露糖型N-聚糖导致
与抗原呈递细胞的结合增加。具有高甘露糖型N-聚糖的某些抗体具有增加的抗体依赖的
细胞毒性。

[0302] (b)具有增加的NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2或NtMan1.4活性或其组合的植物将具有减少的高甘露糖N-聚糖并且因此在其中产生的糖蛋白上具有增加的杂合和复杂和成熟
N-聚糖。某些高甘露糖型N-糖基化糖蛋白因与高甘露糖受体结合增加而从血流中更快地
清除。减少高甘露糖的量可以减少清除时间并因此增加半寿期。
实施例

[0303] 提供以下实施例作为说明并且不作为限制。除非另外说明，否则本发明采用分子生物学、植物生物学、生物信息学和植物育种的常规技术和方法。

[0304] 实施例1：鉴定NtMNS1a、NtMNS1b和NtMNS2的基因组序列

[0305] 通过筛选BAC文库并对含有分别包括NtMNS1a、NtMNS1b或NtMNS2的基因组的部分的三个BAC克隆测序，鉴定NtMNS1a、NtMNS1b和NtMNS2的基因组序列。这些序列在序列
信息部分中描述。

[0306] NtMNS1a、NtMNS1b和NtMNS2的推导氨基酸序列与来自NCBI的其他蛋白质或推导的蛋白质序列比较，显示来自拟南芥的两种蛋白质AtMNS1(At1g51590)和
AtMNS2(At3g21160)享有最高的序列同一性和相似性(表1)。

[0307] 表1.使用程序EMBOSS Needle用于比对，NtMNS1a、NtMNS1b和NtMNS2蛋白与拟南芥AtMNS1和AtMNS2的同一性百分数。

[0308]序列命名 NtMNS1b NtMNS1a NtMNS2 AtMNS1 AtMNS2 SEQ ID NO.
NtMNS1b 100 97.9 86.1 74.8 71.6 62
NtMNS1a 98.8 100 92.1 75.2 71.7 31
NtMNS2 92.3 85.9 100 73.6 73 93

[0309] 为估计本发明的核苷酸序列相对于公众已知序列的序列同一性百分数，NCBIblastn用来鉴定公共数据库中与输入序列显示同源性的序列。使用megablast、blastn和
blastn-short，Blastn允许使用预定义的参数集合进行检索。检索以下数据库：NCBI专利
核苷酸、非冗余EBI专利核苷酸1级、非冗余EBI专利核苷酸2级、TAIR9cdna模型和NCBI
核苷酸条目。Blast检索结果限于e-值小于或等于1的命中。对于输入核苷酸序列SEQ
ID No:1至30、SEQ ID NO:32至61和SEQ ID NO:63至92的每一个，用4个预定义参数集
合进行blastn检索。对于每个输入核苷酸序列，随后以使用任何blastn检索所鉴定的序
列，使用EMBOSS water程序进行局部两两比对。估计在获得的最佳局部比对结果中相同碱
基对的数目并且采用具有最佳拟合的数据库序列，这个数值用来计算完整输入序列SEQ ID NO:1至30、SEQ ID NO:32至61和SEQ ID NO:63至92的同一性百分数。相同碱基对的数
目除以鉴定的序列的总长度。表2中汇总blast结果。

[0310] 表2.使用局部两两比对法，使用程序EMBOSS water、以碱基对计的序列(SEQ)长度和最佳局部比对中相同碱基的数目时，SEQ(SEQ ID NO:)和数据库条目(最佳匹配)的
同一性(%)

[0311]

[0312]

[0313]

[0314] 实施例2：用于选择锌指核酸酶靶位点的检索方案

[0315] 这个实施例显示怎样检索NtMNS基因(NtMNS1a、NtMNS1b、NtMNS2基因)以便与给定的基因组数据库相比，筛选给定基因序列内部的独特靶位点的出现，以开发用于调节
基因表达的工具。本发明中包括通过本发明方法鉴定的靶位点(包括下文公开的那些靶位
点)、序列基序和所述位点或基序的任一者在植物如烟草中修饰相应基因序列的用途。

[0316] 2.1检索算法.开发了计算机程序，所述计算机程序允许使用后缀数组在DNA数据库(如例如实施例1的烟草基因组序列装配结果)内部对输入查询(靶)核苷酸序列筛
选由给定间隔序列尺寸分隔的两个固定长度的子串DNA基序的出现。后缀数组构建和检索
使用开放源libdivsufsort文库-2.0.0(http://code.google.com/p/libdivsufsort/)，
后者将任何输入字符串直接转化成Burrows-Wheeler变换的字符串。该程序扫描完整输入
(靶)核苷酸序列并返回在选择的DNA数据库中小于选定次数出现的全部子串组合。

[0317] 2.2选择靶位点用于查询序列的锌指核酸酶介导的诱变.一个锌指DNA结合结构域识别一个三碱基对核苷酸序列。锌指核酸酶包含锌指蛋白和作为IIS型限制性酶的非特
异性核酸酶，所述锌指蛋白包含1、2、3、4、5、6或更多个锌指DNA结合结构域。锌指核酸酶可以用来导入双链断口至靶序列中。为了导入双链断口，需要一对锌指核酸酶，其中之一与靶序列的正(上半)链结合并且另一者与0、1、2、3、4、5、6个或更多个核苷酸所分隔的相同靶序列的负(下半)链结合。通过对两个固定长度的子串DNA基序的每一个使用3的倍数，
该程序可以用来鉴定由给定间隔序列长度分隔的两个锌指蛋白靶位点。

[0318] 2.3程序输入：

[0319] 1.靶查询DNA序列

[0320] 2.待检索的DNA数据库

[0321] 3.第一子串DNA基序的固定尺寸

[0322] 4.固定尺寸的间隔序列

[0323] 5.第二子串DNA基序的固定尺寸

[0324] 6.由程序输入4分隔的程序输入3和5的组合在程序输入2的选定DNA数据库中出现的阈值

[0325] 2.4程序输出：核苷酸序列列表，对于每个序列，其在最大值程序输入6阈值的情况下具有所述序列在DNA数据库中出现的次数。

[0326] 实施例3：靶向烟草中甲磺酸乙酯诱导的局部突变

[0327] 3.1诱变.烟草的M0种子用甲磺酸乙酯(EMS；C3H8O3S)诱变以产生具有随机点突变的植物群体。测试各种浓度和孵育时间。为估计每种处理的作用，在M1代中对每个处
理估计杀伤曲线，并且将致死性计量为完全籽苗损失。另外，将能育性计量为每株植物产生蒴果和种子的能力并且估计嵌合植物的数目。如果植物的表型显示叶颜色改变，如白化或
泛黄区域，或植株畸形，则将该植物命名为嵌合。使M1植物自我受精并且收获和播种M2种
子。M2种质允许隐性和致死性等位基因恢复为杂合子。

[0328] 3.2突变检测.从各个M2植株提取DNA并且将它们的种子贮存以便未来采样。使用特异性引物扩增靶NtMNS1a、NtMNS1b或NtMNS2基因片段，并且可以通过测序检测到
靶基因中的突变。也可以在扩增之前选择性地汇集来自各个植株的DNA。可选地，这类
DNA可以用荧光标记的引物扩增，从而错配异双链体在野生型和突变体DNA之间生成。随
后异双链体与切割异双链体错配位点的核酸内切酶CEL1孵育，并且所产生的裂解产物
在毛细管ABI3730测序仪上运行，并且分析荧光标记轨迹。CEL1测定法由Olekowski等
人,(1998,NucleicAcids Res.26:4597-4602)描述。后一项技术也称作TILLING(基因
组内定向诱导的局部损伤)并且是反向遗传学方法。改良TILLING方法由Colbert等
人,(2001,Plant Physiol.126:480-484.High-throughputscreening for induced point
mutations)描述并且依赖于特异性酶在正常DNA链和突变体DNA链复性时检测其中错配的
能力。后续分析来自汇集DNA的各个植物DNA鉴定出携带所需突变的植物。

[0329] 实施例4：在烟草中瞬时表达利妥昔单抗单克隆抗体

[0330] 这个实施例显示怎样在α-甘露糖苷酶I活性受调节的烟草植物中产生其N-聚糖上具有受调节甘露糖含量的抗体。

[0331] 4.1利妥昔单抗单克隆抗体表达载体的构建.通过化学合成产生如CAS登记号174722-31-7或WO02/060955中那样的包含利妥昔单抗单克隆抗体轻链和重链的完整编
码序列的表达盒，其密码子为烟草植物细胞中的表达而优化。重链序列随patatin信号肽
一起合成并置于如专利WO09/087391中那样的HT-CPMV启动子和HT-CPMV非翻译5'和
3'UTR序列以及花椰菜花叶病毒35S终止子序列的调控下。带patatin信号肽的轻链置于
如专利WO01/25455中那样的质体蓝素启动子和终止子序列调控下。两种表达盒均克隆在
pCambia-2300的T-DNA中(GenBank:AF234315.1；Hajdukiewicz等人,1994.Plant.Mol.
Biol.25:989-994)以产生pCambia-Rituximab。

[0332] 4.2本生烟草植株的浸润.将pCambia-Rituximab导入根癌农杆菌Agl1中。将细菌在回转摇床上的锥形瓶中包含2g/L牛肉提取物、0.4g/L 酵母提取物、2g/L Bacto-蛋
白胨，2g/L蔗糖，0.1g/L MgSO4和用于选择相应农杆菌菌株及双元载体的适宜抗生素
的YEB-培养基内在28°C和250转/分钟培育直至OD600>1.6。随后将培养物在含有
10mM2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)和适宜抗生素的新鲜LB培养液Miller培养基中1:100
稀释并且进一步在回转摇床上在28°C和250转/分钟培育直至OD600>2。在生长后，通过
以8'000g并且在4°C离心15分钟收集细菌。将沉淀的细菌重悬于含有10mM MgCl2和
5mM MES，终末pH5.6和OD600=2的浸润溶液中。具有受调节的α-甘露糖苷酶I活性的4周
龄本生烟草植株与含有番茄丛矮病毒(TBSV)p19基因沉默阻抑制子(Swiss-ProtP50625)
和pCambia-Rituximab的根癌农杆菌菌株Agl1以1:1比率和终末OD600nm=0.3共浸
润。TBSV p19基因沉默阻抑制子的编码序列在pBin19中处于双重花椰菜花叶病毒35S
启动子和终止子序列的调控下(Bevan MW(1984)Binary Agrobacterium vectors for
planttransformation.Nucleic Acids Res.12:8711-8721)。使用与V-855调节器连接的
V-710Büchi 泵，在玻璃钟罩(Schott-Duran Mobilex300mm)内用细菌进行真空浸润。在整
2
个浸润过程期间保持人工光照(80-100μmol 光子/cm)以确保一致性光照条件。在浸润
后，将植物连同未浸润的对照植物一起置于温室中直至收获。生长条件如施肥、光周期和温度与浸润之前所用相同。使用滴灌系统将水和肥料施加至植物。

[0333] 4.3收获、材料采样和表达分析.在浸润后6日，将叶材料收集于可热密封的小袋内，密封并置于干冰层之间至少10分钟。在收获后，将全部叶样品贮存在-80°C直
至进一步加工。使用咖啡研磨机在干冰上，将收获的叶子均质化成细粉末并且在含有
50mM Tris(pH7.4)、150mM NaCl、0.1%TritonX-100、4M脲和2mM DTT的3vol/wt提取缓
冲液中提取。通过ELISA对可溶性提取物中利妥昔单抗单克隆抗体的表达定量。将平板
(Immulon2HB,Thermofisher)用浓度为2.5ug/mL的捕获抗体(山羊抗小鼠IgG1重链特异
性，Sigma，#M8770)在4°C包被过夜。使用小鼠IgG1对照蛋白(Bethyl，#MI10-102)在虚
拟提取物(从仅用含有p19基因沉默阻抑制子的细菌悬液浸润的叶材料制备)中制备标准
曲线(4-80ng/mL)。可溶性提取物在稀释缓冲液(50mMTris pH7.4，150mM NaCl，0.1%Triton X-100)中1:1000稀释，并且将标准和样品一式三份加载并且在37°C孵育1小时。用于
检测的抗体是来自Jackson ImmunoResearch(#115-035-205)的过氧化物酶缀合的山羊抗
小鼠IgG Fc-特异性抗体，将所述抗体以稀释度1:40,000使用并且在37°C孵育1小时。
使用来自Pierce(#24236)Coomassie-Plus分析试剂测定提取物中的可溶性总蛋白。

[0334] 4.4N-聚糖组成的分析.根据标准方法确定植物细胞提取物中利妥昔单抗抗体的N-聚糖组成(Bakker等人,(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:2899-2904)。

[0335] 实施例5：α-甘露糖苷酶cDNA的克隆

[0336] 5.1核糖核酸的分离和cDNA合成.在液氮中将温室内培育的烟草植株的叶子研磨成细粉末。根据制造商的推荐，使用来自Qiagen的RNeasy RNA提取试剂盒(Qiagen
AG,Hombrechtikon,德国)从200mg研磨的叶粉末提取RNA。根据制造商，将1微克(1μg)
总RNA用DNA酶I(New England Biolabs,Ipswich,USA)处理。根据制造商，使用AMV逆转
录酶(Invitrogen AG,巴塞尔,瑞士)，从DNA酶I处理的500ng RNA合成cDNA。

[0337] 5.2通过PCR克隆.将第一链cDNA稀释十倍并且使用Mastercycler梯度仪(Eppendorf)通过PCR扩增。反应在含有25μl2XPhusion主混合物(Finnzyme)、20μl水，
1μl稀释的cDNA和2μL每种引物(10μM)的50μl体积进行。用于扩增NtMNS1a cDNA
的引物是：

[0338]

[0339] 热循环仪条件如供应商推荐，使用58°C复性温度。在PCR后，所得到的产物在3'-端腺苷酰化。将50μl2X Taq主混合物(New EnglandBiolabs)添加至PCR反应混合物
并且在72°C孵育10分钟。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化产生的PCR产
物。根据制造商(Invitrogen)，将纯化的产物克隆至pCR2.1-TOPO中，并且根据标准操作方案转化至TOP大肠杆菌细胞中。根据标准操作方案，从各个克隆分离DNA并将所产生的质
粒DNA测序。

[0340] 5.3序列分析.使用Contig Express和AlignX(Vector NTI,Invitrogen)编纂多核苷酸序列。MNS1a cDNA序列在下文称作SEQ IDNO:30。MNS1a cDNA序列代表相应cDNA
PCR片段测序时所观察到的序列。

[0341] 序列信息

[0342] 在本说明书和实施例中，参照亦在序列表中表示的以下序列：

[0343] SEQ ID NO:1(具有5’和3’UTR的NtMNS1a)

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[0389] acttcttttcttgtccgtcttgtttgtctaaaaatttggtggtttggtttgtattttctg

[0390] gaaaaagaagtacaaagaatggatatagcttgttatgatttatgccagtattattttcat

[0391] gtgtgcttgcttcacagtttacccatcttctgttgtttgcagtatagcatttaagctttt

[0392] gattttaaatattcaacttgtttgcatttattttggatactgttttagCTGGAAGATTTG

[0393] AAGAATGGTCGAGTCATGCCAGATAAAAAGATGAAATCTAGTGGCAAAGGTGGTCATGCA

[0394] GCAAAAAATATGGATTCACCAGATAATATCCTTGATGCTCAGCGAAGGGAGAAAGTGAAA

[0395] GATGCTATGCTTCATGCTTGGAGTTCTTATGAAAAATATGCATGGGGTCATGATGAATTA

[0396] CAGgtttggatgttacttcgaataagttattttttgtgttgttaatgttattattattat

[0397] tattttttgtgttgttaatgttgcctttgttttattgtatcttgtgatttcgcaattaga

[0398] tcattggtggaggaattctctactttttgatatacttcctgggggagttctctccctttt

[0399] gattaatacaatttaccttatctaaaaaaaatcattggtggaggcatatgtaaagaaatt

[0400] cccggaaaatgaatccgggacattccaatattctttttcctttttgtgtgttaaggggaa

[0401] atggggtataatagatgattagttaattacttaattaaatgagttagttgtaaatttaaa

[0402] aactatttaaaaattaaatgagttagttgtcgattgatgttctccattaccttttctttc

[0403] tttgttattttattttcctaagtgctataccttttgttgactagataagcatgtgacact

[0404] ctagtttttcaattacaatattctgtaggttagtttgcagcagcaacgacaaaaactatg

[0405] cctcaaaaatataaatcatcatgatctaggttgctctatttgggcccatttcatgtcaac

[0406] cttcaatagtttgggcttttctaacagtagagattctctacaattcctagtaacatacac

[0407] tttttttttaaaaagtaacacaaattcaaactttttgtttattatgtttttactcattcc

[0408] atcccatttcatgttccggtgtttgactgggtataaaatttaagaaataaggaagacttt

[0409] ttacatgtaatacaaatatatacaacataccaaaatgacctttactattaacatctaatg

[0410] aaaggaggtaacctaccgtaccttcgtgataaaaaagggttaccttatcctcccaaagaa

[0411] aaggttgtaagagttccgcatatcacttactatttctatctcctaataaaaaaatagttt

[0412] ttatatcaagtgggttcctaagaggttatgtcagtaagcataaaacgttattgctaggag

[0413] taaattgtttgcaattacaaaaatgtctcactcttttctggatagactaaaaaggaagga

[0414] atgccacatacaatgggacaggaggagtatatgttcttttcttcttatatcctgaccaag

[0415] tatattgatttagcatgttttgatgctctggatattgcaaatgactatgaaatagcgatt

[0416] acataagtggctaagacttggccttttaatttattcttttctagggtatgttttgatatg

[0417] attctctagatatttctgaattattgttagtgtcctggtagtgaggatagcaatttcatc

[0418] ttgcaaagttaatgcgcttgggttttaaaatacagacacctttatgctacctaaacggaa

[0419] gaacttcaatgttctgattttgcttaacatttggttgatttaaaattaaaacaaaagtac

[0420] atttgcgacaagtttcccgagaagctttgatgtcatattaaaattagaggaagtttgggg

[0421] tttagtctgtggagttgtatttctcaaaactggtctgctttatgctgaacagtctgttat

[0422] cgataaaagttgtctagctcagaagttcatgaaaatatggacttggactggataaacatt

[0423] tttttctgcccacctttgctgctacttgtgttaagaacaatatgtatatggaaagacact

[0424] tttcttacttttccttgaagattaagatgcaactgtctttgtaatttacataatcagcgc

[0425] tttctttggtgatatgatacaacaacaacaacatctccagtaatatcccacactatggag

[0426] gctatttccaatagaccctcggctcaagaaagcataagcaccacattaatggaaatataa

[0427] acaagaagggacagtaccaaaaagcgatataaaagcaaaataaaaacaacaagacagtaa

[0428] ggtgatcaacaatgaaagaaaacaacggttagtcataaaaacctactaccaacagaaagc

[0429] gagattgcgtgccaatactactgttatgagcactctagactacctactctactaccctaa

[0430] tcctcgacctccatatttttctatcaagggtcatgtcctcggtcagctgaagctgcgcga

[0431] tgtcttgcctattcacctctcccacttctttggcctacctctacctctccgtaggccttc

[0432] cgatgtcaacctctcacacctcctcaccggtgcgtctgtgctcctcctcctcacatgacc

[0433] aaaccacctaagccgcacttcccgcatcttgtcctcaacaggggccgcacccaccttgtc

[0434] ctgaataacctcatttttgatcctatctaacctgatgtgcccgcacatctatcttaatat

[0435] cctcatctctgctaccttcatcatctggacatgagcgatcttgactggtcaacactcagc

[0436] cccatacaacatcgttggtctgaccaccactctgtagaacttacctaagtttcggtggca

[0437] ccttcttgtcacataaaacaccggaagcgagtatccatttcatccatcccgccccaatac

[0438] gatgtgcgacatcttcatcaatctccccatccactgaataatagacccaaggtacttaaa

[0439] actccctctcctagggatgatctgcgagtccagcctcacctccccttcccctccttgagt

[0440] cttgccactgaacttacactccaagtattttgccttagtcctgctcaacttgaaaccttt

[0441] agattccagggtctgcctccatacctctaattgcgcgttcacaccgtcttgcgtctcatc

[0442] aatcaatacaatatcatctgcaaatagcatgcaccacggcacctccccttggatgtggcg

[0443] cgtcagtacgtccatcccagagcaaacaaaaaggggtttagtgctgacccctgatgcaac

[0444] cccatcacaaccggaaaatgattcgactccccacccaccgtcctcactcgggtctttact

[0445] ccattatacatgtccttaatcaacctaacgtaggcaacaggtacatccctagcctccaaa

[0446] catcctcacccttagctctaccactctctcccaaactttcatagtatggttaagcaactt

[0447] gataccccgatagttattgcaattttggatatcacgcttgttcttgtagacaggaaccat

[0448] tgtgctccacatccactcgtcgggcatcttcttcgttctaaaaatgacattaaataacct

[0449] agtgagccactccaagcctgccttgcccgcactcttccaaaacttcaccgggatttcatc

[0450] cagcccggtcgctttgcccctgctcatcttacgcatagccccctcaacttcatcaactct

[0451] aatccgcctacaataaccaaagtcacaacgactcccggagagttccaaatcacccattac

[0452] aatgctcctgtccccttccttgttcaagaaactatggaagtaggtctgccatctccgatg

[0453] gataagcccctcatccaacaaaactttaccttcttcgtcctatagaagaaggattttttt

[0454] acctatagaaggatatgttcttttgacaggtagcaagatatagtataccagtatcccttt

[0455] ttctgtcttaacacatacttctagaaaatattgacacaaaagttcataccttgcagcttc

[0456] agtaatgttcctatcatacccttgagtctgacttgaatgattgtatttatggaaaataaa

[0457] aggtatatataggatagggtaactaattcttgttgatttgtggacattggcttttgatca

[0458] tgtactatagtttcttgacaatcagaaaggaaatgacttcatgaaatctgttggacatat

[0459] cgtttttatttcgtttaaaattgaatatttttagaagttgatatacttgccttgattctg

[0460] cagttggtttctgctttgtgctcgtcgtatgatttacattacttctttagtgcacttatg

[0461] caaaattatttaacaattatgctgaaaatgtccaatctcagCCGCAGTCAAAGAATGGTG

[0462] TTGACAGTTTTGGTGGTCTTGGAGCAACCTTAATAGATTCTCTTGACACACTATATATCA

[0463] TGGGCCTGGATGAGCAGTTTCAGAGAGCTAGAGAgtgagtttattctcttcctcttctag

[0464] aatcatatgtattacttatggtacttgttttgtccgcagacaagagaaaaatgttaaact

[0465] aaatatagtgaaaattatcaaaagcaagacacactgtgtgttttcactaatttaaagtta

[0466] aaatgcaactgcaagattgctgtttcattcatttatggatttggtgccttgcatctgact

[0467] attgccagatgttgaagtgttaattttatcacttccagtttccttctcgttattaagcat

[0468] atttcctctaatctattgaatagtttttgcgaatgatgcagtatgttaggtttttaaact

[0469] ttccacatgtaattgttttcaatgaattattccacgtggctaatagtagctaacacttta

[0470] ctgatggcagATGGGTTGCAAACTCCTTGGATTTCAACAAGAACTATGATGCAAGTGTTT

[0471] TTGAGACAACCATAAGgttgctttataaggtttaatatgagttttttatgagttttcatt

[0472] atcctttctcagcttcaatgatatagcaccatgattcttgtatggttaactatgtttttc

[0473] aacatctcagGGTTGTAGGTGGGCTTCTTAGTACGTACGATCTATCTGGTGATAAGCTTT

[0474] TCCTTGATAAGGCTCAAGACATTGCTGACAGATTGTTGCCCGCATGGAATACAGAATCTG

[0475] GAATCCCTTACAACATTATCAACTTGGCAAATGGGAATCCACATAACCCTGGGTGGACAG

[0476] Gggtaagtttgaactctaataaattgcagttaatacccccccccccccccggttgatact

[0477] actccaatatcttctggcaaagaggatggagggatcagttatcacagaaaagggagggtg

[0478] gatgtgattaatactgtatgtgacaagttattagatttggttcctgattcttatgttccc

[0479] tgaagattgtggagggaacctgacacaggagaagagcatatatctattgggaggtttctg

[0480] aagaagaatcctctcttgaagtttccttataatatgttcaaagaacatttagtttgcttc

[0481] tctttgttcttttgctctcttccctgcattcgcctcccccctttcttttcaaagaacttg

[0482] tattcttacccgttttgtgaacatattgaccggatctaatagtgatctttctcctggaac

[0483] ttgtcaatattgcttatagtttctatagattgtatttttccagaggtggtttgtgcattt

[0484] ttttgaaattattgtgctctttgctctcagGGTGATAGTATCCTGGCAGATTCTGGTACT

[0485] GAGCAGCTTGAGTTTATTGCTCTTTCGCAGAGGACAGGAGACCCAAAATATCAACAAAAG

[0486] gtatgcctgagaaaatttcttaaaatataaactacattcatattcacataaaactacaac

[0487] ttgaaactatgatatgaaaattggtattgtgtagaattgattaagctacagactgttggg

[0488] tcaatctgtcctatttcagGTGGAGAATGTTATCTTAGAACTTAACAAAACTTTTCCAGA

[0489] TGATGGTTTGCTTCCAATATACATTAATCCACATAAAGGCACAACATCATACTCAACTAT

[0490] AACATTTGGGGCAATGGGCGACAGgtaatgaccttcgtttgtccattctagaatgatgcc

[0491] tgtgaaaacctgattgagtaggagtatttatccccaaaagaaaaaaagagggggagagcc

[0492] tttatcctatgcatttgtgtgaattggcatttagagcttccatgttttcttttcatatga

[0493] aaagttagtaaaagatttttttgtttcagCTTTTATGAATATTTACTCAAGGTCTGGATA

[0494] CAAGGAAACAGAACTGCTGCTGTGAGTCATTATAGgtaagcagcttaagttcacttatgt

[0495] ctgtttcgcttcagatattgttgtccttttaaagcttcaattcagtccatccggtgtttc

[0496] acttgatggttcctgtaggtataagtgcatatattaatacacttcctcagcctgaaatca

[0497] aatctgatcatgtcttgcgggaatgcatagaaatattcattgatagtgtttacagatttg

[0498] gagcatttagaatttcaagtaagaaatcttagaacaaggggaaaaaattttgcactaagg

[0499] ataaaaagctgacgtaaatgagatatggtgtcactgtgaatacataatatcagagctata

[0500] tgcttacaacagcagcaaatacttctcaatcgaagctagttgagaaattttgatgatatt

[0501] tcacagtcaggcctgaataaacttaattatgttttaactcgctcctcacgtgcgggcttg

[0502] atttcctttaatgagccaaacacgtggaaattctttttggtccttttagtggtgagccaa

[0503] acagttaggaggtgtgagaggttggccatggtgggtatgatgagaggtagagacatgcca

[0504] aaaaagtattggagagaggtgattaggtaggacacggcacaacttaagcttaccgaggac

[0505] gtgacccttgataggagggtgtggaggttgagaattagggtagaaggttagtaggtagtc

[0506] gagcattttcctttttctttcccataccggtagtattagtgttagtatggtattttttta

[0507] ttcttagattgctattaccacctattgtttgattgctatctttcaccttggttttcttaa

[0508] tatcttgttgttgctactgcttattgtcaccgcttcttttcatcgtttctttagtcaagg

[0509] gtctctcgaaaagagcctctcagccctctcagggtagaagtaaggtctttatacacatta

[0510] cctccccagaccccacttgtgggaattcattgggtttgttgttgttgcatttattttat

[0511] cactttacgaggttctgtggaagcacattggataatgctcagaaaattctatgttgtggc

[0512] tttacattttctttaaggatggtgttgtccaggccagcttgcatggttgctgctttacat

[0513] tttattttttgataaatctttctatggcatatttatactattctcacatattttttactg

[0514] gttctaatcttcaaaaacattttattaattttctcgccagacacattaggagtagtcaaa

[0515] tggggtagctggagtattaaactcatttatgctcctaagactctttctctaattggaag

[0516] ctttaactaaattttacagtggtatttgacgagagtttgaacttgaaatttcagatctaa

[0517] aaactgtgagtactagtggaatttgttacaagtggttgatctttcccttgaatccttttc

[0518] cttctggtgctagaatgcaggaagatgaaattggttatagtggaaaggttgtgctataag

[0519] tgctcagctagaacaaaaatggatctgtgatgtggaaaagaaaaaattatgtttgatgca

[0520] taaagcctttctgagacttgaaaagatttgaaaaatgtagtgattttgtttaaccttttt

[0521] atgtttcttttacaaaattttgcattcctctgtgtttctcaatataattcttctgctaat

[0522] tttgcaagcagGAAAATGTGGGAGACATCAATGAAAGGTCTTTTAAGCTTGGTCCGGAGA

[0523] ACAACTCCTTCGTCTTTTGCATATATTTGCGAGAAGATGGGAAGTTCTTTAAATGACAAG

[0524] gtgatgtataggcttttacacatatttggggagtctgagatgtgttaattcttgactttg

[0525] ttttatttacccttttggattttgtgcagATGGATGAACTTGCATGCTTTGCTCCTGGGA

[0526] TGTTAGCTTTAGGATCATCTGGTTATAGCCCTAATGAGGCTCAGAAGTTCTTATCACTGG

[0527] CTGAGGAGgtatttttaacttacggagcatcattacggaatgtgattttaggttcctatt

[0528] tgcgaaatgatctccatatgccctaattcgtatgtgtgccactatgttgattgaaagtga

[0529] taataagaaagagttatatctacagtcatatggaggaaaattgcgtcaaaagacctatac

[0530] ttctcggagttaatgtggatgtagctaaaaacaatacacaagaaaggatccatataagca

[0531] ataccaactaattgggattaaagatccatagagttctcgtgtttgctgttactccttttt

[0532] attttggttgaagttttgtgtaattgtttaactataagtgtgagatttagagaacatcta

[0533] gttttagtgaacccctgatagtattaatgaacccttatttattattggaatgaaatgggt

[0534] ttaagtagagtataatggatatagagaattcatataatcaactcttttactagtttaggt

[0535] ttgaggtttagttaattgatttgagaagtggtctctgtcgaaaaaggttttaggttttag

[0536] ttcaacttttgagcattagcgatggtgggctgtgggcaatgctctcctaccaccagatgt

[0537] tccctttcgttggctgttatagttagctgggggtgctgaaaggtgaagtgtgggataaga

[0538] accaagtgttagtgactcttaaatgtgttagggggctgggtgttggtcttagattgtgct

[0539] tgcctctatgatttgacttgcctttcatctataggtttccctttcacatgatgggaaggc

[0540] ccagaggatcagtggttcattctataggagcttttagtgactgcagtgctgtttcttgtt

[0541] gccagaaagttctagtattgcttttttgctgaatatcttaaccttctcttgcagCTTGCT

[0542] TGGACTTGCTATAATTTTTATCAGTCAACACCTACAAAACTGGCAGGAGAGAACTATTTT

[0543] TTTAATGCCGGCCAAgtcagttttttcattttagttcatggtgatgtttgtttttgttgt

[0544] ttgcttatggtaatagcttatttaaattcttcatcctgtttaatgctcttcagGATATGA

[0545] GTGTGGGCACATCATGGAATATATTAAGGCCAGAGACAGTTGAGTCGCTGTTTTACCTCT

[0546] GGCGTTTAACAGGAAACAAGACATACCAAGAGTGGGGTTGGAACATATTTCAAGCATTTG

[0547] AAAAGAACTCAAGGATAGAATCTGGATATGTTGGACTTAAAGATgtaaggacaaactcaa

[0548] ttctttcaactttggatagtacctacacctccattatcttctttctttaaatgccttcaa

[0549] atgctgcatctataattctgtttctggaggtaaaaaatctgctgttatttcctgtgttat

[0550] ttgttaaaaatttgcgcctcctcatgaagtacactctttttttgggtttagatatcgata

[0551] attgggatgtacatacatgaatgttatttttgtgctattgtttgatggaaaacttggtgc

[0552] tcctacttggtgttgtctctctcctcaccttaaacaccagctcgcttctaaacttcagtg

[0553] ttcttttttgggttttgcagtactcttattacaggcaggtttctcaaatttgatttattg

[0554] agcaacctttaatatttagtgaagtatgaaagtatgtaacgtttgaaacggtgtacctct

[0555] gtcagcccatccattacataattgtgcgcaaagagcaatattgagctagtgagcccctct

[0556] tttttttaattgctgagcctgatctttattttctcctactagaagctcaacttcagagct

[0557] acccttttttgttctatggatgctctcagtatttttattgcatcttctcctatttgaagc

[0558] taaatttgtcctgggatagcaaaaacttgactccattccttgtagcccaatgtttctttc

[0559] cagttataaagcaagttgtgaagataaaaatgaagtggagggattttgaaatacaaggtg

[0560] tctagtttcagataatgtataattaaattgttgcgactaactttagcatgcattattgct

[0561] aacttttatcacgtcgactggtcttcatgggcagctgtcaaaagtttgtctggaacctct

[0562] ataattcagggttttgtgcttgtaatttgtcggtatgactgctttttcgtgttattcaat

[0563] ggaggcatatatcataaatttggttgtgaagggaaggttttaatttcatatacagtatcg

[0564] ttgttgacttctgttttaacactttttttcggttttcccagGTCAACACTGGTGTCAAAG

[0565] ACAATATGATGCAAAGCTTCTTTCTTGCGGAGACTTTTAAATATCTCTATCTTCTTTTTT

[0566] CACCCTCATCAGTAATCTCTCTAGATGAGTGGGTTTTTAACACAGAAGCCCACCCCATAA

[0567] AAATTGTTACCCGGAATGATCGTGCTATGAATTCTGGAGGGTCAGGTGGACGGCAAGAAT

[0568] CAGATAGGCAATCACGAACCAGGAAAGAAGGTCGATTTCGTATTAATCATTAAtcaagct

[0569] gttgataaattataatgggattgaatgaccaagtggagtgcctcatgaaacttgcatctg

[0570] aggtaaaagaaggatctgcactctgcaactccagattggctggatgtattgctatattct

[0571] gtagcttattaaatgccaccacatggagcagtagttttatgtagcttagcttagctactt

[0572] tagattcgcttcttaaactggcgtgtattataggagattgcaatttttgccggcagctcc

[0573] atttttgggcttgatgagcaaattgctagtcgcacctaatttttcccttagaaagcaaaa

[0574] actcatttcaatgggcacaaaatatgacatttgtgttacccgagtttttttctttgacgt

[0575] tggggctgggtttgagttgtactacccctgagaattgacgtgtgtaaaggtatatgtatc

[0576] tgaatttgtgaatttacgatctctgtgacgctatatgtgtttcagatatatctgatacag

[0577] agtttaagaaaggactttaaaaacttgtaagagtaaaatgagaagtttacaattattgtc

[0578] ttgaaatatataaatgtactattcttttggtatggactaaaacggaaagggtgccgtaga

[0579] aaatggaatagagggagtacgtcttttagttacatacaagtactggagatttcactggtt

[0580] aggttcagcaagtcgtttggaaaaaaattatatacatactttatttggttaatttgttta

[0581] agtttaatgattagaccttttcgaacaatttcatttctcttggtttgactttggtatcgg

[0582] tttattattggtattaacaagaaaacatacgattttcaatgatcttagtatgtttaaagc

[0583] ttaaaatcagtaaggtattgcgtcaaatatcatttttattttatatttctgcttttata

[0584] tagtatcgtttaatttactattaagtgaatgatatgaacataagattggtggcacaagtg

[0585] gcaagaaagtctctgttattatatgtttcacgagtacaggc

[0586] SEQ ID NO:30(NtMNS1a cDNA序列)

[0587] ATGGCGAGGAGTAGATCGTCTTCCACTACTTTCAGGTACATTAATCCGGCTTACTATCTG

[0588] AAACGGCCAAAGCGTCTGGCTTTGCTCTTCATCGTTTTTGTCTTCGCCACCTTCTTCTTT

[0589] TGGGATCGACAAACTTTAGTCCGTGATCATCAGGAAGAGATCTCTAAGTTGAATCATGAA

[0590] GTGACGCAATTGCGAAATCTGCTGGAAGATTTGAAGAATGGTCGAGTCATGCCAGATAAA

[0591] AAGATGAAATCTAGTGGCAAAGGTGGTCATGCAGCAAAAAATATGGATTCACCAGATAAT

[0592] ATCCTTGATGCTCAGCGAAGGGAGAAAGTGAAAGATGCTATGCTTCATGCTTGGAGTTCT

[0593] TATGAAAAATATGCATGGGGTCATGATGAATTACAGCCGCAGTCAAAGAATGGTGTTGAC

[0594] AGTTTTGGTGGTCTTGGAGCAACCTTAATAGATTCTCTTGACACACTATATATCATGGGC

[0595] CTGGATGAGCAGTTTCAGAGAGCTAGAGAATGGGTTGCAAACTCCTTGGATTTCAACAAG

[0596] AACTATGATGCAAGTGTTTTTGAGACAACCATAAGGGTTGTAGGTGGGCTTCTTAGTACG

[0597] TACGATCTATCTGGTGATAAGCTTTTCCTTGATAAGGCTCAAGACATTGCTGACAGATTG

[0598] TTGCCCGCATGGAATACAGAATCTGGAATCCCTTACAACATTATCAACTTGGCAAATGGG

[0599] AATCCACATAACCCTGGGTGGACAGGGGGTGATAGTATCCTGGCAGATTCTGGTACTGAG

[0600] CAGCTTGAGTTTATTGCTCTTTCGCAGAGGACAGGAGACCCAAAATATCAACAAAAGGTG

[0601] GAGAATGTTATCTTAGAACTTAACAAAACTTTTCCAGATGATGGTTTGCTTCCAATATAC

[0602] ATTAATCCACATAAAGGCACAACATCATACTCAACTATAACATTTGGGGCAATGGGCGAC

[0603] AGCTTTTATGAATATTTACTCAAGGTCTGGATACAAGGAAACAGAACTGCTGCTGTGAGT

[0604] CATTATAGGAAAATGTGGGAGACATCAATGAAAGGTCTTTTAAGCTTGGTCCGGAGAACA

[0605] ACTCCTTCGTCTTTTGCATATATTTGCGAGAAGATGGGAAGTTCTTTAAATGACAAGATG

[0606] GATGAACTTGCATGCTTTGCTCCTGGGATGTTAGCTTTAGGATCATCTGGTTATAGCCCT

[0607] AATGAGGCTCAGAAGTTCTTATCACTGGCTGAGGAGCTTGCTTGGACTTGCTATAATTTT

[0608] TATCAGTCAACACCTACAAAACTGGCAGGAGAGAACTATTTTTTTAATGCCGGCCAAGAT

[0609] ATGAGTGTGGGCACATCATGGAATATATTAAGGCCAGAGACAGTTGAGTCGCTGTTTTAC

[0610] CTCTGGCGTTTAACAGGAAACAAGACATACCAAGAGTGGGGTTGGAACATATTTCAAGCA

[0611] TTTGAAAAGAACTCAAGGATAGAATCTGGATATGTTGGACTTAAAGATGTCAACACTGGT

[0612] GTCAAAGACAATATGATGCAAAGCTTCTTTCTTGCGGAGACTTTTAAATATCTCTATCTT

[0613] CTTTTTTCACCCTCATCAGTAATCTCTCTAGATGAGTGGGTTTTTAACACAGAAGCCCAC

[0614] CCCATAAAAATTGTTACCCGGAATGATCGTGCTATGAATTCTGGAGGGTCAGGTGGACGG

[0615] CAAGAATCAGATAGGCAATCACGAACCAGGAAAGAAGGTCGATTTCGTATTAATCATTAASEQ ID NO:31(NtMNS1a蛋白质序列)

[0616] MARSRSSSTTFRYINPAYYLKRPKRLALLFIVFVFATFFFWDRQTLVRDHQEEISKLNHE

[0617] VTQLRNLLEDLKNGRVMPDKKMKSSGKGGHAAKNMDSPDNILDAQRREKVKDAMLHAWSS

[0618] YEKYAWGHDELQPQSKNGVDSFGGLGATLIDSLDTLYIMGLDEQFQRAREWVANSLDFNK

[0619] NYDASVFETTIRVVGGLLSTYDLSGDKLFLDKAQDIADRLLPAWNTESGIPYNIINLANG

[0620] NPHNPGWTGGDSILADSGTEQLEFIALSQRTGDPKYQQKVENVILELNKTFPDDGLLPIY

[0621] INPHKGTTSYSTITFGAMGDSFYEYLLKVWIQGNRTAAVSHYRKMWETSMKGLLSLVRRT

[0622] TPSSFAYICEKMGSSLNDKMDELACFAPGMLALGSSGYSPNEAQKFLSLAEELAWTCYNF

[0623] YQSTPTKLAGENYFFNAGQDMSVGTSWNILRPETVESLFYLWRLTGNKTYQEWGWNIFQA

[0624] FEKNSRIESGYVGLKDVNTGVKDNMMQSFFLAETFKYLYLLFSPSSVISLDEWVFNTEAH

[0625] PIKIVTRNDRAMNSGGSGGRQESDRQSRTRKEGRFRINH★

[0626] SEQ ID NO:32(具有5’和3’UTR的NtMNS1b)

[0627] tgcgtcatttggaagtctcaaattatggataaacaatacaatttttgtattttggacatt

[0628] atgaagtatgacataacatacatctgagtatgaatcaccttactattgaaaagaagtgcg

[0629] ttaacttgaggattaaataataatacatagaacgtcgactggttcaatgagtatctttgt

[0630] gcatgacgtaacaaacacatactatatcaatatcaaatgccttactttttaaatattatt

[0631] ccatcgataaaaataatttgaggattaagtaatacacatagacgagctactggtctttgg

[0632] gcggtaatttcccgatcaatttactgatttatttatccttcagcttcttccaacgtctta

[0633] ttaaatgaaatttaaggtgcatttgcaaagctacattaatactaggctttaattacatga

[0634] attggtctgtttttctagttaattgattaattggtcaatattgaattgattgcaattgaa

[0635] ggatatcattattttctccaactctttaggggtacaaaaattgcaggtaattatgtataa

[0636] tagttaaattcaaaatacgacttttaaatttatgtttatatttgttctctaatataaatt

[0637] ccttcttaaacttactcccattttaatgctctcctatttctatgtatccatataaatatt

[0638] tgtcataagaaaatattttctaaaaaaatgtatgattaaaagaatttttttagtaaagga

[0639] aaagatatttaccgtggattgaccaaatatattcgaagaaaaagatagaaatggatggga

[0640] gaagacaaagcttggtatgttagtcctaggtaaggtgggatgcctaatcttaaatggaag

[0641] acaagtcaatgttacaccgaccgcgcatgattgataagagtactattattaccgcgtttt

[0642] cactctttaccaaggctgaacgggtctttacctaattaacgtcctgtagatttaggcgag

[0643] gtttccttttgggaagtccagtagtcttggtcttcttggtcgttcctcttccccgatcta

[0644] ttcaatctgcatcggaagatcgatctgcacttcgatttactctgtttggtatattcataa

[0645] attgggtggaATGGCGAGGAGTAGATCGTCTTCCACTACTTTCAGGTACATTAATCCGGC

[0646] TTACTATCTGAAACGGCCAAAGCGTCTGGCTTTGCTCTTCATCGTTTTTGTTTTCGCCAC

[0647] CTTCTTCTTTTGGGATCGACAAACTTTAGTCCGTGATCATCAGgttcttcttctctttca

[0648] ttttccaatttttttcaccgtcctttttctctgattattttctttgtggaattcatgttt

[0649] aattttggattaaagtttttaagttgcgttctttaattacaaaacaactatattctttat

[0650] gtttttttttttgcagGAAGAGATCTCTAAGTTGAATGATGAAGTGATGAAATTGCGAAA

[0651] TCTGgttagtggttatctgaattatctatagctgtggaattttttattttaataatcagc

[0652] ctactgtctttaattcttttgtggctgccattcctcttcttgctttgtcgggggactgta

[0653] tgctagagcgtcttttaatgtgtgccagactgccagtacaaagttgtaattactcgagct

[0654] acctcctgttcttccttcttcaaattagatgaggttgagaatctgattaactacttgtag

[0655] tgggggaaaaagataaacttactaattcatgttagatttaacatctgtgtgttaatatgg

[0656] gaaaaatattaatgtctagagggatttatatggccagcttggttatgaagcctgaatttg

[0657] gttcgcttagcgaagagctaccatgtaccacctttacacctacttaatacctcaatctgc

[0658] ttaagtaaggctagtactgcccaacactgaattcggtttgcctagtgaagagttctctgt

[0659] ctttcactgagcttaatacctcaatctgcttcagttagctcagggctagtactgcagtgt

[0660] tgggccctataaatgggcttggagtttaaaaaatatttgtggcattaaagcttaggacca

[0661] tcttaccatgtttagatattataggaaatgaaaaagcagaaaaagtcgagctacgacccg

[0662] gcaaacagaaaaggaacccaactaaattagtcttaagaaggtgatacatctggctcagct

[0663] caaaccaggatgtaaagattagccgatggactgaccaaacaagagatggtggatggagta

[0664] agagtcgagatgtcgcaatttacctatagtgcaccataggtcagcaccttttgtgttatt

[0665] cccttagcattaaagggagaggtaacagtaggtagcaaaaagtcctcgctgaggcatgta

[0666] gaatgcttcctcattggggttaaggagaactggaggagtgttcaagtagacttgagagta

[0667] ccaacacccaatggcttaaaatgatgggacagaatactctatacacacacacacacacac

[0668] acacacacatatatatatatatctatgtgtaatgaaacttcatgaaaatatctatgtgct

[0669] atgtacttctttctttgtccgtcttgtttgtctaaaagtttggtggtttggtttatattt

[0670] tctggaaaaagaagcacaaagaatggatatagctagttatgacttatgccagtattattt

[0671] tcatgtgtgcttgcttcgcagtttacccatcttctgttgtttgcagtatagcattcaagc

[0672] tttttattttaaatactcaacttgtttgcatttattttggatactgttttagCTGGAAGA

[0673] TTTGAAGAATGGTCGAGTCATGCCAGGTGAAAAGATGAAATCTAGTGGCAAAGGTGGTCA

[0674] TGCAGCAAAAAATATGGATTCACCAGATAATATCCTTGATGCTCAGCGAAGGGAGAAAGT

[0675] GAAAGATGCTATGCTTCATGCTTGGAGTTCTTATGAAAAATATGCATGGGGTCATGATGA

[0676] ATTACAGgtttggatgttactttgaataagttcttttttgtgttgttaatgttgcctttt

[0677] ttgttgtatcttgtgatttcgcatgttttgttgcctttttcctttttgtgtgttaagggg

[0678] aaatggggtataatagatgattagttaattacttaattaaatgagttagttgtaaattta

[0679] aaaaactatttaaaaattaaatgagttagttgtcaattgacgttctccattaccttttct

[0680] ttctttgttatttaattttcctaagtgctataccttttgttgactagataagcatgtgac

[0681] actctagtttttcagttacaatattctgtaggttagtttgcagcagcaatgacaaaaact

[0682] acgcctcaaaaatataaatcatcttgatatagtttgctctatttgggcccatttcatgtc

[0683] aaccttcaatagtttggggttttctaacagtagagattctctacaattcctagtaacata

[0684] cacttcttcttttgagaaaagtaacacaaattcaaactttttgtttattatgtttttact

[0685] cattccatcccatttcatgttccagtggttgactgggtattaaagttaagaaataaggaa

[0686] gactttttacacgtaatacaaatatatacaacataccaaaatgacctttactattaacat

[0687] ctaaatgaaaggaggtaacttaccttaccttcctgataaaaaaaggttaccttatcctcc

[0688] caaagaaaaggttgtaagagttccatatatcacttactatttctatctcctaataaaaaa

[0689] agtttttatattaagtgggttcctaagaggttatgtcagtaagcgtaaaacgttattgcg

[0690] aggagtaaattgtttgcaattacaaaaatgtctcactcttctctggatagactaaaaagg

[0691] aagtaatgccacataaaatgggacaggaggagtatatgttcttttcttcatatatcctga

[0692] ccaagtatattgatttagcatgttttgatgctctggatattgcaaatgactatgaaatag

[0693] caattaaatggctaagaattggccttttaatttgttcttttctagggtatgttttgacat

[0694] gattccctagatatttctgaattattgtgagtgtcctggtagtgaggatgacaatttcat

[0695] cttgcaaagttaatgcgcttgggctttaaaataccgacacctttatgctacctaaacgga

[0696] agaacttcaatgttctgattttgcttaacatttggttgatttaaaattaaaacaaaagta

[0697] catctgcgacaagtttccagagaagctttgatgtcaacttaaaattagaggaagtttggg

[0698] gtttaggctgtggagttgtatttctcaaaactggtctgctttatgctgaacagtgttatc

[0699] gataaaagtcgtctagctcagaagttcatgaaaatatggacttggacatggataaacatt

[0700] tttttgtgcccacctttgctgctacttgtgttaagaacaatatgtatatggaaagacact

[0701] tttcttacttttccttgaagattaagatgcaactgtctttgtaatttacataatcagcgc

[0702] tttctttggtgatatgatgtaacaattttttttacctatagaaggatatgttttttgata

[0703] ggtagcaggatatagtatcccttcatatgcaatcttattctactctctttcttctttttc

[0704] tgtctaaacacacaattctagaaaatattgacacaaaagttcataccttgcagcttcagt

[0705] aatgttcctatcatacccttgaggccgacttgaatgattgtatttatggaaaataaaagg

[0706] tatatgtaggatagggtaactaattcttgttgatttgtagacattggcttttgatcatgt

[0707] actatagtttcttgacaatcagaaaggaaatgacttcatgaaatctgttggacatatcct

[0708] ttttatttcgtttaaaattgaatatttttagaagttgatatacttgccttgattctgcag

[0709] ttggtttctgctttgtgcttgtcgtacgatttacattacttctttactgcacttgtgcaa

[0710] aattatttaataattatgctgaaaatgtccaatctcagCCGCAGTCAAAGAATGGTGTTG

[0711] ACAGTTTTGGTGGTCTTGGAGCAACCTTAATAGATTCTCTTGACACACTATATATCATGG

[0712] GCCTGGATGAGCAGTTTCAGAGAGCTAGAGAgtgagtttattctcttcctcttctagaat

[0713] catatgtattacttatggtacttgttttgtccgcagacaagagaaaaatgttaaactaaa

[0714] tatagtgaaaattatcaaatgcaagacactgtgtgttttcactaatttaaagttaaaatg

[0715] caactgcaagattgctgtttcattcatttatggatttgatgccttgcatctgaccgttgc

[0716] cagacgttgaagtgttaattttatcacttccagcttccttctcgttattaagcatatttt

[0717] ctctaatctattggatagtttttgcaaatgatgcagtatgttaggtattcaaactttcca

[0718] catgtaattgttttcaatgaattattccacgtggctaatagtggctaacactttactgat

[0719] ggcagATGGGTTGTGAACTCCTTGGATTTCAACAAGAACTATGATGCAAGTGTTTTTGAG

[0720] ACAACCATAAGgttgctttataaggtttaatatgagttttttatgagttttcgttatcct

[0721] ttctcagcttcaatgatatagcaccatgattcttgtatgattaattatgtttttcaacaa

[0722] ctcagGGTTGTAGGTGGGCTTCTTAGTACGTATGATCTATCTGGTGATAAGCTTTTCCTT

[0723] GATAAGGCTCAAGACATTGCTGACAGATTGTTGCCCGCATGGAATACAGAATCTGGAATC

[0724] CCTTACAACACTATCAACTTGGCTCATGGGAATCCACATAACCCTGGGTGGACAGGGgta

[0725] agtttgaactctaataaattgcagttaatccccccctgttgatactactccaatatcttc

[0726] tggcaaagaggatggagggatcagttatcccagaagggtggatgtgattaatactgtatg

[0727] tgacaagttattagatttggttcctgattcgttccctgaagattgtggagggagcccgac

[0728] taggagaaagtatatatctattgggaggtttctgaagaagaatcctctctttaagtttc

[0729] cttataatatattcaaagaacatttagtttgcttctctttgttcttttgctcttttccct

[0730] gcattcacctcccccctttcttttcaaagaacttgtattcttacccatttaacaaacata

[0731] ttgactgatctaatagtgatctttctcctggaacttgtcaataatgcttatagtttctat

[0732] agattgtatttttccagaggtggtttgtgcatttttttgaaattgttgtgctctttgctc

[0733] tcagGGTGATAGTATCCTGGCAGATTCTGGTACTGAGCAGCTTGAGTTTATTGCTCTTTC

[0734] GCAGAGGACAGGAGACCCAAAATATCAACAAAAGgtatgcctgagaaaatttcttaaaat

[0735] acaaactacgttcatattctcataaaactacaacttgaaactatgatatgaaaattggta

[0736] ttgtgtaaaattgattaagctacagacttgggtcaatctgtcttatttcagGTGGAGAAT

[0737] GTTATCTTGGAACTTAACAAAACTTTTCCAGAGGATGGTTTGCTTCCAATATACATTAAT

[0738] CCACATAAAGGCACAACATCATACTCAACTATAACATTTGGGGCAATGGGCGACAGgtaa

[0739] atgaccatcgtttgtccattcttgcttccccggaccccgcgcatatcgggagcttagtgc

[0740] accgggctgccctttttttttgtccattctagaatgatgcctgtgaaaacctgattgagt

[0741] aggagtatttatccccaaaagaaaaaaagagggggagagcctttatcctatgcatttgtg

[0742] aattggcatttagagcttccatgttttcttttcatatgaaaagttagtaaaagatttttt

[0743] tgtttcagCTTTTATGAATATTTACTCAAGGTCTGGATACAAGGAAACAGAACTGCTGCT

[0744] GTGAGTCATTATAGgtaagcagcttaagttcacttctgtctgtttcgcttcagatattgt

[0745] tgtccttttaaagcttcaattcagtccatccggtgtttcacttgatggttcatgtaggtc

[0746] taagtgcatattttaatgcttaaacacttcctcagcctgaaatcaaatctgatcatgtgt

[0747] tgcgggaatgcatagaaatattcgttgacaatgtttacatatttggagcattttagaatt

[0748] tcaagtaagaaatcctagaacaaggaaaaaaattttgcactgaggataaaaaactgatgg

[0749] aaatgagatatggtgtcactgtgaatacataaaatcagagctatatacttacaacaacag

[0750] caaatacgcctcaatcgaaactagttgagaatttttgatgatatttcagtcaggcctgaa

[0751] taaacttaattatgttttaactcgctcctcacgtgcgggcttgattctttttggtctttt

[0752] tagtggtgagccaaacagttaggagatgtgagaggttggccttggtgggtacgaggagag

[0753] gtagaggcagacaaaagaagtattggggagaggccttggtgggtataaggagaggtagag

[0754] gcaggccaaagaagtattggggagaggtgattaggcaggacatgacgcaacttaagctta

[0755] ccgaggacatgacccttgataggagggtgtggcggtcgagaattagggtagaaggttagt

[0756] aggtagtcgagcattttcctttttctttcccatgccgatattattagtgttagtatgata

[0757] tctttttattcttagattgctattgctacctattgtttgattgctatctttcacttcaat

[0758] tttcttaatatcttgatgttgttactgtttattgccactgcttcttttcatcgtttcttt

[0759] agccaagggtttatcgaaaagagtccctctgccctctcagggtagaggtaaggtctgcat

[0760] acacactaccctacccaaaccccacttgtgtaaattcactgggtttgttattgttgcatt

[0761] tattccatcactttacgaggttctgtggaagcacattggataatgcacattggatataca

[0762] ttttctttaaggatggtgttgtccaggccagcttgcatggttgctgctttacatttaatt

[0763] ttttgataaatctttctatggcatatttatactattctcacatatattttttacttgttc

[0764] taagcttcaaaaactttttattaattgtctcgccagacacattaggagtagtcaaagtgg

[0765] ggtagctggagtattaaactcatttatgctcctaagactctttctctaattagaagcttt

[0766] aactaaattttacagtggtatttgacgagagtttgaacttgaaatttcagatctaagaac

[0767] tgtgagtactagtggaatttgttataagtggttggtctttcccttgaatacttttccttt

[0768] tctggtgctagaatgcaggaagatgaaattggttatagtggaaaggttgtggtataagtg

[0769] cttagctagaacaaaaatggatctgtgatgtggaaaagaaaaaaatatgtttgatgcata

[0770] aagcctttctgagacttgaaaaaatatgaagtgattttgtttaacctttttatgtttctt

[0771] ttacaaaattttgcattcctctgtgttcctcaatataattcttccactaattttgcaagc

[0772] agGAAAATGTGGGAGACATCAATGAAAGGTCTTTTAAGCTTGGTTCGGAGAACGACTCCT

[0773] TCGTCTTTTGCATATATTTGCGAGAAGATGGGAAGTTCTTTAAATGACAAGgtgatgtat

[0774] aggcatttacacatatttggggagtctgagatgtgttaattcttgactttgttttattta

[0775] cccttttggattttctgcagATGGATGAACTTGCATGCTTTGCTCCTGGGATGTTAGCTT

[0776] TAGGATCATCTGGTTATAGCCCTAATGAGGCTCAGAAGTTCTTATCACTGGCTGAGGAGg

[0777] tatttttaacttgcagagcatcattgcggaatgtgattttaggttcctatttgcgaaatg

[0778] atctccatatgccctaattcgtatgtgtgccactatgttgattgaaagtgataataagaa

[0779] agaggtatatctacagtcatatggaggaaaattgcgtcaaaagacctatacttctcggag

[0780] ttaaatgtggatgtagctaaaaacaatacacaagaaaggatccatataagcaataccaac

[0781] taattgggattaaagatccatagagttctcatgtttgctgttactcctttttattttggt

[0782] tgaagttttgtgtaattgtttaactataagtgtgagatttagagaacatctagttttagt

[0783] gaacccctgatagtattactgaacccttatttattattggaatgaaatggttttaagtag

[0784] agcataatggatacagagaattcatataatcaactctttactagtttaggtttgatgttt

[0785] agttaattgattaattgatttgagaagtggtctctgtcgaaaaaagttttaggttttatt

[0786] caacttttgagcattagcgatggtgggctgtgggcaatgctctcctaccaccagatgtt

[0787] cgctttcgttggctgttatagttagctgggggtgctgaaaggtgaagtgtgggataagaa

[0788] acaagtgttagtgactcatgaatgtgttagggggctgagtgttggtctttagattgtgct

[0789] tgcctctatgatttgacttgcctttcatctataggtttccctttcacatgatgggaaggc

[0790] ccagaggatcagtggttcattccataggagcttttagtgactgcagtgctgtttcttgtt

[0791] gccagaaagttctagtattgcttttttgctgaatatcttaaccttctcttgcagCTTGCT

[0792] TGGACTTGCTATAACTTTTACCAGTCAACACCTACAAAACTGGCAGGAGAGAACTATTTT

[0793] TTTAATGCCGGCCAAgtcagtttttttcattttagttcatggtgatgtttgtttttgttg

[0794] tttgcttatggtgataacttatttgaattgttcatcctatttaatgctcttcagGACATG

[0795] AGTGTGGGCACATCATGGAATATATTAAGGCCAGAGACAGTTGAGTCGCTGTTTTACCTC

[0796] TGGCGTTTAACAGGAAACAAGACATACCAAGAGTGGGGTTGGAACATATTTCAAGCATTT

[0797] GAAAAGAATTCAAGGATAGAATCTGGATATGTTGGACTTAAAGATgtaaggacaaactca

[0798] attctttcaactttggatagtacctacacctccattatcttctttctttaaatgccttca

[0799] aatgctgcatctttaataatatttcccgtgttctttgttaaaaaactcatgaaatacact

[0800] cttttttggattttgatattgataattgggatatacatacatgaatgttatttttatgct

[0801] attgtttgatggaaaacctggtgctcctacttggtgttttctctctccttcaccttgtaa

[0802] acaccagctcgcttctaaacttcagttttcttttttgggttttacagcactctaattaca

[0803] ggtaggtttctccaatttgatttattgagcaaccttctataattagtgaagtatgaaagt

[0804] atgtaacgtttgaaaaggtgtacctctgtcagcccatccgtccattacataattgtacac

[0805] aaagagcaacattggctagtgagccccccctttttttaattgctgcccctgatctttatc

[0806] ttctcctactagaagctcaacttcagagctacccttttttgttctatggatgctctcaat

[0807] atttctattgcatcttctcctatttgaagctaaatttgtcctgggacagcaaaaacttga

[0808] ctccgttcctcgtagcccaatgtttctttccagttataaagcaaattgtgaagataaaaa

[0809] tgaagtggagggattttgaaatacaaggtgtcgagtttcagagaatgtataattaagttg

[0810] ttgtgactaactttagcatacataattgccaacttttatcacgtcgactggtcttcatgg

[0811] gcagctgtcaaaagtttgtcgggaacctctagaactcagggttttgtgcttgtaatttgt

[0812] cggtatgactgctttttcgtgttcaatagggacatatatcactaaatttggttgtgaagg

[0813] gaaggttttaatttcatattcagtatcattgttgacctctcttttaacgctttttttttg

[0814] ggttttcccagGTCAACACTGGTGTCAAAGACAATATGATGCAAAGCTTCTTTCTTGCGG

[0815] AGACTCTTAAATATCTCTATCTTCTTTTTTCACCCTCATCAGTAATATCCCTAGATGAGT

[0816] GGGTTTTTAACACAGAAGCCCACCCCATAAAAATTGTTACCCGGAATGATCATGCTATGA

[0817] GTTCTGGAGGTTCAGGTGGACGGCAAGAATCAGATAGGCAATCACGAACCAGGAAAGAAG

[0818] GTCGATTTCGCATTAATCATTAAtcaagctgttgataaactataatgggattcaatgacc

[0819] aagtggagtgcctcatgaaacttgcatctgaggtaaaagaaggatctgcactctgttaac

[0820] tccagattggctgggtgtattgctatattctgtagcttattaaatgcaccacatggagca

[0821] gtagttttatgtagcttagcttagctactttaagattcgcttcttaaactggcgtgtatt

[0822] ataggagattgcaatttttgccggcagctccacatttttgggcttgatgagcaaattgct

[0823] agtcgcacctaatttttcccttagaaagcaaaaactcatttcaatgggcacaaaatatga

[0824] catttgtgttcctgagtttttttctttgacgttggggctgggtttgtgttgtactacccc

[0825] tgagaattgacgtgtgtaaagttatatgtatctgaatttgtgaatttgcgatctctgtga

[0826] cactatgtgtttcagttatatctgatactcatttttatatacctgtatttgattggacac

[0827] ggagtttgcggctttaaacatgttaaaagcatgtcattaaaagtaaaataagaagtttca

[0828] gttaattgttgagtttttggcaaaaatcatcgttcaactatggctcaaaactagggtata

[0829] tccttgtgtaataatagtgaacaaaaaatatccctgaactattcaaaaaatggcaagaat

[0830] tccttctgttaatttcttacaaccaaaacatgtgccaagcacatgacctccccccccccc

[0831] cccaaatcccccttcactcctgattctatccctcccgaagctatcccgctcttccatatt

[0832] cagtgaaactaaggcttcaaaagctatacattctacgtttaacttcataaaataactaga

[0833] gcaacaagataagttattttcttgaacaagaattgaagcta

[0834] SEQ ID NO:61(NtMNS1b cDNA序列)

[0835] ATGGCGAGGAGTAGATCGTCTTCCACTACTTTCAGGTACATTAATCCGGCTTACTATCTG

[0836] AAACGGCCAAAGCGTCTGGCTTTGCTCTTCATCGTTTTTGTTTTCGCCACCTTCTTCTTT

[0837] TGGGATCGACAAACTTTAGTCCGTGATCATCAGGAAGAGATCTCTAAGTTGAATGATGAA

[0838] GTGATGAAATTGCGAAATCTGCTGGAAGATTTGAAGAATGGTCGAGTCATGCCAGGTGAA

[0839] AAGATGAAATCTAGTGGCAAAGGTGGTCATGCAGCAAAAAATATGGATTCACCAGATAAT

[0840] ATCCTTGATGCTCAGCGAAGGGAGAAAGTGAAAGATGCTATGCTTCATGCTTGGAGTTCT

[0841] TATGAAAAATATGCATGGGGTCATGATGAATTACAGCCGCAGTCAAAGAATGGTGTTGAC

[0842] AGTTTTGGTGGTCTTGGAGCAACCTTAATAGATTCTCTTGACACACTATATATCATGGGC

[0843] CTGGATGAGCAGTTTCAGAGAGCTAGAGAATGGGTTGTGAACTCCTTGGATTTCAACAAG

[0844] AACTATGATGCAAGTGTTTTTGAGACAACCATAAGGGTTGTAGGTGGGCTTCTTAGTACG

[0845] TATGATCTATCTGGTGATAAGCTTTTCCTTGATAAGGCTCAAGACATTGCTGACAGATTG

[0846] TTGCCCGCATGGAATACAGAATCTGGAATCCCTTACAACACTATCAACTTGGCTCATGGG

[0847] AATCCACATAACCCTGGGTGGACAGGGGGTGATAGTATCCTGGCAGATTCTGGTACTGAG

[0848] CAGCTTGAGTTTATTGCTCTTTCGCAGAGGACAGGAGACCCAAAATATCAACAAAAGGTG

[0849] GAGAATGTTATCTTGGAACTTAACAAAACTTTTCCAGAGGATGGTTTGCTTCCAATATAC

[0850] ATTAATCCACATAAAGGCACAACATCATACTCAACTATAACATTTGGGGCAATGGGCGAC

[0851] AGCTTTTATGAATATTTACTCAAGGTCTGGATACAAGGAAACAGAACTGCTGCTGTGAGT

[0852] CATTATAGGAAAATGTGGGAGACATCAATGAAAGGTCTTTTAAGCTTGGTTCGGAGAACG

[0853] ACTCCTTCGTCTTTTGCATATATTTGCGAGAAGATGGGAAGTTCTTTAAATGACAAGATG

[0854] GATGAACTTGCATGCTTTGCTCCTGGGATGTTAGCTTTAGGATCATCTGGTTATAGCCCT

[0855] AATGAGGCTCAGAAGTTCTTATCACTGGCTGAGGAGCTTGCTTGGACTTGCTATAACTTT

[0856] TACCAGTCAACACCTACAAAACTGGCAGGAGAGAACTATTTTTTTAATGCCGGCCAAGAC

[0857] ATGAGTGTGGGCACATCATGGAATATATTAAGGCCAGAGACAGTTGAGTCGCTGTTTTAC

[0858] CTCTGGCGTTTAACAGGAAACAAGACATACCAAGAGTGGGGTTGGAACATATTTCAAGCA

[0859] TTTGAAAAGAATTCAAGGATAGAATCTGGATATGTTGGACTTAAAGATGTCAACACTGGT

[0860] GTCAAAGACAATATGATGCAAAGCTTCTTTCTTGCGGAGACTCTTAAATATCTCTATCTT

[0861] CTTTTTTCACCCTCATCAGTAATATCCCTAGATGAGTGGGTTTTTAACACAGAAGCCCAC

[0862] CCCATAAAAATTGTTACCCGGAATGATCATGCTATGAGTTCTGGAGGTTCAGGTGGACGG

[0863] CAAGAATCAGATAGGCAATCACGAACCAGGAAAGAAGGTCGATTTCGCATTAATCATTAA

[0864] SEQ ID NO:62(NtMNS1b蛋白质序列)

[0865] MARSRSSSTTFRYINPAYYLKRPKRLALLFIVFVFATFFFWDRQTLVRDHQEEISKLNDE

[0866] VMKLRNLLEDLKNGRVMPGEKMKSSGKGGHAAKNMDSPDNILDAQRREKVKDAMLHAWSS

[0867] YEKYAWGHDELQPQSKNGVDSFGGLGATLIDSLDTLYIMGLDEQFQRAREWVVNSLDFNK

[0868] NYDASVFETTIRVVGGLLSTYDLSGDKLFLDKAQDIADRLLPAWNTESGIPYNTINLAHG

[0869] NPHNPGWTGGDSILADSGTEQLEFIALSQRTGDPKYQQKVENVILELNKTFPEDGLLPIY

[0870] INPHKGTTSYSTITFGAMGDSFYEYLLKVWIQGNRTAAVSHYRKMWETSMKGLLSLVRRT

[0871] TPSSFAYICEKMGSSLNDKMDELACFAPGMLALGSSGYSPNEAQKFLSLAEELAWTCYNF

[0872] YQSTPTKLAGENYFFNAGQDMSVGTSWNILRPETVESLFYLWRLTGNKTYQEWGWNIFQA

[0873] FEKNSRIESGYVGLKDVNTGVKDNMMQSFFLAETLKYLYLLFSPSSVISLDEWVFNTEAH

[0874] PIKIVTRNDHAMSSGGSGGRQESDRQSRTRKEGRFRINH★

[0875] SEQ ID NO:63(具有5’和3’UTR的NtMNS2)

[0876] ccacagacggcgccaaactgtttgaccaaaaagcgctaagcttttcgttaaactaattaa

[0877] taaagaaaatggaagataaatcttaaccaaaaataattaactttagatctaagcatattg

[0878] aatgcaagaatcgaatgaggccgagcttatataacatttcttaggatgattaaaagacat

[0879] caaacgtaaataataagcttacatctttgatacattgttccgtacttgtaagagcaaaga

[0880] gggaaagtaagaaatgtcgttgataactgtgagatctatctttattgattcaacaatgac

[0881] gattacaaagttttaggcttttactttgttgttggaggtctcctcccgttcttctgttcc

[0882] tttttctctcttttttaggaacccccttttcttgcctttttctctcatatatatatatat

[0883] attaccaatctttccttttatccaacggtctttaaccagcataccttctcttggctatat

[0884] ttttccttactcgcctaagtattacgacatactttctaccgtataagccttctgatggct

[0885] cgatctcgatagtggccgagatactcatcattattatacctcgtaggtacaactatagct

[0886] tggtggatcctttactattccttttaacgataaccgacatgtggtcagattttgacctat

[0887] acaggctttggcattcttaagttggcaaacggcgtgtctggctctacgtcaatttagcac

[0888] caactaaagaagctaaaggaaaaattaagtcccaactattttagcagggtgttctcgttc

[0889] ccaacgaagtacactgtagctccaacctacgccctaacggctattggtctgtactgtttc

[0890] ttgttttaaatataagtaaaatatacttatttcctaatggactaatggagtctttcccct

[0891] ttgtttaacgaaccagtcctgatcttgatcgatctttcacttgatctcgctgataaacaa

[0892] aaacgatatagaggttaacaaaggttcctcttcgcccctctcctttctttgtatagtatt

[0893] gaaataaagagaagtaaaATGGGGAGGAGTAGATCGTCCGGCAATAGGTGGAGGTACATC

[0894] AATCCATCTTACTATTTGAAACGGCCTATGCGTCTCGCATTGCTTTTCATTGTTTTTGTA

[0895] TTTGGTACTTTCTTCTTTTGGGATCGACAAACTTTAGTCCGAGATCACCAGgtacttttg

[0896] tttttccctacttcattgtcaattcccttttattggaactaatcactcttaactcccgta

[0897] atttgggtaattggttctgccatcgatcgttttctttttaattatgagcaagtttgttgc

[0898] tttgttacaacaataacactgtctatgttttcctggagaatctatgtgttccaattgtag

[0899] aattgagagccccattggacgtagcaggcttgtattttgtatctgtattagtagaaaaaa

[0900] gggcagtccggcgcactaagctcccgctatgcgcggggtcggggaagggccggaccagta

[0901] gggtctatcgtacgcagcctgcatttatgcaagaggctgtttccatggctcgaacccgtg

[0902] acctcctggtcacatgacaacaactttaccggttagtagagtcctcaataaatttgatag

[0903] actatactttggaaaattcaaggtaatcagctttttactagatttatctcttgtgttttt

[0904] gtcgtaggtcattcatacaatgaatccaagtagaacttacaaaatgtattagcaagtctc

[0905] ttctcctatcaaagagttaactatcaacagcaacactgagtatggggattgaagagttct

[0906] cagcgatatttgatttttgattacatagactgagagatatataggcattcatttcagaga

[0907] tcttctagttgctgcaggacaatatctttgaggttcttattgataattgaaacttaagtt

[0908] ggtttacggtggtaatatcacccttgataaagataaattgtttagcaaggagcaacaaaa

[0909] acaactacaccttagtcccaaactaattcagaacttctgaagaagtgtggctgctgggat

[0910] tcgtgcccaggtctttacggccagaacttggaattctactatactagacccacgttgaaa

[0911] atagagatgcaacaagaagacttcctaggggtcacaaaacctagtacggcccttgtccaa

[0912] tcctaataccctagtgctttctatttatggttgcaagcaccctgggacatttggttttct

[0913] agctagtagtaccaaagttctagtgatttttgatgcttattgcctttcagtttatataga

[0914] attttcttcttctgtttcatggaatcttcttctgatgtagaagtttatttatatgtattc

[0915] ttcataagcaagctagtggttcttagatgcatttgttatttggatatttttgaagtttta

[0916] aattcagtttgtcttgcaatttgtcaatgaacttgtgattttgcagGAAGAGATCTCTAA

[0917] GTTGCATGAAGAAGTGATACGGTTGCAAAATCTGgtaagcagtttctgcttttcttttca

[0918] aaatctgaactgttatgtttaattttcacctcttctgtaaattttggcttgtggggaaaa

[0919] tctttatactagagcttcttataattttgctggtaagtagccctttcctccttccaactg

[0920] aatgaaaaagattgtttcactgtgtataattgaaaacctgatgaagttataattcttgca

[0921] attcggttcaagcatcatttatgttgtagtaaaaatactttatgcctatgggggagaggt

[0922] atttgaggacagcaatggtgaagatagtggtggtgcgggcaataggtttggcaacaatgg

[0923] cggtggaaggaatagatgggcccatctgtgctctggcaggtttatgctgcaactgatctt

[0924] attgttagggcttgctaggtcttttttgtaaaagaacatataacgaacatcacttgcttg

[0925] ggcaaagtccatctagttttctattgtttattgtagtcgctttcaaaattcttggtgttt

[0926] taaatatttcgttctgttttcttcatcatgatttaattgctggcttttgtttccatttat

[0927] ggtcttgtttactgtagCTGGAAGAGTTGAAGGATGGTCGAGGTATATCAGGTGAAAAGA

[0928] TGAATTTTAGTCGCAGTGGTGGTGATGTGGTGAAGAAAAAGGATTTCGCTGATGACCCCA

[0929] TTGATGCTCAACGAAGAGAAAAAGTGAAAGATGCTATGCTTCATGCCTGGAGTTCATATG

[0930] AAAAATATGCATGGGGCCATGATGAACTTCAGgtctggttgttgctactaataagtcttc

[0931] tttgtagaaatattgcctttgtgccattatgtttagtcacttagcagtcaaatctttggt

[0932] ggaggcatttcagttggccgttaaatgctttaccctgttgattaatttcttatattttct

[0933] ttctctacttggagtgattgtgatcactttgtatgccttacccttaagctgatcatttaa

[0934] atgcgagtcttcatattttcatcatccctaatatttgttgggaaaatgttggatcaagag

[0935] cttcatcccagtcgtagaataatttacattctgaaatgtaatttcatccttggtggagtc

[0936] tgttttaggtttatttggctacaagttgaagaataagttatacctacataggtatcgatc

[0937] ttatgtagttagttctttcctttgtacaaaataatatcttgtactcaagattactgatta

[0938] aaaaaaaaatcttgtactcaagggtttctcagataaaaaggagttacctcaaaatttaaa

[0939] tatgtgaaagggtgaagtctcaattaattaatgctcccactttttatatttgtttcaaat

[0940] actctcacttgacactattggtgaaattatggccattccaaagtgactaacactctagct

[0941] agaaacctttgctttttcttttaccttttaatttaattttgtccttttgctattgatcta

[0942] atggaaaaatcatagctttttactttgtagcatctcatttacccttatgtccactcttta

[0943] agtaaacataaagaagttacatattattatttctcatcccaagaatcctttcatgtcgaa

[0944] gtacggtttagaacactaggagttgtcgagatgtgggaagattattcatacaattggatt

[0945] ctcaaaaagtttatcaagaattttgagtatcctggtaatgaagataacgctatcatcttt

[0946] taagctctttctatgttaaagctttgagagaggagcattagtgcaatcaaaagtgaaaac

[0947] ttcagtcttctgcatttgcaataacttctatggggaaattttttaattgagcatggtaac

[0948] aggtattttattaacaattaaagtagtccttggcacaaacaaagttacaggacctcaaaa

[0949] gaaaaagaaacaaaaagatagtcttgtgctagttacaaaaatcgcaagatgtcaactaca

[0950] gaatctacattttctacaagattaaacaatcagttacggagaaagtaaactgtaataagt

[0951] attttgttgcacatgatatttcttgttcttcttaaaaagtctgtctgcgaggtaaaaact

[0952] tgtggaagtttgtttatgtttatggtatttgggctctgcttccgagtataatagcttcat

[0953] ggtgaacaaaaatcttattcttgatggaattgctagcttcatatatgatctattcgactc

[0954] tctacttccctattcctttttctttctttgaccgaacatgtgatgtaagatcatattcac

[0955] ccagaagcttatacgtgttagcaaaatattcctagacagaatctatatggaattggtatt

[0956] agttctcaatgacttttttttgtggtgactataatttaatgacagtcagaaaggaaatgt

[0957] aaaattgtaagagagatccctttttgttcgttgttcagtactgaatctaagaggataaat

[0958] tttccttgatacttttcgaactgtttctgctatgtgcttgtggaactttatactatatcc

[0959] tttattggtcatgtgcctgtattgatttgattgtcatgataaacctttgcaatgccagCC

[0960] ACAAACAAAGAAGGGTGTTGACAGTTTTGGTGGTCTTGGGGCAACATTAATAGATTCTCT

[0961] TGACACACTATATATCATGGGCCTGGATGAGCAGTTTCAGAGAGCTAGAGAgtgagttca

[0962] ttattctcttgcccctgaaagccccgaattatctttcttattctaattcaggaattagtt

[0963] gtattataacttaaaattttgtgattgctcttgattgtaccttttccctttctttctaga

[0964] ttgagagcttttttatgtgaaaaccagctttgtatatgtggatacattatcttctacttt

[0965] attttatttgacggtgatctcttccctgcacacagtaaccatggttgtctttgacaatat

[0966] tacttatggtcctagttttgttgtaaagaagaaaatgaattgtttactttttttttttta

[0967] atatgaccgggaatcaccagaatcaagtaattggtgcatgcgataatgttaaaatgcatc

[0968] tggggttagtaaaacattttatacttattgtcatctctctgattaatgtctgcagttctc

[0969] ctaactgccgcctcctcaacagccagagtccccaaagtcctcacccagtgagagactgct

[0970] tagagttctgtgtttccttggattgtggatttgatgtctggcattttgactttccaaaat

[0971] aattgaagtgtcaatttcattatatcccttttacttctgggttttagggttatgtattag

[0972] gtgtactttctactctctctgaaacaatgttgccaggtgataggcatttgtaactttata

[0973] tatttttgtgcttcagttaagcgttcattgcttgtggctaacaagttgttgatggcagGT

[0974] GGGTTGCAAGCTCCTTGGATTTCAACAAGAATTATGATGCCAGTGTTTTTGAGACAACCA

[0975] TAAGgtttctttataaggtttaatatgcttttgtaatgagtttacttggattcctgatac

[0976] cttttatcagctttgacgatttgtttctatgttttttgtttcaatgtttctttatgtaat

[0977] tcaacaacagAGTTGTAGGTGGACTTCTTAGTGCATATGATCTCTCTGGTGATAAGCTTT

[0978] TCCTTGATAAGGCTAAAGATATTGCTGACAGACTGTTGCCTGCATGGAATACACCATCTG

[0979] GCATCCCTTACAACATTATCAACTTGTCACATGGGAATCCACATAATCTTGGGTGGACAG

[0980] Gggtaattttgaactataccaaattcaagttgatttccgctgtagtataactcatgtatc

[0981] tcatgctgaaaaggatatagggaattatcctaaattttatttgacgagtcatttgatgct

[0982] ttaccctgcatcaataggagaagagtatctaaaaggggaactgtgtgaatgaagaatcat

[0983] acgttattaaatgctctaattttctcataatatacttaaatgatcttatgatccaatcct

[0984] tgttttctctctttcttgcatctcctccaggcgttctcccaactgacttcagcttgctgg

[0985] gagaaacatgtctgttgcaacttagcaattgcagttctctaggaaactgtcccacatact

[0986] ctcaacttgtttgtgcacccagccatcttgtgatgatgtccttttgctgaaattttcacc

[0987] agtgggaatccaactctcttctttttaattgctttttatttcttttctttggggcatatt

[0988] aggaagctgcagggcttgtgcagtcactgcgatatatggttttttacttgttcttttcct

[0989] cttaaacgcttggacagagtctttttttgcacaccaatgacttatcttttgaaatctgaa

[0990] tatttcagtctcatggcatgtgatatatgatgcttaaatttctatgcacaaacacatata

[0991] tgtaattacatcgctgtagtctagtgtacatttggtgaaattattgtgctcccttctctc

[0992] agGGTAATAGTATCCTGGCAGATTCTGCCTCTGAGCAGCTTGAATTTATTGCTCTTTCGC

[0993] AACGGACAGGAGACTCAAAGTATCAACAGAAGgtatgtgccaatagaatttatctaaaag

[0994] tataacttcttgataactactagtaaataaaactacaattccaaaattggcatggtagac

[0995] aattgattaagctacacatacttgaaacgatgttctgctagtgactgaatggcatatgtt

[0996] cctatttcagGTGGAGAATGTTATCTTAGAACTTAATAGAACTTTTCCAGATGATGGTTT

[0997] GCTTCCAATACACATTAATCCCGAGAGAGGGACAACGTCATACTCCACTATAACGTTTGG

[0998] GGCCATGGGGGACAGgtagctttcatttatctttctccatatgacagatctgataatgtg

[0999] aacctaaagaggactggtatcaccatatccgtctgttcactggcatttggttttcctttg

[1000] tttcttttgtacatttagatagtaaaactatgtcgtttcagCTTTTATGAATATTTACTC

[1001] AAGGCCTGGATACAAGGAAACAAAACAGCTGCTGTGGGACACTACAGgtaagaagcttaa

[1002] gtttaaagtttctttatttttttactttacagttttcctattcaaaacttcaagtggttt

[1003] cctgttttgacatgatgagttgcagttctgatggatccgtaactgtaaagtgtgtaaact

[1004] aatgctagaatactttgtcgggcctgaattcaagtctttgtcatgcatcacggcctaaca

[1005] catagaaatactgttaaatgtttacatgtgtagagcactaccaagaaacccaatcagagg

[1006] aaacacgtgaattttgaccgaacatgaaaggaaaaaggaccattaaggagaaaaaaatga

[1007] caacttgctgaggagttgatttaatctaaatacataaaagtaggcctggattattagagc

[1008] tgttgctattatagtatcgttcgatatacatataaatatcgaagtaagagagattaaatt

[1009] tactgctacttttttaaaaaaaagaaatttcctgctatctttatatcattctgataaata

[1010] atacataatatcaaacctgagctgcatcgggagccttaatgatgacattgttatatactc

[1011] catcactttttcctagaagggcaaaacttaaaatcttgattaacatgtaactagagtact

[1012] ctttctgtgtcgcgttcttgcactcttgttacatcttccaagcatcactttagcatgttt

[1013] ccaaaaattcagatacgccaatcctaagtttcaaatactttgttttctaactttcttgct

[1014] agttaaactagattagtcaaaacgatcaaaatttagtgcaggatgtccttatggattatc

[1015] ttgattagcagctgtaagctcagttctgcagaaactaatttgaagaccaaagaactgggg

[1016] gtttatgggcagcgtctttcctttgagaagtgcaaagcgagctccttatcctttactgct

[1017] ctgaagtgcaggaagacgaaattggttattgtctgaaaactctgtgttataattgcttag

[1018] ttagaaccaaaaggatcagaaatgtggaccaagtcaaagtatgtcaatgcatatttcttt

[1019] cctgagacttctaaatgagtatgacgttcttttgcaaattgcaatctcaagtgtattaca

[1020] tagagttcttccatttaattttccaaacagAAAAATGTGGGAGACATCAATGAAAGGTCT

[1021] TTTAAGCTTGGTGCGGAGGACTACCCCATCATCTTTTGCTTATATTGGTGAGAAGATCGG

[1022] AAGTTCTTTAAATGACAAGgtgatgtatagggttcaaattggtagctgggagttgtgatg

[1023] atgtgtgttattcttatatcatgtttaatctacccttttctgaattctatatagATGGAT

[1024] GAACTTGCATGCTTCGCTCCAGGAATGTTAGCTTTAGGGTCGTCTGGTTATGGTCCTGAC

[1025] GAGTCTCAGAAGTTCTTATCACTGGCAGAAGAGgtaaatttgaacttgtacagcattaaa

[1026] ctatgttttgacttaagttcttatttgaccatcgatctctgatggagaagttttgcatca

[1027] actttgagtatgaggttgtttaggttacattggacattgttcggcctactccagatgatt

[1028] acttggtttactttaatttatttggtggggttatacagggtgaagcatgaaacaacctat

[1029] gaaataacatgtaggtcttgaatgtgggctacagtgcagattttatcattcaaccttcta

[1030] actttctctttcagataaaagggaaagaaggcacataggatcagtgggcttaatctattg

[1031] catattgactacttccattattgctcgttagaacaggaaacttgagtattgctattttac

[1032] tggatatgttgaccccttcttgcagCTTGCTTGGACTTGCTATAACTTCTACCAGTCAAC

[1033] ACCTACAAAATTGGCAGGAGAAAACTATTTCTTTAATGATGACGGGCAGgttgattttac

[1034] caattattttattggtacatatttgttattgttgtttgcttatgctgataaagtatttgt

[1035] gattgtttttcagGATATGACTGTGGGCACATCGTGGAACATACTAAGGCCAGAAACGGT

[1036] TGAGTCTCTATTTTACCTCTGGCGTTTAACTGGAAACAAGACATACCAAGAGTGGGGTTG

[1037] GAACATATTTCAAGCATTTGAAAAGAACTCGAGAATAGAGTCTGGATATGTTGGACTTAA

[1038] AGATgtaagtacaaactcagactcctaactctagttggtgattttgttaaagattaattc

[1039] atgtgaaagaatctgagcatccaacccaaaacttaaaaggcaatgggtggagtgatccag

[1040] gacattacccttaggggctgtttggttcaaaatatcccataatcttgggattagaacagg

[1041] gactataacctggataacttatcccaccttctatatgggataagggataagttattccaa

[1042] gattttggtataacaagaatatcaggtttagctaataactccaaccaaaacgggataagt

[1043] ttaatcccaaaatttataccgggataacccacctaatcccttgaaccaaacgacccctta

[1044] cataaccgatgaaagacaagtgtattctcggagtataacccgattctcgagatgttttgg

[1045] acatctatttttaacttgttggtgtttgtcccagGTTAATACCGGTGTGCAAGACGATAT

[1046] GATGCAAAGCTTTTTCCTTGCGGAGACTCTTAAATATCTCTACCTTCTTTTCTCACCCTC

[1047] TTCACTCATTCCACTAGATGAGTGGGTCTTCAACACAGAGGCCCACCCCATAAAAATTGT

[1048] TAGCCGGAATGATCGAGCAGTGAGTTCTGGAAGGTCAGTTGGACAAACCAAATCATATAG

[1049] GCGGCCACGGACCAGGAGAGAAGGCCGATTTGGTAATAAGTAGattcacaggtcatcatt

[1050] agtttagttgttgattgagaaggccaatttgagagttggaattcaagtgcagttttgctt

[1051] ggcacttcttcaaccagattgacgggattttcccccccaacattgataaaatgctcagta

[1052] taggagaagttatgagtatgtagcatagttatttagtttcctttttctatgttcccttaa

[1053] tactagcgactgtattctagtacaggtcataagggcatttggttgcgggtagctctacat

[1054] atttggggctggacgagtttttgtatatcatacctttttattttcgtttttcaaatacaa

[1055] caggtaaattctaatttcaaggactgttgacaacttttttgcacagttgcgctatggttg

[1056] atgatcaaatatatctcttgagtaacttttggttaaaaatagcacggtctacccagtttt

[1057] tagattggttattcaaaaatagccagcgtttgccaagtcattgaaaaataactactattt

[1058] tgctgctacagaaaccggtccaacataatatactggagtgtggtgcacctgtgtatgaac

[1059] ttccagcatattatgctggaccggtatattatactggaactccagtatattatgctggag

[1060] tatttttctggattttgaatagtgttttcgttcagatttatctttacataaaaagtggct

[1061] aaattttgattacttttgaaactgtgactattttttaatgaccacttgtaaatctgacta

[1062] tttttgaatttctccctaacttttgaggttagtgctgtgagcctgtctgggtaatattgg

[1063] gttggtttaatgtatctcagaatcgatgatagcaaaaatgatatcagttagctgctctaa

[1064] agggctgttatttaggagttagcaaatgtgtcctgaattttagttgtccagtttaatttt

[1065] tcgggacataaatattctgaattgtcctcaaattaagatttttagtttaagacaaaataa

[1066] gtattgactaatatttaaataaaaaccttaagaatggatgtttgtgtaattctctcctgg

[1067] agcttgttaagtcgcattcacatactattttacgttactcc

[1068] SEQ ID NO:92(NtMNS2cDNA序列)

[1069] ATGGGGAGGAGTAGATCGTCCGGCAATAGGTGGAGGTACATCAATCCATCTTACTATTTG

[1070] AAACGGCCTATGCGTCTCGCATTGCTTTTCATTGTTTTTGTATTTGGTACTTTCTTCTTT

[1071] TGGGATCGACAAACTTTAGTCCGAGATCACCAGGAAGAGATCTCTAAGTTGCATGAAGAA

[1072] GTGATACGGTTGCAAAATCTGCTGGAAGAGTTGAAGGATGGTCGAGGTATATCAGGTGAA

[1073] AAGATGAATTTTAGTCGCAGTGGTGGTGATGTGGTGAAGAAAAAGGATTTCGCTGATGAC

[1074] CCCATTGATGCTCAACGAAGAGAAAAAGTGAAAGATGCTATGCTTCATGCCTGGAGTTCA

[1075] TATGAAAAATATGCATGGGGCCATGATGAACTTCAGCCACAAACAAAGAAGGGTGTTGAC

[1076] AGTTTTGGTGGTCTTGGGGCAACATTAATAGATTCTCTTGACACACTATATATCATGGGC

[1077] CTGGATGAGCAGTTTCAGAGAGCTAGAGAGTGGGTTGCAAGCTCCTTGGATTTCAACAAG

[1078] AATTATGATGCCAGTGTTTTTGAGACAACCATAAGAGTTGTAGGTGGACTTCTTAGTGCA

[1079] TATGATCTCTCTGGTGATAAGCTTTTCCTTGATAAGGCTAAAGATATTGCTGACAGACTG

[1080] TTGCCTGCATGGAATACACCATCTGGCATCCCTTACAACATTATCAACTTGTCACATGGG

[1081] AATCCACATAATCTTGGGTGGACAGGGGGTAATAGTATCCTGGCAGATTCTGCCTCTGAG

[1082] CAGCTTGAATTTATTGCTCTTTCGCAACGGACAGGAGACTCAAAGTATCAACAGAAGGTG

[1083] GAGAATGTTATCTTAGAACTTAATAGAACTTTTCCAGATGATGGTTTGCTTCCAATACAC

[1084] ATTAATCCCGAGAGAGGGACAACGTCATACTCCACTATAACGTTTGGGGCCATGGGGGAC

[1085] AGCTTTTATGAATATTTACTCAAGGCCTGGATACAAGGAAACAAAACAGCTGCTGTGGGA

[1086] CACTACAGAAAAATGTGGGAGACATCAATGAAAGGTCTTTTAAGCTTGGTGCGGAGGACT

[1087] ACCCCATCATCTTTTGCTTATATTGGTGAGAAGATCGGAAGTTCTTTAAATGACAAGATG

[1088] GATGAACTTGCATGCTTCGCTCCAGGAATGTTAGCTTTAGGGTCGTCTGGTTATGGTCCT

[1089] GACGAGTCTCAGAAGTTCTTATCACTGGCAGAAGAGCTTGCTTGGACTTGCTATAACTTC

[1090] TACCAGTCAACACCTACAAAATTGGCAGGAGAAAACTATTTCTTTAATGATGACGGGCAG

[1091] GATATGACTGTGGGCACATCGTGGAACATACTAAGGCCAGAAACGGTTGAGTCTCTATTT

[1092] TACCTCTGGCGTTTAACTGGAAACAAGACATACCAAGAGTGGGGTTGGAACATATTTCAA

[1093] GCATTTGAAAAGAACTCGAGAATAGAGTCTGGATATGTTGGACTTAAAGATGTTAATACC

[1094] GGTGTGCAAGACGATATGATGCAAAGCTTTTTCCTTGCGGAGACTCTTAAATATCTCTAC

[1095] CTTCTTTTCTCACCCTCTTCACTCATTCCACTAGATGAGTGGGTCTTCAACACAGAGGCC

[1096] CACCCCATAAAAATTGTTAGCCGGAATGATCGAGCAGTGAGTTCTGGAAGGTCAGTTGGA

[1097] CAAACCAAATCATATAGGCGGCCACGGACCAGGAGAGAAGGCCGATTTGGTAATAAGTAG

[1098] SEQ ID NO:93(NtMNS2蛋白质序列)

[1099] MGRSRSSGNRWRYINPSYYLKRPMRLALLFIVFVFGTFFFWDRQTLVRDHQEEISKLHEE

[1100] VIRLQNLLEELKDGRGISGEKMNFSRSGGDVVKKKDFADDPIDAQRREKVKDAMLHAWSS

[1101] YEKYAWGHDELQPQTKKGVDSFGGLGATLIDSLDTLYIMGLDEQFQRAREWVASSLDFNK

[1102] NYDASVFETTIRVVGGLLSAYDLSGDKLFLDKAKDIADRLLPAWNTPSGIPYNIINLSHG

[1103] NPHNLGWTGGNSILADSASEQLEFIALSQRTGDSKYQQKVENVILELNRTFPDDGLLPIH

[1104] INPERGTTSYSTITFGAMGDSFYEYLLKAWIQGNKTAAVGHYRKMWETSMKGLLSLVRRT

[1105] TPSSFAYIGEKIGSSLNDKMDELACFAPGMLALGSSGYGPDESQKFLSLAEELAWTCYNF

[1106] YQSTPTKLAGENYFFNDDGQDMTVGTSWNILRPETVESLFYLWRLTGNKTYQEWGWNIFQ

[1107] AFEKNSRIESGYVGLKDVNTGVQDDMMQSFFLAETLKYLYLLFSPSSLIPLDEWVFNTEA

[1108] HPIKIVSRNDRAVSSGRSVGQTKSYRRPRTRREGRFGNK*

[1109] SEQ ID NO:94(NtMNS1a cDNA序列)

[1110] ATGGCGAGGAGTAGATCGTCTTCCACTACTTTCAGGTACATTAATCCGGCTTACTATCTGAAAC

[1111] GGCCAAAGCGTCTGGCTTTGCTCTTCATCGTTTTTGTCTTCGCCACCTTCTTCTTTTGGGATCG

[1112] ACAAACTTTAGTCCGTGATCATCAGGAAGAGATCTCTAAGTTGAATCATGAAGTGACGCAATTG

[1113] CGAAATCTGCTGGAAGATTTGAAGAATGGTCGAGTCATGCCAGATAAAAAGATGAAATCTAGTG

[1114] GCAAAGGTGGTCATGCAGCAAAAAATATGGATTCACCAGATAATATCCTTGATGCTCAGCGAAG

[1115] GGAGAAAGTGAAAGATGCTATGCTTCATGCTTGGAGTTCTTATGAAAAATATGCATGGGGTCAT

[1116] GATGAATTACAGCCGCAGTCAAAGAATGGTGTTGACAGTTTTGGTGGTCTTGGAGCAACCTTAA

[1117] TAGATTCTCTTGACACACTATATATCATGGGCCTGGATGAGCAGTTTCAGAGAGCTAGAGAATG

[1118] GGTTGCAAACTCCTTGGATTTCAACAAGAACTATGATGCAAGTGTTTTTGAGACAACCATAAGG

[1119] GTTGTAGGTGGGCTTCTTAGTACGTACGATCTATCTGGTGATAAGCTTTTCCTTGATAAGGCTC

[1120] AAGACATTGCTGACAGATTGTTGCCCGCATGGAATACAGAATCTGGAATCCCTTACAACATTAT

[1121] CAACTTGGCAAATGGGAATCCACATAACCCTGGGTGGACAGGGGGTGATAGTATCCTGGCAGAT

[1122] TCTGGTACTGAGCAGCTTGAGTTTATTGCTCTTTCGCAGAGGACAGGAGACCCAAAATATCAAC

[1123] AAAAGGTGGAGAATGTTATCTTAGAACTTAACAAAACTTTTCCAGATGATGGTTTGCTTCCAAT

[1124] ATACATTAATCCACATAAAGGCACAACATCATACTCAACTATAACATTTGGGGCAATGGGCGAC

[1125] AGCTTTTATGAATATTTACTCAAGGTCTGGATACAAGGAAACAGAACTGCTGCTGTGAGTCATT

[1126] ATAGGAAAATGTGGGAGACATCAATGAAAGGTCTTTTAAGCTTGGTCCGGAGAACAACTCCTTC

[1127] GTCTTTTGCATATATTTGCGAGAAGATGGGAAGTTCTTTAAATGACAAGATGGATGAACTTGCA

[1128] TGCTTTGCTCCTGGGATGTTAGCTTTAGGATCATCTGGTTATAGCCCTAATGAGGCTCAGAAGT

[1129] TCTTATCACTGGCTGAGGAGCTTGCTTGGACTTGCTATAATTTTTATCAGTCAACACCTACAAA

[1130] ACTGGCAGGAGAGAACTATTTTTTTAATGCCGGCCAAGATATGAGTGTGGGCACATCATGGAAT

[1131] ATATTAAGGCCAGAGACAGTTGAGTCGCTGTTTTACCTCTGGCGTTTAACAGGAAACAAGACAT

[1132] ACCAAGAGTGGGGTTGGAACATATTTCAAGCATTTGAAAAGAACTCAAGGATAGAATCTGGATA

[1133] TGTTGGACTTAAAGATGTCAACACTGGTGTCAAAGACAATATGATGCAAAGCTTCTTTCTTGCG

[1134] GAGACTTTTAAATATCTCTATCTTCTTTTTTCACCCTCATCAGTAATCTCTCTAGATGAGTGGG

[1135] TTTTTAACACAGAAGCCCACCCCATAAAAATTGTTACCCGGAATGATCGTGCTATGAATTCTGG

[1136] AGGGTCAGGTGGACGGCAAGAATCAGATAGGCAATCACGAACCAGGAAAGAAGATATATCTGAT

[1137] ACAGAGTTTAAGAAAGGACTTTAA

[1138] SEQ ID NO:95(NtMNS1a蛋白质序列)

[1139] MARSRSSSTTFRYINPAYYLKRPKRLALLFIVFVFATFFFWDRQTLVRDHQEEISKLNHEVTQLR

[1140] NLLEDLKNGRVMPDKKMKSSGKGGHAAKNMDSPDNILDAQRREKVKDAMLHAWSSYEKYAWGHDE

[1141] LQPQSKNGVDSFGGLGATLIDSLDTLYIMGLDEQFQRAREWVANSLDFNKNYDASVFETTIRVVG

[1142] GLLSTYDLSGDKLFLDKAQDIADRLLPAWNTESGIPYNIINLANGNPHNPGWTGGDSILADSGTE

[1143] QLEFIALSQRTGDPKYQQKVENVILELNKTFPDDGLLPIYINPHKGTTSYSTITFGAMGDSFYEY

[1144] LLKVWIQGNRTAAVSHYRKMWETSMKGLLSLVRRTTPSSFAYICEKMGSSLNDKMDELACFAPGM

[1145] LALGSSGYSPNEAQKFLSLAEELAWTCYNFYQSTPTKLAGENYFFNAGQDMSVGTSWNILRPETV

[1146] ESLFYLWRLTGNKTYQEWGWNIFQAFEKNSRIESGYVGLKDVNTGVKDNMMQSFFLAETFKYLYL

[1147] LFSPSSVISLDEWVFNTEAHPIKIVTRNDRAMNSGGSGGRQESDRQSRTRKEDISDTEFKKGL*

[1148] SEQ ID NO:96(NtMNS1b cDNA序列)

[1149] ATGGCGAGGAGTAGATCGTCTTCCACTACTTTCAGGTACATTAATCCGGCTTACTATCTGAAACG

[1150] GCCAAAGCGTCTGGCTTTGCTCTTCATCGTTTTTGTTTTCGCCACCTTCTTCTTTTGGGATCGAC

[1151] AAACTTTAGTCCGTGATCATCAGGAAGAGATCTCTAAGTTGAATGATGAAGTGATGAAATTGCGA

[1152] AATCTGCTGGAAGATTTGAAGAATGGTCGAGTCATGCCAGGTGAAAAGATGAAATCTAGTGGCAA

[1153] AGGTGGTCATGCAGCAAAAAATATGGATTCACCAGATAATATCCTTGATGCTCAGCGAAGGGAGA

[1154] AAGTGAAAGATGCTATGCTTCATGCTTGGAGTTCTTATGAAAAATATGCATGGGGTCATGATGAA

[1155] TTACAGTCAAAGAATGGTGTTGACAGTTTTGGTGGTCTTGGAGCAACCTTAATAGATTCTCTTGA

[1156] CACACTATATATCATGGGCCTGGATGAGCAGTTTCAGAGAGCTAGAGAGGTTGTAGGTGGGCTTC

[1157] TTAGTACGTATGATCTATCTGGTGATAAGCTTTTCCTTGATAAGGCTCAAGACATTGCTGACAGA

[1158] TTGTTGCCCGCATGGAATACAGAATCTGGAATCCCTTACAACACTATCAACTTGGCTCATGGGAA

[1159] TCCACATAACCCTGGGTGGACAGGGGGTGATAGTATCCTGGCAGATTCTGGTACTGAGCAGCTTG

[1160] AGTTTATTGCTCTTTCGCAGAGGACAGGAGACCCAAAATATCAACAAAAGGTGGAGAATGTTATC

[1161] TTGGAACTTAACAAAACTTTTCCAGAGGATGGTTTGCTTCCAATATACATTAATCCACATAAAGG

[1162] CACAACATCATACTCAACTATAACATTTGGGGCAATGGGCGACAGCTTTTATGAATATTTACTCA

[1163] AGGTCTGGATACAAGGAAACAGAACTGCTGCTGTGAGTCATTATAGGAAAATGTGGGAGACATCA

[1164] ATGAAAGGTCTTTTAAGCTTGGTTCGGAGAACGACTCCTTCGTCTTTTGCATATATTTGCGAGAA

[1165] GATGGGAAGTTCTTTAAATGACAAGATGGATGAACTTGCATGCTTTGCTCCTGGGATGTTAGCTT

[1166] TAGGATCATCTGGTTATAGCCCTAATGAGGCTCAGAAGTTCTTATCACTGGCTGAGGAGCTTGCT

[1167] TGGACTTGCTATAACTTTTACCAGTCAACACCTACAAAACTGGCAGGAGAGAACTATTTTTTTAA

[1168] TGCCGGCCAGGACATGAGTGTGGGCACATCATGGAATATATTAAGGCCAGAGACAGTTGAGTCGC

[1169] TGTTTTACCTCTGGCGTTTAACAGGAAACAAGACATACCAAGAGTGGGGTTGGAACATATTTCAA

[1170] GCATTTGAAAAGAATTCAAGGATAGAATCTGGATATGTTGGACTTAAAGATGTCAACACTGGTGT

[1171] CAAAGACAATATGATGCAAAGCTTCTTTCTTGCGGAGACTCTTAAATATCTCTATCTTCTTTTTT

[1172] CACCCTCATCAGTAATATCCCTAGATGAGTGGGTTTTTAACACAGAAGCCCACCCCATAAAAATT

[1173] GTTACCCGGAATGATCATGCTATGAGTTCTGGAGGTTCAGGTGGACGGCAAGAATCAGATAGGCA

[1174] ATCACGAACCAGGAAAGAAGGAGATTGCAATTTTTGCCGGCAGCTCCACATTTTTGGGCTTGATG

[1175] AGCAAATTGCTAGTCGCACCTAA

[1176] SEQ ID NO:97(NtMNS1b蛋白质序列)

[1177] MARSRSSSTTFRYINPAYYLKRPKRLALLFIVFVFATFFFWDRQTLVRDHQEEISKLNDEVMKLR

[1178] NLLEDLKNGRVMPGEKMKSSGKGGHAAKNMDSPDNILDAQRREKVKDAMLHAWSSYEKYAWGHDE

[1179] LQSKNGVDSFGGLGATLIDSLDTLYIMGLDEQFQRAREVVGGLLSTYDLSGDKLFLDKAQDIADR

[1180] LLPAWNTESGIPYNTINLAHGNPHNPGWTGGDSILADSGTEQLEFIALSQRTGDPKYQQKVENVI

[1181] LELNKTFPEDGLLPIYINPHKGTTSYSTITFGAMGDSFYEYLLKVWIQGNRTAAVSHYRKMWETS

[1182] MKGLLSLVRRTTPSSFAYICEKMGSSLNDKMDELACFAPGMLALGSSGYSPNEAQKFLSLAEELA

[1183] WTCYNFYQSTPTKLAGENYFFNAGQDMSVGTSWNILRPETVESLFYLWRLTGNKTYQEWGWNIFQ

[1184] AFEKNSRIESGYVGLKDVNTGVKDNMMQSFFLAETLKYLYLLFSPSSVISLDEWVFNTEAHPIKI

[1185] VTRNDHAMSSGGSGGRQESDRQSRTRKEGDCNFCRQLHIFGLDEQIASRT*

[1186] SEQ ID NO:98(NtMan1.4cDNA序列)

[1187] ATGGGGAGGAGTAGATCGTCCACCAATAGGTGGAGGTACATCAATCCATCTTACTATTTGAAACG

[1188] CCCCAAGCGTCTCGCATTGCTTTTCATTGTTTTCGTATTCGGTACATTCTTCTTTTGGGATCGAC

[1189] AAACGTTAGTCCGAGACCACCAGGAAGAGATCTCTAAGTTGCATGAAGAAGTGATACGGTTGCAA

[1190] AATCTGCTGGAAGAGTTGAAGAATGGTCGAGGTGTATCGGGTGAAAAGGTGAATTTTAGTCGCAC

[1191] TGGTGGTGATGTGCTGAAGAAAAAGGATTTCGCTGAAGACCCCATTGATGCTCAGCGAAGAGAAA

[1192] AAGTGAAAGATGCTATGCTTCACGCCTGGAGTTCATATGAAAAATATGCCTGGGGCCACGATGAA

[1193] CTTCAGCCACAAACAAAGAAGGGTGTTGACAGTTTTGGTGGTCTTGGGGCCACATTAATAGATTC

[1194] TCTTGACACACTATATATCATGGGCCTGGATGAGCAGTTTCAGAGAGCTAGAGAGTGGGTTGCAA

[1195] GCTCATTGGATTTCAACAAGAATTATGATGCCAGTGTTTTTGAGACAACCATAAGAGTTGTTGGT

[1196] GGACTTCTTAGTGCGTATGATCTCTCTGGTGATAAGCTTTTCCTTGATAAGGCTAAAGATATTGC

[1197] TGACAGACTGTTGCCTGCATGGAATACACCATCTGGCATCCCTTACAACATTATCAACTTGTCAC

[1198] ATGGAAATCCGCATAATCCTGGGTGGACAGGGGGTAATAGTATCCTGGCAGATTCTGCCTCTGAG

[1199] CAGCTTGAATTTATTGCTCTTTCGCAAAGGACAGGAGACTCAAAGTATCAACAGAAGGTGGAGAA

[1200] TGTTATCGTAGAACTTAATAGAACTTTTCCAGTTGATGGTTTGCTTCCAATACACATTAATCCCG

[1201] AGAGAGGGACAACGTCATACTCCACTATAACATTTGGGGCCATGGGGGACAGCTTTTATGAATAT

[1202] TTACTCAAGGTCTGGATACAAGGAAACAAAACAGCTGCTGTGGGACACTACAGAAAAATGTGGGA

[1203] GACATCAATGAAAGGCCTTTTAAGCTTGGTGCGGAGGACTACCCCATCATCTTTTGCTTATATTG

[1204] GTGAGAAGATCGGAAGTTCTTTAAATGACAAGATGGATGAACTTGCATGCTTCGCTCCAGGAATG

[1205] TTAGCTTTAGGGTCGTCTGGTTATGGTCCTGACGAGTCTCAGAAGTTCTTATCACTCGCAGAAGA

[1206] GCTTGCTTGGACTTGCTATAACTTCTACCAGTCAACACCTTCAAAATTGGCAGGAGAAAACTATT

[1207] TCTTTAATGATGATGGGCAGGATATGACCGTGGGCACATCGTGGAACATACTAAGGCCAGAAACG

[1208] GTTGAGTCTCTGTTTTACCTCTGGCGTTTAACTGGAAACAAGACATACCAAGAGTGGGGTTGGAA

[1209] CATATTTCAAGCATTTGAAAAGAACTCGAGAATAGAGTCTGGATATGTTGGACTTAAAGATGTTA

[1210] ATACCGGTGTGCAAGACAATATGATGCAAAGCTTTTTCCTTGCGGAGACTCTTAAATATCTCTAC

[1211] CTTCTTTTCTCACCCTCTTCAATCATTCCACTAGATGAGTGGGTCTTCAACACAGAGGCCCACCC

[1212] CATAAAAATTGTTAGCCGGAATGATCCAGCAGTCAGTTCTGGAAGGTCAGTTGGACAAACAAAAT

[1213] CATATAGGCGGCCACGGACCAGGAGAGAAGGCCGATTTGGTAATAAGTAG

[1214] SEQ ID NO:99(NtMan1.4蛋白质序列)

[1215] MGRSRSSTNRWRYINPSYYLKRPKRLALLFIVFVFGTFFFWDRQTLVRDHQEEISKLHEEVIRLQ

[1216] NLLEELKNGRGVSGEKVNFSRTGGDVLKKKDFAEDPIDAQRREKVKDAMLHAWSSYEKYAWGHDE

[1217] LQPQTKKGVDSFGGLGATLIDSLDTLYIMGLDEQFQRAREWVASSLDFNKNYDASVFETTIRVVG

[1218] GLLSAYDLSGDKLFLDKAKDIADRLLPAWNTPSGIPYNIINLSHGNPHNPGWTGGNSILADSASE

[1219] QLEFIALSQRTGDSKYQQKVENVIVELNRTFPVDGLLPIHINPERGTTSYSTITFGAMGDSFYEY

[1220] LLKVWIQGNKTAAVGHYRKMWETSMKGLLSLVRRTTPSSFAYIGEKIGSSLNDKMDELACFAPGM

[1221] LALGSSGYGPDESQKFLSLAEELAWTCYNFYQSTPSKLAGENYFFNDDGQDMTVGTSWNILRPET

[1222] VESLFYLWRLTGNKTYQEWGWNIFQAFEKNSRIESGYVGLKDVNTGVQDNMMQSFFLAETLKYLY

[1223] LLFSPSSIIPLDEWVFNTEAHPIKIVSRNDPAVSSGRSVGQTKSYRRPRTRREGRFGNK★

[1224] 保藏：

[1225] 以下种子样品在2011年1月6日依据布达佩斯条约的条款以菲利普莫里斯生产公司（Philip Morris Products S.A）的名义保藏于NCIMB，Ferguson Building，
Craibstone Estate，Bucksburn，阿伯丁AB219YA，苏格兰，英国：

[1226]PM种子系名称保藏日期登录号
PM016 2011年1月6日NCIMB41798
PM021 2011年1月6日NCIMB41799
PM092 2011年1月6日NCIMB41800
PM102 2011年1月6日NCIMB41801
PM132 2011年1月6日NCIMB41802
PM204 2011年1月6日NCIMB41803
PM205 2011年1月6日NCIMB41804
PM215 2011年1月6日NCIMB41805
PM216 2011年1月6日NCIMB41806
PM217 2011年1月6日NCIMB41807

[1227]

[1228] 关于保藏的微生物或其它生物材料的说明

[1229] （PCT实施细则第13条之二）

[1230]

[1231]

[1232] PCT/RO/134表（1998年7月；2004年1月重印）

[1233]

[1234] 关于保藏的微生物或其它生物材料的说明

[1235] （PCT实施细则第13条之二）

[1236]

[1237]

[1238] PCT/RO/134表（1998年7月；2004年1月重印）

[1239]

[1240] 关于保藏的微生物或其它生物材料的说明

[1241] （PCT实施细则第13条之二）

[1242]

[1243]

[1244] PCT/RO/134表（1998年7月；2004年1月重印）

[1245]

[1246] 关于保藏的微生物或其它生物材料的说明

[1247] （PCT实施细则第13条之二）

[1248]

[1249]

[1250] PCT/RO/134表（1998年7月；2004年1月重印）

[1251]

[1252] 关于保藏的微生物或其它生物材料的说明

[1253] （PCT实施细则第13条之二）

[1254]

[1255]

[1256] PCT/RO/134表（1998年7月；2004年1月重印）

[1257]

[1258] 关于保藏的微生物或其它生物材料的说明

[1259] （PCT实施细则第13条之二）

[1260]

[1261]

[1262] PCT/RO/134表（1998年7月；2004年1月重印）

[1263]

[1264] 关于保藏的微生物或其它生物材料的说明

[1265] （PCT实施细则第13条之二）

[1266]

[1267]

[1268] PCT/RO/134表（1998年7月；2004年1月重印）

[1269]

[1270] 关于保藏的微生物或其它生物材料的说明

[1271] （PCT实施细则第13条之二）

[1272]

[1273]

[1274] PCT/RO/134表（1998年7月；2004年1月重印）

[1275]

[1276] 关于保藏的微生物或其它生物材料的说明

[1277] （PCT实施细则第13条之二）

[1278]

[1279]

[1280] PCT/RO/134表（1998年7月；2004年1月重印）

[1281]

[1282] 关于保藏的微生物或其它生物材料的说明

[1283] （PCT实施细则第13条之二）

[1284]

[1285]

[1286] PCT/RO/134表（1998年7月；2004年1月重印）

标题	发布/更新时间	阅读量
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