增强癌症治疗中特异性免疫疗法的方法
阅读：775发布：2020-05-16
专利汇可以提供增强癌症治疗中特异性免疫疗法的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 的方法和组合物涉及 癌症 治疗 中特异性免疫疗法的增强。具体地说，本发明的多个方面涉及单独使用复合糖药物化合物或将其与其它提高 癌症免疫疗法 的功效的靶向免疫治疗联合使用来增强免疫功能的新方法。，下面是增强癌症治疗中特异性免疫疗法的方法专利的具体信息内容。
1.一种处于可接受的药用载体中的组合物，用于肠胃外或者肠内施用，所述组合物包括：
(i)包括1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)残基和半乳糖醛酸甲酯(MeGalA)残基主链的半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯，所述主链与α-1,2连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基交替性低聚物的支化杂聚物连接，所述鼠李糖残基携带1,4-β-D-半乳糖残基、1,
5-α-L-阿拉伯糖残基或其组合的低聚物的主要支链，
其中，通过气相色谱/质谱法表征，所述1,4-连接的半乳糖醛酸残基和半乳糖醛酸甲酯残基主链占总糖类摩尔含量的55到85之间的摩尔百分数，所述交替性α-1,2-连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基的支化杂聚物占总糖类摩尔含量的1到6之间的摩尔百分数，所述主要支链中的低聚物1,4-β-D-半乳糖占总糖类摩尔含量的6到15之间的摩尔百分数，并且所述主要支链中的低聚物1,5-α-L-阿拉伯糖占总糖类摩尔含量的2到8之间的摩尔百分数，
其中，所述半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯具有范围从20kDa至70kDa的平均分子量，和
(ii)治疗有效量的免疫调节剂；
其中，所述免疫调节剂是抗OX40、抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L2、抗4-1BB/4-1BBL的抗体、抗LAG-3的抗体或其组合；
其中，向有需要的受试者施用有效量的所述组合物将CD8+T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞和CD4+T细胞的活化提高至少10％，导致以下至少一种情况：
当与单独使用治疗有效量的所述免疫调节剂或单独使用所述半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯治疗的对照受试者相比较时，
肿瘤抗原特异性CD8+或CD4+T细胞增加至少10％；
肿瘤尺寸减少至少10％，
转移性肿瘤的尺寸减少至少10％，
转移性肿瘤的数目减少至少10％，
总肿瘤负荷降低，
其中，所述有需要的受试者患有恶性肿瘤。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述施用导致所述受试者的总肿瘤负荷降低至少50％从而治疗癌症。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯还包括木糖残基、葡萄糖残基、岩藻糖残基或其组合。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述有效量的组合物导致根据颗粒酶B表达确定的CD8+活化增加至少10％。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述有效量的组合物导致根据Ki-67表达确定的CD4+活化增加至少10％。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述有效量的组合物导致GR-1阴性/CD11b阳性细胞增加至少10％。
7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述有效量的组合物导致GR-1中间型/CD11b阳性细胞减少至少10％。
8.一种用于肠胃外施用给有需要的受试者的组合物，其中，所述组合物处于可接受的药用载体中，并且包括：
a.治疗有效量的包括1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)残基和半乳糖醛酸甲酯(MeGalA)残基主链的半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯，所述主链与α-1,2-连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基的交替性低聚物的支化杂聚物连接，所述鼠李糖残基携带1,4-β-D-半乳糖残基、1,5-α-L-阿拉伯糖残基或其组合的低聚物的主要支链，其中，通过气相色谱/质谱法表征，所述1,4-连接的半乳糖醛酸残基和半乳糖醛酸甲酯残基主链占总糖类摩尔含量的55到85之间的摩尔百分数，所述交替性α-1,2-连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基的支化杂聚物占总糖类摩尔含量的1到6之间的摩尔百分数，所述主要支链中的低聚物
1,4-β-D-半乳糖占总糖类摩尔含量的6到15之间的摩尔百分数，并且所述主要支链中的低聚物1,5-α-L-阿拉伯糖占总糖类摩尔含量的2到8之间的摩尔百分数，
其中，所述半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯具有范围从20kDa至70kDa的平均分子量，以及
b.治疗有效量的免疫调节剂，其中，所述免疫调节剂是抗OX40、抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L2、抗4-1BB/4-1BBL的抗体、抗LAG-3的抗体或其组合，
其中，所述组合物用于治疗癌症，并且
其中，向有需要的受试者施用有效量的所述组合物将CD8+T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞和CD4+T细胞的活化提高至少10％，导致以下至少一种情况：
当与单独使用治疗有效量的所述免疫调节剂或单独使用所述半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯治疗的对照受试者相比较时，
肿瘤抗原特异性CD8+或CD4+T细胞增加至少10％；
肿瘤尺寸减少至少10％，
转移性肿瘤的尺寸减少至少10％，
转移性肿瘤的数目减少至少10％，
总肿瘤负荷降低。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的组合物，其中，所述免疫调节剂是抗OX40、抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L2或其组合。
增强癌症治疗中特异性免疫疗法的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年9月17日提交的美国临时申请系列No.61/701,914、2013年1月25日提交的美国临时申请系列No.61/756,818和2013年2月1日提交的美国临时申请系列No.61/759,532的权益和优先权，每份文献的全部公开内容通过引用的方式完整地并入本文。
技术领域
背景技术
[0004] 免疫系统识别外来抗原，指挥涉及多种细胞类型的协调反应，所述协调反应导致消除了外来抗原或者表达外来抗原的病原体或者细胞。免疫系统对免受入侵微生物(包括但不限于细菌、病毒和寄生虫)的侵害，以及监视并消除异常或者突变细胞(癌)是重要的。该系统还通过对医学装置插入体内或者异源器官或细胞移植作出反应对治疗干预提供了阻碍。
[0005] 除了免疫系统在保护宿主动物方面的基线功能外，为了有益于治疗疾病而调节免疫系统也具有巨大前景。就此而言，对于许多不同类型的癌症来说，调理患者的自身免疫系统以攻击并治疗患者的癌症可能是非常有前景的治疗方法。
[0006] 尽管近期已有成功的治疗癌症的免疫疗法，但是人类肿瘤的反应在个体之间是不同的，而且在那些有效的情况中，它通常也仅是部分成功。
[0007] 因此，需要能够增强免疫疗法在治疗癌症中的能力的方法。
发明内容
[0008] 本发明的多个方面涉及单独使用复合糖药物化合物或者将其与其它可以提高癌症免疫疗法的功效的靶向免疫疗法联合使用以提高免疫功能的新方法。
[0009] 本发明的多个方面涉及能够提高免疫功能的组合物、使用能够提高免疫功能的组合物的方法及其制备方法。
[0010] 本发明的其它方面涉及治疗有需要的受试者的方法。在一些实施方案中，该方法包括如下步骤：获得用于静脉注射、皮下、其它肠胃外途径或者口服施用的组合物，该组合物包括处于可接受药用载体中的化合物，和向有需要的受试者施用该组合物。
[0011] 在一些实施方案中，所述化合物可以是半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯(GRG)、半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯(GA-RG)、半乳甘露聚糖(GM)、改性合成二糖(MSD)、肽/蛋白抑制剂(PIA)、肽模拟剂(PMA)、半乳糖凝集素特异性抗体(GSA)或者有机小分子(SOM)中的一种或者前述任何一种的组合。
[0012] 在一些实施方案中，特异性GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物能具有与包括半乳糖凝集素1到15的半乳糖凝集素类蛋白的不同结构域相互作用并由此抑制、增强或者调节其功能的能力。
[0013] 在一些实施方案中，特异性GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物能具有与半乳糖凝集素-3蛋白的不同结构域(包括但不限于糖识别结构域的S-面和F-面及N-末端结构域)相互作用，并由此抑制它与抑制半乳糖凝集素-3功能的天然配体的相互作用的能力。
[0014] 在一些实施方案中，特异性GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物能具有与半乳糖凝集素-1蛋白的不同结构域(包括但不限于糖识别结构域和二聚化结构域)相互作用，并由此抑制它与抑制半乳糖凝集素-1功能的天然配体的相互作用的能力。
[0015] 在一些实施方案中，所述化合物可以是在化学上定义为半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯(GRG)的多糖，GRG是一种选择性解聚的支化杂聚物，其主链主要由1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)部分组成，伴随较少的交替性1,4连接的GalA和1,2-连接的鼠李糖(Rha)的主链组成，该主链转而与任意数目的主要包含1,4-β-D-半乳糖(Gal)残基并伴随少量1,5-α-L-阿拉伯糖(Ara)残基的侧链连接。其它的侧链次要组分可以包括木糖(Xyl)、葡萄糖(Glu)和岩藻糖(Fuc)或其组合。
[0016] 在一些实施方案中，所述GRG化合物可以根据美国专利申请公开No.2008/0107622(现在是美国专利8,236,780)中的描述制备，该文献通过引用的方式明确地并入本文用于全部目的。
[0017] 在一些实施方案中，所述GRG化合物可以根据美国专利8,128,966、8,187,624、美国专利申请公开Nos.2012/0315309、2012/0309711中的描述制备，这些文献通过引用的方式明确地并入本文用于全部目的。
[0018] 在一些实施方案中，所述化合物可以是化学上定义为半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯(GA-RG)的多糖，GA-RG是一种选择性解聚的支化杂聚物，其主链主要由1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)和半乳糖醛酸甲酯(MeGalA)残基组成，伴随较少的交替性1,4连接的GalA和1,2-连接的鼠李糖(Rha)的主链组成，该主链转而与任意数目的主要包含1,4-β-D-半乳糖(Gal)残基和1,5-α-L-阿拉伯糖(Ara)残基的侧链连接。其它的侧链次要组分可以包括木糖(Xyl)、葡萄糖(Glu)和岩藻糖(Fuc)或其组合。
[0019] 本发明的多个方面涉及包括如下步骤的方法：(a)获得用于肠胃外或者肠内施用的组合物，所述组合物包括：包括1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)残基和半乳糖醛酸甲酯(MeGalA)残基主链的半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯，所述主链与α-1,2连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基交替性低聚物的支化杂聚物连接，所述鼠李糖残基携带1,4-β-D-半乳糖残基、1,5-α-L-阿拉伯糖残基或其组合的低聚物的主要支链，和治疗有效量的免疫调节剂；处于可接受药用载体中； 以及(b)向有需要的受试者施用导致以下一种或多种情况的有效量的组合物，即：当与用治疗有效量的免疫调节剂单独治疗的对照受试者相比较时,CD8+T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞和CD4+T细胞的活化提高至少10％，肿瘤抗原特异性CD8+或CD4+T细胞增加至少10％；肿瘤尺寸减少至少10％，转移性肿瘤的尺寸减少至少10％，转移性肿瘤的数目减少至少10％，总肿瘤负荷降低。在一些实施方案中，有需要的受试者是患有癌症的受试者。在一些实施方案中，所述施用步骤导致受试者的总肿瘤负荷降低50％从而治疗癌症。
[0020] 在一些实施方案中，在获得所述半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯的步骤中，通过气相色谱/质谱法表征，所述1,4-连接的半乳糖醛酸残基和半乳糖醛酸甲酯残基主链可以占总糖类摩尔含量的55到85之间的摩尔百分数，所述交替性α-1,2-连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基的支化杂聚物可以占总糖类摩尔含量的1到6之间的摩尔百分数，所述主要支链的低聚物1,4-β-D-半乳糖可以占总糖类摩尔含量的6到15之间的摩尔百分数，所述主要支链的低聚物1,5-α-L-阿拉伯糖可以占总糖类摩尔含量的2到8之间的摩尔百分数。
[0021] 在一些实施方案中，所述半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯可以具有范围从20kDa到70kDa的平均分子量。在一些实施方案中，所述半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯还包括木糖残基、葡萄糖残基、岩藻糖残基或其组合。
[0022] 在一些实施方案中，所述化合物可以是与半乳糖凝集素结合并抑制半乳糖凝集素功能的肽/蛋白抑制剂(PIA)。在一些实施方案中，所述肽/蛋白抑制剂可以包括但不限于吡卡酯。在一些实施方案中，吡卡酯根据美国专利6,770,622中的描述制备，该文献通过引用的方式明确地并入本文用于全部目的。
[0023] 在一些实施方案中，所述化合物可以是与半乳糖凝集素结合并抑制半乳糖凝集素功能的肽模拟剂(PMA)。在一些实施方案中，所述PMA可以是但不限于OTX-008(也称为PTX-008)。在一些实施方案中，所述肽模拟剂可以包括但不限于根据美国专利8,207,228中的描述制 备的PMA，该文献通过引用的方式明确地并入本文用于全部目的。
[0024] 在一些实施方案中，所述化合物可以是半乳糖凝集素特异性抗体(GSA)，其包括但不限于结合并抑制半乳糖凝集素-3或者半乳糖凝集素蛋白家族中的其它成员的单克隆抗体。
[0025] 在一些实施方案中，所述化合物可以是可以与半乳糖凝集素分子的多种结构域相互作用的有机小分子(SOM)，所述结构域包括但不限于糖类结合结构域和蛋白质二聚化结构域。
[0026] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的结合淋巴细胞共刺激配体或者受体的单克隆抗体、肽或其它药剂联合使用，并且起到共刺激拮抗剂或者激动剂的作用。共刺激性受体可以包括但不限于CD28和ICOS。共刺激性配体可以包括但不限于CD80、CD86和ICOS配体。
[0027] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的结合淋巴细胞抑制性配体或受体的单克隆抗体、肽或其它药剂联合使用，并且起到淋巴细胞抑制性拮抗剂或者激动剂的作用。抑制性受体可以包括但不限于CTLA-4和LAG-3(淋巴细胞活化基因3；也表示为CD223)。抑制性配体可以包括但不限于CD80和CD86。
[0028] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的结合CTLA-4(抗CTLA-4)的单克隆抗体联合使用。
[0029] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的与淋巴细胞上表达的肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的受体或它们的配体结合的单克隆抗体、肽或其它药剂联合使用，并起到淋巴细胞共刺激性拮抗剂或者激动剂的作用。TNFR超家族的受体成员可以包括但不限于CD134(也称为OX40)，CD27以及4-1BB和TNFR受体配体，所述配体包括但不限于OX40L、CD70和4-1BBL(CD137L)。
[0030] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的结合OX40(抗OX40)的单克隆抗体联合使用。在一些实施方案中，本文所描述的GA-RG或GM化合物可以与治疗有效量的重组OX40L或OX40的其它激动剂联合使用。
[0031] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的结合PD-配体(抗PD-L1和PD-L2)的单克隆抗体联合使用。
[0032] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的结合PD-1(抗PD-1)的单克隆抗体联合使用。
[0033] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的调节树突细胞的活化或功能从而改变抗原加工或反应的单克隆抗体、肽或其它药剂联合使用。
[0034] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的癌症疫苗联合使用。在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的针对肿瘤抗原的疫苗联合使用。
[0035] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的用于治疗或预防传染病的疫苗联合使用。
[0036] 在本发明的某个方面，治疗癌症的方法包括(a)获得用于肠胃外或者肠内施用组合物，所述组合物包括：包括处于可接受药用载体中的半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯，所述半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯包括1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)残基和半乳糖醛酸甲酯(MeGalA)残基主链，所述主链与α-1,2连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基交替性低聚物的支化杂聚物连接，所述鼠李糖残基携 带1,4-β-D-半乳糖残基、1,5-α-L-阿拉伯糖残基或其组合的低聚物的主要支链；以及(b)向有需要的受试者施用导致以下至少一种情况的有效量的所述组合物，即：当与用治疗有效量的治疗癌症的批准疗法治疗的对照受试者相比较时，CD8+T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞和CD4+T细胞的活化提高至少10％，肿瘤抗原特异性CD8+或CD4+T细胞增加至少10％；肿瘤尺寸减少至少10％，转移性肿瘤的尺寸减少至少10％，转移性肿瘤的数目减少至少10％，总肿瘤负荷降低。在一些实施方案中，所述施用步骤可以导致受试者的总肿瘤负荷降低至少50％从而治疗癌症。
[0037] 在一些实施方案中，在获得所述半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯的步骤中，通过气相色谱/质谱法表征，所述1,4-连接的半乳糖醛酸残基和半乳糖醛酸甲酯残基主链可以占总糖类摩尔含量的55到85之间的摩尔百分数，所述交替性α-1,2-连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基的支化杂聚物可以占总糖类摩尔含量的1到6之间的摩尔百分数，所述主要支链的低聚物1,4-β-D-半乳糖可以占总糖类摩尔含量的6到15之间的摩尔百分数，所述主要支链的低聚物1,5-α-L-阿拉伯糖可以占总糖类摩尔含量的2到8之间的摩尔百分数。
[0038] 在一些实施方案中，所述半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯可以具有范围从20kDa到70kDa的平均分子量。在一些实施方案中，所述半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯还包括木糖残基、葡萄糖残基、岩藻糖残基或其组合。
[0039] 在本发明的某个方面，所述方法包括(a)获得用于肠胃外或者肠内施用的组合物的方法，所述组合物包括：(i)半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯(GRG)、半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯(GA-RG)、半乳甘露聚糖(GM)、改性合成二糖(MSD)、肽/蛋白抑制剂(PIA)、肽模拟剂(PMA)、半乳糖凝集素特异性抗体(GSA)或者有机小分子(SOM)中的一种或者前述任何一种的组合，以及(ii)治疗有效量的免疫调节剂，其中，所述免疫调节剂包括能够与一种或多种淋巴细胞共刺激配体或受体、淋巴细胞抑制性配体或受体、肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的 受体、PD-配体或者前述任何一种的组合结合的单克隆抗体、肽、药剂；其中，所述组合物处于可接受的药用载体中。所述方法还包括向有需要的受试者施用能够导致以下至少一种情况的有效量的所述组合物，即：当与单独用治疗有效量的免疫调节剂治疗的对照受试者相比较时，CD8+T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞和CD4+T细胞的活化提高至少10％，肿瘤抗原特异性CD8+或CD4+T细胞增加至少10％；肿瘤尺寸减少至少10％，转移性肿瘤的尺寸减少至少10％，转移性肿瘤的数目减少至少10％，总肿瘤负荷降低。在一些实施方案中，所述施用步骤可以导致受试者的总肿瘤负荷降低至少50％从而治疗癌症。
[0040] 在一些实施方案中，所述免疫调节剂可以是抗OX40、抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L2、抗4-1BB/4-1BBL的抗体、抗LAG-3的抗体或其组合。
[0041] 本发明的其它方面涉及用于肠胃外施用的组合物，其中，所述组合物处于可接受的药用载体中，并且包括：(a)治疗有效量的半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯，其包括1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)残基和半乳糖醛酸甲酯(MeGalA)残基主链，所述主链与α-1,2连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基交替性低聚物的支化杂聚物连接，所述鼠李糖残基携带1,4-β-D-半乳糖残基、1,5-α-L-阿拉伯糖残基或其组合的低聚物的主要支链；以及(b)治疗有效量的免疫调节剂。在一些实施方案中，所述组合物可以用于治疗癌症。
[0042] 在一些实施方案中，所述免疫调节剂可以包括能够与一种或多种淋巴细胞共刺激配体或受体、淋巴细胞抑制性配体或受体、肿瘤坏死因子受体(TNFR)受超家族的受体、PD-配体或者前述任何一种的组合结合的单克隆抗体、肽、药剂。在一些实施方案中，所述免疫调节剂可以是抗OX40、抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L2、抗4-1BB/4-1BBL的抗体、抗LAG-3的抗体或其组合。附图说明
[0043] 将参考附图进一步解释本发明，其中，相同的结构在几个附图中始终由相同的标记表示。所示出的附图并不一定按比例绘制，反之，通常将重点放在示出本发明的原理。
[0044] 图1描述了不同实验组中外周血淋巴细胞的百分比，用于分析表达颗粒酶B的CD8+细胞的百分比。
[0045] 图2描述了不同实验组中外周血淋巴细胞的百分比，用于分析表达Ki-67的CD8+细胞的百分比。
[0046] 图3描述了不同实验组中外周血淋巴细胞的百分比，用于分析表达Ki-67的CD4+细胞的百分比。
[0047] 图4描述了不同实验组在第13天小鼠的TRAMP-C1前列腺肿瘤的尺寸。
[0048] 图5描述了不同实验组在第19天、第25天、第29天和第33天小鼠的TRAMP-C1前列腺肿瘤的尺寸。
[0049] 图6描述了患有TRAMP-C1前列腺癌的不同实验组的存活曲线。
[0050] 图7描述了不同实验组在第11天、第14天、第20天和第25天小鼠的乳腺肿瘤的尺寸。
[0051] 图8A描述了使用4T1乳腺癌肿瘤的实验中单独使用aOX40或将其与GA-RG联合(标记为MD02)治疗的小鼠的存活情况。图8B描述了使用4T1乳腺癌肿瘤的实验中单独使用aOX40或将其与GA-RG联合(标记为MD02)治疗的小鼠的肺转移性肿瘤。
[0052] 图9A描述了单独使用aOX40或将其与GA-RG联合(标记为MD02)治疗的4T1乳腺肿瘤荷瘤小鼠的血液循环中GR-1阴性/CD11b阳性细胞的百分数。图9B示出了单独使用aOX40或将其与GA-RG联合(在这些图中标记为MD02)治疗的4T1乳腺癌肿瘤荷瘤小鼠的血液循环中GR-1中间型/CD11b阳性细胞的百分数。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
[0053] 图10A示出了MCA-205肉瘤荷瘤小鼠对单独使用aOX40或将其与GA-RG联合治疗(在这些附图中标记为MD02)的反应。图10B示出了相同动物组的存活曲线。
[0054] 图11A描述了在不同肿瘤细胞系中分泌到培养基中的半乳糖凝集素-3蛋白的表达。图11B描述了在不同肿瘤细胞系中全细胞裂解液中的半乳糖凝集素-3蛋白的表达。
[0055] 图12A描述了采用流式细胞分析不同标记对天然半乳糖凝集素-3缺乏型CD8T细胞与野生型CD8T细胞的表型比较。图12B是实验中所使用的模型的示意图。
[0056] 图13A-C描述了半乳糖凝集素-3缺乏型CD8T细胞在体内抗原刺激后产生了降低的效应子功能。图13A示出了野生型动物和gal-3无功能型动物中OT-l阳性CD8细胞/总CD8细胞的百分比。图13B示出了野生型CD8淋巴细胞和gal-3无功能型CD8淋巴细胞中标记表达的差别。图13C示出了野生型CD8淋巴细胞和gal-3无功能型CD8淋巴细胞中细胞因子分泌的差别。
[0057] 图14描述了所选择的基因在半乳糖凝集素-3缺乏型CD8T细胞中下调。图14A是发现相对于野生型细胞在Gal 3-/-OT-I细胞中下调的几种基因的图示。图14B示出了所选基因的相对单位和倍数变化。
[0058] 图15示出了采用流式细胞术时CD25(IL2-Ra)或者OX40的表达。图15描述了半乳糖凝集素-3缺乏型CD8T细胞在抗原刺激后具有减少的CD25和OX40表达。
[0059] 图16A示出了在第7天未治疗小鼠(黑条)或施以Gal-3抑制剂GR-MD-02的小鼠的外周血或脾脏中供体细胞的表型。图16B示出了在第29天未治疗小鼠(黑条)或施以Gal-3抑制剂GR-MD-02的小鼠的外周血或脾脏中供体细胞的表型。图16A-B描述了利用GA-RG(在该图中标记为GR-MD-02)抑制半乳糖凝集素-3增加CD8T细胞扩充和效应子功能。
[0060] 图17描述了与单独的抗CTLA4相比，与抗CTLA4治疗联合抑制半乳糖凝集素-3增加脾脏中抗原特异性记忆型CD8T细胞的产生。GA-RG在该图中标记为MD02。
具体实施方式
[0061] 本文中公开了本发明的详细实施方案；然而，应当理解的是，所公开的实施方案仅是说明可以按多种方式体现的本发明。此外，所给出的与本发明的多个实施方案相关的每个实施例都旨在进行说明，而非是限制性的。另外，附图不一定按比例绘制，可以放大一些特征以显示特定组分的细节。此外，附图中所示出的任何量值、说明等都旨在说明性的而非限制性的。因此，本文中公开的特定结构和功能细节不得理解为限制性的，而仅应理解为教导本领域技术人员以多种方式使用本发明的代表性基础。
[0062] 除非另外说明，否则本文中所表述的全部百分数均是重量/重量。
[0064] 已经被寻求用于癌症免疫疗法的一种方法是由术语“肿瘤疫苗”所涵盖的领域，所述领域包括利用肿瘤特异性抗原或过度表达的抗原进行免疫。在这种方法中，将肿瘤细胞特异性抗原或在肿瘤细胞中过度表达的抗原单独注射、作为传递所述抗原的微生物(例如，单核细胞李斯特菌(Listeria Monocytogenes)的部分随佐剂一起注射，或者在体外与免疫细胞(包括但不限于树突细胞)孵育后注射，以引起细胞免疫反应和/或体液免疫反应。
[0065] 已经被寻求用于癌症免疫疗法的另一种方法是通过调节特异性免疫细胞受体或它们的配体功能。这已经利用识别并结合免疫细胞受体和/或配体的单克隆抗体而得以实现。已经表明单克隆抗体与靶受体或配体的结合抑制或者增强所述受体或配体的功能。
[0066] 已被发现的增强针对肿瘤的免疫反应的单克隆抗体包括结合CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4)、PD-1受体(程序性死亡-1)和OX40(也称作CD134)的抗体。除了它们在细胞实验和患有肿瘤的动物中的活性之外，已经表明抗CTLA-4抗体和抗PD-1单克隆抗体在人类中具有重要的抗肿瘤活性。
[0067] 本发明的多个方面涉及单独使用复合糖药品或本文描述的其它药剂或者将其与其它靶向免疫疗法联合使用提高免疫功能的新方法，所述其它靶向免疫疗法可以提高利用免疫系统活化的癌症和其它疾病的免疫疗法的效能。术语“靶向免疫疗法”和“免疫调节剂”可以通用。
[0068] 本发明的一些方面涉及治疗有需要的受试者的方法。在一些实施方案中，该方法包括如下步骤：获得用于静脉注射、皮下、其它肠胃外途径或者口服施用的组合物，该组合物包括处于可接受药用载体中的化合物，和将该组合物施用到有需要的受试者。在一些实施方案中，所述组合物包括处于可接受药用载体中的化合物和免疫调节剂。
[0069] 本发明的其它方面涉及用于肠胃外施用的制剂，其中，所述制剂处于可接受的药用载体中并且包括治疗有效量的化合物和治疗有效量的免疫调节剂。
[0070] 在一些实施方案中，所述化合物可以是半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯(GRG)、半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯(GA-RG)、半乳甘露聚糖(GM)、改性合成二糖(MSD)、肽/蛋白抑制剂(PIA)、肽模拟剂(PMA)、半乳糖凝集素特异性抗体(GSA)或者有机小分子(SOM)中的一种或者前述任何一种的组合。
[0071] 在一些实施方案中，特异性GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物能具有与包括半乳糖凝集素1到15的半乳糖凝集素类蛋白的不同结构域相互作用并由此抑制、增强或者调节其功能的能力。
[0072] 在一些实施方案中，特异性GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物能具有与半乳糖凝集素-3蛋白的不同结构域(包括但不限于糖识别结构域的S-面和F-面及N-末端结构域)相互作用，并由此抑制它与抑制半乳糖凝集素-3功能的天然配体的相互作用的能力。
[0073] 在一些实施方案中，特异性GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物能具有与半乳糖凝集素-1蛋白的不同结 构域(包括但不限于糖识别结构域和二聚化结构域)相互作用，并由此抑制它与抑制半乳糖凝集素-1功能的天然配体的相互作用的能力。
[0074] 术语“有效量”意指本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物与一种或多种抗体、蛋白质或其它药剂联合的量，所述抗体、蛋白质或其它药剂作为肠胃外剂量施用给动物或人时调节免疫反应，增加免疫反应的标记至少10％，至少20％或至少25％。免疫反应的标记包括但不限于具有CD8受体的T淋巴细胞(本文称作的CD8淋巴细胞(如通过不同方法所表明的，包括但不限于对Ki-67染色)的增殖、CD8细胞活化功能的标记(如通过不同方法所表明的，包括但不限于对颗粒酶B染色)、或者在其它细胞调节性细胞或效应子细胞中的变化。其它免疫标记包括但不限于GR-1+和CD11b+单核细胞的相关表达和/或频率。
[0075] 免疫调节剂可以包括但不限于抗OX40抗体(抗OX40)、抗CTLA-4抗体(抗CTLA-4)、抗PD-1抗体、抗PD-1L/2L抗体(抗-PD-L1或抗-PD-L2)、抗4-1BBL/4-1BBL抗体、抗LAG-3抗体，或前述抗体中两种或多种的组合。
[0076] 免疫调节剂还可以包括影响免疫反应过程如抗原依赖性识别、抗原加工、淋巴细胞共刺激和淋巴细胞抑制的抗体、蛋白质、肽或有机小分子。
[0077] 术语“功效”意指表明与单独使用免疫调节剂或者两种或多种这些药剂的组合治疗相比较，单独使用本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物或者将其与免疫调节剂或者两种或多种这些调节剂的组合联合治疗使得肿瘤生长、进展或转移降低至少10％。
[0078] 本发明的多个方面涉及能够提高免疫功能的组合物和使用能够提高免疫功能的组合物的方法。
[0079] 本发明的多个方面涉及治疗有需要的受试者的方法。在一些实施方案中，所述受试者患有癌症。在一些实施方案中，所述方法包括获得用于静脉注射或皮下或口服施用的组合物的步骤，所述组合物包含 处于可接受的药用载体中的化合物。在一些实施方案中，所述方法包括获得用于肠胃外施用的组合物的步骤。“肠胃外施用”包括通过快速浓注或输注施用，以及通过静脉注射、肌肉注射、动脉、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注的方式施用。
[0080] 在一些实施方案中，所述化合物是在化学上定义为半乳糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯(GRG)的多糖，GRG是一种选择性解聚的支化杂聚物，其主链主要由1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)和半乳糖醛酸甲酯(MeGalA)残基组成，伴随较少的交替性1,4-连接的GalA和1,2-连接的鼠李糖(Rha)的主链组成，该主链转而与任意数目的主要包含1,4-b-D-半乳糖(Gal)残基和1,5-a-L-阿拉伯糖(Ara)残基的侧链连接。其它的侧链次要组分可以包括木糖(Xyl)、葡萄糖(Glu)和岩藻糖(Fuc)或其组合。
[0081] 在一些实施方案中，所述GRG化合物根据美国专利申请公开No.2008/0107622(现在是美国专利US8,236,780)中的描述制备，该文献通过引用的方式明确地并入本文用于全部目的。
[0082] 在一些实施方案中，所述GRG化合物可以根据美国专利8,128,966、8,187,624、美国专利申请公开Nos.2012/0315309、2012/0309711中的描述制备，这些文献通过引用的方式明确地并入本文用于全部目的。
[0083] 在一些实施方案中，所述化合物是在化学上定义为半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯(GA-RG)的多糖，GA-RG是一种选择性解聚的支化杂聚物，其主链主要由1,4-连接的半乳糖醛酸(GalA)部分组成，伴随较少的交替性1,4-连接的GalA和1,2-连接的鼠李糖(Rha)的主链组成，该主链转而与任意数目的主要包含1,4-b-D-半乳糖(Gal)残基和1,5-a-L-阿拉伯糖(Ara)残基的侧链连接。在一些实施方案中，通过气相色谱/质谱法表征，所述1,4-连接的半乳糖醛酸残基和半乳糖醛酸甲酯残基主链占总糖类摩尔含量的55到85之间的摩尔百分数，所述交替性α-1,2-连接的鼠李糖残基和α-1,4-连接的GalA残基的支化杂聚 物占总糖类摩尔含量的1到6之间的摩尔百分数，所述主要支链的低聚物1,4-β-D-半乳糖占总糖类摩尔含量的6到15之间的摩尔百分数，所述主要支链的低聚物1,5-α-L-阿拉伯糖占总糖类摩尔含量的2到8之间的摩尔百分数。
[0084] 其它的侧链次要组分可以包括木糖(Xyl)、葡萄糖(Glu)和岩藻糖(Fuc)或其组合。
[0085] 在一些实施方案中，所述1,4-b-D-Gal残基和1,5-a-L-Ara残基在本发明GA-RG化合物中的摩尔百分数是21.5％，1,4-b-D-Gal与1,5-a-L-Ara的摩尔比是3:1。
[0086] 在一些实施方案中，所述化合物是在化学上定义为半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯(GA-RG)的多糖，具有20,000到70,000道尔顿分子量，如通过SEC-RI法确定。在一些实施方案中，所述半乳阿拉伯糖-鼠李糖半乳糖醛酸酯具有范围从20kDa至70kDa的平均分子量。
[0087] 在一些实施方案中，所述GA-RG化合物可以根据国际专利申请PCT/US12/55311中的描述制备，该文献通过引用的方式明确地并入用于全部目的。
[0088] 在一些实施方案中，所述化合物是根据美国专利申请US20110077217中的描述制备的半乳甘露聚糖(GM)多糖组合物，该文献通过引用的方式明确地完整并入用于全部目的。
[0089] 在一些实施方案中，GM化合物的平均分子量大约是4,000到60,000kD，如通过SEC-MALLS法确定。
[0090] 在一些实施方案中，所述化合物是根据美国专利Nos 6,444,655、7,230,096、7,638,623、7,700,763和8,092,825中的描述制备的改性合成二糖(MSD)，该文献通过引用的方式明确地并入用于全部目的。
[0091] 在一些实施方案中，所述化合物是可以与半乳糖凝集素结合并抑制半乳糖凝集素功能的肽/蛋白抑制剂(PIA)，所述抑制剂可以包括但不限于根据美国专利No 6,770,622中的描述制备的PIA，该文献通过引用的方式明确地并入用于全部目的。
[0092] 在一些实施方案中，所述化合物是可以与半乳糖凝集素结合并抑 制半乳糖凝集素功能的肽模拟剂(PMA)，所述肽模拟剂可以包括但不限于根据美国专利8,207,228中的描述制备的吡卡酯和OTX-008(也称为PTX-008)，该文献通过引用的方式明确地并入用于全部目的。
[0093] 在一些实施方案中，所述化合物是半乳糖凝集素特异性单克隆抗体(GSA)。
[0094] 在一些实施方案中，所述化合物是与半乳糖凝集素分子的不同结构域相互作用的有机小分子(SOM)，所述结构域包括但不限于糖结合结构域和蛋白质二聚化结构域。
[0095] 在一些实施方案中，GRG和GA-RG在b-夹层结合结构域的S-面上的典型糖识别域中的多个氨基酸残基处以及在该蛋白质的相对的F面上的氨基酸残基处结合半乳糖凝集素-3分子。
[0096] 在一些实施方案中，GRG和GA-RG结合到半乳糖凝集素-3分子中的氨基酸残基是干扰半乳糖凝集素-3分子功能的原因。
[0097] 在一些实施方案中，改性合成二糖(MSD)结合到半乳糖凝集素-3糖结构域中与GA-RG类似的位点，并且可以在抑制半乳糖凝集素-3分子的功能方面具有类似的功能。
[0098] 在一些实施方案中，肽/蛋白抑制剂(PIA)结合到半乳糖凝集素-3糖结构域中与GA-RG类似的位点，并且可以在抑制半乳糖凝集素-3分子的功能方面具有类似的功能。
[0099] 在一些实施方案中，肽模拟剂(PMA)结合到半乳糖凝集素-3糖结构域中与GA-RG类似的位点，并且可以在抑制半乳糖凝集素-3分子的功能方面具有类似的功能。
[0100] 在一些实施方案中，半乳糖凝集素特异性抗体(GSA)结合到半乳糖凝集素-3糖结构域中与GA-RG类似的位点，并且可以在抑制半乳糖凝集素-3分子的功能方面具有类似的功能。
[0101] 在一些实施方案中，有机小分子(SOM)结合到半乳糖凝集素-3糖结构域中与GA-RG类似的位点，并且可以在抑制半乳糖凝集素-3分子的功能方面具有类似的功能。
[0102] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、 PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的结合CTLA-4(抗CTLA-4)的单克隆抗体联合使用。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞抗原4)，也称为CD152(分化抗原簇152)，是下调免疫系统的蛋白质受体，并且可以发现于导致细胞免疫攻击抗原的T细胞表面上。
[0103] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的结合OX40(抗OX40)的单克隆激动剂抗体或用作激动剂的重组OX40L联合使用。OX40是肿瘤坏死因子/神经生长因子受体(TNFR/NGFR)家族的成员。OX40可以起到T细胞活化以及调节正常淋巴细胞和恶性淋巴细胞分化、增殖或凋亡的作用。
[0104] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的结合PD-1(抗PD-1)的单克隆抗体联合使用。PD-1指程序性细胞死亡蛋白质1，它是T细胞调节剂的CD28/CTLA-4家族的一个成员。
[0105] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的结合淋巴细胞共刺激配体或受体的单克隆的抗体、肽或其它药剂联合使用，并且起到共刺激激动剂或者拮抗剂的作用。共刺激受体包括但不限于CD28和ICOS，共刺激配体包括但不限于CD80、CD86和ICOS配体。
[0106] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的结合淋巴细胞抑制性配体或受体的单克隆抗体、肽或其它药剂联合使用，并且起到抑制淋巴细胞的拮抗剂或者激动剂的作用。抑制性受体包括但不限于CTLA-4，并且抑制性配体包括但不限于CD80和CD86。
[0107] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的结合CTLA-4(抗CTLA-4)的单克隆抗体联合使用。
[0108] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的与淋巴细胞 上表达的肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的受体或它们的配体结合的单克隆抗体、肽或其它药剂联合使用，并且起到淋巴细胞共刺激拮抗剂或者拮激动剂的作用。TNFR超家族的受体成员包括但不限于CD134(也称为OX40)，4-1BB(CD137)和CD27和TNFR受体配体，所述受体配体包括但不限于OX40L、4-1BBL(CD137L)和CD70。
[0109] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的结合OX40(抗OX40)的单克隆抗体联合使用，本文所描述的GA-RG或GM化合物可以与治疗有效量的重组OX40L或OX40的其它激动剂联合使用。
[0110] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的结合PD-配体(抗PD-L1和PD-L2)的单克隆抗体联合使用。
[0111] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的结合PD-1(抗PD-1)的单克隆抗体联合使用。
[0112] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的调节树突细胞的活化或功能从而改变抗原加工或反应的单克隆抗体、肽或其它药剂联合使用。
[0113] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的针对肿瘤抗原的疫苗或者癌症疫苗联合使用。在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与佐剂联合使用。在一些实施方案中，佐剂可以包括TLR配体，诸如聚肌胞、CpG等。
[0114] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以单独使用或者与治疗有效量的针对肿瘤抗原的疫苗或者癌症疫苗联合使用。
[0115] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、 PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以与治疗有效量的用于治疗或预防传染病的疫苗联合使用。
[0116] 在一些实施方案中，本文所描述的GRG、GA-RG、GM、MSD、PIA、PMA、GSA或者SOM化合物可以单独使用或者与治疗有效量的前述药剂的任何一种或者前述药剂的的任何一种的组合联合使用。
[0117] 与治疗有效量的抗OX40、抗CTLA-4、抗PD-1或其它免疫调节剂、或前述任何一种的组合联合使用的GRG或GA-RG多糖对实验动物(例如小鼠)的有效腹腔内剂量或静脉剂量可以是在10和120mg/mg之间每周一次、每周两次或每周三次地给予。
[0118] 与治疗有效量的抗OX40、抗CTLA-4、抗PD-1或其它免疫调节剂、或前述任何一种的组合联合使用的GRG或GA-RG对人类受试者的有效静脉剂量可以是在0.5和15mg/kg之间每周一次、每周两次或每周三次地给予，如根据动物剂量当量计算。
[0119] 与治疗有效量的抗OX40、抗CTLA-4、抗PD-1、或其它免疫调节剂或前述任何一种的组合联合使用的GRG或GA-RG对人类受试者的有效剂量可以按皮下方式、通过其它肠胃外途径或口服方式以1到100倍之间的静脉剂量施用。
[0120] 与治疗有效量的抗OX40、抗CTLA-4、抗PD-1或其它免疫调节剂、或前述任何一种的组合联合使用的本文所描述的GM化合物对给实验动物(例如小鼠)的有效腹腔内剂量或静脉剂量可以是在10和180mg/mg之间每周一次、每周两次或每周三次地给予。
[0121] 与治疗有效量的抗OX40、抗PD-1或其它免疫调节剂、或前述任何一种的组合联合使用的GM对人类受试者的有效静脉剂量可以是在0.5和20mg/kg之间每周一次、每周两次或每周三次地给予，如根据动物剂量当量计算。
[0122] 与治疗有效量的抗OX40、抗CTLA-4、抗PD-1或其它免疫调节剂、或前述任何一种的组合联合使用的GM化合物对人类受试者的有效剂量可以按皮下方式、通过其它肠胃外途径或口服方式以1到100倍之间的静脉剂量施用。
[0123] 在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效通过CD8+或CD4+T细胞增殖增加至少10％来确定。在一些实施方案中，肠胃外施用的组合物的功效通过CD8+或CD4+T细胞增殖增加至少15％来确定。在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效通过CD8+或CD4+T细胞增殖增加至少20％来确定。
[0124] 在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效通过CD8+或CD4+T细胞增殖增加至少10％来评估，如通过Ki-67表达来确定。在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效通过CD8+或CD4+T细胞增殖增加至少15％来评估，如通过Ki-67表达来确定。在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效通过CD8+或CD4+T细胞增殖增加至少20％来评估，如通过Ki-67表达来确定。
[0125] 在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效不与CD8+或CD4+T细胞的一般增殖相关联。
[0126] 在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效通过CD8+T细胞或CD4+T细胞活化增加至少10％到25％来确定。在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效通过CD8+T细胞或CD4+T细胞活化增加至少15％到25％来确定。在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效通过CD8+T细胞或CD4+T细胞活化增加至少20％来确定。
[0127] 在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效通过CD8+T细胞或CD4+T细胞活化增加至少10％来确定，如通过颗粒酶B的表达来确定。在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效通过CD8+T细胞或CD4+T细胞活化增加至少15％来确定，如通过颗粒酶B的表达来确定。在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效通过CD8+T细胞或CD4+T细胞活化增加至少20％来确定，如通过颗粒酶B的表达来确定。
[0128] 在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效与CD8+或CD4+T细胞中颗粒酶B表达的一般增加不相关联。
[0129] 在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效与肿瘤抗原特异性CD8+或CD4+T细胞增加至少10％相关联。在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效与肿瘤抗原特异性CD8+或CD4+T细胞增加至少15％相关联。在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效与肿瘤抗原特异性CD8+或CD4+T细胞增加至少20％相关联。
[0130] 在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效与GR-1阴性/CD11b阳性细胞增加至少10％相关联。在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效与GR-1阴性/CD11b阳性细胞增加至少15％相关联。在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效与GR-1阴性/CD11b阳性细胞增加至少20％相关联。
[0131] 在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效与GR-1中间型或阳性/CD11b阳性细胞减少至少10％相关联。在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效与GR-1中间型或阳性/CD11b阳性细胞减少至少15％相关联。在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效与GR-1中间型或阳性/CD11b阳性细胞减少至少20％相关联。
[0132] 在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效与肿瘤尺寸(与治疗开始时它的尺寸相比较)减小至少10％相关联。在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效与肿瘤尺寸减小至少15％相关联。在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效与肿瘤尺寸减小至少20％相关联。
[0133] 在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效与原发性肿瘤远处转移的数量或尺寸减小至少10％相关联。在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效与原发性肿瘤远处转移的数量或尺寸减小至少15％相关联。在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效与原发性肿瘤远处转移的数量或尺寸减小至少20％相关联。
[0134] 在一些实施方案中，所有病灶所占据的总容积可以由称作“总肿 瘤负荷”(TTB)的单个数字表示。因此，当任何肿瘤对所选择的治疗计划作出反应时，TTB将会变化。在一些实施方案中，可以在用包含与免疫调节剂联合的本文所述化合物(例如糖类化合物)联合治疗后在受试者中确定TTB并且与单独使用所述免疫调节剂治疗的受试者的TTB比较。另外，在其它实施方案中，可以在用本文所述化合物(例如糖类化合物)治疗后在受试者中确定TTB并且与用标准疗法(批准用于癌症治疗的药剂)治疗的受试者的TTB比较。
[0135] 在一些实施方案中，可以利用实体瘤中的免疫相关反应标准，评价单独用所述糖类化合物(例如GA-RG)治疗或与将其与其它免疫疗法(例如免疫调节剂)联合治疗的肿瘤。在一些实施方案中，所使用的免疫相关反应标准可以是Hoos等人描述的标准(J Natl Cancer Inst.102:1388-1397and Clinical Cancer research 15:74,2009)，因此该文献通过引用的方式完整并入本文。肿瘤可测性被定义为在螺旋计算机断层扫描上5X5mm或更多。根据下列公式，可以将基线上指数病灶的垂直直径总和(SPD)加到新病灶的SPD计算总肿瘤负荷(TTB)：总肿瘤负荷＝指数病灶的SPD+可测量的新病灶的SPD。
[0136] 在一些实施方案中，可以评估肿瘤负荷相对于基线肿瘤负荷(即，基线上所有指数病灶的SPD)的变化。如果相对于基线肿瘤负荷，指数和新的可测量的肿瘤负荷降低100％，那么整体反应是irCR(免疫-相关反应完全反应)。如果相对于基线肿瘤负荷，指数和新的可测量的肿瘤负荷降低大于或等于50％，那么整体反应是irPR(免疫-相关反应部分反应)。如果相对于基线肿瘤负荷，指数和新的可测量的肿瘤负荷降低少于50％到增加少于25％，那么整体反应是irSD(免疫-相关反应稳定疾病)。如果相对于基线肿瘤负荷，指数和新的可测量的肿瘤负荷增加高于或等于25％，那么整体反应是irPD(免疫相关反应进行性疾病)，假设该反应和进展由至少间隔4周的第二次评估证实。
[0137] 在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效直接与具有提高功效的肿瘤中的半乳糖凝集素-3的表达水平有关，该功效的提高与肿瘤中增加的半乳糖凝集素-3的表达相关联。
[0138] 在一些实施方案中，在癌症治疗中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效直接与肿瘤细胞中半乳糖凝集素-3和分泌到具有提高的半乳糖凝集素-3的水平的肿瘤微环境中的半乳糖凝集素-3的表达水平有关，所述提高的半乳糖凝集素-3的水平与更好的功效有关。
[0139] 在一些实施方案中，所述用于肠胃外施用的组合物的功效可以用于治疗多种癌症，包括但不限于胃肠癌(食管、胃、小肠、结肠和肛门)、胰腺癌(内分泌和腺癌)、胆管癌、各种类型的肝癌、肉瘤、肌肉瘤、乳腺癌、肺癌、头颈癌、口腔癌、皮肤癌、黑色素瘤、肾癌、尿道、膀胱和前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫内膜癌、神经肿瘤(大脑和神经元)、内分泌腺癌(甲状腺、肾上腺、甲状旁腺、垂体)、骨癌(骨肉瘤)、血液癌(淋巴瘤、白血病)、多发性骨髓瘤和骨髓纤维化。
[0140] 在一些实施方案中，所述治疗方法还包括向受试者施用有效量的肠胃外施用组合物或将其与免疫调节抗体联合施用的步骤，或将其与导致以下至少一种情况的物质联合施用的步骤：
[0141] 如通过多种方法所表明的循环型CD8+或CD4+T细胞中活化迹象(包括但不限于Ki-67和/或颗粒酶B表达)增加至少10％。
[0142] 肿瘤抗原特异性CD8+或CD4+T细胞增加至少10％。
[0143] 肿瘤尺寸或进展的至少10％反应率，
[0144] 无进展存活期(癌症无进展情况下的患者生存期)或患者生存期整体增加。
[0145] 远离原发性肿瘤的转移肿瘤尺寸或数目减少至少10％。
[0146] 与单独标准疗法、不作治疗或仅包括免疫调节剂的疗法相比时，如通过免疫相关反应标准所评估的总肿瘤负荷具有统计显著差异。
[0147] 实施例1：利用抗CTLA-4、抗OX40、或抗PD-1与GA-RG和GM联合共同治疗后免疫反应和前列腺肿瘤反应增强
[0148] 在该实施例中，在小鼠癌症同基因模型中进行实验。所使用的肿瘤细胞是源自小鼠前列腺癌的TRAMP-C1细胞系。为了获得这些细胞，在具有前列腺特异性基因启动子的转基因小鼠中表达SV40大T 抗原，由此在前列腺组织中特异性表达SV40大T。TRAMP-C1细胞系源自所得的前列腺肿瘤；重要的是，该细胞系不表达SV40大T-抗原。对于肿瘤模型，将TRAMP-C1细胞(1X106细胞)经皮下接种到正常C57BL/6小鼠中。
[0149] 用TRAMP-C1细胞接种后，用IgG(作为对照，接种后第4天、第6天和第8天)，或抗CTLA-4(接种后第4天、第6天和第8天200微克)，或抗PD-1(接种后第4天、第6天和第8天200微克)，或抗OX40(接种后第4天和第8天250微克)经腹腔内注射治疗各组小鼠。
[0150] 用与上述化合物相同的化合物加上如下所述的GA-RG或GM治疗其它组的动物：GA-RG，在第4天、第6天和第8天2.4mg/剂量，或者GM，第4天、第6天和第8天2.4mg/剂量，之后是GA-RG 28、30和32。
[0151] 图1示出了不同组实验动物(每组5只小鼠)的实验结果。y轴上表示的量值是也对颗粒酶B呈阳性的分离的CD8+细胞的百分比。蛋白颗粒酶B是CD8阳性淋巴细胞的效应子功能的标记。颗粒酶是由能够在靶细胞如肿瘤细胞或病毒感染的细胞中诱导凋亡的CD8+细胞毒性T细胞内胞质颗粒释放的丝氨酸蛋白酶。将单独的IgG大鼠(对照)与用抗OX40(aOX40)、抗CTLA-4(aCTLA-4)、或抗PD-1(aPD-1)治疗的那些动物比较，表明抗体对照治疗未导致表达颗粒酶B的CD8+细胞的百分比统计显著增加。
[0152] 图1还示出了向用aOX40、aCTLA-4或aPD-1治疗加入GM治疗的结果。虽然将GM加入IgG单独治疗时似乎存在一些CD8+细胞活化，但是这些变化并不明显，并且当将GM加入aOX40、aCTLA-4或aPD-1治疗时，颗粒酶B阳性细胞并没有进一步增加。
[0153] 相反，向aOX40、aCTLA-4或aPD-1治疗加入GA-RG治疗，表现出CD8+细胞活化显著增加。向aOX40、aCTLA-4或aPD-1治疗加入GA-RG分别增加颗粒酶B阳性CD8+细胞的百分比2倍、5倍和4倍。这表示将GA-RG加入该治疗中时，CD8+细胞的活化高度显著和明显地增加。
[0154] 图2示出了不同组实验动物中CD8+T细胞中增殖标记的结果。增殖标记是Ki-67，它是与细胞增殖相关的细胞核蛋白。单独用aOX40、aCTLA-4或aPD-1治疗或将其与GM联合治疗后，CD8+细胞的增殖变化很小。然而，在aOX40、aCTLA-4或aPD-1与GA-RG联合施用的情况下，Ki-67显著增加到与图1中所见的颗粒酶B表达百分比非常类似的程度。
[0155] 图3示出了不同组实验动物的CD4+T细胞中增殖标记Ki-67的结果。单独用aOX40、aCTLA-4或aPD-1治疗或将其与GM联合治疗后，CD4+细胞的增殖变化很小。然而，在aOX40、aCTLA-4或aPD-1与GA-RG联合施用的情况下，Ki-67显著增加与CD8+细胞所见非常类似的程度(图2)。
[0156] 图4示出了不同实验组中肿瘤生长的结果。将GA-RG治疗加入aCTLA-4或aPD-1治疗时，与单独用抗体治疗相比，肿瘤生长明显减慢。
[0157] 这些实验的结果表明，用aOX40、aCTLA-4或aPD-1与GA-RG联合治疗小鼠时，CD8+细胞毒性T细胞的增殖和活化明显增加，CD4+T调节型细胞增殖增加，并且肿瘤尺寸减小。
[0158] 实施例2：抗CTLA4或抗OX40与GA-RG联合共同治疗后增强免疫反应和前列腺肿瘤反应
[0159] 在该实施例中，在小鼠癌症的同基因模型中进行实验。所使用的肿瘤细胞是源自小鼠前列腺癌的TRAMP-C1细胞系，如实施例1中所述。
[0160] 该实施例包括6个肿瘤接种小鼠治疗组，其中两个组处于各自以下情况：对照小鼠在接种后第4天、第8天、第11天和第15天后用IgG联合或联合GA-RG(1.2mg/剂量)治疗；小鼠在接种后第4天、第8天、第11天和第15天用aOX40(250微克或mcg)联合或不联合GA-RG(1.2mg/剂量)治疗；以及小鼠在接种后第4天、第6天、第8天、第11天、第13天和第15天用aCTLA4(200mcg)在接种后第4 天、第8天、第11天和第15天后联合或不联合GA-RG(1.2mg/剂量)治疗。
[0161] 图5示出了接种后在不同时间这些治疗对肿瘤尺寸影响的结果。虽然用aOX40、aCTLA4和GA-RG单独治疗对肿瘤的尺寸影响微小，但是aOX40和aCTLA4和GA-RG的联合在肿瘤接种后直到第33天的每个时间点在减小肿瘤尺寸方面具有非常大的影响。
[0162] 图6示出了6个治疗组中小鼠的存活曲线。用aOX40和aCTLA4和GA-RG联合治疗的各组具有双倍的存活率。
[0163] 这些实验结果表明，用aOX40或aCTLA4与GA-RG联合治疗小鼠时，与用单一药物治疗相比，前列腺肿瘤明显更大地收缩，并且存活增加。用aOX40或aCTLA4联合治疗的20％小鼠存活超过100天，而用任何一种药单独治疗的所有小鼠在58天就死亡了。
[0164] 实施例3：抗CTLA4或抗OX40与GA-RG联合共同治疗后增强免疫反应和乳腺肿瘤反应
[0165] 在该实施例中，在小鼠乳腺癌的同基因模型中进行实验。所使用的肿瘤细胞是4T1，它是从自发产生的BALB/c乳腺肿瘤衍生的同基因乳腺癌细胞系。当原位引入后，4T1系在原发部位迅速生长，并且经过3-6周时间在肺、肝脏、骨和脑中形成转移性肿瘤。经尾静脉或动脉引入时，1-2周后在这些相同的器官中转移明显。向人乳腺癌中受累器官的快速有效转移使得4T1模型成为人类中研究乳腺癌转移性进展的优异小鼠模型。因为该模型在BALB/c小鼠中是同基因的，所以它可以用于研究免疫系统在肿瘤生长和转移中的作用。对于这些
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实验中的肿瘤模型，将4T1细胞(5X10细胞)经皮下注射接种到正常的C57BL/6小鼠中。
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实验中的肿瘤模型，将4T1细胞(5X10细胞)经皮下注射接种到正常的C57BL/6小鼠中。
[0166] 该实施例包括6个接种肿瘤小鼠治疗组，其中两个组各自处于以下情况：对照小鼠在接种后第4天、第8天、第11天和第15天后用IgG联合或不联合GA-RG(1.2mg/剂量)治疗；小鼠在接种后第4天、第8天、第11天和第15天用aOX40(250微克或mcg)联合或不联合 GA-RG(1.2mg/剂量)治疗；以及小鼠在接种后第4天、第6天、第8天、第11天、第13天和第15天用aCTLA4(200mcg)在接种后第4天、第8天、第11天和第15天后联合或不联合GA-RG(1.2mg/剂量)治疗。
[0167] 图7示出了接种后在不同时间这些治疗对肿瘤尺寸影响的结果。虽然单独用aOX40、aCTLA4和GA-RG治疗对肿瘤尺寸有一些影响，但是aOX40和aCTLA4与GA-RG的联合在肿瘤接种后直到第25天的每个时间点在减小肿瘤尺寸方面具有非常大的影响。
[0168] 这些实验结果表明，用aOX40或aCTLA4与GA-RG联合治疗小鼠时，与用单一药物治疗相比，乳腺肿瘤明显更大地收缩，并且存活增加。
[0169] 实施例4：抗OX40与GA-RG联合共同治疗后存活增加和肺转移减少
[0170] 在该实施例中，在利用4T1细胞的小鼠乳腺癌的同基因模型中进行实验。
[0171] 该实施例包括4个接种肿瘤小鼠的治疗组，其中两个组各自处于以下情况：对照小鼠在接种后第4天、第8天、第11天和第15天后用IgG联合或不联合GA-RG(2.4mg/剂量)治疗；小鼠在接种后第4天、第8天、第11天和第15天后用aOX40(250mcg)联合或不联合GA-RG(2.4mg/剂量)治疗。
[0172] 如图8A中所示，用aOX40和GA-RG联合治疗的小鼠比单独用aOX40治疗的小鼠存活更多。
[0173] 在动物中利用克隆源性试验评估肺转移性肿瘤数目，所述试验评价从匀质肺长出的独立细胞克隆的数目。如图8B中所示，与单独用aOX40治疗的小鼠相比，用aOX40和GA-RG联合治疗的小鼠中肺转移性肿瘤的数目减少10倍。
[0174] 这些结果表明，用aOX40和GA-RG联合治疗的小鼠比单独用aOX-40治疗的小鼠存活更多，并且这个作用可能与转移性肿瘤疾病 的减少部分相关。
[0175] 实施例5：单核细胞群体的改变
[0176] 在该实施例中，在利用4T-1细胞的小鼠乳腺癌的同基因模型中进行实验。
[0177] 该实施例包括4个接种肿瘤小鼠的治疗组，其中两个组各自处于以情况：对照小鼠在接种后第4天、第8天、第11天和第15天后用IgG联合或不联合GA-RG(2.4mg/剂量)治疗；小鼠在接种后第4天、第8天、第11天和第15天后用aOX40(250mcg)联合或不联合GA-RG(2.4mg/剂量)治疗。
[0178] 如图9A中所示，GR-1阴性/CD11b阳性细胞的百分数在用aOX40和GA-RG联合治疗的动物的循环中(在本图中标记为MD02)增加。
[0179] 相反，GR-1中间型/CD11b阳性细胞的数目在用aOX40和GA-RG联合治疗的动物中(在本图中标记为MD02)相应地减少。
[0180] GR-1阴性/CD11b阳性细胞的增加表明非抑制型单核细胞增加，这种增加与更少的可能与对肿瘤的治疗效果相关的免疫细胞抑制作用相关。
[0181] 这些结果还表明可以用联合治疗在荷瘤小鼠的血液循环和肿瘤微环境下改变单核细胞/巨噬细胞的表型。
[0182] 实施例6：用抗OX40和GA-RG联合共同治疗后MCA205肿瘤(一种肉瘤肿瘤细胞系)中增强疗效
[0183] 在该实施例中，在利用MCA205细胞的小鼠肉瘤癌的同基因模型中进行实验。
[0184] 该实施例包括4个接种肿瘤小鼠的治疗组，其中两个组各自处于以下情况：对照小鼠(250mcg；第4天，第8天)在接种后第4天、第6天、第8天、第11天、第13天和第15天后IgG联合或不联合GA-RG(2.4mg/剂量)治疗；小鼠在接种后第4天、第6天、第8天、第11天、第13天和第15天后用aOX40(250mcg；第4天，第8天) 联合或不联合GA-RG(2.4mg/剂量)治疗。
[0185] 图10A示出了aOX40与GA-RG联合施用(在本图中标记为GR-MD-02)时肿瘤尺寸随着时间的推移明显减小，并且用这种联合治疗的动物中肿瘤生长非常少。
[0186] 图10B示出了动物的存活曲线。在接受aOX40与GA-RG联合治疗(在本图中标记为GR-MD-02)的动物中存在统计显著的存活改善。
[0187] 这表明随肉瘤肿瘤细胞观察到与前列腺和乳腺癌细胞所见相似的效果，并且在某些方面，这种效果在这些肿瘤模型中更加强大。
[0188] 实施例7：半乳糖凝集素-3在肿瘤细胞系中的表达
[0189] 在这些实验中所使用的肿瘤细胞系及其它肿瘤细胞系中评价半乳糖凝集素-3的表达。
[0190] 图11A示出了存在由多种细胞系分泌到培养介质中的明显数量的半乳糖凝集素-3蛋白，在NOP-17和SCN细胞系中分泌少或无分泌。重要的是，用于之前实施例中的两个细胞系4T1和TRAMP-C1分泌大量的半乳糖凝集素-3。这些数据表明在细胞系中存在可能与药物疗效有关的不同半乳糖凝集素-3表达水平。
[0191] 图11B示出了在多个细胞系的全细胞裂解物中存在明显数量的半乳糖凝集素-3蛋白，NOP-17和SCN细胞系中量少。重要的是，用于之前实施例中的三个细胞系4T1、TRAMP-C1和MCA-205表达大量的半乳糖凝集素-3。
[0192] 值得注意的是，表达最大数量的半乳糖凝集素-3的细胞系MCA-205(图11B)对aOX40与GA-RG联合治疗(实施例6)的反应最大。
[0193] 这些结果还表明肿瘤对与GA-RG联合治疗的反应与半乳糖凝集素表达水平相关。
[0194] 实施例8：半乳糖凝集素-3在T细胞活化中的双重作用
[0195] 免疫抑制作用和肿瘤浸润性淋巴细胞的溶细胞功能降低是为患者产生有效治疗的主要障碍。半乳糖凝集素-3(凝集素家族成员)在包 括乳腺癌和前列腺癌的多种癌中表达。而且，它由前列腺上皮、巨噬细胞和活化型淋巴细胞广泛表达。
[0196] 内源性半乳糖凝集素-3促进替代性巨噬细胞活化并限制TCR-介导的CD4T细胞活化，这种活化限制抗肿瘤免疫。
[0197] 因为半乳糖凝集素-3对炎症和CD8T细胞功能的调节性作用仍未知，所以实施实验以研究这个问题。
[0198] 假设在肿瘤微环境下的半乳糖凝集素-3通过负向调节CD8T细胞的功能促进肿瘤进展。为了检验这个假设，检查CD8T细胞中内源性半乳糖凝集素-3缺失的作用。
[0199] 在体内，与野生型(WT)对照相比，抗原特异性Gal3-/-CD8T细胞展示了降低的效应子功能(减少的增殖、颗粒酶B、IFN-γ和IL-2)。
[0200] 对抗原特异性Gal3-/-或Gal3+/+CT8T细胞中差异性基因表达的分析发现，与对照相比，Gal3-/-CT8T细胞中颗粒酶B、CD25、KIRG-1和Blimp-1基因表达减少。
[0201] 体内研究表明抗原特异性Gal3-/-CD8T细胞在CD25和OX40表达方面明显减少。这些数据表明一个新的且令人惊奇的发现，即，半乳糖凝集素-3在促进CD8T细胞功能方面具有重要作用，这与它在CD4功能中的抑制作用相反。
[0202] 为了评价半乳糖凝集素3在肿瘤微环境下的作用，利用前列腺癌的TRAMP模型，检查肿瘤中半乳糖凝集素3表达。半乳糖凝集素-3在巨噬细胞和肿瘤内部的癌细胞上表达。
[0203] 半乳糖凝集素3联合GA-RG(GR-MD-02)的抑制作用在体内增加CD8T细胞扩充和CD62L表达，这表明Gal3在CD8T细胞功能中的双重作用。
[0204] 图12示出了通过流式细胞分析术天然半乳糖凝集素-3缺乏型CD8T细胞和野生型(WT)CD8T细胞之间的表型比较。图12A示出在未处理的脾细胞上评价WT、Gal3-/-、WTOT-1或Gal3-/-OT-1小鼠中天然CD8和CD4上表型标记的基线表达。对于CD8和CD4，列出的表达百分比是表达CD8或CD4的活细胞的百分比。图12B示出了 该模型：野生型C57BL/6小鼠在第1天接受3x10e6个天然WT细胞或Gal3-/-OT-I CD8T细胞(iv)。用500mcg可溶性OVA(sq；d0)刺激供体OT-I T细胞。
[0205] 图13示出了半乳糖凝集素-3缺乏型CD8T细胞在体内抗原刺激后显示了降低的效应子功能。图13A-C示出了脾脏中在刺激后第7天通过流式细胞分析术确定的供体OT-I T细胞的表型。图表描述了来自3个独立实验之一的各只小鼠(n＝4/组)的平均值(*P<0.05；**P<0.01)。
[0206] 图14示出了所选择的基因在半乳糖凝集素-缺乏型CD8T细胞中下调。将野生型或Gal3-/-OT-1T细胞过继转移到野生型宿主中，并随后用OVA刺激。四天后，收获淋巴结，并且通过细胞分选纯化供体CD8T细胞。从这些细胞中提取RNA，并且利用Affymetrix DNA微阵列评价基因表达的变化。图14A示出了相对于WT，发现在Gal3-/-OT-1细胞中下调的几种基因的图示。图14B示出了所选基因的相对单位和倍数变化。
[0207] 图15示出了半乳糖凝集素-3缺乏型CD8T细胞在抗原刺激后具有减少的CD25和OX40表达。在体外，用肽冲击(5微克/ml或者0.0005微克/ml)的DC2.4树突细胞联合或联合IL-2(100ng/ml)刺激纯化的天然野生型或Gal 3-/-OT-1CD8。稍后在48小时或72小时收获细胞以通过流式细胞术检测CD25(IL-2Ra)OX40的表达。
[0208] 图16示出了半乳糖凝集素-3抑制作用增强CD8T细胞效应子功能。野生型C57BL/6小鼠在第1天接受3x10e6个天然WT OT-I CD8T细胞(iv)。供体OT-I T细胞。Gal-3抑制剂，GR-MD-02(尤其是GA-RG)(白色柱体)(sq；d0，1)。7天(图16A)或29天(图16B)后，通过流式细胞术分别确定外周血或脾中供体细胞的表型。各组之间Ki-67、颗粒酶B或KLRG-1表达无差异。
[0209] 图17示出了在第29天分离的脾细胞中与抗CTLA-4联合使用时，半乳糖凝集素-3联合GA-RG(GR-MD-02)的抑制作用增强CD8T细胞扩充。
[0210] 这些研究表明内源性半乳糖凝集-3缺乏减少CD8T细胞响应于抗原的增殖和活化，并减少细胞因子产生。
[0211] 半乳糖凝集素-3缺乏型CD8T细胞已经减少KLRG、CD25、IFNg、颗粒酶B和FasL，它们在效应子CD8中均增加。
[0212] 半乳糖凝集素-3缺乏型CD8T细胞在体外具有减少的CD25和OX40表达。可以通过加入IL-2拯救CD25表达，而不能通过加入IL-2拯救OX40表达。
[0213] 利用GA-RG(也称为GR-MD-02)的体内半乳糖凝集素-3抑制作用改善了响应于抗原的CD8T细胞增殖和活化。
[0214] 因此，似乎半乳糖凝集素-3联合实质上或专门在胞外区室中发挥作用的抑制剂的抑制作用具有与T细胞中内源性产生的半乳糖凝集素-3的完全缺乏不同的效果。
[0215] 虽然已经结合本发明优选的实施方式具体示出并描述了本发明，但是可以理解，本领域技术人员可以在不偏离本发明范围的情况下对形式和细节上做出各种改变。本文中提及的所有出版物、专利和序列数据库记录在此通过引用的方式完整并入，就好像每个单独的出版物或专利被具体且单独地说明以通过引用的方式并入。
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