寡肽化合物及其应用
阅读：1029发布：2020-11-20
专利汇可以提供寡肽化合物及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种在 治疗 中使用的寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述寡肽化合物的序列，其中，所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，其中X1和X1′独立选自 碱 性 氨 基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组；并且其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个：(i)所述寡肽化合物包含至少一个 信号 序列；(ii)所述PCNA相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]-[K/R](SEQ ID NO.27)。特别是，所述治疗可以是其中希望抑制细胞生长的病症或病况(例如快速增生性病症)的治疗，或者涉及细胞抑制治疗(例如骨髓细胞清除)的治疗。在某些方面，本发明的化合物就其性质可以用作细胞 抑制剂 。在本发明的其他方面，包含所述基序的寡肽化合物可以与细胞抑制剂联合使用，或者与 放射性 治疗联合使用。，下面是寡肽化合物及其应用专利的具体信息内容。
1.一种在治疗中使用的寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述寡肽化合物的序列，
其中，所述PCNA相互作用基序是
X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，
其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组；并且
其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个：
(i)所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；
(ii)所述PCNA相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]-[K/R](SEQ ID NO.27)。
2.一种在希望抑制细胞生长的病症或病况的治疗或者涉及细胞抑制治疗的治疗中使用的寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述寡肽化合物的序列，其中，所述PCNA相互作用基序是
X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，
其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组；并且
其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个：
(i)所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；
(ii)所述PCNA相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]-[K/R](SEQ ID NO.27)。
3.一种寡肽化合物或核酸分子在药物制备中的应用，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述寡肽化合物的序列，所述药物用于希望抑制细胞生长的病症或病况的治疗中或者用于涉及细胞抑制治疗的治疗中，其中，所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组；并且其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个：
(i)所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；
(ii)所述PCNA相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]-[K/R](SEQ ID NO.27)。
4.一种希望抑制细胞生长的病症或病况的治疗方法或涉及细胞抑制治疗的治疗方法，所述方法包括对需要治疗的受试对象施用寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述寡肽化合物的序列，其中，所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组；并且其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个：
(i)所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；
(ii)所述PCNA相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]-[K/R](SEQ ID NO.27)。
5.一种药物组合物，所述药物组合物包含寡肽化合物或核酸分子和至少一种药用可接受的载剂或赋形剂，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述寡肽化合物的序列，其中PCNA结合基序是
X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，
其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组；并且
其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个：
(i)所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；
(ii)所述PCNA相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]-[K/R](SEQ ID NO.27)。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述药物组合物以适合于以下施用方式的形式提供：口服、肠胃外、局部、直肠、生殖器、皮下、经尿道、经皮、鼻内、腹腔内、肌内和/或静脉内施用和/或吸入施用。
7.如权利要求1～6中任一项所述的寡肽化合物、应用、方法或药物组合物，其中所述寡肽化合物为进一步包含核定位信号序列和/或细胞穿透信号序列的构建体形式。
8.如权利要求7所述的寡肽化合物、应用、方法或药物组合物，其中所述构建体包含核定位信号序列和细胞穿透信号序列。
9.一种检测、诊断或监测希望抑制细胞生长的病症或病况的方法，所述方法包括检测含有PCNA相互作用基序的蛋白的表达水平和/或位置，其中所述蛋白的异常水平和/或位置指征所述病症或病况，其中，所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，
其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组。
10.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
(i)寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述PCNA相互作用基序的序列，其中所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，
其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组；和
(ii)细胞抑制剂。
11.一种产品，所述产品包含作为联合制剂的如下物质：
(i)寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述PCNA相互作用基序的序列，其中所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，
其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组；和
(ii)细胞抑制剂，
所述联合制剂同时、依次或分开用于希望抑制细胞生长的病症或病况的治疗或涉及细胞抑制治疗的治疗。
12.一种寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物或核酸分子与细胞抑制剂在希望抑制细胞生长的病症或病况的治疗或涉及细胞抑制治疗的治疗中联合使用，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述PCNA相互作用基序的序列，其中所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，
其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组。
13.一种寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物或核酸分子在放射性治疗、优选为希望抑制细胞生长的病症或病症的治疗或涉及放射性治疗的治疗中用作敏化剂，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述PCNA相互作用基序的序列，其中所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组。
14.一种体外分析方法，所述方法包括对细胞或细胞培养物施用寡肽化合物或核酸分子，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序，所述核酸分子包含编码所述PCNA相互作用基序的序列，其中所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组。
15.一种脂质体，所述脂质体包含：
(i)寡肽化合物，所述寡肽化合物包含PCNA相互作用基序；和/或
(ii)核酸分子，所述核酸分子包含编码所述PCNA相互作用基序的序列；
其中所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，
其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组。
16.如权利要求1～15中任一项所述的寡肽化合物、应用、方法、药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中所述核酸分子包含在载体中。
17.一种能够与PCNA相互作用的寡肽化合物，所述化合物包含基序
X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组，其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个：
(i)所述寡肽化合物包含至少一个信号序列；
(ii)所述PCNA相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]-[K/R](SEQ ID NO.27)，并且所述寡肽化合物包含至少11个氨基酸或等效亚基。
18.一种核酸分子，所述核酸分子编码具有或包含PCNA相互作用基序的肽，所述PCNA相互作用基序的序列为X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，
其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组；并且
其中所述肽的进一步特征在于以下至少一个：
(i)所述肽包含至少一个信号序列；
(ii)所述PCNA相互作用基序是[K/R]-F-[LIV]-[LIV]-[K/R](SEQ ID NO.27)。
19.一种载体，所述载体包含权利要求18所述的核酸分子。
20.如权利要求1～19中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、治疗方法、药物组合物、诊断方法、试剂盒、产品、体外方法或脂质体，其中，X2是芳香族氨基酸和/或X3和X3′是脂肪族氨基酸。
21.如权利要求1～20中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、治疗方法、药物组合物、诊断方法、试剂盒、产品、体外方法或脂质体，其中X1和X1′独立选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、鸟氨酸(Orn)、甲基赖氨酸(MeK)和乙酰基赖氨酸(AcK)；和/或
X2选自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、叔丁基甘氨酸、环己基丙氨酸、叔丁基苯丙氨酸、联苯基丙氨酸和三叔丁基色氨酸；和/或
X3和X3′独立选自亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、甲硫氨酸(M)和正亮氨酸(Nor)。
22.如权利要求1～21中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、治疗方法、药物组合物、诊断方法、试剂盒、产品、体外方法或脂质体，其中，X2不是F。
23.如权利要求1～22中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、治疗方法、药物组合物、诊断方法、试剂盒、产品、体外方法或脂质体，其中，所述PCNA相互作用基序是
[K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R](SEQ ID NO.28)；
[K/R]-[Y/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R](SEQ ID NO.29)；
[K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V/A]-[L/V/A]-[K/R](SEQ ID NO.30)；
[K/R]-[Y/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R](SEQ ID NO.31)；
[K/R]-[F/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R](SEQ ID NO.32)；
[K/R]-[F/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R](SEQ ID NO.33)；
[K/R]-[F/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R](SEQ ID NO.34)；
[K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R](SEQ ID NO.35)；
[K/R]-[Y/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R](SEQ ID NO.36)；或
[K/R]-F-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R](SEQ ID NO.37)。
24.如权利要求1～23中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、治疗方法或药物组合物，其中，所述PCNA相互作用基序具有如SEQ ID NO：2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 或 26所示的序列。
25.如权利要求1～6以及9～24中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述寡肽化合物包含信号序列。
26.如权利要求25所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述信号序列是核定位信号序列和/或细胞穿透信号序列。
27.如权利要求7、8或26中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述细胞穿透信号序列是HIV-TAT或穿透素或其片段或衍生物。
28.如权利要求1～27中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述寡肽化合物和/或核酸分子与细胞抑制剂联合、同时、分开或依次使用。
29.如权利要求1～28中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述寡肽化合物是融合蛋白或适体的一部分。
30.如权利要求1～29中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述寡肽化合物包含至少1、2、3、4或5个D-氨基酸、至少1、2、3、4或5个非编码氨基酸、至少1、2、3、4或5个二氨基酸和/或至少1、2、3、4或5个β-氨基酸。
31.如权利要求1～30中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述寡肽化合物包含至少5个并且不超过
200个亚基。
32.如权利要求1～31中任一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含至少15个核苷酸并且不超过800、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、
150、100或50个核苷酸。
33.如权利要求10～16或20～32中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、试剂盒或产品，其中，所述细胞抑制剂选自放线菌素D、BCNU(卡莫司汀)、卡铂、CCNU、喜树碱(CPT)、斑蝥素、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、柔红霉素、多烯紫杉醇、阿霉素、DTIC、表阿霉素、依托泊苷、吉非替尼、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、伊屋诺霉素、美法仑、甲氨蝶呤、丝裂霉素C(MMC)、米托蒽醌、巯基嘌呤、奥沙利铂、紫杉醇(他克唑)、PARP-1抑制剂、泰索帝、替莫唑胺(TZM)、替尼泊甙、托泊替康、曲奥舒凡、长春瑞滨、长春新碱、长春碱、5-氮胞苷、5，6-二氢-5-氮杂胞苷和5-氟尿嘧啶。
34.如权利要求10～16或20～32中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、试剂盒或产品，其中，所述细胞抑制剂是烷基化剂。
35.权利要求1～34中任一项所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其用于快速增生性病症的治疗或骨髓细胞清除术。
36.如权利要求35所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述快速增生性病症选自恶性、恶化前或非恶性的赘生性疾病、炎症、自身免疫性病症、血液病、皮肤病、病毒诱导性快速增生性病症、骨髓异变病症或骨髓增生性病症。
37.如权利要求36所述的寡肽化合物、核酸分子、载体、应用、方法、药物组合物、试剂盒、产品或脂质体，其中，所述快速增生性病症选自癌症、良性肿瘤、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、炎性肠道疾病、银屑病、瑞特综合征、毛发红糠疹、角质化病症的快速增生性变型、再狭窄、糖尿病性肾病、甲状腺增生、格雷夫氏病、良性前列腺增生、李-氟诺门提综合征、糖尿病性视网膜病变、周围性血管疾病、原位宫颈癌、家族性结肠息肉病、口腔粘膜白斑病、组织细胞增多病、瘢痕疙瘩、血管瘤、快速增生性动脉狭窄、炎性关节炎、表皮角化病、包括关节炎、疣和EBV诱导性疾病在内的丘疹鳞屑性出疹、瘢痕形成、多发性硬化、系统性红斑狼疮(SLE；狼疮)、重症肌无力、非恶性增生、肉芽肿、MGUS(重要性未知的单克隆丙种球蛋白病)、赘生性脑膜炎、真性红细胞增多症、硬化性黏液水肿、疹性黏蛋白沉积症、淀粉样变性和韦格纳肉芽肿。
38.一种用于诊断希望抑制细胞生长的病症或病况的试剂盒，所述试剂盒包含对PCNA相互作用基序具有特异性的抗体及其用于诊断所述病症或病况的使用说明书以及可选的检测底物，
其中，所述PCNA相互作用基序是X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，
其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组。
寡肽化合物及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及新型试剂、药物组合物及其在治疗中的应用，特别是希望或有利于减少或防止细胞增生或生长的任意治疗(例如在快速增生性疾病或者事实上任何需要或响应细胞抑制治疗的病况的治疗中)。 本发明基于增生性细胞核抗原(PCNA)和参与DNA修复、维护和细胞周期调控的各种蛋白的新型相互作用的鉴定以及随后对负责所述相互作用的新型五肽基序(称为APIM)的鉴定。 因此，更具体而言，本发明涉及包含所述基序并且能够与PCNA相互作用的肽及其模拟物、包含所述试剂的药物组合物、以及所述试剂在治疗特别是涉及如上所述的减少或防止细胞增生的治疗中的应用。 本发明还提供治疗方法，所述方法包括包含PCNA相互作用基序的试剂的使用(优选与细胞抑制剂(cytostatic agent)联合使用)。
背景技术
[0003] 细胞抑制剂是例如通过损伤DNA或通过干扰细胞复制机制来抑制或压制细胞生长和/或增殖(增生/复制)的试剂。 烷基化剂是一类细胞抑制剂，其中的一些用于临床目的或用于研究目的。
[0004] 烷基化剂通过改变N或O原子的碱基来导致DNA损伤。 这类损伤取决于试剂的类型，很多试剂导致特异性DNA修饰。 DNA损伤包括可能导致复制过程中编码错误和/或复制阻断然后双链断裂或跨损伤合成的烷基化加合和链间交联。
[0005] 人类和动物细胞具有各种DNA修复系统，包括碱基切除修复、核苷酸切除修复和错配修复。 一个例子是人类DNA氧化性脱甲基酶hABH2，其通过氧化性脱甲基化而将3-甲基胞嘧啶(3meC)转化为胞嘧啶和将1-甲基腺嘌呤(1meA)转化为腺嘌呤。
[0006] DNA修复和经细胞周期调控的DNA复制之间的密切配合对于基因组完整性是关键的。重要的是，在损伤存在的情况下，DNA修复停止，直到所述损伤修复为止，否则会产生变异并繁衍。 已知同时参与DNA复制和DNA修复的一种蛋白是增生性细胞核抗原(PCNA)。
[0007] PCNA是滑动夹(sliding clamp)蛋白家族的成员，其从细菌到高级真核动物在功能性上得到保留，并且它的主要功能是提供具有基因组复制所需的高持续合成性的复制性聚合酶。 在活的S期细胞中，以绿色荧光蛋白(GFP)标记的PCNA形成呈现出复制位点的明确位点(foci)。 因此它能够用作S期标记。
[0008] 参与细胞过程(例如DNA修复、染色质装配、后成重构和染色质重构、姐妹染色单体粘连、细胞周期控制和存活)很多蛋白位于含有超过十二个复制叉的所谓复制工厂中。 这些蛋白中有很多蛋白通过保守PCNA相互作用肽序列(称为PIP盒(QxxL/I/MxxF/DF/Y)，其中x可以是任意氨基酸)与PCNA相互作用。 使用肽展示文库确认了
一种称为KAx盒的替代性PCNA结合基序，但是该基序对体内PCNA相互作用的重要性
还没有得到证实。
一种称为KAx盒的替代性PCNA结合基序，但是该基序对体内PCNA相互作用的重要性
还没有得到证实。
[0009] 各种蛋白与PCNA相互作用，并且这些蛋白中的一些蛋白包括hABH2已经显示出与PCNA共同位于复制位点中。 然而，共定位本身并没有意味着共定位蛋白之间的有任何直接或间接的相互作用。 实际上，hABH2中PCNA结合基序(例如PIP盒或KAx盒)缺失说明hABH2不与PCNA相互作用。
发明内容
[0010] 在导致本发明的工作中，本发明人惊讶地发现，各种蛋白通过一种新型PCNA相互作用基序与PCNA相互作用。 在作为这些蛋白之一的hABH2中，该基序位于N末端。 本发明人确定该基序与PCNA的相互作用是必要和充分的(参见实施例1)。
[0011] 如下文实施例中所更为详细的说明，为了探讨该PCNA相互作用基序在烷基化损伤的DNA修复中的功能，将表达包含该基序的重组肽的细胞系暴露于各种剂量的MMS(甲磺酸甲酯)中，所述MMS是导致形成3-甲基胞嘧啶和1-甲基腺嘌呤的SN2烷
基化剂。发现包含该基序的重组肽的表达使细胞对MMS导致的DNA损伤敏感，表明包
含该基序的重组肽竞争性抑制PCNA与hABH2之间的相互作用。
基化剂。发现包含该基序的重组肽的表达使细胞对MMS导致的DNA损伤敏感，表明包
含该基序的重组肽竞争性抑制PCNA与hABH2之间的相互作用。
[0012] 还测试了包括导致其他类型DNA损伤的BCNU、替莫唑胺(TZM)和丝裂霉素c(MMC)在内的其他试剂，令人非常惊讶的是，本发明人发现包含该基序的重组肽也使
6
细胞对由这些试剂导致的损伤敏感。 这是完全没有预料到的，因为BCNU是O-氯乙
基化剂，其主要导致链间交联以及一些单碱基环加合物(1，N(6)乙醛腺嘌呤)，据报道
6
TZM是OG甲基化剂，而MMC导致通过CpG中的鸟嘌呤的N-烷基化而引起链间交联，
并且hABH2没有修复这些类型的DNA损伤。 相反，存在其它修复这类损伤的酶，例如
6
由TZM导致的损伤直接为O-甲基鸟嘌呤-DNA转移酶(MGMT)所修复。 这些发现表
明包含该基序的重组肽并非仅抑制hABH2与PCNA之间的相互作用，而可能涉及到其他蛋白，即其他蛋白可能通过该新型基序与PCNA相互作用。
6
细胞对由这些试剂导致的损伤敏感。 这是完全没有预料到的，因为BCNU是O-氯乙
基化剂，其主要导致链间交联以及一些单碱基环加合物(1，N(6)乙醛腺嘌呤)，据报道
6
TZM是OG甲基化剂，而MMC导致通过CpG中的鸟嘌呤的N-烷基化而引起链间交联，
并且hABH2没有修复这些类型的DNA损伤。 相反，存在其它修复这类损伤的酶，例如
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由TZM导致的损伤直接为O-甲基鸟嘌呤-DNA转移酶(MGMT)所修复。 这些发现表
明包含该基序的重组肽并非仅抑制hABH2与PCNA之间的相互作用，而可能涉及到其他蛋白，即其他蛋白可能通过该新型基序与PCNA相互作用。
[0013] 本发明人还发现，除了在来自ABH2敲除小鼠(即不具有ABH2的小鼠)的细胞系观察到的以外，包含该基序的重组肽的表达还增加了细胞抑制剂(具有MMS特异性)的细胞毒性效应，进一步表明包含该基序的重组肽具有更宽泛的效果，很可能抑制除了hABH2之外的其他蛋白。
[0014] 这些令人惊讶的发现使得本发明人提出包含PCNA结合基序的肽的治疗应用。
[0015] 本发明的所述新型PCNA结合基序(称为APIM)已经得到表征并且定义如下：
[0016] X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，
[0017] 其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组，优选非极性氨基酸。
[0018] 能够与PNCA相互作用的肽(或寡肽化合物)可能含有或包含这种肽(或序列)基序。 因此，本文公开了一种能够与PNCA相互作用并包含这种基序的寡肽化合物，该寡肽化合物可以代表本发明的某些方面。
[0019] 例如，在一个实施方式中，本发明可以提供了一种寡肽化合物，所述寡肽化合物能够与PCNA相互作用并且包含基序X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)，其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组，优选非极性氨基酸，其中所述寡肽化合物的进一步特征在于以下至少一个：
[0020] (i)所述寡肽化合物包含至少11个氨基酸或等效亚基；
[0021] (ii)X2不是苯丙氨酸；
[0022] (iii)所述寡肽化合物包含至少一个D-氨基酸；
[0023] (iv)所述寡肽化合物包含至少一条信号序列，即，将所述寡肽化合物导向特定位置的序列，例如导向细胞中的序列(例如将所述寡肽化合物导入细胞的细胞穿透序列)和/或导入特定细胞腔室的序列(例如将所述寡肽化合物导入核中的核定位信号)；和[0024] (iv)所述寡肽化合物包含基序[K/R]-F-[LIV]-[LIV]-[K/R](SEQ ID NO：27)。
[0025] 具体而言，在这个实施方式中，所述寡肽化合物包含核定位信号序列。 在另一个实施方式中，所述寡肽化合物包含细胞穿透序列(细胞穿透肽)。在另外一个实施方式中，所述寡肽化合物包含细胞穿透序列和核定位序列。
[0026] 因此可见，在此类实施方式中，本发明的化合物可以采取含有(即包含)包含如上所限定的PCNA相互作用基序和至少一个信号序列的寡肽化合物的构建体形式。 因此可见，在这个方面，本发明提供了一种构建体，所述构建体包含能够与PCNA相互作用并且包含基序X1X2X3X3′X1′(SEQ ID NO：1)以及至少一条信号序列的构建体，其中X1和X1′独立选自碱性氨基酸组，X2是亲脂性氨基酸，而X3和X3′独立选自不带电荷的氨基酸组且优选非极性氨基酸。
[0027] 如上所述，已经确定本发明的新型基序介导含有所述基序的寡肽化合物(例如肽)或蛋白与PCNA的相互作用。
[0028] 所述相互作用可以直接或间接地参与该基序与PCNA的直接结合，或者该基序可以间接结合，例如结合可以由其他分子介导。 因此，述及“PCNA相互作用”或“PCNA结合”可以包括任意形式的相互作用，并且包括直接和间接结合。
[0029] 本文中任意述及“基序”的情况应当理解为是指此处所限定的X1X2X3X3′X1′。
[0030] 优选的是，X1和X1′独立选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、鸟氨酸(Om)、甲基赖氨酸(MeK)和乙酰基赖氨酸(AcK)，更优选的是K、R和H，或者K和R。
[0031] X2优选为芳香族氨基酸，更优选的是，X2选自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、叔丁基甘氨酸、环己基丙氨酸、叔丁基苯丙氨酸、联苯基丙氨酸和三叔丁基色氨酸(在某些实施方式中，该列表可能排除F)，具体而言为F、W和Y，或者W和Y，F和Y，或者F和W，或者在一些具体实施方式中，X2可以是F、或W或Y。
[0032] X3和X3′优选为脂肪族氨基酸，并且可以例如独立选自亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、甲硫氨酸(M)和正亮氨酸(Nor)。
[0033] 优选的是，X3和X3′不同时为A，更优选的是，X3和X3′选自L、I、V和M，进一步优选选自L、I和V。
[0034] 在某些实施方式中，所述基序与PCNA的结合在X2为W或Y时可以得到改善。因此，在一个实施方式中，X2不是F。 在其他一些实施方式中，如上所述，X2可以是F。
[0035] 因此，本发明可以提供一种寡肽化合物，所述寡肽化合物包含基序[K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R](SEQ ID NO：28)，其中所述寡肽化合物能够与PCNA相互作用。
[0036] 在另一个实施方式中，所述基序限定如下：
[0037] [K/R]-[Y/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R](SEQ ID NO：29)。
[0038] 在另一个实施方式中，所述基序限定如下：
[0039] [K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R](SEQ ID NO：30)；
[0040] 在另一个实施方式中，所述基序限定如下：
[0041] [K/R]-[Y/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R](SEQ ID NO：31)；
[0042] 在另一个实施方式中，所述基序限定如下：
[0043] [K/R]-[F/W]-[L/I/V/A/M]-[L/I/V/A/M]-[K/R](SEQ ID NO：32)；
[0044] 在另一个实施方式中，所述基序限定如下：
[0045] [K/R]-[F/W]-[L/I/V/A]-[L/I/V/A]-[K/R](SEQ ID NO：33)；
[0046] 在另一个实施方式中，所述基序限定如下：
[0047] [K/R]-[F/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R](SEQ ID NO：34)；
[0048] 在另一个实施方式中，所述基序限定如下：
[0049] [K/R]-[F/Y/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R](SEQ ID NO：35)；
[0050] 在又一个实施方式中，所述基序限定如下：
[0051] [K/R]-[Y/W]-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R](SEQ ID NO：36)；或
[0052] 在又一个实施方式中，所述基序限定如下：
[0053] [K/R]-F-[L/I/V]-[L/I/V]-[K/R](SEQ ID NO：37)。
[0054] 所述寡肽化合物优选为经分离的化合物。
[0055] 在一个优选的实施方式中，所述化合物具有或包含序列RFLVK(SEQ IDNO：2)。 在其他优选实施方式中，所述寡肽化合物具有或包含选自以下序列的序
列：KFLLR(SEQ ID NO：3)、KYLLR(SEQ ID NO：4)、KWLLR(SEQ ID NO：
5)、KYILR(SEQ ID NO：6)、KYVLR(SEQ ID NO：7)、RFLLR(SEQ ID NO：8)、
RYLLR(SEQ ID NO：9)、RWLLR(SEQ ID NO：10)、RYILR(SEQ ID NO：11)、
RYVLR(SEQ ID NO：12)、RFLIR(SEQ ID NO：13)、RYLVR(SEQ ID NO：14)
RWLMR(SEQ ID NO：15)、RYVLR(SEQ ID NO：16)、RYVIR(SEQ ID NO：17)、
RWLVK(SEQ ID NO：18)、RYLVK(SEQ ID NO：19)、RWLIK(SEQ ID NO：20)、
RWIVK(SEQ ID NO：21)、RWVVK(SEQ ID NO：22)、RWAVK(SEQ ID NO：23)、
RYVVK(SEQ ID NO：24)、RYLIK(SEQ ID NO：25)或RYLMK(SEQ ID NO：26)。这
些具体序列通过举例方式列出，但是它们并非旨在限定本发明的范围。
列：KFLLR(SEQ ID NO：3)、KYLLR(SEQ ID NO：4)、KWLLR(SEQ ID NO：
5)、KYILR(SEQ ID NO：6)、KYVLR(SEQ ID NO：7)、RFLLR(SEQ ID NO：8)、
RYLLR(SEQ ID NO：9)、RWLLR(SEQ ID NO：10)、RYILR(SEQ ID NO：11)、
RYVLR(SEQ ID NO：12)、RFLIR(SEQ ID NO：13)、RYLVR(SEQ ID NO：14)
RWLMR(SEQ ID NO：15)、RYVLR(SEQ ID NO：16)、RYVIR(SEQ ID NO：17)、
RWLVK(SEQ ID NO：18)、RYLVK(SEQ ID NO：19)、RWLIK(SEQ ID NO：20)、
RWIVK(SEQ ID NO：21)、RWVVK(SEQ ID NO：22)、RWAVK(SEQ ID NO：23)、
RYVVK(SEQ ID NO：24)、RYLIK(SEQ ID NO：25)或RYLMK(SEQ ID NO：26)。这
些具体序列通过举例方式列出，但是它们并非旨在限定本发明的范围。
[0056] 在一个优选的实施方式中，本发明寡肽化合物还包含将所述基序靶向特定细胞类型、有助于该化合物进入细胞、和/或将所述化合物定位于特定的胞内腔室(优选为细胞核)的信号序列。
[0057] 因此，所述信号序列可以被看作是任何起到将所述寡肽化合物定位或换言之导向、转运或运输到任何所需位置(例如，任何所需的细胞位置或亚细胞位置)的作用的序列。 在一些优选的实施方式中，所需位置是细胞(即细胞内部)和/或细胞核。
[0058] 因此，所述信号序列可以是起到将所述寡肽化合物运输到细胞中或者跨越细胞膜(即进入细胞内部)的作用的序列。 因此，所述信号序列可以是一条所谓的“细胞穿透”序列(或者更具体地称为“细胞穿透肽”)，在本领域中也称为蛋白转导域(PTD)或蛋白转导序列。
[0059] 因此，如上所述，本发明的一个优选的实施方式是一种构建体，所述构建体包含：(i)包含如本文所限定的APIM基序(即PCNA相互作用基序)的寡肽化合物，和(ii)细胞穿透序列(更具体而言是细胞穿透肽)。
[0060] 细胞穿透肽(CPP)技术在近10年发展很快，已知有很多细胞穿透肽并且在很多文献中有描述，实际上，许多此类肽可以商购获得。 细胞穿透肽在尺寸、序列和电荷上、实际上是在它们的作用机制(对于一些肽目前还未知，而对于其它肽目前还没有充分阐明)上可以有很大变化，但是都具有跨越细胞质膜并将所连接或联合的部分(所谓的“货物”)输送到细胞质中、甚至在一些情况中输送至细胞核中的共同能力。因此，CPP是基于肽的输送载体。
[0061] CPP可以衍生自天然存在的能够转运跨越细胞膜的蛋白(例如果蝇同源异型框蛋白触足蛋白(Antennapedia)(一种转录因子))、病毒蛋白(例如HIV-1转录因子TAT以及来自HSV-1的衣壳蛋白VP22)，或者它们可以源自合成，例如来自嵌合蛋白或合成多肽(例如多精氨酸)。 如上所述，负责转导效应的机制不是单一的，因此CPP的设计可以基于不同的结构和序列。 细胞穿透肽可以参阅Jarver等，2006，Biochimica et Biophysica Acta1758，第260-263页，并且下表2列出了各种代表性肽。US 6,645,501进一步描述了各种可以使用的细胞穿透肽。
[0062] 表2
[0063]
[0064]
[0065]
[0066] 触足蛋白衍生的CPP(Antp类)代表特别受关注的一类，其基于如表2所示的约16个氨基酸穿透素(penetratin)序列，并且对应于触足蛋白的第三环，并且据显示负责蛋白的转运。 穿透素作为输送载具(特别包括药物应用)得到了深入的发展，并且已经提出并说明了很多穿透素衍生物和修饰序列。 具体可以参考WO 91/1891、WO 00/1417、WO 00/29427、WO2004/069279和US 6,080,724。因此，穿透素的所述16个氨基酸序列被可以修饰或截短，或者可以对该肽进行化学修饰，或可以制备逆向、反向或逆反向类似物同时保留细胞穿透活性。
[0067] 可以有利地利用的另一组细胞穿透肽基于HIV-TAT序列，HIV-TAT及其片段代表优选用于本发明的一类CPP。 在US 5,656,122中描述有各种基于TAT的CPP。 如在下文的实施例中使用的一个示例性HIV-TAT肽是RKKRRQRRR(SEQ ID.No.71)，但是容易理解的是可以使用更长或更短的TAT片段。
[0068] 如上所述，对于所有CCP而言，没有共同的特定结构特征或序列基序。 然而，可以通过特定特征(例如双亲性的带净正电荷的肽)来鉴定各类CPP。 其它CPP组可以具有显示出高α-螺旋含量的结构。 另外一组可以是具有高碱性氨基酸含量特征的肽。因此CPP可以是或可以包含诸如精氨酸等碱性氨基酸的寡聚体，例如5至20、6至15、或
6至12个R残基，例如R7(SEQ ID NO：70)、R8(SEQ ID NO：72)或R11(SEQ ID NO：
73)或者QSR8(SEQ ID NO：74)。
6至12个R残基，例如R7(SEQ ID NO：70)、R8(SEQ ID NO：72)或R11(SEQ ID NO：
73)或者QSR8(SEQ ID NO：74)。
[0069] 富含脯氨酸的双亲性肽是另一类CPP，此类肽的特征在于具有来自脯氨酸的吡咯烷环，其描述见Pujals等，2008，Advanced Drug Delivery Reviews 60，第473-484页。
[0070] 其他成功开发的CPP包括pVEC(Elmquist等，2003，Biol.Chem 384，第387-393页；Holm等，2005，Febs Lett.579，第5217-5222页)和降钙素衍生肽(Krauss等，2004，Bioorg.Med.Chem.Lett.，14第51-54页)。
[0071] 可以商购获得的CPP包括基于Pep-1肽的Chariot(Active Motif，法国)、基于protegrin肽PG-I的Syn-B载体(Syntem，法国)、和来自美国Genospectra的基于MPG肽的Express-si Delivery。
[0072] 除了可以公开获得和已报道的CPP之外，可以根据已知或已报道的标准(例如已知的CPP序列或特征，如以上所讨论的碱性氨基酸含量、α-螺旋含量等)来设计并合成新型CPP肽或衍生CPP肽。此外，可以针对CPP活性来筛查随机设计的肽或其他肽，例如通过将含有报道分子(即，如荧光素标签等可检测标记或标签)的肽与所需的货物(本发明的寡肽化合物)偶联或连接，并且测试该构建体是否转运跨越细胞膜(例如通过将这些肽添加到活细胞中，然后例如使用共聚焦显微镜测量细胞进入量)来进行筛查。
[0073] 实际上，虽然一般情况下CPP会穿透或进入基本上任意类型的细胞中，但是有时可能观察到成功或有效的输送可能取决于货物(例如货物肽序列)和/或所用CPP的确切性质，或者随该确切性质而变化。 确定优化的肽序列和肽序列组合等并且测试和/或修饰货物和/或CPP序列或结构等应当完全处于本领域技术人员的常规技术能力内。
[0074] 如上所述，可以包含在本发明的寡肽化合物(或构建体)内的信号序列可以是将所述化合物(或构建体)导入特定亚细胞腔室尤其是细胞核中的信号肽。 核定位信号(NLS)同样为本领域所熟知，并且在文献中广泛描述，可以使用任意已知的NLS或功能性NLS。
[0075] 因此，本发明的另一个优选的实施方式是一种构建体，所述构建体包含(i)包含本文限定的APIM基序(即，PCNA相互作用基序)的寡肽化合物，和(ii)核定位信号。
[0076] NLS在长度和/或序列上可以不同，并且很多特异性NLS序列已经有说明。 然而，现已发现，包含带正电荷的氨基酸(尤其是赖氨酸(K)、精氨酸(R)和/或组氨酸(H))的肽一般可以用作NLS。 因此，一个示例性的NLS可以是例如4～20个氨基酸、
更具体而言4～15、4～12、4～10或4～8个氨基酸的肽，其中至少4个氨基酸(更
具体而言是NLS肽中的60％、70％、75％、80％、85％或90％的氨基酸残基)是带有正电荷的氨基酸，这些氨基酸优选选自K、R或H。 这个示例性的NLS可以例如具有或包含序列RKRH(SEQ ID NO：75)。
更具体而言4～15、4～12、4～10或4～8个氨基酸的肽，其中至少4个氨基酸(更
具体而言是NLS肽中的60％、70％、75％、80％、85％或90％的氨基酸残基)是带有正电荷的氨基酸，这些氨基酸优选选自K、R或H。 这个示例性的NLS可以例如具有或包含序列RKRH(SEQ ID NO：75)。
[0077] 核定位信号(包括实际实验确定的和预测的或推测的NLS序列)以及用于鉴定NLS的策略在Lange等，J.Biol.Chem.2007，282(8)，5101-5105；Makkerh等，Current Biology 1996，6(8)，1025-1027；Leslie等，Methods 2006，39，291-308；以及 Lusk等，Nature Reviews MCB 2007，8，414-420中有描述。
[0078] 典型的NLS由一条(单份)或两条(双份)碱性氨基酸链组成。 单份NLS可以126 132
以SV40大T抗原NLS( PKKKRKV [SEQ ID NO：76])为例，而双份NLS可以以核质
155 170
蛋白NLS( KRPAATKKAGQAKKKK [SEQ ID NO：77])为例。 已经提出单份NLS共
有序列K-[K/R]-X-[K/R](SEQ ID NO：78)，因此在一个实施方式中，本发明的NLS可以包含这条共有序列或者由该共有序列组成(其中X是任意氨基酸)。
以SV40大T抗原NLS( PKKKRKV [SEQ ID NO：76])为例，而双份NLS可以以核质
155 170
蛋白NLS( KRPAATKKAGQAKKKK [SEQ ID NO：77])为例。 已经提出单份NLS共
有序列K-[K/R]-X-[K/R](SEQ ID NO：78)，因此在一个实施方式中，本发明的NLS可以包含这条共有序列或者由该共有序列组成(其中X是任意氨基酸)。
[0079] 本发明的代表性双份NLS可以具有序列KR-[X]5-20-KKKK(SEQ ID NO：79)，例如KR-X10-KKKK(SEQ ID NO：80)(其中X为任意氨基酸)。
[0080] 作为另一种选择，一个示例性的双份NLS可以为RKRH-[X]2-10-KK(SEQ IDNO：81)形式，例如RKRH-X2-KK(SEQ ID NO：82)，如RKRH-II-KK(SEQ ID NO：
83)。
83)。
[0081] 肿瘤蛋白c-myc NLS与典型的NLS的区别在于，9个氨基酸残基中只有3个氨基酸是碱性的(PAAKRVKLD[SEQ ID NO：84])，表明NLS不一定需要与上文
给出的共有序列或典型序列相一致。 Makkerh等(见上文)描述了其中一簇碱性氨
基酸(例如KKKK[SEQ ID NO：85])的侧翼有中性和酸性残基的NLS序列，例如
PAAKKKKLD(SEQ ID NO：86)。
给出的共有序列或典型序列相一致。 Makkerh等(见上文)描述了其中一簇碱性氨
基酸(例如KKKK[SEQ ID NO：85])的侧翼有中性和酸性残基的NLS序列，例如
PAAKKKKLD(SEQ ID NO：86)。
[0082] 可以以例子给出的其他可能的NLS序列包括PKKKRKVL(SEQ ID NO：87)、KKKRK(SEQ ID NO：88)、KKKRVK(SEQ ID NO：89)、KKKRKVL(SEQ ID NO：90)
和RKKRKVL(SEQ ID NO：91)。 可以使用衍生自已知NLS的任意NLS，例如SV40、
核质蛋白、UNG2或c-myc NLS。
和RKKRKVL(SEQ ID NO：91)。 可以使用衍生自已知NLS的任意NLS，例如SV40、
核质蛋白、UNG2或c-myc NLS。
[0083] 可以使用本领域中已知的原理和分析方法测试推定的、提议的或预测的NLS序列的NLS活性。例如，可以将候选NLS序列与所需的货物(在该情况中为本文所限定的本发明的寡肽)连接，并可对构建体提供可检测的报告分子(例如可显色的标签或标记，如荧光标记)并使其与测试细胞接触。 然后可以测定该构建体在细胞中的分布。
[0084] 因此，总而言之，技术人员应当知道适当的信号序列，不过本文通过举例方式TM进行了以下描述。 细胞穿透肽序列的实例包括Penetratin (一种对应于触足蛋白的同源结构域的第3螺旋的16氨基酸肽，如R6-穿透素(其中精氨酸残基被加到穿透素的N末
端))等富含R的标签和HIV Tat蛋白的衍生物(如GRKKRRQRRRPPQQ(SEQ ID NO：
92)。 核定位序列的实例包括SV40蛋白衍生物KKKRK(SEQ ID NO：93)。
端))等富含R的标签和HIV Tat蛋白的衍生物(如GRKKRRQRRRPPQQ(SEQ ID NO：
92)。 核定位序列的实例包括SV40蛋白衍生物KKKRK(SEQ ID NO：93)。
[0085] 一种优选的本发明的构建体包含：(i)包含本文所限定的APIM基序的寡肽化合物、(ii)核定位信号、和(iii)细胞穿透信号序列。
[0087] 而且，本发明的寡肽化合物或构建体包含超过一个PCNA相互作用基序。 因此，作为另一种选择，本发明的构建体可以含有超过一个包含PCNA相互作用基序的寡肽化合物。构建体或寡肽化合物可以含有例如1～10个基序，如1～6、1～4、1～3、或1个或2个基序。 在还含有信号序列的构建体中，可以根据选择将此类基序隔开或定位，例如可以将其聚在一起，或可以通过信号序列元件将其分开，例如，基序-NLS-基序-CPP、或基序-NLS-基序-基序-CPP、或基序-基序-NLS-CPP等。
[0088] 可以按照任何所需或方便的方式采用本领域公知技术使本发明的构建体的组分或元件相互结合或连接。 因此，所述组分或分离的部分可以例如使用已知的化学偶联技术进行连接或偶联，或者可以使用基因工程技术(例如形成融合蛋白的技术)将所述构建体作为单独的整体形成，或者可以简单地使用例如肽合成技术将其作为整体合成。
[0089] 所述分开的部分或组分可以直接相互连接，或者它们可以通过一个或更多个连接子(或间隔子)序列间接连接。因此，连接子序列可以可以间隔或分隔开一个构建体的两个或更多个单独部分或者寡肽构建体中的分开的基序元件。 连接子序列的确切性质并不关键，其可以具有不同的长度和/或序列，例如，其可以具有0～40个残基，更具体而言可以具有0～20、0～15、0～12、0～10、0～8、或0～6、0～4或0～3个残基，例如1、2或3个以上的残基。 举个代表性的实例，连接子序列(如果存在)可以具有1～15、1～12、1～10、1～8、1～6或1～4个残基等。 残基的性质并不关键，
它们可以是例如任何氨基酸，如中性氨基酸、或脂肪族氨基酸、或者作为选择，它们可以为疏水性、极性、带有电荷或者结构形成性(例如脯氨酸)。已据显示可以使用许多不同的连接子序列，包括中性和/或脂肪族氨基酸的短序列(例如1～6个氨基酸)。
它们可以是例如任何氨基酸，如中性氨基酸、或脂肪族氨基酸、或者作为选择，它们可以为疏水性、极性、带有电荷或者结构形成性(例如脯氨酸)。已据显示可以使用许多不同的连接子序列，包括中性和/或脂肪族氨基酸的短序列(例如1～6个氨基酸)。
[0090] 因此，示例性连接子序列包括任意单个氨基酸残基，如A、I、L、V、G、R、Q、T、或W、或由这些残基组成的二肽、三肽、四肽、五肽或六肽。
[0091] 作为代表性连接子可以举出：I、II、IL、R、W、WW、WWW、RIL、RIW、GAQ、GAW、VAT、IILVI(SEQ ID NO：94)、IILVIII(SEQ ID NO：95)等。
[0092] 不同元件之间的连接子可以相同或不同。
[0093] 在一个实施方式中，提供了具有或包含序列MDRWLVKRILVATK(SEQ ID NO：96)或MDRWLVKRILKKKRKVATKG(SEQ ID NO：97)的寡肽化合物。
[0094] 本发明的其他代表性化合物(或具体而言构建体)包括：MDRWLVKGAQPKKKRKVLRQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：98)、MDRWLVKGAWKKKRVKI
IRKKRRQRRRK(SEQ ID NO：99)、MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRG(SEQ
ID NO ：100)、 MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRK(SEQ ID
NO ：101)、 MDRWLVKRIWKKKRKIIRKKRRQRRRK(SEQ ID NO ：
102)、MDRWLVKWWWKKKRKIIRKKRRQRRRK(SEQ ID NO ：103)、
MDRWLVKWWRKRHIIKKRKKRRQRRRK(SEQ ID NO：104)、MDRWLVKR
IWKKKRKIIRRRRRRRRRRRK(SEQ ID NO：105)、MDRWLVKRIWKKKRKII
RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：106)、MDRFLVKGAWRKRHIIKKRKK
RRQRRRK(SEQ ID NO：107)、MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRRK(SEQ
ID NO：108)、MDRWLVKWKKKRKIRKKIRRQRRRK(SEQ ID NO：109)、
MDRWLVKWRKRHIRKKRRQRRRK(SEQ ID NO：110)、 Ac-MDRWLVKG
AWRKRHIRKKRRQRRRK(SEQ ID NO：111)、Ac-MDRWLVKWKKKRKIR
RRRRRRRRRR(SEQ ID NO：112)、Ac-MDRALVKWKKKRKIRRRRRRRR
RRR(SEQ ID NO：113)、Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRRK(SEQ ID
NO：114)、Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRR(SEQ ID NO：115)、M
DRWLVKRIWKKKRKIIRWLVKWWWRKKRRQRRRK(SEQ ID NO ：116)、
KRRRQRRKKRIIKRKKKWWWKVLWRDM(SEQ ID NO：117)。
IRKKRRQRRRK(SEQ ID NO：99)、MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRG(SEQ
ID NO ：100)、 MDRWLVKGAWKKKRKIIRKKRRQRRRK(SEQ ID
NO ：101)、 MDRWLVKRIWKKKRKIIRKKRRQRRRK(SEQ ID NO ：
102)、MDRWLVKWWWKKKRKIIRKKRRQRRRK(SEQ ID NO ：103)、
MDRWLVKWWRKRHIIKKRKKRRQRRRK(SEQ ID NO：104)、MDRWLVKR
IWKKKRKIIRRRRRRRRRRRK(SEQ ID NO：105)、MDRWLVKRIWKKKRKII
RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：106)、MDRFLVKGAWRKRHIIKKRKK
RRQRRRK(SEQ ID NO：107)、MDRWLVKWKKKRKIRRRRRRRRRRRK(SEQ
ID NO：108)、MDRWLVKWKKKRKIRKKIRRQRRRK(SEQ ID NO：109)、
MDRWLVKWRKRHIRKKRRQRRRK(SEQ ID NO：110)、 Ac-MDRWLVKG
AWRKRHIRKKRRQRRRK(SEQ ID NO：111)、Ac-MDRWLVKWKKKRKIR
RRRRRRRRRR(SEQ ID NO：112)、Ac-MDRALVKWKKKRKIRRRRRRRR
RRR(SEQ ID NO：113)、Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRRK(SEQ ID
NO：114)、Ac-MDRWLVKKKKRKRRRRRRRRRRR(SEQ ID NO：115)、M
DRWLVKRIWKKKRKIIRWLVKWWWRKKRRQRRRK(SEQ ID NO ：116)、
KRRRQRRKKRIIKRKKKWWWKVLWRDM(SEQ ID NO：117)。
[0095] 具有在SEQ ID NO：98～117中所给出的序列的寡肽化合物如下文实施例6的表3中所示，其显示了构成所述构建体(即，含有基序的序列、连接子、NLS、CPP等)的不同组分。 因此可见，SEQ ID NO：98～117表示包含至少一个含有基序的序列、NLS和CPP的构建体(如所指出的那样，在有些情况中，它们通过序列可能不同的连接子序列连接)。 SEQ ID NO：117(RI-MDR26-3)是一条由D-氨基酸组成的逆反向肽。使用
了基于SV40或UNG2NLS序列的NLS序列，以及基于穿透素、HIV-TAT或富含R的肽
的CPP序列。
了基于SV40或UNG2NLS序列的NLS序列，以及基于穿透素、HIV-TAT或富含R的肽
的CPP序列。
[0096] 在另一方面，本发明提供了编码具有或包含(例如由其组成)如上所限定的SEQ ID NO：1的肽的核酸分子。还提供了所述核酸分子的互补链(complement)。优选的是，所述核酸分子包含与编码具有或包含例如SEQ ID NO：1的肽的序列可操作性连接的启动子序列。 在一个优选的实施方式中，所述核酸分子还编码如上所限定的信号序列。
[0097] 本发明的所述核酸分子还包含至少15个核苷酸，优选不超过800个核苷酸，更优选不超过700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100或50个核苷酸。 所述核酸分子优选是经分离的分子。
[0098] 另外一个方面涉及包含本文所限定的核酸分子的载体。 所述载体还可含有通常见于载体中的其它元件，例如复制起点、诸如抗生素抵抗等选择性标记和/或多克隆位点。 另外，所述载体还可以为表达载体，并且可以包含其它元件，例如用于表达所述核酸分子的转录和/或翻译控制元件或者调节元件。 这些控制元件如启动子、核糖体结合位点、增强子、终止子等在本领域中是公知的，且在本领域中得到广泛描述。
[0099] 所述载体例如可以是质粒或病毒，优选选自逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒。
[0101] “重组”是指核酸分子和/或载体已经被导入宿主细胞中。 所述宿主细胞可以天然含有或不含有所述核酸分子的内源性拷贝，但是它是重组细胞的原因在于其中已经导入所述核酸分子和/或载体的外源性拷贝或其它内源性拷贝。
[0102] 在另外一方面，提供了包含本文所限定的寡肽化合物、本文所限定的核酸分子和/或本文所限定的载体以及药理学(或药物)可接受的赋形剂的药物组合物。
[0103] 所述赋形剂可以包括本领域已知的任意赋形剂，例如任意载剂或稀释剂或者任意其他成分或试剂，如缓冲剂、抗氧化剂、螯合剂、粘合剂、涂布剂、崩解剂、填料、香料、色素、助流剂(glidant)、润滑剂、防腐剂、吸附剂和/或甜味剂等。
[0104] 所述赋形剂可以选自例如乳酸、右旋葡萄糖、偏亚硫酸钠、苯甲醇、聚乙二醇、丙二醇、微晶纤维素、乳糖、淀粉、壳聚糖、预糊化淀粉、碳酸钙、硫酸钙、葡聚糖结合剂、糊精、右旋葡萄糖、二碱式磷酸钙二水合物、三碱式磷酸钙、碳酸镁、氧化镁、麦芽糊精、甘露醇、粉末化纤维素、氯化钠、山梨醇和/或滑石粉。
[0105] 所述药物组合物可以以本领域已知的任何形式提供，例如片剂、胶囊、包衣片剂、液剂、悬浮剂、片剂(tab)、袋剂、植入物、吸入剂、粉末剂、颗粒剂、乳剂、冻干物、泡腾片、喷雾剂、软膏(salve)、乳剂、芳香膏剂、膏剂或其任意混合物。 其可以作为例如耐胃液制剂和/或持续作用的形式提供。 其形式可以是适于口服、肠胃外、局部、直肠、生殖器、皮下、经尿道、透皮、鼻内、腹腔内、肌内和/或静脉内施用和/或吸入施用的形式。
[0106] 在一个代表性的实施方式中，所述药物组合物为适于脂质体施用的形式，因此优选提供含有所述药物组合物的脂质体。 当使用脂质体时，无需包括另外的赋形剂，因而还提供了含有本文所限定的寡肽化合物、本文所限定的的核酸分子和/或本文所限定的的载体的脂质体。
[0107] 利用数据库检索，本发明人在200多种其它蛋白中发现了新型PCNA结合基序的存在，所述200多种蛋白中的很多蛋白涉及DNA修复、保持和细胞周期调控，例如转录、复制、磷酸化、泛素化、跨损伤DNA合成、姐妹染色单体粘连和细胞周期调控(见表1和实施例4)。 这些蛋白包括如下蛋白：
[0108] -含有见于TFIIS延长因子中的保守N末端域I的功能未知蛋白，它是一种重要的使停顿的转录继续进行的蛋白，于是本发明人称之为TFIIS样蛋白。这种蛋白在其7个N末端氨基酸中含有所述基序。
[0109] -多功能转录因子TFII-I，其对细胞周期调控和增长是关键的。过表达TFII-I的细胞提高γ-H2AX位点(DNA双链断裂的标记)的存留，表明TFII-I在DNA修复中的作用。 这种蛋白含有4个基序。
[0110] -DNA拓扑异构酶IIα(TopoIIα)，其在后复制DNA解链和DNA分离(segregation)中起作用。 该蛋白含有1个基序。
[0111] -关键核苷酸切除修复蛋白XPA，其识别螺旋扭结(kink)。 该蛋白含有1个基序。
[0112] -RAD51B，据显示对正确中心体功能和染色体分离具有重要性的同源重组蛋白。 这种蛋白包含1个基序。
[0113] -范科尼贫血核心复合蛋白FANCC。 据显示，FA核心复合物参与受DNA损伤激活的调控交联剂的DNA修复的信号转导途径。 这种蛋白含有1个基序。
[0114] 据发现含有至少一个基序的其他蛋白列在表1中。
[0115] 不希望受到理论的束缚，本发明人的发现表明通过阻止PCNA与至少一个它的通常伴侣分子(partner)相互作用，可以使细胞对细胞抑制剂的效应敏感。 因此，可以调控细胞抑制剂的效应。 例如，可以抑制修复蛋白与PCNA的相互作用(例如hABH2)，从而抑制DNA的修复，结果增加了细胞抑制剂对DNA造成损伤中的效应。
[0116] 因此，在另外一个方面，提供了一种治疗病症或病况、尤其是希望抑制细胞生长的病症或病况(例如快速增生性病症)或者需要或响应于细胞抑制治疗的任何病症的方法，所述方法包括对需要治疗的受试对象施用(尤其是施用有效量的)本文所限定的寡肽化合物、本文所限定的核酸分子和/或本文所限定的载体。
[0117] 在另一个方面，提供了本文所限定的寡肽化合物、本文所限定的核酸分子和/或本文所限定的载体，其用于治疗尤其是用于治疗希望抑制细胞生长的病症或病况(例如快速增生性病症)或者用于涉及细胞抑制治疗(即使用细胞抑制剂)的任何治疗中。因此，所述化合物等可以用于需要或响应于细胞抑制治疗的任何病症的治疗中。
[0118] 在另一个方面，提供了本文所限定的寡肽化合物、本文所限定的核酸分子和/或本文所限的载体在药物制备中的应用，所述药物用于治疗希望抑制细胞生长的病症病症或病况(例如快速增生性病症)的治疗或者用于涉及细胞抑制治疗的治疗中。
[0119] 如上所述，一个促成本发明的惊人发现在于，可以通过使用具有PCNA相互作用基序的肽来增强或加强一系列不同细胞抑制药物的效应，从而抑制PCNA与可能大范围的蛋白(例如涉及DNA修复和复制以及细胞周期进展等的蛋白)的相互作用。这产生了如下的一般性提案：任何PCNA相互作用分子可以与细胞抑制剂联合使用，以加强所述细胞抑制剂的效应或者使细胞对其效应敏感。
[0120] 因此，在另外一个方面，提供了一种其中希望抑制细胞生长的病症或病况(例如快速增生性病症)的治疗方法，或一种涉及细胞抑制治疗的治疗方法，所述方法包括对需要治疗的受试对象施用能够与PCNA相互作用的寡肽化合物或含有编码能够与PCNA相互作用的所述寡肽化合物的核酸序列的核酸分子，并且分开、同时或依次施用细胞抑制剂。
[0121] 作为选择，提供了能够与PCNA相互作用的寡肽化合物或包含编码所述寡肽化合物的核酸序列的核酸分子。 所述寡肽化合物或所述核酸分子与细胞抑制剂联合用于希望抑制细胞生长的病症或病症例如快速增生性病症的治疗或者用于涉及细胞抑制治疗的治疗中。
[0122] 因此，提供了能够与PCNA相互作用的寡肽化合物或包含编码所述寡肽化合物的核酸序列的核酸分子在药物制备中的应用，所述药物与细胞抑制剂联合用于希望抑制细胞生长的病症或病况(例如快速增生性病症)的治疗或者用于涉及细胞抑制治疗的治疗中。
[0123] 因此，在一个实施方式中，所述药物可以进一步包含细胞抑制剂。
[0124] 所述药物可以为同时包含所述寡肽化合物或核酸分子以及细胞抑制剂的单一组合物形式，或者其可以为用于进行分开(例如同时或依次)施用的包含它们的试剂盒或产品形式。
[0125] 因此还提供了能够与PCNA相互作用的寡肽化合物或包含编码所述寡肽化合物的核酸序列的核酸分子在药物制备中的应用，所述药物用于细胞的病症(例如快速增生性病症)的治疗或者用于涉及细胞抑制治疗的治疗中，其中所述药物与细胞抑制剂分开、同时或依次施用。
[0126] 在另一方面，本发明提供了含有能够与PCNA相互作用的寡肽化合物或包含编码所述寡肽化合物的核酸序列的核酸分子以及细胞抑制剂作为联合制剂的产品，所述联合制剂分开、同时或依次地用于希望抑制细胞生长的病症或病况(例如快速增生性病症)的治疗或者用于涉及细胞抑制治疗的治疗中。
[0127] 能够与PCNA相互作用的所述寡肽化合物，优选为包含或具有SEQ ID NO：1的寡肽化合物可以用于调节或加强细胞抑制剂的效应。
[0128] 因此，本发明的所述寡肽化合物(包括构建体)在希望(或可能有益于)抑制细胞生长的任何状况或临床场合中具有治疗功用。
[0129] 术语“抑制”宽泛地用于包括对细胞生长的任何减少或降低同时对细胞生长的防止或废止。 因此，“抑制”包括细胞生长的减少或防止。 这可以通过任何适当的或常规的方式，例如可以通过本领域公知技术所确定那样测定和评价细胞数量、尺寸(例如其中含有细胞的组织的尺寸)、细胞存活率和/或细胞死亡等来测定。
[0130] 本文中述及的细胞“生长”还宽泛地用于包括细胞生长的任何方面，尤其是包括细胞的增生。
[0131] 因此，所述寡肽化合物可以用于造成细胞生长(尤其是细胞增生)减少的任何病况(本文宽泛地用于包括任何病症或任何临床场合)的治疗中。 因此，所述寡肽化合物可以用于针对细胞生长(或增生)的任何疗法(或治疗)中。 换言之，所述化合物可以用于希望或有利的是抑制细胞增生的任何治疗应用中。
[0132] 本文使用的术语“治疗”泛指有利于管理临床病况的任意效应或步骤(或者干预)，因此包括治疗性和预防性治疗。 所述治疗可以包括降低、缓和、减轻、减缓病况或其一种或多种症状的进展，或消除病况或其一种或多种症状，或者以任何方式改善受试对象的临床状态，所述病况为正在进行治疗、与治疗前的情况或症状有关的病况。 治疗可以包括有助于治疗程序或方案或作为治疗程序或方案的一部分的任意临床步骤或干预。 预防性治疗可以包括延迟、限制、降低或防止病况或病况发作或者其一种或多种症状，例如与预防性治疗前的病况或症状相关的症状。 因此，预防明确地既包括对所述病况或其症状的发生或发展的完全防止，还包括对所述病况或症状发作或发展的任何延迟或者对所述病症或症状发展或进展的降低或限制。 因此，本发明的治疗包括杀死细胞、抑制或减缓细胞的生长、或者抑制或减缓细胞体尺寸的增加或细胞种群的增加(例如组织或肿瘤或者生长物的增加)，降低细胞数量或防止细胞扩散(例如对于其他解剖部位)，降低细胞生长物的尺寸等。 术语“治疗”没有暗指治愈或完全废止或消除细胞生长物或细胞的生长。
[0133] 由于本发明的治疗性应用和功用可能通常涉及抑制细胞的增生，因此在本文所公开或涵盖的治疗和功用中可以靶向任意增生细胞。 此类增生细胞可以包括健康细胞或病态细胞以及发生增生的任意组织的细胞。 例如，所述细胞可以具体包括肿瘤细胞(包括恶性和非恶性肿瘤细胞)、免疫系统细胞(免疫细胞)、一般而言的造血系统细胞或皮肤细胞。
[0134] 可以使用细胞抑制剂治疗涉及异常或不利细胞生长的病症或病况，细胞抑制剂可以用在希望减少或防止细胞生长和增生的任何场合，包括希望杀死或废止细胞的场合。 因此，如上所述换而言之，本发明的寡肽化合物(包括构建体)可以用于涉及(或包括)使用细胞抑制剂的任意治疗方法。 这可以包括响应于细胞抑制剂的任何病况或者可以或需要使用细胞抑制剂进行治疗的任意病况的治疗。
[0135] 快速增生性病症的治疗代表着特别受到关注的一个方面。 术语“快速增生性病症”在本文中宽泛地用于包括涉及增加的、不希望的或不利的细胞增生的任意病症或病况。 因此，其不仅包括其中细胞增生增加(例如相对于正常或健康细胞或者没有存疑病况的细胞(例如相比或相对于健康或对照受试对象，或者相比或相对于在取自同一受试对象中的健康或未受影响的组织的细胞)增加)的病况，而且还包括其中与正常细胞相比细胞增生没有增加(或者没有明显或显著增加)但是一般情况下或在特定场合下不需要或不希望增生发生的病况。 这可以包括例如可以在“正常”响应(例如免疫响应或炎性响应等(换言之，可以能在特定(例如“正常”)场合下发生但是可能是不利的“正常”响应)中发生的不利或不希望的细胞增生。 这种不利的增生响应可以例如是导致不利炎性响应或者不利免疫响应(例如自体免疫响应或过敏反应等)的细胞增生。
[0136] 因此，可以根据本发明进行治疗的快速增生性病症明确包括炎症(更具体而言是炎性病症或病况，或者涉及炎症、与炎症有关或以炎症为特征的病况)和自体免疫病症或病况，或者具有自体免疫成分的病症或病况。
[0137] 快速增生性病症可以涉及(但不限于)具有自主生长能力的细胞(即独立于正常调节机制而存在和复制的细胞)的增生。 因此，快速增生性病症可以是赘生性病症，并且如上所述，这可以是恶性的或者非恶性的病症。
[0138] 快速增生性细胞可以分为病态的(即偏离于正常细胞并且与疾病状态有关)或非病态的(即偏离于正常细胞但不与疾病状态有关)。
[0139] 病态快速增生性细胞可能与以下疾病状态或病症有关，或以以下疾病状态或病症为特征：再狭窄、糖尿病性肾病、甲状腺增生、格雷夫氏病、银屑病，良性前列腺增生症、李-弗诺门提(Li-Fraumenti)综合征和癌症(包括任何肿瘤或恶性瘤)。
[0140] 非病态快速增生性细胞的实例包括哺乳期发育期间的乳腺导管上皮细胞，还包括与伤口修复有关的细胞。
[0142] 如上所述，快速增生性病症可以是恶性的或者非恶性的赘生性病症。 还包括恶化前病症或非赘生性病症。 恶化前、非赘生性或非恶性的快速增生性病症的例子包括骨髓增生异常病症、原位宫颈癌、家族性结肠息肉(例如加德纳综合征)、口腔粘膜白斑病、组织细胞增多病、瘢痕疙瘩、血管瘤、快速增生性动脉狭窄、炎性关节炎、表皮角化病和包括关节炎在内的丘疹鳞屑性出疹。 还包括病毒诱导的快速增生性疾病，如疣和EBV诱导的疾病(例如传染性单核细胞增多症)和瘢痕形成等。
[0143] 因此，所述快速增生性病症可以是任意快速增生性病症，例如选自赘生性病症的快速增生性病症，如癌症、银屑病关节炎、类风湿关节炎和胃部快速增生性病症(如炎性肠道疾病)、皮肤病(包括银屑病、瑞特综合征、毛发红糠疹和角质化病症的快速增生性变型)。
[0144] 癌症是特别受到关注的快速增生性病症，并且包括所有类型的癌症，包括例如实体瘤和血液性癌症。 代表性癌症类型包括宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、胆囊癌、肝癌、头颈部癌、鳞状细胞癌、胃肠道癌、乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病(如急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病)、脑癌(如星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤)、成神经细胞瘤、肉瘤、结肠癌、直肠癌、胃癌、肛门癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、浆细胞瘤、淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、成肾细胞瘤、尤文肉瘤、黑色素瘤和其他皮肤癌。
[0145] 还可以提及的有鼻窦肿瘤、尿道和生殖泌尿系统癌症、食道癌、骨髓瘤、内分泌肿瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、纤维肉瘤以及任何周围或中枢神经系统的恶性或良性肿瘤，包括神经胶质瘤和成神经细胞瘤。
[0146] 自体免疫病症或疾病是另一种特别受关注的病症，包括例如类风湿关节炎、多发性硬化症、免疫疾病(如系统性红斑狼疮(SLE；狼疮)或重症肌无力。
[0147] 一般而言，受关注的还有血液学病症、或者血液或骨髓疾病，其不一定是恶性或癌性，如各种恶液质、或发育不良、非恶性增生、肉芽肿(agranuloma)或MGUS(重要性未知的单克隆丙种球蛋白病)。因此，包括血液或骨髓细胞的不利的、不希望的或异常的增生在内的任何病况都可以根据本发明进行治疗。
[0148] 可以具体提及的其他病症包括：赘生性脑膜炎和骨髓增生性疾病，如真性红细胞增多症(当红血细胞产生过量时发生)。
[0149] 各种病况还可以由于炎症或自体免疫疾病而发生，或者与炎症或自体免疫疾病有关。这些病况也可以根据本发明进行治疗。 可具体举出硬化性黏液水肿、疹性黏蛋白沉积症、淀粉样变性和韦格纳肉芽肿。
[0150] 如上所述，本发明的化合物可以增加或增强细胞抑制剂的效应。 因此，它们可以用于可以使用细胞抑制剂的任何治疗应用中。 这可以包括希望杀死或废止细胞(可能不仅仅包括发病细胞)的任意场合。 特别是希望在移植前废止骨髓的场合。 因此，本发明的化合物可以用于骨髓细胞清除术，尤其是移植前的骨髓细胞清除术，所述移植可以是例如骨髓移植，更多场合是造血干细胞移植(HSCT)(除了来自骨髓，造血干细胞还可以获自或源自血液，例如外周血)。
[0151] 干细胞移植可以用于治疗可以是恶性或非恶性的血液或骨髓疾病或病况(即血液学病况或病症)以及某些其他类型的癌症，包括实体瘤癌如神经母细胞瘤、促结缔组织增生性小圆细胞癌、尤文肉瘤和绒毛膜癌。 血液学恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴癌)和骨髓瘤。 非恶性血液学病症包括吞噬细胞病症(如骨髓增生异常)、贫血(如严重再生障碍性贫血或再生障碍性贫血)、以及骨髓增生性病症(如真性红细胞增多症和特发性血小板增多症)。 可以通过干细胞移植治疗的其他获得性病症包括代谢病症(如淀粉样变性)、环境诱导的疾病(如放射性中毒)。 干细胞移植还可用于治疗先天性病症，包括各种溶酶体贮积病症、免疫缺陷和非恶性血液学病症(如贫血、血细胞减少、噬血细胞综合征、血红蛋白病、镰状细胞病和重型β地中海贫血)。
[0152] 放射性治疗(又称为放射疗法和放射肿瘤学)可以用于包括如上所述的快速增生性病症在内的各种病况的治疗。“放射治疗”是指能够通过直接或间接使构成DNA链的原子离子化来损伤细胞DNA的离子化辐射的使用。间接离子化的发生是水离子化而形成随后损伤DNA的自由基(尤其是羟基自由基)的结果。 在最常见的放射性治疗形式中，大部分放射通过自由基而起效。
[0153] 放射性治疗由于由永生DNA双链断裂或程序性细胞死亡的激活造成的细胞毒性效应而可用于治疗癌症和废止病态组织。 离子化放射在体内和体外使快速增生性细胞(如肿瘤细胞和癌细胞)发生细胞凋亡引起的细胞死亡。
[0154] 不幸的是，放射性治疗经常无法成功地从患者中将癌细胞完全清除，这是因为在不对周围正常组织造成不可接受的高损伤风险的情况下，经常不可能输送足够高剂量的局部辐射来杀死肿瘤细胞。 此外还已知，细胞对辐射诱导的细胞死亡显示出很大不同的易感性，离子化辐射还可通过磷脂酰肌醇3激酶/Akt(PI3K/Akt)和分裂素激活蛋白激酶(MAPK)信号转导途径激活促存活响应机制。 因此，需要通过使细胞对离子化辐射的效果敏化来增强放射性治疗的功效。
[0155] 因此，本发明的化合物可以用于提供这种敏化效应，换言之，增强(或换言之增加、提高或加强)放射性治疗的效果，或者使受试对象(或者更具体而言是可以存在于受试对象中的细胞)对放射性治疗的效果具有更高的易感性。 因此，本发明的化合物可以用于使用放射性治疗的任何治疗应用中。 这可以包括希望杀死或废止细胞(可能不仅包括发病细胞)的任意场合。
[0156] 因此，本发明的化合物可以用作细胞对离子化放射的DNA损伤效果的敏化剂。“敏化剂”是指使用本发明的化合物来增强离子化放射对细胞的DNA损伤效果。这可以通过抑制内源性细胞DNA修复机制来实现。
[0157] 因此，本发明涵盖与放射性治疗联合使用的包含PCNA相互作用基序(更具体而言是包含本文所限定的PCNA相互作用基序)的寡肽化合物或者包含编码所述PCNA相互作用基序的序列的核酸分子，其中所述化合物与放射性治疗分开、同时或依次施用。 所述放射性治疗以及所述化合物可以在响应于放射性治疗或需要放射性治疗的任意病况的治疗中共同施用。 因此，本发明的化合物或构建体可以用于希望抑制细胞生长的病症或病况(例如快速增生性病症)的治疗中或者涉及放射性治疗的任意治疗中。
[0158] 作为另一种限定，本发明提供了作为放射性治疗的敏化剂的包含PCNA相互作用基序(更具体而言是包含本文所限定的PCNA相互作用基序)的寡肽化合物或者包含编码所述PCNA相互作用基序的序列的核酸分子，其中所述化合物与放射性治疗分开、同时或依次施用。
[0159] 本发明的这些方面还提供了使受试对象(或者更具体而言，所述受试对象中的细胞或组织)对放射性治疗敏感的方法，所述方法包括对所述受试对象施用本文所限定的本发明的寡肽化合物，尤其是施用可有效使所述受试对象(或所述细胞或组织)对放射性治疗敏感的量。
[0160] 本发明的这一方面还可以提供一种治疗受试对象的方法，所述方法包括对所述受试对象施用与本文所限定的本发明的寡肽化合物结合的放射性治疗。 更具体而言，所述方法可以是治疗响应于或要求放射性治疗的病症或病况或者希望抑制细胞生长的病症或病况的方法，或者是涉及放射性治疗的治疗方法。
[0161] 本发明考虑到了所有类型的放射性治疗，包括但不限于常规外照射放射治疗、立体定向放射治疗、虚拟仿真、三维适形放射治疗、调强放射治疗和放射性同位素治疗(RIT)。
[0162] 因此，在本文列出的各方面中的任意方面的一个优选实施方式中，本文所限定的寡肽化合物、核酸分子和/或载体与放射性治疗联合使用(同时、分开或依次使用)。
[0163] 在本文列出的各方面中的任意方面的又一个优选实施方式中，本文所限定的寡肽化合物、核酸分子和/或载体与细胞抑制剂联合使用(同时、分开或依次使用)。
[0164] “细胞抑制剂”是指能够抑制或压制动物细胞生长和/或倍增(复制/增生)的试剂。
[0166] 根据细胞抑制剂的作用机制通常可以将其划分为不同的类别，所有这些类别均为本文所考虑。 因此，细胞抑制剂可以是烷基化剂、交联剂、嵌合剂、核苷类似物、纺锤体形成抑制剂和/或拓扑异构酶I和/或II抑制剂。 其他类型或类别的试剂包括抗代谢物、植物生物碱和类萜，或抗肿瘤抗生素。 优选的是，所述细胞抑制剂是烷基化剂。
[0167] 烷基化剂通过使核苷酸烷基化来对DNA进行修饰，这使得阻止了DNA的正确复制。 核苷酸类似物可以在复制过程中并入DNA中并抑制DNA的合成。 纺锤体形成
抑制剂干扰纺锤体的形成，导致细胞分裂中期有丝分裂的停滞。嵌合剂嵌入DNA碱基之间，从而抑制DNA的合成。 拓扑异构酶I和/或II抑制剂影响DNA的扭转，从而干预
DNA的复制。
抑制剂干扰纺锤体的形成，导致细胞分裂中期有丝分裂的停滞。嵌合剂嵌入DNA碱基之间，从而抑制DNA的合成。 拓扑异构酶I和/或II抑制剂影响DNA的扭转，从而干预
DNA的复制。
[0168] 适当的细胞抑制剂在本领域中是已知的，在此仅例举如下：放线菌素D、BCNU(卡莫司汀)、卡铂、CCNU、喜树碱(CPT)、斑蝥素、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞
苷、达卡巴嗪、柔红霉素、多烯紫杉醇、阿霉素、DTIC、表阿霉素、依托泊苷、吉非替尼、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、伊屋诺霉素、美法仑、甲氨蝶呤、丝裂霉素C(MMC)、米托蒽醌、巯基嘌呤、奥沙利铂、紫杉醇(他克唑)、PARP-1抑制剂、泰
索帝、替莫唑胺(TZM)、替尼泊甙、托泊替康、曲奥舒凡、长春瑞滨、长春新碱、长春碱、5-氮胞苷、5，6-二氢-5-氮杂胞苷和5-氟尿嘧啶。 对于任何给定的细胞抑制剂，本领域技术人员知道适当的剂量范围，而在一个实施方式中，细胞抑制剂以其典型剂量范围存在于药物组合物中，或者被施用于受试对象。 在一个有利的实施方式中，可以存在/使用低剂量的细胞抑制剂，这是因为本发明的所述寡肽化合物、核酸分子或载体使细胞对细胞抑制剂敏化，因此当该细胞抑制剂与本发明的寡肽化合物、核酸分子或载体联合使用时，较低剂量的细胞抑制剂具有与单独使用的高剂量细胞抑制剂的治疗效果相同或相当的治疗效果。 因此，本发明的寡肽化合物、核酸分子或载体可以治疗对细胞抑制剂具有较低或者低于平均的耐受性的受试对象(例如老人、婴儿或年幼小孩)或者因为疾病和营养不良等而虚弱的人。
苷、达卡巴嗪、柔红霉素、多烯紫杉醇、阿霉素、DTIC、表阿霉素、依托泊苷、吉非替尼、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、伊屋诺霉素、美法仑、甲氨蝶呤、丝裂霉素C(MMC)、米托蒽醌、巯基嘌呤、奥沙利铂、紫杉醇(他克唑)、PARP-1抑制剂、泰
索帝、替莫唑胺(TZM)、替尼泊甙、托泊替康、曲奥舒凡、长春瑞滨、长春新碱、长春碱、5-氮胞苷、5，6-二氢-5-氮杂胞苷和5-氟尿嘧啶。 对于任何给定的细胞抑制剂，本领域技术人员知道适当的剂量范围，而在一个实施方式中，细胞抑制剂以其典型剂量范围存在于药物组合物中，或者被施用于受试对象。 在一个有利的实施方式中，可以存在/使用低剂量的细胞抑制剂，这是因为本发明的所述寡肽化合物、核酸分子或载体使细胞对细胞抑制剂敏化，因此当该细胞抑制剂与本发明的寡肽化合物、核酸分子或载体联合使用时，较低剂量的细胞抑制剂具有与单独使用的高剂量细胞抑制剂的治疗效果相同或相当的治疗效果。 因此，本发明的寡肽化合物、核酸分子或载体可以治疗对细胞抑制剂具有较低或者低于平均的耐受性的受试对象(例如老人、婴儿或年幼小孩)或者因为疾病和营养不良等而虚弱的人。
[0169] 当使用细胞抑制剂治疗快速增生性病症时碰到的一个问题是，通常并非所有受影响的细胞都被杀死。 可以设想，当细胞抑制剂与本发明的寡肽化合物、核酸分子或载体一起使用时，较高百分比的受影响的细胞被杀死，并在一个实施方式中，将高于通常剂量的细胞抑制剂与本发明的寡肽化合物、核酸分子或载体一起使用，以实现杀死极高比例的发病细胞，例如至少50％、60％、70％或80％，优选至少85％、90％或95％，最优选基本杀死所有的发病细胞。
[0170] 如上所述，当将本文所限定的寡肽化合物、核酸分子或载体与细胞抑制剂联合使用时，两种不同的试剂可以存在于相同的药物组合物中，或者它们可以分开施用。 分开施用可以包括基本同时施用但是通过不同的施用途径或者在不同的部位施用。 分开施用还可以包括在不同的时间点施用，例如间隔长达1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时或12小时施用。
[0171] 所述受试对象是动物(即任何人类或非人类动物)，优选为哺乳动物，最优选为人类。
[0172] 本领域技术人员应当非常了解将本发明的寡肽化合物、核酸分子或载体导入细胞内的方法。下文将以例举方式简单讨论一些适当的方法。 如上文所详述，可以使用肽介导的输送方法，尤其是细胞穿透肽(CPP)，如上所述，细胞穿透肽是短序列(有时是聚阳离子序列)，该序列通过例如提高被哺乳动物细胞的核内体的摄取而有利于含有CPP或连接有CPP的肽、蛋白或核苷酸分子的细胞摄取。 微胶囊化提供了一种将生物活性材料包封在聚合物半透膜中的简单、经济有效的方法，所述包封的目的在于保护该生物材料并以受控方式释放被包封的物质或其产物。 在光化学内化(PCI)中，细胞将受关注分子和光敏化合物均吸收到溶酶体或核内体中。 然后将细胞暴露于适当波长的光中以激活光敏化合物，让光敏化合物破坏溶酶体或核内体的膜，从而将关注分子释放到细胞溶质中。
[0173] 其他方法包括显微注射、红细胞空胞介导的融合、脂质体融合、胞饮泡(pinosome)渗透裂解、刮痕标记(scrape loading)、电穿孔、磷酸钙和病毒介导的转染以及使用共聚载剂等。
[0175] 本文使用标准氨基酸单字母代码，因此K表示赖氨酸(Lys)，I表示异亮氨酸(Ile)等。
[0176] 本发明的寡肽化合物可以包含一个或多个氨基酸，如至少1、2、3、4或5个氨基酸，其具有不是由标准遗传密码子编码的侧链，本文称为“非编码氨基酸”。 这些氨基酸可以选自通过代谢过程形成的氨基酸(例如鸟氨酸或牛磺酸)和/或人为修饰的氨基酸，例如，由9H-芴-9-基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、2，2，5，7，8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)保护的氨基酸或者具有苄氧基羰基(Z)的氨基酸。优选的是，当这些非编码氨基酸存在时，它们不位于所述基序内，但是在一个实施方式中，一个或多个非编码氨基酸存在于所述基序内。
[0177] 通过使用本领域已知的稳定化或保护手段，例如加入保护基团或稳定化基团、引入氨基酸衍生物或类似物或者对氨基酸进行化学修饰，可以改善或提高本发明的寡肽化合物的体内和/或体外稳定性，所述保护基团或稳定化基团可以例如添加至N和/C末端。 所述基团的实例是在本领域中已知可以使肽稳定化的酰基和其他保护基团。
[0178] 本发明的寡肽化合物通常只包含具有L-构型的氨基酸，但是可以存在一个或多个具有D-构型的氨基酸。优选的是，所述寡肽化合物含有至少1、2、3、4或5个D-氨基酸，并且它们优选出现在所述基序中，但是在另一个实施方式中，D-氨基酸仅存在于所述基序之外。 所述寡肽化合物可以是线性的或环状的。
[0179] 因此，特别包括在内的是逆向寡肽化合物或本发明的寡肽化合物的逆向类似物(更具体而言是逆向肽)。
[0180] 此外还包括反向寡肽化合物(或反向肽)，其中残基(例如氨基酸残基)以与亲代化合物或参考化合物(例如肽)相反的方向装配。
[0181] 逆反寡肽化合物包括以亲代化合物或参考化合物序列相逆(相对)的顺序包含D-氨基酸。因此逆反类似物具有相逆末端和相逆的例如肽键顺序，同时基本保持和亲代或参考序列相同的侧链拓扑学。
[0182] 本发明的化合物可以包括部分反向、逆向或逆反序列。
[0183] “寡肽化合物”是指由氨基酸或等效亚基组成的、通过肽键或等效键连接在一起的化合物。 因此，术语“寡肽化合物”包括肽和拟肽(peptidomimetics)。
[0184] “等效亚基”是指结构和功能与氨基酸类似的亚基。 亚基的骨架部分可以不同于标准氨基酸，例如，其可以含有一个或多个氮原子来代替一个或多个碳原子。
[0185] “拟肽”是指功能与肽等效或类似的并且能够采用与其肽对等物相似的三维结构但是不单由通过肽键连接的氨基酸组成的化合物。 优选的一类拟肽是类肽(peptoid)，即N-取代甘氨酸。 类肽与它们的天然肽对等物密切相关，但是它们在化学上的不同之处在于，它们的侧链沿着分子骨架附接在氮原子上，而不是像氨基酸那样附接在α-碳上。
[0186] 在一个优选的实施方式中，所述寡肽化合物的至少基序部分只包含肽键，优选的是，所述基序部分只由编码氨基酸组成。 更优选的是，所述寡肽化合物是肽。
[0187] 所述寡肽化合物可以包含二氨基酸(di-amino acid)和/或β-氨基酸，但是优选至少所述基序部分仅由α-氨基酸组成。 最优选的是，所述寡肽化合物由α-氨基酸组成。
[0188] 前缀“寡”用于表示数量相对较小的亚基(如氨基酸)，即，小于200个亚基，优选小于100、90、80、70、60或50个亚基。 因此本发明的寡肽化合物包含至少5个并且不超过200个亚基。 优选的是，本发明的寡肽化合物包含至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个亚基。 作为另一种限定，本发明的寡肽化合物包含不超过40、35、30、29、28、27、26或25个亚基。 因此，代表性的亚基范围包括5～40、5～35、5～30、5～25、5～20、5～15、5～12、5～10等，优选的是
5～20和5～30个亚基。
5～20和5～30个亚基。
[0189] 当所述寡肽化合物包含超过5个亚基时，则所述基序之外的亚基的性质就不是关键的，因此所述基序之外的亚基可以例如是见于天然蛋白(如hABH2)中的那些亚基，或者它们可以是丙氨酸残基或任意其他适当的残基。
[0190] 拟肽通常在患者体内具有较长的半衰期，因此在希望效果持续较长的一些实施方式中优选拟肽。这可以有助于减少所述组合物必须重复施用的频率。 然而，出于生物安全性原因，在其他一些实施方式中，优选较短的半衰期；在这样的实施方式中，肽是优选的。
[0191] 本发明的寡肽化合物可以形成较大单元的一部分，例如，其可以与多肽融合形成重组融合蛋白，或者连接到骨架上形成肽适体。 因此，含有本发明的寡肽化合物的融合蛋白或适体构成本发明的其它方面。 所述其它方面包括含有所述融合蛋白或适体的药物组合物和所述融合蛋白或适体在如上所述的治疗或治疗方法中的应用。
[0192] 不希望受到理论的束缚，据信为了优化DNA修复、维护和/或细胞周期调控，若干种蛋白必须与PCNA相互作用，并且本发明的寡肽化合物可以和具有共有基序的蛋白竞争与PCNA的相互作用。可能必须通过用于优化DNA修复、维护和/或细胞周期调控的新型基序与PCNA相互作用的蛋白的实例在表1中列出，因此所述蛋白可以是DNA
聚合酶、DNA连接酶、拓扑异构酶、DNA修复蛋白、DNA修复相关/相互作用蛋白、
参与姐妹染色单体粘连、染色质重构、DNA结合、泛素加工或SUMO加工的蛋白、E3泛素连接酶、转录因子、细胞周期调控因子、蛋白激酶、甲基转移酶、酰基转移酶、癌相关抗原、结构蛋白或中心体驱动蛋白。
聚合酶、DNA连接酶、拓扑异构酶、DNA修复蛋白、DNA修复相关/相互作用蛋白、
参与姐妹染色单体粘连、染色质重构、DNA结合、泛素加工或SUMO加工的蛋白、E3泛素连接酶、转录因子、细胞周期调控因子、蛋白激酶、甲基转移酶、酰基转移酶、癌相关抗原、结构蛋白或中心体驱动蛋白。
[0193] 当细胞内存在足够水平的本发明的所述寡肽化合物时，则这些蛋白的一种或多种蛋白的活性降低或者甚至由于竞争抑制而被废止。
[0194] 据信本文所限定的寡肽化合物、核酸分子或载体本身没有酶促活性，并且对细胞没有毒性(见实施例2)。 因此，已据显示，本发明的包含如本文所限定的PCNA相互作用基序的肽的表达对于其中表达该肽的细胞的生长没有影响或者仅有微小的影响。 这取决于表达水平。 然而，在一些场合中，据信本发明的寡肽化合物可能具有细胞毒性，因此它们本身可以用作细胞毒剂(或细胞抑制剂)。因此，本发明的化合物可以在本文所讨论的病况的治疗中用作细胞毒剂，而不是总是必须与另一种细胞抑制剂或放射性治疗联合。
[0195] 实验表明，施用于细胞的所述寡肽化合物可能对细胞具有细胞毒性效应。
[0196] 所述细胞毒性效应因所述化合物的确切性质(例如其序列或组成)而异。 具体而言，所述细胞毒性效应可以用包含NLS和/或CPP的构建体获得，并且采用含有NLS和CPP的构建体观察到了所述细胞毒性效应。 已经观察到核定位构建体具有细胞毒性的有力证据。
[0197] 显示出细胞毒性效应的寡肽化合物可以是反向、逆向或逆反化合物等。
[0198] 更特别的是，还观察到采用本发明的含有多于一个PCNA结合基序的化合物或构建体可以获得增加的细胞毒性效应。
[0199] 在另一个方面，本文提供了一种试剂盒或药物产品，所述试剂盒或药物产品包含：
[0200] (i)本文所限定的寡肽化合物、本文所限定的核酸分子和/或本文所限定的载体；和
[0201] (ii)细胞抑制剂。
[0202] 在另一方面，本发明提供了一种产品，所述产品含有作为联合制剂的(i)本文所限定的寡肽化合物、本文所限定的核酸分子和/或本文所限定的载体；和(ii)细胞抑制剂，所述联合制剂同时、依次或分开用于希望抑制细胞生长的病症或病况(例如快速增生性病症)的治疗或涉及细胞抑制治疗的治疗中。
[0203] 还考虑了本文所限定的寡肽化合物、核酸分子和/或载体对细胞或细胞培养物的体外施用。这种体外方法可以用于研究DNA修复、维护和/细胞周期调控。在一个优选方面，所述体外方法用于鉴定新型细胞抑制剂。 这使得可以更快地鉴定细胞抑制剂，或鉴定单独使用时只具有微弱的细胞抑制性能但是当与本发明的寡肽化合物、核酸分子或载体联合施用时具有有用的细胞抑制活性的试剂。
[0204] 本文所限定的新型PCNA相互作用基序可以用于诊断或监测希望抑制细胞生长的病症或病况(例如快速增生性病症)或涉及细胞抑制治疗或放射性治疗的治疗。
[0205] 本发明人发现若干种癌相关抗原具有PCNA结合基序(见表1)。 因此可以设想通过检测含有所述基序的蛋白的表达水平和/或位置来诊断上文讨论的快速增生性病症等或者监测其进展，其中所述蛋白的异常水平和/或位置指征所述病症(如快速增生性病症)。
[0206] “异常水平”是指所述蛋白水平的增加，例如该水平比同种细胞类型的健康细胞中的水平高出10％、20％、30％或40％，或者所述蛋白的水平降低，例如该水平比同种细胞类型的健康细胞中的水平低10％、20％、30％或40％。
[0207] 在一个优选的实施方式中，含有所述基序的蛋白的水平增加指征病症(例如快速增生性病症)。
[0209] 所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且可以是完整抗体如IgG、IgA、IgE、IgM或IgD，或者抗体片段如Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、Fv、dsFv、ds-scFv、Fd、dAb。
[0210] 检测测试可以在体内或体外进行，例如，在组织样品、细胞样品或体液样品(例如细胞裂解液、血清或血液)中进行。
[0211] 可以通过将所述抗体偶联(物理连接)到可检测物质(即抗体标记)上来帮助检测。 可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、NMR造影剂和放射活性材料。 适当的酶的实例包括合适的例子包括辣根酶过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等；适当的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适当的荧光材料的实例包括：伞形花内酯、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的
125
实例包括：荧光素酶、荧光素和水母素(aequorin)；放射性材料的适当实例包括 I、
131 35 3
I、 S或 H。 在直观标签的情况下，可以使用胶体金属或非金属颗粒。
125
实例包括：荧光素酶、荧光素和水母素(aequorin)；放射性材料的适当实例包括 I、
131 35 3
I、 S或 H。 在直观标签的情况下，可以使用胶体金属或非金属颗粒。
[0212] 优选的是，本发明提供了一种诊断或监测具有希望抑制细胞生长的病症或病况(例如快速增生性病症)的受试对象中的进展的方法，所述方法包括如下步骤：
[0213] (1)在允许形成抗体-抗原复合物的条件下，用对所述基序具有特异性的抗体与取自所述受试对象(例如哺乳动物)的受检样品接触；
[0214] (2)测量所述受检样品中抗体-抗原复合物的量；和
[0215] (3)将所述受检样品中抗体-抗原复合物的量与对照比较。
[0216] 对照可以是取自同一受试对象的健康细胞，例如健康的成纤维细胞。
[0217] 在另一方面，本发明涉及对所述基序具有特异性的抗体。
[0218] 本发明还包括用于诊断或监测希望抑制细胞生长的病症或病况(例如快速增生性病症)的试剂盒，所述试剂盒包含对所述基序具有特异性的抗体及应用其诊断所述病症或病况的使用说明书。 优选的是，所述抗体与如上所述的可检测物质偶联，或者所述试剂盒包含所述可检测物质。
[0219] 一种可选的诊断方法包括对编码所述基序的核酸分子的异常水平的检测。 在该方法中，使用适当的检测方法(例如，使用聚合酶链式反应(PCR)或采用适当标记的探针的杂交技术)来监测所述核酸的水平。 现将参考以下非限定性实施例和附图对本发明进行进一步说明，其中，
[0220] 图1包含共焦显微镜图像，所述图像示出hABH2和PCNA共定位并且hABH2的10个N-末端氨基酸对于该共定位是充分且必要的。 测试以EYFP标记的各种hABH2构
建体(具有残基1～261的全长hABH2、具有残基11～261的截短hABH2、和由残基
1～10组成的hABH2N-末端片段)与ECFP标记的PCNA的共定位(见实施例1)。 左
列显示单独用hABH2转染的的细胞，而其他三列显示用hABH2构建体和PCNA共转染
的细胞。
建体(具有残基1～261的全长hABH2、具有残基11～261的截短hABH2、和由残基
1～10组成的hABH2N-末端片段)与ECFP标记的PCNA的共定位(见实施例1)。 左
列显示单独用hABH2转染的的细胞，而其他三列显示用hABH2构建体和PCNA共转染
的细胞。
[0221] 图2是显示FRET分析结果的图。 显示EYFP(黄色荧光蛋白)/ECFP(青色荧光蛋白)(泳道1，背景由标签二聚化造成)、EYFP-PCNA/ECFP-PCNA(泳道2，
阳性对照，由于PCNA与PCNA结合)、hAHB2-EYFP/ECFP-PCNA(泳道3)和1～
10hABH2-EYFP/ECFP-PCNA(泳道4)之间的归一化FRET(NFRET)测量结果。
阳性对照，由于PCNA与PCNA结合)、hAHB2-EYFP/ECFP-PCNA(泳道3)和1～
10hABH2-EYFP/ECFP-PCNA(泳道4)之间的归一化FRET(NFRET)测量结果。
[0222] 图3含有显示各种细胞抑制剂对表达hABH21-10-EYFP的细胞或作为对照的表达EYFP的细胞的影响的图。 左图显示处理，右图显示未处理细胞。 用10μM MMS、40μM BCNU、1μM MMC或600μM TMZ处理4天、分别为图3a～d)。 所示数据来
自于至少3个实验中的一个代表性实验，在8个平行穴孔中检测了不同剂量的细胞生长。
自于至少3个实验中的一个代表性实验，在8个平行穴孔中检测了不同剂量的细胞生长。
[0223] 图4显示使用Clustal W进行的来自于智人(Homo sapiens)(NP001001655.1)、牛 (Bos Taurus)(NP 001019687.1)、 褐 鼠 (Rattus norvegicus)(XP 222273.3)、 小 家鼠(Mus musculus)(NP 778181.2)、原鸡(Gallus gallus)(XP 415188.2)和紫色球海胆(Strongylocentrotus purpuratus)(XP 797704.1)的ABH2类似物的10个N末端氨基酸的序列比对。 这些序列获自公共数据库。
[0224] 图5显示实施例4中从各种不同物种鉴定出的蛋白的序列的比对。
[0225] 图6是显示如实施例7所述的各种肽的细胞毒性分析的结果的图(图6(a)～(h))。 将HeLa细胞接种至96孔板(6000个细胞/孔)并温育3小时。 在培养基中存
在(实心菱形)或者不存在(实心方形)血清的情况下向各孔添加不同剂量的肽。1小时后，向各孔中添加含有10％或20％血清(相对于无血清培养基)的等体积的培养基。 将细胞温育48小时，然后通过MTT分析进行细胞存活测量。各图显示相对于肽浓度(μM)的细胞生长(OD 750nm)。
实施例
在(实心菱形)或者不存在(实心方形)血清的情况下向各孔添加不同剂量的肽。1小时后，向各孔中添加含有10％或20％血清(相对于无血清培养基)的等体积的培养基。 将细胞温育48小时，然后通过MTT分析进行细胞存活测量。各图显示相对于肽浓度(μM)的细胞生长(OD 750nm)。
实施例
[0226] 实施例中使用的实验程序
[0227] 表达构建体
[0228] 此前对荧光标记的表达构建体ECFP-PCNA和hABH21-261-EYFP的克隆已有说明(Aas等，2003)。 采用hABH21-261-EYFP作为模板，通过PCR生成
hABH21-10-EYFP和hABH211-261-EYFP。 分别使用NdeI/AgeI和AgeI/EcoRI将扩增
子克隆到pEYFP-N1(Clonetech)内。 将来自EST(镜像克隆物5176979(BC035374)
RZPD)的PCR产物克隆到pEYFP-C1(HindIII/Acc651)中，以得到EYFP-TFIIS-L。 通
过在Wim Vermeulen博士(Department of Cell Biology and Genetics，Rotterdam)慷慨提供的His9-HA-EGFP-XPA(Rademakers等，2003)中将EYFP变换为EGFP(NheI/BsrGI
片段)，制得EYFP-XPA构建体。 通过对来自Robert G.Roeder博士(Laboratory of
Biochemistry and Molecular Biology，The Rockefeller University，New York)慷慨提供的pI3CX-TFII-I(Roy等，1993)的TFII-I的PCR扩增并将其克隆到EYFP-N1(SacI/ApaI)
中而生成TFII-I-EYFP。 通过从William T.Beck(Division of Molecular Pharmacology，Department of MolecularGenetics，University of Illinois，Chicago) 慷 慨 提 供 的EGFP-Topo-IIα(pT 104-1)(Mo和Beck，1999)中将EGFP标签(EcoRI blunt/NheI)变换为EYFP标签(XhoI blunt/NheI)而制得EYFP-Topo-IIα。 通过用XhoI/EcoRI突出末端(overhang)对寡聚体进行退火然后克隆至其中在ATG密码子中发生突变的EYFP-N1中，制得包含F4突变体的hABH21-7-EYFP。根据 II操作手册通过定向诱变进
行所有点突变。 限制酶和小牛小肠碱性磷酸酶(CIP)来自New England Inc.，
而寡核苷酸来自MedProbe，Eurogentech(奥斯陆，挪威)。 通过测序对所有构建体进行确认。
hABH21-10-EYFP和hABH211-261-EYFP。 分别使用NdeI/AgeI和AgeI/EcoRI将扩增
子克隆到pEYFP-N1(Clonetech)内。 将来自EST(镜像克隆物5176979(BC035374)
RZPD)的PCR产物克隆到pEYFP-C1(HindIII/Acc651)中，以得到EYFP-TFIIS-L。 通
过在Wim Vermeulen博士(Department of Cell Biology and Genetics，Rotterdam)慷慨提供的His9-HA-EGFP-XPA(Rademakers等，2003)中将EYFP变换为EGFP(NheI/BsrGI
片段)，制得EYFP-XPA构建体。 通过对来自Robert G.Roeder博士(Laboratory of
Biochemistry and Molecular Biology，The Rockefeller University，New York)慷慨提供的pI3CX-TFII-I(Roy等，1993)的TFII-I的PCR扩增并将其克隆到EYFP-N1(SacI/ApaI)
中而生成TFII-I-EYFP。 通过从William T.Beck(Division of Molecular Pharmacology，Department of MolecularGenetics，University of Illinois，Chicago) 慷 慨 提 供 的EGFP-Topo-IIα(pT 104-1)(Mo和Beck，1999)中将EGFP标签(EcoRI blunt/NheI)变换为EYFP标签(XhoI blunt/NheI)而制得EYFP-Topo-IIα。 通过用XhoI/EcoRI突出末端(overhang)对寡聚体进行退火然后克隆至其中在ATG密码子中发生突变的EYFP-N1中，制得包含F4突变体的hABH21-7-EYFP。根据 II操作手册通过定向诱变进
行所有点突变。 限制酶和小牛小肠碱性磷酸酶(CIP)来自New England Inc.，
而寡核苷酸来自MedProbe，Eurogentech(奥斯陆，挪威)。 通过测序对所有构建体进行确认。
[0229] 共焦成像和FRET测量
[0230] 在进行ECFP和EYFP融合构建体的瞬时转染后(根据制造商的推荐用Fugene6(Roche Inc.)进行)，对活HeLa细胞进行16至24小时检验。使用配有Plan-Apochromate
63×/1.4油浸物镜的Zeiss LSM 510Meta激光扫描显微镜获得荧光图像。使用连续扫描，增强的青色荧光蛋白(ECFP)在λ＝458nm处激发并在λ＝470～500nm处检测，而
增强的黄色荧光蛋白(EYFP)在λ＝514nm处激发并在λ＝530～600nm处检测。 切
片的厚度为1μm。
63×/1.4油浸物镜的Zeiss LSM 510Meta激光扫描显微镜获得荧光图像。使用连续扫描，增强的青色荧光蛋白(ECFP)在λ＝458nm处激发并在λ＝470～500nm处检测，而
增强的黄色荧光蛋白(EYFP)在λ＝514nm处激发并在λ＝530～600nm处检测。 切
片的厚度为1μm。
[0231] 如果标签(EYFP和ECFP)距离小于 (10nm)，则发生荧光共振能量转移(FRET)。 使用敏化发射法，测量在供体(ECFP)激发时的受体(EYFP)发射来检测
FRET。 在用EYFP和ECFP激光分别激发(渗色)后，当在ECFP荧光色素激发后从
EYFP发光的强度强于由单独的ECFP或EYFP标记的蛋白发出的光的强度时，根据公式
1/2
FRET＝I2-I1(ID2/ID1)-I3((IA2/IA3)＞0)得到FRET。 使用公式NFRET＝FRET/(I1×I3)对FRET针对表达水平进行归一化。由在含有超过25像素的关注区(ROI)内的平均强度(I)计算NFRET，其中所有像素的强度低于250，而对于供体和受体构建体，平均强度均为
100～200。如上所述对通道1(ECFP)和通道3(EYFP)进行成像测试，通道2(FRET)在
λ＝458nm处激发并在λ＝530～600nm处检测。 采用和共转染细胞相同的设置和相
同的荧光强度(I1和I3)，确定了只用ECFP和EYFP构建体转染的细胞的ID1、ID2、ID3和IA1、IA2、IA3。 在所有实验中，包括了ECFP-PCNA和EYFP-PCNA作为阳性对照，并且由于共表达标签的二聚化，包括了从空载体表达的ECFP和EYFP蛋白作为阴性对照。
FRET。 在用EYFP和ECFP激光分别激发(渗色)后，当在ECFP荧光色素激发后从
EYFP发光的强度强于由单独的ECFP或EYFP标记的蛋白发出的光的强度时，根据公式
1/2
FRET＝I2-I1(ID2/ID1)-I3((IA2/IA3)＞0)得到FRET。 使用公式NFRET＝FRET/(I1×I3)对FRET针对表达水平进行归一化。由在含有超过25像素的关注区(ROI)内的平均强度(I)计算NFRET，其中所有像素的强度低于250，而对于供体和受体构建体，平均强度均为
100～200。如上所述对通道1(ECFP)和通道3(EYFP)进行成像测试，通道2(FRET)在
λ＝458nm处激发并在λ＝530～600nm处检测。 采用和共转染细胞相同的设置和相
同的荧光强度(I1和I3)，确定了只用ECFP和EYFP构建体转染的细胞的ID1、ID2、ID3和IA1、IA2、IA3。 在所有实验中，包括了ECFP-PCNA和EYFP-PCNA作为阳性对照，并且由于共表达标签的二聚化，包括了从空载体表达的ECFP和EYFP蛋白作为阴性对照。
[0232] 细胞系的培养和细胞提取物的制备
[0233] 通过转染(采用Fugene 6)然后通过稀释进行细胞的分选或克隆，并在补充有10％胎牛血清(FCS)、两性霉素B(250μg/ml，Sigma-Aldrich)、庆大霉素(100μg/
ml，Gibco)和谷氨酰胺(1mM，Bio )的选择性(使用今又生(genticine)，
G418，400μg/ml，Invitrogen)Dulbecco改良Eagle培养基高葡萄糖(4.5g/l)(DMEM)(Bio )中延长培养，制备稳定表达所关注构建体的HeLa细胞(宫颈癌)和
HaCaT细胞(自发转化的角化细胞)。 将细胞在37℃于5％二氧化碳的潮湿环境中培
养。 通过将细胞沉淀物以1倍压缩细胞体积(PCV)重悬于缓冲液I(10mM Tris-HCl，pH
8.0和50mM KCl)中和以1×PCV重悬于缓冲液II(10mM Tris-HCl、100mMKCl、20％甘
油、0.5％Nonidet P-40、10mM EGTA、10mM MgCl2、1mMDTT、1×完全蛋白酶抑制剂
(Roche)、磷酸酯抑制剂混合物(PIC I和PIC II，Sigma))中，制得来自HeLa的分级细胞提取物。 细胞在持续振荡下于4℃温育30分钟。 收集上清液(可溶性组分)。 将沉淀物(含有细胞核)重悬在1×PCV的缓冲液III(10mM Tris-HCl、pH 8.0和100mM KCl)
和1×PCV缓冲液II中，并进行短暂超声处理直到所有细胞核破碎。将750μg含有细胞核的组分离心，并将沉淀物(染色质结合组分)重悬在缓冲液II和III中。 用DNA酶/
RNA酶混合物(2μl 核酸内切酶(200U/μl， Biotecnologies，
WI)、2μl DNA酶(10U/μl，Roche Inc.)、2μlBensonase(250U/μl，Novagene，Ge)、
2μl微球菌核酸酶(100U/μl～300U/μl，Sigma-Aldrich)和2μl RNA酶(10mg/ml，Sigma-Aldrich))将染色质结合组分于室温温育30分钟并在37℃温育1小时。 在免疫沉淀(IP)(immunoprecipitation)期间将另外的2μl 与750μg可溶性组分于
4℃温育过夜。
ml，Gibco)和谷氨酰胺(1mM，Bio )的选择性(使用今又生(genticine)，
G418，400μg/ml，Invitrogen)Dulbecco改良Eagle培养基高葡萄糖(4.5g/l)(DMEM)(Bio )中延长培养，制备稳定表达所关注构建体的HeLa细胞(宫颈癌)和
HaCaT细胞(自发转化的角化细胞)。 将细胞在37℃于5％二氧化碳的潮湿环境中培
养。 通过将细胞沉淀物以1倍压缩细胞体积(PCV)重悬于缓冲液I(10mM Tris-HCl，pH
8.0和50mM KCl)中和以1×PCV重悬于缓冲液II(10mM Tris-HCl、100mMKCl、20％甘
油、0.5％Nonidet P-40、10mM EGTA、10mM MgCl2、1mMDTT、1×完全蛋白酶抑制剂
(Roche)、磷酸酯抑制剂混合物(PIC I和PIC II，Sigma))中，制得来自HeLa的分级细胞提取物。 细胞在持续振荡下于4℃温育30分钟。 收集上清液(可溶性组分)。 将沉淀物(含有细胞核)重悬在1×PCV的缓冲液III(10mM Tris-HCl、pH 8.0和100mM KCl)
和1×PCV缓冲液II中，并进行短暂超声处理直到所有细胞核破碎。将750μg含有细胞核的组分离心，并将沉淀物(染色质结合组分)重悬在缓冲液II和III中。 用DNA酶/
RNA酶混合物(2μl 核酸内切酶(200U/μl， Biotecnologies，
WI)、2μl DNA酶(10U/μl，Roche Inc.)、2μlBensonase(250U/μl，Novagene，Ge)、
2μl微球菌核酸酶(100U/μl～300U/μl，Sigma-Aldrich)和2μl RNA酶(10mg/ml，Sigma-Aldrich))将染色质结合组分于室温温育30分钟并在37℃温育1小时。 在免疫沉淀(IP)(immunoprecipitation)期间将另外的2μl 与750μg可溶性组分于
4℃温育过夜。
[0234] 共免疫沉淀反应(co-IP)和Western分析(WB)
[0235] 按照来自New England Inc的程序，将针对抵抗GFP蛋白培育的并且还识别EYFP和ECFP蛋白的自制亲和纯化兔多克隆抗体共价连接至蛋白-A顺磁珠
(下文称为α-GFP珠)。在持续旋转过程中用α-GFP珠(10μl)使各组分在
4℃温育过夜(IP)。 IP后，用200μl 10mMTris-HCl、50mM KCl(pH 7.5)将所述珠洗涤
4次，期间在冰上培育5分钟。然后将所述珠重悬在 (Invitrogen)加样缓冲液
和1mM DTT中，加热，在10％或4％～12％Bis-Tris-HCl(NuP )凝胶上分离并
转移到PVDF膜( Millipore)。 将所述膜在PBST(含0.1％ 20的
PBS)中的5％低脂奶粉中封闭1小时。将一抗α-PCNA(PC10，Santa Cruz biotechnology Inc.)和α-GFP在PBST中的1％奶粉中稀释并温育1小时，然后分别用二抗(多克隆兔
抗小鼠IgG/HRP和多克隆猪抗兔IgG/HRP(DakoCytomation，丹麦))温育1小时。 用化学发光试剂( West Femto Maximum，PIERCE)处理膜，并在Kodak Image
Station 2000R上显像蛋白。
(下文称为α-GFP珠)。在持续旋转过程中用α-GFP珠(10μl)使各组分在
4℃温育过夜(IP)。 IP后，用200μl 10mMTris-HCl、50mM KCl(pH 7.5)将所述珠洗涤
4次，期间在冰上培育5分钟。然后将所述珠重悬在 (Invitrogen)加样缓冲液
和1mM DTT中，加热，在10％或4％～12％Bis-Tris-HCl(NuP )凝胶上分离并
转移到PVDF膜( Millipore)。 将所述膜在PBST(含0.1％ 20的
PBS)中的5％低脂奶粉中封闭1小时。将一抗α-PCNA(PC10，Santa Cruz biotechnology Inc.)和α-GFP在PBST中的1％奶粉中稀释并温育1小时，然后分别用二抗(多克隆兔
抗小鼠IgG/HRP和多克隆猪抗兔IgG/HRP(DakoCytomation，丹麦))温育1小时。 用化学发光试剂( West Femto Maximum，PIERCE)处理膜，并在Kodak Image
Station 2000R上显像蛋白。
[0236] 序列分析
[0237] 对于初始序列分析，利用Swiss-Prot和TrEMBL数据库来找到具有与所关注的序列区相似的子序列的蛋白。 采用PROSITE格式的基序检索数据库。 使用Clustal W来对所关注序列进行比对。 通过比较基因直系同源性来鉴定列在增补文件1中的保守基序。从Inparanoid网页服务器http://inparanoid.sbc.su.se/下载了代表性生物体亚类的Inparanoid
5.1版数据文件。 将人类序列用作参照，并且使用本地工具(local tool)，用APIM基序的常规表达来检索经Inparanoid处理的fasta文件。使用略微扩展的基序限定，其中除Ile、Val和Leu之外，还允许Ala处在基序的3位或4位，但是不能同时在这两个位置上。 在总共22218条蛋白序列中，有636条序列带有至少一个针对APIM基序的记录。 将这些条目针对从网页服务器http://gpcr.biocomp.unibo.it/esldb/下载的eSLDB数据库中的实验亚细胞位置和预测亚细胞位置进行匹配，并移除了349条未表明靶向细胞核的条目。 对于所余287个条目，鉴定了相应的Inparanoid直系同源性，将相应的序列从fasta文件中取出，并用Clustal W将所得序列文库进行比对。
5.1版数据文件。 将人类序列用作参照，并且使用本地工具(local tool)，用APIM基序的常规表达来检索经Inparanoid处理的fasta文件。使用略微扩展的基序限定，其中除Ile、Val和Leu之外，还允许Ala处在基序的3位或4位，但是不能同时在这两个位置上。 在总共22218条蛋白序列中，有636条序列带有至少一个针对APIM基序的记录。 将这些条目针对从网页服务器http://gpcr.biocomp.unibo.it/esldb/下载的eSLDB数据库中的实验亚细胞位置和预测亚细胞位置进行匹配，并移除了349条未表明靶向细胞核的条目。 对于所余287个条目，鉴定了相应的Inparanoid直系同源性，将相应的序列从fasta文件中取出，并用Clustal W将所得序列文库进行比对。
[0238] 将在Inparanoid中没有直系同源性的24条序列条目从分析中除去。 平行使用两种不同的程序来鉴定保守位点。在第一种程序(共有(Consensus)程序)中，根据针对人类序列中各个命中位点进行多重比对来估测共有序列。 当进行估测时，将保守APIM基序(没有Ala)中的共有等价符号当作用于估测共有序列的等价符号，因而将例如Ile、Val和Leu当做单残基类型处理。 再次针对共有序列对常规表达物进行测试，其后接受命中位置。 在替代性程序(单独程序)中，针对每条对应于人类序列中的命中位置的直系同源性子序列来检测常规表达物，只有至少50％的直系同源性与表达物匹配的位置才被接受。 在该估测中，仅由空缺(gap)组成的子序列被排除，假定其代表例如替代性剪切变异体。 这两种程序得到几乎相同的结果，在增补文件1中列出了合并的输出结果。 总共有37个条目被该程序移除，将余下226个条目列出并进行分析。在输出中使用的蛋白说明取自未经Inparanoid处理的人fasta文件和Ensembl release45。 输出文件为html格式，并且可以用标准的网页浏览器打开。
[0239] 预测的PCNA结合肽的斑点印迹分析
[0240] 在Biotechnology centre(University of Oslo，挪威)的肽合成实验室制备了含有28nmol肽的斑点(用Ponceau染色以使斑点显像)的氨基-PEG500-UC540片(经酸固
化，并具有改善的稳定性)。 用1μg/ml PCNA对膜进行2小时的检测，然后用一抗
(α-PCNA，PC10)进行检测，并如对WB那样显影。
化，并具有改善的稳定性)。 用1μg/ml PCNA对膜进行2小时的检测，然后用一抗
(α-PCNA，PC10)进行检测，并如对WB那样显影。
[0241] 细胞存活分析
[0242] 将HeLa和HaCaT细胞接种至96孔板(4000个细胞/孔)并温育4小时。 向板孔中添加不同剂量的MMS(甲烷磺酸甲酯，Acros)、BCNU(1，3-双(2-氯乙基)-1-亚
硝基脲，Sigma)、替莫唑胺(4-甲基-5-氧-2，3，4，6，8-五氮杂双环[4.3.0]壬-2，
7，9-三烯-9-甲酰胺，TZM，Sigma)和丝裂霉素C(6-氨基-1，1a，2，8，8a，8b-六
氢-8-(羟基甲基)-8a-甲氧基-5-甲基-吖丙啶并[2′，3′：3，4]吡咯并[1，2-a]吲哚-4，7-二酮氨基甲酸酯，MMC，Sigma)。 将U2OS细胞仅暴露于MMS和TMZ。 将
细胞持续暴露，然后收集。 使用MTT分析(Mosmann，1983)在4天中每天进行细胞收
集。 测量570nm处的OD，使用来自至少6个板孔的平均值来计算细胞的存活。 所示数据来自于一个代表性实验并且重复进行了至少2次。
硝基脲，Sigma)、替莫唑胺(4-甲基-5-氧-2，3，4，6，8-五氮杂双环[4.3.0]壬-2，
7，9-三烯-9-甲酰胺，TZM，Sigma)和丝裂霉素C(6-氨基-1，1a，2，8，8a，8b-六
氢-8-(羟基甲基)-8a-甲氧基-5-甲基-吖丙啶并[2′，3′：3，4]吡咯并[1，2-a]吲哚-4，7-二酮氨基甲酸酯，MMC，Sigma)。 将U2OS细胞仅暴露于MMS和TMZ。 将
细胞持续暴露，然后收集。 使用MTT分析(Mosmann，1983)在4天中每天进行细胞收
集。 测量570nm处的OD，使用来自至少6个板孔的平均值来计算细胞的存活。 所示数据来自于一个代表性实验并且重复进行了至少2次。
[0243] 实施例1
[0244] 在本实施例中描述的这些工作研究了hABH2在复制位点的定位，并鉴定了hABH2与PCNA之间的直接相互作用以及负责这种相互作用的hABH2区域。
[0245] 在活S期细胞中，标记有绿色荧光蛋白(EGFP)的PCNA形成了呈现复制位点的明确位点，因此可以用作S期标记。
[0246] 将标记有青色荧光蛋白(ECFP)的PCNA以及与黄色荧光蛋白(EYFP)融合的各种hABH2缺失构建体共表达。 发现hABH2中的10个N末端氨基酸的缺失
(hABH211-261-EYFP)使与复制点的PCNA的共定位完全废止。 显然，当将这10个氨基酸与EYFP融合(以得到称为hABH21-10-EYFP的构建体)时，它们足以和PCNA共定位
(图1)。 显然，与只表达hABH2构建体的细胞相比，ECFP-PCNA的共表达加强了全长
hABH2(hABH21-261-EYFP)以及hABH21-10-EYFP在核心位点的定位。 这表明hABH2的
10个N末端氨基酸介导PCNA和hABH2之间的直接相互作用。
(hABH211-261-EYFP)使与复制点的PCNA的共定位完全废止。 显然，当将这10个氨基酸与EYFP融合(以得到称为hABH21-10-EYFP的构建体)时，它们足以和PCNA共定位
(图1)。 显然，与只表达hABH2构建体的细胞相比，ECFP-PCNA的共表达加强了全长
hABH2(hABH21-261-EYFP)以及hABH21-10-EYFP在核心位点的定位。 这表明hABH2的
10个N末端氨基酸介导PCNA和hABH2之间的直接相互作用。
[0247] 为了检测hABH2与PCNA之间的靠近程度，测量了荧光共振能量转移(FRET)。 全长hABH2-EYFP和hABH21-10-EYFP均与ECFP-PCNA产生阳性FRET，显
示出荧光标签之间的距离小于 这表明hABH2变异体直接与ECFP-PCNA相互作用
或者与ECFP-PCNA位于同一复合物中(图2)。
示出荧光标签之间的距离小于 这表明hABH2变异体直接与ECFP-PCNA相互作用
或者与ECFP-PCNA位于同一复合物中(图2)。
[0248] 为 了 证 实 直 接 相 互 作 用， 使 用 来 自 稳 定 表 达 hABH2-EYFP、hABH211-261-EYFP、hABH21-10-EYFP或EYFP的细胞的蛋白提取物进行共免疫沉淀研究。 使用抗GFP抗体来使相应的融合蛋白进行免疫沉淀。 随后的蛋白印迹分析
显示，内源性PCNA被hABH21-216-EYFP和hABH21-10-EYFP所沉淀，但是没有被
hABH211-261-EYFP或EYFP所沉淀。 总之，这些结果表明hABH2直接与PCNA相互作
用，并且结合序列包含在hABH2的10个N末端氨基酸中。
显示，内源性PCNA被hABH21-216-EYFP和hABH21-10-EYFP所沉淀，但是没有被
hABH211-261-EYFP或EYFP所沉淀。 总之，这些结果表明hABH2直接与PCNA相互作
用，并且结合序列包含在hABH2的10个N末端氨基酸中。
[0249] 实施例2
[0250] 检测了hABH21-10抑制hABH2的能力。
[0251] 将只表达hABH21-10-EYFP或EYFP的细胞系暴露于烷基化剂MMS(甲磺酸甲酯)、BCNU(卡氮芥)、替莫唑胺(TZM)或丝裂霉素C(MMC)。MMS是产生由hABH2
修复的3-甲基胞嘧啶(3meC)和1-甲基腺嘌呤(1meA)的SN2烷基化剂，而BCNU是
6
O-氯乙基化剂，其主要导致链间交联和一些单碱基环化加合物(1，N(6)乙醛腺嘌呤)。
6
据报道，TZM是OG甲基化剂，而MMC通过CpG中的鸟嘌呤的N-烷基化而导致链间
交联。
修复的3-甲基胞嘧啶(3meC)和1-甲基腺嘌呤(1meA)的SN2烷基化剂，而BCNU是
6
O-氯乙基化剂，其主要导致链间交联和一些单碱基环化加合物(1，N(6)乙醛腺嘌呤)。
6
据报道，TZM是OG甲基化剂，而MMC通过CpG中的鸟嘌呤的N-烷基化而导致链间
交联。
[0252] 虽然过表达hABH21-10-EYFP或EYFP并没有影响未处理细胞的生长速度，但是发现hABH21-10-EYFP的表达使HeLa细胞对用MMS进行的处理敏化。 令人惊讶的是，还发现hABH21-10-EYFP的表达使HeLa细胞对所有其他受测细胞抑制剂敏化(图3)。这表明敏感性的增加不仅只由hABH2抑制所导致(hABH2据信主要修复3meC和1meA)。
[0253] 从以前的研究知道，小鼠Abh2-/-细胞，即ABH2敲除细胞显示出对MMS的敏感性增加，但是对BCNU的敏感性并没有增加。 因此，表达hABH21-10-EYFP的细胞对诸如BCNU等细胞抑制剂的敏感性增加不能仅解释为由hABH2的抑制所造成。
[0254] 稳定表达hABH21-10-EYFP的HaCaT(自发转化角化细胞)细胞也对MMS和TMZ极为敏感。
[0255] 对用不同烷基化剂处理后的细胞的流动彗星测试分析(Flow and comet assay analysis)表明，所述药物对细胞周期的影响不同，如彗星测试所检测诱导不同水平和不同模式的DNA修复中间体(脱碱基位点、SSB、DSB)。MMS导致S期停止(第1天)，并在4小时后出现最高水平的DNA修复中间体。 然而，经MMS处理的细胞显示出正常
的细胞周期分布，在第2天DNA修复中间体的水平没有升高。 类似于MMS，TMZ也
在4小时后导致最高水平的DNA修复中间体，但是细胞停滞于G2/M直到第3天，表现
出不同的损伤和修复模式。 此外，和所有其他3种检测试剂相比，TMZ诱导了更多的链
6 6
断裂。这令人惊讶，因为据信TMZ主要诱导O 甲基-G(O 甲基-G由MGMT通过直接
修复机制修复)，不涉及任何碱基的移除或链断裂。BCNU处理在第1天导致瞬时G2/M
停滞和非常低水平的修复中间体，表明含有交联物的大部分细胞死亡。 另外，MMC处理在第1和2天导致S期停滞，这对于hABH21-10-EYFP表达细胞而言更为显著(和对照
细胞相比)。 细胞在第3天的G2/M中仍然停滞。 在MMC处理后的彗星测试中没有观
察到细胞系之间的显著差异，但是在第2天，修复中间体的数目最大。
的细胞周期分布，在第2天DNA修复中间体的水平没有升高。 类似于MMS，TMZ也
在4小时后导致最高水平的DNA修复中间体，但是细胞停滞于G2/M直到第3天，表现
出不同的损伤和修复模式。 此外，和所有其他3种检测试剂相比，TMZ诱导了更多的链
6 6
断裂。这令人惊讶，因为据信TMZ主要诱导O 甲基-G(O 甲基-G由MGMT通过直接
修复机制修复)，不涉及任何碱基的移除或链断裂。BCNU处理在第1天导致瞬时G2/M
停滞和非常低水平的修复中间体，表明含有交联物的大部分细胞死亡。 另外，MMC处理在第1和2天导致S期停滞，这对于hABH21-10-EYFP表达细胞而言更为显著(和对照
细胞相比)。 细胞在第3天的G2/M中仍然停滞。 在MMC处理后的彗星测试中没有观
察到细胞系之间的显著差异，但是在第2天，修复中间体的数目最大。
[0256] 通常，通过彗星测试，不可能检测到表达EYFP和hABH21-10-EYFP的细胞之间的修复中间体的量中的任何显著差异。 彗星和流动分析显示，所用的不同试剂诱导不同的细胞周期响应和不同的修复模式。 不过，与表达EYFP的细胞相比，所有试剂在表达APIM的细胞中的细胞毒性都增加，因而表明含有若干个APIM的蛋白在对修复或细胞死亡之间的调控中起作用。
[0257] 实施例3
[0258] 来自多种不同物种的数据库序列ABH2的比对揭示，7个N末端氨基酸被高度保留(图4)。为了鉴定结合序列，使用斑点印迹分析检测了这些氨基酸对肽-PCNA相互作用的重要性。其中特别发现Arg3和Lys7可以相互取代，并且Leu5和Val6可以相互取代或者被其它脂肪族氨基酸(如Ile和Ala)所取代，这不影响对PCNA的表观亲和力。 而且，完全保守的氨基酸序列Phe4可以被Tyr所替换，而Ala处于该位置会显著减弱PCNA结合。
[0259] 氨基酸1～2和8～10用Ala取代不影响PCNA结合，表明五肽RFLVK(SEQID NO.2)是核心相互作用序列。
[0260] 进一步测试表明，所述五肽自身对于PCNA结合已经足够，但是额外的侧翼氨基酸增强了所述相互作用。
[0261] 接着，将hABH2的氨基酸1～7以及其中用Tyr、Trp或Ala替换Phe4的该序列的变异体与EYFP融合表达并检测与PCNA的体内共定位。 和在斑点印迹分析中所见相似，在4位含有芳香族氨基酸的融合蛋白与ECFP-PCNA共定位，而在该位置带有Ala的蛋白没有与ECFP-PCNA共定位。
[0262] 实施例4
[0263] 利用Swiss-Prot和TrEMBL数据库寻找带有和已被鉴定为负责hABH2与PCNA结合的序列相似的子序列的蛋白。 使用共有[KR]-[FYW]-[LIVA]-[LIVA]-[KR](SEQ ID NO.30)作为询查条目，获得了226条命中记录(总结见表1)，其中选择若干条人类蛋白用于进一步分析。
[0264] 一条蛋白是和hABH2类似的在其7个N末端氨基酸中含有以上共有序列的蛋白。 该蛋白还含有见于TFIIS延长因子(用于使停滞的转录继续进行的重要蛋白)的保守的N末端域I。 本发明人将该蛋白命名为TFIIS样蛋白(TFIIS-L)。 该蛋白的功能是未知的。
[0265] 第二条蛋白是多功能转录因子TFII-I，其含有4条共有序列。TFII-I对于细胞周期控制和增生是关键的，过表达TFII-I的细胞的γ-H2AX位点(DNA双链断裂的标记)的存留增加，表明TFII-I在DNA修复中具有作用。
[0266] 还检测了含有一个共有序列的DNA拓扑异构酶α(Topo IIα)。 Topo IIα在后复制DNA解链和DNA分离中起作用。
[0267] 共有序列还见于识别螺旋扭结的关键的核苷酸切除修复蛋白(NER)XPA内部。
[0268] 共有序列还见于RAD51B，RAD51B是一种已据显示对正确的中心体功能和染色体分离具有重要性的同源重组蛋白。
[0269] 另一种蛋白是范科尼贫血核心复合蛋白FANCC，发现该蛋白含有一个共有序列。 范科尼贫血(FA)是一种罕见的遗传病症，其特征是再生障碍性贫血、白血病易感性增加和对交联剂的超敏性。 FA核心复合物已据显示参与DNA损伤激活的信号转导途径，该途径调控交联剂的DNA修复。
[0270] 在所有这些蛋白中，发现所推定的PCNA结合基序在不同的物种中是保守的(图5)。 在这5种蛋白中，只有Topo IIα和FANCC(损伤后)曾经被报道过与BRCA1在核
S期位点处共定位，并且Topo IIα是仅有的含有可能的PIP盒(QttLaFkp，aa 1277-84)的蛋白，本发明人现已表明，这些蛋白中每一个和每一种的EYFP融合蛋白在S期位点都与ECFP-PCNA共定位。
S期位点处共定位，并且Topo IIα是仅有的含有可能的PIP盒(QttLaFkp，aa 1277-84)的蛋白，本发明人现已表明，这些蛋白中每一个和每一种的EYFP融合蛋白在S期位点都与ECFP-PCNA共定位。
[0271] 所发现的其他令人关注的含有APIM的蛋白是参与若干种DNA维护过程(包括DNA修复)的多(ADP-核糖)家族成员(PARP-1、2和4)、参与解决由复制叉引起的
拓扑学问题的解除的PARP-1伴侣和Topo IIα同型DNA拓扑异构酶IIβ。 另外，APIM见于同时参与点突变和大规模基因组稳定化的跨损伤聚合酶ζ的REV3L亚基、同时参与DNA复制和修复的DNA连接酶I和IV、全部参与细胞周期、基因组维护和完整性的
调控的4种E3泛素-蛋白连接酶(UHRF1和UHRF2/NIRF、UBR1和2)、以及若干种其
他E3泛素连接酶(表1)。 令人感兴趣的是，E3泛素连接酶在乳腺肿瘤发生中屡屡显示出在遗传上或表达上被改变。 N-酰基转移酶ESCO1/EFO1同样含有APIM，酵母菌直
系同源物通过该蛋白的截短PIP盒来结合PCNA，并且该蛋白参与正确的姐妹染色单体粘连和染色体蛋白5(hSMC5)的人类结构维护，据显示hSMC5参与由HR导致的双链断裂
的DNA修复和ALT细胞中的调聚物维护。最后，发现通用转录因子II和III的若干种亚基、RNA聚合酶II的亚基和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶含有APIM基序(表1)。
拓扑学问题的解除的PARP-1伴侣和Topo IIα同型DNA拓扑异构酶IIβ。 另外，APIM见于同时参与点突变和大规模基因组稳定化的跨损伤聚合酶ζ的REV3L亚基、同时参与DNA复制和修复的DNA连接酶I和IV、全部参与细胞周期、基因组维护和完整性的
调控的4种E3泛素-蛋白连接酶(UHRF1和UHRF2/NIRF、UBR1和2)、以及若干种其
他E3泛素连接酶(表1)。 令人感兴趣的是，E3泛素连接酶在乳腺肿瘤发生中屡屡显示出在遗传上或表达上被改变。 N-酰基转移酶ESCO1/EFO1同样含有APIM，酵母菌直
系同源物通过该蛋白的截短PIP盒来结合PCNA，并且该蛋白参与正确的姐妹染色单体粘连和染色体蛋白5(hSMC5)的人类结构维护，据显示hSMC5参与由HR导致的双链断裂
的DNA修复和ALT细胞中的调聚物维护。最后，发现通用转录因子II和III的若干种亚基、RNA聚合酶II的亚基和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶含有APIM基序(表1)。
[0272] 表1
[0273]
[0274]
[0275]
[0276] 粗体字：在正常条件下或者DNA损伤后位于复制位点的蛋白。
[0277] 该项目*或其他项目如下：
[0278] 1 G.L.Moldovan，B.Pfander和S.Jentsch，Cell 129(4)，665(2007).
[0279] 2 Z.Lou，K.Minter-Dykhouse和J.Chen，Nat Struct Mol Biol 12(7)，589(2005)；A.Niimi，N.Suka，M.Harata等，Chromosoma 110(2)，102(2001).
[0280] 3 C.M.Simbulan-Rosenthal，D.S.Rosenthal，S.Iyer 等，Molecular and cellular biochemistry 193(1-2)，137(1999).
[0281] 4 C.Jacquemont和T.Taniguchi，BMC biochemistry 8 Suppl 1，S10(2007).[0282] 5 P.R.Potts，M.H.Porteus和H.Yu，Embo J 25(14)，3377(2006).
[0283] 6 P.L.Opresko，M.Otterlei，J.Graakjaer等，Mol Cell 14(6)，763(2004).[0284] 实施例5
[0285] 通过实验测定在实施例4中研究的蛋白中的共有序列的功能。 由于用Ala取代共有序列中的芳香族氨基酸Phe废止了体外PCNA相互作用和体内与PCNA的共定位，因此测定相应的突变是否对全长蛋白具有类似的影响。 在全长hABH2中的Phe4突变为Ala使与PCNA的共定位废止。 在含有所述基序中的4个基序的TFII-I中，将Phe残基
(F431A、F536A、F641A和F803A)单独取代以及全部取代为Ala。 单个突变没有减少
与PCNA的共定位，但是TFII-I中的所有共有序列的突变显著降低了复制位点中与PCNA的共定位，表明存在于同一种蛋白中的若干种共有序列基序可能促成最佳的PCNA相互作用。
(F431A、F536A、F641A和F803A)单独取代以及全部取代为Ala。 单个突变没有减少
与PCNA的共定位，但是TFII-I中的所有共有序列的突变显著降低了复制位点中与PCNA的共定位，表明存在于同一种蛋白中的若干种共有序列基序可能促成最佳的PCNA相互作用。
[0286] 参考文献
[0287] Aas，P.A.，Otterlei，M.，Falnes，P.O.，Vagbo，C.B.，Skorpen，F.，Akbari，M.，Sundheim，O.，Bjoras，M.，Slupphaug，G.，Seeberg，E.和Krokan，H.E.(2003).Human and bacterial oxidative demethylases repair alkylation damage in both RNA and DNA.Nature 421，859-863.
[0288] Mo，Y.Y. 和 Beck，W.T.(1999).Association of human DNA topoisomerase IIalpha with mitotic chromosomes in mammalian cells is independent of its catalytic activity.Experimental cell research 252，50-62.
[0289] Mosmann，T.(1983).Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays.Journal of immunological methods 65，
55-63.
55-63.
[0290] Rademakers，S.，Volker，M.，Hoogstraten，D.，Nigg，A.L.，Mone，M.J.，Van Zeeland，A.A.，Hoeijmakers，J.H.，Houtsmuller，A.B. 和 Vermeulen，W.(2003).Xeroderma pigmentosum group A protein loads as a separate factor onto DNA lesions.Mol Cell Biol 23，5755-5767.
[0291] Roy，A.L.，Malik，S.，Meisterernst，M.和Roeder，R.G.(1993).An alternative pathway for transcription initiation involving TFII-I.Nature 365，355-359.[0292] 实施例6
[0293] 含有带信号序列的含基序(″APIM″)的肽的构建体的制备和测试
[0294] 使用常规技术合成了SEQ ID NO.98～117的肽，并且也使用常规技术引入荧光标签(所指出处)。 所述肽显示在表3中，表3显示每条肽的氨基酸序列，并且还分开列出构成各条肽的各个组分(含有基序( “APIM”)的肽、NLS、CPP和连接子(必要时)以及所用的标签(包含时))。SEQ ID NO.98～116的肽由L-氨基酸组成。SEQ ID
NO.117的肽RI-MDR26-3是由D-氨基酸构成的逆反肽。 表3所示的所有肽具有至少一
个APIM肽、NLS和CPP。
NO.117的肽RI-MDR26-3是由D-氨基酸构成的逆反肽。 表3所示的所有肽具有至少一
个APIM肽、NLS和CPP。
[0295] 进行各种研究以显示所述肽对细胞的影响。 于是，使用基于上述实施例中所述内容的技术，将细胞与所述肽一起温育以确定所述肽在细胞中的位置。 简而言之，将据指示以荧光标签标记的肽与细胞(HeLa细胞)温育，使用共焦显微镜检测细胞摄入物。
[0296] 使用如下所述的MTT测定和克隆生成测定(CFU测定)研究所述肽在敏化细胞中对细胞抑制药物效应的影响。
[0297] 单独使用所述肽，在没有细胞抑制药物的情况下，通过下文所述的MTT测定研究了所述肽的细胞毒性。还从细胞抑制药物MTT测试中所用的对照(带有肽但是不带细胞抑制药的对照)获得细胞毒性数据，其中对对照肽跟踪的时间更长(4天)。
[0298] 如下所述，还对膜毒性进行了研究。
[0299] 在含血清培养基中温育所述肽后，通过肽的MS分析研究肽的稳定性。
[0300] MTT测定
[0301] 将HeLa细胞接种到96孔板(6000个细胞/孔)中并温育3小时。 向板孔中添加不同剂量的MMS和顺铂。24小时后，向无血清培养基中的细胞添加肽并温育1小时。
添加含有细胞抑制药物的新鲜培养基，并在再经过24、48和72小时后收获细胞。 向细胞中添加MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)并于570nm[52]测
量OD，采用来自至少6个孔的平均值来计算细胞存活。所提供的数据来自于一个代表性的实验，并且重做至少2次。
添加含有细胞抑制药物的新鲜培养基，并在再经过24、48和72小时后收获细胞。 向细胞中添加MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)并于570nm[52]测
量OD，采用来自至少6个孔的平均值来计算细胞存活。所提供的数据来自于一个代表性的实验，并且重做至少2次。
[0302] 克隆生成(CFU)测定
[0303] 将750个HeLa细胞接种到10cm细胞培养皿中的11ml含有细胞抑制药物(MMS)的生长培养基中。 第2天，在无血清条件下用肽处理细胞1小时。 向细胞添加含有新鲜细胞抑制药物的新鲜培养基以再温育10天。然后将细胞在PBS中的6％戊二醛中室温固定15分钟，在PBS中洗涤一次，用结晶紫染色，并对集落形成单元进行计数。仅将由至少50个细胞组成的集落包括在内。
[0304] 细胞毒性测定
[0305] 48小时后，使用MTT测定来测量所述肽的细胞毒性。 将HeLa细胞接种到96孔板(6000个细胞/孔)并温育3小时。 在培养基中存在或不存在血清的情况下向板孔中添加不同剂量的肽。1小时后，添加1×或2×等体积的培养基(对于无血清培养基而
言)并将细胞温育48小时，然后添加MTT(见上文)。
言)并将细胞温育48小时，然后添加MTT(见上文)。
[0306] 通过流式细胞术测定膜毒性
[0307] 用不同浓度的肽(2μM、4μM和8μM)处理细胞1小时。 接着，添加碘化丙啶(PI)(PBS中50μg/ml)，如果细胞膜具有渗透性，则这会将DNA染色。 在随后的10分钟内在FACS Canto流式细胞仪(BD-Life Science)中进行分析。
[0308] 结果显示在图4中。 从中可以看出，所有受测的经标签标记的肽定位于核内，所述肽基本上是含APIM肽的带有CPP和NLS的构建体。这种效应见于带有连接构建体的各个组分的不同连接子序列的肽、具有不同长度的连接子以及不带连接子序列的肽。
这表明连接子序列的存在并非必要，并且连接子序列可以不同。
这表明连接子序列的存在并非必要，并且连接子序列可以不同。
[0309] 使用细胞抑制剂进行的MTT和CFU实验的结果显示出肽在增加细胞抑制剂的生长抑制效应中的影响。因此，所述肽能够使细胞对细胞抑制剂的效应敏感。 这种效应类似于以上实施例2中针对表达含APIM的肽的转染细胞系所报道的效应。
[0310] 表4还显示了许多肽的细胞毒性效应。 进一步的实验工作(数据未示出)表明，与那些并非定位于细胞核的肽相比，据观察定位于细胞核的肽具有较高的细胞毒性效应。 采用一种肽(MDR2；SEQ ID NO.98)进行的膜毒性实验似乎表明膜毒性较低，这可能表明针对该肽所观察到的细胞毒性效应并非缘自膜效应。 据观察在一些情况中，仅在肽浓度增加时才可以看到细胞毒性效应(例如，在肽为1μM时可能看不到细胞毒性(但可看到使细胞对细胞抑制剂敏感的效应))，而在肽为2μM时，看到了肽自身的细胞毒性效应以及敏化效应)。
[0311] 表4中的结果还显示，采用不同的NLS和/或CPP序列可以获得所述肽在进入细胞和定位至细胞核、使细胞对细胞抑制剂敏感、以及在细胞毒性中的效应，但是效应的量级或程度可能有所不同，所述效应似乎并不依赖于特定的NLS和/或CPP序列。
[0312] 如表3和4所示，某些肽在N末端引入有Ac基团。 将其包含在内的目的是使所述肽在血清和细胞溶质中稳定。 肽MDR26-72-0(SEQ ID NO.112)在CFU和MTT测
试以及细胞毒性测试中显示出良好的稳定性和良好的活性。 MDR26-72-0含有作为CPP的富含R的序列。 据信采用等价的肽可以获得同样好的结果，在所述等价肽中，将CPP以源自或基于穿透素或HIV-TAT(其中NLS可以源自SV40或UNG2)的CPP替换。
试以及细胞毒性测试中显示出良好的稳定性和良好的活性。 MDR26-72-0含有作为CPP的富含R的序列。 据信采用等价的肽可以获得同样好的结果，在所述等价肽中，将CPP以源自或基于穿透素或HIV-TAT(其中NLS可以源自SV40或UNG2)的CPP替换。
[0313]
[0314]
[0315]
[0316] 实施例7
[0317] 进一步的细胞毒性数据
[0318] 在该实施例中，提供了更为详细的来自细胞毒性测试的数据。 细胞毒性测试如以上实施例6所述进行。 结果显示在图6中，图6显示了针对肽MDR26-0(SEQ IDNO.100)、MDR26-3(SEQ ID NO.103)、MDR26-4(SEQ ID NO.104)、MDR26-8(SEQ
ID NO.106)、MDR26-7(SEQ ID NO.105)、MDR26-72-0(SEQ ID NO.112)、
MDR26-72-01(SEQ ID NO.115)和MDR34(SEQ ID NO.116)的MTT细胞毒性测试结果。
ID NO.106)、MDR26-7(SEQ ID NO.105)、MDR26-72-0(SEQ ID NO.112)、
MDR26-72-01(SEQ ID NO.115)和MDR34(SEQ ID NO.116)的MTT细胞毒性测试结果。
[0319] 可见，能够观察到肽的细胞毒性，而在没有血清的情况下具有更为明显的效果。 对于具有1个APIM基序的所有MDR26变体肽都可以看到细胞毒性。 对于具有2个APIM基序的MDR34变体看到更高的细胞毒性。 对于与没有标签(MDR34-0)的
MDR34(SEQ ID NO.116)或者作为MDR34的反向(I-MDR-34)或逆反(RI-MDR-34)等
效物的MDR34相对应的肽，获得了类似的显示细胞毒性的结果。 不具有NLS序列而是具有作为连接子2的延长连接子序列IILVIII(SEQ ID.NO.95)的MDR34-2显示出较低的细胞毒性。
MDR34(SEQ ID NO.116)或者作为MDR34的反向(I-MDR-34)或逆反(RI-MDR-34)等
效物的MDR34相对应的肽，获得了类似的显示细胞毒性的结果。 不具有NLS序列而是具有作为连接子2的延长连接子序列IILVIII(SEQ ID.NO.95)的MDR34-2显示出较低的细胞毒性。
[0320] 实施例8
[0321] 还进行了证实PCNA和含APIM肽之间的相互作用的进一步实验。 共免疫沉淀(co-IP)实验显示，内源性PCNA和来自稳定表达EYFP-PCNA的细胞的EYFP-PCNA均能够使hABH2沉淀。 在富含染色质组分中所见的更多的hABH2和PCNA之间的相互作
用表明，在PCNA或hABH2上具有后翻译修饰。在这些实验中，使用偶联有抗α-EYFP
抗体的磁珠展示出来自稳定表达EYFP-PCNA的细胞的hABH2的co-IP。 用α-hABH2
对膜进行检测，再用α-PCNA抗体进行检测。 使用偶联有抗α-PCNA抗体的磁珠也展示出来自仅表达内源性蛋白的hABH2的co-IP。 使用α-hABH2对膜进行检测，再用
α-PCNA抗体进行检测。
用表明，在PCNA或hABH2上具有后翻译修饰。在这些实验中，使用偶联有抗α-EYFP
抗体的磁珠展示出来自稳定表达EYFP-PCNA的细胞的hABH2的co-IP。 用α-hABH2
对膜进行检测，再用α-PCNA抗体进行检测。 使用偶联有抗α-PCNA抗体的磁珠也展示出来自仅表达内源性蛋白的hABH2的co-IP。 使用α-hABH2对膜进行检测，再用
α-PCNA抗体进行检测。
[0322] 显示体内交联的进一步的实验证实APIM和PCNA之间的直接结合。 使用α-FLAG亲和凝胶对来自稳定表达hABH21-7-EYFP 3×FLAG和hABH21-7-F4A-EYFP
3×FLAG的细胞的交联或逆向交联FLAG融合蛋白进行免疫沉淀。 使用α-PCNA或
α-FLAG抗体通过蛋白印迹分析IP洗脱组分。
3×FLAG的细胞的交联或逆向交联FLAG融合蛋白进行免疫沉淀。 使用α-PCNA或
α-FLAG抗体通过蛋白印迹分析IP洗脱组分。
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