包含半胱氨酸工程化抗体的轭合化合物
阅读：458发布：2020-12-31
专利汇可以提供包含半胱氨酸工程化抗体的轭合化合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本披露提供了包含用一个或多个 反应性 半胱 氨 酸残基工程化的 抗体 及其 片段 的轭合化合物，并且更具体地说提供具有 治疗 或诊断应用的轭合化合物。这些轭合化合物包含例如与 化学治疗 药、毒素、以及诸如 放射性 核素或 荧光 团的检测标记轭合的半胱氨酸工程化抗体或其片段。本披露还提供使用披露的轭合化合物用于体外、原位、离体以及体内诊断或治疗 哺乳动物 细胞或相关病理病症的方法。，下面是包含半胱氨酸工程化抗体的轭合化合物专利的具体信息内容。
1.一种轭合化合物，包含半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白和至少一个异源部分，其
中：
(i)该抗体或Fc融合蛋白的Fc结构域包含至少一种选自以下各项的工程化半胱氨酸氨
基酸：在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、
293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、411、
417、433、435或439处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入、以及其组合，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引；并且
(ii)其中至少一个异源部分轭合至这些工程化半胱氨酸之一。
2.如权利要求1所述的轭合化合物，其中该工程化半胱氨酸氨基酸是选自在氨基酸位
置241、243、251、253、258、264、271、285、288、291、296、301、307、309、311、329、385、387、433或435处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入、以及其组合。
3.如权利要求1所述的轭合化合物，其中该工程化半胱氨酸氨基酸是选自在氨基酸位
置258或435处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入、以及其组合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的轭合化合物，包含：
(a)在位于位置239处的丝氨酸(S)与位于位置240处的缬氨酸(V)之间插入的半胱氨酸
(C)；
(b)取代位于位置258处的谷氨酸(E)的半胱氨酸(C)；
(c)取代位于位置435处的组氨酸(H)的半胱氨酸(C)；
(d)取代位于位置435处的精氨酸(R)的半胱氨酸(C)；或者
(e)其组合，
其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的轭合化合物，其中该Fc结构域进一步包含至少一
种选自以下各项的工程化半胱氨酸残基：在氨基酸位置239、248、254、273、279、282、286、
287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、
384、389、398、400、413、415、418、422、440、441、442、443以及446处的半胱氨酸氨基酸取代。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的轭合化合物，包含至少两个、至少三个、或至少四
个硫醇基。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的轭合化合物，包含至少6、8、10、12、14、16或更多个硫醇基。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的轭合化合物，其中至少一个异源部分化学轭合至
工程化半胱氨酸。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的轭合化合物，包含至少两个、至少三个、或至少四
个异源部分。
10.根据权利要求9所述的轭合化合物，其中这些异源部分中的每个异源部分均轭合至
工程化半胱氨酸。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的轭合化合物，包含至少6、8、10、12、14、16或更多个异源部分。
12.根据权利要求11所述的轭合化合物，其中这些异源部分中的每个异源部分均轭合
至工程化半胱氨酸。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的轭合化合物，其中所有这些异源部分是相同
的。
14.根据权利要求9至12中任一项所述的轭合化合物，其中至少一个异源部分是与其余
异源部分不同的。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的轭合化合物，其中该抗体或Fc融合蛋白的Fc结
构域是IgG Fc结构域。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的轭合化合物，其中该抗体或Fc融合蛋白的Fc结
构域是人IgG Fc结构域。
17.根据权利要求16所述的轭合化合物，其中该人IgG是IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的轭合化合物，其中该Fc融合蛋白包含介导与靶
标的结合的多肽。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的轭合化合物，其中该Fc融合蛋白包含选自下组
的抗原结合结构域，该组由以下各项组成：(a)scFv；(b)双抗体；(c)Fd片段；(d)Fv片段；(e)(f)F(ab′)2片段；(g)FCABTM；以及(h)F(ab)片段。
20.根据权利要求1至18中任一项所述的轭合化合物，其中该Fc融合蛋白包含蛋白支架
或抗体模拟物。
21.根据权利要求1至17中任一项所述的轭合化合物，其中该Fc融合蛋白包含选自下组
的多肽，该组由以下各项组成：(a)配体；(b)酶；(c)受体的配体结合部分；以及(d)粘着蛋白。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的轭合化合物，其中该抗体或Fc融合蛋白的Fc结
构域进一步包含至少一个选自下组的非天然发生的氨基酸残基，该组由以下各项组成：
234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、2341、234V、234F 235A、235D、235R、235W、235P、
235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、2351、235V、235F、236E 239D、239E、239N、239Q、239F、
239T、239H、239Y、2401、240A、240T、240M、241W、241L、241Y 241E、241R.243W、243L 243Y、
243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T 255L、256E、256M、2621、262A、
262T、262E、2631、263A、263T、263M、264L、2641、264W、264T 264R、264F、264M、264Y、264E、
265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、2651、265L、265H、265T 2661、266A、266T、266M、267Q、
267L、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P292L、296E、296Q、296D、296N、296S、296T、
296L、2961、296H、269G、297S、297D、297E、298H 2981、298T、298F、2991、299L、299A、299S、
299V、299H、299F、299E、3051、313F、316D、325Q、325L、3251、325D、325E、325A、325T、325V、
325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、3281、328V、328T、
328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、3301、330F、330R、
330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、3311、331C、331Y、
331H、331R、331N、331D、331T、332D，332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、332H、332Y、
332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Y、以及443W，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的轭合化合物，其中该抗体是单克隆抗体、双特
异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人抗体、或人源化抗体。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的轭合化合物，其中至少一个异源部分是毒素、
药物、放射性核素、免疫调节剂、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子、肿瘤坏死因子、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微小RNA、肽核酸、光敏治疗剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、非天然氨基酸、肽、脂质、碳水化合物、支架分子、荧光标签、可视化肽、生物素、血清半衰期延长剂、捕获标签、螯合剂、固相支撑体、或其组合，并且其中轭合是在这些工程化半胱氨酸之一处。
25.根据权利要求24所述的轭合化合物，其中该药物是氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺
酸酯、亚硝基脲、吉西他滨、三氮烯、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位化合物、长春花生物碱、取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮抑素、紫杉醇、喜树碱、SN-38、阿霉素、阿霉素类似物、抗代谢物、烷化剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、蛋白体抑制剂、HDAC抑制剂、促凋亡剂、甲氨蝶呤、CPT-
11、或其组合，并且其中轭合是在这些工程化半胱氨酸之一处。
26.根据权利要求24所述的轭合化合物，其中该药物是奥瑞斯他汀、微管溶素或吡咯并
苯并二氮杂卓(PBD)。
27.根据权利要求26所述的轭合化合物，其中该奥瑞斯他汀是MMAE(单甲基奥瑞斯他汀
E)或MMAF(单甲基奥瑞斯他汀F)。
28.根据权利要求24所述的轭合化合物，其中该药物是美登木素生物碱。
29.根据权利要求28所述的轭合化合物，其中该美登木素生物碱是N2′-脱乙酰基-N2′-
(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)、N2′-脱乙酰基-N2′-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM3)或N2′-脱乙酰基-N2′(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM4)。
30.根据权利要求24所述的轭合化合物，其中该毒素是相思豆毒素、马钱子碱、毒芹素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、志贺毒素、内毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、霍乱毒素、镰叶芹醇、α毒素、格尔德霉素、白树毒素、百脉根苷、蓖麻毒素、番木鳖碱、河豚毒素、皂苷、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、或其组合。
31.根据权利要求24所述的轭合化合物，其中该螯合剂是DTPA、EC、DMSA、EDTA、Cy-
EDTA、EDTMP、DTPA、CyDTPA、Cy2DTPA、BOPTA、DTPA-MA、DTPA-BA、DTPMP、DOTA、TRITA、TETA、DOTMA、DOTA-MA、HP-DO3A、pNB-DOTA、DOTP、DOTMP、DOTEP、DOTPP、DOTBzP、DOTPME、HEDP、DTTP、N3S三酰胺硫醇、DADS、MAMA、DADT、N2S4联胺四硫醇、N2P2二硫醇-二膦、6-肼基烟酸、丙烯胺肟、四胺、环拉胺、或其组合。
51 57
32.根据权利要求24所述的轭合化合物，其中该放射性核素是铬( Cr)、钴( Co)、氟
(18F)、钆(153Gd、159Gd)、锗(68Ge)、钬(166Ho)、铟(115In、113In、112In、111In)、碘(131I、125I、123I、121I)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、钯(103Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re)、铑(105Rh)、钌(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、锶(85Sr)、硫(35S)、锝
99 201 113 117 3 133 169 175 90 65
( Tc)、铊( Tl)、锡( Sn、 Sn)、氚(H)、氙( Xe)、镱( Yb、 Yb)、钇( Y)、锌( Zn)、或其组合。
33.根据权利要求32所述的轭合化合物，其中该放射性核素是通过螯合剂附接至该轭
合化合物。
34.根据权利要求24所述的轭合化合物，其中该血清半衰期延长剂包括白蛋白、白蛋白
结合多肽、PAS、人绒毛膜促性腺激素C-末端肽(CTP)的β亚基、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、XTEN、白蛋白结合小分子、或其组合。
35.根据权利要求24所述的轭合化合物，其中该可视化肽能够在体外、体内、离体或其
任何组合中可视化或定位该轭合化合物。
36.根据权利要求35所述的轭合化合物，可视化肽是生物素受体肽、硫辛酸受体肽、荧
光蛋白、用于连接双砷染料或用于轭合亚稳态锝的含半胱氨酸肽、用于轭合基于荧光共振能量转移(FRET)的亲近测定法所用的铕包合物的肽、或其任何组合。
37.根据权利要求36所述的轭合化合物，其中该荧光蛋白是GFP、RFP、YFP、EGFP、或
EYFP。
38.根据权利要求36所述的轭合化合物，其中该双砷染料是4’，5’-双(1，3，2-二硫砷杂环戊烷-2-基)荧光素(FlAsH)。
39.根据权利要求36所述的轭合化合物，其中该生物素受体肽有助于基于抗生物素蛋
白的试剂和基于链霉抗生物素蛋白的试剂的轭合。
40.根据权利要求36所述的轭合化合物，其中该硫辛酸受体肽有助于硫醇反应性探针
轭合至结合硫辛酸或直接连接荧光硫辛酸类似物。
41.根据权利要求24所述的轭合化合物，其中该捕获标签是生物素或His6标签。
42.根据权利要求24所述的轭合化合物，其中该荧光标签包括荧光素型染料、罗丹明型
染料、丹酰型染料、丽丝胺型染料、花青型染料、藻红蛋白型染料、德克萨斯红型染料、以及其组合。
43.根据权利要求24所述的轭合化合物，其中该荧光标签是亚历克萨荧光染料488C5-
马来酰亚胺。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的轭合化合物，其中该异源部分是经由接头轭合
至这些工程化半胱氨酸之一。
45.根据权利要求44所述的轭合化合物，其中该接头是可裂解接头。
46.根据权利要求44所述的轭合化合物，其中该接头是不可裂解接头。
47.根据权利要求44所述的轭合化合物，其中该接头包含非肽接头。
48.根据权利要求47所述的轭合化合物，其中该接头由非肽接头组成。
49.根据权利要求47或48中任一项所述的轭合化合物，其中该非肽接头包括MC、val-
cit、MC-val-cit、MC-val-cit-PABC、Mal-PEG2C2、Mal-PEG3C2Mal-PEG6C2、MP、MPEG、SMCC、MBS、SMPT、LC-SPDP、BMPEO、SPP、或SMPB。
50.根据权利要求44所述的轭合化合物，其中该接头包含肽接头。
51.根据权利要求44所述的轭合化合物，其中该接头由肽接头组成。
52.根据权利要求50或51中任一项所述的轭合化合物，其中该肽接头包含至少2个氨基
酸、至少3、至少4、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、或至少100个氨基酸。
53.根据权利要求50或51中任一项所述的轭合化合物，其中该肽接头包含至少200、至
少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、或至少1,000个氨基酸。
54.根据权利要求50所述的轭合化合物，其中该肽接头包含具有化学式[(Gly)x-Sery]
z的肽，其中x是从1至4，y是0或1，并且z是从1至50。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的轭合化合物，其中该半胱氨酸工程化抗体或Fc
融合蛋白特异性地结合至少一个靶标。
56.根据权利要求55所述的轭合化合物，其中该靶标是蛋白质。
57.根据权利要求55所述的轭合化合物，其中该靶标是非蛋白质。
58.根据权利要求55所述的轭合化合物，其中该抗体或Fc融合蛋白结合与选自下组的
抗体的靶标相同的靶标，该组由以下各项组成：阿巴伏单抗、阿巴西普、阿昔单抗、阿达木单抗、阿德木单抗、阿仑单抗、阿妥莫单抗、阿非莫单抗、麻安莫单抗、阿尼莫单抗、安如珠单抗、阿泊珠单抗、阿西莫单抗、阿塞珠单抗、阿利珠单抗、阿托木单抗、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、巴土昔单抗、贝妥莫单抗、贝利木单抗、柏替木单抗、贝索单抗、贝伐单抗、比西单抗、溴烯比妥、比伐单抗美登素、阿仑珠单抗、康纳单抗、美坎珠单抗、卡罗单抗、卡妥索单抗、维多珠单抗、培舍珠单抗、西妥昔单抗、克立昔单抗、达塞珠单抗、达昔单抗、达利珠单抗、德尼单抗、地莫单抗、阿托度单抗、多立珠单抗、顿图木单抗、度里姆单抗、德木鲁单抗、依美昔单抗、依库丽单抗、埃巴单抗、依决洛单抗、依法利珠单抗、依芬古单抗、艾西莫单抗、培戈赖莫单抗、西艾匹莫单抗、依法利珠单抗、依匹莫单抗、依帕珠单抗、厄利珠单抗、厄妥索单抗、依那西普单抗、伊瑞西珠单抗、艾韦单抗、法索单抗、法拉莫单抗、泛维珠单抗、芳妥珠单抗、加利昔单抗、罗氏单抗、加维莫单抗、吉妥单抗、高利单抗、高米昔单抗、伊巴丽珠单抗、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、英西单抗、英夫利昔单抗、伊诺莫单抗、奥英妥珠单抗、伊匹单抗、伊拉土木单抗、凯利昔单抗、拉贝珠单抗、来马索单抗、莱布利珠单抗、乐德木单抗、来沙木单抗、莱西珠单抗、利韦单抗、林妥珠单抗、鲁卡木单抗、鲁昔单抗、马帕木单抗、马司莫单抗、马妥珠单抗、美泊利单抗、美替木单抗、米拉图珠单抗、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、莫罗木单抗、莫维珠单抗、莫罗单抗、他那可单抗、他那莫单抗、那他珠单抗、奈巴库单抗、英利昔单抗、尼妥珠单抗、巯诺莫单抗、奥瑞珠单抗、奥度莫单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、奥戈伏单抗、奥昔珠单抗、帕吉昔单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、帕考珠单抗、喷托莫单抗、帕妥珠单抗、培克珠单抗、平妥单抗、普立昔单抗、普立木单抗、兰尼单抗、瑞西巴库单抗、瑞加韦单抗、瑞利珠单抗、利妥昔单抗、罗维珠单抗、卢利珠单抗、沙妥莫单抗、司韦单抗、西罗珠单抗、西利珠单抗、索土珠单、司他芦单抗、硫索单抗、他珠单抗、他度珠单抗、他利珠单抗、帕他普莫单抗、特非珠单抗、阿替莫单抗、替奈昔单抗、特普利珠单抗、替西木单抗、托珠单抗、托利珠单抗、托西莫单抗、曲妥单抗、托眉力木单抗、西莫白介素单抗、妥韦单抗、乌珠单抗、优特克单抗、伐利昔单抗、维妥珠单抗、维帕莫单抗、维西珠单抗、伏洛昔单抗、伏妥莫单抗、扎鲁木单抗、扎木单抗、齐拉木单抗、和阿佐莫单抗。
59.根据权利要求55所述的轭合化合物，其中该抗体或Fc融合蛋白包含来自选自下组
的抗体的抗原结合区，该组由以下各项组成：阿巴伏单抗、阿巴西普、阿昔单抗、阿达木单抗、阿德木单抗、阿仑单抗、阿妥莫单抗、阿非莫单抗、麻安莫单抗、阿尼莫单抗、安如珠单抗、阿泊珠单抗、阿西莫单抗、阿塞珠单抗、阿利珠单抗、阿托木单抗、巴匹珠单抗、巴利昔单抗、巴土昔单抗、贝妥莫单抗、贝利木单抗、柏替木单抗、贝索单抗、贝伐单抗、比西单抗、溴烯比妥、比伐单抗美登素、阿仑珠单抗、康纳单抗、美坎珠单抗、卡罗单抗、卡妥索单抗、维多珠单抗、培舍珠单抗、西妥昔单抗、克立昔单抗、达塞珠单抗、达昔单抗、达利珠单抗、德尼单抗、地莫单抗、阿托度单抗、多立珠单抗、顿图木单抗、度里姆单抗、德木鲁单抗、依美昔单抗、依库丽单抗、埃巴单抗、依决洛单抗、依法利珠单抗、依芬古单抗、艾西莫单抗、培戈赖莫单抗、西艾匹莫单抗、依法利珠单抗、依匹莫单抗、依帕珠单抗、厄利珠单抗、厄妥索单抗、依那西普单抗、伊瑞西珠单抗、艾韦单抗、法索单抗、法拉莫单抗、泛维珠单抗、芳妥珠单抗、加利昔单抗、罗氏单抗、加维莫单抗、吉妥单抗、高利单抗、高米昔单抗、伊巴丽珠单抗、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、英西单抗、英夫利昔单抗、伊诺莫单抗、奥英妥珠单抗、伊匹单抗、伊拉土木单抗、凯利昔单抗、拉贝珠单抗、来马索单抗、莱布利珠单抗、乐德木单抗、来沙木单抗、莱西珠单抗、利韦单抗、林妥珠单抗、鲁卡木单抗、鲁昔单抗、马帕木单抗、马司莫单抗、马妥珠单抗、美泊利单抗、美替木单抗、米拉图珠单抗、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、莫罗木单抗、莫维珠单抗、莫罗单抗、他那可单抗、他那莫单抗、那他珠单抗、奈巴库单抗、英利昔单抗、尼妥珠单抗、巯诺莫单抗、奥瑞珠单抗、奥度莫单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、奥戈伏单抗、奥昔珠单抗、帕吉昔单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、帕考珠单抗、喷托莫单抗、帕妥珠单抗、培克珠单抗、平妥单抗、普立昔单抗、普立木单抗、兰尼单抗、瑞西巴库单抗、瑞加韦单抗、瑞利珠单抗、利妥昔单抗、罗维珠单抗、卢利珠单抗、沙妥莫单抗、司韦单抗、西罗珠单抗、西利珠单抗、索土珠单、司他芦单抗、硫索单抗、他珠单抗、他度珠单抗、他利珠单抗、帕他普莫单抗、特非珠单抗、阿替莫单抗、替奈昔单抗、特普利珠单抗、替西木单抗、托珠单抗、托利珠单抗、托西莫单抗、曲妥单抗、托眉力木单抗、西莫白介素单抗、妥韦单抗、乌珠单抗、优特克单抗、伐利昔单抗、维妥珠单抗、维帕莫单抗、维西珠单抗、伏洛昔单抗、伏妥莫单抗、扎鲁木单抗、扎木单抗、齐拉木单抗、和阿佐莫单抗。
60.根据权利要求55所述的轭合化合物，其中该靶标是细菌抗原并且该异源部分是抗
细菌剂。
61.根据权利要求55所述的轭合化合物，其中该靶标是病毒抗原并且该异源部分是抗
病毒剂。
62.根据权利要求55所述的轭合化合物，其中该靶标是肿瘤抗原并且该异源部分是抗
肿瘤剂。
63.根据权利要求55所述的轭合化合物，其中该靶标是真菌抗原并且该异源部分是抗
真菌剂。
64.根据权利要求55所述的轭合化合物，其中该靶标是寄生虫抗原并且该异源部分是
抗寄生虫剂。
65.根据权利要求55所述的轭合化合物，其中该靶标是支原体抗原并且该异源部分是
抗支原体剂。
66.根据权利要求55所述的轭合化合物，其中该靶标是分化抗原或组织相容性抗原并
且该异源部分是细胞毒性剂。
67.根据权利要求1至66中任一项所述的轭合化合物，其中该半胱氨酸工程化抗体或Fc
融合蛋白包含一对或三个选自以下各项的工程化半胱氨酸：
(i)在亲本抗体或其片段的位置258处的半胱氨酸氨基酸取代和在该亲本抗体或其片
段的卡巴特位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(ii)在该亲本抗体的位置289处的半胱氨酸氨基酸取代和在该亲本抗体的位置239与
240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(iii)在该亲本抗体的位置339处的半胱氨酸氨基酸取代和在该亲本抗体的位置239与
240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(iv)在该亲本抗体或其片段的位置435处的半胱氨酸氨基酸取代和在该亲本抗体或其
片段的卡巴特位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(v)在亲本抗体或其片段的位置442处的半胱氨酸氨基酸取代和在该亲本抗体或其片
段的卡巴特位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(vi)在该亲本抗体的位置258处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在该亲本抗体的位置
289处的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(vii)在该亲本抗体的位置258处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在该亲本抗体的位置
339处的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(viii)在该亲本抗体或其片段的位置258处的第一半胱氨酸氨基酸取代、以及在该亲
本抗体或其片段的卡巴特位置435处的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(ix)在该亲本抗体或其片段的位置258处的第一半胱氨酸氨基酸取代、以及在该亲本
抗体或其片段的卡巴特位置442处的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(x)在该亲本抗体的位置435处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在该亲本抗体的位置289
处的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(xi)在该亲本抗体的位置435处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在该亲本抗体的位置
339处的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(xii)在该亲本抗体或其片段的位置435处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在该亲本抗
体或其片段的卡巴特位置442处的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(xiii)在该亲本抗体的位置258和289处的半胱氨酸氨基酸取代和在该亲本抗体的位
置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(xiv)在该亲本抗体的位置258和339处的半胱氨酸氨基酸取代和在该亲本抗体的位置
239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(xv)在该亲本抗体的位置258和435处的半胱氨酸氨基酸取代和在该亲本抗体的位置
239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(xvi)在该亲本抗体的位置258和442处的半胱氨酸氨基酸取代和在该亲本抗体的位置
239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(xvii)在该亲本抗体的位置289和339处的半胱氨酸氨基酸取代和在该亲本抗体的位
置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(xviii)在该亲本抗体的位置339和435处的半胱氨酸氨基酸取代和在该亲本抗体的位
置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；以及
(xix)在该亲本抗体的位置435和442处的半胱氨酸氨基酸取代和在该亲本抗体的位置
239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
68.一种核酸，编码如权利要求1所述的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白。
69.一种载体，包含如权利要求68所述的核酸。
70.一种宿主细胞，包含如权利要求68所述的核酸或如权利要求69所述的载体。
71.一种配制品，包含如权利要求1至67中任一项所述的轭合化合物以及稀释剂、载体、
或赋形剂。
72.一种药物配制品，包含如权利要求1至67中任一项所述的轭合化合物以及药学上可
接受的稀释剂、载体、或赋形剂。
73.一种制品，包括如权利要求71所述的药物配制品；容器；以及包装说明书或标签。
74.一种用于制备根据权利要求1至67中任一项所述的轭合化合物的方法，包括：
(i)通过用编码半胱氨酸(C)氨基酸的密码子替代在位置258或435处的至少一个密码
子，或在编码位置239和240处的氨基酸的密码子之间插入编码半胱氨酸(C)的密码子来诱变编码抗体或Fc融合蛋白的至少一个核酸序列，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引；
(ii)表达该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白；
(iii)分离该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白；并且
(iv)使该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的至少一个工程化半胱氨酸基团与异源
部分反应。
75.一种用于制备根据权利要求1至67中任一项所述的轭合化合物的方法，包括：
(i)将编码可变重链区或异源蛋白质的核酸序列可操作地连接至编码Fc区蛋白质的核
酸序列，其中编码该Fc区蛋白质的该核酸序列包含：
(a)编码在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、
288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的半胱氨酸的或在编码位置239和240处的氨基酸的密码子之间插入的至少一个密码子，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引；或者
(b)编码在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、271、285、288、291、296、301、307、
309、311、329、385、387、433或435处的半胱氨酸的或在编码位置239和240处的氨基酸的密码予之间插入的至少一个密码子，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引；或者
(c)编码在氨基酸位置258或435处的半胱氨酸的或在编码位置239和240处的氨基酸的
密码子之间插入的至少一个密码子，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引；
(ii)表达该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白；
(iii)分离该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白；并且
(iv)使该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的至少一个工程化半胱氨酸基团与异源
部分反应。
76.根据权利要求74或75所述的方法，其中诱变包含定点诱变。
77.一种用于检测根据权利要求1至67中任一项所述的轭合化合物与靶细胞的结合的
方法，包括：
(a)使细胞暴露于如权利要求1至67中任一项所述的轭合化合物；并且
(b)测定该轭合化合物与这些靶细胞的结合程度。
78.一种检测有需要的受试者的癌症、自身免疫性、炎性或感染性疾病或病症的方法，
包括向该受试者给予如权利要求1至67中任一项所述的轭合化合物。
79.一种治疗有需要的受试者的癌症、自身免疫性、炎性或感染性疾病或病症的方法，
该方法包括向该受试者给予如权利要求1至67中任一项所述的轭合化合物。
80.如权利要求78所述的方法，进一步包括给予另外的疗法，其中该另外的疗法是选自
下组，该组由以下各项组成：化学疗法、生物疗法、免疫疗法、放射疗法、激素疗法、以及外科手术。
81.一种向细胞递送异源部分的方法，包括用如权利要求1至67中任一项所述的轭合化
合物治疗该细胞。
82.如权利要求80所述的方法，其中该轭合化合物被该细胞内化。
83.根据权利要求1至67中任一项所述的轭合化合物，其中至少70％的该轭合化合物在
血清孵育3天后是完整的。
84.根据权利要求1至67中任一项所述的轭合化合物，其中至少70％的该轭合化合物在
血清孵育7天后是完整的。
85.根据权利要求1至67、83或84中任一项所述的轭合化合物，其中该轭合物在用血清
孵育时经7天时段表现出小于约50％的活性损失。
86.如权利要求83、84或85所述的轭合化合物，其中该血清是选自啮齿动物血清、犬血
清、灵长类动物血清以及人血清。
87.如权利要求68或69所述的轭合化合物，其中该孵育是在4℃至37℃下进行。
88.根据权利要求85至87中任一项所述的轭合化合物，其中活性是在细胞杀伤测定中
测定。
89.一种用于制备轭合化合物的方法，包括：
使半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的至少一个工程化半胱氨酸基团与异源部分反
应，其中该抗体或Fc融合蛋白的Fc结构域包含至少一种选自以下各项的工程化半胱氨酸氨基酸：在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、
293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、411、
417、433、435或439处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入、以及其组合，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
90.根据权利要求84所述的方法，其中该工程化半胱氨酸氨基酸是选自在氨基酸位置
241、243、251、253、258、264、271、285、288、291、296、301、307、309、311、329、385、387、433或
435处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入、以及其组合，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
91.根据权利要求84所述的方法，其中该工程化半胱氨酸氨基酸是选自在氨基酸位置
258或435处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入、以及其组合，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
92.根据权利要求84至86中任一项所述的方法，其中轭合效率是当可比较性半胱氨酸
工程化抗体或Fc融合蛋白的工程化半胱氨酸基团与具有氨基酸位置289处的半胱氨酸氨基酸取代的异源部分反应时获得的轭合效率的至少50％，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
93.根据权利要求84至86中任一项所述的方法，其中轭合效率是当可比较性半胱氨酸
工程化抗体或Fc融合蛋白的工程化半胱氨酸基团与具有氨基酸位置289处的半胱氨酸氨基酸取代的异源部分反应时获得的轭合效率的多于100％，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
包含半胱氨酸工程化抗体的轭合化合物
背景
[0001] 本披露提供半胱氨酸工程化抗体和Fc融合蛋白、以及包含此类半胱氨酸工程化分子的轭合化合物。此类轭合物可以用于诊断和治疗应用。
[0002] 已建立抗体用于诊断和靶向治疗患有癌症、免疫学病症和血管形成紊乱的患者的用途。抗体-药物轭合物(ADC)(即免疫轭合物)用于局部递送细胞毒性剂或细胞抑制剂(即，在癌症治疗中杀死或抑制肿瘤细胞的药物)(兰伯特(Lambert)(2005)当代药理学观点(Curr.Opinion in Pharmacology)5：543-549；吴(Wu)等人(2005)自然生物技术(Nature Biotechnology)23：1137-1146；佩恩(Payne)(2003)癌细胞(Cancer Cell)3：207-21)的用途理论上允许向肿瘤靶向递送药物部分，其中它们结合靶标并且可以被内化从而导致细胞内累积，其中全身给药这些非轭合药剂可能导致对于正常细胞以及旨在消除的肿瘤细胞均不可接受的毒性水平。设计和优化ADC的努力已集中在单克隆抗体(mAb)的选择性以及药物连接和药物释放特性(兰伯特，J.(2005)当代药理学观点5：543-549)。这些方法包括将抗体与药物、毒素、放射性同位素、肽、其他抗体等轭合。
[0003] 将药物部分附接(即，通过共价键连接)至抗体的常规手段通常形成其中药物部分附接在抗体上的许多位点处的分子异质混合物。例如，细胞毒性药物已典型地通过抗体的很多赖氨酸残基轭合至抗体，从而产生一种异质的抗体-药物轭合混合物。
[0004] 半胱氨酸残基已通过基因工程技术引入到蛋白质中以形成与配体的共价附接或形成新的分子内二硫键。然而，通过将蛋白质的不同氨基酸残基突变成半胱氨酸氨基酸而形成的工程化半胱氨酸硫醇基可能是有问题的，特别是在不成对(游离半胱氨酸)残基或相对易于反应或氧化的那些残基的情况下。例如，分子内或分子间二硫化物的形成可能导致蛋白质聚集。工程化半胱氨酸的位置可以影响药物在轭合过程中的可及性，从而在导致收益低。引入新的半胱氨酸可以使抗体无活性或由于错折叠或损失三级结构而导致与其靶标的结合特异性损失(张(Zhang)等人(2002)分析生物化学(Anal.Biochem.)311：1-9)。而且，这些轭合化合物可能具有较差的血清稳定性，从而导致活性损失并降解(例如，通过抗体部分的蛋白降解或清除，或通过药物部分的水解)。因此，本披露的一个目的是提供能够产生具有增强的稳定性(例如，血清稳定性)的轭合化合物的改进的半胱氨酸工程化策略。
概述
概述
[0005] 本披露提供包含半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白和至少一个异源部分的轭合化合物，其中(i)该抗体或其Fc融合蛋白的Fc结构域包含至少一种选自以下各项的工程化半胱氨酸氨基酸：在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、
401、402、411、417、433、435或439处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入以及其组合，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特(Kabat)(1991，NIH出版91-
3242，国家技术信息服务(Naional Technical Information Service)，维吉尼亚州斯普林菲尔德(Springfield，VA))所列的EU索引；以及(ii)其中至少一个异源部分轭合至工程化半胱氨酸之一上。
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、
401、402、411、417、433、435或439处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入以及其组合，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特(Kabat)(1991，NIH出版91-
3242，国家技术信息服务(Naional Technical Information Service)，维吉尼亚州斯普林菲尔德(Springfield，VA))所列的EU索引；以及(ii)其中至少一个异源部分轭合至工程化半胱氨酸之一上。
[0006] 在一些方面中，轭合化合物包含2种或更多种工程化半胱氨酸氨基酸。
[0007] 在一些方面中，轭合化合物在血清中具有高稳定性。
[0008] 本披露的另一个方面提供用于生成具有如在此所述的至少一种工程化半胱氨酸氨基酸的抗体或Fc融合蛋白的核酸、载体和宿主细胞。
[0009] 本披露的另一个方面提供制备包含半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白和至少一个异源部分的轭合化合物的方法。在一个实施例中，异源部分是一种药物，其中该药物选自细胞毒性剂、化学治疗剂、肽、肽模拟物、蛋白质支架、酶、毒素、放射性核素、DNA、RNA、siRNA、微小RNA、肽核酸、荧光标签或生物素。
[0010] 本披露的另一个方面提供本披露的轭合化合物，其中这些轭合化合物在结合细胞表面受体时能够内化。在这些方面中，本披露的轭合化合物适用于细胞内递送货物分子和/或药剂。
[0011] 本披露的另一个方面提供用本披露的轭合化合物来治疗、检测和诊断癌症、自身免疫性、炎性或感染性疾病的方法。
[0013] 图1A和图1B分别示出IgG重链(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的CH2区和CH3区的氨基酸序列和根据卡巴特(卡巴特等人，具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公共卫生服务，马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院(Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md)(1991))中所列的EU索引的编号。不同于IgG1的残基是以阴影表示的并且已知等位基因变异的位点由星号(*)指示。阴影框表示在实例1中鉴定的几个半胱氨酸取代/插入位点，并且箭头表示在此提供的实例中检测血清稳定性的半胱氨酸取代/插入位点。
[0014] 图2示出与包含具有在EU位置258(E258C)处的半胱氨酸工程化的1C1抗体的轭合化合物相对应的尺寸排阻色谱法(SEC)谱图，该1C1抗体使用马来酰亚胺化学品轭合至亚历克萨荧光染料488(AF488)。将轭合化合物用人血清(NHS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)孵育。A图示出在第0天的NHS孵育，B图示出在第0天的PBS孵育，C图示出在七天后的NHS孵育，并且D图示出在七天后的PBS孵育。280处的信号是样品中的总蛋白含量，并且494处的信号是轭合至AF488的蛋白质。在血清孵育七天后，仅一小部分AF488转移至HSA。
[0015] 图3示出与包含具有在EU位置435(H435C)处的半胱氨酸工程化的1C1抗体的轭合化合物相对应的尺寸排阻色谱法(SEC)谱图，该1C1抗体使用马来酰亚胺化学品轭合至亚历克萨荧光染料488(AF488)。将轭合化合物用人血清(NHS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)孵育。A图示出在第0天的NHS孵育，B图示出在第0天的PBS孵育，C图示出在七天后的NHS孵育，并且D图示出在七天后的PBS孵育。在血清孵育七天后，仅一小部分AF488转移至HSA。
[0016] 图4示出与包含具有在EU位置443(L443C)处的半胱氨酸工程化的1C1抗体的轭合化合物相对应的尺寸排阻色谱法(SEC)谱图，该1C1抗体使用马来酰亚胺化学品轭合至亚历克萨荧光染料488(AF488)。将轭合化合物用人血清(NHS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)孵育。A图示出在第0天的NHS孵育，B图示出在第0天的PBS孵育，C图示出在七天后的NHS孵育，并且D图示出在七天后的PBS孵育。在血清孵育七天后，仅一小部分AF488转移至HSA。
[0017] 图5示出与包含具有在EU位置239与240(C239ins)之间的插入点处的半胱氨酸工程化的1C1抗体的轭合化合物相对应的尺寸排阻色谱法(SEC)谱图，该1C1抗体使用马来酰亚胺化学品轭合至亚历克萨荧光染料488(AF488)。将轭合化合物用人血清(NHS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)孵育。A图示出在第0天的NHS孵育，B图示出在第0天的PBS孵育，C图示出在七天后的NHS孵育，并且D图示出在七天后的PBS孵育。在血清孵育七天后，仅一小部分AF488转移至HSA。
[0018] 图6示出与包含具有在EU位置239(S239C)处的半胱氨酸工程化的1C1抗体的轭合化合物相对应的尺寸排阻色谱法(SEC)谱图，该1C1抗体使用马来酰亚胺化学品轭合至亚历克萨荧光染料488(AF488)。将轭合化合物用人血清(NHS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)孵育。A图示出在第0天的NHS孵育，B图示出在第0天的PBS孵育，C图示出在七天后的NHS孵育，并且D图示出在七天后的PBS孵育。在血清孵育七天后，仅一小部分AF488转移至HSA。
[0019] 图7示出与包含具有在其轻链(LC)中的EU位置205(LC-V205C)处的半胱氨酸工程化(一种高度稳定的突变)的1C1抗体的轭合化合物相对应的尺寸排阻色谱法(SEC)谱图，该
1C1抗体使用马来酰亚胺化学品轭合至亚历克萨荧光染料488(AF488)。将轭合化合物用人血清(NHS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)孵育。A图示出在第0天的NHS孵育，B图示出在第0天的PBS孵育，C图示出在七天后的NHS孵育，并且D图示出在七天后的PBS孵育。在血清孵育七天后，仅一小部分AF488转移至HSA。
1C1抗体使用马来酰亚胺化学品轭合至亚历克萨荧光染料488(AF488)。将轭合化合物用人血清(NHS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)孵育。A图示出在第0天的NHS孵育，B图示出在第0天的PBS孵育，C图示出在七天后的NHS孵育，并且D图示出在七天后的PBS孵育。在血清孵育七天后，仅一小部分AF488转移至HSA。
[0020] 图8示出与包含具有在EU位置289(T289C)处的半胱氨酸工程化(一种高度稳定的突变)的1C1抗体的轭合化合物相对应的尺寸排阻色谱法(SEC)谱图，该1C1抗体使用马来酰亚胺化学品轭合至亚历克萨荧光染料488(AF488)。将轭合化合物用人血清(NHS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)孵育。A图示出在第0天的NHS孵育，B图示出在第0天的PBS孵育，C图示出在七天后的NHS孵育，并且D图示出在七天后的PBS孵育。在血清孵育七天后，大部分AF488转移至HSA。
[0021] 图9示出与图2至图8所提供的实验数据对应的原始数据(A图)和相对于第0天归一化的数据(B图)。在血清孵育7天后，包含E258C、H435、L443以及C239ins突变并且与AF488轭合的新半胱氨酸工程化1C1抗体是稳定的。新工程化化合物的稳定性比得上1C1-LC-V205C-AF488稳定位点对照的稳定性。1C1-T289C-AF488轭合化合物是比较位点对照。
[0022] 图10示出EU E258C和C239ins突变不影响FcRn结合。图10A示出当在指示的位置处携带指示的突变的抗体被固定在ELISA板上时，FcRn能够结合与携带WT IgG1 Fc的抗体相比类似的水平。图10B示出当在使用马来酰亚胺化学品轭合或未轭合至AF488的情况下在指示的位置携带指示的突变的抗体被固定在ELISA板上时，FcRn能够结合与携带WT IgG1 Fc的抗体相比类似的水平。还示出呈现这些曲线中每一个的LogEC50值的表。
[0023] 图11示出具有野生型Fc区或半胱氨酸工程化Fc区的抗体与人Fc受体、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa(158V和158F等位基因两者)以及FcRn的结合亲和力。“N/A”表示结合太弱以至于不能获得KD的可靠估值。提供在pH 6下与FcRn的结合。
[0024] 图12示出野生型(WT)、E258C、S239C、C239ins、H435C以及Lc-V205C突变的差示扫描热量法(DSC)谱图。E258C、S239C和Lc-V205C的谱图类似于WT的谱图，而C239ins和H435C突变体两者出现一个新的较低熔融峰。还示出呈现来源于DSC热分析图的Tm1值的表。
[0025] 图13A-图13C示出来源于1C1抗体的单个Cys突变抗体药物轭合物(ADC)对于DU145细胞的细胞毒性，这些抗体药物轭合物包含基于奥瑞斯他汀的细胞毒性药物。绘制1C1-
S239C-ADC、1C1-LC-V205C-ADC、1C1-E258C-ADC、C1-H435C-ADC、1C1-239ins-ADC、1C1-T289C-ADC、1C1-L443C-ADC、1C1-ccADC(使用随机轭合方法)以及1C1-WT-ADC(模拟轭合)和R347-S239C-ADC阴性对照的细胞毒性曲线。A图示出在第0天的影响。B图示出在第3天的影响。C图示出在第7天的影响。还示出呈现这些曲线中每一个的EC50值的表。
S239C-ADC、1C1-LC-V205C-ADC、1C1-E258C-ADC、C1-H435C-ADC、1C1-239ins-ADC、1C1-T289C-ADC、1C1-L443C-ADC、1C1-ccADC(使用随机轭合方法)以及1C1-WT-ADC(模拟轭合)和R347-S239C-ADC阴性对照的细胞毒性曲线。A图示出在第0天的影响。B图示出在第3天的影响。C图示出在第7天的影响。还示出呈现这些曲线中每一个的EC50值的表。
[0026] 图14A-图14C示出来源于1C1抗体的ADC对DU145细胞的细胞毒性，这些ADC包含两个工程化半胱氨酸和基于奥瑞斯他汀的细胞毒性药物。绘制1C1-239ins-E258C-ADC、C1-
239ins-H435C-ADC、1C1-239ins-S442C-ADC、1C1-FF-E258C-S435C-ADC、1C1-FF-E258C-S442C-ADC、1C1-FF-H435C-S442C-ADC(注意“FF”表示此构建体含有消融Fc介导的效应子功能的另外的突变EU L234F/L235F)以及1C1-T289C-ADC的细胞毒性曲线。A图示出在第0天的影响。B图示出在第3天的影响。C图示出在第7天的影响。还示出呈现这些曲线中每一个的EC50值的表。
详细说明
239ins-H435C-ADC、1C1-239ins-S442C-ADC、1C1-FF-E258C-S435C-ADC、1C1-FF-E258C-S442C-ADC、1C1-FF-H435C-S442C-ADC(注意“FF”表示此构建体含有消融Fc介导的效应子功能的另外的突变EU L234F/L235F)以及1C1-T289C-ADC的细胞毒性曲线。A图示出在第0天的影响。B图示出在第3天的影响。C图示出在第7天的影响。还示出呈现这些曲线中每一个的EC50值的表。
详细说明
[0027] 本披露提供包含半胱氨酸工程化抗体和Fc融合蛋白的轭合化合物，其中一个或多个氨基酸残基已被活性半胱氨酸残基取代，并且更具体地说提供具有治疗或诊断应用的轭合化合物。在此披露的轭合化合物包含轭合至例如化学治疗药、毒素、放射性核素以及检测标记(诸如放射性核素或荧光团)的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白。本披露还涉及使用披露的轭合化合物用于体外、原位、离体以及体内诊断或治疗哺乳动物细胞或相关病理病症的方法。
[0028] 为了更容易地理解本披露，首先定义某些术语。附加的定义在整个详细说明中列出。I.定义
[0029] 在详细描述提供的实施例之前，应当理解本披露并不限于特定的组合物或方法步骤，并且这些组合物或方法步骤可以改变。如在本说明书和随附权利要求书中所使用，除非上下文另外明确说明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”包括复数参考对象。术语“一个”(或“一种”)、以及术语“一个或多个/一种或多种”和“至少一个”在此可以互换地使用。
[0030] 此外，在此使用“和/或”应当理解为在有或没有另一者的情况下，两个指定的特征或组分中的每一者的特定披露。因此，如在此的短语诸如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、以及“B”(单独)。同同样，如在短语诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在包括以下各方面：A、B以及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
[0031] 除非另外定义，否则在此所使用的所有技术和科学术语具有与本披露涉及的领域所属的技术人员通常所理解的相同的意义。例例如，生物医学和分子生物学简明词典(the Coneise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology)，Juo，Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社；细胞和分子生物学词典(The Dictionary of Cell and Molecular
Biology)，第3版，1999，学术出版社(Academic Press)；以及生物化学和分子生物学牛津词典(Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)，修订版，2000，牛津大学出版社(Oxford University Press)，为技术人员提供本披露中使用的许多术语的一般词典。
Biology)，第3版，1999，学术出版社(Academic Press)；以及生物化学和分子生物学牛津词典(Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)，修订版，2000，牛津大学出版社(Oxford University Press)，为技术人员提供本披露中使用的许多术语的一般词典。
[0032] 单位、前缀和符号均以它们的国际单位系统(SI)接受形式表示。数值范围包括定义该范围的数字。除非另外指明，否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。在此提供的小标题不是不同方面的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面。因此，通过以其全文参考说明书，更完全地定义了就在以下定义的术语。
[0033] 应当理解，当用语言“包含”来说明方面时，还提供了关于“由......组成”和/或“主要由......组成”描述的其他类似方面。
[0034] 氨基酸在此通过它们的通常己知的三字母符号或通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来提及。
同样地，核苷酸通过它们的普遍公认的单字母代码来提及。
同样地，核苷酸通过它们的普遍公认的单字母代码来提及。
[0036] 典型抗体包含由二硫键互连的至少两个重(H)链和两个轻(L)链。每个重链由一个重链可变区(在此缩写成VH)和一个重链恒定区组成。重链恒定区由三个或四个恒定结构域CH1、CH2、CH3、CH4组成。每个轻链由一个轻链可变区(在此缩写成VL)和一个轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，名为互补决定区(CDR)，它们散布在较为保守的名为构架区(FW)的区域内。每个VH和VL由三个CDR和四个FW形成，以如下顺序从氨基末端至羧基末端来安排：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或宿主因素(包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。本披露的示例性半胱氨酸工程化抗体包括典型抗体、融合蛋白和包含抗体或其抗原结合片段的构建体，例如，包含共价连接(例如，经由肽键或经由化学接头)至典型抗体重链的CH2结构域N-端或CH3结构域C-端的Fc结构域和scFv的构建体。
[0037] 术语“抗体”意指通过位于免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性地结合一个靶标如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或上述物质的组合的一个免疫球蛋白分子。如在此使用的，术语“抗体”包括完整多克隆抗体，完整单克隆抗体，抗体片段(诸如Fab、Fab′、F(ab′)2、以及Fv片段)，单链式Fv(sc Fv)突变体，产生自至少两个完整抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白以及包含抗原酶识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，只要这些抗体展现希望的生物活性。抗体可以是以下五大类免疫球蛋白中的任一种：Ig A、Ig D、Ig E、Ig G、以及Ig M、或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA1和IgA2)，基于它们的重链恒定区的特性分别被称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类的免疫球蛋白具有不同的且众所周知的亚基结构以及三维构型。抗体可以是裸的或轭合至其他分子如毒素、放射性同位素等等，以便形成抗体-药物轭合物(ADC)。
[0038] 术语“抗原结合片段”是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的抗原决定可变区。本领域中已知的是，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。抗体片段的实例包括但不限于：Fab、Fab′、F(ab′)2、以及Fv片段、线性抗体、单链抗体、以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0039] “单克隆抗体”是指参与高度特异性识别并且结合单个抗原决定簇或表位的均质性抗体种群。这与典型地包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。
[0040] 术语“单克隆抗体”包括完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(诸如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指以任何数量的方式制成的此类抗体，这些方式包括但不限于，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达以及转基因动物。
[0041] 术语“人源化抗体”是指来源于非人类(例如，鼠类)免疫球蛋白的抗体，该抗体被工程化为含有最小的非人类(例如，鼠类)序列。典型地，人源化抗体是人类免疫球蛋白，其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自非人类物种(例如，小鼠、大鼠、兔子或仓鼠)的CDR的具有所希望特异性、亲和性和能力的残基替代(琼斯(Jone)等人，1986，自然(Nature)，321：522-525；里希曼(Riechmann)等人，1988，自然，332：323-327；费尔海恩(Verhoeyen)等人，
1988，科学(Science)，239：1534-1536)。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv构架区(FW)残基被来自非人类物种的具有所希望特异性、亲和性和能力的抗体中的相应残基替代。
1988，科学(Science)，239：1534-1536)。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv构架区(FW)残基被来自非人类物种的具有所希望特异性、亲和性和能力的抗体中的相应残基替代。
[0042] 人源化抗体还可以通过取代Fv构架区中和/或替代的非人类残基内的额外残基来进一步修饰以便改善并优化抗体特异性、亲和性和/或能力。通常，人源化抗体将基本上都包括至少一个、并且典型地两个或三个可变结构域，这些可变结构域含有的所有或基本上所有的CDR区对应于非人类免疫球蛋白，而所有或基本上所有的FR区是人类的。人源化抗体还可以包括免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，典型地是一种人免疫球蛋白的至少一部分。在美国专利号5,225,539或5,639,641中描述用于产生人源化抗体的方法的实例。
[0043] 抗体的“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，单独地抑或进行组合。重链和轻链的这些可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)(又称为高变区)连接的四个构架区(FW)组成。每个链中的CDR由FW区紧密靠近地保持在一起，与来自另一个链的CDR促成了抗体的抗原结合位点的形成。有至少两种技术用于确定CDR：(1)一种基于跨物种序列变异性的方法(即，卡巴特等人，具有免疫学意义的蛋白质序列，(第5版，1991，马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院))；和(2)一种基于抗原抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等人(1997)分子生物学杂志(Molec.Biol.)273：927-948)。此外，这两种方法的组合有时在本领域中用于确定CDR。
[0044] 卡巴特编号系统总体上在提及可变结构域(大约轻链的1-107个残基和重链的1-113个残基)中的残基时使用(例如，卡巴特等人，具有免疫学意义的蛋白质序列，第5版，公共卫生服务，马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院(1991))。
[0045] 如卡巴特中的氨基酸位置编号是指在卡巴特等人，具有免疫学意义的蛋白质序列，第5版，公共卫生服务，马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院(1991)中用于抗体编译的重链可变区或轻链可变域的编号系统。使用这个编号系统，实际线性氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FW或CDR的缩短或插入该FW或CDR中的较少的或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包含在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据卡巴特的残基
52a)以及在重链FW残基82之后插入的残基(例如，根据卡巴特的残基82a、82b以及82c等)。
表1
52a)以及在重链FW残基82之后插入的残基(例如，根据卡巴特的残基82a、82b以及82c等)。
表1
[0046] 可以通过抗体序列与“标准”卡巴特编号序列在同源区的比对而针对给定的抗体确定残基的卡巴特编号。乔西亚相反地是指结构环的位置(乔西亚和莱斯克(Lesk)，分子生物学杂志196：901-917(1987))。当使用卡巴特编号规定编号时，乔西亚CDR-H1环的末端取决于环的长度在H32与H34之间变化(这是因为卡巴特编号方案将插入放置在H35A和H35B处；如果既不存在35A也不存在35B，则该环在32处结束；如果仅存在35A，则该环在33处结束；如果35A和35B两者均存在，则该环在34处结束)。AbM高变区表示在卡巴特CDR与乔西亚结构环之间的折衷，并且通过牛津大学分子AbM抗体建模软件来使用。
[0047] IMGT(免疫遗传学)也提供一种用于免疫球蛋白可变区(包括CDR)的编号系统。参见例如，勒弗朗，M.P.(Lefranc，M.P.)等人，发育和比较免疫学(Dev.Comp.Immunol)27：55-
77(2003)，该文献通过引用结合在此。IMGT编号系统是基于高变环的多于5,000个序列的比对、结构数据和表征，并且允许容易地比较所有物种的可变区和CDR区。根据IMGT编号方案，VH-CDR1是在位置26至35处，VH-CDR2是在位置51至57处，VH-CDR3是在位置93至102处，VL-CDR1是在位置27至32处，VL-CDR2是在位置50至52处，并且VL-CDR3是在位置89至97处。
77(2003)，该文献通过引用结合在此。IMGT编号系统是基于高变环的多于5,000个序列的比对、结构数据和表征，并且允许容易地比较所有物种的可变区和CDR区。根据IMGT编号方案，VH-CDR1是在位置26至35处，VH-CDR2是在位置51至57处，VH-CDR3是在位置93至102处，VL-CDR1是在位置27至32处，VL-CDR2是在位置50至52处，并且VL-CDR3是在位置89至97处。
[0048] 如在此使用的Fc区包括含有抗体除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的恒定区的多肽及其片段。因此，Fc是指IgA、IgD以及IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域、以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域、以及任选地在这些结构域的N-末端的柔性铰链区。对于IgA和IgM，Fc区可以包含J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3(Cγ2和Cγ3)和任选地Cγ1(Cγ1)与Cγ2(Cγ2)之间的铰链区。虽然Fc区的边界可以发生变化，但人IgG重链Fc区通常被定义成包含其羧基末端的残基C226或P230，其中编号是根据基于卡巴特(卡巴特等人，具有免疫学意义的蛋白质序列，第5版，公共卫生服务，马里兰州贝塞斯达的美国国家卫生研究院(1991))中阐述的EU索引。Fc可以是指孤立地这个区，或在抗体、抗体片段或Fc融合蛋白的环境中的这个区。已在多个不同Fc位置处观察到多态性，包括但不限于如由EU索引编号的位置270、272、312、315、356、以及358，并且因此所呈现的序列与现有技术序列之间可能存在略微的差异。
[0049] 如在此所用，术语“Fc融合蛋白”包括含有全长Fc结构域的蛋白质(例如，本披露轭合化合物)以及含有Fc结构域片段(例如，完全CH2结构域、完全CH3结构域、CH2片段、CH3片段或其组合)的蛋白质。Fc融合蛋白还可包含全部或一部分铰链区。
[0050] 术语“人抗体”意指由人类产生的抗体或具有与使用本领域已知的任何技术制成的由人类产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一个人重链和/或轻链多肽的抗体，例如像，包含鼠类轻链和人重链多肽的抗体。
[0051] 术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。典型地，轻链和重链两者的可变区对应于来源于一个哺乳动物物种(例如，小鼠、大鼠、兔子等)的具有所希望特异性、亲和性和能力的抗体的可变区，而恒定区与来源于另一个哺乳类物种(通常为人类)的抗体中的序列同源以便避免在那些物种中引起免疫应答。
[0052] “抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式，其中结合至存在于某些细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞、以及巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上的分泌的Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性地结合至带有抗原的靶细胞并且随后用细胞毒素杀伤该靶细胞。针对靶细胞表面的IgG抗体“武装”细胞毒性细胞并且绝对是这种杀伤所需要的。靶细胞的溶解是细胞外的，要求直接的细胞与细胞接触，并且不涉及补体。可以预期的是，除抗体之外，包含Fc区(确切地是Fc融合蛋白)的、具有特异性地结合带有抗原的靶细胞能力的其他蛋白质将能够影响细胞介导的细胞毒性。为了简单起见，由Fc融合蛋白的活性产生的细胞介导的细胞毒性在此也称为ADCC活性。
[0053] “分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是呈自然界中未发现形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经被纯化至它们不再呈自然界中发现形式的程度的那些。在一些方面中，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。
[0054] 术语“受试者”是指有待成为特定治疗的接受者的任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长动物、啮齿类等。典型地，术语“受试者”和“患者”在提及人类受试者时可以互换地使用。
[0055] 术语“药用组合物”是指一种呈关于允许活性成分(例如，在此披露的轭合化合物)的生物活性有效的这种形式的制剂，以及不包含对于该组合物将给予的受试者而言具有不可接受毒性的额外组分的制剂。这种组合物可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。这种组合物可以是无菌的。
[0056] 如在此披露的轭合化合物的“有效量”是足以实施具体阐述目的的量。关于阐述的目的，“有效量”可以经验为主地并且以常规方式来确定。
[0057] 术语“治疗有效量”是指在此披露的轭合化合物或其他药物足以“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症的量。
[0058] 当在此使用时，词语“标记”是指一种直接或间接轭合至在此披露的半胱氨酸工程化抗体或其片段以便产生“标记的”轭合化合物的可检测化合物或组合物。该标记可以是本身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况下可以催化可检测底物化合物或组合物的化学改变。
[0059] 术语诸如“治疗(treating/treatment/to treat)”是指(1)治愈、减缓已诊断病理病状或病症、减少其症状和/或停止其进展的治疗措施，以及(2)防止和/或减缓目标病理病状或病症进展的预防性或防御性措施。因此，需要治疗的那些包括已经患有病症的患者；具有患病症的倾向的患者；以及病症有待预防的那些患者。在某些方面中，如果患者表现出例如，一种疾病或病症(例如某种类型的癌症)的全部、部分或暂时缓解，则受试者根据本披露的方法被成功“治疗”该疾病或病症(例如癌症)。
[0060] 术语“癌症”、“肿瘤”、“癌性的”以及“恶性的”是指或描述典型地特征为细胞生长失控的哺乳动物的生理病状。癌症的实例包括但不限于恶性肿瘤，包括腺癌、淋巴瘤、母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤以及白血病。此类癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌，肝癌(诸如肝癌和肝细胞瘤)、膀胱癌、乳腺癌(包括激素介导的乳腺癌，参见例如，英尼斯(Innes)等人(2006)英国癌症杂志(Br.J.Cancer)94：1057-1065)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、骨髓瘤(诸如多发性骨髓瘤)、唾液腺癌、肾癌(诸如肾细胞癌和维尔姆斯氏瘤)、基底细胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食道癌、各种类型的头颈癌以及粘液性起源的癌症(诸如粘液性卵巢癌)、胆管癌(肝)以及肾乳头状癌。
[0061] “自身免疫性疾病”在此是一种因个体自身组织或器官或其共分离或表现形式或自其产生病症引起的并且针对自身组织或器官或其共分离或表现形式或自其产生病症的疾病或病症。在许多这些自身免疫病症和炎性病症中，可能存在许多临床和实验室标记物，包括但不限于高γ球蛋白血症、高水平自身抗体、在组织中的抗原抗体复合物沉积物(由皮质类固醇或免疫抑制治疗引起)、以及在受影响的组织中的淋巴样细胞聚集体。不局限于关于B细胞介导的自身免疫性疾病的任何理论，认为B细胞通过多个机制途径证明在人类自身免疫性疾病中的致病作用，这些机制途径包括自身抗体产生、免疫复合物形成、树突细胞和T细胞活化、细胞因子合成、直接趋化因子释放，以及提供用于异位新淋巴生成的病灶。这些途径中的每个途径可以不同程度地参与自身免疫性疾病的病理。自身免疫性疾病可以是一种器官特异性疾病(即，免疫应答特异地针对诸如内分泌系统、造血系统、皮肤、心肺系统、胃肠和肝系统、肾脏系统、甲状腺、耳朵、神经肌肉系统、中枢神经系统等的器官系统)或一种可能影响多个器官系统(例如，系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎、多发性肌炎等)的全身性疾病。
[0062] 如在此可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指具有任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶并入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和它们的类似物。前述说明适用于在此提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。
[0063] 术语“载体”意指一种构建体，该构建体能够在宿主细胞中递送一个或多个感兴趣的基因或序列并且在一些方面中，能够表达这些基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞(诸如生产细胞)。
[0064] 在此可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指具有任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线性或支化的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还包括已被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分轭合。该定义中还包括，例如，含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。应当理解，由于本披露的多肽是基于抗体的，因此在某些方面中，这些多肽可以作为单链或相关链出现。
[0065] “重组”多肽或蛋白质是指经由重组DNA技术产生的多肽或蛋白质。如同已经通过任何合适的技术分离、分馏或部分纯化或基本上纯化的天然或重组多肽一样，出于本披露的目的，在工程化宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质也被视为是分离的。在此披露的多肽可以是使用本领域已知的方法重组产生。可替代地，在此披露的蛋白质和肽可以是化学合成的。
[0066] 术语“氨基酸取代”是指用另一个氨基酸残基替代存在于亲本序列中的一个氨基酸残基。亲本序列中的氨基酸可以是例如经由化学肽合成或通过本领域已知的重组方法来取代。因此，提及“在位置X处取代”或“在位置X处取代”是指用替代性氨基酸残基取代存在于位置X处的氨基酸。取代类型可以根据模式AXY描述，其中A是对应于天然存在于位置X处的氨基酸的单个字母代码，并且A是取代的氨基酸残基。因此，L234F将是指用苯丙氨酸(F)取代在位置234处的亮氨酸氨基酸(L)。
[0067] 术语“氨基酸插入”是指在存在于亲本序列中的两个氨基酸残基之间引入一个新的氨基酸残基。一个氨基酸可以例如经由化学肽合成或通过本领域已知的重组方法来插入在亲本序列之中。因此如在此所用，短语“在位置X与Y之间的插入”(其中X和Y对应于氨基酸位置(例如，在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入))是指在X与Y位置之间的氨基酸插入，并且还是指在编码位置X和Y处氨基酸的密码子之间的编码氨基酸的密码子的核酸序列中的插入。插入类型可以根据模式AX-ins描述，其中A是对应于被插入的氨基酸的单个字母代码，并且X是该插入之间的位置。因此，C239ins将是指在位置239之后插入半胱氨酸氨基酸(C)(即，在位置239与240之间的插入)。C239ins在此还可以由更短的缩写“239ins”表示。
[0068] 术语“工程化半胱氨酸”或“在位置......处工程化的半胱氨酸”或其语法变型是指已被工程化至抗体或抗体的一部分(例如，Fc结构域或其片段)中并且具有一个硫醇官能团(-SH)的半胱氨酸(C)氨基酸。II.包含工程化半胱氨酸的轭合化合物
[0069] 本披露提供包含半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白和至少一个异源部分的轭合化合物，其中(i)该抗体或其Fc融合蛋白的Fc结构域包含至少一种选自以下各项的工程化半胱氨酸氨基酸：在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、
401、402、411、417、433、435或439处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入以及其组合，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特(Kabat)(1991，NIH出版91-
3242，国家技术信息服务(Naional Technical Information Service)，维吉尼亚州斯普林菲尔德(Springfield，VA))所列的EU索引；以及(ii)其中至少一个异源部分轭合至工程化半胱氨酸之一上。
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、
401、402、411、417、433、435或439处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入以及其组合，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特(Kabat)(1991，NIH出版91-
3242，国家技术信息服务(Naional Technical Information Service)，维吉尼亚州斯普林菲尔德(Springfield，VA))所列的EU索引；以及(ii)其中至少一个异源部分轭合至工程化半胱氨酸之一上。
[0070] 在一些方面中，工程化半胱氨酸氨基酸是选自在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、271、285、288、291、296、301、307、309、311、329、385、387、433或435处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入、以及其组合。
[0071] 在其他方面中，工程化半胱氨酸氨基酸是选自在氨基酸位置258处或435处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入、以及其组合。
[0072] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含在此披露的一个或多个位置处的至少一种工程化半胱氨酸氨基酸(例如，位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、
386、387、401、402、411、417、433、435或439处，或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入)，并且任选地包含适于在本领域中描述的半胱氨酸工程化的另外位置处的另外工程化半胱氨酸，包括但不限于位置239、248、254、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、
324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、
415、418、422、440、441、442、443以及446。
386、387、401、402、411、417、433、435或439处，或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入)，并且任选地包含适于在本领域中描述的半胱氨酸工程化的另外位置处的另外工程化半胱氨酸，包括但不限于位置239、248、254、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、
324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、
415、418、422、440、441、442、443以及446。
[0073] 在示例性抗体1C1上鉴定适于在此披露的半胱氨酸工程化的位点。这些位置位于抗体的CH2和CH3结构域中，这些结构域在所有物种的抗体中是非常保守的。这些位点应当广泛适用于其他抗体，并且不另外需要特定抗体结构的结构设计或知识，并且不干扰该抗体可变结构域固有的抗原结合特性。
[0074] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置241处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含在氨基酸位置243处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及在氨基酸位置241、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、
293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、411、
417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置251处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、
291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置253处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、258、264、269、271、272、274、280、281、285、
288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含在氨基酸位置243处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及在氨基酸位置241、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、
293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、411、
417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置251处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、
291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置253处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、258、264、269、271、272、274、280、281、285、
288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0075] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置258处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置264处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、269、271、272、274、280、281、285、
288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置264处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、269、271、272、274、280、281、285、
288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0076] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置269处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0077] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置271处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置272处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、274、280、281、285、
288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置272处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、274、280、281、285、
288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0078] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置274处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置280处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、281、285、
288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置280处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、281、285、
288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0079] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置281处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0080] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置285处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置288处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置291处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、
281、285、288、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、
401、402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置288处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置291处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、
281、285、288、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、
401、402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0081] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置293处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置294处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置294处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0082] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置296处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置301处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置301处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0083] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置307处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置309处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置309处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0084] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置311处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置318处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置318处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0085] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置329处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、340、341、345、357、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置340处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置340处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0086] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置341处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、345、357、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置345处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置345处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0087] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置357处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置385处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置385处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0088] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置386处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、387、401、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置387处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置387处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、401、
402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0089] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置401处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、402、
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置402处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、
401、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置402处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、
401、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0090] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置411处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置417处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、
401、402、411、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
402、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置417处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、
401、402、411、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0091] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置433处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置435处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、
401、402、411、417、433或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
402、411、417、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置435处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、
285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、
401、402、411、417、433或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。
[0092] 在一些方面中，该轭合化合物包含(i)在氨基酸位置439处的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433或435处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，轭合化合物包含(i)在位置239与240之间插入的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、
281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、
387、401、402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸。
402、411、417、433或435处的第二工程化半胱氨酸氨基酸或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入。在一些方面中，轭合化合物包含(i)在位置239与240之间插入的工程化半胱氨酸氨基酸，以及(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、
281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、
387、401、402、411、417、433、435或439处的第二工程化半胱氨酸氨基酸。
[0093] 在一些方面中，轭合化合物包含在Fc结构域的CH2和/或CH3结构域中的至少一个半胱氨酸工程化。在一些方面中，轭合化合物包含
(i)在CH2结构域中的一种工程化半胱氨酸氨基酸，或
(ii)在CH3结构域中的一种工程化半胱氨酸氨基酸，或
(iii)在CH2结构域中的多于一种的工程化半胱氨酸氨基酸，或
(iv)在CH3结构域中的多于一种的工程化半胱氨酸氨基酸，或
(v)在CH2结构域中的一种工程化半胱氨酸氨基酸和在CH3结构域中的一种工程化半胱
氨酸氨基酸，或
(vi)在CH2结构域中的一种工程化半胱氨酸氨基酸和在CH3结构域中的多于一种的工
程化半胱氨酸氨基酸，或
(vii)在CH2结构域中的多于一种的工程化半胱氨酸氨基酸和在CH3结构域中的一种工
程化半胱氨酸氨基酸，或
(viii)在CH2结构域中的多于一种的工程化半胱氨酸氨基酸和在CH3结构域中的多于
一种的工程化半胱氨酸氨基酸，
其中这些工程化半胱氨酸氨基酸是选自：
(i)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、
291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的半胱氨酸氨基酸取代，位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；或者，
(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、271、285、288、291、296、301、307、309、
311、329、385、387、433或435处的半胱氨酸氨基酸取代，在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；或者，
(iii)在氨基酸位置258或435处的氨基酸取代，或在位置239与240之间的半胱氨酸氨
基酸插入。
(i)在CH2结构域中的一种工程化半胱氨酸氨基酸，或
(ii)在CH3结构域中的一种工程化半胱氨酸氨基酸，或
(iii)在CH2结构域中的多于一种的工程化半胱氨酸氨基酸，或
(iv)在CH3结构域中的多于一种的工程化半胱氨酸氨基酸，或
(v)在CH2结构域中的一种工程化半胱氨酸氨基酸和在CH3结构域中的一种工程化半胱
氨酸氨基酸，或
(vi)在CH2结构域中的一种工程化半胱氨酸氨基酸和在CH3结构域中的多于一种的工
程化半胱氨酸氨基酸，或
(vii)在CH2结构域中的多于一种的工程化半胱氨酸氨基酸和在CH3结构域中的一种工
程化半胱氨酸氨基酸，或
(viii)在CH2结构域中的多于一种的工程化半胱氨酸氨基酸和在CH3结构域中的多于
一种的工程化半胱氨酸氨基酸，
其中这些工程化半胱氨酸氨基酸是选自：
(i)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、
291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、
411、417、433、435或439处的半胱氨酸氨基酸取代，位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；或者，
(ii)在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、271、285、288、291、296、301、307、309、
311、329、385、387、433或435处的半胱氨酸氨基酸取代，在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；或者，
(iii)在氨基酸位置258或435处的氨基酸取代，或在位置239与240之间的半胱氨酸氨
基酸插入。
[0094] 在一些方面中，此类多于一种的工程化半胱氨酸氨基酸是两种、三种、四种或五种工程化半胱氨酸氨基酸。在一些方面中，CH2结构域中的工程化半胱氨酸氨基酸是在位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、
307、309、311、318、329、340处，或是插入在位置239与240之间。在一些方面中，CH2结构域中的工程化半胱氨酸氨基酸是在位置241、243、251、253、258、264、271、285、288、291、296、
301、307、309、311、329处，或是插入在位置239与240之间。在一些方面中，CH2结构域中的工程化半胱氨酸氨基酸是在位置258处，或是插入在位置239与240之间。在一些方面中，CH3结构域中的工程化半胱氨酸氨基酸是在位置341、345、357、385、386、387、401、402、411、417、
433、435或439处。在一些方面中，CH3结构域中的工程化半胱氨酸氨基酸是在位置385、387、
433或435处。在一些方面中，CH3结构域中的工程化半胱氨酸氨基酸是在位置435处。
307、309、311、318、329、340处，或是插入在位置239与240之间。在一些方面中，CH2结构域中的工程化半胱氨酸氨基酸是在位置241、243、251、253、258、264、271、285、288、291、296、
301、307、309、311、329处，或是插入在位置239与240之间。在一些方面中，CH2结构域中的工程化半胱氨酸氨基酸是在位置258处，或是插入在位置239与240之间。在一些方面中，CH3结构域中的工程化半胱氨酸氨基酸是在位置341、345、357、385、386、387、401、402、411、417、
433、435或439处。在一些方面中，CH3结构域中的工程化半胱氨酸氨基酸是在位置385、387、
433或435处。在一些方面中，CH3结构域中的工程化半胱氨酸氨基酸是在位置435处。
[0095] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含选自下组的半胱氨酸氨基酸取代，该组由以下各项组成：F241C、F243C、L251C、I253C、S254C、E258C、V264C、P271C、E272C、K274C、Q274C、D280C、G281C、H285C、K288C、P291C、E293C、E294C、Y296C、F296C、R301C、T307C、L309C、V309C、Q311C、E318C、P329C、K340C、G341C、E345C、E357C、G385C、Q386C、P387C、D401C、G402C、T411C、W417C、H433C、H435C、R435C、K439C、在S239与V240之间的半胱氨酸氨基酸插入，以及其组合。
[0096] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含选自下组的半胱氨酸氨基酸取代，该组由以下各项组成：F241C、F243C、L251C、I253C、E258C、V264C、P271C、H285C、K288C、P291C、Y296C、F296C、R301C、T307C、L309C、V309C、Q311C、P329C、G385C、P387C、H433C、H435C、在S239与V240之间的半胱氨酸氨基酸插入，以及其组合。
[0097] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含在CH2结构域中含有选自以下氨基酸取代的至少一个工程化半胱氨酸的Fc结构域：F241C、F243C、L251C、I253C、S254C、E258C、V264C、P271C、E272C、K274C、Q274C、D280C、G281C、H285C、K288C、P291C、E293C、E294C、Y296C、R301C、T307C、L309C、V309C、Q311C、E318C、P329C、K340C、在S239与V240之间的半胱氨酸氨基酸插入，以及其组合。
[0098] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含在CH3结构域中含有选自以下氨基酸取代的至少一个工程化半胱氨酸的Fc结构域：G341C、E345C、E357C、G385C、Q386C、P387C、D401C、G402C、T411C、W417C、H433C、H435C、R435C、K439C，以及其组合。
[0099] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含在CH2结构域中含有选自以下氨基酸取代的至少一个工程化半胱氨酸的Fc结构域：F241C、F243C、L251C、I253C、E258C、V264C、P271C、H285C、K288C、P291C、Y296C、R301C、T307C、L309C、Q311C、P329CC、在S239与V240之间的半胱氨酸氨基酸插入，以及其组合。在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含在CH3结构域中含有选自以下氨基酸取代的至少一个工程化半胱氨酸的Fc结构域：G385C、P387C、H433C、H435C，以及其组合。
[0100] 在具体方面中，在此披露的轭合化合物包含含有以下各项的Fc结构域：(a)在位于位置239处的丝氨酸(S)与位于位置240处的缬氨酸(V)之间插入的半胱氨酸
(C)；
(b)取代位于位置258处的谷氨酸(E)的半胱氨酸(C)；
(c)取代位于位置435处的组氨酸(H)的半胱氨酸(C)；
(d)取代位于位置435处的精氨酸(R)的半胱氨酸(C)；或者，
(e)其组合，
其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
(C)；
(b)取代位于位置258处的谷氨酸(E)的半胱氨酸(C)；
(c)取代位于位置435处的组氨酸(H)的半胱氨酸(C)；
(d)取代位于位置435处的精氨酸(R)的半胱氨酸(C)；或者，
(e)其组合，
其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
[0101] 本领域技术人员将理解，由于存在等位基因变体，因此在此披露的EU位置中的不同氨基酸可以被半胱氨酸替代。例如，在一些方面中，当亲本抗体是IgG3时，半胱氨酸(C)可以取代位于这种亲本抗体或其片段中的位置435处的精氨酸(R)。
[0102] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含选自下组的一种工程化半胱氨酸，该组由以下各项组成：在位置241、243、251、253、258、264、271、285、288、291、296、301、307、309、311、329、385、387、433、或435处的插入、或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含选自下组的一种工程化半胱氨酸，该组由以下各项组成：在位置258、435处的插入、或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
[0103] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含选自下组的两种工程化半胱氨酸，该组由以下各项组成：在位置241、243、251、253、258、264、271、285、288、291、296、301、307、309、311、329、385、387、433、或435处的插入、或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含选自下组的两种工程化半胱氨酸，该组由以下各项组成：在位置258、435处的插入、或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
[0104] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含选自下组的三种工程化半胱氨酸，该组由以下各项组成：在位置241、243、251、253、258、264、271、285、288、291、296、301、307、309、311、329、385、387、433、或435处的插入、或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含选自下组的三种工程化半胱氨酸，该组由以下各项组成：在位置258、435处的插入、或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
[0105] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含选自下组的四种工程化半胱氨酸，该组由以下各项组成：在位置241、243、251、253、258、264、271、285、288、291、296、301、307、309、311、329、385、387、433、或435处的插入、或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含选自下组的四种工程化半胱氨酸，该组由以下各项组成：在位置258、435处的插入、或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
[0106] 在一些方面中，该轭合化合物包含在位置258处的一种工程化半胱氨酸和在位置435处的第二半胱氨酸工程化。在一些方面中，该轭合化合物包含在位置258处的一种工程化半胱氨酸和在位置442处的第二半胱氨酸工程化。在一些方面中，该轭合化合物包含在位置435处的一种工程化半胱氨酸和在位置442处的第二半胱氨酸工程化。在一些方面中，该轭合化合物包含在位置258处的一种工程化半胱氨酸和在位置239与240之间的第二半胱氨酸工程化。在一些方面中，该轭合化合物包含在位置435处的一种工程化半胱氨酸和在位置
239与240之间的第二半胱氨酸工程化。在一些方面中，该轭合化合物包含在位置442处的一种工程化半胱氨酸和在位置239与240之间的第二半胱氨酸工程化。在一些方面中，该轭合化合物在位置258、435和442处的三种工程化半胱氨酸。在其他方面中，该轭合化合物包含在位置258、435处的两种工程化半胱氨酸，以及在位置239与240之间的第三半胱氨酸工程化。在其他方面中，该轭合化合物包含在位置258和442处的两种工程化半胱氨酸，以及在位置239与240之间的第三半胱氨酸工程化。在其他方面中，该轭合化合物包含在位置435和
442处的两种工程化半胱氨酸，以及在位置239与240之间的第三半胱氨酸工程化。在一些方面中，该轭合化合物包含在位置258、435和442处的三种工程化半胱氨酸，以及在位置239与
240之间的第四半胱氨酸工程化。
239与240之间的第二半胱氨酸工程化。在一些方面中，该轭合化合物包含在位置442处的一种工程化半胱氨酸和在位置239与240之间的第二半胱氨酸工程化。在一些方面中，该轭合化合物在位置258、435和442处的三种工程化半胱氨酸。在其他方面中，该轭合化合物包含在位置258、435处的两种工程化半胱氨酸，以及在位置239与240之间的第三半胱氨酸工程化。在其他方面中，该轭合化合物包含在位置258和442处的两种工程化半胱氨酸，以及在位置239与240之间的第三半胱氨酸工程化。在其他方面中，该轭合化合物包含在位置435和
442处的两种工程化半胱氨酸，以及在位置239与240之间的第三半胱氨酸工程化。在一些方面中，该轭合化合物包含在位置258、435和442处的三种工程化半胱氨酸，以及在位置239与
240之间的第四半胱氨酸工程化。
[0107] 在一些具体方面中，该轭合化合物包含半胱氨酸工程化抗体，该半胱氨酸工程化抗体包含一对或三种选自以下各项的工程化半胱氨酸：(i)在亲本抗体的位置258处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239与240之
间的半胱氨酸氨基酸插入；
(ii)在亲本抗体的位置289处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239与240之
间的半胱氨酸氨基酸插入；
(iii)在亲本抗体的位置339处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239与240
之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(iv)在亲本抗体的位置435处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239与240之
间的半胱氨酸氨基酸插入；
(v)在亲本抗体的位置442处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239与240之
间的半胱氨酸氨基酸插入；
(vi)在亲本抗体的位置258处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置289处
的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(vii)在亲本抗体的位置258处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置339处
的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(viii)在亲本抗体的位置258处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置435
处的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(ix)在亲本抗体的位置258处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置442处
的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(x)在亲本抗体的位置435处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置289处的
第二半胱氨酸氨基酸取代；
(xi)在亲本抗体的位置435处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置339处
的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(xii)在亲本抗体的位置435处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置442处
的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(xiii)在亲本抗体的位置258和289处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239
与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(xiv)在亲本抗体的位置258和339处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239
与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(xv)在亲本抗体的位置258和435处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239与
240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(xvi)在亲本抗体的位置258和442处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239
与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(xvii)在亲本抗体的位置289和339处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239
与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(xviii)在亲本抗体的位置339和435处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置
239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；以及
(xix)在亲本抗体的位置435和442处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239
与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
间的半胱氨酸氨基酸插入；
(ii)在亲本抗体的位置289处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239与240之
间的半胱氨酸氨基酸插入；
(iii)在亲本抗体的位置339处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239与240
之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(iv)在亲本抗体的位置435处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239与240之
间的半胱氨酸氨基酸插入；
(v)在亲本抗体的位置442处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239与240之
间的半胱氨酸氨基酸插入；
(vi)在亲本抗体的位置258处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置289处
的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(vii)在亲本抗体的位置258处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置339处
的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(viii)在亲本抗体的位置258处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置435
处的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(ix)在亲本抗体的位置258处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置442处
的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(x)在亲本抗体的位置435处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置289处的
第二半胱氨酸氨基酸取代；
(xi)在亲本抗体的位置435处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置339处
的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(xii)在亲本抗体的位置435处的第一半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置442处
的第二半胱氨酸氨基酸取代；
(xiii)在亲本抗体的位置258和289处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239
与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(xiv)在亲本抗体的位置258和339处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239
与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(xv)在亲本抗体的位置258和435处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239与
240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(xvi)在亲本抗体的位置258和442处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239
与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(xvii)在亲本抗体的位置289和339处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239
与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
(xviii)在亲本抗体的位置339和435处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置
239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；以及
(xix)在亲本抗体的位置435和442处的半胱氨酸氨基酸取代和在亲本抗体的位置239
与240之间的半胱氨酸氨基酸插入；
其中该氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
[0108] 本领域技术人员将理解，在一些方面中，由于包含Fc区的分子的同源二聚体性质，某个位置处的单个半胱氨酸残基工程化经常导致在所得抗体或Fc融合蛋白中的这个位置处显示两个半胱氨酸残基。在一些方面中，轭合化合物的Fc区可以用突变进行差别性工程化以便：促进和/或保持异源二聚体化(例如，嵌合突变、互补突变、锁定和停靠突变、突起入孔(knobs intoholes)突变、链交换工程化结构域(SEED)突变等)；改变半衰期(例如，增强FcRn结合)。因此，轭合化合物可以被工程化以便形成异源二聚体，该异源二聚体包含例如在此披露的一个Fc区或其片段中的某个位置处的一个半胱氨酸工程化(例如，在位置258处的半胱氨酸)，以及在此披露的第二Fc区或片段中的不同位置处的一个半胱氨酸工程化(例如，在位置435处的半胱氨酸工程化)。同样的工程化将适用于其中Fc区包含在此披露的特定位置处的两个、三个或四个半胱氨酸工程化的方面。类似地，两个Fc区可以包含在此披露的特定位置处的不同数量的工程化半胱氨酸，例如，一个Fc区可以包含一个、两个、三个或四个工程化半胱氨酸，而第二Fc区可以不包含工程化半胱氨酸，或者可以包含在此披露的特定位置处工程化的一个、两个、三个或四个半胱氨酸。
[0109] 在此披露的工程化半胱氨酸引入硫醇基，该硫醇基可以用于与各种异源分子衍生化(例如，以便生成诊断试剂、产生抗体药物轭合物、添加可以提高亲本抗体生物利用度的部分，或添加不同的抗原结合部分以生成例如双特异性抗体)。因此，工程化以上披露的EU位置中的一个或多个半胱氨酸可以得到具有占据所有引入的硫醇基的一个或多个异源分子的化合物，或其中多个硫醇基之一可供用于另外轭合的化合物。因此在一些方面中，出于轭合至异源分子的目的，轭合化合物包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个硫醇基。在一些方面中，出于轭合至异源分子的目的，轭合化合物包含多于16个硫醇基。
[0110] 在一些方面中，1、2、3或4个半胱氨酸氨基酸在图1和图2中指示的EU位置处被工程化。在一些方面中，其他半胱氨酸可以在适于本领域所述半胱氨酸工程化的另外的EU位置处被工程化。在一些方面中，其他氨基酸可以在本领域披露的另外的EU位置处被修饰。因此，在一些方面中，在此披露的轭合化合物进一步包含至少一种选自以下各项的工程化半胱氨酸残基：在氨基酸位置239、248、254、273、279、282、286、287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、
418、422、440、441、442、443以及446处的半胱氨酸氨基酸取代。
418、422、440、441、442、443以及446处的半胱氨酸氨基酸取代。
[0111] 包含CH2和/或CH3结构域的抗体或其片段的任何形式可以如在此所披露地被工程化，即，它可以突变。例如，亲本Fc抗体片段可以被工程化以形成半胱氨酸工程化Fc片段。类似地，亲本单克隆抗体可以如在此所披露地被半胱氨酸工程化。在此披露的设计、选择和制备方法以及本领域已知的方法能够产生具有在此披露的EU位置处的半胱氨酸工程化的抗
体，并且还能够产生在指定的、设计的、选择性位点处具有药物分子的轭合化合物，诸如抗体药物轭合物(ADC)化合物。工程化半胱氨酸残基允许通过硫醇反应性基团(诸如马来酰亚胺或卤代乙酰基)特异性轭合异源部分(例如，药物部分)。
体，并且还能够产生在指定的、设计的、选择性位点处具有药物分子的轭合化合物，诸如抗体药物轭合物(ADC)化合物。工程化半胱氨酸残基允许通过硫醇反应性基团(诸如马来酰亚胺或卤代乙酰基)特异性轭合异源部分(例如，药物部分)。
[0112] 因此，本披露提供一种制备轭合化合物的方法，该方法包括使半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的至少一个工程化半胱氨酸基团与异源部分反应，其中该抗体或Fc融合蛋白的Fc结构域包含至少一种选自以下各项的工程化半胱氨酸氨基酸：在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、
309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、411、417、433、435或439处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，以及其组合，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特(Kabat)所列的EU索引。在一些方面中，工程化半胱氨酸氨基酸是选自在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、271、285、288、291、296、301、307、309、311、
329、385、387、433或435处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入、以及其组合。在其他方面中，工程化半胱氨酸氨基酸是选自在氨基酸位置258处或435处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，以及其组合。
309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、411、417、433、435或439处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，以及其组合，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特(Kabat)所列的EU索引。在一些方面中，工程化半胱氨酸氨基酸是选自在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、271、285、288、291、296、301、307、309、311、
329、385、387、433或435处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入、以及其组合。在其他方面中，工程化半胱氨酸氨基酸是选自在氨基酸位置258处或435处的半胱氨酸氨基酸取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，以及其组合。
[0113] 在一些方面中，在选自241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、
401、402、411、417、433、435、439的氨基酸位置的工程化半胱氨酸以及在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入(其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引)的轭合效率是
当可比较的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的工程化半胱氨酸基团与具有在氨基酸位
置289处的半胱氨酸氨基酸取代的异源部分反应(其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列
的EU索引)时所获得的轭合效率的至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少55％、至少约
60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少90％、至少约
95％或至少约100％。
401、402、411、417、433、435、439的氨基酸位置的工程化半胱氨酸以及在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入(其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引)的轭合效率是
当可比较的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的工程化半胱氨酸基团与具有在氨基酸位
置289处的半胱氨酸氨基酸取代的异源部分反应(其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列
的EU索引)时所获得的轭合效率的至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少55％、至少约
60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少90％、至少约
95％或至少约100％。
[0114] 在一些方面中，该轭合效率是当可比较的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的工程化半胱氨酸基团与具有在氨基酸位置289处的半胱氨酸氨基酸取代的异源部分反应时所获得的轭合效率的至少50％，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。在一些方面中，该轭合效率是当可比较的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的工程化半胱氨酸基团与具有在氨基酸位置289处的半胱氨酸氨基酸取代的异源部分反应时所获得的轭合效率的至少80％，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。在其他方面中，该轭合效率是当可比较的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的工程化半胱氨酸基团与具有在氨基酸位置289处的半胱氨酸氨基酸取代的异源部分反应时所获得的轭合效率的多于100％，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
[0115] 在某些方面中，在此披露的轭合化合物可以根据以下一般过程制得：(i)通过以下各项诱变(例如通过定点诱变)编码抗体或Fc融合蛋白的至少一个核酸序
列
(a)用编码半胱氨酸(C)氨基酸的密码子替代在氨基酸位置241、243、251、253、258、
264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、
340、341、345、357、385、386、387、401、402、411、417、433、435或439处的至少一个密码子，或在编码位置239和240处的氨基酸的密码子之间插入编码半胱氨酸(C)的密码子，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引；或者
(b)用编码半胱氨酸(C)氨基酸的密码子替代在氨基酸位置241、243、251、253、258、
264、271、285、288、291、296、301、307、309、311、329、385、387、433或435处的至少一个密码子，或在编码位置239和240处的氨基酸的密码子之间插入编码半胱氨酸(C)的密码子，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引；或者
(c)用编码半胱氨酸(C)氨基酸的密码子替代在氨基酸位置258或435处的至少一个密
码子，或在编码位置239和240处的氨基酸的密码子之间插入编码半胱氨酸(C)的密码子，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引；
(ii)表达该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白；
(ii)分离该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白；以及
(iv)使该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的至少一个工程化半胱氨酸基团与异源
部分反应。
列
(a)用编码半胱氨酸(C)氨基酸的密码子替代在氨基酸位置241、243、251、253、258、
264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、
340、341、345、357、385、386、387、401、402、411、417、433、435或439处的至少一个密码子，或在编码位置239和240处的氨基酸的密码子之间插入编码半胱氨酸(C)的密码子，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引；或者
(b)用编码半胱氨酸(C)氨基酸的密码子替代在氨基酸位置241、243、251、253、258、
264、271、285、288、291、296、301、307、309、311、329、385、387、433或435处的至少一个密码子，或在编码位置239和240处的氨基酸的密码子之间插入编码半胱氨酸(C)的密码子，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引；或者
(c)用编码半胱氨酸(C)氨基酸的密码子替代在氨基酸位置258或435处的至少一个密
码子，或在编码位置239和240处的氨基酸的密码子之间插入编码半胱氨酸(C)的密码子，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引；
(ii)表达该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白；
(ii)分离该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白；以及
(iv)使该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的至少一个工程化半胱氨酸基团与异源
部分反应。
[0116] 在某些方面中，在此披露的轭合化合物可以根据以下一般过程制得：(i)将编码可变重链区或异源蛋白质的核酸序列可操作地连接至编码Fc区蛋白质的核
酸序列，其中编码该Fc区蛋白质的核酸序列包含：
(a)编码在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、
288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的半胱氨酸的或在编码位置239和240处的氨基酸的密码子之间插入的至少一个密码子，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引；或者
(b)编码在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、271、285、288、291、296、301、307、
309、311、329、385、387、433或435处的半胱氨酸的或在编码位置239和240处的氨基酸的密码子之间插入的至少一个密码子，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引；或者(c)编码在氨基酸位置258或435处的半胱氨酸的或在编码位置239和240处的氨基酸的
密码子之间插入的至少一个密码子，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引；
(ii)表达该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白；
(ii)分离该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白；以及
(iv)使该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的至少一个工程化半胱氨酸基团与异源
部分反应。
酸序列，其中编码该Fc区蛋白质的核酸序列包含：
(a)编码在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、
288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、
402、411、417、433、435或439处的半胱氨酸的或在编码位置239和240处的氨基酸的密码子之间插入的至少一个密码子，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引；或者
(b)编码在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、271、285、288、291、296、301、307、
309、311、329、385、387、433或435处的半胱氨酸的或在编码位置239和240处的氨基酸的密码子之间插入的至少一个密码子，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引；或者(c)编码在氨基酸位置258或435处的半胱氨酸的或在编码位置239和240处的氨基酸的
密码子之间插入的至少一个密码子，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引；
(ii)表达该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白；
(ii)分离该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白；以及
(iv)使该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的至少一个工程化半胱氨酸基团与异源
部分反应。
[0117] 在一些方面中，约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、或约95％的异源部分化学轭合到在选自241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、
311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、411、417、433、435、439氨基酸位置的工程化半胱氨酸以及在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引，这些异源部分在血清孵育3天后是完整的。在一些方面中，至少70％的化学轭合的异源部分在血清孵育3天后是完整的。在一些方面中，约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、或约95％的化学轭合的异源部分在血清孵育7天后是完整的。在其他方面中，至少70％的化学轭合的异源部分在血清孵育7天后是完整的。
311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、411、417、433、435、439氨基酸位置的工程化半胱氨酸以及在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引，这些异源部分在血清孵育3天后是完整的。在一些方面中，至少70％的化学轭合的异源部分在血清孵育3天后是完整的。在一些方面中，约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、或约95％的化学轭合的异源部分在血清孵育7天后是完整的。在其他方面中，至少70％的化学轭合的异源部分在血清孵育7天后是完整的。
[0118] 在一些方面中，约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、或约95％的异源部分化学轭合至选自258、435的氨基酸位置处的工程化半胱氨酸以及位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引，这些异源部分在血清孵育3天后是完整的。在一些方面中，至少70％的化学轭合的异源部分在血清孵育3天后是完整的。在一些方面中，约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约
80％、约85％、或约95％的化学轭合的异源部分在血清孵育7天后是完整的。在其他方面中，至少70％的化学轭合的异源部分在血清孵育7天后是完整的。
80％、约85％、或约95％的化学轭合的异源部分在血清孵育7天后是完整的。在其他方面中，至少70％的化学轭合的异源部分在血清孵育7天后是完整的。
[0119] 在一些方面中，包含化学轭合至在选自241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、
385、386、387、401、402、411、417、433、435、439的氨基酸位置处的工程化半胱氨酸以及在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入的异源部分的轭合化合物(其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引)在用血清孵育时经3天时段表现出小于约5％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、或约50％的活性损失。在一些方面中，轭合化合物在用血清孵育时经7天时段表现出小于约5％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约
40％、约45％、或约50％的活性损失。在其他方面中，轭合化合物在用血清孵育时经7天时段表现出小于约50％的活性损失。
385、386、387、401、402、411、417、433、435、439的氨基酸位置处的工程化半胱氨酸以及在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入的异源部分的轭合化合物(其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引)在用血清孵育时经3天时段表现出小于约5％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、或约50％的活性损失。在一些方面中，轭合化合物在用血清孵育时经7天时段表现出小于约5％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约
40％、约45％、或约50％的活性损失。在其他方面中，轭合化合物在用血清孵育时经7天时段表现出小于约50％的活性损失。
[0120] 在一些方面中，轭合化合物包含化学轭合至在选自258、435的氨基酸位置处的工程化半胱氨酸以及在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入的异源部分，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引，这些轭合化合物在用血清孵育时经3天时段表现出小于约5％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、或约50％的活性损失。在一些方面中，轭合化合物在用血清孵育时经7天时段表现出小于约5％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、或约50％的活性损失。在其他方面中，轭合化合物在用血清孵育时经7天时段表现出小于约50％的活性损失。
[0121] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含化学轭合至工程化半胱氨酸的至少一个异源部分。在其他方面中，轭合化合物包含至少两个、至少三个、或至少四个异源部分，其中至少一个异源部分轭合至工程化半胱氨酸。在其他方面中，轭合化合物包含至少两个、至少三个、或至少四个异源部分，其中这些异源部分中的每个均轭合至工程化半胱氨酸。在一些方面中，轭合化合物包含至少6、8、10、12、14、16或更多个异源部分，其中至少一个异源部分轭合至工程化半胱氨酸。在一些方面中，轭合化合物包含至少6、8、10、12、14、16或更多个异源部分，其中这些异源部分中的每个均轭合至工程化半胱氨酸。在某些方面中，所有异源部分是相同的。在其他方面中，至少一个异源部分是与其他异源部分不同的。
[0122] 在一些方面中，半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的Fc结构域是单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人抗体、或人源化抗体的一部分。
[0123] 在一些方面中，半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的Fc结构域是IgG Fc结构域或其片段。在一些方面中，此IgG Fc结构域或其片段是人类的。在一些方面中，该IgG是人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型或其片段。在一些方面中，半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的Fc结构域不包含全长CH2。在其他方面中，半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的Fc结构域不包含全长CH3结构域和/或全长CH4结构域。在一些方面中，Fc融合蛋白包含介导结合靶标的多肽。例如，该Fc融合蛋白可以包含选自下组的抗原结合结构域，该组由以下各项组成：(a)scFv；(b)双抗体；(c)Fd片段；(d)Fv片段；(e) (f)F(ab′)2片段；(g)FCABTM；以及(h)F(ab)片段。
[0124] 在一些方面中，半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白可以包含Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd、单链Fv或scFv、双硫化物连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、内抗体、IgG△CH2、迷你抗体、F(ab′)3、四体抗体、三体抗体、双体抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2、或scFv-Fc。
[0125] 在一些方面中，Fc融合蛋白包含蛋白质支架(例如，腱生蛋白或纤维连接蛋白来源的支架)或抗体模拟物。在其他方面中，Fc融合蛋白包含选自下组的多肽，该组由(a)配体、(b)酶、(c)受体的配体结合部分、以及(d)粘着蛋白组成。
[0126] 在其他方面中，半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的Fc结构域是突变体Fc结构域。Fc结构域中的许多突变已在文献中描述。例如，Fc结构域突变在PCT公开号WO2012/
064733、WO2013/093809、WO2008/070593、以及WO1996/014339；美国公开号US2007/
0269369、US2007/0111260、以及US2010/0297103；以及美国专利号7,855,275中描述，所有这些专利通过引用以其全部内容结合在此。在一些方面中，半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的Fc结构域包含选自下组的至少一个非天然发生的氨基酸残基，该组由以下各项组
成：234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、2341、234V、234F 235A、235D、235R、235W、
235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239A、239D、239E、239N、
239Q、239F、239T、239H、239Y、2401、240A、240T、240M、241W、241L、241Y 241 E、241 R.243W、
243L 243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T 255L、256E、256M、
2621、262A、262T、262E、2631、263A、263T、263M、264L、2641、264W、264T 264R、264F、264M、
264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、2651、265L、265H、265T 2661、266A、266T、
266M、267Q、267L、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P 292L、296E、296Q、296D、296N、
296S、296T、296L、2961、296H、269G、297S、297D、297E、298H 2981、298T、298F、2991、299L、
299A、299S、299V、299H、299F、299E、3051、313F、316D、325Q、325L、3251、325D、325E、325A、
325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、3281、
328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、3301、
330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、3311、
331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D，332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、
332H、332Y、332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Y、以及443W，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
064733、WO2013/093809、WO2008/070593、以及WO1996/014339；美国公开号US2007/
0269369、US2007/0111260、以及US2010/0297103；以及美国专利号7,855,275中描述，所有这些专利通过引用以其全部内容结合在此。在一些方面中，半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的Fc结构域包含选自下组的至少一个非天然发生的氨基酸残基，该组由以下各项组
成：234D、234E、234N、234Q、234T、234H、234Y、2341、234V、234F 235A、235D、235R、235W、
235P、235S、235N、235Q、235T、235H、235Y、235I、235V、235F、236E、239A、239D、239E、239N、
239Q、239F、239T、239H、239Y、2401、240A、240T、240M、241W、241L、241Y 241 E、241 R.243W、
243L 243Y、243R、243Q、244H、245A、247L、247V、247G、251F、252Y、254T 255L、256E、256M、
2621、262A、262T、262E、2631、263A、263T、263M、264L、2641、264W、264T 264R、264F、264M、
264Y、264E、265G、265N、265Q、265Y、265F、265V、2651、265L、265H、265T 2661、266A、266T、
266M、267Q、267L、269Y、269F、269R、270E、280A、284M、292P 292L、296E、296Q、296D、296N、
296S、296T、296L、2961、296H、269G、297S、297D、297E、298H 2981、298T、298F、2991、299L、
299A、299S、299V、299H、299F、299E、3051、313F、316D、325Q、325L、3251、325D、325E、325A、
325T、325V、325H、327G、327W、327N、327L、328S、328M、328D、328E、328N、328Q、328F、3281、
328V、328T、328H、328A、329F、329H、329Q、330K、330G、330T、330C、330L、330Y、330V、3301、
330F、330R、330H、331G、331A、331L、331M、331F、331W、331K、331Q、331E、331S、331V、3311、
331C、331Y、331H、331R、331N、331D、331T、332D，332S、332W、332F、332E、332N、332Q、332T、
332H、332Y、332A、339T、370E、370N、378D、392T、396L、416G、419H、421K、440Y、以及443W，其中氨基酸位置编号是根据卡巴特所列的EU索引。
[0127] 在一些方面中，半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的Fc结构域已减少与Fc受体的结合从而减小例如经由ADCC的细胞毒性。在一些方面中，半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的Fc结构域已增加与Fc受体的结合从而增大例如经由ADCC的细胞毒性。
[0128] 某些修饰可以提供所希望的效应子功能或血清半衰期。在希望消除或减少效应子功能以便于最小化副作用或治疗并发症的情况下，可以使用某些其他Fc区。抗体和Fc融合蛋白的Fc区可以被修饰来提高对FcRn的结合亲和力并且因此增加血清半衰期。因此，在一些方面中，半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的Fc结构域已减少与Fc受体FcRn的结合。
[0129] 在一些方面中，半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的Fc结构域包含选自下组的一个或多个位置处的非天然发生的ADCC降低的氨基酸残基，该组由以下各项组成：如通过在卡巴特中列出的EU索引来编号的234、235、236、237、238、239、240、241、243、244、245、247、251、252、254、255、256、262、263、264、265、266、267、269、279、280、284、292、296、297、298、
299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、
378、392、416、419、421、440以及443。能够减小抗体ADCC活性的许多特定突变是本领域已知的，并且包括例如234F、235E、235F、235Q(或235Y)、239A、332Q、331S以及其组合。例如，参见WO8807089、WO9958572、WO9951642、WO2012175751、WO2011149999、WO2011066501、
WO2000042072、WO2011120134中描述的突变，这些专利通过引用以其全部内容结合在此。具有降低ADCC效应子功能的抗体还包括具有在Fc区残基238、265、269、270、297、327以及329中的一个或多个的取代的那些抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体还包括具有在氨基酸位置265、269、270、297以及327中的两个或更多个位置处的取代的Fc突变体，包括具有残基265和297到丙氨酸的取代的Fc突变体(美国专利号7,332,581)。任选地，可以并入降低ADCC和CDC两者的突变。
(a)异源部分
299、305、313、316、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、339、341、343、370、373、
378、392、416、419、421、440以及443。能够减小抗体ADCC活性的许多特定突变是本领域已知的，并且包括例如234F、235E、235F、235Q(或235Y)、239A、332Q、331S以及其组合。例如，参见WO8807089、WO9958572、WO9951642、WO2012175751、WO2011149999、WO2011066501、
WO2000042072、WO2011120134中描述的突变，这些专利通过引用以其全部内容结合在此。具有降低ADCC效应子功能的抗体还包括具有在Fc区残基238、265、269、270、297、327以及329中的一个或多个的取代的那些抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体还包括具有在氨基酸位置265、269、270、297以及327中的两个或更多个位置处的取代的Fc突变体，包括具有残基265和297到丙氨酸的取代的Fc突变体(美国专利号7,332,581)。任选地，可以并入降低ADCC和CDC两者的突变。
(a)异源部分
[0130] 在此披露的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白可以与能够通过反应性半胱氨酸硫醇基共价附接至半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的任何异源部分轭合。在一个示例性方面中，轭合化合物包含半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白和异源部分，其中该异源部分通过一个或多个工程化半胱氨酸附接到半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白。在一些方面
中，一个或多个接头被插入在异源部分与半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白之间。因此，本披露的轭合化合物可以由化学式CEP-(L-H)p表示，其中CEP是半胱氨酸工程化蛋白(即，抗体或Fc融合蛋白)，L是接头，H是异源部分，并且p是1、2、3或4。可以经由工程化半胱氨酸的硫醇基轭合至半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的异源部分数目受到如在此披露地引入
的半胱氨酸残基数目的限制。因此，上述化学式是指其中半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白包含1、2、3或4个工程化半胱氨酸氨基酸的轭合化合物。
中，一个或多个接头被插入在异源部分与半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白之间。因此，本披露的轭合化合物可以由化学式CEP-(L-H)p表示，其中CEP是半胱氨酸工程化蛋白(即，抗体或Fc融合蛋白)，L是接头，H是异源部分，并且p是1、2、3或4。可以经由工程化半胱氨酸的硫醇基轭合至半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的异源部分数目受到如在此披露地引入
的半胱氨酸残基数目的限制。因此，上述化学式是指其中半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白包含1、2、3或4个工程化半胱氨酸氨基酸的轭合化合物。
[0131] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含在这些工程化半胱氨酸之一处轭合的至少一个异源部分，其中此异源部分是毒素、药物、放射性核素、免疫调节剂、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子、肿瘤坏死因子、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微小RNA、肽核酸、光敏治疗剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、非天然氨基酸、肽、脂质、碳水化合物、支架分子、荧光标签、可视化肽、生物素、血清半衰期延长剂、捕获标签、螯合剂、固相支撑体、或其组合。在此披露的工程化半胱氨酸可以与能够共价附接至反应性半胱氨酸硫醇基的任何异源部分轭合(辛格(Singh)等人(2002))分析生物化学304：147-15；哈洛E.(Harlow E.)和莱恩，D.(Lane，D.)(1999)使用抗体：实验室手册(Using
Antibodies：A Laboratory Manual)，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold
SpringsHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)；伦布拉德R.L.(Lundblad R.L.)(1991)用于蛋白质修饰的化学试剂(Chemical Reagents for Protein
Modification)，第2版，佛罗里达州波卡拉顿的CRC出版社(CRC Press，Boca Raton，
Fla.))。
Antibodies：A Laboratory Manual)，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold
SpringsHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)；伦布拉德R.L.(Lundblad R.L.)(1991)用于蛋白质修饰的化学试剂(Chemical Reagents for Protein
Modification)，第2版，佛罗里达州波卡拉顿的CRC出版社(CRC Press，Boca Raton，
Fla.))。
[0132] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含在这些工程化半胱氨酸之一处轭合的至少一个异源部分，其中此异源部分是药物。在一些方面中，该药物是氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲、吉西他滨、三氮烯、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶抑制剂、表鬼臼毒素、铂配位化合物、长春花生物碱、取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素拮抗剂、内皮抑素、紫杉醇、喜树碱、SN-38、阿霉素、阿霉素类似物、抗代谢物、烷化剂、抗有丝分裂剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、mTOR抑制剂、热休克蛋白(HSP90)抑制剂、蛋白体抑制剂、HDAC抑制剂、促凋亡剂、甲氨蝶呤、CPT-11、或其组合，并且其中轭合是在这些工程化半胱氨酸之一处。在具体方面中，该药物是氨磷汀、顺铂、达卡巴嗪、更生霉素、氮芥、链佐星、环磷酰胺、卡莫司汀(carrnustine)、洛莫司汀、阿霉素脂、吉西他滨、柔红霉素、柔红霉素脂、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、紫杉醇、多西他赛、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、克拉屈滨、10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)、吉非替尼、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司钠、干扰素α、干扰素β、依立替康、米托蒽醌、拓扑替康、亮丙立德、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、链佐星、他莫昔芬、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、苯丁酸氮芥芳香酶抑制剂，以及其组合。
[0133] 在一些方面中，该药物是奥瑞斯他汀(auristatin，美国专利号5,635,483；5,780,588)，例如MMAE(单甲基奥瑞斯他汀E)或MMAF(单甲基奥瑞斯他汀F)。在其他方面中，该药物是多拉司他汀或多拉司他汀肽类似物或衍生物。多拉司他汀和奥瑞斯他汀已显示干扰微管动力学、GTP水解以及核与细胞分裂(沃伊克(Woyke)等人，抗微生物制剂与化学疗法
(Antimicrob.Agents and Chemother)45：3580-3584(2001))并且具有抗癌活性(美国专利号5,663,149)。多拉司他汀或奥瑞斯他汀药物部分可以通过肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端附接到轭合化合物(参见，例如WO2002088172)。
(Antimicrob.Agents and Chemother)45：3580-3584(2001))并且具有抗癌活性(美国专利号5,663,149)。多拉司他汀或奥瑞斯他汀药物部分可以通过肽药物部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端附接到轭合化合物(参见，例如WO2002088172)。
[0134] 在其他方面中，该药物是美登木素生物碱。在一些方面中，该美登木素生物碱是N 2′-脱乙酰基-N 2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)、N 2′-脱乙酰基-N2′-(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(DM3)或N 2′-脱乙酰基-N 2′(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素
(DM4)。美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合而起作用的有丝分裂抑制剂。美登素从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)中首次分离(美国专利号3,896,111)。随后地，发现某些微生物也产生诸如美登醇和C-3美登醇酯的美登木素生物碱(美国专利号4,151,042)。
例如，在美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；
4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,
348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；以及4,371,533中披露了合成的美登醇以及其衍生物和类似物。
(DM4)。美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合而起作用的有丝分裂抑制剂。美登素从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)中首次分离(美国专利号3,896,111)。随后地，发现某些微生物也产生诸如美登醇和C-3美登醇酯的美登木素生物碱(美国专利号4,151,042)。
例如，在美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；
4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,
348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；以及4,371,533中披露了合成的美登醇以及其衍生物和类似物。
[0135] 美登木素生物碱药物部分是抗体药物轭合物中有吸引力的药物部分，因为它们：(i)通过发酵或化学修饰、发酵产物的衍生相对易于制备，(ii)可以与适于通过非二硫化接头轭合至抗体的官能团进行衍生作用，(iii)在血浆中稳定，以及(iv)有效抵抗各种肿瘤细胞系。在美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0425235B1；刘(Liu)等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93：8618-8623(1996)(描述的包含名为DM1的美登木素生物碱的免疫轭合物)；以及沙里(Chari)等人，癌症研究(CancerResearch)52：127-
131(1992)中描述了含有美登木素生物碱的轭合物、制备该轭合物的方法以及它们的治疗性用途。
131(1992)中描述了含有美登木素生物碱的轭合物、制备该轭合物的方法以及它们的治疗性用途。
[0136] 美登木素生物碱轭合化合物可以通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接来制备，而不显著减小抗体或美登木素生物碱分子的生物活性。参见，例如，美国专利号5,
208,020。每个抗体分子轭合的平均3-4个美登木素生物碱分子已显示出增强靶细胞的细胞毒性而不消极地影响抗体的功能或溶解度的功效，尽管预期甚至一个毒素/抗体分子相对于使用裸抗体增强细胞毒性。美登木素生物碱是本领域中熟知的并且可以通过已知技术合成或从天然来源分离。例如在美国专利号5,208,020中披露了适合的美登木素生物碱。示例性美登木素生物碱药物部分包括具有修饰芳环的那些，诸如：C-19-脱氯(美国专利号4,
256,746)(通过氢化锂铝还原安丝菌素(ansamytocin)P2来制备)；C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利号4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌属或放线菌进行
脱甲基作用或使用LAH进行脱氯作用来制备)；以及C-20-脱甲基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-脱氯(美国专利号4,294,757)(通过使用酰氯进行酰化作用来制备)，以及具有在其他位置处的修饰的那些药物部分。示例性美登木素生物碱药物部分还包括具有诸如以下修饰的那些：C-9-SH(美国专利号4,424,219)(通过美登醇与H2S或P2S5反应来制备)；C-14-烷氧基甲基(脱甲基/CH2OR)(美国专利号4,331,598)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利号4,450,254)(由诺卡氏菌属制备)；C-15-羟基/酰氧基(美国专利号4,364,866)(通过用链霉菌属转化美登醇来制备)；C-15-甲氧基(美国专利号4,313,946和4,315,929)(从滑桃树(Trewia nudlflora)分离)；C-18-N-脱甲基(美国专利号4,362,663和4,322,
348)(通过由链霉菌属脱甲基美登醇来制备)；以及4，5-脱氧(美国专利号4,371,533)(通过三氯化钛/LAH还原美登醇来制备)。根据连接的类型，已知美登素化合物上的许多位置适用作连接位置。例如，对于形成酯键，具有羟基的C-3位置、用羟甲基修饰的C-14位置、用羟基修饰的C-15位置以及具有羟基的C-20位置均是适合的。
208,020。每个抗体分子轭合的平均3-4个美登木素生物碱分子已显示出增强靶细胞的细胞毒性而不消极地影响抗体的功能或溶解度的功效，尽管预期甚至一个毒素/抗体分子相对于使用裸抗体增强细胞毒性。美登木素生物碱是本领域中熟知的并且可以通过已知技术合成或从天然来源分离。例如在美国专利号5,208,020中披露了适合的美登木素生物碱。示例性美登木素生物碱药物部分包括具有修饰芳环的那些，诸如：C-19-脱氯(美国专利号4,
256,746)(通过氢化锂铝还原安丝菌素(ansamytocin)P2来制备)；C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利号4,361,650和4,307,016)(通过使用链霉菌属或放线菌进行
脱甲基作用或使用LAH进行脱氯作用来制备)；以及C-20-脱甲基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-脱氯(美国专利号4,294,757)(通过使用酰氯进行酰化作用来制备)，以及具有在其他位置处的修饰的那些药物部分。示例性美登木素生物碱药物部分还包括具有诸如以下修饰的那些：C-9-SH(美国专利号4,424,219)(通过美登醇与H2S或P2S5反应来制备)；C-14-烷氧基甲基(脱甲基/CH2OR)(美国专利号4,331,598)；C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利号4,450,254)(由诺卡氏菌属制备)；C-15-羟基/酰氧基(美国专利号4,364,866)(通过用链霉菌属转化美登醇来制备)；C-15-甲氧基(美国专利号4,313,946和4,315,929)(从滑桃树(Trewia nudlflora)分离)；C-18-N-脱甲基(美国专利号4,362,663和4,322,
348)(通过由链霉菌属脱甲基美登醇来制备)；以及4，5-脱氧(美国专利号4,371,533)(通过三氯化钛/LAH还原美登醇来制备)。根据连接的类型，已知美登素化合物上的许多位置适用作连接位置。例如，对于形成酯键，具有羟基的C-3位置、用羟甲基修饰的C-14位置、用羟基修饰的C-15位置以及具有羟基的C-20位置均是适合的。
[0137] 在一些方面中，该药物是加利车霉素。抗生素的加利车霉素家族能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂。对于制备加利车霉素家族的轭合物，参见例如，美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,
296。可以使用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG以及θ11(辛曼(Hinman)等人，癌症研究53：3336-3342(1993)；洛德(Lode)等人，癌症研究
58：2925-2928(1998)；以及上述的美国氰胺公司(American Cyanamid)的美国专利)。
296。可以使用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG以及θ11(辛曼(Hinman)等人，癌症研究53：3336-3342(1993)；洛德(Lode)等人，癌症研究
58：2925-2928(1998)；以及上述的美国氰胺公司(American Cyanamid)的美国专利)。
[0138] 在一些方面中，该药物是微管溶素。微管溶素是从粘细菌物种分离出的一类天然产物中的成员(沙瑟(Sasse)等人，抗生素杂质(J.Antibiot)53：879-885(2000))。作为细胞骨架相互作用剂，微管溶素是抑制微管蛋白聚合并且导致细胞周期停滞和细胞凋亡的有丝分裂毒物(斯坦梅茨(Steinmetz)等人，国际版应用化学(Chem.Int.Ed)43：4888-4892(2004)；卡里尔(Khalil)等人，生物化学(ChemBioChem.7)：678-683(2006)；考尔(Kaur)等人，生物化学杂志(Biochem.J)396：235-242(2006))。微管溶素是极强的细胞毒性分子，超过了任何临床相关传统化学治疗剂(例如，埃博霉素、紫杉醇和长春碱)的细胞生长抑制。此外，它们有效抵抗多重耐药性细胞系(德姆林(Domling)等人，分子多样性(Mol.Diversity)
9：141-147(2005))。这些化合物在低皮摩尔范围中显示针对具有IC50值的一组癌细胞系测试的高细胞毒性；因此，它们作为抗癌治疗是有意义的。参见，例如，WO2012019123，该专利各自通过引用以其全文结合在此。例如在美国专利号7,776,814中披露了微管溶素轭合物。
9：141-147(2005))。这些化合物在低皮摩尔范围中显示针对具有IC50值的一组癌细胞系测试的高细胞毒性；因此，它们作为抗癌治疗是有意义的。参见，例如，WO2012019123，该专利各自通过引用以其全文结合在此。例如在美国专利号7,776,814中披露了微管溶素轭合物。
[0139] 在一些方面中，该药物是吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)。PBD是相对小的分子并且一些具有识别并共价结合DNA小沟中的特异性序列的能力并且因此展现抗生素/抗肿瘤活性。许多PBD及其衍生物是本领域已知的，例如PBD二聚体(例如，SJG-136或SG2000)、C2不饱和PBD二聚体、带有C2芳基取代的吡咯并苯并二氮杂卓二聚体(例如，SG2285)、通过水解活化的PBD二聚体前药(例如，SG2285)，以及聚吡咯PBD(例如，SG2274)。在WO 2000/012507、WO
2007/039752、WO 2005/110423、WO 2005/085251以及WO 2005/040170，以及美国专利号7,
612,062中进一步描述PBD，这些专利各自均通过引用以其全部内容结合在此。
2007/039752、WO 2005/110423、WO 2005/085251以及WO 2005/040170，以及美国专利号7,
612,062中进一步描述PBD，这些专利各自均通过引用以其全部内容结合在此。
[0140] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含在这些工程化半胱氨酸之一处轭合的至少一个异源部分，其中此异源部分是毒素。在一些方面中，该毒素包括例如相思豆毒素、马钱子碱、毒芹素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、志贺毒素、内毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、霍乱毒素、镰叶芹醇、α毒素、格尔德霉素、白树毒素、百脉根苷、蓖麻毒素、番木鳖碱、河豚毒素、皂苷、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、或其组合。在其他方面中，该毒素包括例如蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、丝林霉素(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、新霉素、单端孢菌毒素(tricothecenes)或其组合。参见，例如，WO1993/021232。
[0141] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含在这些工程化半胱氨酸之一处轭合的至少一个异源部分，其中此异源部分是螯合剂。在一些方面中，该螯合剂是例如DTPA、EC、DMSA、EDTA、Cy-EDTA、EDTMP、DTPA、CyDTPA、Cy2DTPA、BOPTA、DTPA-MA、DTPA-BA、DTPMP、DOTA、TRITA、TETA、DOTMA、DOTA-MA、HP-DO3A、pNB-DOTA、DOTP、DOTMP、DOTEP、DOTPP、DOTBzP、DOTPME、HEDP、DTTP、N3S三酰胺硫醇、DADS、MAMA、DADT、N2S4联胺四硫醇、N2P2二硫醇-二膦、6-肼基烟酸、丙烯胺肟、四胺、环拉胺或其组合。
[0142] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含在这些工程化半胱氨酸之一处轭合的至少一个异源部分，其中此异源部分是放射性核素。在一些方面中，该放射性核素是例如铬(51Cr)、钴(57Co)、氟(18F)、钆(153Gd、159Gd)、锗(68Ge)、钬(166Ho)、铟(115In、113In、112In、111In)、碘(131I、125I、123I、121I)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、钯(103Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re)、铑(105Rh)、钌(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、锶(85Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、铊(201Tl)、锡(113Sn、117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb)、钇(90Y)、锌(65Zn)、或其组合。在一些具体方面中，该放射性核素通过螯合剂附接至轭合化合物。
[0143] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含在这些工程化半胱氨酸之一处轭合的至少一个异源部分，其中此异源部分是血清半衰期延长剂。在一些具体方面中，该血清半衰期延长剂包括例如白蛋白、白蛋白结合多肽、PAS、人绒毛膜促性腺激素C-末端肽(CTP)的β亚基、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、XTEN、白蛋白结合小分子、或其组合。
[0144] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含在这些工程化半胱氨酸之一处轭合的至少一个异源部分，其中此异源部分是可视化标记。可视化标记包括但不限于，发色团、荧光团、荧光蛋白、磷光染料、叠层染料、颗粒、半抗原、酶、放射性同位素或其组合。
[0145] 在一些方面中，该可视化标记是可视化肽。在一些方面中，该可视化肽能够在体外、体内、离体或其任何组合中可视化或定位轭合化合物。在一些方面中，该可视化肽是生物素受体肽、硫辛酸受体肽、荧光蛋白、用于连接双砷染料或用于轭合亚稳态锝的含半胱氨酸肽、用于轭合基于荧光共振能量转移(FRET)的亲近测定法所用的铕包合物的肽、或其任何组合。在一些方面中，该荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、或其任何组合。在一些方面中，该荧光蛋白是藻胆蛋白或其衍生物。荧光蛋白，特别是藻胆蛋白，适用于产生叠层染料标记的标记试剂。出于获得较大的斯托克斯位移的目的，这些叠层染料包含荧光蛋白和荧光团，其中发射光谱从荧光蛋白的吸收光谱的波长发生更远的位移。这可以有效于检测样品中的低量的靶标，其中发射的荧光被最大限度地优化，换言之很少甚至没有发射光被荧光蛋白重吸收。为了实现这一点，荧光蛋白和荧光团充当能量转移对，其中荧光蛋白在荧光团所吸收的波长下发射，并且荧光团随后在距离荧光蛋白比仅存在荧光蛋白时所能够获得的波长更远的波长下发射。功能组合可以是本领域中已知的藻胆蛋白和磺基罗丹明荧光团或磺化花青荧光团。该荧光团有时充当能量供体并且荧光蛋白是能量受体。
[0146] 在其他方面中，该双砷染料是4’，5’-双(1，3，2-二硫砷杂环戊烷-2-基)荧光素(FlAsH)。在一些方面中，该生物素受体肽有助于基于抗生物素蛋白的试剂和基于链霉抗生物素蛋白的试剂的轭合。在一些方面中，该硫辛酸受体肽有助于硫醇反应性探针轭合至结合硫辛酸或直接连接荧光硫辛酸类似物。
[0147] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含在这些工程化半胱氨酸之一处轭合的至少一个异源部分，其中此异源部分是荧光标签。在一些方面中，该荧光标签包括荧光素型染料、罗丹明型染料、丹酰型染料、丽丝胺型染料、花青型染料、藻红蛋白型染料、德克萨斯红型染料、或其任何组合。适于轭合至在此披露的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的荧光团包括不限于；芘(包括任选相应的衍生化合物)、蒽、萘、吖啶、芪、吲哚或苯并吲哚、噁唑或苯并噁唑、噻唑或苯并噻唑、4-氨基-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑(NBD)、花青(包括任何相应的化合物)、羰花青(包括任何相应的化合物)、7-氨基-4-甲基-2-喹啉酮(carbostyryl)、卟啉、水杨酸酯、邻氨基苯甲酸酯、薁、二萘嵌苯、吡啶、喹啉、硼聚氮杂引达省(包括任何相应的化合物)、呫吨(包括任何相应的化合物)、噁嗪(包括任何相应的化合物)或苯并噁嗪、卡巴秦(包括任何相应的化合物)、芴酮、香豆素(包括披露的相应化合物)、苯并呋喃(包括相应的化合物)以及苯甲酮(benzphenalenone)(包括任何相应的化合物)以及其衍生物。如在此所用，噁嗪包括试卤灵(包括任何相应化合物)、氨基噁嗪酮、二氨基噁嗪、以及其苯并取代的类似物、或其任何组合。
[0148] 在某些方面中，轭合至在此披露的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的荧光团包括呫吨(对甲氨基酚、罗丹明、荧光素以及其衍生物)、香豆素、花青、芘、噁嗪、硼聚氮杂引达省、或其任何组合。在一些实施例中，此类荧光团是磺化呫吨、氟化呫吨、磺化香豆素、氟化香豆素、磺化花青、或其任何组合。还包括以下列商品名出售且通常已知为以下各项的染料：Alexa Cy Oregon Pacific 以及
[0149] 附接至在此披露的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白上的荧光团的选择将决定轭合化合物的吸收和荧光发射特性。可以使用的荧光团标记的物理特性包括但不限于，光谱特征(吸收、发射和斯托克斯位移)、荧光强度、寿命、极化以及光致漂白率、或其组合。所有这些物理特性可以用于将一个荧光团与另一个荧光团区分开，并且从而允许多元分析。
在某些方面中，荧光团在大于480nm的波长下具有吸收极大值。在一些方面中，荧光团在处于或接近488nm至514nm(特别适用于由氩离子激光激发源的输出激发)或在接近546nm(特
别适用于由水银弧光灯激发)处吸收。在一些方面中，荧光团可以针对组织或完整生物体应用在NIR(近红外区域)中发射。荧光标记的其他所希望的特性可以包括细胞渗透性和低毒性，例如，如果将在细胞或生物体(例如，活体动物)中执行抗体的标记。在一些具体方面中，该荧光标签是亚历克萨荧光染料488 C5-马来酰亚胺。
在某些方面中，荧光团在大于480nm的波长下具有吸收极大值。在一些方面中，荧光团在处于或接近488nm至514nm(特别适用于由氩离子激光激发源的输出激发)或在接近546nm(特
别适用于由水银弧光灯激发)处吸收。在一些方面中，荧光团可以针对组织或完整生物体应用在NIR(近红外区域)中发射。荧光标记的其他所希望的特性可以包括细胞渗透性和低毒性，例如，如果将在细胞或生物体(例如，活体动物)中执行抗体的标记。在一些具体方面中，该荧光标签是亚历克萨荧光染料488 C5-马来酰亚胺。
[0150] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含在这些工程化半胱氨酸之一处轭合的至少一个异源部分，其中此异源部分是捕获标签。在一些方面中，该捕获标签是生物素或His6标签。生物素是有用的，这是因为它可以在酶系统中起作用以进一步放大可检测的信号并且它还可以充当用于分离目的亲和色谱中使用的标签。出于检测目的，可以使用对于生物素具有亲和力的酶轭合物，诸如抗生物素蛋白-HRP。随后可以添加过氧化物酶底物以产生可检测的信号。除生物素之外，可以使用其他半抗原，包括激素、天然发生和合成的药物、污染物、过敏原、效应分子、生长因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、氨基酸、肽、化学中间体、核苷酸及类似物。
[0151] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含在这些工程化半胱氨酸之一处轭合的至少一个异源部分，其中此异源部分是酶。酶是有效标记物，因为可以获得可检测的信号的放大，从而得到增加的测定灵敏度。酶自身通常不产生可检测的响应，但是当它被适当的底物接触时，起到分解底物的作用，这样使得转化的底物产生荧光信号、比色信号或发光信号。因为标记试剂上的一种酶可以导致多个底物被转化成可检测的信号，所以酶将可检测的信号放大。选择酶底物以产生可测量的产物，例如，比色发光、荧光发光或化学发光。这类底物在本领域中广泛使用且是本领域已知的。
[0152] 在一些实施例中，比色或荧光底物和酶组合使用氧化还原酶如辣根过氧化物酶和底物如3，3’-二氨基联苯胺(DAB)和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)，这产生有区别的颜色(分别是棕色和红色)。产生可检测的产物的其他比色氧化还原酶底物包括但不限于：2，2-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻苯二胺(OPD)、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、邻联茴香胺、5-氨基水杨酸、4-氯-1-萘酚。荧光底物包括但不限于，高香草酸或4-羟基-3-甲氧基苯乙酸、还原的吩噁嗪和还原的苯并噻嗪，包括 Red试剂及其变体和还原的二氢呫吨，包括二氢荧光素以及二氢若丹明，包括二氢若丹明123。作为酪胺酰胺的过氧化物酶底物表示一类独特的过氧化物酶底物，在于它们在酶作用之前可以是固有地可检测，但在如酪胺酰胺信号放大(TSA)所描述的过程中通过过氧化物酶作用“固定在适当位置”。这些底物广泛地用于标记样品(这些样品是细胞、组织或阵列)中的靶标以用于其随后通过显微术、流式细胞术、光学扫描以及荧光测定法进行检测。
[0153] 比色(并且在一些情况下是荧光)底物和酶组合有时使用磷酸酶诸如酸性磷酸酶、碱性磷酸酶或这种磷酸酶的重组型式与比色底物诸如5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)、6-氯-3-吲哚基磷酸酯、5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯、对硝基苯基磷酸酯或邻硝基苯基磷酸酯或者与荧光底物诸如4-甲基伞形酮基磷酸酯、6，8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素基磷酸酯(DiFMUP，美国专利号5,830,912)、荧光素二磷酸酯、3-邻甲基荧光素磷酸酯、试卤灵磷酸酯、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(DDAO磷酸酯)或ELF 97、ELF 39或相关磷酸酯的组合。
[0154] 糖苷酶，具体地说β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶和β-葡糖苷酶是另外适合的酶。适当的比色底物包括但不限于，5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)和类似的吲哚基半乳糖苷、葡糖苷和葡糖苷酸、邻硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、以及对硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷。在一些实施例中，荧光底物包括试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷、荧光素二半乳糖苷(FDG)、荧光素二葡糖苷酸以及它们的结构变体4-甲基伞形酮基β-D-吡喃半乳糖苷、羧基伞形酮基β-D-吡喃半乳糖苷、以及氟化香豆素β-D-吡喃半乳糖苷。
[0156] 酶以及其产生化学发光的适当底物适用于一些测定。这些包括但不限于天然和重组形式的荧光素酶和水母发光蛋白。磷酸酶、糖苷酶和氧化酶的产生化学发光的底物，如含有稳定的二氧杂环丁烷、鲁米诺、异氨基苯二酰肼以及吖啶酯的那些也是产生的。
[0157] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物包含在这些工程化半胱氨酸之一处轭合的至少一个异源部分，其中此异源部分是核酸。该核酸可以是选自下组，该组由DNA、RNA、短干扰RNA(siRNA)、微小RNA、发夹结构或核酸模拟物(诸如肽核酸)组成。在某些方面中，该轭合核酸是至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少100、至少200、至少500、至少1000、至少5000或更多个碱基对。该轭合核酸可以是单链的。在不同方面中，该轭合核酸可以是双链的。在一些方面中，该轭合核酸编码开放阅读框。在一些方面中，由该轭合核酸编码的开放阅读框对应于凋亡诱导蛋白、病毒蛋白、酶或癌抑制蛋白。用于递送此类核酸至细胞的技术是本领域已知的。
(b)接头
(b)接头
[0158] 在一些方面中，异源部分经由接头轭合至工程化半胱氨酸之一。如在此所用，术语“接头”是指其主要功能是经由工程化半胱氨酸的硫醇基将异源部分连接至半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的肽或多肽序列(例如，合成肽或多肽序列)、或非肽接头。在一些方面中，接头可以存在于本披露轭合化合物的任何两个异源部分或非接头元件之间。例如，一个或多个接头可以存在于半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白与异源部分之间，或者存在于第一异源部分与第二异源部分之间。在一些方面中，两个或更多个接头可以被串联连接。当多个接头存在于在此披露的轭合化合物中时，各接头可以是相同或不同的。总体上，接头为轭合化合物提供柔韧性。接头并未典型地裂解，因此，在一些方面中，该接头是不可裂解接头。然而在某些实施例中，这种裂解可能是希望的。因此，在一些方面中，接头可以包含一个或多个蛋白酶可裂解位点，这些位点可以位于该接头的序列中或在接头序列的两端侧接该接头。
[0159] 在一些方面中，轭合化合物包含非肽接头。在其他方面中，接头由非肽接头组成。在一些方面中，该非肽接头包括例如马来酰亚胺己酰基(MC)、val-cit、MC-val-cit、MC-val-cit-PABC、Mal-PEG2C2、Mal-PEG3C2 Mal-PEG6C2、马来酰亚胺丙酰基(MP)、甲氧基聚乙二醇(MPEG)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、4-琥珀酰亚胺氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(SMPT)、6-[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺]己酸琥珀酰亚胺酯(LC-SPDP)、BMPEO、SPP、4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、或其任何组合。参见，例如，美国专利号7,375,078。
[0160] 在一些方面中，该轭合化合物包含肽接头。在一些方面中，该接头由肽接头组成。在一些方面中，该肽接头包含至少2个氨基酸、至少3、至少4、至少5、至少10、至少20、至少
30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、或至少100个氨基酸。在其他方面中，该肽接头包含至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、或至少1,000个氨基酸。仍在其他方面中，该肽接头可以包含至少约10、20、30、40、50、60、
70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、
1500、1600、1700、1800、1900、或2000个氨基酸。该肽接头可以包含1-5个氨基酸、1-10个氨基酸、1-20个氨基酸、10-50个氨基酸、50-100个氨基酸、100-200个氨基酸、200-300个氨基酸、300-400个氨基酸、400-500个氨基酸、500-600个氨基酸、600-700个氨基酸、700-800个氨基酸、800-900个氨基酸、或900-1000个氨基酸。
30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、或至少100个氨基酸。在其他方面中，该肽接头包含至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、或至少1,000个氨基酸。仍在其他方面中，该肽接头可以包含至少约10、20、30、40、50、60、
70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、
1500、1600、1700、1800、1900、或2000个氨基酸。该肽接头可以包含1-5个氨基酸、1-10个氨基酸、1-20个氨基酸、10-50个氨基酸、50-100个氨基酸、100-200个氨基酸、200-300个氨基酸、300-400个氨基酸、400-500个氨基酸、500-600个氨基酸、600-700个氨基酸、700-800个氨基酸、800-900个氨基酸、或900-1000个氨基酸。
[0161] 肽接头的实例是本领域熟知的，例如根据化学式[(Gly)x-Sery]z的肽接头，其中x是从1至4，y是0或1，并且z是从1至50。在一个方面中，该肽接头包含序列Gn，其中n可以是从1至100的整数。在一个具体方面中，该接头的序列是GGGG。该肽接头可以包含序列(GA)n。该肽接头可以包含序列(GGS)n。在其他方面中，该肽接头包含序列(GGGS)n。仍在其他方面中，该肽接头包含序列(GGS)n(GGGGS)n。在这些情况中，n可以是从1-100的整数。在其他情况中，n可以是从1-20的整数，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20。接头的实例包括但不限于、GGG、SGGSGGS、GGSGGSGGSGGSGGG、GGSGGSGGGGSGGGGS、
GGSGGSGGSGGSGGSGGS、或GGGGSGGGGSGGGGS。在其他方面中，该接头是聚-G序列(GGGG)n，其中n可以是从1-100的整数。
GGSGGSGGSGGSGGSGGS、或GGGGSGGGGSGGGGS。在其他方面中，该接头是聚-G序列(GGGG)n，其中n可以是从1-100的整数。
[0162] 在一个方面中，该肽接头是合成的，即非天然发生的。在一个方面中，肽接头包括含有一个的氨基酸序列的肽(或多肽)(例如天然或非天然发生的肽)，该氨基酸序列将第一线性氨基酸序列连接或遗传融合至第二线性氨基酸序列(非天然连接或本质上遗传融合)。例如，在一个方面中，该肽接头可以包括作为天然发生的多肽的修饰形式的非天然发生的多肽(例如，包含诸如添加、取代或缺失的突变)。在另一个方面中，该肽接头可以包含括天然发生的氨基酸。在另一个方面中，该肽接头可以包括以自然界中未出现的线性序列存在的天然发生的氨基酸。仍在另一个方面中，该肽接头可以包括天然发生的多肽序列。
III.抗体和Fc融合蛋白的半胱氨酸工程化
III.抗体和Fc融合蛋白的半胱氨酸工程化
[0163] 在一些方面中，该轭合化合物包含特异性地结合至少一个靶标的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白。在一些方面中，该半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白可以结合多于一个靶标。在一些方面中，该半胱氨酸工程化抗体保留亲本抗体对应物的抗原结合能力。因此，在此披露的半胱氨酸工程化抗体可以能够结合、优选特异性地结合抗原。此类抗原包括例如肿瘤相关抗原(TAA)、细胞表面受体蛋白质和其他细胞表面分子、跨膜蛋白、信号蛋白、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与组织发育或分化相关(例如，已知或怀疑功能上有助于组织发育或分化)的分子、淋巴因子、细胞因子、参与细胞周期调控的分子、参与血管发生的分子以及与血管生成相关(例如，已知或怀疑功能上有助于血管生成)的分子。肿瘤相关抗原可以是簇分化因子(即，CD蛋白)。半胱氨酸工程化抗体能够结合的抗原可以是上述种类之一的亚类成员。
[0164] 在一些方面中，该轭合化合物包含特异性地结合至少一个靶标的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白和特异性地结合至少一个第二靶标的至少一个异源部分。在一些方面中，半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白和异源部分可以结合相同靶标。在一些方面中，半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白和异源部分可以结合不同靶标。因此，在一些方面中，该轭合化合物是单特异性的。在其他方面中，轭合化合物是双特异性的、三特异性的、四特异性的等等。在其他方面中，轭合化合物是多特异性的。在一些方面中，轭合化合物是单价的、二价的、三价的、四价的等等。仍在其他方面中，轭合化合物是多价的。在具体方面中，半胱氨酸工程化抗体和Fc融合蛋白以及衍生的轭合化合物是二价的，例如工程化抗体化合物包含两个不同的特异性抗原结合位点或者工程化Fc融合蛋白包含两个不同的靶标结合结构域。在具体方面中，半胱氨酸工程化抗体及其片段以及衍生的轭合化合物是双特异性的，即该分子可以特异性地结合两个不同抗原(例如，在相同或不同分子上的两个不同表位)。在一些具体方面中，半胱氨酸工程化抗体及其片段以及衍生的轭合化合物是双特异性的和四价
的，例如，衍生自包含能够结合两个不同抗原(例如，在相同或不同分子上的两个不同表位)的四个抗原结合位点的亲本抗体。
的，例如，衍生自包含能够结合两个不同抗原(例如，在相同或不同分子上的两个不同表位)的四个抗原结合位点的亲本抗体。
[0165] 本披露提供一种用于检测在此披露的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白、或在此披露的轭合化合物与靶细胞的结合的测定，该测定包括：(a)使细胞暴露于半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白或轭合化合物；并且
(b)测定半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白或轭合化合物与靶细胞的结合程度。
(b)测定半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白或轭合化合物与靶细胞的结合程度。
[0166] 在此披露的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白、或在此披露的衍生轭合化合物对于靶标的靶标结合能力可以使用本领域熟知的任何适合的方法(例如，流式细胞术、酶联免TM疫吸附测定(ELISA)、或放射免疫测定(RIA)、或动力学(例如BIACORE 分析))在实验上测定。还可以容易地采用直接结合测定以及竞争性结合测定形式。参见例如，贝尔索夫斯基(Berzofsky)等人，在基础免疫学(Fundamental Immunology)中的“抗体抗原相互作用
(Antibody-Antigen Interactions)”，保罗，W.E.(Paul，W.E.)编著，纽约州纽约市雷文出版社(Raven Press：New York，N.Y.)(1984)；库比(Kuby)，免疫学(Immunology)，纽约州纽约市W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Company：New York，N.Y.)(1992)；以及在此所述的方法。如果在不同条件(例如，盐浓度、pH、温度等等)下测量，那么在此披露的具体半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白、或衍生化轭合化合物与靶标相互作用的测量的亲和力可以改变。
(Antibody-Antigen Interactions)”，保罗，W.E.(Paul，W.E.)编著，纽约州纽约市雷文出版社(Raven Press：New York，N.Y.)(1984)；库比(Kuby)，免疫学(Immunology)，纽约州纽约市W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Company：New York，N.Y.)(1992)；以及在此所述的方法。如果在不同条件(例如，盐浓度、pH、温度等等)下测量，那么在此披露的具体半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白、或衍生化轭合化合物与靶标相互作用的测量的亲和力可以改变。
[0167] 实际上，任何分子均可以特异性地结合和/或并入包含半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白和异源部分的轭合化合物。在一些方面中，TNF超家族的成员(受体或配体)，以及属于此蛋白质家族的蛋白质的亚基、结构域、基序以及表位特异性地结合和/或并入轭合化合物。TNF超家族包括许多分子，包括但不限于肿瘤坏死因子-α(“TNF-α”)、肿瘤坏死因子-β(“TNF-β”)、淋巴毒素-α(“LT-α”)、CD30配体、CD27配体、CD40配体、4-1 BB配体、Apo-1配体(也称为Fas配体或CD95配体)、Apo-2配体(也称为TRAIL)、Apo-3配体(也称为TWEAK)、骨保护素(OPG)、APRIL、RANK配体(也称为TRANCE)、TALL-1(也称为BlyS、BAFF或THANK)、DR4、DR5(也称为Apo-2、TRAIL-R2、TR6、Tango-63、hAPO8、TRICK2、或KILLER)、DR6、DcR1，DcR2、DcR3(也称为TR6或M68)、CAR1、HVEM(也称为ATAR或TR2)、GITR、ZTNFR-5、NTR-1、TNFL1、CD30、LTBr、4-1BB受体以及TR9。
[0168] 在一些方面中，该轭合化合物特异性地结合和/或并入一个或多个分子，以及选自下组的分子的亚基、结构域、基序以及表位，该组由以下各项组成：5T4、ABL、ABCF1、ACVR1、ACVR1 B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、ADORA2A、聚集蛋白聚糖、AGR2、AICDA、AIF1、AIGI、AKAP1、AKAP2、AMH、AMHR2、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL3、ANGPTL4、ANPEP、APC、APOCl、AR、芳香酶、ATX、AXl、AZGP1(锌-a-糖蛋白)、B7.1、B7.2、B7-H1、BAD、BAFF、BAG1、BAIl、BCR、BCL2、BCL6、BDNF、BLNK、BLR1(MDR15)、BlyS、BMP1、BMP2、BMP3B(GDFIO)、BMP4、BMP6、BMP8、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、BPAG1(网蛋白)、BRCA1、C19orflO(IL27w)、C3、C4A、C5、C5R1、CANT1、CASP1、CASP4、CAVl、CCBP2(D6/JAB61)、CCL1(1-309)、CCLI1(嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-Id)、CCL16(mcc-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、MCAF、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MEP-2)、SLC、exodus-2、CCL22(MDC/STC-I)、CCL23(MPIF-I)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIPIb)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CCRI(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-IRB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TERI/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)，CD164、CD19、CDIC、CD20、CD200、CD22、CD24、CD28、CD3、CD33、CD35、CD37、CD38、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD40、CD40L、CD44、CD45RB、CD52、CD69、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CD8、CD80、CD81、CD83、CD86、CD137、CDH1(E钙粘蛋白)、CDH10、CDH12、CDH13、CDH18，CDH19、CDH20、CDH5、CDH7、CDH8、CDH9、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7，CDK9、CDKN1A(p21Wap1/Cip1)，CDKN1B(p27Kip1)、CDKN1C、CDKN2A(p161NK4a)、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、CEBPB、CERI、CHGA、CHGB、壳多糖酶、CHST10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、CLDN3、CLDN7(密封蛋白(claudin)-7)、CLN3、CLU(丛生蛋白)、CMKLR1、CMKOR1(RDCl)、CNR1、COL18A1、COLIA1、COL4A3、COL6A1、CR2、Cripto、CRP、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTLA4、CTL8、CTNNB1(b-连环蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、CX3CL1
(SCYD1)、CX3CR1(V28)、CXCL1(GRO1)、CXCL10(IP-IO)、CXCLI1(I-TAC/IP-9)、CXCL12
(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR4、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、CYB5、CYCl、CYSLTR1、DAB21P、DES、DKFZp451J0118、DNCL1、DPP4、E2F1、Engel、Edge、茴香、EFNA3、EFNB2、EGF、EGFR、ELAC2、ENG、Enola、ENO2、ENO3、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、EPHRIN-A1、EPHRIN-A2、EPHRINA3、EPHRIN-A4、EPHRIN-A5、EPHRIN-A6、EPHRIN-B1、EPHRIN-B2、EPHRIN-B3、EPHB4、EPG、ERBB2(Her-2)、EREG、ERK8、雌激素受体、Earl、ESR2、F3(TF)、FADD、法尼基转移酶、FasL、FASNf、FCER1A、FCER2、FCGR3A、FGF、FGF1(aFGF)、FGF10、FGF1 1、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF8、FGF9、FGFR3、FIGF(VEGFD)、FILI(EPSILON)、FBL1(ZETA)、FLJ12584、FLJ25530、FLRT1(纤连蛋白)、FLT1、FLT-3、FOS、FOSLI(FRA-1)、FY(DARC)、GABRP(GABAa)、GAGEB1、GAGEC1、GALNAC4S-6ST、GATA3、GD2、GDF5、GFI1、GGT1、GM-CSF、GNAS1、GNRH1、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR44、GPR81(FKSG80)、GRCC10(C10)、GRP、GSN(凝溶胶蛋白)、GSTP1、HAVCR2、HDAC、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、Hedgehog、HGF、HIF1A、HIP1、组胺和组胺受体、HLA-A、HLA-DRA、HM74、HMOXl、HSP90、HUMCYT2A、ICEBERG、ICOSL、ID2、IFN-a、IFNA1、IFNA2、IFNA4，1FNA5、EFNA6、BFNA7、IFNB1、IFNγ、IFNW1、IGBP1、IGF1、IGFIR、IGF2、IGFBP2，1GFBP3、IGFBP6、DL-1、ILIO、ILIORA、ILIORB、IL-1、IL1R1(CD121a)、IL1R2(CD121b)、ILIRA、IL-2、IL2RA(CD25)、IL2RB(CD122)、IL2RG(CD132)、IL-4、IL-4R(CD123)、IL-5、IL5RA(CD125)、IL3RB(CD131)、IL-6、IL6RA、(CD126)、IR6RB(CD130)、IL-7、IL7RA(CD127)、IL-8、CXCR1(IL8RA)、CXCR2、(IL8RB/CD128)、IL-9、IL9R(CD129)、IL-
10、IL10RA(CD210)、IL10RB(CDW210B)、IL-11、IL11RA、IL-12、IL-12A、IL-12B、IL-12RB1、IL-12RB2、IL-13、IL13RA1、IL13RA2、IL14、IL15、IL15RA、1L16、IL17、IL17A、IL17B、IL17C、IL17R、IL18、IL18BP、IL18R1、IL18RAP、IL19、ILIA、ILIB、IL1F10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、DL1F9、ILIHYI、ILIR1、IL1R2、ILIRAP、ILIRAPLI、IL1RAPL2、IL1 RL1、IL1 RL2、ILIRN、IL2、IL20、IL20RA、IL21R、IL22、IL22R、IL22RA2、IL23、DL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL30、IL3RA、IL4，1L4R、IL6ST(糖蛋白130)、ILK、INHA、INHBA、INSL3、INSL4、IRAK1、IRAK2、ITGA1、ITGA2，1TGA3、ITGA6(a6整合蛋白)、ITGAV、ITGB3、ITGB4(134整合蛋白)、JAG1、JAK1、JAK3、JTB、JUN、K6HF、KAI1、KDR、KITLG、KLF5(GC Box BP)、KLF6、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KRTHB6(II型毛发特异性角蛋白)、LAMA5、LEP(瘦蛋白)、Lingo-p75、Lingo-Troy、LPS、LTA(TNF-b)、LTB、LTB4R(GPR16)、LTB4R2、LTBR、MACMARCKS、MAG或Omgp、MAP2K7(c-Jun)、MCP-1、MDK、MIB1、沉默中期因子(midkine)、MIF、MISRII、MJP-
2，MK、MKI67(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(金属硫粘连蛋白-UI)、mTOR、MTSS1、MUC1(粘蛋白)、MYC、MYD88、NCK2、神经蛋白聚糖、NFKBI、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgRNogo66、(Nogo)、NgR-p75、NgR-Troy、NMEI(NM23A)、NOTCH、NOTCH1、NOX5、NPPB、NROB1、NROB2、NRID1、NR1D2、NR1H2、NR1H3、NR1H4、NRll2、NRll3、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NR6A1、NRP1、NRP2、NT5E、NTN4、ODZl、OPRDI、P2RX7、PAP、PART1、PATE、PAWR、PCA3、PCDGF、PCNA、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAMI、培门冬酶、PF4(CXCL4)、PGF、PGR、磷酸蛋白聚糖、PIAS2、PI3激酶、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG、PLXDCI、PKC、PKC-β、PPBP(CXCL7)、PPID、PR1、PRKCQ、PRKD1、PRL、PROC、PROK2、PSAP、PSCA、PTAFR、PTEN、PTGS2(COX-2)、PTN、RAC2(P21Rac2)、RANK、RANK配体、RARB、RGS1、RGS13、RGS3、RNFI10(ZNF144)、Ron、ROBO2、RXR、S100A2、SCGB 1D2(亲脂素B)、SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)、SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)、SCYE1(内皮细胞单核细胞激活性细胞因子)、SDF2，SERPENA1、SERPINA3、SERPINB5(乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂)、SERPINEI(PAl-I)、SERPINFI、SHIP-1、SHIP-2、SHB1、SHB2、SHBG、SfcAZ、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPP1、SPRR1B(Sprl)、ST6GAL1、STAB1、STAT6、STEAP、STEAP2、TB4R2、TBX21、TCP10、TDGF1、TEK、TGFA、TGFB1、TGFBII1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、THIL、THBS1(血小板反应蛋白-1)、THBS2、THBS4、THPO、TIE(Tie-1)、TIMP3、组织因子、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TNF、TNFa、TNFAIP2(B94)、TNFAIP3、TNFRSFI1A、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、TNFRSF5、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6
(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TOLLIP、Toll-样受体、TOP2A(拓扑异构酶lia)、TP53、TPM1、TPM2，TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRKA、TREM1、TREM2、TRPC6、TSLP、TWEAK、酪氨酸酶、uPAR、VEGF、VEGFB、VEGFC、多功能蛋白聚糖、VHL C5、VLA-4、Wnt-1、XCL1(淋巴细胞趋化蛋白)、XCL2(SCM-Ib)、XCRI(GPR5/CCXCR1)、YY1、以及ZFPM2。
(SCYD1)、CX3CR1(V28)、CXCL1(GRO1)、CXCL10(IP-IO)、CXCLI1(I-TAC/IP-9)、CXCL12
(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR4、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、CYB5、CYCl、CYSLTR1、DAB21P、DES、DKFZp451J0118、DNCL1、DPP4、E2F1、Engel、Edge、茴香、EFNA3、EFNB2、EGF、EGFR、ELAC2、ENG、Enola、ENO2、ENO3、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、EPHRIN-A1、EPHRIN-A2、EPHRINA3、EPHRIN-A4、EPHRIN-A5、EPHRIN-A6、EPHRIN-B1、EPHRIN-B2、EPHRIN-B3、EPHB4、EPG、ERBB2(Her-2)、EREG、ERK8、雌激素受体、Earl、ESR2、F3(TF)、FADD、法尼基转移酶、FasL、FASNf、FCER1A、FCER2、FCGR3A、FGF、FGF1(aFGF)、FGF10、FGF1 1、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF8、FGF9、FGFR3、FIGF(VEGFD)、FILI(EPSILON)、FBL1(ZETA)、FLJ12584、FLJ25530、FLRT1(纤连蛋白)、FLT1、FLT-3、FOS、FOSLI(FRA-1)、FY(DARC)、GABRP(GABAa)、GAGEB1、GAGEC1、GALNAC4S-6ST、GATA3、GD2、GDF5、GFI1、GGT1、GM-CSF、GNAS1、GNRH1、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR44、GPR81(FKSG80)、GRCC10(C10)、GRP、GSN(凝溶胶蛋白)、GSTP1、HAVCR2、HDAC、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、Hedgehog、HGF、HIF1A、HIP1、组胺和组胺受体、HLA-A、HLA-DRA、HM74、HMOXl、HSP90、HUMCYT2A、ICEBERG、ICOSL、ID2、IFN-a、IFNA1、IFNA2、IFNA4，1FNA5、EFNA6、BFNA7、IFNB1、IFNγ、IFNW1、IGBP1、IGF1、IGFIR、IGF2、IGFBP2，1GFBP3、IGFBP6、DL-1、ILIO、ILIORA、ILIORB、IL-1、IL1R1(CD121a)、IL1R2(CD121b)、ILIRA、IL-2、IL2RA(CD25)、IL2RB(CD122)、IL2RG(CD132)、IL-4、IL-4R(CD123)、IL-5、IL5RA(CD125)、IL3RB(CD131)、IL-6、IL6RA、(CD126)、IR6RB(CD130)、IL-7、IL7RA(CD127)、IL-8、CXCR1(IL8RA)、CXCR2、(IL8RB/CD128)、IL-9、IL9R(CD129)、IL-
10、IL10RA(CD210)、IL10RB(CDW210B)、IL-11、IL11RA、IL-12、IL-12A、IL-12B、IL-12RB1、IL-12RB2、IL-13、IL13RA1、IL13RA2、IL14、IL15、IL15RA、1L16、IL17、IL17A、IL17B、IL17C、IL17R、IL18、IL18BP、IL18R1、IL18RAP、IL19、ILIA、ILIB、IL1F10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、DL1F9、ILIHYI、ILIR1、IL1R2、ILIRAP、ILIRAPLI、IL1RAPL2、IL1 RL1、IL1 RL2、ILIRN、IL2、IL20、IL20RA、IL21R、IL22、IL22R、IL22RA2、IL23、DL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL30、IL3RA、IL4，1L4R、IL6ST(糖蛋白130)、ILK、INHA、INHBA、INSL3、INSL4、IRAK1、IRAK2、ITGA1、ITGA2，1TGA3、ITGA6(a6整合蛋白)、ITGAV、ITGB3、ITGB4(134整合蛋白)、JAG1、JAK1、JAK3、JTB、JUN、K6HF、KAI1、KDR、KITLG、KLF5(GC Box BP)、KLF6、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KRTHB6(II型毛发特异性角蛋白)、LAMA5、LEP(瘦蛋白)、Lingo-p75、Lingo-Troy、LPS、LTA(TNF-b)、LTB、LTB4R(GPR16)、LTB4R2、LTBR、MACMARCKS、MAG或Omgp、MAP2K7(c-Jun)、MCP-1、MDK、MIB1、沉默中期因子(midkine)、MIF、MISRII、MJP-
2，MK、MKI67(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(金属硫粘连蛋白-UI)、mTOR、MTSS1、MUC1(粘蛋白)、MYC、MYD88、NCK2、神经蛋白聚糖、NFKBI、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgRNogo66、(Nogo)、NgR-p75、NgR-Troy、NMEI(NM23A)、NOTCH、NOTCH1、NOX5、NPPB、NROB1、NROB2、NRID1、NR1D2、NR1H2、NR1H3、NR1H4、NRll2、NRll3、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NR6A1、NRP1、NRP2、NT5E、NTN4、ODZl、OPRDI、P2RX7、PAP、PART1、PATE、PAWR、PCA3、PCDGF、PCNA、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAMI、培门冬酶、PF4(CXCL4)、PGF、PGR、磷酸蛋白聚糖、PIAS2、PI3激酶、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG、PLXDCI、PKC、PKC-β、PPBP(CXCL7)、PPID、PR1、PRKCQ、PRKD1、PRL、PROC、PROK2、PSAP、PSCA、PTAFR、PTEN、PTGS2(COX-2)、PTN、RAC2(P21Rac2)、RANK、RANK配体、RARB、RGS1、RGS13、RGS3、RNFI10(ZNF144)、Ron、ROBO2、RXR、S100A2、SCGB 1D2(亲脂素B)、SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)、SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)、SCYE1(内皮细胞单核细胞激活性细胞因子)、SDF2，SERPENA1、SERPINA3、SERPINB5(乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂)、SERPINEI(PAl-I)、SERPINFI、SHIP-1、SHIP-2、SHB1、SHB2、SHBG、SfcAZ、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPP1、SPRR1B(Sprl)、ST6GAL1、STAB1、STAT6、STEAP、STEAP2、TB4R2、TBX21、TCP10、TDGF1、TEK、TGFA、TGFB1、TGFBII1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、THIL、THBS1(血小板反应蛋白-1)、THBS2、THBS4、THPO、TIE(Tie-1)、TIMP3、组织因子、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TNF、TNFa、TNFAIP2(B94)、TNFAIP3、TNFRSFI1A、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、TNFRSF5、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6
(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TOLLIP、Toll-样受体、TOP2A(拓扑异构酶lia)、TP53、TPM1、TPM2，TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRKA、TREM1、TREM2、TRPC6、TSLP、TWEAK、酪氨酸酶、uPAR、VEGF、VEGFB、VEGFC、多功能蛋白聚糖、VHL C5、VLA-4、Wnt-1、XCL1(淋巴细胞趋化蛋白)、XCL2(SCM-Ib)、XCRI(GPR5/CCXCR1)、YY1、以及ZFPM2。
[0169] 在一些方面中，该轭合化合物包含特异性地结合和/或并入一个或多个非蛋白分子(例如，核酸(例如，DNA或RNA)、脂质、醣脂、多糖等等)的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白、或异源部分。在一些方面中，该轭合化合物包含特异性地结合和/或并入肿瘤相关糖脂抗原以及该肿瘤相关糖脂抗原的亚基、结构域、基序以及表位(参见，美国专利号5,091,
178)的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白、或异源部分。
178)的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白、或异源部分。
[0170] 在一些方面中，该轭合化合物包含含有与配体竞争性结合以下各项的结构域(例如，表位结合结构域或配体结构域)的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白：PDGFRα、PDGFRβ、PDGF、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFE、VEGFF、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、FGF、FGF2、HGF、KDR、fit-1、FLK-1Ang-2、Ang-1、PLGF、CEA、CXCL13、Baff、IL-21、CCL21、TNF-α、CXCL12、SDF-1、bFGF、MAC-1、IL23p19、FPR、IGFBP4、CXCR3、TLR4、CXCR2、EphA2、EphA4、肝配蛋白B2、EGFR(ErbB1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)、HER4ErbB4或tyro2)、SC1、LRP5、LRP6、RAGE、Nav1.7、GLP1、RSV、RSV F蛋白、流感HA蛋白、流感NA蛋白、HMGB1、CD16、CD19、CD20、CD21、CD28、CD32、CD32b、CD64、CD79、CD22、ICAM-1、FGFR1、FGFR2、HDGF、EphB4、GITR、13-淀粉样蛋白、hMPV、PIV-1、PIV-2、OX40L、IGFBP3、cMet、PD-1、PLGF、脑啡肽酶(Neprolysin)、CTD、IL-18、IL-6、CXCL-13、IL-1R1、IL-15、IL-4R、IgE、PAl-1、NGF、EphA2、CEA、uPARt、DLL-4、av136、a5131、I型和II型干扰素受体、CD19、ICOS、IL-17、因子II、Hsp90、IGF、CD19、GM-CSFR、PIV-3、CMV、IL-13、IL-9、以及EBV。
[0171] 在一些方面中，该轭合化合物包含结合与选自下组的抗体的靶标相同的靶标的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白，该组由以下各项组成：阿巴伏单抗、阿巴西普(也称为)、阿昔单抗(也称为 c7E3 Fab)、阿达木单抗(也称为)、阿德木单抗、阿仑单抗(也称为 MabCampath或Campath-1H)、阿妥莫单抗、
阿非莫单抗、麻安莫单抗、阿尼莫单抗(anetumumab)、安如珠单抗(anrukizumab)、阿泊珠单抗、阿西莫单抗、阿塞珠单抗、阿利珠单抗(atlizumab)、阿托木单抗、巴匹珠单抗、巴利昔单抗(也称为 )、巴土昔单抗、贝妥莫单抗(也称为 )、贝利木
单抗(也称为 )、柏替木单抗、贝索单抗、贝伐单抗(也称为
)、比西单抗、溴烯比妥、比伐单抗美登素(bivatuzumab mertansine)、阿仑珠
单抗、康纳单抗(也称为ACZ885)、美坎珠单抗、卡罗单抗(也称为 )、卡妥
索单抗(也称为 )、维多珠单抗(也称为 )、培舍珠单抗、西妥昔单抗
(也称为 )、克立昔单抗、达塞珠单抗、达昔单抗、达利珠单抗(也称为
)、德尼单抗(也称为AMG 162)、地莫单抗、阿托度单抗、多立珠单抗
(dorlixizumab)、顿图木单抗(duntumumab)、度里姆单抗(durimulumab)、德木鲁单抗
(durmulumab)、依美昔单抗、依库丽单抗(也称为 )、埃巴单抗(edobacomab)、依
决洛单抗(也称为Mab17-1A、 )、依法利珠单抗(也称为 )、依芬古
单抗(efungumab，也称为 )、艾西莫单抗、培戈赖莫单抗(enlimomab
pegol)、西艾匹莫单抗(epitumomab cituxetan)、依法利珠单抗、依匹莫单抗、依帕珠单抗、厄利珠单抗(erlizumab)、厄妥索单抗(也称为 )、依那西普单抗(也称为
)、伊瑞西珠单抗(也称为瑞图单抗、 ABEGRINTM)、艾韦单抗、法索
单抗(fanolesomab，也称为 )、法拉莫单抗、泛维珠单抗(felvizumab)、芳
妥珠单抗(也称为 )、加利昔单抗、罗氏单抗(gantenerumab)、加维莫单抗(也称为
)、吉妥单抗(也称为 )、高利单抗(也称为CNTO 148)、高米昔单
抗(gomiliximab)、伊巴丽珠单抗(ibalizumab，也称为TNX-355)、替伊莫单抗(也称为
)、伊戈伏单抗、英西单抗、英夫利昔单抗(也称为 )、伊诺莫单
抗、奥英妥珠单抗、伊匹单抗(也称为MDX-010、MDX-101)、伊拉土木单抗(iratumumab)、凯利昔单抗(keliximab)、拉贝珠单抗、来马索单抗(lemalesomab)、莱布利珠单抗
(lebrilizumab)、乐德木单抗、来沙木单抗(也称为HGS-ETR2、ETR2-ST01)、莱西珠单抗(lexitumumab)、利韦单抗、林妥珠单抗、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗、马帕木单抗(也称为HGSETR1、TRM-1)、马司莫单抗、马妥珠单抗(也称为EMD72000)、美泊利单抗(也称为)、美替木单抗、米拉图珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、莫
罗木单抗、莫维珠单抗(也称为NUMAXTM)、莫罗单抗(也称为OKT3)、他那可单抗、他那莫单抗、那他珠单抗(也称为 )、奈巴库单抗、英利昔单抗、尼妥珠
单抗(也称为THERACIM )、巯诺莫单抗(也称
为 )、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥度莫单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗(也称
为 )、奥戈伏单抗(也称为 )、奥昔珠单抗(otelixizumab)、帕吉昔单
抗、帕利珠单抗(也称为 )、帕尼单抗(也称为ABX-EGF、 )、帕考珠
单抗、喷托莫单抗(pemtumomab，也称为 )、帕妥珠单抗(也称为2C4、
)、培克珠单抗、平妥单抗(pintumomab)、普立昔单抗、普立木单抗、兰尼单抗
(也称为 )、瑞西巴库单抗、瑞加韦单抗、瑞利珠单抗、利妥昔单抗(也称为
)、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、沙
妥莫单抗、司韦单抗、西罗珠单抗、西利珠单抗(也称为MEDI-507)、索土珠单、司他芦单抗(stamulumab，也称为MYO-029)、硫索单抗(也称为 )、他珠单抗
(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗、他利珠单抗、帕他普莫单抗(taplitumomab
paptox)、特非珠单抗(也称为 )、阿替莫单抗、替奈昔单抗、特普利珠单抗
(teplizumab)、替西木单抗(ticilimumab)、托珠单抗(也称为 )、托利珠单抗
(toralizumab)、托西莫单抗、曲妥单抗(也称为 )、托眉力木单抗
(tremelimumab，也称为CP-675，206)、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗、乌珠单抗、优特克单抗(也称为CNTO 1275)、伐利昔单抗、维妥珠单抗、维帕莫单抗、维西珠单抗(也称为 )、伏洛昔单抗(也称为M200)、伏妥莫单抗(也称为
)、扎鲁木单抗、扎木单抗(zanolimumab，也称为HuMAX-CD4)、齐拉木单抗、
或阿佐莫单抗。在一些方面中，该轭合化合物包含含有来自选自以上抗体列表的抗体的抗原结合区的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白。
阿非莫单抗、麻安莫单抗、阿尼莫单抗(anetumumab)、安如珠单抗(anrukizumab)、阿泊珠单抗、阿西莫单抗、阿塞珠单抗、阿利珠单抗(atlizumab)、阿托木单抗、巴匹珠单抗、巴利昔单抗(也称为 )、巴土昔单抗、贝妥莫单抗(也称为 )、贝利木
单抗(也称为 )、柏替木单抗、贝索单抗、贝伐单抗(也称为
)、比西单抗、溴烯比妥、比伐单抗美登素(bivatuzumab mertansine)、阿仑珠
单抗、康纳单抗(也称为ACZ885)、美坎珠单抗、卡罗单抗(也称为 )、卡妥
索单抗(也称为 )、维多珠单抗(也称为 )、培舍珠单抗、西妥昔单抗
(也称为 )、克立昔单抗、达塞珠单抗、达昔单抗、达利珠单抗(也称为
)、德尼单抗(也称为AMG 162)、地莫单抗、阿托度单抗、多立珠单抗
(dorlixizumab)、顿图木单抗(duntumumab)、度里姆单抗(durimulumab)、德木鲁单抗
(durmulumab)、依美昔单抗、依库丽单抗(也称为 )、埃巴单抗(edobacomab)、依
决洛单抗(也称为Mab17-1A、 )、依法利珠单抗(也称为 )、依芬古
单抗(efungumab，也称为 )、艾西莫单抗、培戈赖莫单抗(enlimomab
pegol)、西艾匹莫单抗(epitumomab cituxetan)、依法利珠单抗、依匹莫单抗、依帕珠单抗、厄利珠单抗(erlizumab)、厄妥索单抗(也称为 )、依那西普单抗(也称为
)、伊瑞西珠单抗(也称为瑞图单抗、 ABEGRINTM)、艾韦单抗、法索
单抗(fanolesomab，也称为 )、法拉莫单抗、泛维珠单抗(felvizumab)、芳
妥珠单抗(也称为 )、加利昔单抗、罗氏单抗(gantenerumab)、加维莫单抗(也称为
)、吉妥单抗(也称为 )、高利单抗(也称为CNTO 148)、高米昔单
抗(gomiliximab)、伊巴丽珠单抗(ibalizumab，也称为TNX-355)、替伊莫单抗(也称为
)、伊戈伏单抗、英西单抗、英夫利昔单抗(也称为 )、伊诺莫单
抗、奥英妥珠单抗、伊匹单抗(也称为MDX-010、MDX-101)、伊拉土木单抗(iratumumab)、凯利昔单抗(keliximab)、拉贝珠单抗、来马索单抗(lemalesomab)、莱布利珠单抗
(lebrilizumab)、乐德木单抗、来沙木单抗(也称为HGS-ETR2、ETR2-ST01)、莱西珠单抗(lexitumumab)、利韦单抗、林妥珠单抗、鲁卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗、马帕木单抗(也称为HGSETR1、TRM-1)、马司莫单抗、马妥珠单抗(也称为EMD72000)、美泊利单抗(也称为)、美替木单抗、米拉图珠单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、莫
罗木单抗、莫维珠单抗(也称为NUMAXTM)、莫罗单抗(也称为OKT3)、他那可单抗、他那莫单抗、那他珠单抗(也称为 )、奈巴库单抗、英利昔单抗、尼妥珠
单抗(也称为THERACIM )、巯诺莫单抗(也称
为 )、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥度莫单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗(也称
为 )、奥戈伏单抗(也称为 )、奥昔珠单抗(otelixizumab)、帕吉昔单
抗、帕利珠单抗(也称为 )、帕尼单抗(也称为ABX-EGF、 )、帕考珠
单抗、喷托莫单抗(pemtumomab，也称为 )、帕妥珠单抗(也称为2C4、
)、培克珠单抗、平妥单抗(pintumomab)、普立昔单抗、普立木单抗、兰尼单抗
(也称为 )、瑞西巴库单抗、瑞加韦单抗、瑞利珠单抗、利妥昔单抗(也称为
)、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、沙
妥莫单抗、司韦单抗、西罗珠单抗、西利珠单抗(也称为MEDI-507)、索土珠单、司他芦单抗(stamulumab，也称为MYO-029)、硫索单抗(也称为 )、他珠单抗
(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗、他利珠单抗、帕他普莫单抗(taplitumomab
paptox)、特非珠单抗(也称为 )、阿替莫单抗、替奈昔单抗、特普利珠单抗
(teplizumab)、替西木单抗(ticilimumab)、托珠单抗(也称为 )、托利珠单抗
(toralizumab)、托西莫单抗、曲妥单抗(也称为 )、托眉力木单抗
(tremelimumab，也称为CP-675，206)、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗、乌珠单抗、优特克单抗(也称为CNTO 1275)、伐利昔单抗、维妥珠单抗、维帕莫单抗、维西珠单抗(也称为 )、伏洛昔单抗(也称为M200)、伏妥莫单抗(也称为
)、扎鲁木单抗、扎木单抗(zanolimumab，也称为HuMAX-CD4)、齐拉木单抗、
或阿佐莫单抗。在一些方面中，该轭合化合物包含含有来自选自以上抗体列表的抗体的抗原结合区的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白。
[0172] 在此披露的轭合化合物可以特异性地结合和/或并入来自多个来源的分子，例如，病毒、细菌(例如支原体)、真菌或动物标靶。在一些情况下，该动物分子是人类分子。在一些方面中，在此披露的轭合化合物可以特异性地结合和/或并入来自寄生虫(例如，真菌、细菌、线虫等等)的分子。在一些方面中，该分子是抗原。因此，在一些方面中，该轭合化合物可以靶向细菌性抗原，并且该异源部分是抗细菌剂。在其他方面中，该靶标是病毒抗原，并且该异源部分是抗病毒剂。仍在其他方面中，该轭合化合物可以靶向肿瘤抗原(例如，人肿瘤抗原)，并且该异源部分是抗肿瘤剂。在一些方面中，该轭合化合物可以靶向真菌抗原，并且该异源部分是抗真菌剂。在一些方面中，该轭合化合物可以靶向寄生虫抗原，并且该异源部分是抗寄生虫剂。在其他方面中，该轭合化合物可以靶向支原体抗原，并且该异源部分是抗支原体剂。在一些方面中，该轭合化合物可以靶向分化抗原或组织相容性抗原，并且该异源部分是细胞毒性剂。可以根据本领域已知的方法来制备包含所披露半胱氨酸突变(在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、411、417、433、
435、或439处的取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，以及其任何组合)以及任选地在适于本领域所述半胱氨酸工程化的另外位置处的一个或多个半胱氨酸突变(例
如，在氨基酸位置239、248、254、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、
330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、
422、440、441、442、443以及446处的取代)的半胱氨酸工程化抗体和Fc融合蛋白。参见，例如，美国专利号4,816,567。
435、或439处的取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，以及其任何组合)以及任选地在适于本领域所述半胱氨酸工程化的另外位置处的一个或多个半胱氨酸突变(例
如，在氨基酸位置239、248、254、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、
330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、
422、440、441、442、443以及446处的取代)的半胱氨酸工程化抗体和Fc融合蛋白。参见，例如，美国专利号4,816,567。
[0173] 可以通过本领域已知的各种方法来制备编码所披露的半胱氨酸突变的核酸，例如，DNA。这些方法包括但不限于，通过定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变、以及盒式诱变编码该多肽的较早制备的DNA来制备。还可以通过限制性片段操纵或通过用合成寡核苷酸重叠延伸PCR来构建重组抗体和Fc融合蛋白的变体。诱变引物编码一个或多个半胱氨酸密码子置换。可以采用标准诱变技术来产生编码此类突变的半胱氨酸工程化抗体和Fc融合蛋白的DNA。一般指导可以在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆，实验室手册
(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社，1989；
以及奥苏贝尔(Ausubel)等人，分子生物学通用方法(Current Protocols in Molecular Biology)，纽约州纽约市格林尼出版公司和威利国际公司(Greene Publishing and
Wiley-Interscience，New York，N.Y.)，1993中找到。
(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社，1989；
以及奥苏贝尔(Ausubel)等人，分子生物学通用方法(Current Protocols in Molecular Biology)，纽约州纽约市格林尼出版公司和威利国际公司(Greene Publishing and
Wiley-Interscience，New York，N.Y.)，1993中找到。
[0174] 定点诱变是一种用于制备取代变体(即，突变体蛋白)的方法。这种技术是本领域熟知的(参见例如，卡特(Carter)(1985)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)13：4431-4443；霍(Ho)等人(1989)基因(Amst.)77：51-59；以及孔克尔(Kunkel)等人(1987)美国国家科学院院刊82：488)。简言之，在实施DNA的定点诱变时，通过首先将编码所希望的突变的寡核苷酸杂化至起始DNA的单链来改变此起始DNA。在杂化后，使用杂化寡核苷酸作为引物，并且使用起始DNA的单链作为模板，使用DNA多聚酶合成整个第二链。因此，编码所希望的突变的寡核苷酸被并入所得的双链DNA。可以在表达质粒中表达蛋白质的有待诱变的基因内实施定点诱变，并且可以对所得质粒进行测序以证实所希望的半胱氨酸置换突变的引入(刘等人(1998)，生物化学期刊(J.Biol.Chem.)273：20252-20260)。定点方法和格式，包括商业上可获得的那些，例如 多定点诱变试剂盒(加利福尼亚州拉荷亚的
Stratagene公司)。
Stratagene公司)。
[0175] PCR诱变还适用于制备起始多肽的氨基酸序列变体。参见希古契(Higuchi)，(1990)，PCR方法(PCR Protocols)，第177-183页，学术出版社(Academic Press)；伊托(Ito)等人(1991)基因102：67-70；伯恩哈德(Bernhard)等人(1994)生物轭合化学
(Bioconjugate Chem.)5：126-132；以及瓦莱特(Vallette)等人(1989)核酸研究17：723-
733。简言之，当少量模板DNA用作PCR的起始材料时，在序列稍微不同于模板DNA中的相应区域的引物可以用于产生相对大量的特异性DNA片段，这些特异性DNA片段仅在其中引物不同于模板的位置处与模板序列有所不同。
(Bioconjugate Chem.)5：126-132；以及瓦莱特(Vallette)等人(1989)核酸研究17：723-
733。简言之，当少量模板DNA用作PCR的起始材料时，在序列稍微不同于模板DNA中的相应区域的引物可以用于产生相对大量的特异性DNA片段，这些特异性DNA片段仅在其中引物不同于模板的位置处与模板序列有所不同。
[0176] 用于制备变体的另一种方法即盒式诱变是基于由威尔斯(Wells)等人(1985)基因34：315-323所述的技术。该起始材料是包含有待突变的起始多肽DNA的质粒(或其他载体)。
鉴定有待突变的起始DNA中的一个或多个密码子。在鉴定的一个或多个突变位点的每一侧上必须存在独特的限制性内切核酸酶位点。如果不存在此类限制性位点，则可以使用上述寡核苷酸介导的诱变方法在起始多肽DNA中的适当位置处引入这些位点来产生它们。在这些位点处切割质粒DNA来使它线性化。使用标准程序合成编码限制性位点之间的DNA序列但含有所希望的一个或多个突变的双链寡核苷酸，其中分开合成寡核苷酸的两条链并且然后使用标准技术将它们杂交在一起。这种双链寡核苷酸被称为盒。这种盒被设计成具有与线性化质粒末端相容的5′末端和3′末端，这样使得它可以直接连接质粒。现在此质粒含有突变的DNA序列。可以通过DNA测序确认含有编码半胱氨酸置换的突变体DNA。
鉴定有待突变的起始DNA中的一个或多个密码子。在鉴定的一个或多个突变位点的每一侧上必须存在独特的限制性内切核酸酶位点。如果不存在此类限制性位点，则可以使用上述寡核苷酸介导的诱变方法在起始多肽DNA中的适当位置处引入这些位点来产生它们。在这些位点处切割质粒DNA来使它线性化。使用标准程序合成编码限制性位点之间的DNA序列但含有所希望的一个或多个突变的双链寡核苷酸，其中分开合成寡核苷酸的两条链并且然后使用标准技术将它们杂交在一起。这种双链寡核苷酸被称为盒。这种盒被设计成具有与线性化质粒末端相容的5′末端和3′末端，这样使得它可以直接连接质粒。现在此质粒含有突变的DNA序列。可以通过DNA测序确认含有编码半胱氨酸置换的突变体DNA。
[0177] 还通过使用双链质粒DNA作为模板通过基于PCR的诱变的寡核苷酸定向诱变来产生单突变(萨姆布鲁克和拉塞尔，(2001)，分子克隆：实验手册，第3版；左勒(Zoller)等人(1983)酶学方法(Methods Enzymol.)100：468-500；左勒，M.J.和史密斯M.(Smith M.)，(1982)核酸研究10：6487-6500)。
[0178] 可以使用重组DNA技术以许多不同方式进一步修饰编码本披露半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的一个或多个多核苷酸。在一些方面中，抗体(例如，小鼠单克隆抗体)的轻链和重链的恒定结构域可以被(1)例如人抗体的那些区域取代以便产生嵌合抗体或被(2)
非免疫球蛋白多肽取代以便产生融合抗体。在一些方面中，截断或去除这些恒定区以便产生单克隆抗体的所希望的抗体片段。定点诱变或高密度诱变可变区可以用于优化单克隆抗体的特异性、亲和性等等。
非免疫球蛋白多肽取代以便产生融合抗体。在一些方面中，截断或去除这些恒定区以便产生单克隆抗体的所希望的抗体片段。定点诱变或高密度诱变可变区可以用于优化单克隆抗体的特异性、亲和性等等。
[0179] 可以使用本领域已知的不同技术来直接制备人抗体。可以产生在体外免疫的或从产生针对靶抗原的抗体的免疫个体分离的永生化人B淋巴细胞(参见，例如，科尔(Cole)等人，单克隆抗体和癌症疗法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，艾伦R.丽思出版社(AlanR.Liss)，第77页(1985)；伯默(Boemer)等人，免疫学杂志(J.Immunol)147：86-95(1991)；以及美国专利号5,750,373)。然后在永生化人B淋巴细胞中编码该抗体的一个或多个cDNA可以被制备并且插入表达载体和/或异源宿主细胞，以用于表达非天然发生的重组版本抗体。
[0180] 而且，在此披露的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白可以是选自噬菌体文库，其中噬菌体文库表达作为具有异源噬菌体蛋白的融合蛋白的人抗体或其片段，如例如在沃恩(Vaughan)等人，自然生物技术14：309-314(1996)；希茨(Sheets)等人，美国国家科学院院刊95：6157-6162(1998)；霍根鲍姆(Hoogenboom)和温特(Winter)，分子生物学杂志227：381(1991)；以及马克思等人，分子生物学杂志222：581(1991))中所述。用于产生和使用抗体噬菌体文库的技术还在美国专利号5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；6,593,081；6,300,064；6,653,068；6,706,484；以及7,264,963中描述，这些专利各自通过引用以其全部内容结合。
[0181] 在一些方面中，本披露的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白可以是人源化抗体。用于工程化、人源化或表面重修非人抗体或人抗体的方法也可以使用并且是本领域熟知
的。人源化、表面重修或类似工程化抗体可以具有来自非人类来源的一个或多个氨基酸残基，该来源例如但不限于，小鼠、大鼠、兔子、非人类灵长动物或其他哺乳动物。这些非人类氨基酸残基被经常称为“输入”残基的残基替代，这些残基典型地取自己知人序列的“输入”可变结构域、恒定结构域或其他结构域。此类输入序列可以用于降低免疫原性或减小、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期、或如本领域已知的任何其他适合的特征。可以使用任何已知的方法进行在此披露的半胱氨酸工程化抗体或其片段的人源化、表面重修或工程化，这些方法诸如但不限于在达姆施罗德(Damschroder)等人，分子免疫学杂志44：3049-3060(2007)；琼斯等人，自然321：522(1986)；里希曼等人，自然
332：323(1988)；费尔海恩等人，科学239：1534(1988))；西姆斯(Sims)等人，免疫学杂志
151：2296(1993)；乔西亚和莱斯克，分子生物学杂志196：901(1987)；卡特等人，美国国家科学院院刊89：4285(1992)；普雷斯塔(Presta)等人，免疫学杂志151：2623(1993)；美国专利号5,639,641；5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,
723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,
089；5,225,539；4,816,567，7,557,189；7,538,195；以及7,342,110；WO90/14443；WO90/
14424；WO90/14430；WO2005/042743；WO2006/102095以及EP229246中描述的那些方法，这些专利各自通过引用全部结合在此，包括其中引用的参考文献。
IV.半胱氨酸工程化抗体和Fc融合蛋白的表达和纯化
的。人源化、表面重修或类似工程化抗体可以具有来自非人类来源的一个或多个氨基酸残基，该来源例如但不限于，小鼠、大鼠、兔子、非人类灵长动物或其他哺乳动物。这些非人类氨基酸残基被经常称为“输入”残基的残基替代，这些残基典型地取自己知人序列的“输入”可变结构域、恒定结构域或其他结构域。此类输入序列可以用于降低免疫原性或减小、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期、或如本领域已知的任何其他适合的特征。可以使用任何已知的方法进行在此披露的半胱氨酸工程化抗体或其片段的人源化、表面重修或工程化，这些方法诸如但不限于在达姆施罗德(Damschroder)等人，分子免疫学杂志44：3049-3060(2007)；琼斯等人，自然321：522(1986)；里希曼等人，自然
332：323(1988)；费尔海恩等人，科学239：1534(1988))；西姆斯(Sims)等人，免疫学杂志
151：2296(1993)；乔西亚和莱斯克，分子生物学杂志196：901(1987)；卡特等人，美国国家科学院院刊89：4285(1992)；普雷斯塔(Presta)等人，免疫学杂志151：2623(1993)；美国专利号5,639,641；5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,
723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,
089；5,225,539；4,816,567，7,557,189；7,538,195；以及7,342,110；WO90/14443；WO90/
14424；WO90/14430；WO2005/042743；WO2006/102095以及EP229246中描述的那些方法，这些专利各自通过引用全部结合在此，包括其中引用的参考文献。
IV.半胱氨酸工程化抗体和Fc融合蛋白的表达和纯化
[0182] 在某些方面中，本披露提供包含编码含有所披露半胱氨酸突变(在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、
307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、411、417、433、435、或439处的取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，以及其任何组合)的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的核酸序列的多核苷酸。这些多核苷酸可以呈RNA形式或呈DNA形式。
DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成DNA；并且如果单链可以是编码链或非编码(反义)链，那么DNA可以是双链或单链的。在某些方面中，DNA是用于产生非天然发生的重组半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的cDNA。
307、309、311、318、329、340、341、345、357、385、386、387、401、402、411、417、433、435、或439处的取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入，以及其任何组合)的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的核酸序列的多核苷酸。这些多核苷酸可以呈RNA形式或呈DNA形式。
DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成DNA；并且如果单链可以是编码链或非编码(反义)链，那么DNA可以是双链或单链的。在某些方面中，DNA是用于产生非天然发生的重组半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的cDNA。
[0183] 在某些方面中，多核苷酸是分离的。在某些方面中，多核苷酸是基本上纯的。在某些方面中，多核苷酸包含在相同阅读框中融合至有助于例如多肽表达和多肽从宿主细胞分泌的多核苷酸(天然或异源)(例如，充当用于控制多肽从细胞运输的分泌序列的前导序列)的成熟多肽的编码序列。具有前导序列的多肽是前蛋白质并且可以使得前导序列被宿主细胞裂解以形成成熟形式的多肽。在某些方面中，多核苷酸被改变以优化用于某一宿主细胞的密码予使用。
[0184] 在某些方面中，多核苷酸包含在相同阅读框中融合至允许例如纯化编码的多肽的异源标记物序列的成熟半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的编码序列。例如，在细菌宿主的情况下，该标记物序列可以是由pQE-9载体供给的六聚组氨酸标签以便提供对融合至该标记物的成熟多肽的纯化，或者当使用哺乳动物宿主(例如，COS-7细胞)时，该标记物序列可以是来源于流感病毒血凝素蛋白的血球凝集素(HA)标签。
[0185] 多核苷酸可以含有在编码区、非编码区、或两者中的改变。在一些方面中，这些多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加、或缺失而不改变编码的多肽的特性或活性的改变。在一些方面中，多核苷酸变体由归因于遗传密码的简并性的沉默取代产生。多核苷酸变体还可以因为各种原因而产生，例如，为了优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子改变成诸如大肠杆菌的细菌宿主优选的那些密码子)。
[0186] 在一些方面中，可以通过使用寡核苷酸合成仪进行化学合成来构建编码在此披露的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的多核苷酸。此类寡核苷酸可以是基于所希望的多肽的氨基酸序列并且选择在宿主细胞(其中将产生感兴趣的重组多肽)中偏爱的那些密码子来设计。标准方法可以用于合成编码感兴趣的分离多肽的分离多核苷酸序列。例如，完整氨基酸序列可以用于构建反-翻译基因。此外，可以合成含有编码特定分离多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，可以合成并且然后连接几个编码所希望多肽部分的小寡核苷酸。个体的寡核苷酸典型地含有用于互补组装的5′或3′突出端。
[0187] 还提供包含在此描述的多核苷酸的载体和细胞。一旦组装(通过合成、定点诱变或另一种方法)，编码特定的感兴趣的分离多肽(例如，半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白)的多核苷酸序列可以被插入表达载体中并且操作性地连接到适于在所希望宿主中表达该蛋白质的表达控制序列。可以通过核苷酸测序、限制酶切作图以及表达适合宿主中的生物活性多肽来确认适当的组装。如本领域中所熟知的，为了在宿主中获得高表达水平的转染基因，该基因必须操作性地连接到在选择表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列。
[0188] 在某些方面中，重组表达载体用于扩增并表达编码在此披露的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体，它具有编码例如抗HER2抗体的多肽链或和其抗原结合片段的合成的或cDNA来源的DNA片段，操作性地连接到来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的适合的转录和翻译调控元件。转录单位总体上包含以下组件：(1)基因表达中具有调节作用的一个或多个遗传元件，例如转录启动子或增强子，(2)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构序列或编码序列，以及(3)适当的转录和翻译启动和终止序列，如以下详细描述的。此类调控元件可以包括用于控制转录的操纵子序列。可以采用多种多样的表达宿主/载体组合。对于真核宿主有用的表达载体包括例如含有来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒、以及巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对于细菌宿主有用的表达载体包括已知细菌质粒，诸如来自大肠杆菌的质粒，包括pCR 1、pBR322、pMB9以及其衍生物，更广泛的宿主范围质粒，诸如M13和丝状单链DNA噬菌体。
[0189] 用于表达半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的适合的宿主细胞包括在适当的启动子控制下的原核细胞、酵母菌、昆虫或高等真核细胞。原核细胞包括革兰阴性或革兰阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括如下所述哺乳动物起源的已建立的细胞系。还可以采用无细胞翻译系统。用于细菌、真菌、酵母菌、以及哺乳动物细胞宿主的适当的克隆和表达载体由波韦尔斯(Pouwels)等人(克隆载体：实验室手册(Cloning Vectors：A Laboratory Manual)，纽约爱思唯尔公司(Elsevier，N.Y.)，1985)描述，该文献的相关披露通过引用结合在此。关于蛋白质产生(包括抗体产生)方法的其他信息可以在例如美国公开号2008/0187954、美国专利号6,413,746和6,660,501、以及国际专利公开号WO 04009823中找到，这些专利各自通过引用以其全部内容结合。
[0190] 还可以有利地采用不同的哺乳动物或昆虫细胞培养系统，以表达本披露的重组半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白。可以在哺乳动物细胞中进行重组蛋白质的表达，因为此类蛋白质总体上被正确地折叠，适当地修饰并且完全起作用。适合的哺乳动物宿主细胞系的实例包括HEK-293和HEK-293T、由格卢兹曼(Gluzman)(细胞23：175，1981)描述的猴肾细胞的COS-7系、以及包括例如L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、NSO、HeLa以及BHK细胞系的其他细胞系。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件，诸如复制原点、连接有待表达的基因的适合的启动子和增强子、以及其他5′或3′侧接非转录序列、以及5′或3′非翻译序列(诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点)，以及转录终止序列。用于产生昆虫细胞中的异源蛋白质的杆状病毒系统通过卢科和萨莫斯(Luckow&Summers)，生物技术(BioTechnology)6：47(1988)评价。
[0191] 可以根据任何适合的方法来纯化由转化宿主产生的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白。此类标准方法包括色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱以及尺寸分级柱色谱)、离心、差别溶解度，或者通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。亲和标签诸如六组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感外壳序列以及谷胱甘肽-S-转移酶可以附接至蛋白质，以便允许蛋白质通过合适的亲和柱后较容易地得到纯化。还可以使用诸如蛋白质水解、核磁共振和x射线结晶的此类技术来物理性表征分离的蛋白质。
[0192] 例如，可以首先使用商业上可获得的蛋白浓缩过滤器例如艾美康恩(Amicon)或密理博皮里康恩(Millipore Pellicon)超滤单元浓缩来自将重组蛋白分泌到培养基中的系统的上清液。浓缩步骤之后，浓缩物可以施加到适合的纯化基质。在一些方面中，可以采用阴离子交换树脂，例如具有侧接的二乙氨基乙基(DEAE)基团的基质或基底。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、右旋糖酐、纤维素或在蛋白质纯化中常用的其他类型。在一些方面中，可以采用阳离子交换步骤。适合的阳离子交换剂包括含有磺丙基或羧甲基的各种不可溶基质。
[0193] 另外地或任选地，可以使用采用疏水性RP-HPLC介质(例如，具有侧接甲基或其他脂族基团的硅胶)的一个或多个反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤，以便进一步纯化半胱氨酸工程化抗体或其片段。还可以采用不同组合的一些或所有上述纯化步骤以便提供均质的重组蛋白。
[0194] 在培养物中产生的重组半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白可以例如通过以下方法分离：最初从细胞沉淀提取，然后进行一次或多次浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤。可以采用高效液相层析(HPLC)进行最终纯化步骤。用于重组蛋白表达的细胞可以通过任何常规方法来破坏，包括冻融循环、超声处理、机械破坏或使用细胞溶解剂。用于纯化抗体和其他蛋白质的本领域已知的方法还包括，例如在美国专利公开号US2008/
0312425、US2008/0177048以及US2009/0187005中描述的那些，这些专利各自通过引用以其全部内容结合。
V.异源部分对半胱氨酸工程化抗体和Fc融合蛋白的轭合
0312425、US2008/0177048以及US2009/0187005中描述的那些，这些专利各自通过引用以其全部内容结合。
V.异源部分对半胱氨酸工程化抗体和Fc融合蛋白的轭合
[0195] 包含披露的半胱氨酸突变(在氨基酸位置241、243、251、253、258、264、269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、341、345、
357、385、386、387、401、402、411、417、433、435、或439处的取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入、以及其任何组合)的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白可以使用硫醇反应性试剂来位点特异地且有效地与至少一个异源部分偶联。在一些方面中，异源部分的轭合可以发生在由在此披露的一个或多个位置(例如，位置241、243、251、253、258、264、
269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、
341、345、357、385、386、387、401、402、411、417、433、435或439处，或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入)处的至少一个工程化半胱氨酸残基以及任选地在本领域已知的一个或多个位置(例如，位置239、248、254、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、
326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、
418、422、440、441、442、443以及446)处的至少一个工程化半胱氨酸残基提供的硫醇基处。
357、385、386、387、401、402、411、417、433、435、或439处的取代、在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入、以及其任何组合)的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白可以使用硫醇反应性试剂来位点特异地且有效地与至少一个异源部分偶联。在一些方面中，异源部分的轭合可以发生在由在此披露的一个或多个位置(例如，位置241、243、251、253、258、264、
269、271、272、274、280、281、285、288、291、293、294、296、301、307、309、311、318、329、340、
341、345、357、385、386、387、401、402、411、417、433、435或439处，或在位置239与240之间的半胱氨酸氨基酸插入)处的至少一个工程化半胱氨酸残基以及任选地在本领域已知的一个或多个位置(例如，位置239、248、254、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、
326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、
418、422、440、441、442、443以及446)处的至少一个工程化半胱氨酸残基提供的硫醇基处。
[0196] 用于将异源部分轭合至工程化半胱氨酸残基的不同方法是本领域已知的。用于这种轭合的试剂典型地带有反应性官能团，该反应性官能团可以与半胱氨酸(例如，本发明的工程化半胱氨酸)的半胱氨酸硫醇直接反应以形成轭合化合物，或与接头试剂直接反应以形成接头标记的中间体，或与接头蛋白直接反应以形成轭合化合物。在接头的情况下，可以使用的有机化学反应、条件和试剂包括但不限于：半胱氨酸基团与接头试剂反应以经由共价键形成蛋白质接头中间体，接着与活化的异源部分反应；以及异源部分的亲核基团与接头试剂反应以经由共价键形成异源部分-接头中间体，接着与半胱氨酸基团(例如，本发明的工程化半胱氨酸)反应。
[0197] 在某些方面中，双功能接头适用于本发明。例如，双功能接头包含用于共价连接到一个或多个半胱氨酸残基的硫醇修饰基团和用于共价或非共价连接到轭合化合物的至少一个附接部分(例如，第二硫醇修饰部分)。各种蛋白质和化合物(以及接头)可以用于制备本发明的化合物。半胱氨酸硫醇基是亲核的并且能够反应以便与包括以下各项的接头试剂或化合物-接头中间体或药物上的亲电子基团形成共价键：(i)活性酯，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、以及酰基卤；(ii)烷基卤和苄基卤，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基、以及马来酰亚胺基团；以及(iv)二硫化物，包括经由硫化交换的吡啶基二硫化物。异源部分或接头上的亲核基团包括但不限于胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、以及芳酰肼，这些亲核基团能够反应以便与接头部分和接头试剂上的亲电子基团形成共价键。在某些方面中，标记试剂包括马来酰亚胺、卤代乙酰基、碘乙酰胺琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸酯、磺酰氯、2，6-二氯三嗪基，
[0198] 可以通过在评估轭合反应之后剩余的游离硫醇的存在来确定异源分子与在此披露的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白的轭合效率。可以通过各种领域内接受的技术来确定游离硫醇基的存在。在某些方面中，该方法在此提供与异源部分的有效轭合，其中该轭合效率是至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少
90％、至少95％、至少98％或更高，如通过轭合反应之后剩余的游离硫醇水平所测量的。
90％、至少95％、至少98％或更高，如通过轭合反应之后剩余的游离硫醇水平所测量的。
[0199] 在一些方面中，该方法在此使得异源部分轭合至在此披露的含有游离半胱氨酸残基的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白，这些游离半胱氨酸残基包含封闭或封端的巯基。此类封端包括蛋白质、肽、离子以及与巯基相互作用的其他物质并且防止或抑制轭合物形成。在一些方面中，在此披露的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白可能需要在轭合反应之前去封端。在具体方面中，半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白是未封端的并且显示能够轭合的游离巯基。在具体方面中，在此披露的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白经受不干扰或重排天然发生的二硫键的去封端反应。
[0200] 在一些方面中，在此披露的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白可以经受轭合反应，其中有待轭合的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白以至少1mg/ml、至少2mg/ml、至少
3mg/ml、至少4mg/ml、至少5mg/ml或更高的浓度存在。
3mg/ml、至少4mg/ml、至少5mg/ml或更高的浓度存在。
[0201] 硫醇反应性试剂可以是例如多功能接头试剂、捕获(即，亲和性)标记试剂(例如，生物素-接头试剂)、检测标记(例如，荧光团试剂)、固相固定试剂(例如，SEPHAROSETM、聚苯乙烯、或玻璃)、或药物-接头中间体。硫醇反应性试剂的一个实例是N-乙基马来酰亚胺(NEM)。在一个示例性方面中，半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白与多功能接头试剂的反应提供具有可以进一步与异源部分(例如，药物部分)反应的功能化接头的中间体轭合化合
物。
物。
[0202] 这种方法可以应用到其他硫醇反应性试剂的轭合中，其中反应基是例如马来酰亚胺、碘乙酰胺、吡啶基二硫化物、卤代乙酰基、碘乙酰胺琥珀酰亚胺酯(例如NHS、N-羟基琥珀酰亚胺)、异硫氰酸酯、磺酰氯、2，6-二氯三嗪基、五氟苯酯以及亚磷酰胺、或其他硫醇反应性轭合配伍物(豪格兰(Haugland)，2003，荧光探针和研究化学品手册的分子探针手册(Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals)，分子探针公司(Molecular Probes，Inc.)；布林克利(Brinkley)，1992，生物轭合化学3：2；加曼(Garman)，1997，非放射性标记：实践介绍(Non-Radioactive Labelling：A Practical Approach)，伦敦学术出版社(AcademicPress，London)；米恩斯(Means)(1990)生物轭合化学1：2；赫曼森，G.(Hermanson，G.)，生物轭合技术(Bioconjugate Techniques)(1996)圣地亚哥学术出版社(Academic Press，San Diego)，第40-55、643-671页)。
[0203] 因此，在此披露的半胱氨酸工程化抗体或Fc融合蛋白可以使用本领域已知的硫醇轭合方法轭合到至少一个诸如以下各项的异源部分：毒素、药物、放射性核素、免疫调节剂、细胞因子、淋巴因子、趋化因子、生长因子、肿瘤坏死因子、激素、激素拮抗剂、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微小RNA、肽核酸、光敏治疗剂、抗血管生成剂、促凋亡剂、非天然氨基酸、肽、脂质、碳水化合物、支架分子、荧光标签、可视化肽、生物素、血清半衰期延长剂、捕获标签、螯合剂、固相支撑体、或其组合，其中轭合是在工程化半胱氨酸之一处。VI.药用组合物
[0204] 本披露提供包含与稀释剂、载体或赋形剂一起配制的在此披露的至少一种轭合化合物的配制品。本披露还提供包含与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起配制的在此披露的至少一种轭合化合物的药用组合物。此类配制品或药用组合物可以包含一种轭合化合物或例如但不限于两种或更多种不同轭合化合物的组合。例如，在此披露的配制品或药用组合物可以包含结合不同靶标(例如，不同表位)或具有互补活动的轭合化合物的组合。
[0205] 为了制备包含在此披露的轭合化合物的药用组合物或无菌组合物，可以将该轭合化合物与药学上可接受的载体或赋形剂混合。治疗剂和诊断剂的配制品可以通过与呈例如冻干粉、浆液、水溶液、洗剂、或悬浮液形式的生理上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂混合来制备。
[0206] 包含在此披露的轭合化合物的药用组合物还可以在联合治疗(诸如，与其他试剂组合)中给予。例如，联合治疗可以包含与至少一种疗法组合的在此披露的轭合化合物，其中该疗法可以是外科手术、免疫疗法、化学疗法、放射疗法、或药物疗法。
[0207] 药用化合物可以包含一种或多种药学上可接受的盐。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括从诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等无毒性无机酸衍生的以及从诸如脂族一元和二元羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族酸和芳族磺酸等无毒性有机酸衍生的盐。碱加成盐包括从诸如钠、钾、镁、钙等碱金属衍生的以及从诸如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等无毒有机胺衍生的盐。
[0208] 药用组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
[0209] 可以用于在此披露的药用组合物中的适合的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、及其适合的混合物、植物油如橄榄油以及可注射有机酯例如油酸乙酯。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣材料、在分散液的情况下通过维持所要求的颗粒大小、以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。
[0210] 这些药用组合物还可以含有诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂以及分散剂的佐剂。可以通过灭菌程序并且通过包括不同抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、山梨酸苯酚等)两者来确保防止微生物的出现。还令人希望的是在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠等等。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的吸收延长。
[0211] 药用组合物在制造和贮藏条件下可以是无菌和稳定的。该组合物可以被配制成溶液、微乳、脂质体、或适合于高药物浓度的其他有序结构。该载体可以是含有以下物质的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)以及其适合的混合物。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过维持所要求的颗粒大小、以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在许多情况下，可以适合的是在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨醇)、或氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现可注射组合物的吸收延长。
[0212] 可以通过以下各项来制备无菌可注射溶液：将活性化合物以所需的量，根据需要，与一种以上列举的成分或这些成分的组合并入适当的溶剂中，然后进行灭菌微孔过滤。总体上，通过将有效化合物掺入无菌载体来制备分散体，该无菌载体含有基础分散介质以及来自以上列举的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，适当的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥(冻干法)，这些方法产生活性成分的粉末以及来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外的所需成分。
[0213] 在一个方面中，这些组合物在此是基本上不含内毒素和/或相关热原物质的无热原配制品。内毒素包括限制在微生物体内并且在微生物破裂或死亡时释放出来的毒素。热原物质还包括来自细菌和其他微生物外膜的诱导发热的热稳定的物质(糖蛋白类)。如果向人类给予这两种物质，会引起发热、低血压和休克。由于潜在的有害影响，即使低量的内毒素也必须从静脉内给予的药物溶液中适当地去除。食品与药物管理局(“FDA”)已经针对静脉内药物应用，设置了在单个一小时内每公斤体重每剂量5个内毒素单位(EU)的上限。当以每公斤体重几百或几千毫克的量给予治疗性蛋白质时，甚至痕量的内毒素也必须适当地去除。
[0214] 在一个方面中，组合物中的内毒素和热原水平是小于10EU/mg、小于5EU/mg、小于1EU/mg、小于0.1EU/mg、小于0.01EU/mg、或小于0.001EU/mg。在某些实施例中，组合物中的内毒素和热原水平是小于约10EU/mg、小于约5EU/mg、小于约1EU/mg、或小于约0.1EU/mg、小于约0.01EU/mg、或小于约0.001EU/mg。
VII.诊断方法
VII.诊断方法
[0215] 在某些方面中，在此提出的轭合化合物可以用于体内和/或体外诊断测定。此类诊断测定包括例如(i)检测是否存在疾病或病症、(ii)监测或预测疾病或病症(诸如但不限于癌症)的发展或进展、(iii)临床测试过程诸如确定具体疗法的功效、或(iv)鉴定对于某种治疗的候选患者。
[0216] 在一些方面中，在此披露的技术提供了确定感兴趣的靶分子存在于怀疑含有这种分子的样品中的方法。在一些方面中，该方法包括使样品暴露于在此披露的轭合化合物并且确定轭合化合物与样品中感兴趣的靶分子结合，其中轭合化合物与样品中感兴趣的靶分子的结合指示在样品中存在感兴趣的靶分子。在一些方面，该样品是生物样品。在某些方面中，生物样品是来自正经历或怀疑经历与感兴趣的靶分子相关的疾病或病症的一种哺乳动物。
[0217] 例如，可以通过以下各项来实现检测在此披露的轭合化合物与感兴趣的靶分子(例如，细胞表面上的靶标)的结合：
(a)在允许于轭合化合物与感兴趣的靶分子之间形成复合物的条件下，使待测样品(例
如，细胞)任选地与对照样品一起，暴露于轭合化合物；并且
(b)测定轭合化合物与靶分子的结合程度。
(a)在允许于轭合化合物与感兴趣的靶分子之间形成复合物的条件下，使待测样品(例
如，细胞)任选地与对照样品一起，暴露于轭合化合物；并且
(b)测定轭合化合物与靶分子的结合程度。
[0218] 在此披露的轭合化合物可以用于在有需要的受试者中检测癌症、自身免疫性、炎性或感染性疾病或病症的方法，其中该方法包括向受试者给予该轭合化合物。可以例如使用ELISA检测轭合化合物与靶标之间的复合物形成。当使用一个对照样品与测试样品时，可以检测两种样品中的复合物，并且在这些样品之间复合物形成的任何统计学显著性差异指示测试样品中存在感兴趣的靶分子。
[0219] 在某些方面中，在此披露的轭合化合物可以用于使用体内诊断测定来检测感兴趣的靶分子的过度表达或扩增。在一些方面中，将轭合化合物添加至一个样品，其中轭合化合物结合有待检测的感兴趣的靶分子并且用一个可检测标记(例如，放射性同位素或荧光标记)来标记，并且从外部扫描患者以便定位该标记。可以在福尔马林固定的石蜡包埋的组织TM上进行FISH测定，诸如INFORM (由亚利桑那州的维塔纳(Ventana，Ariz.)出售)或
PATHVISIONTM(伊利诺伊州威赛斯公司(Vysis，III.))，以确定感兴趣的靶分子例如在肿瘤中的过度表达程度(如果有的话)。
PATHVISIONTM(伊利诺伊州威赛斯公司(Vysis，III.))，以确定感兴趣的靶分子例如在肿瘤中的过度表达程度(如果有的话)。
[0220] 在某些方面中，在此披露的轭合化合物可以用于一种诊断与表达感兴趣的靶分子的细胞增加相关的细胞增殖性病症的方法之中。在一些方面中，该方法包括使生物样品中的测试细胞与在此披露的轭合化合物接触；通过检测在此披露的轭合化合物的结合来确定样品的测试细胞中感兴趣的靶分子水平；并且比较结合对照样品中的细胞的轭合化合物水平，其中结合的轭合化合物水平被归一化成测试样品和对照样品的细胞表达的感兴趣的分子数目，并且其中测试样品中结合的轭合化合物水平与对照样品相比更高表明存在与表达感兴趣的靶分子的细胞相关的细胞增殖性病症。
[0221] 在某些方面中，在此披露的轭合化合物可以用于一种检测血液或血清中感兴趣的可溶性分子的方法之中。在一些方面中，该方法包括使来自怀疑经历与感兴趣的分子相关的病症的哺乳动物的血液或血清测试样品与在此披露的轭合化合物相接触，并且检测测试样品中感兴趣的可溶性分子相对于来自正常哺乳动物的血液或血清的对照样品的增加。在一些方面，检测方法作为一种诊断与哺乳动物血液或血清中感兴趣的可溶分子的增加相关的病症的方法是有用的。
[0222] 在某些方面中，在此披露的轭合化合物可以通过诸如以下各项的生物医学和分子成像的不同方法和技术而用作成像生物标记物和探针：(i)MRI(磁共振成像)；(ii)微CT(计算机化断层显像)；(iii)SPECT(单光子发射计算机断层术)；(iv)PET(正电子发射断层扫描)(参见陈(Chen)等人(2004)生物轭合化学15：41-49)；(v)生物发光；(vi)荧光；以及(vii)超声波。免疫闪烁成像是一种成像过程，其中用放射性物质标记的抗体来源的化合物被给予动物或人类患者，并且获得身体中抗体所定位的位点的图像(美国专利号6,528,624)。成像生物标记物可以被客观地测量并且评估为正常生物过程、致病过程、或对治疗性干预的药理学响应的指示物。成像生物标记物可以提供关于以下的药效学(PD)治疗信息：
(i)靶蛋白的表达，(ii)治疗剂对靶蛋白的结合，即选择性，以及(iii)清除率和半衰期药代动力学数据。
VIII.治疗方法
(i)靶蛋白的表达，(ii)治疗剂对靶蛋白的结合，即选择性，以及(iii)清除率和半衰期药代动力学数据。
VIII.治疗方法
[0223] 本披露还提供一种治疗有需要的受试者的癌症、自身免疫性、炎性或感染性疾病或病症的方法，该方法包括向受试者给予在此披露的轭合化合物。在一些方面中，该方法进一步包括给予另外的疗法，其中该另外的疗法是例如化学疗法、生物疗法、免疫疗法、放射疗法、激素疗法、以及外科手术。还提供一种向细胞递送异源部分(例如，治疗剂)的方法，该方法包括用在此披露的轭合化合物治疗该细胞。在一些方面中，该轭合化合物可以被细胞内化。
[0224] 在不同方面中，在此披露的轭合化合物可以被给予细胞，例如癌细胞。轭合化合物的生物效应可以是例如细胞死亡、细胞增殖抑制、效应缺乏、细胞形态的变化、或细胞生长模式的变化。在一些方面中，该轭合化合物包含如上所述的可检测标记。在某些方面中，标记指示出细胞内肿瘤抗原的位置。
[0225] 在某些方面中，轭合化合物可以被给予需要治疗的受试者。在不同方面中，轭合化合物携带靶向肿瘤抗原的药物或毒素。在一些方面中，该轭合化合物携带可以鉴定或定位靶标(例如，抗原)的可检测标记。一些方面包括检测轭合化合物的生物效应，例如治疗效应。在某些方面中，可以监测受试者的病状。轭合化合物的医学剂量可以响应于监测来调节。
[0226] 在此披露的轭合化合物和包含这些轭合化合物的组合物适用于许多目的，例如，作为预防、管理或治疗大范围慢性和急性疾病和病症的疗法，这些疾病和病症包括但不限于自身免疫和/或炎性病症、过度增殖病症(诸如良性肿瘤或恶性肿瘤、白血病以及淋巴恶性肿瘤)；传染性疾病，包括病毒、细菌和真菌疾病。在一些方面中，在此披露的组合物和方法可以与用于预防、管理或治疗以上疾病和病症的一种或多种常规疗法一起使用。在一些方面中，还提供了使用在此披露的轭合化合物灭活不同传染剂如病毒、真菌、真核微生物、以及细菌的方法。
[0227] 在一些方面中，还提供了使用在此披露的轭合化合物和包含这些轭合化合物的组合物消耗细胞群的方法。在一个方面中，在此的方法可以用于消耗以下细胞类型：嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞、单核细胞、内皮细胞以及肿瘤细胞。
[0228] 在某些方面中，在此披露的轭合化合物和包含这些轭合化合物的组合物还可以适用于诊断和检测疾病或其症状。在一些方面中，这些组合物可以适用于监测疾病进展。在不同方面中，这些组合物可以适用于监测治疗方案。在某些方面中，这些组合物适用于离体应用(诸如诊断试剂盒)中的诊断。
[0229] 在一些方面中，在此披露的轭合化合物和包含这些轭合化合物的组合物可以靶向作为内化的细胞表面受体的抗原。在某些方面中，靶抗原是细胞外抗原。在一些方面中，靶标是核内抗原。在一些方面中，在此披露的轭合化合物一旦结合，就内化至细胞内，其中内化是比对照抗体多至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％、至少约100％、至少约110％、至少约130％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、或至少约170％。
[0230] 在某些实施例中，在此披露的轭合化合物一旦结合，就内化至细胞内，其中，内化是比对照抗体多1％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-100％、100％-110％、110％-120％、120％-130％、
130％-140％、140％-150％、150％-160％、160％-170％、或更高。
IX.试剂盒
130％-140％、140％-150％、150％-160％、160％-170％、或更高。
IX.试剂盒
[0231] 本披露还提供包含可以用于进行在此披露的方法的在此披露的轭合化合物的制品，例如，试剂盒。在某些方面中，试剂盒包括在一个或多个容器中的至少一种纯化的轭合化合物。在一些方面中，试剂盒含有所有必要和/或足够进行检测测定的组件，包括所有对照、用于进行测定的指导，以及例如用于分析和表示结果的任何必要的软件。本领域的技术人员将易于认识到，在此披露的轭合化合物可以易于并入本领域中熟知的已建立的试剂盒形式之一。在一些方面中，该试剂盒包括一个容器和在该容器上或与该容器相关的一个标签或包装说明书。适合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、泡罩包装等。这些容器可以由诸如玻璃或塑料的各种材料形成。在一些方面中，该容器可以容纳有效于治疗特定疾病或病症、包含在此披露的轭合化合物的组合物，并且可以具有一个无菌进入孔(例如该容器可以是静脉输注液袋或具有皮下注射针可穿透的塞子的小瓶)。该标签或包装说明书可以指示该组合物用于治疗选择的病状，诸如癌症。可替代地或另外地，该试剂盒可以进一步包括第二个(或第三个)容器，该第二个(或第三个)容器包含药学上可接受的缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液以及右旋糖溶液。该试剂盒可以进一步包括从商业和使用者立场上来看所希望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、以及注射器。
[0232] 以上引用的所有参考文献，连同在此引用的所有参考文献，是通过引用以其全文结合在此。
[0233] 通过说明而不是通过限制的方式，提供以下实例。实例
实例1
Fc半胱氨酸扫描
实例1
Fc半胱氨酸扫描
[0234] 将Fc区的187个氨基酸用QuikChange诱变单独突变为半胱氨酸。检查高流通量小规模转染和表达系统中的表达和聚集水平。使用PhyNexus微提取器自动化仪器初始检查高流通量自动化固相轭合方法中的轭合效率并且将其归一化为Fc-T289的轭合效率。(在此测定中，Fc-T289C具有高于95％的轭合效率。)
[0235] 进行手动液相、中等规模轭合以确认这些突变的轭合效率，这些突变具有对于T289C可见的轭合效率的至少约50％的轭合效率。在摇瓶中表达Fc突变体，并且测定在条件培养基中的表达水平。通过蛋白A纯化Fc突变体，并且通过SEC分析聚集水平。
[0236] 表2示出在Phynexus方法中具有对于T289C可见的轭合效率的至少约50％的轭合效率的突变体的轭合和小规模表达数据。＞100％的轭合效率是粗体且加下划线的；80％-
100％的轭合效率是加下划线的；50％-80％的轭合效率是纯文本。未示出具有小于50％的轭合效率的克隆。在表3中还提供了使用手动液相轭合测定的选定突变体的轭合效率。表3示出选定突变体的表达水平和单体含量百分比。
100％的轭合效率是加下划线的；50％-80％的轭合效率是纯文本。未示出具有小于50％的轭合效率的克隆。在表3中还提供了使用手动液相轭合测定的选定突变体的轭合效率。表3示出选定突变体的表达水平和单体含量百分比。
[0237] 还通过质谱分析法测量E258C和H435C与AF488的轭合效率并且将其与先前报道的Fc突变S239C、T289C和轻链突变V205C(在此称为LC-V205C)的效率相比较。如表4中所总结，所有突变均具有接近100％的轭合效率(DAR＝2是100％轭合)。包括野生型抗体作为阴性对照(即，未工程化半胱氨酸残基)。
[0238] 如由这些研究中可以看出，工程化到以下表2中提供的大多数位点中的半胱氨酸具有至少约50的轭合效率并且充分表达。这些位点可以适用于产生抗体或Fc融合蛋白轭合物。具体地，在包括258、274、286、289、291、293、296、318、329、340、341、342、345、401、415、
433、435以及443的多个位置处的工程化半胱氨酸在一个或两个测定形式中表现出非常高的轭合效率并且充分表达。预期在一个或多个这些位点处的工程化半胱氨酸残基用于有效产生位点特异性抗体或Fc融合蛋白轭合物。
表2：轭合效率研究汇总
表3：选定突变体的表达水平和单体含量百分比
表4：通过质谱分析法测量的轭合效率
Ab-轭合物 DAR(IgG) +2药物比率(IgG)
1C1-E258C-AF488 2.04 98％(HC)
1C1-H435C-AF488 1.98 96％(HC)
1C1-S239C-AF488 1.98 96％(HC)
1C1-LC-V205C-AF488 2.06 99％(LC)
1C1-T289C-AF488 2.00 94％(HC)
实例2
插入突变体和初始血清稳定性筛选
433、435以及443的多个位置处的工程化半胱氨酸在一个或两个测定形式中表现出非常高的轭合效率并且充分表达。预期在一个或多个这些位点处的工程化半胱氨酸残基用于有效产生位点特异性抗体或Fc融合蛋白轭合物。
表2：轭合效率研究汇总
表3：选定突变体的表达水平和单体含量百分比
表4：通过质谱分析法测量的轭合效率
Ab-轭合物 DAR(IgG) +2药物比率(IgG)
1C1-E258C-AF488 2.04 98％(HC)
1C1-H435C-AF488 1.98 96％(HC)
1C1-S239C-AF488 1.98 96％(HC)
1C1-LC-V205C-AF488 2.06 99％(LC)
1C1-T289C-AF488 2.00 94％(HC)
实例2
插入突变体和初始血清稳定性筛选
[0239] 除实例1中描述的半胱氨酸取代之外，产生两个插入突变体，其中半胱氨酸被插入在残基239与240之间(表示为C239ins)或残基238与239之间(表示为238-ins)。C239ins表现出比得上T289C的轭合效率(参见表6并且数据未示出)。这是出人意料的，因为V240C突变的轭合效率非常低(仅约11％)。
[0240] 检查这些变体中的若干变体的血清稳定性。对于初始稳定性测定，亚历克萨荧光染料488 C5-马来酰亚胺(AFF488)轭合至选定位点作为便于分析的替代药物货物。将样品用正常人血清(NHS)或PBS缓冲液孵育3-7天。在用NHS或PBS孵育之后，使用荧光尺寸排阻色谱(SEC)测定法监测含有AFF488的轭合物的稳定性。使用在IgG峰中剩余的荧光百分比估算该稳定性。对于用人血清孵育的样品，AF488转移到人血清白蛋白(HSA)(在血清中药物交换的主要受者)的百分比可以直接测量为HSA峰中的信号百分比。图2-图8分别示出突变体E258C、H435C、L443C、C239ins、S239C、LC-V205C、以及T289C的SEC谱图，并且包括用NHS(A图和C图)和PBS(B图和D图)在第0天(A图和B图)和在第7天(C图和D图)孵育的样品。这些研究的结果绘制在图9中并且总结在表5之中。
[0241] 发现在这些研究中测试的四个轭合位点(E258C、H435C、L443C以及C239ins)在血清孵育7天后具有至少70％完整的轭合化合物，类似于对于包含先前报道的LC-V205C和S239C突变的一些抗体所观察到的稳定性(参见表5)。
表5：与AF488轭合的选定Cys突变体在血清孵育7天的稳定性
实例3
Fc受体结合稳定性和热稳定性测量
表5：与AF488轭合的选定Cys突变体在血清孵育7天的稳定性
实例3
Fc受体结合稳定性和热稳定性测量
[0242] 测试若干突变体与各种Fc受体的结合。在ELISA测定中，结合FcRn的E258C、S239C、C239ins、以及LC-V205C比得上野生型(WT)(图10A)。此外，当E轭合至A488时，258C、LC-V205C和S239C与FcRn的结合是基本上相同的(图10B)。这些数据表明，这些突变甚至当轭合至药物时也不影响FcRn结合。相比之下，H435C突变破坏FcRn结合(数据未示出)，这对应于先前报道的观察：在位置EU 435处的带正电荷残基是FcRn结合所需要的。
[0243] 进行BIACORE分析以便测定C239ins、S442C以及L234F/S239A/S442C三倍突变对于人Fc受体、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa(158V和158F等位基因两者)以及FcRn的亲和性。在图11中示出的数据证实C239ins减少与FcγRI的结合、破坏与FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa(158V和158F等位基因两者)的结合但对FcRn结合具有可忽视的影响。相比之下，S442C对与测试的任何Fc受体的结合几乎没有影响。正如预期的，L234F和S239A的增加(据报道减少与某些FcγR的结合的突变)导致与FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa(158V和158F等位基因两者)的结合大幅减少。因此，当效应子功能是不希望的时，C239ins突变可以特别地适用于产生位点特异性抗体或Fc融合轭合物。
[0244] 使用差示扫描热量法(DSC)检查E258C、S239C、LC-V205C、C239ins以及H435C与野生型(WT)相比的热稳定性。如图12所示，E258C、239C以及Lc-V205C突变的DSC谱图与WT基本上相同，这表明这些突变并不影响模型1C1 IgG1的热稳定性，如通过DSC所测的。对于C239ins和H435C两者出现一个新的较低熔融峰，然而两种突变的Tm1仍然高于60℃，这表明对这些突变的热稳定性影响极小。
实例4
单个突变毒素轭合物的血清稳定性-细胞毒性
实例4
单个突变毒素轭合物的血清稳定性-细胞毒性
[0245] 1C1-Fc-Cys突变体-轭合物：在细胞毒性测定中测试2个药物/Ab的血清稳定性：1C1-S239C、1C1-E258C、1C1-H435C、1C1-L443C、1C1-LC-V205C、1C1-239ins、以及1C1-T289C。还测试使用经典轭合制备的1C1-ccADC 6药物/Ab对照、用于细胞毒性测定的R347-S239C-阴性对照和1C1-WT(用作非轭合)。每个抗体-药物轭合物(ADC)包含基于奥瑞斯他汀的毒素。
[0246] 如表6所示，每个cys突变体具有88％-98％轭合效率，相比之下野生型示出仅2％背景轭合。将ADC用血清孵育0、3或7天，并且测定如以下实例6所描述的细胞毒性。各单个突变和对照的细胞毒性曲线绘制在图13A、图13B和图13C(分别是第0、3和7天)之中。还在曲线图下面的表中提供EC50值。来自此研究的所有数据均总结在表7中并且提供第3和第7天的倍数EC50损失。
[0247] 当使用马来酰亚胺化学品连接时，1C1-E258C-ADC、1C1-H435C-ADC、1C1-L443C-ADC、以及1C1-239ins-ADC在血清孵育之后是稳定的，并且比得上据报道在血清中稳定的其他位点(例如，LC-V205C)。这些突变的EC50被保留，甚至在血清孵育7天之后仍保留。1C1-T289C-ADC失去一些活性。参见表7。使用1C1-238-ins-ADC进行类似的研究，然而此突变在7天过程中显示多于6.25倍的EC50损失(数据未示出)，这表明在此位点使用马来酰亚胺化学品的轭合物不稳定并且在血清中孵育时迅速失去活性。
[0248] Fc区中位于EU位置258、435和443(E258C、H435C、L443C)处和位于EU位置239与240(239ins)之间的新工程化插入位点的四个工程化半胱氨酸位点被鉴定为高度易轭合并且具有示例性血清稳定性。
表6：1C1-Fc-Cys突变体的轭合效率
位置 质谱
1C1-S239C 97％
1C1-E258C 97％
1C1-T289C 92％
1C1-H435C 88％
1C1-L443C 97％
1C1-LC-V205C 98％
1C1-239ins 96％
R347-S239C 97％
1C1-WT 2％
表7：血清孵育后1C1-单个Cys突变-ADC对DU145细胞的EC50和细胞毒性损失。
实例5
双重Cys突变毒素轭合物的血清稳定性-细胞毒性
表6：1C1-Fc-Cys突变体的轭合效率
位置 质谱
1C1-S239C 97％
1C1-E258C 97％
1C1-T289C 92％
1C1-H435C 88％
1C1-L443C 97％
1C1-LC-V205C 98％
1C1-239ins 96％
R347-S239C 97％
1C1-WT 2％
表7：血清孵育后1C1-单个Cys突变-ADC对DU145细胞的EC50和细胞毒性损失。
实例5
双重Cys突变毒素轭合物的血清稳定性-细胞毒性
[0249] 在某些应用中，可能希望每个抗体具有多于两个药物(即，4或更多的DAR)。将上述Cys突变以与彼此和/或与其他突变的不同组合进行测试，其他突变包括在一些情况下消融Fc介导的效应子功能的突变L234F-L235F(指定为“FF”)，并且使用在实例6中描述的细胞毒性测定来测试血清稳定性。1C1-Fc-2Cys突变体和轭合物：在细胞毒性测定中测试4个药物/Ab轭合物的血清稳定性：1C1-239ins-E258C、1C1-239ins-H435C、1C1-239ins-S442C、1C1-FF-E258C-H435C、1C1-FF-E258C-S442C、以及1C1-FF-H435C-S442C。还包括用于细胞毒性测定的1C1-T289C-2个药物/Ab比较物和R347-S239C-2个药物/Ab阴性对照。所有ADC均包含使用马来酰亚胺化学品轭合的基于奥瑞斯他汀的毒素。
[0250] 如表8所示，每个cys突变体具有约92％-100％轭合效率。将ADC用血清孵育0、3或7天，并且测定如以下实例6所描述的细胞毒性。各组合突变和对照的细胞毒性曲线绘制在图14A、图14B和图14C(分别是第0、3和7天)之中。还在曲线图下面的表中提供了EC50值。来自此研究的所有数据均总结在表9中并且提供第3和第7天的倍数EC50损失。
[0251] 在血清孵育之后所有测试的1C1-双Cys突变体ADC均是稳定的。EC50被保留，特别是在血清孵育7天之后。1C1-T289C-ADC失去一些活性。参见表9。表8：1C1-Fc-Cys突变体的轭合效率
表9：血清孵育后1C1-双Cys突变体ADC对DU145细胞的EC50和细胞毒性损失。
实例6
材料和方法
表9：血清孵育后1C1-双Cys突变体ADC对DU145细胞的EC50和细胞毒性损失。
实例6
材料和方法
[0252] Fc半胱氨酸突变：为了方便诱变，将构成1C1抗体的人IgG1重链克隆到pOE-单个盒载体(医学免疫公司(MedImmune LLC))之中。通过使用QuikChange II XL定点诱变试剂盒(加利福尼亚州圣克拉拉安捷伦科技公司(Agilent Technologies Inc.，Santa Clara，CA))以96孔板形式根据制造商说明将Fc片段上的187个氨基酸单独突变成半胱氨酸。通过测序确认每个位置的半胱氨酸突变。使用类似方法学来产生半胱氨酸插入突变。
[0253] 高流通量小规模转染和表达：在96孔板中将1C1 κ链克隆到pOE-κ载体(医学免疫公司)中，将1C1 κ链载体和1C1重链载体(野生型或具有突变的半胱氨酸)的DNA共转染到293F细胞(纽约grand Island生物技术公司(Life Technologies，Grand Island，NY))中，在转染之后第5天收获含有表达的1C1抗体的条件培养基(CM)，通过使用由纯化1C1 WT抗体制成的标准曲线的Octet来确定CM中的抗体浓度，还通过蛋白质凝胶来分析表达以估算聚集水平。
[0254] 高流通量自动化固相位点特异性轭合：将亚历克萨荧光染料488 C5-马来酰亚胺(纽约州格兰德岛生命技术公司(Life Technologies Grand Island，NY))用作便于分析的替代药物货物。通过使用PhyNexus微提取器自动化(MEA)仪器(加利福尼亚州圣何塞的
PhyNexus公司(PhyNexus，Inc.，SanJose，CA))进行高流通量自动化轭合。在Phynexus移液管尖端中的固定化蛋白A上捕获CM中的1C1抗体，通过三(2-羧乙基)膦(TCEP)(伊利诺伊州罗克福德的赛默飞科技公司(Thermo Scientific，Rockford，IL))还原以去除封端的半胱氨酸，通过脱氢抗坏血酸(dhAA)(密苏里州圣路易斯市的西格马阿德里奇公司(Sigma-
Aldrich Corp.，St.Louis，MO))氧化以再形成抗体的链内二硫键，并且与10倍摩尔的过量亚历克萨荧光染料488 C5-马来酰亚胺轭合。由N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)(密苏里州圣路易斯市的西格马阿德里奇公司)停止反应，通过IgG洗脱缓冲液洗脱轭合的抗体。
PhyNexus公司(PhyNexus，Inc.，SanJose，CA))进行高流通量自动化轭合。在Phynexus移液管尖端中的固定化蛋白A上捕获CM中的1C1抗体，通过三(2-羧乙基)膦(TCEP)(伊利诺伊州罗克福德的赛默飞科技公司(Thermo Scientific，Rockford，IL))还原以去除封端的半胱氨酸，通过脱氢抗坏血酸(dhAA)(密苏里州圣路易斯市的西格马阿德里奇公司(Sigma-
Aldrich Corp.，St.Louis，MO))氧化以再形成抗体的链内二硫键，并且与10倍摩尔的过量亚历克萨荧光染料488 C5-马来酰亚胺轭合。由N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)(密苏里州圣路易斯市的西格马阿德里奇公司)停止反应，通过IgG洗脱缓冲液洗脱轭合的抗体。
[0255] 轭合效率分析：选择具有通过质谱分析的高于95％的轭合效率的1C1-T289C作为轭合基准对照。通过荧光SEC分析轭合效率，使用T289C-AF488制备标准曲线：将不同量的T289C-AF488负载到具有荧光探测器的HPLC-SEC上(Ex＝494，Em＝519)。使用280nm(作为X轴)和494nm(作为Y轴)处的曲线下面积(AUC)值制备标准曲线。该标准曲线是线性的，R2非常接近1。将25ul 1C1-突变体-AF488负载到SEC柱上，使用每个样品的280与494的面积值使用T289C-AF488标准曲线计算轭合效率。将轭合效率表示为T289C轭合的％，还通过质谱来测量一些突变体的轭合效率，并且它们是完全相关的。
[0256] 中等规模表达和手动轭合：进行手动轭合以确认轭合效率。在摇瓶的293F细胞中表达具有通过自动化固相轭合方法得到的高于50％基准T289C轭合水平的1C1-Fc突变体，并且通过蛋白A HPLC测量条件培养基中的表达水平。通过蛋白A亲和色谱法纯化1C1-Fc突变体，并且通过SEC分析聚集水平。对于手动轭合，将2mg 1C1-Fc突变体在37℃下在50mM TCEP中还原3h以使工程化半胱氨酸去封端，接着在轭合缓冲液(PBS+1mMEDTA，pH 7.2)中进行充分透析以去除游离半胱氨酸，然后在室温下在50mM dhAA中氧化4h以再形成链内二硫键。将此材料在室温下与8倍摩尔的过量亚历克萨荧光染料488 C5-马来酰亚胺轭合1h，通过N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)该停止反应，通过在旋转浓缩器中将样品稀释和浓缩3个循环来去除游离未轭合AF488，将轭合的1C1-Fc突变体浓缩为最终体积0.3-0.5ml，通过nano-drop测量蛋白质浓度。通过荧光SEC和质谱测量轭合效率。
[0257] 用于稳定性测定的ADC血清孵育：将在50ul PBS(最终体积的20％)中的100ug AF488轭合的1C1-Fc突变体与200ul正常人血清或PBS(最终体积的80％)混合。在过滤后，将
10ul混合物负载到HPLC荧光SEC柱以获得血清孵育对照第0天的荧光谱图。将其余各混合物在37℃下孵育3天和7天。以与第0天的样品相同的方式获得荧光谱图。通过将抗体-药物轭合物(ADC)的荧光峰(面积)除以总荧光(面积)以得到每个时间点的ADC荧光百分比来分析
血清稳定性。使用0天、3天和7天的IgG峰中剩余的荧光％估算稳定性。观察血清孵育3天或7天样品的人血清白蛋白(HSA)面积中的新荧光峰。计算此峰值以估算轭合物转移至HSA的百分比。
10ul混合物负载到HPLC荧光SEC柱以获得血清孵育对照第0天的荧光谱图。将其余各混合物在37℃下孵育3天和7天。以与第0天的样品相同的方式获得荧光谱图。通过将抗体-药物轭合物(ADC)的荧光峰(面积)除以总荧光(面积)以得到每个时间点的ADC荧光百分比来分析
血清稳定性。使用0天、3天和7天的IgG峰中剩余的荧光％估算稳定性。观察血清孵育3天或7天样品的人血清白蛋白(HSA)面积中的新荧光峰。计算此峰值以估算轭合物转移至HSA的百分比。
[0258] FcRn结合ELISA：在4℃下用5ug/ml各1C1 Fc-Cys突变体涂布半孔ELISA板过夜，用pH 5.8的PBST洗涤，并且用在室温下用pH 5.8的鱼明胶封闭缓冲液封闭1h。将0.02-100ug/ml FcRn-生物素(在pH 5.8鱼明胶封闭缓冲液中稀释，总计11份稀释液)添加到孔中并且在室温下孵育2h。用pH 5.8 PBST洗涤板，并且添加链霉抗生物素蛋白-HRP并且在室温下孵育40min，用TMB显色ELISA并且用0.2N H2SO4停止。通过EnVision 2104多标记读数计(马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默公司(PerkinElmer，Waltham，MA))测量OD450，通过Prism 5软件使用具有可变斜率的log(激动剂)对比响应作为模型(美国圣地亚哥的GraphPad软件公
司(GraphPad Software，San Diego，CA))来分析EC50。
司(GraphPad Software，San Diego，CA))来分析EC50。
[0259] 平衡结合常数FcγR的测量：在ProteOn XPR36仪器上测量IgG与hFcγR结合的结合常数(KD)。简言之，如仪器制造商所概述的，使用标准胺偶联化学法将抗体以高密度固定在GLC传感器芯片上。测量的IgG的最终表面密度大约是3000RU。还使用相同的固定方案减去IgG来在此传感器芯片上制备参考流细胞。在仪器缓冲液(含有50mM磷酸盐、pH 7.4、
0.15M NaCl、3mM EDTA、以及0.005％Tween-20的磷酸盐缓冲盐水[PBS]/Tween/乙二胺四乙酸[EDTA]缓冲液)中制备4000nM、16,000nM、或32,000nM的各hFcγR的储备溶液，并且然后以相同缓冲液连续稀释(1∶3)以便获得每个受体所希望的浓度系列：1.82nM-4,000nM(hFcγRI)、197.5nM-16,000nM(hFeγRIIA)、395.1nM-16,000nM(hFeγRIIb)、21.9nM-16,000nM(hFcγRIIIA-158V)、以及395-32,000mM(hFcγRIIIA-158F)。以25μL/min的流速持续8min将各浓度的FcγR注入5T4-108-maia IgG和参照细胞表面，在此过程中收集结合数据。在注射之间，用60秒脉冲的5mM HCl再生(即，去除结合的FcγR)表面。在整个注射系列过程中，还穿插若干缓冲液注射。随后，使用这些缓冲液注射之一连同参考细胞数据，以通过通常称为“双参照”的技术(米什卡(Myszka)，1999)校正任何注射人工制品(例如，非特异性结合)的结合数据。在收集所有结合数据之后，对各个浓度(C)下的结合(在平衡状态下的反应
[Req])的个别数据集取平均值，并且然后将其拟合至1∶1结合等温(Req对比C)图。据此，使用销售商的评估软件(版本3.1.0.6)导出平衡结合常数KD。
0.15M NaCl、3mM EDTA、以及0.005％Tween-20的磷酸盐缓冲盐水[PBS]/Tween/乙二胺四乙酸[EDTA]缓冲液)中制备4000nM、16,000nM、或32,000nM的各hFcγR的储备溶液，并且然后以相同缓冲液连续稀释(1∶3)以便获得每个受体所希望的浓度系列：1.82nM-4,000nM(hFcγRI)、197.5nM-16,000nM(hFeγRIIA)、395.1nM-16,000nM(hFeγRIIb)、21.9nM-16,000nM(hFcγRIIIA-158V)、以及395-32,000mM(hFcγRIIIA-158F)。以25μL/min的流速持续8min将各浓度的FcγR注入5T4-108-maia IgG和参照细胞表面，在此过程中收集结合数据。在注射之间，用60秒脉冲的5mM HCl再生(即，去除结合的FcγR)表面。在整个注射系列过程中，还穿插若干缓冲液注射。随后，使用这些缓冲液注射之一连同参考细胞数据，以通过通常称为“双参照”的技术(米什卡(Myszka)，1999)校正任何注射人工制品(例如，非特异性结合)的结合数据。在收集所有结合数据之后，对各个浓度(C)下的结合(在平衡状态下的反应
[Req])的个别数据集取平均值，并且然后将其拟合至1∶1结合等温(Req对比C)图。据此，使用销售商的评估软件(版本3.1.0.6)导出平衡结合常数KD。
[0260] 平衡结合常数人FcRn蛋白的测量；在ProteOn XPR36仪器上测量IgG与人FcRn蛋白质(huFcRn)的结合亲和性(KD)。简言之，如上所述地使用标准胺偶联化学法抗体将抗体以高密度固定在GLC传感器芯片上。在仪器缓冲液(含有150mM NaCl和0.05％Tween-20的pH 6的50mM磷酸盐缓冲液)中制备3000nM的huFcRn蛋白质储备溶液，并且然后以相同缓冲液连续稀释(3∶1)至1.37nM。以25μL/min的流速持续16min将各浓度的FcRn依次注射到串联的5T4-108-maia IgG和参照细胞表面。收集结合数据，然后在每个受体注射或缓冲液空白注射之间60秒注射含有150mM NaCl和0.05％Tween-20的pH 7.4的50mM磷酸盐缓冲液以再生
IgG表面(即，去除结合FcRn蛋白质)。在整个注射系列过程中，还穿插若干缓冲液注射。随后，使用这些缓冲注射液之一连同参照细胞数据一起，以通过“双参照”(米什卡，1999)校正注射人工制品(例如，非特异性结合)的原始数据集。在收集所有结合数据之后，对各个浓度(C)下的结合(Req)的个别数据集取平均值，并且然后将其拟合至1∶1结合等温(Req对比C)图。据此，使用销售商的BIA评估软件(版本4.1.)导出平衡结合常数KD。
IgG表面(即，去除结合FcRn蛋白质)。在整个注射系列过程中，还穿插若干缓冲液注射。随后，使用这些缓冲注射液之一连同参照细胞数据一起，以通过“双参照”(米什卡，1999)校正注射人工制品(例如，非特异性结合)的原始数据集。在收集所有结合数据之后，对各个浓度(C)下的结合(Req)的个别数据集取平均值，并且然后将其拟合至1∶1结合等温(Req对比C)图。据此，使用销售商的BIA评估软件(版本4.1.)导出平衡结合常数KD。
[0261] 热稳定性测量：通过差示扫描热量法(VP-DSC，马萨诸塞北安普顿的米克罗卡尔公司(MicroCal，LLC，Northampton，MA))测量1C1 Fc-Cys突变体的热解折叠曲线，将pH 6.0的25mM组氨酸缓冲液中1mg/ml浓度的0.503ml 1C1 Fc-Cys突变体负载到腔室内，以1℃/min从20℃至110℃进行扫描。使用由制造商提供的Origin7软件中的非二态模型确定来自热分析图数据的转换中点(Tm值)。
[0262] 与毒素轭合：使用与上述轭合至AF488相同的方法将2mg各1C1 Fc-Cys突变体和基准对照突变体与毒素1或毒素2手动轭合。通过II型CHT(陶瓷羟基磷灰石)液相色谱法去除游离药物，用pH 7.0的10mM磷酸盐缓冲液中的0-2M NaCl梯度洗脱。收集单体ADC峰并且以pH 6.025mM组氨酸加上7％蔗糖进行透析，并且浓缩至0.3至0.5ml。通过质谱分析轭合效率。
[0263] 测定ADC血清稳定性的细胞毒性测定：以与如上所述的相同的方式建立ADC血清孵育。将DU-145细胞铺在白壁96孔板(宾夕法尼亚拉德纳的VWR公司)上：在80ul/孔中的2000个细胞，并且在37℃下在5％CO2培养箱中生长过夜。将ADC-血清样品用培养基稀释至0.004-80ug/ml，将20ul稀释的ADC-血清添加到80ul细胞中，重复三次。培养物中ADC的最终浓度是0.0008至16ug/ml，将细胞在培养箱中再孵育3天，并且通过使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定试剂盒(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega，Madison，WI))来测定活细胞。通过EnVision 2104多标记读数计(马萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默公司)测量发光信号，并且通过Prism 5软件使用具有可变斜率的log(激动剂)对比响应作为模型(美国圣地亚哥的GraphPad软件公司)来分析细胞杀伤的EC50。
****
****
[0264] 上文借助于示出指定功能的实践及其关系的功能结构单元描述了在此提供的实施例。为了便于描述，在此已经任意地限定了这些功能结构单元的边界。也可以限定替代边界，只要指定功能与它们的相互关系被适当地执行。
[0265] 具体实施例的以上描述足以在不脱离在此提出的一般概念的情况下，允许其他人无需过多实验通过应用本领域技术内的知识，容易地针对此类具体实施例的各种应用修改和/或改编。因此，基于在此提出的传授内容和指导，此类改编和修改旨在处于所披露实施例的含义和等效范围内。应当理解在此的短语或术语是出于描述而非限制的目的，这样使得本说明书的术语或短语可根据这些传授内容和指导为技术人员所理解。
[0266] 本披露的宽度和范围应当不限于以上描述的示例性实施例中的任一个，而应当仅根据以下权利要求书和它们的等效物来限定。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 重组李斯特菌疫苗菌株及其用于癌症免疫疗法的方法 | 2020-05-17 | 251 |
| 癌症对免疫疗法的反应的决定因素 | 2020-05-11 | 639 |
| 生产用于癌症免疫疗法的DNA疫苗的方法 | 2020-05-15 | 650 |
| 用于治疗癌症的组合免疫疗法 | 2020-05-12 | 987 |
| 在癌症免疫疗法中有用的生物标记 | 2020-05-12 | 97 |
| 用于癌症免疫疗法的MR1限制性T细胞受体 | 2020-05-16 | 94 |
| 用于癌症免疫疗法的组合物和方法 | 2020-05-11 | 715 |
| 用于癌症免疫疗法的ROR1(NTRKR1)特异性的嵌合抗原受体 | 2020-05-17 | 16 |
| 用于癌症免疫疗法的CD123特异性嵌合抗原受体 | 2020-05-15 | 420 |
| 癌症的免疫疗法 | 2020-05-11 | 698 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
癌症免疫疗法热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈