中和催乳素受体抗体及其治疗用途
阅读：1012发布：2020-06-19
专利汇可以提供中和催乳素受体抗体及其治疗用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及中和催乳素受体 抗体 006-H08及其成熟形式，和 抗原 结合 片段 ，包含它们的药物组合物，以及它们在 治疗 或 预防 催乳素受体介导的良性病症和适应症如子宫内膜异位症、子宫腺肌病、非 激素 女性避孕、良性乳房 疾病 和乳腺痛、泌乳抑制、 良性前列腺增生 、 纤维 瘤、高催乳素血症性和正常催乳素血症性脱发中的用途，以及在联合激素疗法中协同治疗以抑制乳腺上皮 细胞增殖 的用途。本发明的抗体阻断催乳素受体介导的 信号 传导。，下面是中和催乳素受体抗体及其治疗用途专利的具体信息内容。
1.抗体或其确定的成熟变体或其抗原结合片段，其拮抗催乳素受体介导的信号传导并且结合至催乳素受体及其人多态变体的胞外域的表位，其中所述催乳素受体的胞外域的氨基酸序列对应SEQ ID NO:70，并且核酸序列对应SEQ ID NO:71，
其中所述抗体的可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:7的HCDR2和SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述抗体的可变轻链包含对应于SEQ ID NO:18的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2和SEQ ID NO:29的LCDR3的CDR序列，
其中所述成熟变体通过多样化所述抗体的可变轻链的LCDR3的序列、可变重链的HCDR3的序列、可变轻链的LCDR1的序列和/或可变重链的HCDR2的序列中的一个或多个氨基酸残基获得，且
其中所述成熟变体的可变重链和可变轻链选自以下组中：
b.所述可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:74的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述可变轻链包含对应于SEQ ID NO:78的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、SEQ ID NO:90的LCDR3的CDR序列；或者
d.所述可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:7的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述可变轻链包含对应于SEQ ID NO:82的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、SEQ ID NO:29的LCDR3的CDR序列；或者
e.所述可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:7的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述可变轻链包含对应于SEQ ID NO:86的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、SEQ ID NO:29的LCDR3的CDR序列；或者
f.所述可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:74的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述可变轻链包含对应于SEQ ID NO:87的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、SEQ ID NO:100的LCDR3的CDR序列；或者
h.所述可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:74的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述可变轻链包含对应于SEQ ID NO:89的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、SEQ ID NO:93的LCDR3的CDR序列；或者
i.所述可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:74的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述可变轻链包含对应于SEQ ID NO:79的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、SEQ ID NO:101的LCDR3的CDR序列；或者
k.所述可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:7的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述可变轻链包含对应于SEQ ID NO:18的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、SEQ ID NO:100的LCDR3的CDR序列；或者
l.所述可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:7的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述可变轻链包含对应于SEQ ID NO:18的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、SEQ ID NO:97的LCDR3的CDR序列；或者
m.所述可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:7的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述可变轻链包含对应于SEQ ID NO:18的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、SEQ ID NO:98的LCDR3的CDR序列；或者
p.所述可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:7的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述可变轻链包含对应于SEQ ID NO:18的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、SEQ ID NO:94的LCDR3的CDR序列；或者
q.所述可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:74的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述可变轻链包含对应于SEQ ID NO:88的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、SEQ ID NO:90的LCDR3的CDR序列；或者
r.所述可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:74的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述可变轻链包含对应于SEQ ID NO:81的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、SEQ ID NO:95的LCDR3的CDR序列；或者
s.所述可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:75的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述可变轻链包含对应于SEQ ID NO:18的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、SEQ ID NO:29的LCDR3的CDR序列；或者
t.所述可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:77的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述可变轻链包含对应于SEQ ID NO:18的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、SEQ ID NO:29的LCDR3的CDR序列；或者
u.所述可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:7的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述可变轻链包含对应于SEQ ID NO:80的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、SEQ ID NO:29的LCDR3的CDR序列；或者
v.所述可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:7的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述可变轻链包含对应于SEQ ID NO:85的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、SEQ ID NO:29的LCDR3的CDR序列；或者
w.所述可变重链包含对应于SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:7的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的CDR序列，并且所述可变轻链包含对应于SEQ ID NO:84的LCDR1、SEQ ID NO:24的LCDR2、SEQ ID NO:29的LCDR3的CDR序列。
2.如权利要求1所述的抗体或其确定的成熟变体或抗原结合片段，包括：
a.对应于SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:40的氨基酸序列的可变轻链结构域；
b.对应于SEQ ID NO:143的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:165的氨基酸序列的可变轻链结构域；
d.对应于SEQ ID NO:145的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:167的氨基酸序列的可变轻链结构域；
e.对应于SEQ ID NO:146的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:168的氨基酸序列的可变轻链结构域；
f.对应于SEQ ID NO:147的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:169的氨基酸序列的可变轻链结构域；
h.对应于SEQ ID NO:149的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:171的氨基酸序列的可变轻链结构域；
i.对应于SEQ ID NO:150的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:172的氨基酸序列的可变轻链结构域；
k.对应于SEQ ID NO:152的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:174的氨基酸序列的可变轻链结构域；
l.对应于SEQ ID NO:153的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:175的氨基酸序列的可变轻链结构域；
m.对应于SEQ ID NO:154的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:176的氨基酸序列的可变轻链结构域；
p.对应于SEQ ID NO:157的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:179的氨基酸序列的可变轻链结构域；
q.对应于SEQ ID NO:158的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:180的氨基酸序列的可变轻链结构域；
r.对应于SEQ ID NO:159的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:181的氨基酸序列的可变轻链结构域；
s.对应于SEQ ID NO:160的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:182的氨基酸序列的可变轻链结构域；
t.对应于SEQ ID NO:161的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:183的氨基酸序列的可变轻链结构域；
u.对应于SEQ ID NO:162的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:184的氨基酸序列的可变轻链结构域；
v.对应于SEQ ID NO:163的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:185的氨基酸序列的可变轻链结构域；
w.对应于SEQ ID NO:164的氨基酸序列的可变重链结构域和SEQ ID NO:186的氨基酸序列的可变轻链结构域。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其确定的成熟变体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其确定的成熟变体或其抗原结合片段由抗原结合区组成，所述抗原结合区特异性结合至催乳素受体的一个或多个区域，或者对催乳素受体的一个或多个区域具有高亲和力，催乳素受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:70的人多态变体的氨基酸位置1-210所示，其中亲和力为至少100nM。
4.如权利要求3所述的抗体或其确定的成熟变体或其抗原结合片段，其中所述亲和力低于100nM。
5.如权利要求3所述的抗体或其确定的成熟变体或其抗原结合片段，其中所述亲和力低于30nM。
6.如权利要求3所述的抗体或其确定的成熟变体或其抗原结合片段，其中所述亲和力低于1nM。
7.如权利要求1或2所述的抗体或其确定的成熟变体或其抗原结合片段，其中所述重链恒定区为修饰或未修饰的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
8.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-7中任一项所述的抗体或其确定的成熟变体或其抗原结合片段。
9.如权利要求8所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分子由选自以下组中的序列所示：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:331、SEQ ID NO:333至SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:337至SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:340至SEQ ID NO:342、SEQ ID NO:345至SEQ ID NO:353、SEQ ID NO:355至SEQ ID NO:357、SEQ ID NO:359至SEQ ID NO:360、SEQ ID NO:362至SEQ ID NO:364和SEQ ID NO:367至SEQ ID NO:374。
10.表达载体，其包含权利要求8或9的分离的核酸分子。
11.宿主细胞，其包含权利要求10的载体或者权利要求8或9的分离的核酸分子，其中所述宿主细胞是高等真核宿主细胞、低等真核宿主细胞或原核细胞。
12.如权利要求11所述的宿主细胞，其中所述原核细胞是细菌细胞。
13.一种利用权利要求11或12的宿主细胞产生抗体或其确定的成熟变体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在合适的条件下培养权利要求11或12的宿主细胞，并回收所述抗体或其确定的成熟变体或其抗原结合片段。
14.通过权利要求13的方法产生的如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其确定的成熟变体或其抗原结合片段。
15.如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其确定的成熟变体或其抗原结合片段，其纯化至至少95重量％同质性。
16.权利要求1-7中任一项所述的抗体或其确定的成熟变体或其抗原结合片段在制备药物中的应用。
17.一种药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的抗体或其确定的成熟变体或其抗原结合片段以及药学可接受的载体，所述载体包含赋形剂和助剂。
18.权利要求17所述的药物组合物，进一步包含至少一种其它试剂。
19.试剂盒，其包含治疗有效量的如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其成熟变体或其抗原结合片段，包装在容器中，所述试剂盒任选包含第二治疗剂，并且还包含附着至所述容器或者与所述容器一起包装的标签，所述标签描述所述容器的内容物并提供使用所述容器的内容物的适应症和/或说明书以治疗子宫内膜异位症、子宫腺肌病、良性乳房疾病和乳腺痛、泌乳抑制、高催乳素血症性和正常催乳素血症性脱发、良性前列腺增生、纤维瘤，或者用于非激素女性避孕，或者治疗联合激素疗法下的妇女以抑制乳腺上皮细胞增殖。
20.如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其成熟变体或其抗原结合片段在制备用于治疗和/或预防子宫内膜异位症的药物中的应用。
21.如权利要求20所述的应用，其中所述子宫内膜异位症是子宫腺肌病。
22.如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其成熟变体或其抗原结合片段在制备用于女性避孕的药物中的应用。
23.如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其成熟变体或其抗原结合片段在制备用于治疗良性乳房疾病的药物中的应用。
24.如权利要求23所述的应用，其中所述良性乳房疾病是乳腺痛。
25.如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其成熟变体或其抗原结合片段在制备用于抑制泌乳的药物中的应用。
26.如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其成熟变体或其抗原结合片段在制备用于治疗良性前列腺增生的药物中的应用。
27.如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其成熟变体或其抗原结合片段在制备用于治疗高催乳素血症性和正常催乳素血症性脱发的药物中的应用。
28.如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其成熟变体或其抗原结合片段在制备用于治疗接受联合激素疗法的妇女的药物中的应用。
29.如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其成熟变体或其抗原结合片段，其用于治疗接受联合激素疗法的妇女，其中所述联合激素疗法为雌激素加上黄体酮疗法。
中和催乳素受体抗体及其治疗用途
技术领域
[0001] 本发明涉及催乳素受体抗体006-H08，并且提供重组抗原结合区以及包含此类抗原结合区的抗体和功能片段，其特异性结合并中和催乳素受体；编码前述抗体的核酸序列；包含所述核酸序列的载体；包含它们的药物组合物以及它们在治疗或预防良性疾病和适应症中的用途，所述良性疾病和适应症受益于催乳素受体介导的信号传导的抑制，例如子宫内膜异位症、子宫腺肌病、非激素女性避孕、良性乳房疾病、乳腺痛、泌乳抑制、良性前列腺增生、纤维瘤以及高催乳素血症性和正常催乳素血症性脱发；以及在联合激素疗法中协同治疗以抑制乳腺上皮细胞增殖。
背景技术
[0002] 对治疗各种良性疾病和适应症以及预防联合(即雌激素加上黄体酮)激素疗法中的乳腺上皮细胞增殖存在未满足的医疗需求，所述良性疾病和适应症例如子宫内膜异位症、子宫腺肌病、非激素女性避孕、良性乳房疾病、乳腺痛、泌乳抑制、良性前列腺增生、纤维瘤、高催乳素血症性和正常催乳素血症性脱发。
[0003] 催乳素(PRL)是包含199个氨基酸的多肽激素。PRL属于生长激素(GH)，多肽激素的胎盘催乳激素(PL)家族，并且在垂体的催乳激素细胞以及几种垂体外组织如淋巴细胞、乳腺上皮细胞、子宫肌层和前列腺中合成。两种不同启动子调控垂体和垂体外PRL合成(BioEssays 28:1 05 1-1055,2006)。
[0004] PRL结合至PRL受体(PRLR)，PRL受体是属于1类细胞因子受体超家族的单次跨膜受体(Endocrine Reviews 19:225-268,1998)。PRLR以三种不同同种型存在，即可以通过它们的胞质尾区长度区分的短、长和中间形式。当配体结合时，顺序过程导致PRLR活化。PRL通过其结合位点1与一个PRLR分子相互作用，然后通过其结合位点2吸引第二个受体分子，导致PRLR的活性二聚体。PRLR二聚化导致JAK/STAT (詹纳斯激酶/信号转导及转录激活蛋白)途径的优势激活。当受体二聚化时，JAK(主要是JAK2)与该受体关联、磷酸根转移并互相激活。此外，PRLR还被磷酸化，并且可以结合至包含SH2-结构域的蛋白如STAT。受体结合的STAT随后磷酸化，从该受体解离并易位至细胞核，在那里它们刺激靶基因的转录。此外，已描述通过PRLR激活Ras-Raf-MAPK途径以及激活胞质src激酶(综述见Endocrine Reviews 19:225-268,1998)。
[0005] PRLR介导的信号传导在各种过程中起作用，例如乳腺发育、泌乳、生殖、乳腺和前列腺肿瘤生长、自身免疫性疾病、一般生长和代谢以及免疫调节(Endocrine Reviews19:225-268,1998;Annu.Rev.Physiol.64:47-67,2002)。
[0006] 目前，完全干扰PRLR介导的信号传导是不可能的。干扰PRLR介导的信号传导的唯一方法是通过使用溴麦角环肽和其他多巴胺受体2激动剂来抑制垂体PRL分泌(Nature Clinical Practice Endocrinology and Metabolism 2(10):571-581,2006)。然而，这些物质不抑制垂体外PRL合成，垂体外PRL合成可以成功地补偿垂体PRL合成的抑制，导致几乎不受影响的PRLR介导的信号传导(Endocrine Reviews 19:225-268,1998)。因此，多巴胺2型受体激动剂无益于患有乳腺癌或者自身免疫性疾病如系统性狼疮或类风湿性关节炎的患者并不令人惊讶(Breast Cancer Res.Treat.14:289-29,1989;Lupus7:414-419,1998)，虽然这些疾病涉及催乳素。多巴胺受体激动剂不阻断乳腺癌细胞或淋巴细胞中的局部催乳素合成，所述合成分别在乳腺癌或自身免疫性疾病中起关键作用。
发明内容
[0007] 尽管上文提到尝试提供方法用于治疗或预防良性疾病和适应症如子宫内膜异位症、子宫腺肌病、非激素女性避孕、良性乳房疾病和乳腺痛、泌乳抑制、良性前列腺增生、纤维瘤、高催乳素血症性和正常催乳素血症性脱发，以及用于在联合激素疗法中协同治疗以防止乳腺上皮细胞增殖，仍然没有化合物可用于满足该需要。因此本发明的目的是通过提供化合物来解决该问题，所述化合物是这些良性疾病和适应症的治疗剂。
[0009] 通过中和PRLR抗体阻断PRLR激活导致PRLR介导的信号传导的完全抑制。相比之下，多巴胺受体激动剂仅可以干扰应答升高的垂体催乳素分泌而增强的PRLR介导的信号传导，但是不可以干扰由于激活PRLR突变或者由于局部升高的催乳素生成而增强的PRLR介导的信号传导。
[0010] 因此，通过提供抗体006-H08及其抗原结合片段或其变体用于治疗上文提到的良性疾病和适应症来解决该问题，所述抗体006-H08及其抗原结合片段或其变体以高亲和力结合至PRLR，有效中和PRLR介导的信号传导，并且优选与来自其他物种如猕猴(Macacca mulatta)和食蟹猴(Macacca fascicularis)、小家鼠(Mus musculus)或褐家鼠(Rattus norvegicus)的PRLR交叉反应。
[0011] 一 些PRLR抗 体 已描 述 于 申 请WO2008/022295(Novartis)和 美 国 专 利7,422,899(Biogen)。本发明基于新抗体的发现，所述新抗体是PRLR特异性的，对PRLR具有高亲和力，以这种方式中和PRLR介导的信号传导，并且可以将治疗益处递送至个体(新抗体的序列如SEQ ID NO:34、40、46和52)。本发明的抗体可以用于本文中更全面描述的许多情况，所述抗体可以是人或人源化或嵌合或人工程化的。
[0012] 因此，本发明的目的是抗体或抗原结合片段，由此所述抗体拮抗催乳素受体介导的信号传导。
[0013] 新抗体“002-H06”、“002-H08”、“006-H07”、“001-E06”、“005-C04”是相应申请的主题。
[0014] 在小鼠疾病模型中体内表征这些抗体仅对表现出与小鼠催乳素受体的交叉反应性的抗体是可能的。仅在相应申请中公开的抗体005-C04表现出足够的与小鼠催乳素受体的交叉反应性，因此是可以用于小鼠体内模型的唯一抗体。因此用这个抗体获得的结果作为替代证明相应申请中公开的所有其他中和催乳素受体抗体在分析的疾病模型中的一般效力。
[0015] 将所述抗体在几种细胞系统中表征以确定它们的物种特异性以及它们失活PRLR介导的信号传导的不同读数范式(paradigm)的效价和效力(参见实施例5-10)。用大鼠Nb2-11细胞(实施例6，图6)或者人PRLR(实施例5，图5)或小鼠PRLR(实施例10，图10)稳定转染的Ba/F细胞进行增殖测定。Novartis抗体XHA 06.983对大鼠和小鼠PRLR未表现出活性，而Novartis抗体XHA06.642对大鼠PRLR表现出活性，但对小鼠PRLR未表现出活性。XHA 06.642抑制人PRLR介导的信号传导(实施例5、7、8)。关于用人PRLR稳定转染的Ba/F细胞的增殖抑制，本发明的新抗体006-H08表现出最高效价(实施例5，图5)。相应申请的新抗体005-C04是唯一表现出对小鼠(实施例10、9)和人PRLR(实施例5、7、8)的交叉反应性的抗体。因此，与Novartis抗体XHA06.642相比，新抗体005-C04适合在小鼠模型中测试PRLR介导的信号传导的抑制。本申请或相应申请中描述的所有其他抗体是人PRLR特异性的。除了细胞增殖测定(实施例5、6、10)，利用人(实施例8)或小鼠(实施例9)PRLR稳定转染以及LHRE(催乳激素应答元件)控制下的萤光素酶报道基因瞬时转染的HEK293细胞进行萤光素酶报道测定。利用这些系统，Novartis抗体XHA06.642不能有效阻断小鼠PRLR介导的信号传导再次变得明显(实施例9)。相比之下，新抗体005-C04(相应申请)阻断小鼠PRLR激活萤光素酶报道基因(实施例9)。人T47D细胞中的STAT5磷酸化用作额外的读数以分析所述抗体对人PRLR的抑制活性(实施例7，图7)。正如预期的，非特异性抗体在所有分析的实验范式中无活性。
[0016] 本发明涉及通过提供抗PRLR抗体来抑制PRLR阳性细胞的生长以及上文提到的良性疾病和适应症的发展的方法。本发明提供人单克隆抗体、其抗原结合片段以及所述抗体和片段的变体，其特异性结合至PRLR(SEQID NO:70)或SEQ ID No:70的人多态变体的胞外域(ECD)，所述人多态变体例如PNAS 105(38),14533,2008和J.Clin.Endocrinol.Metab.95(1),271,2010中描述的I146L和I76V变体。
[0017] 本发明的另一目的是一种抗体，其结合至催乳素受体及其人多态变体的胞外域的表位，其中所述催乳素受体的胞外域的氨基酸序列对应SEQ IDNO:70，并且核酸序列对应SEQ ID NO:71。
[0018] 本发明的抗体、抗原结合片段以及所述抗体和片段的变体包含轻链可变区和重链可变区。本发明涵盖的抗体或抗原结合片段的变体是其中保持所述抗体或抗原结合抗体片段对PRLR的结合活性的分子(序列参见表5)。
[0019] 因此，本发明的目的是抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段与抗体006-H08或其确定的成熟变体竞争。所述抗体及其成熟变体的序列如表5所示。
[0020] 在另一实施方案中，公开抗体或抗原结合片段，
[0021] a.其中可变重链区和轻链区的氨基酸序列，对于可变重链结构域，与SEQ ID NO:34至少60%、更优选70%、更优选80%、或90%、或甚至更优选95%相同，并且对于可变轻链结构域，与SEQ ID NO:40至少60%、更优选70%、更优选80%、或90%、或甚至更优选95%相同；或者
[0022] b.其中对于抗体006-H08的成熟形式，可变重链结构域和轻链结构域的氨基酸序列与其至少60%、更优选70%、更优选80%、或90%、或甚至更优选95%相同；或者
[0023] c.其中CDR的氨基酸序列，对于重链结构域，与SEQ ID NO:1、7和13至少60%、更优选70%、更优选80%、更优选90%、或甚至更优选95%相同，并且对于可变轻链结构域，与SEQ ID NO:18、24和29至少60%、更优选70%、更优选80%、更优选90%、或甚至更优选95%相同。
[0024] 在另一实施方案中，公开包含抗体006-H08的CDR的抗体或抗原结合片段，其中[0025] a.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、7和13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:18、24和29的CDR序列；
[0026] b.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、74、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:78、24、90的CDR序列；或者
[0027] c.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、75、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:82、24、91的CDR序列；或者
[0028] d.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、7、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:82、24、29的CDR序列；或者
[0029] e.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、7、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:86、24、29的CDR序列；或者
[0030] f.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、74、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:87、24、100的CDR序列；或者
[0031] g.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、74、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:87、24、92的CDR序列；或者
[0032] h.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、74、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:89、24、93的CDR序列；或者
[0033] i.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、74、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:79、24、101的CDR序列；或者
[0034] j.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、76、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:89、24、90的CDR序列；或者
[0035] k.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、7、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:18、24、100的CDR序列；或者
[0036] l.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、7、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:18、24、97的CDR序列；或者
[0037] m.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、7、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:18、24、98的CDR序列；或者
[0038] n.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、74、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:83、24、99的CDR序列；或者
[0039] o.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、7、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:18、24、96的CDR序列；或者
[0040] p.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、7、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:18、24、94的CDR序列；或者
[0041] q.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、74、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:88、24、90的CDR序列；或者
[0042] r.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、74、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:81、24、95的CDR序列；或者
[0043] s.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、75、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:18、24、29的CDR序列；或者
[0044] t.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、77、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:18、24、29的CDR序列；或者
[0045] u.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、7、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:80、24、29的CDR序列；或者
[0046] v.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、7、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:85、24、29的CDR序列；或者
[0047] w.可变重链包含对应于SEQ ID NO:1、7、13的CDR序列，并且可变轻链包含对应于SEQ ID NO:84、24、29的CDR序列。
[0048] 在一实施方案中，本文公开人抗体006-H08或其成熟形式，其中抗体
[0049] a.006-H08包含对应于SEQ ID NO:46的核酸序列和SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ ID NO:52的核酸序列和SEQ ID NO:40的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0050] b.006-H08-12-2包含对应于SEQ ID NO:331的核酸序列和SEQID NO:353的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ ID NO:165的核酸序列和SEQ ID NO:143的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0051] c.006-H08-13-2包含对应于SEQ ID NO:332的核酸序列和SEQID NO:354的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ ID NO:166的核酸序列和SEQ ID NO:144的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0052] d.006-H08-13-6-1包含对应于SEQ ID NO:333的核酸序列和SEQID NO:355的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ ID NO:167的核酸序列和SEQ ID NO:145的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0053] e.006-H08-14-6-0包含对应于SEQ ID NO:334的核酸序列和SEQID NO:356的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ ID NO:168的核酸序列和SEQ ID NO:146的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0054] f.006-H08-15-5包含对应于SEQ ID NO:335的核酸序列和SEQID NO:357的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ ID NO:169的核酸序列和SEQ ID NO:147的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0055] g.006-H08-19-1包含对应于SEQ ID NO:336的核酸序列和SEQID NO:358的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ ID NO:170的核酸序列和SEQ ID NO:148的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0056] h.006-H08-29-1包含对应于SEQ ID NO:337的核酸序列和SEQID NO:359的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ ID NO:171的核酸序列和SEQ ID NO:149的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0057] i.006-H08-32-2包含对应于SEQ ID NO:338的核酸序列和SEQID NO:360的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ ID NO:172的核酸序列和SEQ ID NO:150的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0058] j.006-H08-33-0包含对应于SEQ ID NO:339的核酸序列和SEQID NO:361的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ ID NO:173的核酸序列和SEQ ID NO:151的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0059] k.006-H08-33-16-0包含对应于SEQ ID NO:340的核酸序列和SEQ ID NO:362的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ IDNO:174的核酸序列和SEQ ID NO:152的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0060] l.006-H08-35-17-1包含对应于SEQ ID NO:341的核酸序列和SEQ ID NO:363的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ IDNO:175的核酸序列和SEQ ID NO:153的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0061] m.006-H08-35-17-4包含对应于SEQ ID NO:342的核酸序列和SEQ ID NO:364的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ IDNO:176的核酸序列和SEQ ID NO:154的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0062] n.006-H08-35-1包含对应于SEQ ID NO:343的核酸序列和SEQID NO:365的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ ID NO:177的核酸序列和SEQ ID NO:155的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0063] o.006-H08-36-17-0包含对应于SEQ ID NO:344的核酸序列和SEQ ID NO:366的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ IDNO:178的核酸序列和SEQ ID NO:156的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0064] p.006-H08-37-19-0包含对应于SEQ ID NO:345的核酸序列和SEQ ID NO:367的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ IDNO:179的核酸序列和SEQ ID NO:157的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0065] q.006-H08-39-7包含对应于SEQ ID NO:346的核酸序列和SEQID NO:368的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ ID NO:180的核酸序列和SEQ ID NO:158的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0066] r.006-H08-48-5包含对应于SEQ ID NO:347的核酸序列和SEQID NO:369的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ ID NO:181的核酸序列和SEQ ID NO:159的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0067] s.006-H08-53-27-0包含对应于SEQ ID NO:348的核酸序列和SEQ ID NO:370的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ IDNO:182的核酸序列和SEQ ID NO:160的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0068] t.006-H08-59-30-0包含对应于SEQ ID NO:349的核酸序列和SEQ ID NO:371的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ IDNO:183的核酸序列和SEQ ID NO:161的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0069] u.006-H08-63-32-4包含对应于SEQ ID NO:350的核酸序列和SEQ ID NO:372的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ IDNO:184的核酸序列和SEQ ID NO:162的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0070] v.006-H08-65-33-2包含对应于SEQ ID NO:351的核酸序列和SEQ ID NO:373的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ IDNO:185的核酸序列和SEQ ID NO:163的氨基酸序列的可变轻链结构域；
[0071] w.006-H08-68-35-2包含对应于SEQ ID NO:352的核酸序列和SEQ ID NO:374的氨基酸序列的可变重链结构域，并且包含具有SEQ IDNO:186的核酸序列和SEQ ID NO:164的氨基酸序列的可变轻链结构域。
[0072] 在另一实施方案中，本文公开前述抗体的抗体或抗原结合片段，其中
[0073] a.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、7、13、18、24、29的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0074] b.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、74、13、78、24、90的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0075] c.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、75、13、82、24、91的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0076] d.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、7、13、82、24、29的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0077] e.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、7、13、86、24、29的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0078] f.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、74、13、87、24、100的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0079] g.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、74、13、87、24、92的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0080] h.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、74、13、89、24、93的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0081] i.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、74、13、79、24、101的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0082] j.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、76、13、89、24、90的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0083] k.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、7、13、18、24、100的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0084] l.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、7、13、18、24、97的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0085] m.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、7、13、18、24、98的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0086] n.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、74、13、83、24、99的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0087] o.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、7、13、18、24、96的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0088] p.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、7、13、18、24、94的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0089] q.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、74、13、88、24、90的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0090] r.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、74、13、81、24、95的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0091] s.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、75、13、18、24、29的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0092] t.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、77、13、18、24、29的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0093] u.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、7、13、80、24、29的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0094] v.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、7、13、85、24、29的CDR中的1、2、3、4、5或6个；或者
[0095] w.所述抗体包含对应于SEQ ID NO:1、7、13、84、24、29的CDR中的1、2、3、4、5或6个。
[0096] 在本发明的另一实施方案中，抗体006-H08由抗原结合区组成，所述抗原结合区特异性结合至PRLR的一个或多个区域，或者对PRLR的一个或多个区域具有高亲和力，PRLR的氨基酸序列如SEQ ID NO:70的氨基酸位置1-210所示，其中亲和力为至少100nM，优选低于约100nM，更优选低于约30nM，甚至更优选具有低于约10nM的亲和力，或者甚至更优选具有低于1nM的亲和力，或者甚至更优选具有低于30pM的亲和力。
[0097] 本发明的目的还是前述抗体006-H08，其中重链恒定区为修饰或未修饰的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
[0098] 表1提供本发明的代表性抗体的解离常数和解离速率的概括，所述解离常数和解离速率通过PRLR(SEQ ID NO:70)的单体胞外域在直接固定的抗体上的表面等离子共振(Biacore)来测定。
[0099] 表1：通过表面等离子共振测定的HEK293细胞中表达的人PRLR的胞外域对抗PRLR人IgG1分子的单价解离常数和解离速率
[0100]抗体 KD[M] kd[1/s]
006-H08 0.7x 10-9 2.4x 10-4
002-H06 2.7x 10-9 5.4x 10-4
002-H08 1.8x 10-9 2.0x 10-4
006-H07 2.0x 10-9 1.3x 10-3
001-E06 15.8x 10-9 4.8x 10-3
005-C04 12.2x 10-9 9.3x 10-3
-9 -4
HE06.642 0.3x 10 3.2x 10
XHA06.642 1.2x 10-9 1.3x 10-4
XHA06.983 0.2x 10-9 1.7x 10-4
006-H08 0.7x 10-9 2.4x 10-4
002-H06 2.7x 10-9 5.4x 10-4
002-H08 1.8x 10-9 2.0x 10-4
006-H07 2.0x 10-9 1.3x 10-3
001-E06 15.8x 10-9 4.8x 10-3
005-C04 12.2x 10-9 9.3x 10-3
-9 -4
HE06.642 0.3x 10 3.2x 10
XHA06.642 1.2x 10-9 1.3x 10-4
XHA06.983 0.2x 10-9 1.7x 10-4
[0101] IgG1形式用于基于细胞的亲和力测定，通过荧光激活细胞分选术(FACS)联合斯卡查德分析来测定。
[0102] 表2示出代表性IgG抗体在人乳腺癌细胞系T47D和大鼠淋巴瘤细胞系Nb2上的结合强度。
[0103] 表2：通过FACS在人乳腺癌细胞系T47D和大鼠淋巴瘤细胞系Nb2上测定的抗PRLR抗体的基于细胞的结合效力
[0104]
[0105] 抗体产生
[0106] 为了分离能够功能性阻断人和小鼠PRLR的一组抗体，平行研究来自Bioinvent的称为 的合成人抗体噬菌体展示文库的两种形式( etal.2000,Nature BioTechnology.18,852-856.)，其分别表达scFv和Fab片段。用于scFv或Fab选择的靶标是人PRLR (SEQ ID NO.70的氨基酸位置1-210)和小鼠PRLR(SEQ ID NO:72的氨基酸位置1-210)的可溶性ECD，作为生物素化(NHS-LC生物素，Pierce)和非生物素化变体应用；以及表达PRLR的人乳腺癌细胞系T47D。
[0107] 通过蛋白和全细胞淘选的组合并通过具体工具的开发，噬菌体展示技术(PDT)中的各种方法的组合用来分离高亲和力的PRLR特异性的人单克隆抗体。淘选工具和筛选方法包括与Fc结构域融合重组表达的人和小鼠PRLR的ECD (R&D Systems，目录号分别为1167-PR和1309-PR；分别为SEQ ID NO:70和72的位置1-216，各自融合至人IgG1Fc结构域，人IgG1的位置100-330)，与6-组氨酸标签融合重组表达的人PRLR的胞外域(SEQID NO:70)，分别用人和小鼠PRLR各自稳定转染的HEK293和小鼠淋巴瘤细胞系Ba/F，和各自天然表达PRLR的乳腺癌细胞系T47D和大鼠淋巴瘤细胞Nb2，以及开发能够鉴别中和抗体的淘选方法和筛选测定，所述中和抗体优先结合至展示在细胞表面上的PRLR，并且与来自小鼠和大鼠的PRLR交叉反应(参见实施例6和10)。
[0108] 通过在ELISA测试中利用重组表达的抗原首先鉴别人PRLR的结合物并最终鉴别小鼠PRLR的结合物来进行筛选。然后，通过FACS分析检查T47D细胞上的Fab和scFv片段的细胞结合，随后测试这些物质对细胞内信号传导的中和活性。为了这个目的，测定T47D细胞中PRLR、STAT5和ERK1/2的磷酸化的抑制(参见实施例14)。将最佳功能阻断的scFv和Fab转化为完整IgG1分子，并且测试对PRLR的ECD的单价亲和力，以及在萤光素酶报道基因测定和依赖于催乳素生长的细胞的增殖测定中的抑制活性。这些具体方法的组合允许分离本发明的主题新抗体“006-H08”，以及相应申请的主题抗体“002-H06”、“002-H08”、“006-H07”、“001-E06”、“005-C04”。
[0109] 肽变体
[0110] 本发明的抗体并不限于本文提供的具体肽序列。相反，本发明还包括这些多肽的变体。参考本公开以及常规可用的技术和参考文献，技术人员能够制备、测试和利用本文公开的抗体的功能变体，同时理解具有结合并功能性阻断PRLR的能力的变体在本发明的范围内。
[0111] 变体可以包括例如，与本文公开的肽序列相比，具有至少一个改变的互补性决定区域(CDR)(高变的)和/或框架(FR)(可变的)结构域/位置的抗体。为了更好地说明这个概念，随后简要描述抗体结构。
[0112] 抗体包含两条肽链，每条肽链包含1个(轻链)或3个(重链)恒定结构域以及可变区(VL,VH)，后者在每种情况下由4个FR区(VH:HFR1,HFR2,HFR3,HFR4;VL:LFR1,LFR2,LFR3,LFR4)和3个间隔的CDR(VL:LCDR1,LCDR2,LCDR3;VH:HCDR1,HCDR2,HCDR3)组成。抗原结合位点由一个或多个CDR形成，而FR区为CDR提供结构框架，因此在抗原结合中起重要作用。通过改变CDR或FR区中的一个或多个氨基酸残基，技术人员通常可以产生突变或多样化的抗体序列，例如这可以针对抗原筛选新的或改良的特性。
[0113] 图12提供编号可变结构域VL和VH中的每个氨基酸位置的方案。表3(VH)和4(VL)划定本发明的某些抗体的CDR区，并且互相比较给定位置的氨基酸，以及与相应的共有或“主基因”序列比较给定位置的氨基酸，其中CDR区用“X”标记。表5和6将SEQ ID编号分配至本发明提供的抗体、抗体片段和PRLR变体。
[0114] 表3：VH序列
[0115]
[0116] 表4:VL序列
[0117]
[0118] 表5：抗体的序列
[0119]
[0120]
[0121]
[0122] 表6：PRLR变体的序列
[0123]抗体 SEQ ID
人ECD PRLR(蛋白) 70
人ECD PRLR(核苷酸) 71
小鼠ECD PRLR(蛋白) 72
小鼠ECD PRLR(核苷酸) 73
人ECD PRLR(蛋白) 70
人ECD PRLR(核苷酸) 71
小鼠ECD PRLR(蛋白) 72
小鼠ECD PRLR(核苷酸) 73
[0124] 技术人员可以使用表3、4和5中的数据来设计在本发明的范围内的肽变体。优选通过改变一个或多个CDR区内的氨基酸来构建变体；变体还可以具有一个或多个改变的框架区(FR)。例如，可以改变肽FR结构域，其中与种系序列相比残基有偏差。
[0125] 参考图12所列的新抗体与相应共有或“主基因”序列的比较，可以改变的候选残基包括例如以下残基：
[0126] -位置75处的残基赖氨酸(K)在VH 006-H08(SEQ ID 34)中变为谷氨酰胺(Q)[0127] -位置108处的残基亮氨酸(L)在VH 006-H08(SEQ ID 34)中变为甲硫氨酸(M)[0128] -位置110处的残基苏氨酸(T)在VH 006-H08(SEQ ID 34)中变为异亮氨酸(I)[0129] -位置67处的残基苯丙氨酸(F)在VH 002-H08(SEQ ID 36)中变为亮氨酸(L)。
[0130] 此外，变体可以通过成熟获得，即通过利用一个抗体作为优化的起点，通过多样化所述抗体中的一个或多个氨基酸残基，优选一个或多个CDR中的氨基酸残基，并且通过对所得的抗体变体集合筛选具有改良特性的变体。特别优选多样化VL的LCDR3、VH的HCDR3、VL的LCDR1和/或VH的HCDR2中的一个或多个氨基酸残基。多样化可以通过利用三核苷酸诱变(TRIM)技术合成DNA分子集合来进行[ B.,Ge,L.,Plü
ckthun,A.,Schneider,K.C.,Wellnhofer,G.,and Moroney S.E.(1994)Trinucleotide phosphoramidites:ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.Nucl.Acids Res.22,5600.]。
ckthun,A.,Schneider,K.C.,Wellnhofer,G.,and Moroney S.E.(1994)Trinucleotide phosphoramidites:ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.Nucl.Acids Res.22,5600.]。
[0131] 保守氨基酸变体
[0132] 可以使得多肽变体保留本文所述的抗体肽序列的整体分子结构。考虑到各氨基酸的特性，技术人员会认识到一些合理取代。氨基酸取代，即“保守取代”可以例如在所涉及的残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或两亲性质的相似性的基础上进行。
[0133] 例如，(a)非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；以及(d)负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。取代通常可以在(a)-(d)组内进行。此外，基于它们破坏α-螺旋的能力，甘氨酸和脯氨酸可以互相取代。相似地，某些氨基酸，如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸较常见于α-螺旋，而缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和苏氨酸较常见于β-折叠。甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和脯氨酸常见于转角。一些优选取代可以在以下组中进行：(i)S和T；(ii)P和G；以及(iii)A、V、L和I。考虑到已知的遗传密码以及重组和合成DNA技术，技术人员可以容易地构建编码保守氨基酸变体的DNA。
[0134] 如本文所用，两个多肽序列之间的“序列相同性”表示所述序列之间相同的氨基酸的百分比。“序列同源性”表示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。本发明的优选多肽序列在CDR区中具有至少60%，更优选至少70%或80%，更优选至少90%并且最优选至少95%的序列相同性。优选抗体在CDR区中还具有至少80%，更优选90%并且最优选95%的序列同源性。但是，所有这些公开的分子均阻断催乳素受体介导的信号传导。
[0135] 本发明的DNA分子
[0136] 本发明还涉及编码本发明的抗体的DNA分子。这些序列包括但不限于SEQ ID NO46和52以及331-374所示的那些DNA分子。
[0137] 本发明的DNA分子并不限于本文公开的序列，还包括其变体。本发明中的DNA变体可以参考它们在杂交中的物理特性来描述。技术人员会认识到DNA可以用来利用核酸杂交技术鉴别其互补物及其等同物或同系物，因为DNA是双链的。还会认识到杂交可以在具有少于100%互补性时发生。然而，考虑到条件的适当选择，杂交技术可以用来区分DNA序列，这基于它们与特定探针的结构相关性。关于这类条件的指导参见Sambrook et al.,1989[Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,USA)]和 Ausubel et al.,1995[Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,&Struhl,K.eds.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York:John Wiley and Sons]。
[0138] 两个多核苷酸序列之间的结构相似性可以表示为这两个序列会互相杂交的条件的“严格性”的函数。如本文所用，术语“严格性”指条件不利于杂交的程度。严格条件非常不利于杂交，并且仅结构上最相关的分子会在这类条件下互相杂交。相反地，非严格条件有利于表现出较低程度的结构相关性的分子的杂交。因此，杂交严格性与两个核酸序列的结构关系直接相关。以下关系可用于关联杂交与相关性(其中Tm为核酸双链体的解链温度)：
[0139] a.Tm=69.3+0.41(G+C)%
[0140] b.错配碱基对的数目每增加1%，双链体DNA的Tm降低1°C。
[0141] c.(Tm)μ2-(Tm)μ1=18.5log10μ2/μ1
[0142] 其中μ1和μ2是两种溶液的离子强度。
[0143] 杂交严格性是许多因素的函数，包括总DNA浓度、离子强度、温度、探针大小以及破坏氢键的物质的存在。促进杂交的因素包括高DNA浓度、高离子强度、低温、较长的探针大小以及不存在破坏氢键的物质。杂交通常在两个阶段中进行：“结合”阶段和“洗涤”阶段。
[0144] 首先，在结合阶段中，探针在有利于杂交的条件下结合至靶标。通常在这个阶段通过改变温度来控制严格性。对于高严格性，温度通常为65°C至70°C，除非使用短(<20nt)寡核苷酸探针。代表性杂交溶液包含6x SSC、0.5%SDS、5x Denhardt溶液和100μg非特异性载体DNA[参见Ausubel等人，2.9节，补充27(1994)]。当然，许多不同但功能等同的缓冲条件是已知的。当相关性程度较低时，可以选择较低的温度。低严格性结合温度为约25°C至40°C。中等严格性为至少约40°C至低于约65°C。高严格性为至少约65°C。
[0145] 其次，通过洗涤去除过量的探针。在这个阶段通常应用更严格的条件。因此，这个“洗涤”阶段在通过杂交确定相关性中最重要。洗涤溶液通常包含较低盐浓度。一种示例性中等严格性溶液包含2X SSC和0.1%SDS。高严格性洗涤溶液包含少于约0.2X SSC的等同物(离子强度)，优选严格溶液包含约O.1X SSC。与各种严格性相关的温度与上文所讨论的关于“结合”的相同。洗涤溶液在洗涤期间还通常更换多次。例如，典型的高严格性洗涤条件包括在55°C下洗涤30分钟2次以及在60°C下洗涤15分钟3次。
[0146] 因此，本发明的主题是编码本发明的抗体和抗原结合片段的分离的核酸序列。
[0147] 本发明的另一实施方案是前述分离的核酸序列，其编码本发明的抗体，其中所述核酸序列如表5所给出。
[0148] 因此，本发明包括在高严格性结合和洗涤条件下与表5所示的分子杂交的核酸分子，其中这类核酸分子编码具有如本文所述的特性的抗体或其功能片段。
[0149] 优选分子(从mRNA的角度)是与本文所述的DNA分子之一具有至少75%或80%(优选至少85%，更优选至少90%，并且最优选至少95%)序列相同性的那些分子。所述分子阻断催乳素受体介导的信号传导。
[0150] 功能等同变体
[0151] 本发明范围内的另一类DNA变体可以参考它们编码的产物来描述。这些功能等同基因的特征在于由于遗传密码的简并性，它们编码SEQ ID No:34-45中的相同肽序列。
[0152] 认为本文提供的DNA分子的变体可以几种不同方式构建。例如，它们可以构建为全合成DNA。高效合成在20至约150个核苷酸的范围中的寡核苷酸的方法广泛应用。参见Ausubel等人，2.11节，补充21(1993)。重叠寡核苷酸可以Khorana etal.,J.Mol.Biol.72:209-217(1971)首先报道的方式合成和装配；还参见Ausubel等人，见上文，8.2节。合成DNA优选设计具有工程化在基因的5'和3'末端的方便的限制位点，以促进克隆入适当载体。
[0153] 如本文所示，产生变体的方法从本文公开的DNA之一开始，然后进行位点定向诱变。参见Ausubel等人，见上文，第8章，补充37(1997)。在典型方法中，将靶DNA克隆入单链DNA噬菌体载体。分离单链DNA，并且将其与包含期望的核苷酸改变的寡核苷酸杂交。合成互补链，并且将双链噬菌体引入宿主。一些所得的子代会包含期望的突变，这可以利用DNA测序来证实。此外，增加子代噬菌体是期望突变体的概率的各种方法是可用的。这些方法是本领域技术人员公知的，并且用于产生这类突变体的试剂盒是可商购的。
[0154] 重组DNA构建体和表达
[0155] 本发明还提供包含本发明的一个或多个核苷酸序列的重组DNA构建体。本发明的重组构建体用于与载体连接，例如质粒、噬粒、噬菌体或病毒载体，编码本发明的抗体的DNA分子插入其中。
[0156] 编码基因可以通过Sambrook等人，1989和Ausubel等人，1989中所述的技术来制备。或者，DNA序列可以利用例如合成仪化学合成。参见，例如，Oligonucleotide Synthesis(1984,Gait,ed.,IRL Press,Oxford)中所述的技术，该文献整体援引加入本文。本领域技术人员能够将编码可变结构域的DNA与编码各种人IgG同种型的恒定区或其衍生物(突变或未突变的)的基因片段融合。本领域技术人员能够应用重组DNA技术以利用接头来将可变结构域融合于单链形式中，所述接头例如包含3次甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸的15-氨基酸段。本发明的重组构建体包含能够表达编码DNA的RNA和/或蛋白产物的表达载体。所述载体还可以包含调节序列，包括可操作地连接至开放阅读框(ORF)的启动子。所述载体还可以包含选择标记序列。特异性起始和细菌分泌信号也可以是插入的靶基因编码序列的高效翻译所需的。
[0157] 本发明还提供包含至少一种本发明的DNA的宿主细胞。所述宿主细胞实际上可以是表达载体可用的任何细胞。例如，其可以是高等真核宿主细胞如哺乳动物细胞，低等真核宿主细胞如酵母细胞，并且可以是原核细胞如细菌细胞。将重组构建体引入宿主细胞可以通过磷酸钙转染、DEAE、葡聚糖介导的转染、电穿孔或噬菌体感染实现。
[0158] 细菌表达
[0159] 通过将编码期望蛋白的结构DNA序列连同合适的翻译起始和终止信号插入具有功能启动子的可操作的阅读相(phase)来构建可用于细菌的表达载体。所述载体包含一个或多个表型选择标记以及复制起点以确保维持所述载体，并且如果期望，在宿主内提供扩增。用于转化的合适原核宿主包括大肠杆菌(E.coli)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属内的各种物种。
[0160] 细菌载体可以是例如基于噬菌体、质粒或噬粒的。这些载体可以包含选择标记和细菌复制起点，其来源于可商购的质粒，通常包含公知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的元件。转化合适的宿主菌株并使所述宿主菌株生长至适当的细胞密度之后，通过适当的方法(例如，温度变化或化学诱导)将选择的启动子去阻遏/诱导，并且将细胞培养额外的时间。通常通过离心收获细胞，通过物理或化学方法使细胞破裂，并且保留所得的粗提取物用于进一步纯化。
[0161] 在细菌系统中，许多表达载体可以有利地选择，这取决于表达的蛋白预期的用途。例如，当制备大量这样的蛋白用于产生抗体或筛选肽文库时，例如，指导表达高水平的容易纯化的融合蛋白产物的载体可以是期望的。
[0162] 因此，本发明的目的是包含编码本发明的新抗体的核酸序列的表达载体。
[0163] 哺乳动物表达和纯化
[0164] 哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平蛋白表达的病毒元件，例如来源于巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。病毒调节元件的进一步描述及其序列参见例如，Stinski的U.S.5,168,062、Bell等人的U.S.4,510,245以及Schaffner等人的U.S.4,968,615。重组表达载体还可以包含复制起点和选择标记(参见例如，Axel等人的U.S.4,399,216、
4,634,665和U.S.5,179,017)。合适的选择标记包括在引入载体的宿主细胞上赋予对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性的基因。例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因赋予对甲氨蝶呤的抗性，而neo基因赋予对G418的抗性。
4,634,665和U.S.5,179,017)。合适的选择标记包括在引入载体的宿主细胞上赋予对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性的基因。例如，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因赋予对甲氨蝶呤的抗性，而neo基因赋予对G418的抗性。
[0165] 将表达载体转染入宿主细胞可以利用标准技术如电穿孔、磷酸钙沉淀和DEAE-葡聚糖转染来进行。
[0166] 用于表达本文提供的抗体、抗原结合部分或其衍生物的合适的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)[包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220，使用DHFR选择标记，例如描述于R.J.Kaufman and P.A.Sharp (1982)Mol.Biol.159:601-621]]、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。在一些实施方案中，设计表达载体，从而表达的蛋白分泌入宿主细胞生长的培养基。可以利用标准蛋白纯化方法来将所述抗体、抗原结合部分或其衍生物从培养基回收。
[0167] 本发明的抗体或其抗原结合片段可以通过公知的方法从重组细胞培养物回收和纯化，所述方法包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、A蛋白层析、G蛋白层析、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析以及凝集素层析。高效液相层析(“HPLC”)也可以用于纯化。参见例如，Colligan,Current Protocols in Immunology 或 Current Protocols in Protein Science,John Wiley&Sons,NY，N.Y.,(1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，各自整体援引加入本文。
[0168] 本发明的抗体或其抗原结合片段包括天然纯化的产物，化学合成方法的产物，以及通过重组技术从真核宿主(包括例如，酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)制备的产物。根据重组制备方法所用的宿主，本发明的抗体可以是糖基化的，或者可以是非糖基化的。这类方法描述于许多标准实验室手册，例如上文的Sambrook，第17.37-17.42节；上文的Ausubel，第10、12、13、16、18和20章。
[0169] 因此，本发明的目的还是包含所述载体或核酸分子的宿主细胞，其中所述宿主细胞可以是高等真核宿主细胞如哺乳动物细胞，低等真核宿主细胞如酵母细胞，并且可以是原核细胞如细菌细胞。
[0170] 本发明的另一目的是利用所述宿主细胞制备抗体和抗原结合片段的方法，所述方法包括在合适的条件下培养所述宿主细胞并回收所述抗体。
[0171] 因此，本发明的另一目的是如本发明所述的抗体，所述抗体用本发明的宿主细胞产生并纯化至至少95重量%同质性。
[0172] 子宫内膜异位症和子宫腺肌病(宫内子宫内膜异位症)
[0173] 子宫内膜异位症是良性的雌激素依赖性的妇科病症，其特征在于子宫腔外存在子宫内膜组织(腺体和基质)。子宫内膜异位症病变主要在盆腔腹膜上、卵巢和直肠阴道隔中发现(Obstet.Gynecol.Clin.North.Am.24:235-238,1997)。子宫内膜异位症通常与不育和疼痛症状如痛经相关。此外，许多患者患有自身免疫性疾病(Hum.Reprod.17(19):2715-2724,2002)。也称为宫内子宫内膜异位症的子宫腺肌病描述的是子宫内膜异位症的亚型，其仅限于子宫。在子宫腺肌病的情况下，子宫内膜腺体侵入子宫肌层和子宫壁。
[0174] 根据移植理论，在患者和健康妇女中，子宫内膜片段均被逆行月经冲入腹膜腔(Obstet.Gynecol.64:151-154,1984)。看来患者的骨盆腔中子宫内膜异位症病变的成功建立关键涉及4个主要因素：
[0175] a)在月经周期的晚期分泌阶段，健康妇女中的子宫内膜细胞凋亡。在患者中，子宫内膜细胞中的凋亡程度明显降低(Fertil.Steril.69:1042-1047,1998)。因此，在患者中存在比健康妇女更高的概率，已被逆行月经冲入腹膜腔的子宫内膜片段未死亡并成功植入。
[0176] b)对于异位子宫内膜片段在腹膜中的成功植入和长期存活，新血管必须形成(British Journal of Pharmacology,149:133-135,2006)。
[0177] c)许多患者患有自身免疫性疾病，因此具有受损的免疫系统(Hum.Reprod.17(19):2002,2715-2724,2002)。这可以导致这样的结论：完整的免疫应答-当存在于健康妇女中时-可以对预防子宫内膜异位症病变的建立起作用。
[0178] d)病变必须生长，因此依赖于促细胞分裂刺激和生长因子的存在。
[0179] 为了治疗子宫内膜异位症，目前存在以下方法：
[0180] a)促性腺激素释放激素(GnRH)类似物：导致卵巢雌二醇合成的抑制，并且诱导生长关键依赖于雌二醇的存在的异位子宫内膜异位症植入物的萎缩。
[0181] b)芳化酶抑制剂：抑制由子宫内膜异位症植入物局部产生雌二醇，诱导凋亡，并且抑制异位子宫内膜异位症片段的增殖。
[0182] c)选择性雌激素受体调节剂：在正常子宫内膜植入物和异位植入物中具有雌激素受体拮抗活性，因此导致植入的异位子宫内膜异位症组织的萎缩。
[0183] d)孕酮受体激动剂：抑制正常和异位子宫内膜细胞的增殖，诱导分化和凋亡。
[0184] e)复方口服避孕药：维持现状，预防疾病的发展，并且诱导异位和正位子宫内膜的萎缩。
[0185] f)手术切除病变。
[0186] GnRH类似物、SERM和芳化酶抑制剂具有严重的副作用，并且在患有子宫内膜异位症的年轻妇女中导致潮热和骨质流失。用孕酮受体激动剂治疗导致排卵抑制、不规则月经出血然后闭经、体重增加以及抑郁。由于静脉血栓栓塞的风险增加，复方口服避孕药不适用于35岁以上的妇女、吸烟者以及患有超重的个体。手术切除病变倾向于高复发率。
[0187] 本发明的抗体干扰垂体和局部产生的催乳素刺激的PRLR介导的信号传导或者由于激活PRLR突变的PRLR介导的信号传导，因此比仅干扰垂体催乳素分泌的多巴胺-2-受体激动剂更有效。
[0188] 因此，本发明的目的是作为药物的抗体006-H08或抗原结合片段。
[0189] PRL和PRLR在子宫中表达，并且在正常子宫生理中起作用；PRL可以作为强效促分裂原并且具有免疫调节作用。在本发明中，据证实PRL/PRLR系统中的改变在人子宫内膜异位症中起作用。通过定量Taqman PCR分析健康妇女的子宫内膜以及患者的子宫内膜和病变中的PRL和PRLR表达(参见实施例2)如图1和2所示。
[0190] 如图1(PRL表达)和图2(PRLR表达)所证实的，PRL及其受体在子宫内膜异位症病变中强烈上调。这个发现第一次产生实验证据，证明自分泌PRL信号传导可以在子宫内膜异位症病变的建立、生长和维持中起基础作用。
[0191] 成功地在宫内子宫内膜异位症的动物模型，即小鼠中的子宫腺肌病中测试PRLR抗体(参见实施例20)。子宫腺肌病的特征在于子宫内膜的子宫肌层中子宫内膜腺体的浸润性生长。其类似于限于子宫的子宫内膜异位症形式-非月经物种可以发展的子宫内膜异位症的唯一形式。在患有子宫内膜异位症的患者的临床治疗中有效的达那唑在子宫腺肌病的治疗中也是有效的(Life Sciences 51:1119-1125,1992)。但是达那唑为促雄性黄体酮，并且在年轻妇女中导致严重的促雄性副作用，这限制其用途。
[0192] 本发明的抗体解决提供子宫内膜异位症的新治疗或预防子宫内膜异位症的问题，并且表现出比目前的标准疗法更小的副作用。
[0193] 因此，本发明的另一方面是采用中和PRLR抗体和抗原结合片段来治疗或预防子宫内膜异位症和子宫腺肌病(宫内子宫内膜异位症)。
[0194] 本发明的另一方面是如本发明所述的抗体和抗原结合片段用于治疗或预防子宫内膜异位症和子宫腺肌病(宫内子宫内膜异位症)的用途。
[0195] 非激素女性避孕
[0196] 目前女性避孕的方法如下：
[0197] a)包含雌激素和黄体酮的复方口服避孕药。
[0198] 孕激素组分通过下丘脑-垂体-性腺轴上的负反馈介导避孕效果。雌激素组分保证良好的出血控制，并且通过诱导靶细胞中的孕酮受体来增强促孕激素作用。
[0199] b)仅包含黄体酮的子宫内避孕器。
[0200] 局部释放的黄体酮使子宫内膜处于抗着床状态中。此外，宫颈粘膜对于精细胞变得几乎不透的。
[0201] c)仅黄体酮的丸剂和植入物。
[0202] 黄体酮通过下丘脑-垂体-性腺轴上的负反馈抑制排卵。此外，宫颈粘膜对精细胞的透性降低。
[0203] d)包含炔雌醇加上黄体酮的阴道环。
[0204] 复方口服避孕药的主要副作用是静脉血栓栓塞(VTE)的风险升高。此外，超重或吸烟的妇女，以及患有自身免疫性疾病如狼疮的妇女和35岁以上的妇女不可以使用口服复方避孕药。
[0205] 仅包含黄体酮的子宫内避孕器和植入物可以导致功能失调性子宫出血。
[0206] 仅黄体酮的丸剂可以引起不规则出血模式、点滴出血、闭经。异位妊娠的风险增加。体重增加和骨密度降低是其他副作用。
[0207] 阴道环可以导致阴道炎、白带或排出。
[0208] 几年前已产生PRLR缺陷小鼠(Genes Dev 11:167-178,1997)。有趣的是，PRLR缺-/-陷的雌性而不是雄性小鼠是完全不育的。PRLR 雌性在受精后立即表现出卵发育的停滞，即它们表现出着床前发育的停滞。仅极少数卵母细胞到达胚泡阶段，并且不能在突变雌性中着床，但是在移植后于野生型代孕母亲中发育为正常胚胎。PRLR缺陷小鼠的不育表型可以通过孕酮补充恢复直至中期妊娠。明显地，PRLR介导的信号传导在产生允许和维持妊娠所必需的孕酮的黄体的维持和功能中起重要作用。此外，PRLR缺陷的雌性而不是雄性表现出体重降低，这与腹部脂肪量的降低和瘦蛋白水平相关。
[0209] 目前为止，没有失活的人PRLR突变是已知的，因此PRLR介导的信号传导在人能育性中的确切作用仍是未知的。然而，有增加的证据证明还是在人中，需要最低催乳素水平以允许成功妊娠。由于高催乳素血症黄体功能不全而患有原发性不育的患者用溴麦角环肽治疗。在一些情况下，催乳素水平被过度抑制，并且缩短的黄体期再次出现(Bohnet HG et al.in Lisuride and other dopamine agonists edited by D.B.Calne et al,Raven Press,New York,1983)。从这些数据得出结论，高催乳素血症状态和低催乳素血症状态负面干扰雌性能育性。这可以通过PRL与其受体的相互作用来解释。在低催乳素水平的情况下，没有足够的受体激活，而在高催乳素血症的情况下，也没有足够的受体激活，因为所有受体均被一个催乳素分子封闭并不可以再二聚化。换句话说，催乳素的剂量反应是钟形的，并且最佳受体激活仅在一定浓度范围中实现。有来自第二研究的证据证明患者中缺少子宫内膜催乳素表达导致早期着床失败(Human Reprod.19:1911-1916,2004)。此外，据证实在离体情况下，催乳素可以防止培养的人卵泡细胞凋亡，因此如在PRLR缺陷小鼠中证实的维持早期黄体功能(Human Reprod.18:2672-2677,2003)。
[0210] 为了测试中和PRLR抗体的避孕效力，如实施例11所述，将小鼠用特异性和非特异性PRLR抗体注射并与雄性交配。读数为每个处理组的产仔数和每只动物的胎仔数(litter size)。图11所示的实验证实，当以30mg/kg体重测试时，用本发明的中和抗体处理完全防止小鼠中的妊娠。
[0211] 与前述标准方法相比，用中和PRLR抗体的女性避孕具有几个优点：
[0212] ●所述抗体可以用于吸烟、超重和高龄妇女以及患有红斑狼疮的妇女(PRLR抗体甚至可以有益于治疗狼疮和减少腹部脂肪，即PRLR缺陷小鼠具有较少腹部脂肪)。
[0213] ●PRLR抗体不提高VTE (静脉血栓栓塞)风险。
[0214] ●与用于复方口服避孕药的雌激素和黄体酮相比，PRLR介导的信号传导的中和导致乳腺上皮细胞增殖的抑制，并且与能育性控制的激素方法相比，其甚至可以保护使用者免患乳腺癌。
[0215] 本发明的另一目的是PRLR-中和PRLR抗体和抗原结合片段用于女性避孕的用途，与标准疗法相比其具有减少的副作用。
[0216] 本发明的另一方面是如本发明所述的抗体和抗原结合片段用于女性避孕的用途，与标准疗法相比其具有减少的副作用。
[0217] 良性乳房疾病和乳腺痛
[0218] 良性乳房疾病涵盖各种症状，例如纤维囊性乳房疾病、纤维腺瘤、乳腺痛和巨囊。30-50%的绝经前妇女患有纤维囊性乳房疾病(Epidemiol Rev19:310-327,1997)。根据妇女的年龄，良性乳房疾病可以呈现不同表型(J Mammary Gland Biol Neoplasia
10:325-335,2005)：在早期生殖阶段(15-25岁)期间，当正常乳房中的小叶发育发生时，良性乳房疾病导致纤维腺瘤。观察到单个巨大纤维腺瘤以及多个腺瘤。这些纤维腺瘤包含基质细胞以及上皮细胞，并且从小叶发生。在成熟生殖阶段(25-40岁)中，乳房在每个月经周期期间经历周期性变化。患病的妇女呈现周期性乳腺痛，并且在她们的乳房中具有几个小结。后来(35-55岁)，正常乳房退化，而在患病的乳房中可以观察到巨囊和上皮细胞增生，有或无异型(atypia)。那些伴随有增加的上皮细胞增殖的良性乳房疾病形式具有较高的发展乳腺癌的风险。如果细胞异型存在于增殖细胞部分中，这种风险可以高达
11%(Zentralbl 119:54-58,1997)。25%的60-80岁的妇女也患有良性乳房疾病，
通常雌激素替代疗法或肥胖症是绝经后持续良性乳房疾病的原因(Am J Obstet Gynecol
154:161-179,1986)。
10:325-335,2005)：在早期生殖阶段(15-25岁)期间，当正常乳房中的小叶发育发生时，良性乳房疾病导致纤维腺瘤。观察到单个巨大纤维腺瘤以及多个腺瘤。这些纤维腺瘤包含基质细胞以及上皮细胞，并且从小叶发生。在成熟生殖阶段(25-40岁)中，乳房在每个月经周期期间经历周期性变化。患病的妇女呈现周期性乳腺痛，并且在她们的乳房中具有几个小结。后来(35-55岁)，正常乳房退化，而在患病的乳房中可以观察到巨囊和上皮细胞增生，有或无异型(atypia)。那些伴随有增加的上皮细胞增殖的良性乳房疾病形式具有较高的发展乳腺癌的风险。如果细胞异型存在于增殖细胞部分中，这种风险可以高达
11%(Zentralbl 119:54-58,1997)。25%的60-80岁的妇女也患有良性乳房疾病，
通常雌激素替代疗法或肥胖症是绝经后持续良性乳房疾病的原因(Am J Obstet Gynecol
154:161-179,1986)。
[0219] 纤维囊性乳房疾病的病理生理学是由导致结缔组织的过度增殖(hyperproliferation)(纤维化)然后兼性上皮细胞增殖的雌激素优势和孕酮缺陷来确定的。如已提到的，乳腺癌的风险在表现出纤维囊性病灶内增加的上皮细胞增殖的患者中升高。临床上纤维囊性乳房疾病呈现乳房疼痛和乳房触痛。70%患有纤维囊性乳房疾病的患者遭受黄体功能不全或不排卵(Am J Obstet 154:161-179,1986)。黄体功能不全导致降低的孕酮水平和雌激素优势。
[0220] 乳腺痛(乳房疼痛)在妇女生殖寿命中的一些时间影响约70%的妇女。乳房疼痛可以或可以不与经前期综合征的其他标准相关。据证实患有乳腺痛的妇女在刺激下丘脑垂体轴后应答，释放过量催乳素(Clin Endocrinol23:699-704,1985)。
[0221] 良性乳房疾病和乳腺痛的标准疗法为：
[0222] 1)溴麦角环肽
[0223] 溴麦角环肽作为多巴胺激动剂仅阻断垂体催乳素合成，但不阻断乳腺上皮细胞中催乳素的局部合成。因此其仅在那些依赖于升高的全身催乳素水平的乳腺痛和良性乳房疾病形式中有效。溴麦角环肽的主要副作用为：
[0224] 恶心、呕吐、水肿、低血压、头晕、脱发、头痛和幻觉。
[0225] 2)达那唑
[0226] 达那唑为促雄性黄体酮，通过其抗促性腺激素活性对抗良性乳房疾病中观察到的雌激素优势。主要副作用为：
[0227] 月经不调、抑郁、痤疮、多毛症、声音变得低沉和潮热以及体重增加。
[0228] 3)他莫昔芬
[0229] 他莫昔芬为选择性雌激素受体调节剂，其在乳房中具有抗雌激素活性，而在子宫中具有雌激素活性。主要副作用为：
[0230] 绝经后症状如骨质流失和潮热、卵巢囊肿以及子宫内膜癌。
[0231] 4)黄体酮
[0232] 黄体酮通过抑制垂体性腺轴、抑制排卵和雌激素减少(depletion)来抑制良性乳房疾病。雌激素减少导致绝经症状，例如骨质流失和潮热。
[0233] 5)低剂量复方口服避孕药
[0234] 这种治疗不适用于35岁以上的妇女、吸烟者以及糖尿病和超重患者。
[0235] 一般来说，在三分之一患有良性乳房疾病的妇女中发现催乳素水平升高。因为雌激素增加垂体催乳素分泌，所以认为血清催乳素水平的升高是这种疾病中的雌激素优势的结果。据报道激活PRLR突变常存在于患有多发性乳房腺瘤的妇女中-类似于纤维囊性乳房疾病的亚型(Paul Kelly,Breast Congress Turin,2007and Proc Natl Acad Sci105:14533-14538;2008)。
[0236] 良性乳房疾病、乳腺痛和经前期乳房紧张依赖于一种共同的病理生理学机制：增强的催乳素信号传导。升高的催乳素信号传导可以是以下事件的结果：
[0237] ■全身性高催乳素血症(由于垂体腺瘤)
[0238] ■局部高催乳素血症(由于增殖性乳腺上皮细胞中的催乳素合成)。局部高催乳素血症不会转化为血液中升高的催乳素水平。
[0239] ■在正常催乳素水平的存在下组成型活化的PRLR信号传导(由于激活PRLR突变)。
[0240] 考虑到某些形式的良性乳房疾病可以引起乳腺癌，对于治疗这种疾病存在医疗需要。
[0241] 为了证实中和PRLR抗体在良性乳房疾病的临床前模型中的效力，采用基于全身性高催乳素血症的小鼠模型。如实施例16所述，将成年Balb/c小鼠用垂体同基因移植物在肾被膜下移植(Methods in Mammary gland Biology and Breast Cancer Research,101-107,2000)。与未处理的处女对照小鼠相比，全身性高催乳素血症引起乳腺中增加的上皮细胞增殖，并且刺激侧向分支和小叶肺泡发育。具有升高的癌性发展风险的最严重的人纤维囊性乳房疾病形式的特征在于增加的上皮细胞增殖。如实施例16所述，在这种Balb/c小鼠模型中测试中和PRLR抗体，关于它们的以下能力与非特异性抗体比较：
[0242] ■阻断侧向分支和小叶肺泡发育
[0243] ■抑制乳腺上皮细胞增殖
[0244] ■抑制STAT5的磷酸化，STAT5是在PRLR活化后正常激活和磷酸化的转录因子。
[0245] 如图15A-C中证实的，中和PRLR抗体以剂量依赖性方式阻断所有上述读数范式。
[0246] 本发明的另一目的是中和PRLR抗体或抗原结合片段用于治疗绝经前和绝经后妇女的良性乳房疾病和乳腺痛的用途。
[0247] 本发明的另一方面是如本发明所述的抗体或抗原结合片段用于治疗绝经前和绝经后妇女的良性乳房疾病和乳腺痛的用途。
[0248] 泌乳抑制
[0249] 催乳素是参与分娩后泌乳的主要激素。这由PRLR缺陷小鼠的表型证实。甚至杂合小鼠也具有严重的泌乳问题，并且完全不能为它们的后代哺乳(Frontiers in Neuroendocrinology 22:140-145,2001)。
[0250] 为了许多原因，妇女必须停止母乳喂养，即母体摄入对婴儿有潜在危险的药物，严重感染(乳腺炎、肾炎)，大量产后出血和严重母体疾病如糖尿病、癌，以及新生儿虚弱或疾病。目前，多巴胺受体激动剂如溴麦角环肽和利舒脲用来抑制分娩后泌乳。但是，这些化合物可以引起严重的副作用，例如恶心、呕吐、水肿、低血压、头晕、脱发、头痛和幻觉。此外，多巴胺受体激动剂不适用于患有心血管疾病和高血压的妇女。溴麦角环肽的另一缺点是其半衰期时间短，需要在14天的时间中每天摄入药物4-6次。
[0251] 为了测试中和催乳素受体抗体在小鼠中的效力，使NMRI小鼠与雄性交配。如实施例15所述，出生后将胎仔数调整至8只动物，并且将雌性用针对PRLR的特异性和非特异性抗体处理。作为母体泌乳能力的度量，每天监测后代的重量。读数在实施例15中详述，并且结果如图14A-D所示。中和PRLR抗体表现出泌乳的剂量依赖性抑制，并且导致乳腺退化和降低的乳蛋白产生。
[0252] 本发明的另一目的是中和PRLR抗体用于抑制泌乳的用途。
[0253] 本发明的另一目的是如本发明所述的抗体006-H08和抗原结合片段用于抑制泌乳的用途。
[0254] 良性前列腺增生
[0255] 良性前列腺增生(BPH)是老年男性中第四流行的医疗疾病状况。前列腺增大是影响超过50%年龄≥50岁的男性的年龄依赖性进行性疾病状况。BPH的特征在于前列腺基质和上皮细胞的增生，导致在前列腺的尿道周围区域中形成大的离散性小结，其压缩尿道。因此，尿流障碍是BPH的一个主要结果。
[0256] BPH的标准疗法包括：
[0257] a)α1-肾上腺素能受体拮抗剂(例如坦洛新、阿夫唑嗪、特拉唑嗪、多沙唑嗪)缓解下泌尿道中的BPH症状。它们通过阻断α-受体-介导的前列腺平滑肌刺激来减少膀胱出口阻塞。主要副作用是血管舒张不良事件、头晕和射精失败。
[0258] b)5α-还原酶抑制剂(例如非那雄胺)
[0259] 5α-还原酶抑制剂防止双氢睾酮的形成，双氢睾酮是前列腺中睾酮的活性形式，其负责前列腺的增大。主要副作用是性功能障碍，例如勃起障碍和性欲降低。
[0260] c)经尿道前列腺切除术(TURP)
[0261] 这种手术治疗与高发病率有关。副作用是出血、失禁、狭窄形成、丧失射精以及膀胱穿孔。
[0262] d)前列腺支架置入术
[0263] 将支架插入尿道的前列腺部分以保证适当的尿流。主要副作用是被覆皮壳、泌尿道感染和支架迁移。此外，在任何经尿道操作之前必须移除支架。
[0264] 如对乳腺所述，PRL和PRLR在前列腺内以自分泌/旁分泌方式作用(J.Clin.Invest.99:618pp,1997)。
[0265] 临床研究显示高催乳素血症(和肢端肥大症)与前列腺增大和炎性细胞的基质积累有关。人生长激素在锌的存在下可以结合至人PRLR，这可以解释为什么肢端肥大症可以导致良性前列腺增生。PRL血清水平在患有BPH的患者中常升高。
[0266] 广泛过量表达PRL基因的转基因动物发展严重的基质前列腺增生，表明PRL是前列腺增生发展的重要病理生理学因子(Endocrinology 138:4410pp,1997)。此外，在转基因小鼠中于前列腺特异性probasin启动子下局部过量表达PRL导致基质扩张、炎性细胞积累和局灶性上皮增生，这是人BPH的基本特征(Endocrinology 144:2269pp,2003)。
[0267] PRLR在前列腺中高表达(实施例3，图3)。在激素缺失和治疗后在大鼠前列腺组织中观察到PRLR蛋白表达的变化(实施例4，图4)。除了PRLR，前列腺细胞还表达催乳素。
[0268] 如实施例17所述，雄性Balb/c小鼠在肾被膜下接受垂体同基因移植物，并且发展良性前列腺增生。在这个模型中测试中和催乳素受体抗体和非特异性抗体对良性前列腺增生的影响。读数范式如实施例17所述。如图16所示，中和PRLR抗体抑制良性前列腺生长，因此适合治疗良性前列腺增生。
[0269] 本发明的另一目的是中和PRLR抗体或抗原结合片段用于治疗良性前列腺增生的用途。
[0270] 本发明的另一方面是如本发明所述的抗体或抗原结合片段用于治疗良性前列腺增生的用途。
[0271] 高催乳素血症性脱发
[0272] 治疗脱发仍是未满足的需要。头皮毛发生长周期：生长期的特征在于活跃的毛发生长，退化期表现出退化，然后为毛发生长终期(静息)。脱落期(exogen)(死亡毛发的释放)与毛发生长终期的结束一致。脱发可以是任何阶段中紊乱的毛发生长的结果。
[0273] 毛发生长终期脱发可以具有许多诱因(生理和情绪压力、医疗状况、铁和锌缺乏)，重要地，雄激素性脱发在其早期阶段表现出毛发生长终期毛发脱落(Cleveland clinic journal of medicine 2009;76:361-367)。生长期脱发通常是辐射或化疗的结果。
[0274] 米诺地尔和非那雄胺用于治疗雄激素性脱发，而糖皮质激素用于斑秃。一般来说，所有这些治疗均具有副作用(非那雄胺：在男性中性欲丧失和阳痿，糖皮质激素：糖尿病、体重增加、骨质疏松)，并且治疗脱发的问题并未完全解决。
[0275] 在啮齿动物中，成年动物中的剃毛实验用来分析化合物对脱发的影响，通过利用剃毛区域中的毛发再生长作为读数范式(British Journal of dermatology2008;159:300-305)。成年动物的剃毛(大部分在毛发生长终期中的毛发)诱导生长期，其特征在于毛发生长。
[0276] 在如实施例17所述的实验中(良性前列腺增生)，将接受垂体同基因移植物的动物剃毛。在这些实验的过程中，意外地发现接受垂体同基因移植物的动物在剃毛区域中表现出严重的毛发再生长障碍。用中和PRLR抗体但不是非特异性抗体处理刺激毛发生长(图17)。
[0277] 这个观察证实升高的催乳素受体介导的信号传导参与脱发。为了更详细地分析这个发现，进行与以前描述的实验非常类似的进一步的剃毛实验(British Journal of dermatology 2008;159:300-305)。这些额外的剃毛实验描述于实施例18。该实验证实中和PRLR抗体在高催乳素血症和正常催乳素血症雄性和雌性小鼠中刺激毛发生长。
[0278] 本发明的抗体解决为女性和男性的高催乳素血症性和正常催乳素血症性脱发提供新治疗的问题。
[0279] 因此，本发明的另一方面是采用中和PRLR抗体或抗原结合片段来治疗或预防高催乳素血症性和正常催乳素血症性脱发。
[0280] 本发明的另一方面是如本发明所述的抗体或抗原结合片段用于治疗或预防高催乳素血症性脱发的用途。
[0281] 联合激素疗法
[0282] 为了治疗仍然具有子宫的绝经后妇女的潮热，使用雌激素(雌二醇或马结合雌激素=CEE)和黄体酮(例如醋酸甲羟孕酮(MPA)、孕酮、屈螺酮、左炔诺孕酮)的组合。必须加入黄体酮以抑制雌二醇激活的子宫上皮细胞增殖。但是，加入黄体酮增加乳腺上皮细胞增殖。因为这两者，正常以及癌性乳腺上皮细胞通过增殖应答联合的雌激素加上黄体酮疗法，据发现乳腺癌的相对风险在CEE加上MPA治疗后升高(JAMA 233:321-333;2002)。
[0283] 中和PRLR抗体在每个月或每两个月给予联合激素疗法下的妇女时会抑制增加的乳腺上皮细胞增殖。
[0284] 如实施例19所述，采用以前开发的用于定量分析子宫和乳房中的黄体酮影响的小鼠模型(Endocrinology 149:3952-3959,2008)。将小鼠卵巢切除，并且在卵巢切除后14天用媒介物或者100ng雌二醇加上100mg/kg孕酮处理3周以模拟激素替代疗法。将动物用特异性PRLR(10mg/kg或30mg/kg)或非特异性抗体(30mg/kg)每周处理一次。分析中和PRLR抗体对联合激素疗法下的乳房中的增殖活性的影响。
[0285] 本发明的抗体解决治疗在联合激素疗法下观察到的增加的乳腺上皮细胞增殖的问题。
[0286] 本发明的另一目的是中和PRLR抗体或抗原结合片段在联合激素疗法(即雌激素+黄体酮疗法)中抑制乳腺上皮细胞增殖的用途。
[0287] 本发明的另一方面是如本发明所述的抗体或抗原结合片段在联合激素疗法(即雌激素+黄体酮疗法)中抑制乳腺上皮细胞增殖的用途。
[0288] 定义
[0289] 如本文所用，靶抗原人“PRLR”指在其胞外域中具有与SEQ ID NO.70的氨基酸位置1-210基本上相同的氨基酸序列的人多肽及其天然存在的等位和/或剪接变体。如本文所用，“PRLR的ECD”指上述氨基酸所代表的PRLR的胞外部分。此外，靶标人PRLR还涵盖该受体的突变形式，例如Paul Kelly所述的激活突变I146L (Proc Natl Acad Sci U S A.105(38):14533-14538,2008;和oral communication Turin,2007)。
[0290] 如本文所用，短语“治疗有效量”是指治疗性或预防性抗体的量，当按照期望的治疗方案给予该量时，会适当引起期望的治疗或预防效果或应答，包括缓解疾病的一些或全部此类症状或者降低对该疾病的易感性。
[0291] 如本文所用，如果抗体能够区分抗原与一种或多种参考抗原，则这样的抗体“特异性结合至”、“对…是特异性的”或“特异性识别”这样的抗原(这里为PRLR)，因为结合特异性不是绝对的，而是相对特性。在其最一般的形式中(并且当未提到定义的参考时)，“特异性结合”指例如按照以下方法之一确定的抗体区分所关注的抗原与不相关的抗原的能力。这类方法包括但不限于蛋白印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-测试以及肽扫描。例如，可以进行标准ELISA测定。可以通过标准显色进行评分(例如具有辣根过氧化物(horseradish peroxide)的二抗和具有过氧化氢的四甲基联苯胺)。通过例如在450nm的光密度来将某些孔中的反应评分。典型背景(＝阴性反应)可以为0.1OD；典型阳性反应可以为1OD。这表示阳性/阴性的差异可以超过10倍。通常，通过使用不止单个参考抗原而是一套约3-5个不相关的抗原如奶粉、BSA、转铁蛋白等来进行结合特异性的测定。
[0292] 然而，“特异性结合”还可以指抗体区分靶抗原与用作参考点的一种或多种密切相关的抗原的能力。此外，“特异性结合”可以涉及抗体区分其靶抗原的不同部分的能力，例如PRLR的不同结构域、亚结构域或区域，如PRLR的ECD的N端或C端区域中的表位；或者区分PRLR的ECD的一个或多个关键氨基酸残基或氨基酸残基段的能力。
[0293] “亲和力”或“结合亲和力”KD常通过测量平衡缔合常数(ka)和平衡解离常数(kd)并计算kd除以ka的商来确定(KD=kd/ka)。术语“免疫特异性”或“特异性结合”表示抗体-6以低于或等于10 M的亲和力KD(单价亲和力)结合至PRLR或其ECD。术语“高亲和力”表-7
示抗体以低于或等于10 M的亲和力KD(单价亲和力)结合至PRLR或其ECD。抗体可以具有与其他不相关的分子相比大很多的对靶抗原的亲和力。抗体还可以具有与同系物相比-3 -4 -5
大很多的对靶抗原的亲和力，例如至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、10 倍、10 倍、10-6
倍、10 倍或更大的对靶抗原的相对亲和力。这样的亲和力可以利用常规技术容易地测定，例如通过平衡透析；通过使用BIAcore2000仪器，利用制造商所列的一般方法；通过利用放射性标记的靶抗原进行放射免疫测定；或者通过技术人员已知的其他方法。可以例如通过Scatchard et al.,Ann N.Y.Acad.ScL,51:660(1949)的方法分析亲和力数据。
示抗体以低于或等于10 M的亲和力KD(单价亲和力)结合至PRLR或其ECD。抗体可以具有与其他不相关的分子相比大很多的对靶抗原的亲和力。抗体还可以具有与同系物相比-3 -4 -5
大很多的对靶抗原的亲和力，例如至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、10 倍、10 倍、10-6
倍、10 倍或更大的对靶抗原的相对亲和力。这样的亲和力可以利用常规技术容易地测定，例如通过平衡透析；通过使用BIAcore2000仪器，利用制造商所列的一般方法；通过利用放射性标记的靶抗原进行放射免疫测定；或者通过技术人员已知的其他方法。可以例如通过Scatchard et al.,Ann N.Y.Acad.ScL,51:660(1949)的方法分析亲和力数据。
[0294] 如本文所用，短语“抗体拮抗催乳素介导的信号传导”是指通过本发明的抗体阻断催乳素受体激活，这导致催乳素受体介导的信号传导的完全抑制。
[0295] 如本文所用，短语“抗体竞争结合”是指一抗体与第二抗体或更多抗体之间竞争结合至催乳素受体。
[0296] 术语“抗体”以其最广泛的含义使用，并且包括完全装配的抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、可以结合抗原的抗体片段(例如，Fab'、F'(ab)2、Fv、单链抗体、双抗体)、骆驼抗体(camel bodies)以及包含上述的重组肽，只要它们表现出期望的生物学活性。抗体可以在它们的重链上携带不同的恒定结构域(Fc结构域)，优选来源于IgG1、IgG2或IgG4同种型(参见下文)。可以引入用于修改效应子功能的突变。已鉴别在与补体蛋白C1q的相互作用中起主导作用的Fc-结构域中的氨基酸残基以及Fc受体，并且已描述影响效应子功能的突变(综述参见Labrijn et al.,Current opinion in Immunology 20:479-485,2008)。特别地，IgG1的低糖基化(aglycosylation)可以通过在氨基酸位置297处将天冬酰胺突变为丙氨酸或者将天冬酰胺突变为谷氨酰胺来实现，据报道这消除抗体衍生的细胞介导的细胞毒性(ADCC)(Sazinsky et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.105(51):20169,2008;Simmons et al.,J.of Immunological Methods263:133-147,2002)。在位置322处用丙氨酸代替赖氨酸导致ADCC降低和去除补体衍生的细胞毒性(CDC)，而同时用丙氨酸代替位置234和235处的两个亮氨酸导致避免ADCC和CDC[Hezareh et al.,J.of Virology,75(24):12161-12168,2001]。为了在体内应用IgG4同种型作为保留亲和性的二价治疗剂，可以引入修饰，例如“核心铰链区”中的丝氨酸至脯氨酸的交换(Schuurman,J.et al.Immunology 97:693-698,1999)。人IgG2分子形成异源共价二聚体的趋势可以通过将位置127、232和233处的半胱氨酸之一交换为丝氨酸来规避(Allen et al.,Biochemistry,2009,48(17),pp 3755-3766)。具有减少的效应子功能的可选形式可以为IgG2m4形式，其来源于IgG2，携带4个IgG4特异性氨基酸残基变化(An et al.,mAbs 1(6),2009)。抗体片段可以通过重组DNA技术或者通过完整抗体的酶促或化学切割来制备，并且在下文进一步描述。单克隆抗体的非限制性实例包括小鼠、嵌合、人源化、TM
人和Human Engineered 免疫球蛋白、抗体，具有来源于免疫球蛋白的序列的嵌合融合蛋白，或者它们的突变蛋白或衍生物，各自在下文进一步描述。考虑完整分子和/或片段的多聚体或团聚体，包括化学衍生的抗体。
人和Human Engineered 免疫球蛋白、抗体，具有来源于免疫球蛋白的序列的嵌合融合蛋白，或者它们的突变蛋白或衍生物，各自在下文进一步描述。考虑完整分子和/或片段的多聚体或团聚体，包括化学衍生的抗体。
[0297] 如本文所用，术语“单克隆抗体”指获得自基本上同质的抗体群体的抗体，即包含该群体的各抗体是相同的，除了可能少量存在的可能自然发生的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性，单克隆抗体的优势在于它们通过同质培养来合成，不被具有不同特异性和特征的其他免疫球蛋白污染。
[0298] 修饰语“单克隆”表示抗体的特征为获得自基本上同质的抗体群体，并且不应当理解为要求通过任何特定方法制备抗体。例如，所用的单克隆抗体可以通过由Kohler et al.,Nature,256:495[1975首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见例如，美国专利第4,816,567号)。“单克隆抗体”还可以是例如重组、嵌合、人源化、TM人、Human Engineered 或抗体片段。
[0299] “免疫球蛋白”或“天然抗体”为四聚体糖蛋白。在天然存在的免疫球蛋白中，每个四聚体包含两个相同的多肽链对，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包括约100-110个或更多个氨基酸的“可变”区，其主要负责抗原识别。每条链的羧基端部分定义为恒定区，其主要负责效应子功能。免疫球蛋白可以根据它们的重链恒定结构域的氨基酸序列分配至不同类别。重链分类为μ(mu)、Δ(delta)、γ(gamma)、α(alpha)和ε(epsilon)，并且定义抗体的同种型分别为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。这些同种型中的一些可以进一步分为亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。不同同种型具有不同的效应子功能；例如，IgG1和IgG3同种型通常具有ADCC活性。人轻链分类为K(kappa)和λ(lambda)轻链。在轻链和重链内，可变区与恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。一般参见Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))。
[0300] 抗体/免疫球蛋白的“功能片段”或“抗原结合的抗体片段”在本文定义为保留抗原结合区的抗体/免疫球蛋白片段(例如，IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”通常存在于抗体的一个或多个高变区中，即CDR-1、-2、和/或-3区；然而，可变“框架”区也可以在抗原结合中起重要作用，例如通过提供CDR的支架。优选地，“抗原结合区”至少包含可变轻(VL)链的氨基酸残基4-103和可变重(VH)链的氨基酸残基5-109，更优选VL的氨基酸残基3-107和VH的氨基酸残基4-111，并且特别优选完整的VL和VH链[VL的氨基酸位置1-109和VH的氨基酸位置1-113，而氨基酸位置的编号根据Kabat数据库进行(Johnson and Wu,Nucleic Acids Res.,2000,28,214-218)]。用于本发明的免疫球蛋白的优选类别为IgG。
[0301] 术语“高变”区指抗体或功能片段的可变结构域VH和VL的氨基酸残基，其负责抗原结合。高变区包含来自“互补性决定区域”或CDR的氨基酸残基[即，如图12所述的轻链可变结构域中的残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和88-97(LCDR3)以及重链可变结构域中的残基29-36(HCDR1)、48-66(HCDR2)和93-102(HCDR3)]和/或那些来自高变环的残基[即，如Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)所述的轻链可变结构域中的残基26-32(LCDR1内)、50-52(LCDR2内)和91-96(LCDR3内)以及重链可变结构域中的残基26-32(HCDR1内)、53-55(HCDR2内)和96-101(HCDR3内)]。
[0302] 抗体片段的非限制性实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、结构域抗体(dAb)、互补性决定区域(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、双抗体、三链抗体、四链抗体(tetrabodies)、微抗体(minibodies)、线性抗体(Zapata et al.,Protein Eng.,8(10):1057-1062(1995))；螯合重组抗体、三体(tribodies)或双体(bibodies)、胞内抗体、纳米抗体(nanobodies)、小模块免疫药物(SMIP)、抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、骆驼化抗体、包含VHH的抗体、或者它们的突变蛋白或衍生物、和至少包含足以赋予多肽特异性抗原结合的免疫球蛋白的一部分如CDR序列的多肽，只要抗体保留期望的生物学活性；以及由抗体片段形成的多特异性抗体(C.A.K Borrebaeck,editor(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs in Molecular Biology),Oxford University Press;R.Kontermann&S.Duebel,editors(2001)Antibody Engineering(Springer Laboratory Manual),Springer Verlag)。除“双特异性”或“双功能”抗体以外的抗体理解为具有各自相同的结合位点。可以将F(ab’)2或Fab工程化以最小化或完全去除发生在CH1和CL结构域之间的分子间二硫键相互作用。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单一抗原结合位点；以及残余的“Fc”片段，其名字反映其容易地结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个“Fv”片段的F(ab')2片段。“Fv”片段是包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这个区域由紧密、非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。在这个构型中，每个可变结构域的3个CDR相互作用以定义VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。共同地，6个CDR赋予抗体抗原结合特异性。但是，甚至单个可变结构域(或者仅包含抗原特异性的3个CDR的Fv的一半)仍具有识别并结合抗原的能力。
[0303] “单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。
[0304] 优选地，Fv多肽还包含VH与VL结构域之间的多肽接头，其使得Fv能够形成抗原结合的期望结构。sFv的综述参见Pluckthun in The Pharmacology of
Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
[0305] Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab片段与Fab'片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基端加入几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在本文中是Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。F(ab')2抗体片段起初制备为Fab'片段对，所述Fab'片段对之间具有铰链半胱氨酸。
[0306] “框架”或FR残基是那些除高变区残基以外的可变结构域残基。
[0307] 短语“恒定区”指赋予效应子功能的抗体分子的部分。
[0308] 术语“突变蛋白”或“变体”可以互换使用，并且指在可变区或等同于可变区的部分中包含至少一个氨基酸取代、缺失或插入的抗体多肽序列，只要该突变蛋白或变体保留期望的结合亲和力或生物学活性。
[0309] 突变蛋白可以与亲本抗体基本上同源或基本上相同。
[0310] 术语“衍生物”指通过这样的技术共价修饰的抗体，如泛素化、缀合至治疗剂或诊断剂、标记(例如，用放射性核素或各种酶)、共价聚合物连接如聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)以及通过化学合成非天然氨基酸来插入或取代。
[0311] “人”抗体或功能人抗体片段在本文定义为不是嵌合或“人源化”的并且不是来自(整体或部分)非人物种的抗体或抗体片段。人抗体或功能抗体片段可以来源于人，或者可以是合成的人抗体。“合成的人抗体”在本文中定义为具有整体或部分、电子(in silico)来源于合成序列的序列的抗体，所述合成序列基于已知的人抗体序列的分析。人抗体序列或其片段的电子设计可以例如通过分析人抗体或抗体片段序列的数据库并利用由此获得的数据设计多肽序列来实现。人抗体或功能抗体片段的另一实例是由分离自人来源的抗体序列文库的核酸编码的抗体或功能抗体片段(即，这样的文库基于采自人天然来源的抗体)。人抗体的实例包括如Carlsson and Exp.Rev.Mol.Diagn.1(1),102-108(2001), et al.Nat.Biotech.18,852-856(2000)和美国专利
第6,989,250号所述的基于n-CoDeR的抗体。
第6,989,250号所述的基于n-CoDeR的抗体。
[0312] “人源化抗体”或功能人源化抗体片段在本文中定义为这样的抗体或抗体片段：(i)来源于非人来源(例如，具有异源免疫系统的转基因小鼠)，该抗体基于人种系序列；或者(ii)CDR移植的，其中可变结构域的CDR来自非人来源，而可变结构域的一个或多个框架是人来源的，并且恒定结构域(如果有)是人来源的。
[0313] 如本文所用，短语“嵌合抗体”指包含来源于两个不同抗体的序列的抗体(参见例如，美国专利第4,816,567号)，所述两个不同抗体通常源自不同物种。最典型地，嵌合抗体包含人和小鼠抗体片段，一般为人恒定区和小鼠可变区。
[0314] “Human EngineeredTM”抗体通过根据Studnicka等人的美国专利第5,766,886号所示的方法改变亲本序列而产生，例如SEQ ID NO 58、61、64、67所示的抗体以及专利申请WO08/022295所述的抗体。
[0315] 本发明的抗体可以来源于重组抗体基因文库。制备重组人抗体基因的所有组成成分的技术的开发以及编码的抗体片段在丝状噬菌体表面上的展示提供直接制备和选择人抗体的重组方法，其还可以应用于人源化、嵌合、小鼠或突变蛋白抗体。通过噬菌体技术制备的抗体在细菌中制备为抗原结合片段，通常为Fv或Fab片段，因此缺少效应子功能。效应子功能可以通过两种策略之一引入：可以将该片段工程化入完整抗体，用于在哺乳动物细胞中表达，或者工程化入具有能够引发效应子功能的第二结合位点的双特异性抗体片段。通常，将抗体的Fd片段(VH-CH1)和轻链(VL-CL)分别通过PCR克隆并在组合噬菌体展示文库中随机重组，然后所述组合噬菌体展示文库可以用来选择结合至特定抗原。Fab片段在噬菌体表面表达，即物理连接至编码它们的基因。因此，通过抗原结合选择Fab共选择Fab编码序列，随后可以扩增所述Fab编码序列。通过几轮抗原结合和重新扩增，即称为淘选的过程，将抗原特异性的Fab富集并最终分离。已描述从噬菌体-展示文库衍生人抗体的各种方法。这类文库可以建立在单一主框架上，如Carlsson and Exp.
Rev.Mol.Diagn.1(1),102-108(2001), et al.Nat.Biotech.18,852-856(2000)
和美国专利第6,989,250号所述允许多样的体内形成的(即人来源的)CDR重组入所述主框架。或者，这样的抗体文库可以基于电子设计并由合成产生的核酸编码的氨基酸序列。例如，抗体序列的电子设计通过分析人序列的数据库并利用由此获得的数据设计多肽序列来实现。设计和获得电子产生的序列的方法描述于例如Knappik et al.,J.Mol.Biol.(2000)296:57;Krebs et al.,J.Immunol.Methods.(2001)254:67;和美国专利第
6,300,064号。噬菌体展示技术的综述参见WO08/022295(Novartis)。
Rev.Mol.Diagn.1(1),102-108(2001), et al.Nat.Biotech.18,852-856(2000)
和美国专利第6,989,250号所述允许多样的体内形成的(即人来源的)CDR重组入所述主框架。或者，这样的抗体文库可以基于电子设计并由合成产生的核酸编码的氨基酸序列。例如，抗体序列的电子设计通过分析人序列的数据库并利用由此获得的数据设计多肽序列来实现。设计和获得电子产生的序列的方法描述于例如Knappik et al.,J.Mol.Biol.(2000)296:57;Krebs et al.,J.Immunol.Methods.(2001)254:67;和美国专利第
6,300,064号。噬菌体展示技术的综述参见WO08/022295(Novartis)。
[0316] 或者，本发明的抗体可以来自动物。可以将这样的抗体人源化或人工程化，总结于WO08/022295(Novartis)；这样的抗体可以来自转基因动物[还参见
WO08/022295(Novartis)]。
WO08/022295(Novartis)]。
[0317] 如本文所用，抗原如PRLR的不同“形式”在本文定义为由不同翻译和翻译后修饰所致的不同蛋白分子，例如但不限于初级催乳素受体转录物的剪接差异、糖基化的差异以及翻译后蛋白酶剪切的差异。
[0318] 如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合至免疫球蛋白或T-细胞受体的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。如果通过本领域技术人员公知的任何方法，显示一种抗体在竞争性结合测定中与第二种抗体竞争，并且如果优选地表位的所有氨基酸被这两种抗体结合，则认为两种抗体“结合相同表位”。
[0319] 术语“成熟抗体”或“成熟抗原结合片段”如成熟Fab变体包括抗体或抗体片段的衍生物，其表现出较强地结合至给定抗原如PRLR的胞外域，即具有增加的亲和力的结合。成熟是鉴别抗体或抗体片段的6个CDR内导致这种亲和力增加的少量突变的过程。成熟过程是将突变引入抗体与筛选以鉴别改进的结合物的分子生物学方法的组合。
[0320] 治疗方法
[0321] 治疗方法包括向需要治疗的个体给予治疗有效量的本发明涵盖的抗体。“治疗有效”量在本文定义为抗体量，其具有足够的数量以作为单剂量或根据多剂量方案，单独或联合其他物质阻断治疗的个体区域中的PRLR阳性细胞增殖，这导致不良疾病状况的减轻，而且所述量是毒理学可耐受的。所述个体可以是人或非人动物(例如，兔、大鼠、小鼠、猴或其他低等灵长类)。
[0322] 本发明的抗体可以与已知的药物共给药，并且在某些情况下，所述抗体本身可以是修饰的。例如，可以将抗体缀合至免疫毒素或放射性同位素以可能进一步增加效力。
[0323] 本发明的抗体可以在PRLR不期望地高表达的各种情况中用作治疗或诊断工具。特别适合用本发明的抗体治疗的病症和疾病状况为子宫内膜异位症、子宫腺肌病、非激素女性生育避孕、良性乳房疾病和乳腺痛、泌乳抑制、良性前列腺增生、纤维瘤、高催乳素血症性和正常催乳素血症性脱发，以及在联合激素疗法中协同治疗以抑制乳腺上皮细胞增殖。
[0324] 为了治疗任何上述病症，按照本发明使用的药物组合物可以利用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂以常规方式配制。本发明的抗体可以通过任何合适的方法给药，所述方法可以根据治疗的病症类型变化。可能的给药途径包括肠胃外(例如，肌肉内、静脉内、动脉内、腹腔内或皮下)、肺内和鼻内，并且，如果期望局部免疫抑制治疗，包括病灶内(intralesional)给药。此外，本发明的抗体可以通过具有例如递减剂量的所述抗体的脉冲输液给药。优选地，剂量给药通过注射进行，最优选静脉内或皮下注射，这部分地取决于给药是短暂的或长期的。待给予的量取决于各种因素，例如临床症状、个体的重量、是否给予其他药物。技术人员会认识到给药途径会根据待治疗的病症或疾病状况变化。
[0325] 根据本发明确定新多肽的治疗有效量主要取决于具体患者特征、给药途径以及治疗的病症的性质。一般指导可以例如在国际协调会议的出版物和Remington's Pharmaceutical Sciences， 第 27 和 28 章，484-528 页 (18th ed.,Alfonso R.Gennaro,Ed.,Easton,Pa.:Mack Pub.Co.,1990)中找到。更具体地，确定治疗有效量取决于如药物的毒性和效力这样的因素。毒性可以利用本领域公知和前述参考文献中的方法确定。效力可以利用相同指导结合下文实施例所述的方法确定。
[0326] 药物组合物和给药
[0327] 本发明还涉及药物组合物，其可以包含PRLR抗体，所述PRLR抗体是单独的或与至少一种其他物质如稳定化合物组合，所述药物组合物可以在任何无菌的生物相容性药物载体中给药，所述载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。可以将任何这些分子在药物组合物中单独或与其他物质、药物或激素组合给予患者，在所述药物组合物中所述分子与赋形剂或药学可接受的载体混合。在本发明的一实施方案中，所述药学可接受的载体是药学惰性的。
[0328] 本发明还涉及药物组合物的给药。这样的给药肠胃外完成。肠胃外递送的方法包括体表、动脉内(直接至肿瘤)、肌肉内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹腔内、子宫内或鼻内给药。除了活性成分，这些药物组合物可以包含合适的药学可接受的载体，包括赋形剂和助剂，其促进将活性化合物加工入可以药学使用的制剂。制剂和给药技术的进一步细节可以在Remington's Pharmaceutical Sciences的最新版本(Ed.Maack Publishing Co,Easton,Pa.)中找到。
[0329] 用于肠胃外给药的药物制剂包括活性化合物的水溶液。为了注射，可以将本发明的药物组合物配制于水溶液中，优选生理学上相容的缓冲液如汉克斯(Hank)溶液、林格氏液或生理缓冲盐水。水性注射混悬剂可以包含增加该混悬剂的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。此外，所述活性化合物的混悬剂可以制备为适当的油性注射混悬剂。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油，或者合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或者脂质体。任选地，混悬剂还可以包含合适的稳定剂或物质，其增加所述化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液。
[0330] 为了体表或鼻部给药，适合待渗透的特定屏障的渗透剂可以用于制剂。这类渗透剂是本领域公知的。
[0331] 肠胃外给药还包括肠胃外递送的方法，其还包括动脉内、肌肉内、皮下、髓内、鞘内和心室内、静脉内、腹腔内、子宫内、阴道或鼻内给药。
[0332] 试剂盒
[0333] 本发明还涉及药物包装和试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器装有上文提到的本发明的组合物的一种或多种成分。与这类容器相关的可以是管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构所规定形式的提示，其反映产品的生产、使用或销售机构批准用于人给药。
[0334] 在另一实施方案中，所述试剂盒可以包含编码本发明的抗体的DNA序列。优选地，编码这些抗体的DNA序列提供在质粒中，所述质粒适合转染入宿主细胞并由宿主细胞表达。质粒可以包含启动子(通常为诱导型启动子)以调节DNA在宿主细胞中的表达。质粒还可以包含适当的限制位点以促进将其他DNA序列插入所述质粒以产生各种抗体。质粒还可以包含许多其他元件以促进所编码的蛋白的克隆和表达。这类元件是本领域技术人员公知的，并且包括例如选择标记、起始密码子、终止密码子等。
[0335] 制备和储存
[0337] 所述药物组合物可以提供为在4.5-5.5的pH范围的1mM-50mM组氨酸、0.1%-2%蔗糖、2%-7%甘露醇中的冻干粉，其在使用之前与缓冲液组合。
[0338] 已经制备包含配制于可接受的载体中的本发明的化合物的药物组合物之后，可以将它们放置在适当的容器中并标记所示疾病状况的治疗。对于PRLR抗体的给药，这样的标记会包括给药的量、频率和方法。
[0339] 治疗有效剂量
[0340] 适合用于本发明的药物组合物包括这样的组合物，其中包含有效量的活性成分以实现预期目的，即治疗特征为PRLR表达的特定疾病状态。有效剂量的确定在本领域技术人员的能力之内。
[0341] 对于任何化合物，治疗有效剂量最初可以在细胞培养测定如淋巴瘤细胞或动物模型(通常为小鼠、大鼠、兔、狗、猪或猴)中估计。动物模型还用来获得期望的浓度范围和给药途径。然后这类信息可以用来确定在人中给药的可用剂量和途径。
[0342] 治疗有效剂量指改善症状或疾病状况的蛋白或者其抗体、拮抗剂或抑制剂的量。这类化合物的疗效和毒性可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学方法来确定，例如，ED50(在群体的50%中治疗有效的剂量)和LD50(对群体的50%致死的剂量)。治疗与毒性效果之间的剂量比为治疗指数，并且其可以表示为比值ED50/LD50。表现出大治疗指数的药物组合物是优选的。获得自细胞培养测定和动物研究的数据用于配制人使用的剂量范围。这类化合物的剂量优选在循环浓度的范围内，其包括很少或无毒性的ED50。剂量在这个范围内变化，取决于所用的剂型、患者的敏感性和给药途径。
[0343] 确切剂量由个体医师根据待治疗的患者来选择。调整剂量和给药以提供足够水平的活性部分或维持期望的效果。可以考虑的其他因素包括疾病状态的严重程度，例如子宫内膜异位症病变的大小和部位；患者的年龄、重量和性别；饮食、给药时间和频率、药物组合、反应敏感性以及对治疗的耐受/应答。长效药物组合物可以每3-4天、每周、或每两周一次、或每月内一次给药，这取决于具体制剂的半衰期和清除率。
[0344] 正常剂量可以为0.1-100,000微克，高达约2g的总剂量，这取决于给药途径。具体剂量和递送方法的指导在文献中提供。参见US.4,657,760；US.5,206,344；或US.5,225,212。本领域技术人员会采用与蛋白或它们的抑制剂的制剂不同的多核苷酸制剂。相似地，多核苷酸或多肽的递送会是特定细胞、疾病状况、部位等特异性的。放射性标记的抗体的优选特异性活性可以为0.1-10mCi/mg蛋白(Riva et al.,Clin.Cancer Res.5:3275s-3280s,1999;Wong et al.,Clin.Cancer Res.6:3855-3863,2000;Wagner et al.,J.Nuclear Med.43:267-272,2002)。
[0345] 本发明通过以下实施例进一步描述。提供实施例仅为了参考具体实施方案说明本发明。这些例证虽然说明本发明的某些具体方面，但是不意图限制或者限定所公开的发明的范围。
[0346] 所有实施例均利用标准技术进行，所述标准技术对于本领域技术人员是公知和常规的，除了其他地方详细描述的。以下实施例的常规分子生物学技术可以如标准实验室手册所述进行，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。附图说明
[0347] 图1：来自健康妇女和患有子宫内膜异位症的妇女的人子宫内膜和病变(异位组织)中的催乳素-mRNA(PRL-mRNA)表达(通过实时TaqMan PCR分析来分析)。
[0348] 图2：来自健康妇女和患有子宫内膜异位症的妇女的人子宫内膜和病变(异位组织)中的催乳素受体-mRNA(PRLR-mRNA)表达(通过实时TaqMan PCR分析来分析)。
[0349] 图3：大鼠组织中PRLR基因表达的RNA印迹分析。PRLR的基因表达显示在胎盘和前列腺中高表达。
[0350] 图4：用不同激素处理的大鼠前列腺中的PRLR表达的蛋白印迹分析。雌二醇处理完整大鼠和阉割导致大鼠前列腺中的PRLR蛋白上调，而双氢睾酮处理完整大鼠与媒介物处理完整动物相比，对前列腺中的PRLR表达没有影响。
[0351] 图5：通过中和PRLR抗体和非特异性对照抗体抑制催乳素激活的Ba/F(=Baf)细胞增殖(稳定表达人PRLR)。测定IgG1形式的以下抗体的IC50值：005-C04(实心圆)：1.29μg/ml=8.6nM；006-H08(空心圆)：0.15μg/ml=1nM；HE06.642(实心三角形)：
0.34μg/ml=2.2nM；002-H06(空心三角形)：0.54μg/ml=3.6nM；002-H08(实心正方形)：
0.72μg/ml=4.8nM；非特异性对照抗体(空心正方形)：无细胞增殖抑制。
0.34μg/ml=2.2nM；002-H06(空心三角形)：0.54μg/ml=3.6nM；002-H08(实心正方形)：
0.72μg/ml=4.8nM；非特异性对照抗体(空心正方形)：无细胞增殖抑制。
[0352] 图6：通过中和PRLR抗体和非特异性对照抗体抑制催乳素诱导的大鼠淋巴瘤细胞增殖(NB2细胞)。测定以下IC50值：XHA06.642(实心圆)：10μg/ml=67nM；XHA06.983(空心圆)：对大鼠淋巴瘤细胞增殖没有影响；非特异性对照抗体(实心三角形)：在10μg/ml没有影响。
[0353] 图7：通过中和PRLR抗体和非特异性对照抗体抑制T47D细胞中催乳素刺激的STAT5磷酸化。
[0354] 非特异性对照抗体(FITC)不抑制T47D细胞中的STAT5磷酸化。相比之下，抗体XHA06.642、005-C04(=IgG1005-C04)和006-H08(=IgG1006-H08)以剂量依赖性方式抑制T47D细胞中STAT5的磷酸化。
[0355] 图8：中和PRLR抗体和非特异性对照对催乳素激活的萤光素酶报道基因活性的影响，其使用人催乳素受体(hPRLR)稳定转染并在催乳激素应答元件(LHRE)的控制下瞬时表达萤光素酶基因的HEK293细胞。测定IgG1形式的以下抗体的IC50值：006-H08(实心圆)：0.83μg/ml=5.5nM；HE06.642(空心圆)：0.63μg/ml=4.2nM；非特异性对照抗体(实心三角形)：不抑制萤光素酶活性。
[0356] 图9：中和PRLR抗体和非特异性对照对催乳素激活的萤光素酶报道基因活性的影响，其使用小鼠催乳素受体(mPRLR)稳定转染并在催乳激素应答元件(LHRE)的控制下瞬时表达萤光素酶基因的HEK293细胞。测定IgG1形式的以下抗体的IC50值：005-C04(实心三角形)：0.45μg/ml=3nM；XHA06.642(实心圆)：>>50μg/ml>>333nM，非特异性对照抗体(空心圆)：不抑制萤光素酶活性。
[0357] 图10：通过中和催乳素受体抗体和非特异性对照抗体抑制催乳素激活的Ba/F(=Baf)细胞增殖(稳定表达小鼠催乳素受体)。测定IgG1形式的以下抗体的IC50值：非特异性FITC抗体(实心正方形)：无细胞增殖抑制；HE06.642(实心圆)：>>>30μg/ml>>>200nM；001-E06(空心圆)：43.7μg/ml=291nM；001-D07(实心三角形)：16.5μg/ml=110nM；005-C04(空心三角形)：0.74μg/ml=4.9nM。
[0358] 图11：用磷酸缓冲盐水(= 媒介物)、非特异性对照抗体(FITC IgG1)或中和抗体IgG1005-C04(=005-C04)处理的雌性小鼠中的妊娠率和平均胎仔数。妊娠率为87.5%(媒介物处理的雌性)、75%(用10mg/kg的非特异性抗体处理的雌性)、100%(用10mg/kg的IgG1005-C04处理的雌性)和0%(用30mg/kg的IgG1005-C04处理的雌性)。平均胎仔数为10.9只动物(媒介物处理的雌性)、12.3只动物(用10mg/kg的非特异性抗体处理的雌性)、13只动物(用10mg/kg的IgG1005-C04处理的雌性)和0只动物(用30mg/kg的IgG1005-C04处理的雌性)。
[0359] 图12：根据Johnson和Wu(Nucleic Acids Res.2000,28,214-218)的框架氨基酸位置的Kabat编号。
[0360] 图13：所选的抗PRLR抗体(005-C04,001-E06,HE06642)的FACS分析结果。在表达人和小鼠PRLR的HEK293细胞上，以固定浓度测定抗体的结合，与不表达PRLR的亲代细胞系进行比较。
[0361] 图14A：产后(postpartal)每天的窝幼仔(litter)增重表示为产后第1天获得的窝幼仔重量的百分比。示出来自未处理的母亲(实心圆)、来自用10mg/kg的非特异性小鼠IgG2a抗体处理的母亲(空心圆)以及来自用10mg/kg(实心三角形)和30mg/kg(空心三角形)的包含小鼠IgG2a恒定结构域的中和抗体005-C04(=IgG2a 005-C04)处理的母亲的窝幼仔增重。箭头指示进行抗体注射的天数。从产后第8天开始，来自用30mg/kg的IgG2a 005-C04处理的母亲的窝幼仔增重有显著降低。
[0362] 图14B：每天增加的窝幼仔增重表示为产后第1天的窝幼仔重量的百分比。示出来自未处理的母亲(实心圆)、用10mg/kg的非特异性小鼠IgG2a抗体处理的母亲(空心圆)以及用10mg/kg(实心三角形)和30mg/kg(空心三角形)的包含小鼠IgG2a恒定结构域的中和抗体005-C04(=IgG2a 005-C04)处理的母亲的幼仔的结果。基本上图14A呈现图14A所示的图的斜率。来自未处理的母亲和用10mg/kg的非特异性抗体处理的母亲的每天窝幼仔增重在产后第1天的窝幼仔重量的30%左右波动。相比之下，用30mg/kg的IgG2a
005-C04处理母亲导致从第7天开始增重显著降低(*p<0.05；***p<0.005对来自用非特异性抗体处理的母亲的幼仔)，而用10mg/kg的IgG2a 005-C04处理导致从第11天开始每天增重显著降低(p<0.05对来自用非特异性抗体处理的母亲的幼仔)。箭头指示抗体施用的天数。
005-C04处理母亲导致从第7天开始增重显著降低(*p<0.05；***p<0.005对来自用非特异性抗体处理的母亲的幼仔)，而用10mg/kg的IgG2a 005-C04处理导致从第11天开始每天增重显著降低(p<0.05对来自用非特异性抗体处理的母亲的幼仔)。箭头指示抗体施用的天数。
[0363] 图14C：来自哺乳母亲的乳腺的组织切片。来自未处理的母亲或用非特异性抗体处理的母亲的乳腺充满产乳管(ducts producing milk)。相比之下，由脂肪岛(黑色箭头)的出现所证实的乳腺退化是由中和IgG2a 005-C04抗体剂量依赖性诱导的。
[0364] 图14D：来自哺乳母亲的乳腺中的乳蛋白表达。乳蛋白β酪蛋白(Csn-2)、乳清酸性蛋白(WAP)和IGF-1的表达在用中和PRLR抗体IgG2a 005-C04处理的母亲中以剂量依赖性方式降低，但在用非特异性抗体处理的母亲中未降低。将基因表达归一化至TATA框结合蛋白(TBP)的表达。
[0365] 图15A：在良性乳房疾病的高催乳素血症小鼠模型中形成侧枝和肺泡样结构。中和PRLR抗体IgG1005-C04(=005-C04)于10和30mg/kg下在接受垂体同基因移植物的小鼠中抑制侧向分支和肺泡样结构的形成。
[0366] 图15B：良性乳房疾病的高催乳素血症小鼠模型中上皮细胞增生和上皮细胞增殖的程度。一些BrdU阳性细胞由白色箭头标记。中和PRLR抗体IgG1005-C04(=005-C04)阻断乳腺中的上皮细胞增生和上皮细胞增殖。
[0367] 图15C：良性乳房疾病的高催乳素血症小鼠模型中STAT5磷酸化的程度。一些磷酸化STAT5阳性细胞由白色箭头指示。当以30mg/kg的剂量施用时，中和PRLR抗体IgG1005-C04(=005-C04)完全阻断STAT5磷酸化。
[0368] 图16：通过包含小鼠IgG2a恒定结构域的中和PRLR抗体005-C04(=IgG2a005-C04)抑制前列腺生长。与未处理的假手术小鼠相比，垂体同基因移植刺激前列腺生长。
用10mg/kg剂量和30mg/kg剂量的中和PRLR抗体处理抑制前列腺生长(***p<0.005对未处理的假手术小鼠)。
用10mg/kg剂量和30mg/kg剂量的中和PRLR抗体处理抑制前列腺生长(***p<0.005对未处理的假手术小鼠)。
[0369] 图17：中和PRLR抗体在高催乳素血症的存在下刺激毛发生长。垂体同基因移植(并剃毛)后三周从用于实施例17和图16所述的实验的雄性小鼠拍摄照片。高催乳素血症抑制剃毛区域中的毛发再生长。中和PRLR抗体而不是非特异性抗体在10和30mg/kg的005-C04(=IgG2a 005-C04)的剂量于高催乳素血症条件下刺激毛发再生长。
[0370] 图18：中和PRLR抗体而不是非特异性抗体在高催乳素血症和正常催乳素血症雄性和雌性小鼠中刺激剃毛区域中的毛发再生长(实施例18)。因此中和PRLR抗体适合在男性(图18B)和女性(图18A)中于正常催乳素血症和高催乳素血症条件下治疗脱发。
[0371] 图19：中和PRLR抗体而不是非特异性对照抗体抑制联合激素疗法(即联合雌激素加上黄体酮疗法)后乳腺中增加的上皮细胞增殖。
[0372] 评估4个乳腺横切片内增殖性导管上皮细胞的绝对数量，并且中值在图内示出为单杠。在卵巢切除的媒介物处理的小鼠中上皮细胞增殖相当低(中值=0)。雌二醇处理导致上皮细胞增殖的一些刺激(中值=9)，在雌激素加上孕酮处理下观察到最大乳腺上皮细胞增殖(中值=144)。用中和催乳素受体抗体005-C04(用10mg/kg的005-C04处理后中值=84；用30mg/kg的005-C04处理后中值=27)而不是非特异性对照抗体(中值=154)处理导致乳腺上皮细胞增殖剂量依赖性降低，几乎降回至仅雌二醇的水平。
[0373] 因此中和PRLR抗体适合在联合激素疗法(即雌二醇加上孕酮疗法)下治疗增加的乳腺上皮细胞增殖。
[0374] 图20：中和PRLR抗体而不是非特异性对照抗体抑制小鼠中的宫内子宫内膜异位症。结果示出为如实施例20所述的疾病评分。每个实验组的疾病评分中值示出为单杠。正常催乳素血症小鼠发展宫内子宫内膜异位症至一定程度(疾病评分中值=0.25)。由于垂体同基因移植的高催乳素血症增加疾病评分，并且更多动物患有疾病(疾病评分中值=2.5)。虽然用30mg/kg的非特异性抗体每周处理一次(评分中值=2.5)或两次(评分中值=2)对疾病没有影响，但是用特异性中和抗体处理表现出患病动物量的剂量依赖性减少；在使用特异性抗体的所有情况下疾病评分中值均为0。值得注意的是，每周两次接受10或30mg/kg的特异性抗体的所有动物均完全治愈，并且它们的疾病评分显著低于正常催乳素血症小鼠的疾病评分。因此中和PRLR抗体适合治疗妇女的宫内子宫内膜异位症(= 子宫腺肌病)和宫外子宫内膜异位症。
[0375] 图21：利用均相时间分辨荧光(HTRF)测定的成熟006-H08Fab变体的结合测试：
[0376] 通过与006-H08的IgG1分子竞争测试包含Fab的大肠杆菌上清结合至人PRLR的胞外域。该图说明Fab变体的结合，为柱形图。5个不同温育时间的信号强度(在665nM)在y-轴上给出，Fab变体的名称在x-轴上。在给定时间点与对照Fab 006-H08相比较低的信号表示增加的结合至PRLR。部分1中列出的所有Fab代表提高的结合物，而部分2中示出提高的以及一些未提高的结合物。
[0377] Seq ID NO:1表示HCDR1的氨基酸序列，006-H08
[0378] Seq ID NO:2表示HCDR1的氨基酸序列，002-H06
[0379] Seq ID NO:3表示HCDR1的氨基酸序列，002-H08
[0380] Seq ID NO:4表示HCDR1的氨基酸序列，006-H07
[0381] Seq ID NO:5表示HCDR1的氨基酸序列，001-E06
[0382] Seq ID NO:6表示HCDR1的氨基酸序列，005-C04
[0383] Seq ID NO:7表示HCDR2的氨基酸序列，006-H08
[0384] Seq ID NO:8表示HCDR2的氨基酸序列，002-H06
[0385] Seq ID NO:9表示HCDR2的氨基酸序列，002-H08
[0386] Seq ID NO:10表示HCDR2的氨基酸序列，006-H07
[0387] Seq ID NO:11表示HCDR2的氨基酸序列，001-E06
[0388] Seq ID NO:12表示HCDR2的氨基酸序列，005-C04
[0389] Seq ID NO:13表示HCDR3的氨基酸序列，006-H08，002-H06
[0390] Seq ID NO:14表示HCDR3的氨基酸序列，002-H08
[0391] Seq ID NO:15表示HCDR3的氨基酸序列，006-H07
[0392] Seq ID NO:16表示HCDR3的氨基酸序列，001-E06
[0393] Seq ID NO:17表示HCDR3的氨基酸序列，005-C04
[0394] Seq ID NO:18表示LCDR1的氨基酸序列，006-H08
[0395] Seq ID NO:19表示LCDR1的氨基酸序列，002-H06
[0396] Seq ID NO:20表示LCDR1的氨基酸序列，002-H08
[0397] Seq ID NO:21表示LCDR1的氨基酸序列，006-H07
[0398] Seq ID NO:22表示LCDR1的氨基酸序列，001-E06
[0399] Seq ID NO:23表示LCDR1的氨基酸序列，005-C04
[0400] Seq ID NO:24表示LCDR2的氨基酸序列，006-H08，002-H08
[0401] Seq ID NO:25表示LCDR2的氨基酸序列，002-H06
[0402] Seq ID NO:26表示LCDR2的氨基酸序列，006-H07
[0403] Seq ID NO:27表示LCDR2的氨基酸序列，001-E06
[0404] Seq ID NO:28表示LCDR2的氨基酸序列，005-C04
[0405] Seq ID NO:29表示LCDR3的氨基酸序列，006-H08
[0406] Seq ID NO:30表示LCDR3的氨基酸序列，002-H06，001-E06
[0407] Seq ID NO:31表示LCDR3的氨基酸序列，002-H08
[0408] Seq ID NO:32表示LCDR3的氨基酸序列，006-H07
[0409] Seq ID NO:33表示LCDR3的氨基酸序列，005-C04
[0410] Seq ID NO:34表示VH的氨基酸序列，006-H08
[0411] Seq ID NO:35表示VH的氨基酸序列，002-H06
[0412] Seq ID NO:36表示VH的氨基酸序列，002-H08
[0413] Seq ID NO:37表示VH的氨基酸序列，006-H07
[0414] Seq ID NO:38表示VH的氨基酸序列，001-E06
[0415] Seq ID NO:39表示VH的氨基酸序列，005-C04
[0416] Seq ID NO:40表示VL的氨基酸序列，006-H08
[0417] Seq ID NO:41表示VL的氨基酸序列，002-H06
[0418] Seq ID NO:42表示VL的氨基酸序列，002-H08
[0419] Seq ID NO:43表示VL的氨基酸序列，006-H07
[0420] Seq ID NO:44表示VL的氨基酸序列，001-E06
[0421] Seq ID NO:45表示VL的氨基酸序列，005-C04
[0422] Seq ID NO:46表示核酸序列VH，006-H08
[0423] Seq ID NO:47表示核酸序列VH，002-H06
[0424] Seq ID NO:48表示核酸序列VH，002-H08
[0425] Seq ID NO:49表示核酸序列VH，006-H07
[0426] Seq ID NO:50表示核酸序列VH，001-E06
[0427] Seq ID NO:51表示核酸序列VH，005-C04
[0428] Seq ID NO:52表示核酸序列VL，006-H08
[0429] Seq ID NO:53表示核酸序列VL，002-H06
[0430] Seq ID NO:54表示核酸序列VL，002-H08
[0431] Seq ID NO:55表示核酸序列VL，006-H07
[0432] Seq ID NO:56表示核酸序列VL，001-E06
[0433] Seq ID NO:57表示核酸序列VL，005-C04
[0434] Seq ID NO:58表示VH的氨基酸序列，HE06642，Novartis(WO2008/22295)[0435] Seq ID NO:59表示VH的氨基酸序列，XHA06642，Novartis(WO2008/22295)[0436] Seq ID NO:60表示VH的氨基酸序列，XHA06983，Novartis(WO2008/22295)[0437] Seq ID NO:61表示VL的氨基酸序列，HE06642
[0438] Seq ID NO:62表示VL的氨基酸序列，XHA06642，Novartis(WO2008/22295)[0439] Seq ID NO:63表示VL的氨基酸序列，XHA06983Novartis(WO2008/22295)
[0440] Seq ID NO:64表示核酸序列VH，HE06642
[0441] Seq ID NO:65表示核酸序列VH，XHA06642Novartis(WO2008/22295)
[0442] Seq ID NO:66表示核酸序列VH，XHA06983Novartis(WO2008/22295)
[0443] Seq ID NO:67表示核酸序列VL，HE06642
[0444] Seq ID NO:68表示核酸序列VL，XHA06642Novartis(WO2008/22295)
[0445] Seq ID NO:69表示核酸序列VL，XHA06983,Novartis(WO2008/22295)
[0446] Seq ID NO:70表示人ECD_PRLR，氨基酸位置1-210，S1结构域1-100(S1结构域构建体1-102)，S2结构域101-210
[0447] Seq ID NO:71表示CDS人ECD_PRLR，核苷酸位置1-630
[0448] Seq ID NO:72表示小鼠ECD_PRLR，氨基酸位置1-210
[0449] Seq ID NO:73表示CDS小鼠ECD_PRLR，核苷酸位置1-630
[0450] SEQ ID NO:74表示HCDR2，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0451] SEQ ID NO:75表示HCDR2，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0452] SEQ ID NO:76表示HCDR2，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0453] SEQ ID NO:77表示HCDR2，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0454] SEQ ID NO:78表示LCDR1，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0455] SEQ ID NO:79表示LCDR1，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0456] SEQ ID NO:80表示LCDR1，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0457] SEQ ID NO:81表示LCDR1，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0458] SEQ ID NO:82表示LCDR1，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0459] SEQ ID NO:83表示LCDR1，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0460] SEQ ID NO:84表示LCDR1，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0461] SEQ ID NO:85表示LCDR1，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0462] SEQ ID NO:86表示LCDR1，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0463] SEQ ID NO:87表示LCDR1，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0464] SEQ ID NO:88表示LCDR1，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0465] SEQ ID NO:89表示LCDR1，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0466] SEQ ID NO:90表示LCDR3，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0467] SEQ ID NO:91表示LCDR3，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0468] SEQ ID NO:92表示LCDR3，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0469] SEQ ID NO:93表示LCDR3，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0470] SEQ ID NO:94表示LCDR3，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0471] SEQ ID NO:95表示LCDR3，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0472] SEQ ID NO:96表示LCDR3，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0473] SEQ ID NO:97表示LCDR3，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0474] SEQ ID NO:98表示LCDR3，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0475] SEQ ID NO:99表示LCDR3，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0476] SEQ ID NO:100表示LCDR3，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0477] SEQ ID NO:101表示LCDR3，成熟的006-H08变体，氨基酸序列
[0478] SEQ ID NO:143表示VH，006-H08-12-2，氨基酸序列
[0479] SEQ ID NO:144表示VH，006-H08-13-2，氨基酸序列
[0480] SEQ ID NO:145表示VH，006-H08-13-6-1，氨基酸序列
[0481] SEQ ID NO:146表示VH，006-H08-14-6-0，氨基酸序列
[0482] SEQ ID NO:147表示VH，006-H08-15-5，氨基酸序列
[0483] SEQ ID NO:148表示VH，006-H08-19-1，氨基酸序列
[0484] SEQ ID NO:149表示VH，006-H08-29-1，氨基酸序列
[0485] SEQ ID NO:150表示VH，006-H08-32-2，氨基酸序列
[0486] SEQ ID NO:151表示VH，006-H08-33-0，氨基酸序列
[0487] SEQ ID NO:152表示VH，006-H08-33-16-0，氨基酸序列
[0488] SEQ ID NO:153表示VH，006-H08-35-17-1，氨基酸序列
[0489] SEQ ID NO:154表示VH，006-H08-35-17-4，氨基酸序列
[0490] SEQ ID NO:155表示VH，006-H08-35-1，氨基酸序列
[0491] SEQ ID NO:156表示VH，006-H08-36-17-0，氨基酸序列
[0492] SEQ ID NO:157表示VH，006-H08-37-19-0，氨基酸序列
[0493] SEQ ID NO:158表示VH，006-H08-39-7，氨基酸序列
[0494] SEQ ID NO:159表示VH，006-H08-48-5，氨基酸序列
[0495] SEQ ID NO:160表示VH，006-H08-53-27-0，氨基酸序列
[0496] SEQ ID NO:161表示VH，006-H08-59-30-0，氨基酸序列
[0497] SEQ ID NO:162表示VH，006-H08-63-32-4，氨基酸序列
[0498] SEQ ID NO:163表示VH，006-H08-65-33-2，氨基酸序列
[0499] SEQ ID NO:164表示VH，006-H08-68-35-2，氨基酸序列
[0500] SEQ ID NO:165表示VL，006-H08-12-2，氨基酸序列
[0501] SEQ ID NO:166表示VL，006-H08-13-2，氨基酸序列
[0502] SEQ ID NO:167表示VL，006-H08-13-6-1，氨基酸序列
[0503] SEQ ID NO:168表示VL，006-H08-14-6-0，氨基酸序列
[0504] SEQ ID NO:169表示VL，006-H08-15-5，氨基酸序列
[0505] SEQ ID NO:170表示VL，006-H08-19-1，氨基酸序列
[0506] SEQ ID NO:171表示VL，006-H08-29-1，氨基酸序列
[0507] SEQ ID NO:172表示VL，006-H08-32-2，氨基酸序列
[0508] SEQ ID NO:173表示VL，006-H08-33-0，氨基酸序列
[0509] SEQ ID NO:174表示VL，006-H08-33-16-0，氨基酸序列
[0510] SEQ ID NO:175表示VL，006-H08-35-17-1，氨基酸序列
[0511] SEQ ID NO:176表示VL，006-H08-35-17-4，氨基酸序列
[0512] SEQ ID NO:177表示VL，006-H08-35-1，氨基酸序列
[0513] SEQ ID NO:178表示VL，006-H08-36-17-0，氨基酸序列
[0514] SEQ ID NO:179表示VL，006-H08-37-19-0，氨基酸序列
[0515] SEQ ID NO:180表示VL，006-H08-39-7，氨基酸序列
[0516] SEQ ID NO:181表示VL，006-H08-48-5，氨基酸序列
[0517] SEQ ID NO:182表示VL，006-H08-53-27-0，氨基酸序列
[0518] SEQ ID NO:183表示VL，006-H08-59-30-0，氨基酸序列
[0519] SEQ ID NO:184表示VL，006-H08-63-32-4，氨基酸序列
[0520] SEQ ID NO:185表示VL，006-H08-65-33-2，氨基酸序列
[0521] SEQ ID NO:186表示VL，006-H08-68-35-2，氨基酸序列
[0522] SEQ ID NO:331表示VH，006-H08-12-2，核酸序列
[0523] SEQ ID NO:332表示VH，006-H08-13-2，核酸序列
[0524] SEQ ID NO:333表示VH，006-H08-13-6-1，核酸序列
[0525] SEQ ID NO:334表示VH，006-H08-14-6-0，核酸序列
[0526] SEQ ID NO:335表示VH，006-H08-15-5，核酸序列
[0527] SEQ ID NO:336表示VH，006-H08-19-1，核酸序列
[0528] SEQ ID NO:337表示VH，006-H08-29-1，核酸序列
[0529] SEQ ID NO:338表示VH，006-H08-32-2，核酸序列
[0530] SEQ ID NO:339表示VH，006-H08-33-0，核酸序列
[0531] SEQ ID NO:340表示VH，006-H08-33-16-0，核酸序列
[0532] SEQ ID NO:341表示VH，006-H08-35-17-1，核酸序列
[0533] SEQ ID NO:342表示VH，006-H08-35-17-4，核酸序列
[0534] SEQ ID NO:343表示VH，006-H08-35-1，核酸序列
[0535] SEQ ID NO:344表示VH，006-H08-36-17-0，核酸序列
[0536] SEQ ID NO:345表示VH，006-H08-37-19-0，核酸序列
[0537] SEQ ID NO:346表示VH，006-H08-39-7，核酸序列
[0538] SEQ ID NO:347表示VH，006-H08-48-5，核酸序列
[0539] SEQ ID NO:348表示VH，006-H08-53-27-0，核酸序列
[0540] SEQ ID NO:349表示VH，006-H08-59-30-0，核酸序列
[0541] SEQ ID NO:350表示VH，006-H08-63-32-4，核酸序列
[0542] SEQ ID NO:351表示VH，006-H08-65-33-2，核酸序列
[0543] SEQ ID NO:352表示VH，006-H08-68-35-2，核酸序列
[0544] SEQ ID NO:353表示VL，006-H08-12-2，核酸序列
[0545] SEQ ID NO:354表示VL，006-H08-13-2，核酸序列
[0546] SEQ ID NO:355表示VL，006-H08-13-6-1，核酸序列
[0547] SEQ ID NO:356表示VL，006-H08-14-6-0，核酸序列
[0548] SEQ ID NO:357表示VL，006-H08-15-5，核酸序列
[0549] SEQ ID NO:358表示VL，006-H08-19-1，核酸序列
[0550] SEQ ID NO:359表示VL，006-H08-29-1，核酸序列
[0551] SEQ ID NO:360表示VL，006-H08-32-2，核酸序列
[0552] SEQ ID NO:361表示VL，006-H08-33-0，核酸序列
[0553] SEQ ID NO:362表示VL，006-H08-33-16-0，核酸序列
[0554] SEQ ID NO:363表示VL，006-H08-35-17-1，核酸序列
[0555] SEQ ID NO:364表示VL，006-H08-35-17-4，核酸序列
[0556] SEQ ID NO:365表示VL，006-H08-35-1，核酸序列
[0557] SEQ ID NO:366表示VL，006-H08-36-17-0，核酸序列
[0558] SEQ ID NO:367表示VL，006-H08-37-19-0，核酸序列
[0559] SEQ ID NO:368表示VL，006-H08-39-7，核酸序列
[0560] SEQ ID NO:369表示VL，006-H08-48-5，核酸序列
[0561] SEQ ID NO:370表示VL，006-H08-53-27-0，核酸序列
[0562] SEQ ID NO:371表示VL，006-H08-59-30-0，核酸序列
[0563] SEQ ID NO:372表示VL，006-H08-63-32-4，核酸序列
[0564] SEQ ID NO:373表示VL，006-H08-65-33-2，核酸序列
[0565] SEQ ID NO:374表示VL，006-H08-68-35-2，核酸序列实施例
[0566] 实施例1 从人抗体噬菌体展示文库分离靶标特异性抗体
[0567] 为了分离能够中和人PRLR的活性的一组抗体，平行研究表达Fab和scFv片段的三个人抗体噬菌体展示文库。用于文库淘选的靶标为催乳素受体的可溶性胞外域(ECD)，其代表人催乳素受体氨基酸25-234，如上文WO08/022295(Novartis)所述制备。可选靶标为PRLR的ECD，其C端连接至6个组氨酸或者通过具有氨基酸序列“异亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸”的接头连接至人IgG1-Fc结构域。
[0568] 从噬菌体展示选择靶标特异性抗体根据Marks等人 (Methods MoIBiol.248:161-76,2004)所述的方法进行。简单地说，将噬菌体展示文库与50pmol生物素化的ECD在室温下温育1hr，然后利用100μl链霉亲和素珠悬浮液( M-280
链霉亲和素，Invitrogen)捕获形成的复合物。通过用洗涤缓冲液(PBS+5%乳)洗涤该珠来去除非特异性噬菌体。用0.5ml的100nM三乙胺(TEA)洗脱结合的噬菌体，并且立即通过加入等体积的IMTRIS-Cl pH 7.4进行中和。洗脱的噬菌体池(pool)用来感染在对数期生长的TG1大肠杆菌细胞，并且如(Methods MoI Biol.248:161-76,2004)所述拯救(rescue)噬粒。选择重复总计3轮。在ELISA测定中对获得自用洗脱的噬菌体(来自第三轮淘选)感染的TG1细胞的单菌落筛选结合活性。简单地说，将获得自用洗脱的噬菌体感染的TG1细胞的单菌落用来接种96-孔板中的培养基。
链霉亲和素，Invitrogen)捕获形成的复合物。通过用洗涤缓冲液(PBS+5%乳)洗涤该珠来去除非特异性噬菌体。用0.5ml的100nM三乙胺(TEA)洗脱结合的噬菌体，并且立即通过加入等体积的IMTRIS-Cl pH 7.4进行中和。洗脱的噬菌体池(pool)用来感染在对数期生长的TG1大肠杆菌细胞，并且如(Methods MoI Biol.248:161-76,2004)所述拯救(rescue)噬粒。选择重复总计3轮。在ELISA测定中对获得自用洗脱的噬菌体(来自第三轮淘选)感染的TG1细胞的单菌落筛选结合活性。简单地说，将获得自用洗脱的噬菌体感染的TG1细胞的单菌落用来接种96-孔板中的培养基。
[0569] 使微量培养物生长至OD60O=0.6，在这个点通过加入1mM IPTG然后在30°C下于振荡培养箱中培养过夜来诱导可溶性抗体片段的表达。将细菌离心下来，制备周质提取物并用来按照微孔板制造商提供的标准ELISA方案检测对固定在96-孔微孔板(96-孔平底免疫吸附板，Nunc)上的ECD的抗体结合活性。
[0570] 抗催乳素受体(PRLR)抗体结合至重组胞外域(ECD)的亲和力利用 2000来估算，并且用于抗体的亲和力排名。
[0571] 实施例2 通过实时TaqMan PCR分析来定量分析来自患者和健康对照的正位和异位子宫内膜以及子宫内膜异位症病变中的催乳素和催乳素受体基因表达
[0572] 利用ABI Prism 7700序列检测器系统，根据制造商的说明书(PE Applied Biosystems)，并如Endocrinolgy 2008,149(8):3952-3959)所述和本领域技术人员已知的进行实时Taqman PCR分析。将PRL和PRLR的相对表达水平归一化至亲环蛋白(cyclophyllin)的表达。我们利用定量实时Taqman PCR分析来分析来自健康妇女的子宫内膜以及来自患者的子宫内膜和子宫内膜异位症病变中PRL和PRLR的表达。催乳素及其受体的表达在子宫内膜异位症病变中与健康子宫内膜或来源于患者的子宫内膜相比明显上调。
[0573] 结果如图1和2所示。
[0574] 这些发现表明自分泌催乳素信号传导在子宫内膜异位症和子宫腺肌病(宫内子宫内膜异位症，限于子宫的子宫内膜异位症形式)的发展和维持中起作用。
[0575] 实施例3 通过RNA印迹分析人组织中的催乳素受体表达
[0576] 从不同大鼠组织分离RNA，并且在凝胶电泳后将其转移至尼龙膜。将该膜依次用放射性标记的大鼠催乳素受体或β-肌动蛋白(作为加样对照)的cDNA杂交、洗涤并暴露于胶片。条带对应大鼠催乳素受体和β-肌动蛋白的mRNA。图3所示的结果显示催乳素受体在胎盘、前列腺、卵巢和肾上腺中有强表达。
[0577] 实施例4 大鼠前列腺中催乳素受体蛋白表达的调节-阉割和激素处理的影响[0578] 将大鼠阉割或保持完整。将完整动物每天用媒介物(完整)、DHT(3mg/kg)或E2(0.4mg/kg)处理14天。之后从所有处理组的动物分离前列腺，并且制备蛋白提取物。将蛋白提取物通过凝胶电泳分离并转移至膜。利用可商购的抗体MA610(Santa Cruz Biotechnology)检测催乳素受体。结果如图4所示，并且显示大鼠前列腺中催乳素受体的激素调节。
[0579] 实施例5通过中和催乳素受体抗体和非特异性对照抗体抑制催乳素诱导的BaF3细胞(用人催乳素受体稳定转染)增殖
[0580] 为了分析中和PRLR抗体的体外效力，使用催乳素激活的BaF3细胞的细胞增殖的抑制。将细胞用人PRLR稳定转染，并且在包含2mM谷氨酰胺的RPMI中，在10%的FCS和10ng/ml的人催乳素的存在下常规培养。在不含催乳素的、包含1%的FCS的培养基中饥饿
6小时后，将细胞以10000个细胞/孔的密度接种入96-孔板。将细胞用20ng/ml催乳素刺激并与渐增剂量的中和PRLR抗体共培养2天。利用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega)分析细胞增殖。产生抑制催乳素刺激的细胞生长的剂量-反应曲线，并且计算IC50值。作为阴性对照，使用非特异性对照抗体刺激。
6小时后，将细胞以10000个细胞/孔的密度接种入96-孔板。将细胞用20ng/ml催乳素刺激并与渐增剂量的中和PRLR抗体共培养2天。利用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega)分析细胞增殖。产生抑制催乳素刺激的细胞生长的剂量-反应曲线，并且计算IC50值。作为阴性对照，使用非特异性对照抗体刺激。
[0581] 剂量-反应曲线和IC50值如图5所示。非特异性抗体不抑制稳定表达人PRLR的BaF细胞的增殖，而特异性抗体阻断细胞增殖并表现出不同效力。中和抗体006-H08在这个读数范式中表现出最高效力。
[0582] 实施例6 通过特异性和非特异性抗体抑制催乳素诱导的大鼠淋巴瘤细胞增殖[0583] 还利用催乳素依赖性大鼠淋巴瘤细胞(Nb2-11细胞)增殖的抑制来测试中和PRLR抗体的体外效力。使Nb2-11细胞在包含10%的FCS和10%的马血清的RPMI中常规生长。开始细胞生长测定之前，使细胞在包含1%的FCS代替10%的FCS的相同培养基中生长24小时。之后，将细胞以10000个细胞/孔的密度接种在96-孔板中的不含FCS的培养基中。
在渐增剂量的中和PRLR抗体或对照抗体的存在或不存在下，将细胞用10ng/ml人催乳素刺激2天。之后利用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega)评价细胞增殖。剂量-反应曲线和IC50值如图6所示。非特异性抗体和不结合大鼠PRLR的抗体XHA06.983不阻断Nb2-11细胞增殖。结合大鼠PRLR的XHA06.642阻断Nb2-11细胞增殖。
在渐增剂量的中和PRLR抗体或对照抗体的存在或不存在下，将细胞用10ng/ml人催乳素刺激2天。之后利用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega)评价细胞增殖。剂量-反应曲线和IC50值如图6所示。非特异性抗体和不结合大鼠PRLR的抗体XHA06.983不阻断Nb2-11细胞增殖。结合大鼠PRLR的XHA06.642阻断Nb2-11细胞增殖。
[0584] 实施例7 通过中和催乳素受体抗体抑制T47D细胞中催乳素诱导的STAT5磷酸化[0585] 为了分析中和PRLR抗体在额外的读数中的体外效力，使用催乳素处-理的人T47D细胞中STAT5磷酸化的抑制。使T47D细胞在包含10%的FCS和2mM的谷氨酰胺的RPMI中5
生长。将细胞以0.5x 10个细胞/孔的密度接种在24-孔板上。第二天，将细胞在不含血清的RPMI中饥饿1h。之后在20ng/ml人催乳素不存在或存在的情况下，将细胞温育30min，有或无不同剂量的中和PRLR抗体或非特异性对照抗体。之后将细胞漂洗并在70μl裂解缓冲液中裂解。将裂解物离心，并且将上清冷冻在-80°C。利用蛋白印迹(来自upstate
07-586的抗pSTAT5A/B抗体，1:1000稀释)分析提取物。作为加样对照，将剥离的印迹与抗β微管蛋白抗体(ab7287，1:500稀释)温育。
生长。将细胞以0.5x 10个细胞/孔的密度接种在24-孔板上。第二天，将细胞在不含血清的RPMI中饥饿1h。之后在20ng/ml人催乳素不存在或存在的情况下，将细胞温育30min，有或无不同剂量的中和PRLR抗体或非特异性对照抗体。之后将细胞漂洗并在70μl裂解缓冲液中裂解。将裂解物离心，并且将上清冷冻在-80°C。利用蛋白印迹(来自upstate
07-586的抗pSTAT5A/B抗体，1:1000稀释)分析提取物。作为加样对照，将剥离的印迹与抗β微管蛋白抗体(ab7287，1:500稀释)温育。
[0586] 结果如图7所示。除了非特异性FITC抗体，所有中和PRLR抗体均剂量依赖性阻断人T47D细胞中的STAT5磷酸化。所有测试的抗体均以高亲和力结合至人PRLR。
[0587] 实施例8 用人PRLR稳定转染的Hek293细胞中萤光素酶报道基因活性的抑制-中和催乳素受体抗体和非特异性对照抗体的分析
[0588] 为了进一步分析中和PRLR抗体的体外效力，使用报道基因测定。将用人PRLR稳定转染的HEK293HEK293细胞用LHRE (催乳激素应答元件)控制下的萤光素酶报道基因瞬时转染7小时。之后，将细胞以20000个细胞/孔的密度接种在96-孔板上(0.5%活性炭处理的血清，DMEM)。第二天，加入有或无渐增剂量的中和PRLR抗体或对照抗体的300ng/ml人催乳素。24小时后，测定萤光素酶活性。结果如图8所示。与非特异性抗体相比，006-H08和HE06.642抑制用人PRLR稳定转染的HEK293细胞中的萤光素酶活性。
[0589] 实施例9用小鼠PRLR稳定转染的Hek293细胞中萤光素酶报道基因活性的抑制-中和催乳素受体抗体和非特异性对照抗体的分析
[0590] 为了进一步分析中和PRLR抗体对小鼠催乳素受体的体外效力，使用报道基因测定。将用小鼠PRLR稳定转染的HEK293细胞用LHRE (催乳激素应答元件)控制下的萤光素酶报道基因瞬时转染7小时。之后，将细胞以20000个细胞/孔的密度接种在96-孔板上(0.5%活性炭处理的血清，DMEM)。第二天，加入有或无渐增剂量的中和PRLR抗体或对照抗体的200ng/ml人催乳素。24小时后，测定萤光素酶活性。结果如图9所示。虽然抗体005-C04(实心三角形)表现出高活性(IC50值=3nM)，但是抗体HE06.642(实心圆)高达330nM仍未表现出活性。非特异性对照抗体(空心圆)完全无活性。与Novartis抗体HE06.642相比，抗体005-C04能够阻断小鼠PRLR介导的信号传导。
[0591] 实施例10 通过中和催乳素受体抗体和非特异性对照抗体抑制催乳素诱导的BaF3细胞(用小鼠催乳素受体稳定转染)增殖
[0592] 为了分析中和PRLR抗体的体外效力，使用催乳素激活的Ba/F3细胞的细胞增殖的抑制。将细胞用小鼠PRLR稳定转染，并且在包含2mM谷氨酰胺的RPMI中，在10%的FCS和10ng/ml的人催乳素的存在下常规培养。在不含催乳素的、包含1%的FCS的培养基中饥饿
6小时后，将细胞以10000个细胞/孔的密度接种入96-孔板。将细胞用40ng/ml催乳素刺激并与渐增剂量的中和PRLR抗体共培养2天。利用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega)分析细胞增殖。产生抑制催乳素刺激的细胞生长的剂量-反应曲线，并且计算IC50值。作为阴性对照，使用非特异性对照抗体刺激。
6小时后，将细胞以10000个细胞/孔的密度接种入96-孔板。将细胞用40ng/ml催乳素刺激并与渐增剂量的中和PRLR抗体共培养2天。利用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega)分析细胞增殖。产生抑制催乳素刺激的细胞生长的剂量-反应曲线，并且计算IC50值。作为阴性对照，使用非特异性对照抗体刺激。
[0593] 剂量-反应曲线和IC50值如图10所示。非特异性对照抗体(实心正方形)对小鼠PRLR无活性。抗体HE06.642、001-E06和001-D07仅有限地抑制小鼠PRLR激活。仅抗体005-C04完全阻断小鼠PRLR激活。
[0594] 实施例11中和催乳素受体抗体IgG1005-C04在小鼠中的避孕效果
[0595] 为了测试中和催乳素受体抗体对小鼠的能育性的影响，使12周龄的雌性和雄性NMRI小鼠交配7天(第0天-第7天)。在第-3、0、3和6天将雌性小鼠用腹腔内注射的磷酸缓冲盐水、非特异性IgG1对照抗体(抗FITC，10mg/kg)或者溶于磷酸缓冲盐水的浓度为10或30mg/kg体重的中和IgG1抗体005-C04(=IgG1005-C04)处理。每个实验组使用10只雌性。每只雄性与两只雌性交配，一只雌性来自用磷酸缓冲盐水或非特异性抗体处理的阴性对照组，另一只雌性用特异性中和抗体处理。将其中雄性不使得至少一只雌性妊娠的交配从数据评价排除。读数参数为平均胎仔数和妊娠率(以%衡量)，妊娠率计算为每实验组的产仔数除以这组内理论上可能的产仔数。结果如图11所示。
[0596] 图11A示出获得的妊娠率。妊娠率如下：
[0598] ●在用非特异性对照抗体(10mg/kg)处理的小鼠组中为75%，
[0599] ●在用中和PRLR抗体IgG1005-C04(10mg/kg)处理的小鼠组中为100%，以及[0600] ●在用中和PRLR抗体IgG1005-C04(30mg/kg)处理的小鼠组中为0%。
[0601] 图11B示出观察到的不同实验组的胎仔数。胎仔数如下：
[0602] ●在用磷酸缓冲盐水处理的小鼠组中每胎10.9只小鼠，
[0603] ●在用非特异性对照抗体(10mg/kg)处理的小鼠组中每胎12.3只小鼠，
[0604] ●在用中和PRLR抗体IgG1005-C04(10mg/kg)处理的小鼠组中每胎13只小鼠，以及
[0605] ●在用中和PRLR抗体IgG1005-C04(30mg/kg)处理的小鼠组中每胎0只小鼠。
[0606] 来自这个交配研究的结果证实中和催乳素受体抗体IgG1-005-C04在以30mg/kg体重测试时完全防止小鼠的妊娠。
[0607] 实施例12 表位分组
[0608] 利用Biacore通过监测抗PRLR抗体对同时结合至ECD-PRLR (SEQ IDNO:70)来进行表位分组实验。简单地说，将第一抗体通过伯胺偶联利用n-羟基琥珀酰胺(n-hydroxysuccinamide,NHC)和N-乙基-N’-二甲基氨基丙基碳二亚胺(EDC)共价固定至传感器芯片。然后用乙醇酰胺(ethanolamide)封闭表面上未被占据的结合位点。通过固定的抗体将可溶的ECD-PRLR (SEQID NO:70)捕获在表面上，因此对于所有结合的ECD-PRLR分子，捕获抗体的表位被封闭。使第二抗体立即通过表面以结合至固定的ECD-PRLR。识别相同或重叠表位的两个抗体不能结合至ECD-PRLR，而针对不同表位的抗体能够结合。将抗体表面用甘氨酸，pH 2.8再生以去除结合的蛋白，然后用其他抗体重复该过程。测试抗体的所有组合。代表性结果如表7所示。抗体006-H08、002-H06、002-H08、006-H07和XHA06983在ECD-PRLR上互相竞争结合，显示它们靶向重叠表位(表位组1，表6)。此外，上述抗体与PRL竞争结合，这也是001-E06的情况(表位组2，表6)。这个抗体靶向与上述抗体不同的ECD-PRLR位点。最后，抗体005-C04与HE06.642和XHA06.642竞争结合，但不与PRL竞争(表位组3，表6)。
[0609] 表7：靶向人催乳素受体(PRLR)的胞外域(ECD)上的重叠表位的抗体组
[0610]抗体 表位组 与催乳素竞争
006-H08 1 是
002-H06 1
是
002-H08 1 是
006-H07 1 是
001-E06 2 是
005-C04 3 否
HE06.642 3 否
XHA06.642 3 否
XHA06.983 1 是
006-H08 1 是
002-H06 1
是
002-H08 1 是
006-H07 1 是
001-E06 2 是
005-C04 3 否
HE06.642 3 否
XHA06.642 3 否
XHA06.983 1 是
[0611] 实施例13 抗体在细胞表面上表达的小鼠和人PRLR上的交叉反应性
[0612] 为了确定抗PRLR抗体在细胞上表达的小鼠和人PRLR上的结合特征，通过流式细胞术分别在稳定表达人和小鼠PRLR的HEK293细胞上测试结合。将所述细胞以及没有PRLR6
的亲代HEK293细胞系收获，离心并以约5x10个细胞/ml重悬于包含2%的FBS和0.1%的叠氮钠的1xPBS (FACS缓冲液)。将抗体005-C04、001-E06和HE06.642在FACS缓冲液中稀释至2倍终浓度，并且加入适当的样品孔(50μl/孔)。对于二抗和自发荧光对照，将
50μl的FACS缓冲液加入适当的孔。将50μl的细胞悬浮液加入每个样品孔。将样品在
4°C下温育1小时，用冷FACS缓冲液洗涤两次，并且重悬于包含1:100稀释的PE缀合的山羊抗人IgG的FACS缓冲液。在4°C下温育30min后，将细胞用冷FACS缓冲液洗涤两次，重悬于包含1mg/ml碘化丙啶(Invitrogen,San Diego,CA)的FACS缓冲液，并且通过流式细胞术分析。如图13所示，抗体005-C04和001-E06结合至这些细胞上的人和小鼠PRLR，而HE06.642仅结合至人PRLR。这个观察与实施例9中报道的HE06.642在小鼠PRLR依赖性萤光素酶报道基因测定中失效的发现一致。虽然005-C04与HE06.642竞争性结合至人PRLR，但是这两个抗体关于小鼠PRLR的不同结合特征表明它们的表位特异性不同。
的亲代HEK293细胞系收获，离心并以约5x10个细胞/ml重悬于包含2%的FBS和0.1%的叠氮钠的1xPBS (FACS缓冲液)。将抗体005-C04、001-E06和HE06.642在FACS缓冲液中稀释至2倍终浓度，并且加入适当的样品孔(50μl/孔)。对于二抗和自发荧光对照，将
50μl的FACS缓冲液加入适当的孔。将50μl的细胞悬浮液加入每个样品孔。将样品在
4°C下温育1小时，用冷FACS缓冲液洗涤两次，并且重悬于包含1:100稀释的PE缀合的山羊抗人IgG的FACS缓冲液。在4°C下温育30min后，将细胞用冷FACS缓冲液洗涤两次，重悬于包含1mg/ml碘化丙啶(Invitrogen,San Diego,CA)的FACS缓冲液，并且通过流式细胞术分析。如图13所示，抗体005-C04和001-E06结合至这些细胞上的人和小鼠PRLR，而HE06.642仅结合至人PRLR。这个观察与实施例9中报道的HE06.642在小鼠PRLR依赖性萤光素酶报道基因测定中失效的发现一致。虽然005-C04与HE06.642竞争性结合至人PRLR，但是这两个抗体关于小鼠PRLR的不同结合特征表明它们的表位特异性不同。
[0613] 实施例14Fab和scFv抗体对细胞信号传导级联的抑制活性
[0614] 为了功能性表征Fab和scFv筛选结果对PRLR引发的信号传导级联的活性，测量对用催乳素处理的人T47D细胞中的PRLR本身以及转录调节蛋白ERK1/2和STAT5的磷酸化的抑制。使T47D细胞在包含2mM的L-谷氨酰胺、10%的活性炭处理的FBS和胰岛素-转6
铁蛋白-硒-A (Gibco)的RPMI中生长。将细胞以1.5x 10个细胞/孔的密度接种在6
孔板或96-孔板上。第二天，更新生长培养基。在第三天，将细胞在不含血清的RPMI中饥饿1小时。之后在500ng/ml人催乳素的存在下，将细胞温育5min，有或无不同剂量的中和PRLR抗体或非特异性对照抗体。之后将细胞漂洗并在裂解缓冲液中裂解。将裂解物离心，并且将上清冷冻在-80°C。通过ELISA测试样品，对于测量PRLR磷酸化，根据DuoSet IC“人磷酸化催乳素R”试剂盒(R&D Systems)，对于测量STAT5磷酸化，根据PathScan磷酸化STAT5(Tyr694)夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology;#7113)，而对于测量ERK1/2磷酸化，根据磷酸化ERK1/ERK2试剂盒(R&D Systems)。表8提供关于Fab或scFv形式的筛选结果的选择在7.5μg/ml的固定剂量下的拮抗活性的综述。
铁蛋白-硒-A (Gibco)的RPMI中生长。将细胞以1.5x 10个细胞/孔的密度接种在6
孔板或96-孔板上。第二天，更新生长培养基。在第三天，将细胞在不含血清的RPMI中饥饿1小时。之后在500ng/ml人催乳素的存在下，将细胞温育5min，有或无不同剂量的中和PRLR抗体或非特异性对照抗体。之后将细胞漂洗并在裂解缓冲液中裂解。将裂解物离心，并且将上清冷冻在-80°C。通过ELISA测试样品，对于测量PRLR磷酸化，根据DuoSet IC“人磷酸化催乳素R”试剂盒(R&D Systems)，对于测量STAT5磷酸化，根据PathScan磷酸化STAT5(Tyr694)夹心ELISA试剂盒(Cell Signaling Technology;#7113)，而对于测量ERK1/2磷酸化，根据磷酸化ERK1/ERK2试剂盒(R&D Systems)。表8提供关于Fab或scFv形式的筛选结果的选择在7.5μg/ml的固定剂量下的拮抗活性的综述。
[0615] 表8：如通过ELISA对人乳腺癌细胞系T47D的细胞裂解物测定的，筛选结果的选择对PRLR、ERK1/2和STAT5的磷酸化的拮抗活性
[0616]
[0617] *scFv形式，°Fab形式
[0618] 实施例15中和PRLR抗体在小鼠中抑制泌乳
[0619] 使成年NMRI雌性与NMRI雄性交配。在产后第1天，将胎仔数调整至每只哺乳母亲8只小鼠。从产后第1天开始每天早上测定后代的重量。哺乳母亲保持未经处理(图14A,B中实心圆)，或者用非特异性抗体(10mg/kg体重；图14A,B中空心圆)、或包含小鼠IgG2a恒定结构域的中和PRLR抗体005-C04(=IgG2a 005-C04；10mg/kg，图14A,B中实心三角形)、或中和PRLR抗体IgG2a 005-C04(30mg/kg，图14A,B中空心三角形)腹腔内处理。组大小为每个实验组5-6只哺乳母亲。在产后第1、3、6、9、10和12天(在图14A,B中用箭头指示)将母亲用特异性或非特异性对照抗体处理。结果如图14所示。图14A示出产后每一天的每天窝幼仔增重，表示为第1天各窝幼仔重量的百分比。从产后第8天开始，来自用中和PRLR抗体处理的母亲的后代与来自保持未经处理或接受非特异性对照抗体的母亲的后代之间的窝幼仔增重有显著差异。由于伦理学原因，在产后第10天，在接受最高剂量的中和PRLR抗体的母亲的实验组中必须处死几只幼仔。在图14B中，结果以不同方式示出。示出每天的差异性窝幼仔增重，表示为产后第1天的窝幼仔重量的百分比。基本上图14B显示图14A所示的图的斜率。来自未处理的母亲或用非特异性抗体处理的母亲的幼仔的窝幼仔重量的差异性每日增加在产后第1天的起始窝幼仔重量的30%左右波动。在来自用30mg/kg体重的中和PRLR抗体处理的母亲的幼仔中从第7天开始每天窝幼仔重量增加有显著的严重减少(*p<0.05；***p<0.005对来自用非特异性抗体处理的母亲的幼仔)。
从出生后第11天开始，如果与来自用非特异性对照抗体处理的母亲的幼仔相比，在来自用
10mg/kg的中和PRLR抗体处理的母亲的幼仔中每天窝幼仔重量增加也显著减少(p<0.05对来自用非特异性抗体处理的母亲的幼仔)。结论是中和PRLR抗体IgG2a 005-C04对泌乳抑制有剂量依赖性效应。图14C示出来自不同实验组的哺乳母亲的乳腺的组织切片。未处理的母亲和用非特异性对照抗体处理的母亲的乳腺充满产乳管。相比之下，在用中和PRLR抗体IgG2a 005-C04处理的母亲中有乳腺退化的标志。图14C中的黑色箭头指向乳腺组织中的脂肪岛(参见特异性抗体IgG2a 005-C04对乳腺退化程度的剂量依赖性效应(图14C))。
此外，分析来自不同实验组的母亲的乳腺中主要乳蛋白β-酪蛋白(Csn-2)、乳清酸性蛋白(WAP)和IGF-1的表达(图14D)。将基因表达归一化至TATA-框结合蛋白(TBP)的表达。
中和PRLR抗体IgG2a 005-C04剂量依赖性降低乳蛋白表达，而非特异性抗体(10mg/kg)没有任何显著效果。
从出生后第11天开始，如果与来自用非特异性对照抗体处理的母亲的幼仔相比，在来自用
10mg/kg的中和PRLR抗体处理的母亲的幼仔中每天窝幼仔重量增加也显著减少(p<0.05对来自用非特异性抗体处理的母亲的幼仔)。结论是中和PRLR抗体IgG2a 005-C04对泌乳抑制有剂量依赖性效应。图14C示出来自不同实验组的哺乳母亲的乳腺的组织切片。未处理的母亲和用非特异性对照抗体处理的母亲的乳腺充满产乳管。相比之下，在用中和PRLR抗体IgG2a 005-C04处理的母亲中有乳腺退化的标志。图14C中的黑色箭头指向乳腺组织中的脂肪岛(参见特异性抗体IgG2a 005-C04对乳腺退化程度的剂量依赖性效应(图14C))。
此外，分析来自不同实验组的母亲的乳腺中主要乳蛋白β-酪蛋白(Csn-2)、乳清酸性蛋白(WAP)和IGF-1的表达(图14D)。将基因表达归一化至TATA-框结合蛋白(TBP)的表达。
中和PRLR抗体IgG2a 005-C04剂量依赖性降低乳蛋白表达，而非特异性抗体(10mg/kg)没有任何显著效果。
[0620] 中和PRLR抗体IgG2a 005-C04在哺乳小鼠中剂量依赖性阻断泌乳并导致乳腺退化，证实其可用于泌乳抑制。
[0621] 实施例16中和PRLR抗体适合治疗良性乳房疾病
[0622] 激活PRLR突变或者局部或全身性高催乳素血症可以引起良性乳房疾病。因此，采用高催乳素血症小鼠模型以诱导乳腺中增加的增殖(良性乳房疾病的最严重形式的标志)。在第0天，12周龄的雌性Balb/c小鼠在肾被膜下接受垂体同基因移植物或者保持未经手术。将垂体同基因移植小鼠保持未经处理，或者在第0、3、7、11和15天用非特异性抗体(10mg/kg)、IgG1形式的中和PRLR抗体005-C04(=IgG1005-C04;10mg/kg)或中和PRLR抗体IgG1005-C04(30mg/kg)腹腔内处理。实验组大小为8-10只动物。在垂体移植后第17天将小鼠处死。死亡前2小时，动物接受腹腔内注射的BrdU以监测上皮细胞增殖。将左腹股沟乳腺固定在卡诺伊溶液(Carnoy’s solution)中，制备乳腺全封片(whole mount)并用Carmine alaune染色(图15A)。将右腹股沟乳腺在4%磷酸盐缓冲福尔马林中固定过夜。随后将乳腺包埋在石蜡中，并且如以前所述进行BrdU免疫染色(Endocrinology149(8):3952-3959;2009)。此外，进行pSTAT5免疫染色(来自abcam的抗pSTAT5抗体，ab32364，1:60稀释)以监测对用中和PRLR抗体处理应答的PRLR介导的信号传导的抑制。
图15A示出来自不同实验组的乳腺全封片的放大。不接受垂体的成年小鼠的乳腺显示导管和尾芽，而在接受垂体同基因移植物的小鼠中有极度的侧向分支并形成肺泡样结构。用非特异性抗体(10mg/kg)处理不抑制侧向分支和肺泡样结构的形成。相比之下，用10mg/kg体重的中和抗体IgG1005-C04处理导致在接受垂体同基因移植物的10只动物中的8只中完全抑制侧向分支，而用30mg/kg的IgG1005-C04处理在接受垂体同基因移植物的9只动物中的9只中完全抑制侧向分支。组织学分析和BrdU免疫染色如图15B所示。垂体同基因移植导致上皮细胞增生，这不被非特异性抗体处理抑制，而在包含垂体同基因移植物并用
10或30mg/kg体重剂量的中和PRLR抗体处理的小鼠中没有上皮细胞增生。在图15B中白色箭头指示一些BrdU阳性细胞，其反映将要分裂的处于细胞周期的S-期的细胞。用中和抗体IgG1005-C04(30mg/kg体重)处理的小鼠显示几乎完全抑制乳腺中的上皮细胞增殖。
在图15C中白色箭头指示一些磷酸化STAT5阳性细胞。用30mg/kg的IgG1005-C04处理导致完全抑制STAT5磷酸化，表明完全阻断PRLR介导的信号传导。
图15A示出来自不同实验组的乳腺全封片的放大。不接受垂体的成年小鼠的乳腺显示导管和尾芽，而在接受垂体同基因移植物的小鼠中有极度的侧向分支并形成肺泡样结构。用非特异性抗体(10mg/kg)处理不抑制侧向分支和肺泡样结构的形成。相比之下，用10mg/kg体重的中和抗体IgG1005-C04处理导致在接受垂体同基因移植物的10只动物中的8只中完全抑制侧向分支，而用30mg/kg的IgG1005-C04处理在接受垂体同基因移植物的9只动物中的9只中完全抑制侧向分支。组织学分析和BrdU免疫染色如图15B所示。垂体同基因移植导致上皮细胞增生，这不被非特异性抗体处理抑制，而在包含垂体同基因移植物并用
10或30mg/kg体重剂量的中和PRLR抗体处理的小鼠中没有上皮细胞增生。在图15B中白色箭头指示一些BrdU阳性细胞，其反映将要分裂的处于细胞周期的S-期的细胞。用中和抗体IgG1005-C04(30mg/kg体重)处理的小鼠显示几乎完全抑制乳腺中的上皮细胞增殖。
在图15C中白色箭头指示一些磷酸化STAT5阳性细胞。用30mg/kg的IgG1005-C04处理导致完全抑制STAT5磷酸化，表明完全阻断PRLR介导的信号传导。
[0623] 图15A、B和C的结果证实中和PRLR抗体适合治疗乳腺的良性增殖性疾病乳腺病。中和PRLR抗体抑制乳腺上皮细胞增殖和磷酸化STAT5的激活。
[0624] 实施例17用中和PRLR抗体治疗良性前列腺增生
[0625] 通过在8周龄于肾被膜下移植两个垂体来在雄性Balb/c小鼠中建立良性前列腺增生。对照组保持未经手术。接受垂体同基因移植物的小鼠保持未经处理，或者接受腹腔内注射的非特异性抗体(10mg/kg)、或10和30mg/kg体重剂量的包含小鼠IgG2a恒定结构域的中和PRLR抗体005-C04(=IgG2a 005-C04)。垂体移植的那天(=第0天)开始，并且在垂体移植后的第3天、第7天、第11天、第15天、第18天、第22天和第25天进行抗体注射。在第28天将小鼠处死。测定前列腺腹叶的相对重量。结果如图16所示。垂体同基因移植导致相对前列腺重量增加。用10mg/kg和30mg/kg中和PRLR抗体IgG2a 005-C04处理减少前列腺重量，而用非特异性对照抗体处理没有任何效果。因此中和PRLR抗体适合治疗良性前列腺增生。
[0626] 在垂体同基因移植后第18天，明显的是在接受垂体同基因移植物的动物中毛发生长减少。中和PRLR抗体在高催乳素血症条件下刺激毛发生长。代表性图片如图17所示。因此中和PRLR可以用于治疗高催乳素血症性脱发。
[0627] 实施例18 中和PRLR抗体对毛发生长的影响
[0628] 如以前所述利用电动剃须刀将8周龄雄性和雌性C57BL/6小鼠的背毛去除(British Journal of Dermatology 2008;159:300-305)。在一些组中通过在肾被膜下垂体同基因移植来诱导高催乳素血症，剩余组中的动物为正常催乳素血症。将动物用特异性PRLR抗体(IgG2a 005-C04)或非特异性对照抗体(30mg/kg，腹腔内)每周处理一次(从第
0天开始，第0天为垂体同基因移植那天)。随后的抗体注射在第7和14天进行。3周后，再生长的毛发可见，为粉白色剃毛皮肤上的深色，并且测量变为深色的剃毛区域的百分比。
剃毛后15天将雌性小鼠处死，并且在剃毛后18天将雄性小鼠处死。
0天开始，第0天为垂体同基因移植那天)。随后的抗体注射在第7和14天进行。3周后，再生长的毛发可见，为粉白色剃毛皮肤上的深色，并且测量变为深色的剃毛区域的百分比。
剃毛后15天将雌性小鼠处死，并且在剃毛后18天将雄性小鼠处死。
[0629] 使用以下实验组(组大小为6只小鼠)：
[0630] 1.剃毛雌性
[0631] 2.具有垂体同基因移植物的剃毛雌性
[0632] 3.具有垂体同基因移植物的剃毛雌性+每周一次30mg/kg非特异性抗体IgG2a005-C04
[0633] 4.具有垂体同基因移植物的剃毛雌性+每周一次30mg/kg特异性抗体
[0634] 5.剃毛雌性+每周一次30mg/kg非特异性抗体
[0635] 6.剃毛雌性+每周一次30mg/kg特异性抗体
[0636] 7.剃毛雄性
[0637] 8.具有垂体同基因移植物的剃毛雄性
[0638] 9.具有垂体同基因移植物的剃毛雄性+每周一次30mg/kg非特异性抗体
[0639] 10.具有垂体同基因移植物的剃毛雄性+每周一次30mg/kg特异性抗体IgG2a005-C04
[0640] 11.剃毛雄性+每周一次30mg/kg非特异性抗体
[0641] 12.剃毛雄性+每周一次30mg/kg特异性抗体
[0642] 来自不同组的动物的代表性图片如图18所示，毛发再生长的区域的百分比如图18所示。
[0643] 中和PRLR抗体而不是非特异性抗体在高催乳素血症和正常催乳素血症条件下，在雄性和雌性小鼠中刺激毛发再生长。因此中和PRLR抗体适合在高催乳素血症和正常催乳素血症条件下治疗女性和男性的脱发。实施例19通过中和PRLR抗体抑制增加的乳腺上皮细胞增殖
[0644] 为了测试中和PRLR抗体对联合激素疗法(即雌激素加上黄体酮疗法)激活的增加的乳腺上皮细胞增殖的影响，采用以前描述的小鼠模型，其允许定量子宫和乳腺中的增殖效应(Endocrinology 149:3952-3959,2008)。将6周龄C57BL/6雌性小鼠卵巢切除。卵巢切除后2周，将动物用每天注射的媒介物(乙醇/花生油10%/90%)或100ng雌二醇加上100mg/kg孕酮皮下处理2周。将动物用腹腔内注射的小鼠IgG2a形式的中和PRLR抗体(10mg/kg和30mg/kg)或非特异性抗体(30mg/kg)每周处理一次，共3周。在卵巢切除后第36天进行解剖。死亡前2小时动物接受腹腔内注射的溶于磷酸缓冲盐水的溴脱氧尿苷(BrdU)(70mg/kg体重)。近端2/3的右腹股沟乳腺用于分析以前描述的乳腺上皮细胞增殖(BrdU免疫染色)(Endocrinology149:3952-3959,2008)。
[0645] 实验包括以下组：
[0646] 1.用媒介物处理的卵巢切除的动物
[0647] 2.用100ng雌二醇处理的卵巢切除的动物
[0648] 3.用100ng雌二醇(E)和100mg/kg孕酮(P)处理的卵巢切除的动物
[0649] 4.用E+P和10mg/kg特异性抗体005-C04处理的卵巢切除的动物
[0650] 5.用E+P和30mg/kg特异性抗体005-C04处理的卵巢切除的动物
[0651] 6.用E2+P和30mg/kg非特异性对照抗体处理的卵巢切除的动物
[0652] 结果如图19所示。评估4个乳腺横切片内增殖性导管上皮细胞的绝对数量。中值如单杠所示。在卵巢切除的媒介物处理的小鼠中上皮细胞增殖相当低。雌二醇处理导致上皮细胞增殖的一些刺激，在雌激素加上孕酮处理下观察到最大乳腺上皮细胞增殖(图19)。用中和催乳素受体抗体005-C04而不是非特异性对照抗体处理导致乳腺上皮细胞增殖剂量依赖性降低，几乎降回仅雌二醇的水平。
[0653] 因此中和PRLR抗体适合在联合激素疗法(即雌二醇加上孕酮疗法)下治疗增加的乳腺上皮细胞增殖。
[0654] 实施例20 在SHN小鼠中用中和PRLR抗体治疗子宫腺肌病(= 宫内子宫内膜异位症)
[0655] 为了测试中和PRLR抗体在子宫内膜异位症中的效力，采用依赖于全身性高催乳素血症的SHN小鼠中的子宫腺肌病模型(Acta anat.116:46-54,1983)。通过7周龄雌性小鼠的肾被膜下垂体同基因移植来诱导SHN小鼠中的高催乳素血症(Acta anat.116:46-54,1983)。垂体同基因移植后一周开始腹腔内给予中和PRLR抗体(10mg/kg或30mg/kg)或非特异性抗体(30mg/kg)。如以前所述评价腺组织浸润子宫肌层
(Laboratory Animal Science 1998,48:64-68)。通过腹腔内注射进行抗体处理9周，每周一次和两次。在解剖时(垂体移植后第70天)，将子宫在缓冲的4%福尔马林中固定过夜并包埋在石蜡中。子宫腺肌病(= 宫内子宫内膜异位症)的程度评价如下：
(Laboratory Animal Science 1998,48:64-68)。通过腹腔内注射进行抗体处理9周，每周一次和两次。在解剖时(垂体移植后第70天)，将子宫在缓冲的4%福尔马林中固定过夜并包埋在石蜡中。子宫腺肌病(= 宫内子宫内膜异位症)的程度评价如下：
[0656] 0级= 无子宫腺肌病
[0657] 0.5级= 子宫肌层的内层松动其同心方向
[0658] 1级= 子宫内膜腺体侵入子宫肌层的内层
[0659] 2级= 子宫内膜腺体在子宫肌层的内层和外层之间
[0660] 3级= 子宫内膜腺体侵入子宫肌层的外层
[0661] 4级= 子宫内膜腺体在子宫肌层的外层外
[0662] 实验包括以下实验组：
[0663] 1.没有垂体移植的动物，即正常催乳素血症小鼠
[0664] 2.具有垂体移植的动物，即高催乳素血症小鼠
[0665] 3.具有垂体移植的动物，用30mg/kg剂量的非特异性对照抗体每周处理一次[0666] 4.具有垂体移植的动物，用30mg/kg剂量的非特异性对照抗体每周处理两次[0667] 5.具有垂体移植的动物，用10mg/kg剂量的小鼠IgG2a形式的中和催乳素受体抗体005-C04每周处理一次
[0668] 6.具有垂体移植的动物，用10mg/kg剂量的小鼠IgG2a形式的中和催乳素受体抗体005-C04每周处理两次
[0669] 7.具有垂体移植的动物，用30mg/kg剂量的小鼠IgG2a形式的中和催乳素受体抗体005-C04每周处理一次
[0670] 8.具有垂体移植的动物，用30mg/kg剂量的小鼠IgG2a形式的中和催乳素受体抗体005-C04每周处理两次
[0671] 结果如图20所示。每个处理组中的每只动物的评分单独给出，并且每个处理组的中值如单杠所示。正常催乳素血症小鼠发展宫内子宫内膜异位症至一定程度(疾病评分中值=0.25)。由于垂体同基因移植的高催乳素血症增加疾病评分，并且更多动物患有疾病(疾病评分中值=2.5)。虽然用30mg/kg非特异性抗体每周处理一次或两次对疾病没有影响，但是用特异性中和抗体处理表现出疾病评分的剂量依赖性降低。值得注意的是，每周两次接受10或30mg/kg的特异性抗体的所有动物均完全治愈，并且它们的疾病评分显著低于正常催乳素血症小鼠的疾病评分(图20)。因此中和PRLR抗体适合治疗妇女的宫内子宫内膜异位症(= 子宫腺肌病)和宫外子宫内膜异位症。
[0672] 实施例21
[0673] 抗体变体的成熟：
[0674] 抗体亲和力成熟为两步法，其中将饱和诱变与基于孔的高通量筛选组合以鉴定导致亲和力提高的少量突变。在亲和力成熟的第一轮中，根据BMC Biotechnology7:65,2007，利用NNK-三核苷酸盒(其中N表示腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸各25%的混合物，而K表示胸腺嘧啶和鸟嘌呤核苷酸各50%的混合物)通过位点定向诱变来引入野生型抗体的定位多样化。这样，在单独的氨基酸位置引入所有20个氨基酸。这种定位随机化仅限于6个互补性决定区域(CDR)。在亲和力成熟的第二轮中，将有益取代重组并筛选进一步的改进。
[0675] 通过均相时间分辨荧光测定(HTRF)筛选成熟的006-H08Fab变体：
[0676] 将归一化的大肠杆菌来源的上清和8nM生物素化的PRLR的胞外域与1nM链霉亲和素-铕一起在96孔-微量滴定板中温育30min。之后加入200mM的KF和50nM的Alexa Fluor 647标记的006-H08的IgG1。将该混合物在室温下分别温育5、20、35、50和65分钟。在所示的时间点，利用EnVision MultilabelReader(Perkin Elmer)测量在665nm(和620nm)的吸收。获得的结果如图21所示。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种治疗良性前列腺增生的壮药组合物及其制备方法 | 2020-05-20 | 779 |
| 瘀浊内阻型良性前列腺增生用的中药 | 2020-05-11 | 390 |
| 用SARMS治疗良性前列腺增生 | 2020-05-12 | 742 |
| 治疗良性前列腺增生和其他良性前列腺疾病的方法 | 2020-05-14 | 211 |
| 良性前列腺增生(BPH)的人蛋白标记 | 2020-05-14 | 323 |
| 一种治疗良性前列腺增生的药物及其制备方法 | 2020-05-19 | 63 |
| 治疗心血管病和良性前列腺增生的药物组合物 | 2020-05-18 | 455 |
| 治疗良性前列腺增生（BPH）的涂敷剂及其用途 | 2020-05-16 | 901 |
| 一种治疗良性前列腺增生的中药复方 | 2020-05-14 | 729 |
| NK－1受体拮抗剂对抗良性前列腺增生的用途 | 2020-05-18 | 896 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈