基于干细胞的器官和组织的产生的方法
阅读：902发布：2023-01-23
专利汇可以提供基于干细胞的器官和组织的产生的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 公开了一种用于在非人类动物中产生人体组织的方法，包括：(i)产生人类幼稚状态干细胞并将其注射到非人类动物的囊胚或胚胎中以产生嵌合动物；(ii)获得来自嵌合动物的人体组织或细胞中分泌或制得的人体组织、器官、细胞或因子；和(iii)将所 收获 的材料移植或给予人体，从而在非人类动物中产生人体组织。，下面是基于干细胞的器官和组织的产生的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于在非人类哺乳动物宿主中产生人体组织或器官的方法，包括：
(i)产生人幼稚状态干细胞并将其注射到非人类动物宿主的受精卵、桑椹胚、囊胚、胚胎或发育中的胎儿，以使得产生嵌合动物；
(ii)收获由来自嵌合动物的人体组织或细胞分泌或在其中制得的人体组织、器官、细胞或因子；
(iii)将收获的材料移植到或给予人体以产生人体组织。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使用NME7、NME7-AB、NME7-X1、NME6或二聚NME1产生幼稚状态干细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中幼稚干细胞是iPS细胞，其在含有NME7、NME7-AB、NME6、NME7-X1或二聚NME1的培养基中重编程。
4.根据权利要求2所述的方法，其中幼稚干细胞是胚胎干细胞，其在含有NME7、NME7-AB、NME6、NME7-X1或二聚NME1的培养基中培养。
5.根据权利要求1所述的方法，其中从基因上改变囊胚或胚胎的非人体细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中基因改变导致在宿主动物中不能产生特定的组织或器官。
7.根据权利要求1所述的方法，其中维持干细胞处于幼稚状态或将已启动的干细胞恢复到幼稚状态的试剂是NME蛋白、2i、5i、化学品或核酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中NME蛋白是NME1二聚物、NME7单体、NME7-AB、NME6二聚物或细菌NME。
9.根据权利要求1所述的方法，其中非人类动物是啮齿动物、猪牛、绵羊或灵长类动物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
11.根据权利要求3所述的方法，其中NME蛋白作为单个生长因子存在于无血清的培养基中。
12.根据权利要求1所述的方法，其中非人类动物宿主表达NME蛋白，其具有与将产生的干细胞种类的天然序列同源的序列。
13.根据权利要求12所述的方法，其中NME蛋白是NME7、NME7-AB、NME7-X1、或二聚的NME1或NME6。
14.根据权利要求13所述的方法，其中NME蛋白是NME7。
15.根据权利要求12所述的方法，其中NME蛋白与将产生的干细胞种类的天然NME蛋白序列至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同源。
16.根据权利要求14所述的方法，其中NME蛋白与将产生的干细胞种类的天然序列至少
60％同源。
17.根据权利要求14所述的方法，其中NME蛋白与将产生的干细胞种类的天然序列至少
70％同源。
18.一种NME蛋白，其具有与小鼠天然NME蛋白至少75％同源的序列。
19.一种NME蛋白，其具有与大鼠天然NME蛋白至少75％同源的序列。
20.一种NME蛋白，其具有与猪天然NME蛋白至少75％同源的序列。
21.一种NME蛋白，其具有与绵羊天然NME蛋白至少75％同源的序列。
22.一种NME蛋白，其具有与牛天然NME蛋白至少75％同源的序列。
23.一种NME蛋白，其具有与食蟹猴天然NME蛋白至少75％同源的序列。
24.一种NME蛋白，其具有与猕猴天然NME蛋白至少75％同源的序列。
25.一种NME蛋白，其具有与黑猩猩天然NME蛋白至少75％同源的序列。
26.一种NME蛋白，其具有与倭黑猩猩天然NME蛋白至少75％同源的序列。
27.一种NME蛋白，其具有与大猩猩天然NME蛋白至少75％同源的序列。
28.一种抗体，其结合于包含MUC1*的胞外结构域的序列的肽，其中所述序列是非人类的。
29.一种抗体，其结合于包含MUC1*的胞外结构域的序列的肽，其中所述序列是灵长类动物的。
30.一种抗体，其结合于包含MUC1*的胞外结构域的序列的肽，其中所述序列是猕猴、黑猩猩、猿、倭黑猩猩或大猩猩的。
31.一种抗体，其结合于包含MUC1*的胞外结构域的序列的肽，其中所述序列是非灵长类动物的。
32.一种抗体，其结合于包含MUC1*的胞外结构域的序列的肽，其中所述序列是啮齿动物的。
33.一种抗体，其结合于包含MUC1*的胞外结构域的序列的肽，其中所述序列是小鼠或大鼠的。
34.一种抗体，其结合于包含MUC1*的胞外结构域的序列的肽，其中所述序列是哺乳动物的。
35.一种抗体，其结合于包含MUC1*的胞外结构域的序列的肽，其中所述序列是猪、牛或绵羊的。
36.一种用于产生干细胞的方法，在体细胞或培养的干细胞中诱导多能性，包括将细胞与NME蛋白和/或抗MUC1*抗体相接触的步骤，其中NME蛋白与供体细胞的序列至少75％同源，且抗MUC1*抗体结合于包含MUC1*胞外结构域的序列的肽，其中所述序列与所贡献细胞的物种的天然序列至少75％同源。
37.一种治疗需要所产生的组织或器官的人的方法，包括实施如权利要求1所述的步骤。
38.一种产生第一非人类哺乳动物的方法，所述第一非人类哺乳动物包含特别是来源于第二哺乳动物的DNA、分子、细胞、组织或器官，所述第二哺乳动物与第一非人类哺乳动物属于或不属于相同的种或属，包括将来自第二哺乳动物的细胞引入第一非人类哺乳动物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中来自第二哺乳动物的细胞为祖细胞、干细胞或幼稚状态干细胞。
40.根据权利要求39所述的方法，其中通过在含有NME的培养基中培养细胞而产生幼稚状态干细胞。
41.根据权利要求40所述的方法，其中NME蛋白是二聚的NME1、二聚的NME6、NME7-X1或NME7-AB。
42.根据权利要求41所述的方法，其中NME具有对第二哺乳动物为内源性的序列。
43.根据权利要求38所述的方法，其中第二哺乳动物是人类。
44.根据权利要求38所述的方法，其中第一非人类哺乳动物是啮齿动物、家养哺乳动物、猪、牛或非人灵长类动物。
45.根据权利要求39所述的方法，其中将祖细胞、干细胞或幼稚状态干细胞引入第一非人类哺乳动物的受精卵、桑椹胚、囊胚、胚胎或发育中的胎儿。
46.根据权利要求38所述的方法，进一步包括：
允许第一非人类哺乳动物发育并从掺入了一些第二哺乳动物DNA的第一非人类哺乳动物的分子、细胞、组织或器官收获；以及
并将该分子、细胞、组织或器官给予有需要的第二哺乳动物用于治疗或预防疾病或症状。
47.根据权利要求46所述的方法，其中祖细胞、干细胞或幼稚状态干细胞是iPS细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中产生iPS细胞的体细胞来自第二哺乳动物，对其给予所获得的分子、细胞、组织或器官，用于治疗或预防疾病或症状。
49.根据权利要求46所述的方法，包括：
确定器官发育时间段和参与器官发育的内源基因；以及
在第一非人类哺乳动物器官的发育时期期间敲除或敲减内源基因，其中所述器官由第二哺乳动物的细胞产生。
50.根据权利要求38所述的方法，其中第一非人类哺乳动物接近第二哺乳动物，在整体序列上的同一性大于70％、75％、80％、85％、90％或95％，或者NME序列同一性大于45％、
50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
51.根据权利要求46所述的方法，包括：
确定器官发育时间段和参与器官发育的内源基因；以及
基因上改变第一非人类哺乳动物的受精卵、桑椹胚的细胞、囊胚的细胞、或者胚胎或发育中的胎儿的细胞，使得第二哺乳动物NME7-AB或NME1由诱导型或可抑制型启动子表达，使得第二哺乳动物细胞响应于非哺乳动物NME7-AB或NME1而及时扩增。
52.根据权利要求39所述的方法，包括在期望的器官或组织正常发育的位置在发育的后期将第二哺乳动物干细胞注射到胚胎中。
53.根据权利要求52所述的方法，进一步包括通过在该位置诱导第一非人类哺乳动物或第二哺乳动物NME7或NME1的表达来扩增哺乳动物干细胞。
54.根据权利要求53所述的方法，包括通过在该位置诱导第一非人类哺乳动物或第二哺乳动物NME1的表达来扩增哺乳动物干细胞。
55.根据权利要求53所述的方法，其中第二哺乳动物启动子链接于内源性第一非人类哺乳动物蛋白并在期望的时间和位置表达，随后引入指导期望的组织发育的试剂。
56.根据权利要求55所述的方法，其中内源性第一非人类哺乳动物蛋白是诱导NME1或NME7表达的蛋白。
57.根据权利要求56所述的方法，其中内源性第一非人类哺乳动物蛋白是诱导NME1表达的蛋白。
58.一种在嵌合动物中测试潜在药剂的效力和毒性的方法，所述嵌合动物表达一些第二哺乳动物DNA或一些第二哺乳动物的组织，包括：
(i)产生第一非人类哺乳动物，所述第一非人类哺乳动物包括特别是来源于第二哺乳动物的DNA、分子、细胞、组织或器官，所述第二哺乳动物与第一非人类哺乳动物属于或不属于相同的种或属，包括将来自第二哺乳动物的细胞引入第一非人类哺乳动物；以及(ii)对第一非人类哺乳动物给予测试药物，以获得对源于第二哺乳动物的组织或器官的效果。
59.根据权利要求58所述的方法，其中NME在第一非人类哺乳动物中表达，其增强了来源于第二哺乳动物的细胞的增殖。
60.一种在嵌合动物中发现潜在药剂的方法，所述嵌合动物表达一些第二哺乳动物DNA或一些第二哺乳动物的组织，包括：
(i)产生第一非人类哺乳动物，所述第一非人类哺乳动物包括特别是来源于第二哺乳动物的DNA、分子、细胞、组织或器官，所述第二哺乳动物与第一非人类哺乳动物属于或不属于相同的种或属，包括将来自第二哺乳动物的细胞引入第一非人类哺乳动物；以及(ii)对第一非人类哺乳动物给予化合物，以获得对源于第二哺乳动物的组织或器官的效果，其中有效的效果指示存在潜在药物。
61.根据权利要求60所述的方法，其中NME在第一非人类哺乳动物中表达，其增强了来源于第二哺乳动物的细胞的增殖。
基于干细胞的器官和组织的产生的方法
技术领域
[0001] 本申请涉及在非人类动物中创建人体组织的方法。本申请还涉及在非人类动物上的药物测试，因为它涉及存在于非人类动物中的人体组织。本申请还涉及用从非人类动物获得的人体组织或器官治疗患者的方法。本申请还涉及产生能够掺入人体细胞和组织的转基因动物的方法。
背景技术
[0002] 目前，在通过将干细胞插入发育中的胚胎或囊胚制造嵌合动物的领域有相当多的研究。最终目标是能够在诸如牛、绵羊或猪的动物中产生人体器官或组织，其中所得到的器官或组织将用于移植到人体中。供体干细胞可以来自需要新的肝脏、心脏等的患者。如果成功，该技术将取代对器官供体的需求；目前大多数患者在确定合适的器官供体之前死亡。
[0003] 目前技术的存在是由于：1)制造一种不会产生心脏、胰腺、肺或其他器官或组织的基因敲除动物；2)通过将供体干细胞注射到另一个的桑葚胚或囊胚来制造嵌合动物；3)制造嵌合动物，其中受精或未受精的卵已经敲除了基因，使得它们不再具有形成特定器官或组织的能力，但是供体干细胞确实具有形成该特定器官或组织的能力，所以嵌合动物在靶向器官中可能具有高达100％的供体干细胞的DNA。这些技术已显示适用于多种物种的应用，如小鼠到大鼠，大鼠到小鼠。产生的器官的尺寸取决于受体动物的尺寸。然而，大鼠和小鼠是相近的物种。
[0005] 一个问题是，至少在啮齿动物的例子中，只有幼稚状态的干细胞能够掺入桑葚胚或内细胞团并形成嵌合体。启动状态的干细胞则不能。
[0006] 本发明通过提供产生在幼稚状态的人类干细胞的方法来解决该问题，其用于产生非人类-人类嵌合动物也用于提供适合多能人类干细胞在非人类环境中生长的环境。本发明通过提供“人源化”宿主动物的方法来解决该问题，其通过从基因方面改变它们使得它们能够在非人类宿主动物中表达能够生长和扩增人体细胞的人类因子。
发明内容
[0007] I.在一个方面，本发明涉及在嵌合动物中测试潜在药剂的效力和毒性的方法，所述嵌合动物表达一些人类DNA或一些人类组织。在该方法中，表达人类的一些DNA或组织的动物是通过将人类幼稚干细胞导入非人体细胞或细胞群中产生的。在一个方面，非人体细胞是卵细胞，在另一个方面其为受精卵，在另一个方面，所述细胞是桑椹胚、囊胚或胚胎。出于伦理的考虑或其他原因，有利的是产生嵌合动物，其中整合的幼稚状态干细胞也是非人类的，但是其为与受体细胞、细胞群、桑椹胚、囊胚或胚胎不同的物种。在以上方法中，维持干细胞处于幼稚状态或将已启动的干细胞恢复到幼稚状态的试剂可以是NME蛋白、2i、5i，或抑制剂、化学品的其他混合物，或核酸。NME蛋白可以是NME1二聚物、NME7单体、NME7-AB、NME7-X1、NME6二聚物、或细菌NME。
[0008] 非人类哺乳动物可以是诸如小鼠或大鼠的啮齿动物，包括猕猴、恒河、猿、黑猩猩、倭黑猩猩等的灵长类动物，或包括猪、绵羊、牛等的家畜。嵌合动物可以具有基因缺陷、具有诱发的疾病，或者同时产生或从源自人类的细胞植入的癌症。
[0009] 在以上方法中，非人类动物可以是转基因的，其中该动物在生殖细胞或体细胞中表达人MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖细胞或体细胞包含引入所述动物的重组人MUC1或MUC1*或NME基因序列。表达人MUC1或MUC1*或NME蛋白的基因可以处于诱导型启动子的控制之下。启动子可以诱导性响应在非人类动物中自然发生的蛋白或者在发育前、后或期中给予动物的试剂。或者，非人类动物可以是转基因的，其中动物在生殖细胞或体细胞中表达其天然的序列MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖细胞或体细胞包含引入所述动物的重组天然种类的MUC1或MUC1*或NME基因序列。NME种类可以是NME7、NME7-X1、NME1、NME6、或细菌NME。
[0010] 在以上方法中，维持干细胞处于幼稚状态或将已启动的干细胞恢复到幼稚状态的试剂可以是NME蛋白、2i、5i，或抑制剂、化学品的其他混合物，或核酸。NME蛋白可以是NME1二聚物、NME7单体、NME7-AB、NME7-X1、NME6二聚物、或细菌NME。
[0011] 在该方法中，所述试剂可以抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6的表达。所述试剂可以是抗MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6的siRNA，或抗编码上调MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6表达的蛋白的任何基因的siRNA。癌干细胞可以以CXCR4或E-cadherin(CDH1)的表达相比较癌细胞或正常细胞的增加为特征。
[0012] 在另一个方面，本发明涉及一种用于在非人类哺乳动物中从异种移植物中产生组织的方法，包括：(i)产生转基因非人类哺乳动物，其中所述哺乳动物在生殖细胞和体细胞中表达人MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中所述生殖细胞和体细胞含有引入到所述哺乳动物中的重组人MUC1或MUC1*或NME基因序列，其中所述基因序列的表达可以处于诱导型和阻抑型调控序列的控制下；(ii)将异源起源的干细胞或祖细胞转移到非人类哺乳动物中，使得该基因可被诱导表达以增加干细胞或祖细胞的数量；以及(iii)抑制基因表达以从异种移植的干细胞产生组织。
[0013] 在该方法中，在步骤(iii)中，基因表达抑制可以通过将干细胞与组织分化因子接触而实施，或者在步骤(iii)中，基因表达抑制可以在哺乳动物中自然地实施以响应自然产生的宿主组织分化因子。转移的细胞可以是人类的。所述组织可以是器官。NME蛋白可以是NME7、NME7-AB、NME7-X1、NME1、NME6、或细菌NME。所述动物可以是哺乳动物、啮齿动物、灵长类动物或家养动物如猪、绵羊或牛物种。
[0014] II.在其他方面，本发明涉及制造具有至少一些人体细胞或细胞群的动物，其中DNA中的至少一些是人类来源的。这样的动物可以生长人体组织，包含一些人体细胞或包含一些人类DNA用于产生人体或类人体组织的细胞的组织。在其他情况下，这样的动物生长包括至少一些人体细胞的器官。在其他情况下，这样的动物生长完全由人体细胞组成的器官。在另外的情况下，宿主动物甚至在开发生长人体四肢后能够在基因上或者分子上进行操纵。其中制得或选自其中的四肢、神经、血管、组织、器官或因素，将随后从动物中获得并用于多种目的，包括但不限于：1)移植于人体；2)给予人体用于医药效益，包括抗衰老；以及3)科学实验，包括药物试验和疾病建模。
[0015] 在一个方面，本发明涉及一种用于在非人类动物中产生人体组织的方法，包括：(i)产生人类幼稚状态干细胞并将其注射到非人类动物的受精卵、桑椹胚、囊胚或胚胎中，以使得产生嵌合动物；(ii)收获由来自嵌合动物的人体组织或细胞中分泌或在其中制得的人体组织、器官、细胞或因子；以及(iii)将收获的材料移植到或给予人体。可以使用NME7、NME7-AB、NME7-X1或二聚NME1产生幼稚状态干细胞。幼稚干细胞可以是iPS细胞，其在含有NME7、NME7-AB、NME7-X1或二聚NME1的培养基中重编程。或者，幼稚干细胞可以是胚胎干细胞，其在含有NME7、NME7-AB、NME7-X1或二聚NME1的培养基中培养。可以在基因上改变囊胚或胚胎的非人体细胞。以及基因改变可以导致宿主动物不能产生特定的组织或器官。基因改变可以使非人类动物表达人类分子，其在非人类宿主动物中促进或增强人类干细胞或祖细胞的掺入或生长。进一步地，维持干细胞处于幼稚状态或将已启动的干细胞恢复到幼稚状态的试剂可以是NME蛋白、2i、5i、化学品、或核酸。NME蛋白可以是NME1二聚物、NME7单体、NME7-AB、NME6二聚物、或细菌NME，或NME7-X1。非人类动物可以是啮齿动物、小鼠、大鼠、猪、绵羊、非人灵长类动物、猕猴、黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩或任何非人类哺乳动物。在本发明的一个方面，出于其与人类NME蛋白的高序列同源性特别是人类NME7-AB或NME7-X1，或与人类MUC1*胞外结构域的高序列同源性而选择非人类动物。在一些情况下，NME蛋白可以存在于无血清的培养基中作为单个生长因子。
[0016] 能否产生嵌合动物的一个试验是如果来自第一物种的干细胞能够掺入第二物种的内细胞团(ICM)中。当两个不同的物种关系密切时，更容易产生嵌合动物，例如两个啮齿动物。我们将人幼稚状态干细胞注射到小鼠桑椹胚中，并显示了它们掺入到了内细胞团(ICM)中。在特定的实例中，将在人NME7-AB中产生随后在人体中培养的人幼稚状态干细胞注射到了小鼠的卵细胞受精后2.5天的桑椹胚中。这在内细胞团形成之前。四十八(48)小时后分析桑椹胚，这样的分析显示了人类干细胞已经掺入到了内细胞团中，指示嵌合动物将开始发育。附图说明
[0017] 本发明将从下面给出的详细描述和附图中得到更充分的理解，附图仅仅是作为说明的方式而给出的，因此不是对本发明的限制，其中：
[0018] 图1显示了在体细胞成纤维细胞中主要多能调节基因Oct4和Nanog的表达的RT-PCR测量图，“fbb”细胞在正常成纤维细胞生长培养基或无血清基本培养基中培养，其中加有人重组NM23，也称为NME1二聚物、NME7-AB或HSP593细菌NME1二聚物。“+ROCi”是指Rho激酶抑制剂，其被添加到一些细胞中以使其粘附到表面。
[0019] 图2显示了在体细胞成纤维细胞中编码染色质重排因子BRD4、JMJD6、MBD3和CHD4的基因表达的RT-PCR测量图，“fbb”细胞在正常的成纤维细胞生长培养基或无血清基本培养基中培养，其中加有人重组NM23，也称为NME1二聚物、NME7-AB或HSP593细菌NME1二聚物。“+ROCi”是指Rho激酶抑制剂，其被添加到一些细胞中以使其粘附到表面。
[0020] 图3显示了在体细胞成纤维细胞中多能基因OCT4和NANOG，染色质重排因子BRD4、JMJD6、MBD3和CHD4，以及NME1和NME7的表达的RT-PCR测量图，“fbb”细胞在正常的成纤维细胞生长培养基或无血清基本培养基中培养，其中加有人重组NM23，也称为NME1二聚物、NME7-AB或HSP593细菌NME1二聚物。“+ROCi”是指Rho激酶抑制剂，其被添加到一些细胞中以使其粘附到表面。
[0021] 图4A-4B显示了具有多能形态的人胚胎干细胞的照片，其中干细胞在具有重组人NME1二聚物作为所添加的仅有的生长因子的无血清基本培养基中培养。图4A显示了在4倍放大率下拍摄的照片，以及图4B显示了在20倍放大率下拍摄的照片。
[0022] 图5A-5C显示了具有多能形态的人胚胎干细胞的照片，其中干细胞在具有重组人NME7-AB作为所添加的仅有的生长因子的无血清基本培养基中培养。图5A显示了在4倍放大率下拍摄的照片，图5B显示了在10倍放大率下拍摄的照片，以及图5C显示了在20倍放大率下拍摄的照片。
[0023] 图6A-6B显示了来自ELISA夹心检测的HRP信号的图表，显示了NME7-AB二聚物MUC1*外细胞域肽。图6A显示了结合于涂覆有MUC1*胞外结构域肽PSMGFR的表面的NME7-AB的量，以及图6B显示了结合于在结合的NME7-AB上的第二位点的第二MUC1*肽。
[0024] 图7显示了在最早阶段的人幼稚干细胞中转录因子BRD4和辅助因子JMJD6相比较在晚期启动的干细胞的表达水平的RT-PCR测量图。
[0025] 图8显示了在4倍放大率下，人成纤维细胞在含有以二聚物形式的人NME1的无血清培养基中培养18天后的照片。
[0026] 图9显示了在20倍放大率下，人成纤维细胞在含有以二聚物形式的人NME1的无血清培养基中培养18天后的照片。
[0027] 图10显示了在4倍放大率下，人成纤维细胞在含有人NME7-AB的无血清培养基中培养18天后的照片。
[0028] 图11显示了在20倍放大率下，人成纤维细胞在含有人NME7-AB的无血清培养基中培养18天后的照片。
[0029] 图12显示了在4倍放大率下，人成纤维细胞在无NME蛋白的标准培养基中18天后的照片。
[0030] 图13显示了在20倍放大率下，人成纤维细胞在无NME蛋白的标准培养基中18天后的照片。
[0031] 图14A-14C显示了发明者们就人类干细胞如何限制它们自身复制的发现的机理模型的动画。图14A显示NME7-AB由天然干细胞分泌，并且NME7-AB如何将MUC1*生长因子受体作为单体而二聚化，但随后被BRD4抑制，而辅助因子JMJD6上调NME1，图14B显示NME1由晚期幼稚状态干细胞分泌，但是仅作为二聚物与MUC1*结合，而图14C显示随着干细胞数量的增加，NME1的浓度也增加，使得NME1形成不结合MUC1*的六聚体，并且它们诱导分化。
[0032] 图15A-15B显示了利用发明者们开发的识别NME7-AB和NME7-X1的抗体染色人成纤维细胞的照片。图15A显示了第3天的囊胚，其中每个细胞对NME7-AB或NME7-X1的存在呈阳性染色，以及图15B显示第5天的囊胚，其中只有内细胞团的幼稚细胞对于NME7-AB或NME7-X1的存在呈阳性染色。
[0033] 图16A-16B显示了来自免疫共沉淀实验的蛋白印迹凝胶的照片，其中人幼稚状态诱导的多能干(iPS)细胞和胚胎干(ES)细胞被裂解，针对MUC1(Ab5)的胞质尾区的抗体用于与MUC1结合的免疫共沉淀物质。然后通过蛋白印迹检测免疫沉淀物。图16A显示了用抗NME7抗体探测的蛋白印迹的照片，并显示两种NME7，一种分子量为30kDa，另一种为33kDa，与MUC1结合，而粗细胞裂解物中的全长NME7具有42kDa的分子量，以及图16B显示蛋白印迹的照片，其中图16A的凝胶被剥离并用抗MUC1*胞外结构域抗体重新探测，表明NME7-AB或NME7-X1结合MUC1的切割形式，称为MUC1*，其分子量为17-25kDa，取决于糖基化。
[0034] 图17显示了使用NME7-AB作为MNC3抗-MUC1*胞外结构域抗体的粘附表面上唯一的生长因子用于在幼稚状态下培养人类干细胞的本发明方法的动画。当期望诱导分化时，加入合成的MUC1*胞外结构域肽以结合所有的NME7-AB。
[0035] 图18A-18C显示来自RNA SEQ实验的热图，其中来自于FGF并处于启动状态的人胚胎干(ES)细胞通过在NME7-AB或NME1二聚物中培养而恢复到较不成熟的幼稚状态。图18A显示亲代FGF培养的ES细胞的热图，图18B显示在NME7-AB中培养10代的亲代细胞的热图，图18C显示在NME1二聚物中培养10代的亲代细胞的热图。
[0036] 图19A-19B显示用与组蛋白3上的三甲基化赖氨酸27结合的抗体染色的人胚胎干(ES)细胞的照片，其中红色焦点的存在表明雌性源干细胞的第二个X染色体已经失活，XaXi，这是一个迹象表明，细胞是启动状态，并已启动早期分化并做出了一些细胞命运的决定；红色云的存在或红色染色的缺失表明两个X染色体仍然是活性的，XaXa，因此没有做出分化决定，所以是幼稚的。图19A显示了已经在FGF培养基中培养至少10代的雌性源干细胞的照片，图19B显示了在NME7-AB培养基中培养了10代的相同细胞的照片。
[0037] 图20A-20B显示在两个时间点在NME7-AB培养基中在MNC3抗-MUC1*抗体表面上培养的人多能干细胞的照片，显示在四天时间内10-20倍的扩增速率，其中是一个比启动状态干细胞快得多的生长速率，这也是在NME7-AB中培养的干细胞处于幼稚状态的另一个指标。图20A显示了在第四天的干细胞，以及图20B显示了在第四天的干细胞。
[0038] 图21A-21C显示使用Yamanaka主要重编程因子OCT4、NANOG、KLF4和使用仙台病毒转导递送的c-Myc重编程为成为多能干细胞的成纤维细胞照片，其中通过用碱性磷酸酶染色显现重编程的诱导的多能干细胞。图21A显示在FGF培养基上通过MEF饲养细胞进行的重编程，图21B显示在mTeSR培养基上通过人工基底膜进行的重编程，以及图21C显示在NME7-AB培养基上通过MNC3抗-MUC1*抗体表面进行的重编程。
[0039] 图22A-22D显示携带荧光标记的人iPS细胞的照片，在NME7-AB中衍生并培养的黄色细胞，在第2.5天注射到小鼠囊胚中，然后在第4.5天48小时后成像，显示了在NME7-AB中培养的人iPS细胞有能力整合到小鼠胚胎的内细胞团中。图22A显示克隆E人iPS细胞(黄色)的荧光显微照片，其发现进入包含幼稚干细胞的小鼠胚胎的内细胞团中的途径。图22B是相同的照片，但是打开另一个荧光通道以允许DAPI成像，蓝色的，显示所有细胞，并显示NME7-AB细胞仅仅整合到在将发育成为胎盘的滋养外胚层中的内细胞团中，图22C显示了克隆R人iPS细胞(黄色)的荧光显微照片，其发现进入含有幼稚干细胞的小鼠胚胎的内细胞团中的途径，图22D是相同的照片，但是打开另一个荧光通道以允许DAPI成像以显示所有细胞，并显示NME7-AB细胞只能整合到内细胞团中，在将发育成胎盘的滋养外胚层中的内细胞团中。
[0040] 图23A-23J显示了产生人iPS细胞、克隆E的NME7-AB的共聚焦图像，其注射到2.5天的小鼠桑椹胚中。对人Tra 1-81(红色)染色48小时后显示NME7-AB人类干细胞掺入小鼠桑椹胚的内细胞团中。图23A、23C、23E、23G和23I为荧光图像。图23B、23D、23F、23H和23J为明视场图像。
[0041] 图24A-24J显示了产生人iPS细胞、克隆R的NME7-AB的共聚焦图像，其注射到2.5天的小鼠桑椹胚中。对人Tra 1-81(红色)染色48小时后显示NME7-AB人类干细胞掺入小鼠桑椹胚的内细胞团中。图24A、24C、24E、24G和24I为荧光图像。箭头指向幼稚状态NME7-AB人类干细胞掺入小鼠桑椹胚中，指示嵌合动物的形成。图24B、24D、24F、24H和24J为明视场图像。
[0042] 图25A-25D显示了产生人iPS细胞的FGF的共聚焦图像，其注射到2.5天的小鼠桑椹胚中。对人Tra 1-81(红色)染色和对滋养外胚层的染色(绿色)48小时后显示一些散乱的人类干细胞，但是没有启动的人类干细胞掺入小鼠桑椹胚的内细胞团中，指示开始形成嵌合动物失败。图25A和25C为荧光图像，图25B和25D为明视场图像。
[0043] 图26A-26D显示了产生人iPS细胞的NME7-AB的共聚焦图像，其在50％NME7-AB培养基和50％KSOM，钾单纯优化培养基中培养，随后被注射到2.5天的小鼠桑椹胚中。48小时后拍摄荧光和明视场图像。对人Tra 1-81(红色)染色和对滋养外胚层的染色(绿色)48小时后显示了人体细胞的最低量，如果存在的话，整合并且没有启动的人类干细胞掺入小鼠桑椹胚的内细胞团中，指示开始形成嵌合动物失败。图26A、26C、26E和26G为荧光图像，以及图26B、26D、26F和26H包括DAP染色。
[0044] 图27A-27F显示了产生人iPS细胞、克隆E的NME7-AB的共聚焦图像，其用荧光标记tdtomato转染，所以它们可以自己发出荧光红色。它们注射到2.5天的小鼠桑椹胚中。48小时后拍摄图像，并显示了NME7-AB人体细胞整合到小鼠桑椹胚的内细胞团中。图27A、27B和27C以红色显示了NME7-AB人体细胞、以绿色显示了小鼠细胞的滋养外胚层，并且图27D、27E和27F以红色显示了NME7-AB人体细胞、以绿色显示了小鼠细胞的滋养外胚层，以及以蓝色显示了来自DAPI染色的所有的细胞核。
[0045] 图28A-28J显示了产生人iPS细胞、克隆E的NME7-AB的共聚焦图像，其用荧光标记tdtomato转染，所以它们可以自己发出荧光红色。它们注射到2.5天的小鼠桑椹胚中，并在48小时后拍摄图像。图像显示了NME7-AB人体细胞整合到小鼠桑椹胚的内细胞团中。图28A、
28C、28E、28G和28I以红色显示了NME7-AB人体细胞、以绿色显示了小鼠细胞的滋养外胚层，以及图28B、28D、28F和28H以红色显示了NME7-AB人体细胞、以绿色显示了小鼠细胞的滋养外胚层，以及以蓝色显示了来自DAPI染色的所有的细胞核。
28C、28E、28G和28I以红色显示了NME7-AB人体细胞、以绿色显示了小鼠细胞的滋养外胚层，以及图28B、28D、28F和28H以红色显示了NME7-AB人体细胞、以绿色显示了小鼠细胞的滋养外胚层，以及以蓝色显示了来自DAPI染色的所有的细胞核。
[0046] 图29A-29J显示了产生人iPS细胞、克隆R的NME7-AB的共聚焦图像，其用荧光标记tdtomato转染，所以它们可以自己发出荧光红色。它们注射到2.5天的小鼠桑椹胚中，并在48小时后拍摄图像。图像显示了NME7-AB人体细胞掺入小鼠桑椹胚的内细胞团中。箭头指示了人体细胞合并到小鼠内细胞团中。图29A、29C、29E、29G、29I以红色显示了NME7-AB人体细胞、以绿色显示了小鼠细胞的滋养外胚层，以及图29B、29D、29F和29H以红色显示了NME7-AB人体细胞、以绿色显示了小鼠细胞的滋养外胚层，以及以蓝色显示了来自DAPI染色的所有的细胞核。
[0047] 图30A-30J显示了产生人iPS细胞、克隆R的NME7-AB的共聚焦图像，其用荧光标记tdtomato转染，所以它们可以自己发出荧光红色。它们注射到2.5天的小鼠桑椹胚中。48小时后拍摄图像。图像显示了NME7-AB人体细胞整合到小鼠桑椹胚的内细胞团中。箭头指示了人体细胞掺入小鼠内细胞团中。图30A、30C、30E、30G和30I以红色显示了NME7-AB人体细胞、以绿色显示了小鼠细胞的滋养外胚层，以及图30B、30D、30F和30H以红色显示了NME7-AB人体细胞、以绿色显示了小鼠细胞的滋养外胚层，以及以蓝色显示了来自DAPI染色的所有的细胞核。
[0048] 图31A-31F显示了证明非人灵长类诱导的多能干细胞的产生的实验中对照板的照片。在这些对照实验中，培养来自食蟹猴的成纤维细胞，但是核多能基因没有被转导。图像显示了非干细胞的成纤维细胞的形态。图31A和31D是在4倍放大率下拍摄的，图31B和31E是在10倍放大率下拍摄的，以及图31C和31F是在20倍放大率下拍摄的。
[0049] 图32A-32C显示了通过在NME7培养基(在这种情况下为NME7-AB)中在抗MUC1*抗体的表面上培养已经重编程为诱导的多能干(iPS)细胞的来自食蟹猴成纤维细胞的第6天照片，在这种情况下是MN-C3，并且通过转导具有核多能基因的细胞，在这种情况下是Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。6孔板的每个孔铺上50000个来自食蟹猴的成纤维细胞。具有茎状形态的新出现的细胞集落被圈起来。图32A是在4倍放大率下拍摄的，图32B是在10倍放大率下拍摄的，以及图32C是在20倍放大率下拍摄的。
[0050] 图33A-33F显示了通过在NME7培养基(在这种情况下为NME7-AB)中在抗MUC1*抗体的表面上培养已经重编程为诱导的多能干(iPS)细胞的来自食蟹猴成纤维细胞的第6天照片，在这种情况下是MN-C3，并且通过转导具有核多能基因的细胞，在这种情况下是Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。6孔板的每个孔铺上100,000个来自食蟹猴的成纤维细胞。具有茎状形态的新出现的细胞集落被圈起来。图33A和33D是在4倍放大率下拍摄的，图33B和33E是在10倍放大率下拍摄的，以及图33C和33F是在20倍放大率下拍摄的。
[0051] 图34A-34F显示了通过在NME7培养基(在这种情况下为NME7-AB)中在抗MUC1*抗体的表面上培养已经重编程为诱导的多能干(iPS)细胞的来自食蟹猴成纤维细胞的第14天照片，在这种情况下是MN-C3，并且通过转导具有核多能基因的细胞，在这种情况下是Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。干细胞集落清晰可见。图34A、34B和34C是在4倍放大率下拍摄的，图34D、34E和34F是在20倍放大率下拍摄的，图34A和34D显示了来自铺上24,000个猕猴成纤维细胞的结果，图34B和34E显示了来自铺上6,000个猕猴成纤维细胞的结果，以及图34C和34F示了来自铺上12,000个猕猴成纤维细胞的结果。
[0052] 图35A-35D显示了在含有NME7-AB的无血清培养基中增殖的恒河猴胚胎干细胞(ES)细胞的照片，NME7-AB作为第一天NME7-AB培养基中在抗MUC1*抗体表面第二代的唯一生长因子。胚胎干细胞集落清晰可见。图35A和35B是在4倍放大率下拍摄的，图35C和35D是在10倍放大率下拍摄的。
[0053] 图36A-36D显示了在含有NME7-AB的无血清培养基中增殖的恒河猴胚胎干细胞(ES)细胞的照片，NME7-AB作为第三天NME7-AB培养基中抗MUC1*抗体表面第二代的唯一生长因子。胚胎干细胞集落清晰可见。图36A和36B是在4倍放大率下拍摄的，以及图36C和36D是在10倍放大率下拍摄的。
[0054] 图37A-37B显示了在含有NME7-AB的无血清培养基中增殖的恒河猴胚胎干(ES)细胞的照片，NME7-AB作为第一天、第三代的唯一生长因子。图37A显示了1000um处的比例尺，图37B显示了400um处的比例尺。
[0055] 图38A-38H显示了在含有NME7-AB的无血清培养基中增殖的恒河猴胚胎干(ES)细胞的照片，NME7-AB作为第四天、第三代的唯一生长因子。图38A、38C和38F是在4倍放大率下拍摄的，图38B、38D和38G是在10倍放大率下拍摄的，以及38E和38H是在20倍放大率下拍摄的。
[0056] 图39A-39C显示了通过在NME7培养基(在这种情况下为NME7-AB)中在抗MUC1*抗体的表面上培养已经重编程为诱导的多能干(iPS)细胞的来自恒河猴成纤维细胞的第14天照片，在这种情况下是MN-C3，并且通过用核多能基因转导该细胞，在这种情况下是在多能基因的转导后第14天的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。图39A是在4倍放大率下拍摄的，图39B是在10倍放大率下拍摄的，以及图39C是在20倍放大率下拍摄的。
[0057] 图40A-40C显示了通过在NME7培养基(在这种情况下为NME7-AB)中在抗MUC1*抗体的表面上培养已经重编程为诱导的多能干(iPS)细胞的来自恒河猴的若干代成纤维细胞的照片，在这种情况下是MN-C3，并且通过用核多能基因转导该细胞，在这种情况下是Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。图40A是在4倍放大率下拍摄的，图40B是在10倍放大率下拍摄的，以及图40C是在20倍放大率下拍摄的。
[0058] 图41A-41D显示了猕猴iPS细胞在NME7-AB培养基中的第16天衍生物的照片，用核多能基因转导该细胞，在这种情况下是Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，在相同的条件下，除了将猕猴成纤维细胞接种到MNC3抗MUC1*抗体表面上的一种情况，以及接种到小鼠胚胎饲养细胞MEF上的另一种情况。清楚地观察到，当在没有小鼠饲养细胞的情况下铺板时，非人灵长类动物的iPS衍生物效率更高。图41A和41B为接种在MNC3抗体表面上，图41C和41D为接种在小鼠饲养细胞上。
[0059] 图42A-42B显示了通过在NME7培养基(在这种情况下为NME7-AB)中在MEF表面上培养已经重编程为诱导的多能干(iPS)细胞的来自恒河猴成纤维细胞的第14天照片，并且通过用核多能基因转导该细胞，在这种情况下是Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。图42A是在10倍放大率下拍摄的，以及图42B是在20倍放大率下拍摄的。
[0060] 图43A-43E显示了在抗MUC1*抗体表面NME7-AB诱导的来自恒河猴的多能干细胞的照片，在这种情况下MN-C3为第三天、第一代。图43A是在4倍放大率下拍摄的，图43B是在10倍放大率下拍摄的，图43C是在20倍放大率下拍摄的，以及图43D和43E是在40倍放大率下拍摄的。
[0061] 图44A-44F显示了在抗MUC1*抗体表面NME7-AB诱导的来自恒河猴的若干代多能干细胞的照片，在这种情况下MN-C3为第一天、第二代。干细胞集落是存在的，清晰可见。图44A和44D是在10倍放大率下拍摄的，图44B和44E是在20倍放大率下拍摄的，以及图44C和44F是在40倍放大率下拍摄的。
[0062] 图45A-45H显示了在小鼠饲养细胞表面NME7-AB诱导的来自恒河猴的若干代多能干细胞的照片，MEF，第二代的第二天。图45A和45E是在4倍放大率下拍摄的，图45B和45F是在10倍放大率下拍摄的，图45C和45G是在20倍放大率下拍摄的，以及图45D和45H是在40倍放大率下拍摄的。
[0063] 图46A-46H显示了在小鼠饲养细胞表面NME7-AB诱导的来自恒河猴的若干代多能干细胞的照片，MEF，在第二代的第三天。图46A和46E是在4倍放大率下拍摄的，图46B和46F是在10倍放大率下拍摄的，图46C和46G是在20倍放大率下拍摄的，以及图46D和46H是在40倍放大率下拍摄的。
[0064] 图47A-47G显示了在小鼠饲养细胞表面NME7-AB诱导的来自恒河猴的若干代多能干细胞的照片，MEF，在第三代的第一天和第二天。图47A、47B、47C和47D是在第三代的第一天拍摄的，图47E、47F和47G是在第三代的第二天拍摄的，图47A和47E是在4倍放大率下拍摄的，图47B和47F是在10倍放大率下拍摄的，图47C和47G是在20倍放大率下拍摄的，以及图47D是在40倍放大率下拍摄的。
[0065] 图48A-48D显示了在小鼠饲养细胞表面NME7-AB诱导的来自恒河猴的若干代多能干细胞的照片，MEF，在第三天，第四代。图48A是在4倍放大率下拍摄的，图48B和48C是在10倍放大率下拍摄的，以及图48D是在20倍放大率下拍摄的。
具体实施方式
[0066] 定义
[0067] 如本文所使用的，“MUC1*”胞外结构域主要由PSMGFR序列(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：6))限定。因为MUC1切割的准确位点取决于切割它的酶，根据细胞种类、组织种类或细胞演变的时间，裂解酶可以有多种，MUC1*胞外结构域的准确序列在N末端可以有多种。
[0068] 如本文所使用的，术语“PSMGFR”是如GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：6)所述的MUC1生长因子受体的原始序列的首字母缩略词。在这点上，“N-10 PSMGFR”、“N-15 PSMGFR”或“N-20 PSMGFR”中的“N-数字”是指在PSMGFR的N末端删去的氨基酸残基的数目。类似地，“C-10 PSMGFR”、“C-15 PSMGFR”或“C-20 PSMGFR”中的“C-数字”是指在PSMGFR的C末端删去的氨基酸残基的数目。
[0069] 如本文所使用的，“MUC1*的胞外结构域”是指，缺乏串联重复结构域的MUC1蛋白的胞外部分。在大多数情况下，MUC1*是切割产物，其中MUC1*蛋白由缺乏串联重复的短胞外结构域、跨膜结构域和胞质尾区组成。MUC1的切割的精确位置是未知的，可能因为其看起来能够被多于一个的酶切割。MUC1*的胞外结构域将包括大部分的PSMGFR序列，但可以具有额外的10-20个N末端氨基酸。
[0070] 如本文所使用的，“NME家族蛋白”或“NME家族成员蛋白”，编号1-10，是集合到一起的蛋白，因为他们都具有至少一个NDPK(核苷酸二磷酸激酶)结构域。在一些情况下，NDPK结构域在能够催化ATP转化为ADP方面是非功能性的。NME蛋白正式地称为NM23蛋白，编号为H1、H2等。本文中，术语NM23和NME可以互换。本文中，术语NME1、NME2、NME6和NME7用来指代天然蛋白以及NME变体。在一些情况下，这些变体是更可溶的，在E.coli中表达得更好或者比天然序列蛋白更加可溶。例如，NME7用在说明书中可以意味着天然蛋白或变体，诸如具有高级商业适用性的NME7-AB，因为变体允许可溶的、正确折叠的蛋白在E.coli中的高收率的表达。在本文中提及的“NME1”能够与“NM23-H1”互换。其也旨在本发明并不受到NME的准确序列的限制。突变体NME1-S120G，也称为NM23-S120G，在本申请的全部内容中可以互换使用。优选S120G突变体和P96S突变体，因为它们优选用于二聚物形成，但在本文中可以称为NM23二聚物或NME1二聚物。
[0071] 在2012年5月8日递交的，题目为“Genetically Engineered Growth Factor Variants”的PCT/US2012/036975中公开了多种人工创造的NME1二聚物，关于其公开的二聚物生长因子的内容通过引用并入本文。
[0072] 如本文所提及的NME7旨在意味着具有约42kDa的分子量的天然NME7，具有25和33kDa之间的分子量的切割形式，没有DM10前导序列的变体，NME7-AB或重组NME7蛋白，或其序列的变体可以改变以允许有效表达或增加产量、溶解性或使NME7更有效或商业上更可行的其它特征。
[0073] 如本文所使用的，也称为“NM23-H1二聚物”的“NME1二聚物”可以是两个彼此非共价结合的NME1蛋白，两个彼此共价连接的NME1蛋白或两个基因上融合在一起的NME1蛋白，包括通过链(linker)。NME1二聚物可以通过制造由两种NME1蛋白组成的DNA构建体进行基因工程改造，其可以通过柔性链分离。两个NME蛋白不一定是完整的蛋白或天然序列。例如，可以使用促进二聚物形成和稳定性的C端缺失。可以使用促进二聚物形成和稳定性的诸如S120和/或P96S的突变体。其他NME家族成员二聚物，例如NME2或NME6二聚物，类似地是两个彼此非共价结合的NME蛋白，两个彼此共价连接的NME蛋白或两个基因上融合在一起的NME蛋白，包括通过链。
[0074] 如本文所使用的，“维持干细胞处于幼稚状态或将已启动的干细胞恢复到幼稚状态的试剂”是指蛋白、小分子或核酸，其单独和组合维持干细胞处于幼稚状态，类似胚胎的内细胞团的细胞。实例包括但不限于NME1二聚物、人或细菌、NME7、NME7-AB、2i、5i、诸如抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6表达的siRNA的核酸。
[0075] 如本文所使用的，关于称为“小分子”的试剂，其可以是分子量在50Da与2000Da之间，更优选在150Da与1000Da之间，进一步优选在200Da和750Da之间的合成化学品或基于化学的分子。
[0076] 如本文所使用的，关于称为“天然产物”的试剂，其可以是化学分子或生物分子，只要该分子存在于自然界中。
[0077] 如本文所使用的，“2i抑制剂”是指MAP激酶信号传导途径的GSK3-β和MEK的小分子抑制剂。名称2i是在研究论文(Silva J et al 2008)中创造的，然而本文中“2i”是指GSK3-β或MEK的任何抑制剂，因为存在许多小分子或生物制剂，如果它们抑制这些靶点，对多能性或肿瘤发生具有相同的效果。
[0078] 如本文所使用的，FGF、FGF-2或bFGF是指成纤维细胞生长因子。
[0079] 如本文所使用的，“Rho相关激酶抑制剂”可以是小分子、肽或蛋白(Rath N,et al,2012)。Rho激酶抑制剂在这里和其他地方缩写为ROCi或ROCKi或Ri。特定的rho激酶抑制剂的使用意味着是示例性的，并且可以被任何其他rho激酶抑制剂代替。
[0080] 如本文所使用的，术语“干细胞样”是指其中细胞获得干细胞或祖细胞特征的状态，共享干细胞祖细胞的基因表达谱的重要元件。干细胞样细胞可以是经历诱导至较不成熟状态的体细胞，例如增加多能基因的表达。干细胞样细胞也指已经经历一些去分化或处于亚稳态的细胞，它们从其可以改变终末分化。
[0082] 关于除a、g、c、t之外的核苷酸符号的使用，它们遵循在WIPO标准ST.25附录2表1中给出的惯例，其中k代表t或g；n代表a、c、t或g，m代表a或c，r代表a或g，s表示c或g，w代表a或t，y代表c或t。
[0083]描述了全长人MUC1受体(黏蛋白1前体，GenBank登录号：P15941)。
[0084] MTPGTQSPFFLLLLLTVLT(SEQ ID NO：2)
[0085] MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTA(SEQ ID NO：3)
[0086] MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTG(SEQ ID NO：4)
[0087] SEQ ID NO：2、3和4描述了用于将MUC1受体和截短的同种型引导至细胞膜表面的N末端MUC-1信号序列。如SEQ ID NO：2、3和4中的变体所示，在C-末端可以缺失多达3个氨基酸残基。
[0088]GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO：5)描述了截短的MUC1受体同种型，在其N末端具有nat-PSMGFR，并包括人全长MUC1受体的跨膜和胞质序列。
[0089] GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：6)描述了人MUC1生长因子受体(nat-PSMGFR：“PSMGFR”的一个实例)的天然原始序列的胞外结构域：
[0090] TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：7)描述了人MUC1生长因子受体(nat-PSMGFR：“PSMGFR”的一个实例)的天然原始序列的胞外结构域，在SEQ ID NO：6的N末端具有单个氨基酸缺失)。
[0091] GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：8)描述了MUC1生长因子受体(var-PSMGFR：“PSMGFR”的一个实例)的天然原始序列的“SPY”功能变体的胞外结构域，具有增强的稳定性。
[0092] TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：9)描述了MUC1生长因子受体(var-PSMGFR：“PSMGFR”的一个实例)的天然原始序列的“SPY”功能变体的胞外结构域，具有增强的稳定性，在SEQ ID NO：8的C末端具有单个氨基酸缺失。
[0093]tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg(SEQ ID NO：10)描述了人MUC1胞质结构域核苷酸序列。
[0094]CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO：11)描述了人MUC1胞质结构域氨基酸序列。
[0095]gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttcttgatgtactttatgtatagaaaataa(SEQ ID NO：12)描述了人NME7核苷酸序列(NME7：GENBANK登录号AB209049)。
[0096]DPETMNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGMLNTLYSVHFVNRRAMFIFLMYFMYRK(SEQ ID NO：13)描述了人NME7氨基酸序列(NME7：GENBANK登录号AB209049)。
[0097]atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQ ID NO：14)描述了人NM23-H1，也已知为NME1核苷酸序列(NM23-H1：GENBANK登录号AF487339)。
[0098]MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE(SEQ ID NO：15)NM23-H1描述了氨基酸序列(NM23-H1也已知为NME1：GENBANK登录号AF487339)。
[0099]atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQ ID NO：16)描述了人NM23-H1S120G变体核苷酸序列(NM23-H1：GENBANK登录号AF487339)[0100]
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE(SEQ ID NO：17)描述了NM23-H1S120G变体氨基酸序列(NM23-H1：GENBANK登录号AF487339)。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE(SEQ ID NO：17)描述了NM23-H1S120G变体氨基酸序列(NM23-H1：GENBANK登录号AF487339)。
[0101]atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa(SEQ ID NO：18)描述了人NM23-H2核苷酸序列(NM23-H2：GENBANK登录号AK313448)。
[0102]MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDWVYE(SEQ ID NO：19)描述了NM23-H2氨基酸序列(NM23-H2：GENBANK登录号AK313448)。
[0103] 优化用于E.coli表达的人NM23-H7-2同种型b序列：
[0104] (DNA)
[0105]atgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQ ID NO：20)
[0106] (氨基酸)
[0107]MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ ID NO：21)
[0108] 人NME7-A：
[0109] (DNA)
[0110]atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(SEQ ID NO：22)
[0111] (氨基酸)
[0112]MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQ ID NO：23)[0113] 人NME7-A1：
[0114] (DNA)
[0115]atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga(SEQID NO：24)[0116] (氨基酸)
[0117]MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQ ID NO：25)
[0118] 人NME7-A2：
[0119] (DNA)
[0120]atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(SEQ ID NO：26)
[0121] (氨基酸)
[0122]MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQ ID NO：27)
[0123] 人NME7-A3：
[0124] (DNA)
[0125]atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga(SEQ ID NO：28)
[0126] (氨基酸)
[0127]MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQ ID NO：29)
[0128] 人NME7-B：
[0129] (DNA)
[0130]atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(SEQ ID NO：30)
[0131] (氨基酸)
[0132]MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQ ID NO：31)[0133] 人NME7-B1：
[0134] (DNA)
[0135]atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(SEQ ID NO：32)
[0136] (氨基酸)
[0137]MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN—(SEQ ID NO：
33)
33)
[0138] 人NME7-B2：
[0139] (DNA)
[0140]atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(SEQ ID NO：34)
[0141] (氨基酸)
[0142]MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQ ID NO：35)
[0143] 人NME7-B3：
[0144] (DNA)
[0145]atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(SEQ ID NO：36)
[0146] (氨基酸)
[0147]MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN--(SEQ ID NO：37)
[0148] 人NME7-AB：
[0149] (DNA)
[0150]atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(SEQ ID NO：38)
[0151] (氨基酸)
[0152]MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN--(SEQ ID NO：39)[0153] 人NME7-AB1：
[0154] (DNA)
[0155]atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(SEQ ID NO：40)
[0156] (氨基酸)
[0157] MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF
[0158] -(SEQ ID NO：41)
[0159] 优化用于E.coli表达的人NME7-A序列：
[0160] (DNA)
[0161]atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga(SEQ ID NO：42)
[0162] (氨基酸)
[0163]MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQ ID NO：43)[0164] 优化用于E.coli表达的人NME7-A1序列：
[0165] (DNA)
[0166]atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga(SEQ ID NO：44)[0167] (氨基酸)
[0168]MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQ ID NO：45)
[0169] 优化用于E.coli表达的人NME7-A2序列：
[0170] (DNA)
[0171]atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga(SEQ ID NO：46)
[0172] (氨基酸)
[0173]MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQ ID NO：47)
[0174] 优化用于E.coli表达的人NME7-A3序列：
[0175] (DNA)
[0176]atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga(SEQ ID NO：48)
[0177] (氨基酸)
[0178]MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQ ID NO：49)
[0179] 优化用于E.coli表达的人NME7-B序列：
[0180] (DNA)
[0181]atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(SEQ ID NO：50)
[0182] (氨基酸)
[0183]MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQ ID NO：51)[0184] 优化用于E.coli表达的人NME7-B1序列：
[0185] (DNA)
[0186]atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQ ID NO：52)
[0187] (氨基酸)
[0188]MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ ID NO：
53)
53)
[0189] 优化用于E.coli表达的人NME7-B2序列：
[0190] (DNA)
[0191]atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(SEQ ID NO：54)
[0192] (氨基酸)
[0193]MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQ ID NO：55)
[0194] 优化用于E.coli表达的人NME7-B3序列：
[0195] (DNA)
[0196]atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQ ID NO：56)
[0197] (氨基酸)
[0198]MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ ID NO：57)
[0199] 优化用于E.coli表达的人NME7-AB序列：
[0200] (DNA)
[0201]atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQ ID NO：58)
[0202] (氨基酸)
[0203]MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ ID NO：59)[0204] 优化用于E.coli表达的人NME7-AB1序列：
[0205] (DNA)
[0206]Atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(SEQ ID NO：60)
[0207] (氨基酸)
[0208] MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF
[0209] -(SEQ ID NO：61)
[0210] 小鼠NME6
[0211] (DNA)
[0212]Atgacctccatcttgcgaagtccccaagctcttcagctcacactagccctgatcaagcctgatgcagttgcccacccactgatcctggaggctgttcatcagcagattctgagcaacaagttcctcattgtacgaacgagggaactgcagtggaagctggaggactgccggaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagcggctggtggagttcatgacaagtgggccaatccgagcctatatccttgcccacaaagatgccatccaactttggaggacactgatgggacccaccagagtatttcgagcacgctatatagccccagattcaattcgtggaagtttgggcctcactgacacccgaaatactacccatggctcagactccgtggtttccgccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaggaaccccagctgcggtgtggtcctgtgcactacagtccagaggaaggtatccactgtgcagctgaaacaggaggccacaaacaacctaacaaaacctag(SEQ ID NO：62)
[0213] (氨基酸)
[0214]MTSILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRTRELQWKLEDCRRFYREHEGRFFYQRLVEFMTSGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARYIAPDSIRGSLGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVHYSPEEGIHCAAETGGHKQPNKT-(SEQ ID NO：63)
[0215] 人NME6：
[0216] (DNA)
[0217]Atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga(SEQ ID NO：64)
[0218] (氨基酸)
[0219]MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQ ID NO：65)
[0220] 人NME6 1：
[0221] (DNA)
[0222]Atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga(SEQ ID NO：66)[0223] (氨基酸)
[0224]MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQ ID NO：67)
[0225] 人NME6 2：
[0226] (DNA)
[0227]Atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga(SEQ ID NO：68)
[0228] (氨基酸)
[0229]MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQ ID NO：69)
[0230] 人NME6 3：
[0231] (DNA)
[0232]Atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga(SEQ ID NO：
70)
70)
[0233] (氨基酸)
[0234]MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQ ID NO：71)
[0235] 优化用于E.coli表达的人NME6序列：
[0236] (DNA)
[0237]Atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga(SEQ ID NO：72)
[0238] (氨基酸)
[0239]MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQ ID NO：73)
[0240] 优化用于E.coli表达的人NME6 1序列：
[0241] (DNA)
[0242]Atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga(SEQ ID NO：74)[0243] (氨基酸)
[0244]MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQ ID NO：75)
[0245] 优化用于E.coli表达的人NME6 2序列：
[0246] (DNA)
[0247]Atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga(SEQ ID NO：76)
[0248] (氨基酸)
[0249]MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQ ID NO：77)
[0250] 优化用于E.coli表达的人NME6 3序列：
[0251] (DNA)
[0252]Atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga(SEQ ID NO：
78)
78)
[0253] (氨基酸)
[0254]MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQ ID NO：79)
[0255] 组氨酸标记
[0256] (ctcgag)caccaccaccaccaccactga(SEQ ID NO：80)
[0257] Strept II标记
[0258] (accggt)tggagccatcctcagttcgaaaagtaatga(SEQ ID NO：81)
[0259] PSMGFR N-10肽：
[0260] QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：82)
[0261] PSMGFR C-10肽：
[0262] GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(SEQ ID NO：83)
[0263] 人NME7
[0264] 核苷酸二磷酸激酶7同种型a[智人](Hu_7)
[0265]MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO：84)
[0266] 由SEQ ID NO：84表示的人NME7同种型a与由SEQ ID NO：21表示的人NME7同种型b在376个氨基酸的重叠区上具有90.4％的序列同一性。
[0267] 人NME7-X1
[0268] (DNA)
[0269]atgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattag(SEQ ID NO：
85)
85)
[0270] (氨基酸)
[0271]MMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN*(SEQ ID NO：86)
[0272] 小鼠MUC1和NME7
[0273] 小鼠MUC1*胞外结构域PSMGFR与人类在45个氨基酸的重叠区上为51.1％相同[0274] GTFSASDVKSQLIQHKKEA-DDYNLTISEVKVNEMQFPPSAQSRP(SEQ ID NO：87)
[0275] 小鼠同种型1NME7与人类NME7同种型a在395个氨基酸的重叠区上为84.3％相同[0276] 核苷酸二磷酸激酶7(小鼠NME7)同种型1小家鼠(Mo_7)
[0277]MRACQQGRSSSLVSPYMAPKNQSERFAFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPTDGSVEMHDVKNRRTFLKRTKYEDLRLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAVSKAGEIIEMINKSGFTITKLRMMTLTRKEAADFHVDHHSRPFYNELIQFITSGPVIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGLSRTDAPGSIRALFGTDGVRNAAHGPDTFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIIKPHAISEGMLGKILIAIRDACFGMSAIQMFNLDRANVEEFYEVYKGVVSEYNDMVTELCSGPCVAIEIQQSNPTKTFREFCGPADPEIARHLRPETLRAIFGKTKVQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO：88)
[0278] 小鼠同种型2NME7与人类NME7同种型a在253个氨基酸的重叠区上为88.4％相同[0279] 核苷酸二磷酸激酶7同种型2[小家鼠](Mo2-7)
[0280]MRACQQGRSSSLVSPYMAPKNQSERFAFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPTDGSVEMHDVKNRRTFLKRTKYEDLRLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAVSKAGEIIEMINKSGFTITKLRMMTLTRKEAADFHVDHHSRPFYNELIQFITSGPVIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGLSRTDAPGSIRALFGTDGVRNAAHGPDTFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIIKPHAISEDLFIHYM(SEQ IDNO：89)
[0281] 野猪MUC1和NME7
[0282]MTRDIQAPFFFGLLLLPVLTGEGNKQTNKNLALSLSSQFLQVYKEDGLLGLFYIKFRPGSVLVELILAFQDSAAAHNLKTQFDRLKAEAGTYNLTISEVSVIDAPFPSSAQPGSGVPGWGIALLVLVCILVALAIIYVIALAVCQCRRKNCGQLDIFPTRDAYHPMSEYPTYHTHGRYVPPGSTKRNPYEQVSAGNGGGSLSYSNLAATSANL(SEQ ID NO：90)[0283] 猪MUC1*PSMGFR与人类在46个氨基酸的重叠区上为52.2％相同
QDSAAAHNLKTQFDRLKAEAGTYNLTISEVSVIDAPFPSSAQPGS(SEQ ID NO：91)
QDSAAAHNLKTQFDRLKAEAGTYNLTISEVSVIDAPFPSSAQPGS(SEQ ID NO：91)
[0284] 猪NME7与人类NME7同种型a在453个氨基酸的重叠区上为65.6％相同
[0285] 预计：核苷酸二磷酸激酶7[野猪，猪](Pi_7)
[0286]MNHSERFVFIAEWYDPNASLFRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYEDLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSKKEKTLALIKPDAVSKAGEIIEIINKAGFTLTKLKMMTLSRKEATDFHIDHQSRPFLNELIQFITSGPIIAMEILRDDAICEWKKLLGPANSGLARTDAPGSIRAVFGTDGIRNAAHGPDSLSCAAREMELFFPSSGVCGPANTAKFTNCTTCCIVKPHAISEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVSEYNEMVTEMYFSAPSSSAIWRSPTVLNSLQSDISSRDFSSGPRSIPRSNFYWLTNHLLEMLSLLLLGVHKGVPKEVFVGEAHVSPGCAPVLVGGTLSRVKDRKKENHFSLVFVMLSSVSLPASSRYVKAAKGPQLIKGFSRGRGLLLALNTGCGNCFWL(SEQ ID NO：92)
[0287] 绵羊MUC1和NME7
[0288]MTPDIQAPFLSLLLLFQVLTVANVTMLTASVSTSPNSTVQVSSTQSSPTSSPTKETSWSTTTTLLRTSSPAPTPTTSPGRDGASSPTSSAAPSPAASSSHDGALSLTGSPAPSPTASPGHGGTLTTTSSPAPSPTASPGHDGASTPTSSPAPSPAASPGHDGALSLTGSPAPSPTASPGHGGTLTTTSSPAPSPTASPGHDGASTPTSSPAPSPAASSSHDGALSLTGSPAPSPPASPGHGGTLTTTSSPAPSPTASPGHGGTLTTTSSPAPSPTASPGHDGASTPTSSPAPTAHSSHDGALTTTGSPAPSPAASPGHDSVPPRATSPAPSPAASPGQHAASSPTSSDISSVTTSSMSSSMVTSAHKGTSSRATTTPVSKGTPSSVPSSETAPTAASHSTRTAAASTSPSTALSTASHPKTSQQLSVQVSLFFLSFRITNLQFNSSLENPQTSYYQELQRSILDVILQTYKQRDFLGLSEIKFRPGSVLVDLTLAFREGTTAELVKAQFSQLEAHAANYSLTISGVSVRDAQFPSSAPSASGVPGWGIALLVLVCVLVALAIIYLIALVVCQCGRKKCEQLDIFPTLGAYHPMSEYSAYHTHGRFVPPGSTKRSPYEEVSAGNGGSNLSYTNLAATSANL(SEQ ID NO：93)
[0289] 绵羊MUC1*胞外结构域PSMGFR与人类为46.8％相同
[0290] REGTTAELVKAQFSQLEAHAANYSLTISGVSVRDAQFPSSAPSAS(SEQ ID NO：94)
[0291] 绵羊NME7与人类NME7同种型a在395个氨基酸的重叠区上为88.4％相同
[0292] 预计：核苷酸二磷酸激酶7同种型X1[绵羊(Ovis aries)，绵羊(Sheep)](Sh_7)[0293]MNPTFVLLSLERNVTESLGNHSERFVFIAEWFDPNASLFRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYEDLHLEDLFIGNKVNIFSRQLVLLDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAVSKAGEIIEIINKAGFTLTKLKMMTLSRKEATDFHIDHQSRPFLNELIQFITSGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGLARTDAPESIRALFGTDGIKNAAHGPDSFACAAREMELFFPSSGVCGPANTAKFTNCTTCCIVKPHAVSEGLLGKILITIRDAGFEISAMQMFNMDRINVEEFYEVYKGVVSEYNEMVTEMYSGPCVAMEIQQTNPTMTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO：95)
[0294] 食蟹猴MUC1和NME7
[0295] 食蟹猴MUC1*胞外结构域PSMGFR与人类为88.9％相同
[0296] GTTNVHDVETQFNQRKTEAASRYNLTISDISVRDVPFPFSAQTGA(SEQ ID NO：96)
[0297] 食蟹猴NME7与人NME7同种型a在251个氨基酸的重叠区上为98％相同
[0298] 未命名的蛋白产物[食蟹猴](Ma_7)(序列不完全，仅NME7A)
[0299]MSHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDSLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITSGPVIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASGSIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEVRRNP(SEQ ID NO：97)
[0300] 恒河猴MUC1和NME7
[0301] 恒河猴MUC1*PSMGFR
[0302] 恒河猴MUC1*胞外结构域PSMGFR与人类为88.9％相同
[0303] GTTNVHDVETQFNQRKTEAASRYNLTISDISVRDVPFPFSAQTGA(SEQ ID NO：98)
[0304] 恒河猴NME7与人类NME7同种型a在376个氨基酸的重叠区上为98.4％相同
[0305] 猕猴(恒河猴)(Mm_7)
[0306]MSHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDSLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITSGPVIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASGSIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPVDPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO：99)
[0307] 倭黑猩猩MUC1和NME7
[0308] 倭黑猩猩MUC1
[0309] MTPGVQSPFFLLLLLTVLTATTAPKPATVVTGSGHASSAPGGEKETSATQR
[0310]SSVPSSTEKNAVSMTSSVLSSHSPGSGSSTTQGQDVTLAPATEPASGSAATWGQDVTSVPVTRPALGSTTPPAHDVTSALDNKPAPGSTAPPAHDVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPALGSTAPPVHNVTSASGSASGSASTLVHNGTSARATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHSTKTDASSTHHSTVPPLTSSNHSTSPQLSTGVSFFFLSFHISNLRFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL(SEQ ID NO：100)
[0311] 倭黑猩猩MUC1*胞外结构域PSMGFR与人类为100％相同。
[0312] GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：101)
[0313] 倭黑猩猩NME7与人类NME7同种型a在376个氨基酸的重叠区上为100％相同
[0314] 倭黑猩猩预计：核苷酸二磷酸激酶7[倭黑猩猩，倭黑猩猩](Bo_7)
[0315]MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO：102)
[0316] 黑猩猩MUC1和NME7
[0317] 黑猩猩MUC1
[0318] MTPGIQSPFFLLLLLTVLTVVTGSGHASSAPGGEKETSATQRSSVPSSTEKN
[0319]AVSMTSSVLSSHSPGSGSSTTQGQDVTLAPATEPASGSAATWGQDVTSVPVTRPALGSTTPPAHDVTSAPDNKPAPGSTAPPAHDVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPALGSTAPPVHNVTSASGSASGSASTLVHNGTSARATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHSTKTDASSTHHSTVPPLTSSNHSTSPQLSTGVSFFFLSFHISNLRFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL(SEQ ID NO：103)
[0320] 黑猩猩MUC1*胞外结构域PSMGFR与人类为100％相同。
[0321] GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：104)
[0322] 黑猩猩NME7与人类NME7同种型a在376个氨基酸的重叠区上为99.7％相同
[0323] 核苷酸二磷酸激酶7[黑猩猩(Pan troglodytes)，黑猩猩(Chimp)](CH_7)
[0324]MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHNMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO：105)
[0325] 大猩猩MUC1和NME7
[0326] 大猩猩MUC1
[0327]MTPGTQSPFFLLLLLTVLTATTAPKPTTVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVPSSTEKNAVSMTSSILSSHSPGSGSSTTQGQDVTPAPATEPASGSAATWGQDVTSVPVTRPALGSTTPPAHDVTSAPDNKPAPGSTTPPAHGVSSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHVHNVTSASGSASGSASTLVHNGTSARATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLANHSTKTDASSTHHSTVPPLTSSNHSTSPQLSTGVSFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVVLAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPVRDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL(SEQ ID NO：106)
[0328] 大猩猩MUC1*PSMGFR与人类为100％相同
[0329] GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO：107)
[0330] 大猩猩NME7与人类NME7同种型a在376个氨基酸的重叠区上为78.2％相同
[0331] NME7[ENSGGOP00000002464]，大猩猩(Go_7)
[0332]MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAARLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADP(SEQ ID NO：
108)
108)
[0333] 小鼠
[0334] 核苷酸二磷酸激酶7[小家鼠](Mo_7)
[0335]MKTNQSERFAFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPTDGSVEMHDVKNRRTFLKRTKYEDLRLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAVSKAGEIIEMINKSGFTITKLRMMTLTRKEAADFHVDHHSRPFYNELIQFITSGPVIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGLSRTDAPGSIRALFGTDGVRNAAHSPDTFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIIKPHAISEGMLGKILIAIRDACFGMSAIQMFNLDRANVEEFYEVYKGVVSEYNDMVTELCSGPCVAIEIQQSNPTKTFREFCGPADPEIARHLRPETLRAIFGKTKVQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO：109)
[0336] 小鼠NME7与人NME7同种型a在378个氨基酸的重叠区上为87.8％相同
[0337] 核苷酸二磷酸激酶7同种型X1[小家鼠](MoX1-7)
[0338]MHDVKNRRTFLKRTKYEDLRLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAVSKAGEIIEMINKSGFTITKLRMMTLTRKEAADFHVDHHSRPFYNELIQFITSGPVIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGLSRTDAPGSIRALFGTDGVRNAAHGPDTFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIIKPHAISEGMLGKILIAIRDACFGMSAIQMFNLDRANVEEFYEVYKGVVSEYNDMVTELCSGPCVAIEIQQSNPTKTFREFCGPADPEIARHLRPETLRAIFGKTKVQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO：110)
[0339] 小鼠NME7与人NME7同种型a在376个氨基酸的重叠区上为79.8％相同
[0340] 食蟹猴
[0341] 未命名的蛋白产物[猕猴](Ma_7)(序列不完全，仅NME7A)
[0342]MSHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDSLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITSGPVIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASGSIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEVRRNP(SEQ ID NO：111)
[0343] 猕猴NME7与人NME7同种型a在251个氨基酸的重叠区上为98.0％相同
[0344] 猕猴(恒河猴)(Mm_7)
[0345]MSHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDSLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITSGPVIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASGSIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPVDPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO：112)
[0346] 猕猴NME7与人NME7同种型a在376个氨基酸的重叠区上为98.4％相同
[0347] 黑猩猩
[0348] 核苷酸二磷酸激酶7b[黑猩猩，黑猩猩](CHb_7)
[0349] MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTAR
[0350]QLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHSRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO：113)[0351] 黑猩猩NME7与人NME7同种型a在376个氨基酸的重叠区上为90.2％相同
[0352] 绵羊
[0353] 预计：核苷酸二磷酸激酶7同种型X2(Shx2_7)[绵羊(Ovis aries)，绵羊(Sheep)][0354]MNHSERFVFIAEWFDPNASLFRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYEDLHLEDLFIGNKVNIFSRQLVLLDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAVSKAGEIIEIINKAGFTLTKLKMMTLSRKEATDFHIDHQSRPFLNELIQFITSGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGLARTDAPESIRALFGTDGIKNAAHGPDSFACAAREMELFFPSSGVCGPANTAKFTNCTTCCIVKPHAVSEGLLGKILITIRDAGFEISAMQMFNMDRINVEEFYEVYKGVVSEYNEMVTEMYSGPCVAMEIQQTNPTMTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO：114)
[0355] 绵羊NME7与人类NME7同种型a在377个氨基酸的重叠区上为92.6％相同
[0356] 预计：核苷酸二磷酸激酶7同种型X3[绵羊(Ovis aries)，绵羊(Sheep)](Shx3_7)[0357]MHDVKNHRTFLKRTKYEDLHLEDLFIGNKVNIFSRQLVLLDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAVSKAGEIIEIINKAGFTLTKLKMMTLSRKEATDFHIDHQSRPFLNELIQFITSGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGLARTDAPESIRALFGTDGIKNAAHGPDSFACAAREMELFFPSSGVCGPANTAKFTNCTTCCIVKPHAVSEGLLGKILITIRDAGFEISAMQMFNMDRINVEEFYEVYKGVVSEYNEMVTEMYSGPCVAMEIQQTNPTMTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILD N(SEQ ID NO：115)
[0358] 绵羊NME7与人类NME7同种型a在377个氨基酸的重叠区上为83.6％相同
[0359] 小鼠
[0360] 小鼠MUC1
[0361]MTPGIRAPFFLLLLLASLKGFLALPSEENSVTSSQDTSSSLASTTTPVHSSNSDPATRPPGDSTSSPVQSSTSSPATRAPEDSTSTAVLSGTSSPATTAPVNSASSPVAHGDTSSPATSLSKDSNSSPVVHSGTSSAATTAPVDSTSSPVVHGGTSSPATSPPGDSTSSPDHSSTSSPATRAPEDSTSTAVLSGTSSPATTAPVDSTSSPVAHDDTSSPATSLSEDSASSPVAHGGTSSPATSPLRDSTSSPVHSSASIQNIKTTSDLASTPDHNGTSVTTTSSALGSATSPDHSGTSTTTNSSESVLATTPVYSSMPFSTTKVTSGSAIIPDHNGSSVLPTSSVLGSATSLVYNTSAIATTPVSNGTQPSVPSQYPVSPTMATTSSHSTIASSSYYSTVPFSTFSSNSSPQLSVGVSFFFLSFYIQNHPFNSSLEDPSSNYYQELKRNISGLFLQIFNGDFLGISSIKFRSGSVVVESTVVFREGTFSASDVKSQLIQHKKEADDYNLTISEVKVNEMQFPPSAQSRPGVPGWGIALLVLVCILVALAIVYFLALAVCQCRRKSYGQLDIFPTQDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPGSTKRSPYEEVSAGNGSSSLSYTNPAVVTTSANL(SEQ ID NO：116)
[0362] 猕猴(恒河猴)MUC1，部分的
[0363]VTGSGHTNSTPGGEKETSATQRSSMPISTKNAVSMTSRLSSHSPVSGSSTTQGQDVTLALATEPATGSATTLGHNVTSAPDTSAAPGSTGPPAGVVTSAPDTSAAPGSTGPPARVVTSAPDTSAAPGSTGPPARVVTSAPDTSAAPGSTGPPARVVTSAPDTSAAPGSTGPPARVVTSAPDTSAAPGSTGPPARVVTSAPDTSAAPGSTGPPARVVTSAPDTSAAPGSTGPPARVVTSAPDTSAAPGSTGPPARVVTSAPGTSAAPGSTAPPGSTAPPAHDVTSASDSASGSASTLVHSTTSARATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHSTKTDASSTHHSTVPPFTSNHSTSPQLSLGVSFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTNYYQQLQRDISELFLQIYKQGDFLGLSNIMFRPGSVVVQSTLVFREGTTNVHDVETQFNQRKTEAASRYNLTISDISVRDVPFPFSAQTGAGVPGWGIALLVLVCVLVVLAIVYFIALAVCQCRQKNYRQLDIFPARDAYHPMSEYPTYHTHGRYVPAGGTNRSPYE(SEQ ID NO：117)
[0364] 猕猴_MUC1(同种型X1)
[0365]MTPGTQSPFFLLLILTVLTAATVPEPTTVVTGSGHTNSTPGGEKETSATQRSSMPISTKNAVSMTSRLSSHSPVSGSSTTQGQDVTLALAMESATGSATTLGHVVTSAPDTSAAPGSTGPPAHVVTSAPDTSAAPGSTGPPAHVVTSAPDTSAAPGSTAPPAHVVTSAPDTSAAPGSTAPPAHDVTSASDSASGSASTLVHSTTSARATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHSTKTDASSTHHSTVPPFTSSNHSTSPQLSLGVSFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTNYYQQLQRDISELFLQIYKQGDFLGLSNIMFRPGSVVVQSTLVFREGTTNVHDVETQFNQRKTEAASRYNLTISDISVRDVPFPFSAQTGAGVPGWGIALLVLVCVLVVMAIVYFIALAVCQCRQKNYRQLDIFPARDAYHPMSEYPTYHTHGRYAPAGGTNRSPYEEVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL(SEQ ID NO：118)
[0366] 野猪MUC1，部分的
[0367]NSSLEDPTTSYYKDLQRRISELFLQVYKEDGLLGLFYIKFRPGSVLVELILAFQDSAAAHNLKTQFDRLKAEAGTYNLTISEVSVIDAPFPSSAQPGSGVPGWGIALLVLVCILVALAIIYVIALAVCQCRRKNCGQLDIFPTRDAYHPMSEYPTYHTHGRYVPPGSTKRNPYEQVSAGNGGGSLSYSNLAATSANL(SEQ ID NO：119)
[0368] 绵羊MUC1(绵羊(Sheep))
[0369]MTPDIQAPFLSLLLLFQVLTVANVTMLTASVSTSPNSTVQVSSTQSSPTSSPTKETSWSTTTTLLRTSSPAPTPTTSPGRDGASSPTSSAAPSPAASSSHDGALSLTGSPAPSPTASPGHGGTLTTTSSPAPSPTASPGHDGASTPTSSPAPSPAASPGHDGALSLTGSPAPSPTASPGHGGTLTTTSSPAPSPTASPGHDGASTPTSSPAPSPAASSSHDGALSLTGSPAPSPPASPGHGGTLTTTSSPAPSPTASPGHGGTLTTTSSPAPSPTASPGHDGASTPTSSPAPTAHSSHDGALTTTGSPAPSPAASPGHDSVPPRATSPAPSPAASPGQHAASSPTSSDISSVTTSSMSSSMVTSAHKGTSSRATTTPVSKGTPSSVPSSETAPTAASHSTRTAAASTSPSTALSTASHPKTSQQLSVQVSLFFLSFRITNLQFNSSLENPQTSYYQELQRSILDVILQTYKQRDFLGLSEIKFRPGSVLVDLTLAFREGTTAELVKAQFSQLEAHAANYSLTISGVSVRDAQFPSSAPSASGVPGWGIALLVLVCVLVALAIIYLIALVVCQCGRKKCEQLDIFPTLGAYHPMSEYSAYHTHGRFVPPGSTKRSPYEEVSAGNGGSNLSYTNLAATSANL(SEQ ID NO：120)
[0370] I.在一个方面，本发明涉及在嵌合动物中测试潜在药剂的效力和毒性的方法，所述嵌合动物表达人类的一些DNA或组织。在该方法中，表达人类的一些DNA和组织的动物是通过将人类幼稚干细胞导入非人体细胞或细胞群中产生的。在一个方面，非人体细胞是卵细胞，在另一个方面其为受精卵，在另一个方面，所述细胞是桑椹胚、囊胚或胚胎。出于伦理的考虑或其他原因，有利的是产生嵌合动物，其中整合的幼稚状态干细胞也是非人类的，但是其为与受体细胞、细胞群、桑椹胚、囊胚或胚胎不同的物种。在以上方法中，维持干细胞处于幼稚状态或将已启动的干细胞恢复到幼稚状态的试剂可以是NME蛋白、2i、5i，或抑制剂、化学品的其他混合物，或核酸。NME蛋白可以是NME1二聚物、NME7单体、NME7-AB、NME7-X1、NME6二聚物、或细菌NME。
[0371] 非人类哺乳动物可以是诸如小鼠或大鼠的啮齿动物，包括猕猴、恒河、猿、黑猩猩、倭黑猩猩等的灵长类动物，或包括猪、绵羊、牛等的家畜。嵌合动物可以具有基因缺陷、具有诱发的疾病，或者同时产生或从源自人类的细胞植入的癌症。
[0372] 在以上方法中，非人类动物可以是转基因的，其中该动物在生殖细胞或体细胞中表达人MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖细胞或体细胞包含引入所述动物的重组人MUC1或MUC1*或NME基因序列。表达人MUC1或MUC1*或NME蛋白的基因可以处于诱导型启动子的控制之下。启动子可以诱导性响应在非人类动物中自然发生的蛋白或者在发育发前、后或期中给予动物的试剂。或者，非人类动物可以是转基因的，其中该动物在生殖细胞或体细胞中表达其天然MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中生殖细胞或体细胞包含引入所述动物的重组天然种MUC1或MUC1*或NME基因序列。NME种类可以是NME7、NME7-X1、NME1、NME6、或细菌NME。
[0373] 在以上方法中，维持干细胞处于幼稚状态或将已启动的干细胞恢复到幼稚状态的试剂可以是NME蛋白、2i、5i，或抑制剂、化学品的其他混合物，或核酸。NME蛋白可以是NME1二聚物、NME7单体、NME7-AB、NME7-X1、NME6二聚物、或细菌NME。
[0374] 在该方法中，所述试剂可以抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6的表达。所述试剂可以是抗MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6的siRNA，或抗编码上调MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6表达的蛋白的任何基因的siRNA。癌干细胞可以以CXCR4或E-cadherin(CDH1)的表达相比较癌细胞或正常细胞的增加为特征。
[0375] 在另一个方面，本发明涉及一种用于在非人类哺乳动物中从异种移植物中产生组织的方法，包括：(i)产生转基因非人类哺乳动物，其中所述哺乳动物在生殖细胞和体细胞中表达人MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中所述生殖细胞和体细胞含有引入到所述哺乳动物中的重组人MUC1或MUC1*或NME基因序列，其中所述基因序列的表达可以处于诱导型和阻抑型调控序列的控制下；(ii)将异源起源的干细胞或祖细胞转移到非人类哺乳动物中，使得该基因可诱导表达以增加干细胞或祖细胞的数量；以及(iii)抑制基因表达以从异种移植的干细胞产生组织。
[0376] 在该方法中，在步骤(iii)中，基因表达抑制可以通过将干细胞与组织分化因子接触而实施，或者在步骤(iii)中，基因表达抑制可以在哺乳动物中自然地实施以响应自然产生的宿主组织分化因子。转移的细胞可以是人类的所述组织可以是器官。NME蛋白可以是NME7、NME7-AB、NME7-X1、NME1、NME6、或细菌NME。所述动物可以是哺乳动物、啮齿动物、灵长类动物或家养动物如猪、绵羊或牛物种。
[0377] II.在其他方面，本发明涉及制造具有至少一些人体细胞或细胞群的动物，其中DNA中的至少一些是人类来源的。这样的动物可以生长人体组织，包含一些人体细胞或细胞群的组织，所述细胞或细胞群包含一些人类DNA用于产生人体或类人体组织。在其他情况下，这样的动物生长包括至少一些人体细胞的器官。在其他情况下，这样的动物生长完全由人体细胞组成的器官。在另外的情况下，宿主动物甚至在开发生长人体四肢后能够在基因上或者分子上进行操纵。其中制得或选自其中的四肢、神经、血管、组织、器官或因素，将随后从动物中获得并用于多种目的，包括但不限于：1)移植于人体；2)给予人体用于医药效益，包括抗衰老；以及3)科学实验，包括药物试验和疾病建模。
[0378] 在一个方面，本发明涉及一种用于在非人类哺乳动物中产生人体组织的方法，包括：(i)产生人幼稚状态干细胞并将其注射到非人类动物的受精卵、桑椹胚、囊胚或胚胎中，以使得产生嵌合动物；(ii)收获由来自嵌合动物的人体组织或细胞中分泌或在其中制得的人体组织、器官、细胞或因子；以及(iii)将收获的材料移植到或给予人体。可以使用NME7、NME7-AB、NME7-X1或二聚NME1产生幼稚状态干细胞。幼稚干细胞可以是iPS细胞，其在含有NME7、NME7-AB、NME7-X1或二聚NME1的培养基中重编程。或者，幼稚干细胞可以是胚胎干细胞，其在含有NME7、NME7-AB、NME7-X1或二聚NME1的培养基中培养。可以将囊胚或胚胎的非人体细胞改变基因。以及基因改变可以导致宿主动物不能产生特定的组织或器官。基因改变可以使非人类动物表达人类分子，其在非人类宿主动物中促进或增强人类干细胞或祖细胞的掺入或生长。进一步地，维持干细胞处于幼稚状态或将已启动的干细胞恢复到幼稚状态的试剂可以是NME蛋白、2i、5i、化学品、或核酸。NME蛋白可以是NME1二聚物、NME7单体、NME7-AB、NME6二聚物、或细菌NME、或NME7-X1。非人类动物可以是啮齿动物、小鼠、大鼠、猪、绵羊、非人灵长类动物、猕猴、黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩或任何非人类哺乳动物。在本发明的一个方面，出于其与人类NME蛋白的高序列同源性特别是人NME7-AB或NME7-X1，或与人类MUC1*胞外结构域的高序列同源性而选择非人类动物。在一些情况下，NME蛋白可以存在于无血清的培养基中作为单个生长因子。
[0379] 能否产生嵌合动物的一个试验是如果来自第一物种的干细胞能够掺入第二物种的内细胞团(ICM)中。当两个不同的物种关系密切时，例如两个啮齿动物，更容易产生嵌合动物。我们将人幼稚状态干细胞注射到小鼠桑椹胚中，并显示了它们掺入到了内细胞团(ICM)中。在特定的实例中，将在人NME7-AB中产生随后在人体中培养的人幼稚状态干细胞注射到了小鼠的卵细胞受精后2.5天的桑椹胚中。这在内细胞团形成之前。四十八(48)小时后分析桑椹胚，这样的分析显示了人类干细胞已经掺入到了内细胞团中，指示嵌合动物将开始发育。
[0380] III.在一个方面，本发明涉及一种用于在非人类哺乳动物中产生人体组织或器官的方法，包括：(i)产生人幼稚状态干细胞并将其注射到非人类动物宿主的受精卵、桑椹胚、囊胚、胚胎或发育中的胎儿中，以使得产生嵌合动物；(ii)收获由来自嵌合动物的人体组织或细胞分泌或在其中制得的人体组织、器官、细胞或因子；(iii)将收获的材料移植到或给予人体以产生人体组织。可以使用NME7、NME7-AB、NME7-X1、NME6或二聚NME1产生幼稚状态干细胞。幼稚干细胞是iPS细胞，其在含有NME7、NME7-AB、NME6、NME7-X1或二聚NME1的培养基中重编程。幼稚干细胞是胚胎细胞，其在含有NME7、NME7-AB、NME6、NME7-X1或二聚NME1的培养基中培养。可以将囊胚或胚胎的非人体细胞改变基因。基因改变导致宿主动物不能产生特定的组织或器官。维持干细胞处于幼稚状态或将已启动的干细胞恢复到幼稚状态的试剂是NME蛋白、2i、5i、化学品、或核酸。NME蛋白是NME1二聚物、NME7单体、NME7-AB、NME6二聚物、或细菌NME。非人类动物是啮齿动物、猪牛、绵羊或灵长类动物。啮齿动物是小鼠或大鼠。NME蛋白作为单个生长因子存在于无血清的培养基中。非人类动物宿主表达NME蛋白，其具有与将产生的干细胞种类的天然序列同源的序列。NME蛋白是NME7、NME7-AB、NME7-X1、或二聚NME1或NME6。NME蛋白是NME7。NME蛋白与将产生的干细胞种类的天然NME蛋白序列至少
45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同源。NME蛋白与将产生的干细胞种类的天然序列至少60％同源。NME蛋白与将产生的干细胞种类的天然序列至少
70％同源。
45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同源。NME蛋白与将产生的干细胞种类的天然序列至少60％同源。NME蛋白与将产生的干细胞种类的天然序列至少
70％同源。
[0381] 本发明的其他方面涉及：具有与小鼠天然NME蛋白至少75％同源的序列的NME蛋白，具有与大鼠天然NME蛋白至少75％同源的序列的NME蛋白，具有与猪天然NME蛋白至少75％同源的序列的NME蛋白，具有与绵羊天然NME蛋白至少75％同源的序列的NME蛋白，具有与牛天然NME蛋白至少75％同源的序列的NME蛋白，具有与食蟹猴天然NME蛋白至少75％同源的序列的NME蛋白，具有与猕猴天然NME蛋白至少75％同源的序列的NME蛋白，具有与黑猩猩天然NME蛋白至少75％同源的序列的NME蛋白，具有与倭黑猩猩天然NME蛋白至少75％同源的序列的NME蛋白，具有与大猩猩天然NME蛋白至少75％同源的序列的NME蛋白，一抗体，其结合于包含MUC1*的胞外结构域的序列的肽，其中该序列是非人类的；一抗体，其结合于包含MUC1*的胞外结构域的序列的肽，其中该序列是灵长类动物的；一抗体，其结合于包含MUC1*的胞外结构域的序列的肽，其中该序列是猕猴、黑猩猩、猿、倭黑猩猩或大猩猩的；一抗体，其结合于包含MUC1*的胞外结构域的序列的肽，其中该序列是非灵长类动物的；一抗体，其结合于包含MUC1*的胞外结构域的序列的肽，其中该序列是啮齿动物的；一抗体，其结合于包含MUC1*的胞外结构域的序列的肽，其中该序列是小鼠或大鼠的；一抗体，其结合于包含MUC1*的胞外结构域的序列的肽，其中该序列是哺乳动物的；一抗体，其结合于包含MUC1*的胞外结构域的序列的肽，其中该序列是猪、牛或绵羊的。
[0382] 在另一方面，本发明涉及用于产生干细胞的方法，在体细胞或培养的干细胞中诱导多能性，包括将细胞与NME蛋白和/或抗MUC1*抗体相接触的步骤，其中NME蛋白与供体细胞的序列至少75％同源，抗MUC1*抗体结合于包含MUC1*胞外结构域的序列的肽，其中所述序列与所贡献细胞的物种的天然序列至少75％同源。
[0383] 在另一方面，本发明涉及一种治疗需要产生组织或器官的人的方法，包括实施上述步骤。
[0384] 在又一方面，本发明涉及产生第一非人类哺乳动物的方法，所述第一非人类哺乳动物包括特别是来源于第二哺乳动物的DNA、分子、细胞、组织或器官，所述第二哺乳动物与第一非人类哺乳动物属于或不属于相同的种或属，包括将来自第二哺乳动物的细胞引入第一非人类哺乳动物。来自第二哺乳动物的细胞为祖细胞、干细胞或幼稚状态干细胞。通过在含有NME的培养基中培养细胞来产生幼稚状态干细胞。NME是NME1、二聚NME6、NME7-X1或NME7-AB。NME具有对第二哺乳动物为内源性的序列。第二哺乳动物是人类。第一非人类哺乳动物是啮齿动物、家养哺乳动物、猪、牛或非人灵长类动物。将祖细胞、干细胞或幼稚状态干细胞引入第一非人类哺乳动物的受精卵、桑椹胚、囊胚、胚胎或发育中的胎儿。
[0385] 在上述方法中，进一步的步骤包括：允许第一非人类哺乳动物发育并从掺入了一些第二哺乳动物DNA的第一非人类哺乳动物的分子、细胞、组织或器官收获，并将该分子、细胞、组织或器官给予有需要的第二哺乳动物用于治疗或预防疾病或症状。祖细胞、干细胞或幼稚状态干细胞是iPS细胞。产生iPS细胞的体细胞来自所获得的用于治疗或预防疾病或症状而给予的分子、细胞、组织或器官的第二哺乳动物。
[0386] 在上述方法中，进一步的步骤包括：确定器官发育时间段和参与器官发育的内源基因；以及在第一非人类哺乳动物器官的发育时期期间敲除或敲减内源基因，其中所述器官由第二哺乳动物的细胞产生。
[0387] 在上述方法中，第一非人类哺乳动物接近第二哺乳动物，在整体序列上的同一性大于70％、75％、80％、85％、90％或95％，或者NME序列的同一性大于45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
[0388] 在上述方法中，进一步的步骤包括：确定器官发育时间段和参与器官发育的内源基因；以及基因上改变第一非人类哺乳动物的受精卵、桑椹胚细胞、囊胚细胞、或胚胎或发育中胎儿的细胞，使得第二哺乳动物NME7-AB或NME1由诱导型或可抑制型启动子表达，第二哺乳动物细胞响应于非哺乳动物NME7-AB或NME1而及时扩增。进一步的步骤包括在期望的器官或组织正常发育的位置在发育的后期将第二哺乳动物干细胞注射到胚胎中。进一步的步骤包括通过在该位置诱导第一非人类哺乳动物或第二哺乳动物NME7或NME1的表达来扩增哺乳动物干细胞。进一步的步骤包括通过在该位置诱导第一非人类哺乳动物或第二哺乳动物NME1的表达来扩增哺乳动物干细胞。第二哺乳动物启动子链接于内源性第一非人类哺乳动物蛋白并在期望的时间和位置表达，随后引入指导期望的组织发育的试剂。内源性第一非人类哺乳动物蛋白是诱导NME1或NME7，优选为NME1的表达的蛋白。
[0389] 在另一方面，本发明涉及在嵌合动物中测试潜在药剂的效力和毒性的方法，所述嵌合动物表达一些第二哺乳动物DNA或一些第二哺乳动物的组织，包括：(i)产生第一非人类哺乳动物，所述第一非人类哺乳动物包括特别是来源于第二哺乳动物的DNA、分子、细胞、组织或器官，所述第二哺乳动物与第一非人类哺乳动物属于或不属于相同的种或属，包括将来自第二哺乳动物的细胞引入第一非人类哺乳动物；以及(ii)将测试药物给予第一非人类哺乳动物，以期望得到对来源于第二哺乳动物的组织或器官的作用。NME在第一非人类哺乳动物中表达，其增强了来源于第二哺乳动物的细胞的增殖。
[0390] 在另一方面，本发明涉及在嵌合动物中发现潜在药剂的方法，所述嵌合动物表达一些第二哺乳动物DNA或一些第二哺乳动物的组织，包括：(i)产生第一非人类哺乳动物，所述第一非人类哺乳动物包括特别是来源于第二哺乳动物的DNA、分子、细胞、组织或器官，所述第二哺乳动物与第一非人类哺乳动物属于或不属于相同的种或属，包括将来自第二哺乳动物的细胞引入第一非人类哺乳动物；以及(ii)将化合物给予第一非人类哺乳动物，以期望得到对来源于第二哺乳动物的组织或器官的作用，其中有效作用表明潜在药物存在。NME在第一非人类哺乳动物中表达，其增强了来源于第二哺乳动物的细胞的增殖。
[0391] MUC1*/NME在干细胞中的增殖和引入
[0392] 我们发现人类干细胞过量表达其为有效的生长因子受体的MUC1*。MUC1*、NM23-H1的配体，也称为NME1，以二聚物的形式单独足以使人类干细胞在多能状态下生长，而无需饲养细胞、条件培养基、或任何其他的生长因子或细胞因子(Mahanta S et al 2008；Hikita S et al 2008)。我们之前显示了NME1二聚物是MUC1*生长因子受体的配体，其中MUC1*是在大部分胞外结构域被切割并从细胞表面脱落之后的剩余的跨膜部分。胞外结构域的剩余部分基本上由PSMGFR序列组成。NME1二聚物结合于并二聚MUC1*受体。使用合成的PSMGFR肽，NME-MUC1*相互作用的竞争性抑制诱导了多能干细胞的分化，这显示了多能干细胞生长是由NME1二聚物和MUC1*生长因子受体之间的相互作用介导的。人类干细胞分泌NME1，在二聚化后，它与MUC1*受体结合并刺激人类干细胞的生长和多能性。通过添加PSMGFR肽或通过添加抗MUC1*(抗PSMGFR)抗体的Fab，相互作用的竞争性抑制在体外诱导细胞死亡和分化(Hikita et al 2008)。
[0393] 我们发现NME家族的新生长因子NME7，其在缺乏FGF或任何其他生长因子的情况下使人类干细胞生长并抑制分化。我们制造了一个截短的重组人NME7，我们称其为NME7-AB或rhMNE7-AB。它缺乏N-末端DM10结构域，分子量约为33kDa。从干细胞分泌的自然发生的NME7切割产物似乎本质上与我们的重组NME7-AB相同。称为NME7-X1的NME7的选择性剪接变体被理论化。我们通过PCR显示了NME7-X1确实在自然界中存在并且同样由人类干细胞分泌并且为30kDa。我们也制造了人重组NME7-X1。另外，我们显示了与人NME1具有高度序列同源性的一些细菌NME1蛋白与人NME1起到同样作用。它们结合于并二聚MUC1*胞外结构域并且诱导多能性。我们显示支持人类干细胞生长并诱导多能性的一个这样的细菌NME1蛋白是盐单胞菌Sp.593，也已知为HSP593。成纤维细胞是体细胞，不是干细胞。但是，我们发现NME7-AB、NME7-X1、NME1二聚物和HSP593二聚物能够诱导体细胞以恢复到较不成熟的状态。图1显示了在NME7-AB、NME1二聚物或HSP593NME1二聚物中简单培养的人成纤维细胞引起干细胞标志物OCT4和NANOG的上调。图2显示了这些NME蛋白抑制MBD3和CHD4的表达；这些基因的抑制显示了使人类干细胞恢复到较幼稚的状态(Rais Y et al,2013)。BRD4已经显示了抑制NME7的表达以及它的辅助因子JMJD6上调NME1。图3的PCR图表显示了NME7-AB或NME1二聚物诱导多能性，通过上调多能基因和抑制据报道在幼稚状态干细胞中抑制的那些。图4A和4B显示了在NME1二聚物作为仅添加的生长因子中培养人类干细胞完全支持多能干细胞生长。图5A-5C显示了在NME7-AB单体作为仅添加的生长因子中培养人类干细胞完全支持多能干细胞生长。而NME1必须是二聚物，为了结合并二聚化MUC1*生长因子受体，单体的NME7-AB和NME7-X1具有两个对于MUC1*的结合位点。图6A和6B显示了在夹心ELISA检测中，NME7-AB能够同时结合于两个MUC1*胞外结构域的肽，在本文中也指PSMGFR肽(JHK SEQ ID？)。在幼稚状态干细胞中BRD4和辅助因子JMJD6受到抑制，这在图2和图7中有所显示。图8-11显示了NME1二聚物和NME7-AB诱导人成纤维细胞恢复到较不成熟、干细胞样状态，这可以通过它们形态的巨大变化看到，其与干细胞形态相似并且毫无疑问并不像在图12-13中所显示的成纤维细胞的形态。
[0394] 我们推理，在很早期的人类干细胞中分泌NME7-AB和NME7-X1，其允许它们结合于并二聚化MUC1*生长因子受体的胞外结构域。因此，NME7-AB稳定化第一幼稚状态。在较晚阶段，BRD4抑制NME7并且它的辅助因子JMJD6上调NME1的表达，其必须是结合于并二聚化MUC1*生长因子受体的二聚物。因此，NME1稳定化第二类幼稚状态。因为发育中的桑椹胚或囊胚的干细胞繁殖，分泌的NME1的量增加并且二聚物变成六聚体。六聚的NME1并不结合于MUC1*并且诱导分化(Smagghe et al 2013)。图14显示了干细胞如何限制它们自身复制的这种机理模型。以前，NME7仅报道为在睾丸中表达。我们发现人桑椹胚的早期细胞和人成纤维细胞的内细胞团中表达NME7。图15A显示了第三天的人桑椹胚的所有细胞对NME7染色呈现阳性(在实例部分#61中说出哪种抗体)。图15B显示了到第5天，桑椹胚发育为囊胚，并且在发育的这个阶段，NME7阳性细胞限制于已知处于幼稚状态的内细胞团。我们发现了幼稚状态人类干细胞表达和分泌两种截短形式的NME7，均缺乏N终端DM10结构域。这些截短的NME7种类结合于MUC1*生长因子受体的胞外结构域。我们称为NME7-AB的NME7的一个形式经历了翻译后裂解以产生表观分子量为～33kDa的NME7种类。另一个截短的形式是称为NME7-X1的～30kDa的选择性剪接同种型。这与全长NME7形成对比，其具有～42kDa的计算的分子量并似乎限制于细胞质。NME1二聚物、NME6二聚物、NME7-AB和NME7-X1对人类干细胞起到生长因子的作用。它们通过结合于并二聚化MUC1*生长因子受体而促进生长、多能性和幼稚状态的诱导。但是，NME7-AB和NME7-X1作为单体时同样具有这样的效果因为它们对于MUC1*的胞外结构域具有两个结合位点。图16A-16B显示了来自免疫共沉淀实验的蛋白质印迹凝胶的照片，其中人幼稚状态诱导的多能干(iPS)细胞和胚胎干(ES)细胞被裂解，针对MUC1(Ab5)的胞质尾区的抗体用于免疫共沉淀与MUC1结合的物质。然后通过蛋白质印迹检测免疫沉淀物。图16A显示了用抗NME7抗体探测的蛋白质印迹的照片，并显示两种NME7，一种分子量为30kDa，另一种为33kDa，与MUC1结合，而粗细胞裂解物中的全长NME7具有42kDa的分子量，以及图16B显示蛋白质印迹的照片，其中图16A的凝胶被剥离并用抗MUC1*胞外结构域抗体重新探测，表明NME7-AB或NME7-X1结合MUC1的切割形式，称为MUC1*，其分子量为17-25kDa，取决于糖基化。
[0395] 图17描绘了本发明的方法，用于在最早期的幼稚阶段生长干细胞。将NME7-AB或NME7-X1以低毫摩尔浓度添加到无血清的培养基中，其范围为1nM-60nM，优选为2nM-32nM，优选为2nM-10nM，最优选为4nM。饲养细胞和胞外基质蛋白以及混合物包含递送信号的生长因子和其他生物分子，所以期望当诱导或稳定幼稚状态时避免它们的使用。优选的是抗MUC1*抗体的使用，诸如MN-C3、MN-C8或人源化版或者MN-C3或MN-C8的碎片，或者NME蛋白，作为使得干细胞粘附于表面的表面涂层。或者，可以在悬浮液中培养细胞以免需要粘合层。当期望诱导分化时，加入包含大部分或全部PSMGFR肽的肽。添加具有MUC1*生长因子受体的大部分或全部胞外结构域的序列的肽充当配体库(ligand sink)并结合所有NME生长因子，使得分化同步且更完整。这种肽的加入也确保了所有的OCT4阳性细胞被诱导分化，其最小化或消除畸胎瘤形成的风险。这些方法用来生产干细胞，用于研究、药物开发、治疗用途，或者可以植入受精卵、桑椹胚、囊胚、胚胎或胎儿中以产生具有一些人DNA、分子、细胞、组织或器官的非人类动物。然后可以将这种含有至少一些人类DNA的分子、细胞、组织或器官用于研究、药物开发、药物测试或给予人以治疗或预防疾病或症状。为了将人类干细胞插入非人类宿主，NME7-AB或NME7-X1应具有人类序列或与天然人类序列至少80％相同的序列。但是，也可以期望在非人类物种之间创建嵌合体。例如，可以创建非人灵长类-非灵长类嵌合体以避免伦理关注。在那种情况下，由于高度的序列同源性，NME蛋白的序列可以是人类的或者非人类灵长类的序列。然而，如果希望产生低级哺乳动物的嵌合体，则NME7序列应该是其干细胞将被插入宿主桑椹胚或囊胚的哺乳动物的序列。或者，可能希望具有以低百分比或仅在宿主动物的某些区域中表达的人体细胞和组织。在那些情况下，可能需要插入不处于最初的初始状态但处于较晚的幼稚状态的干细胞。在这些情况下，NME1二聚物将用于上述方法以培养干细胞。
[0396] 为了产生真正的嵌合动物，要注射到受精卵、桑椹胚或囊胚中的干细胞必须处于幼稚状态。图18显示了由RNA-SEQ实验产生的热图。已经在FGF中衍生并生长以使其处于启动状态的人胚胎干细胞然后转移到上述培养系统中，其中所添加的生长因子是NME7-AB或NME1二聚物。基因表达的热图显示FGF生长的启动状态的细胞与NME7-AB生长的细胞或NME1生长的细胞具有完全不同的基因表达特征，表明它们与引发的细胞不同并且是幼稚的。NME7和NME1生长细胞处于幼稚状态的另一个标志是NME7-AB，NME1二聚物或NME7-X1中的iPS细胞产生比基于FGF的培养基中的iPS产生的效率高得多。图19A-19C显示将体细胞在FGF基培养基中重编程变成诱导的多能干细胞(iPS细胞)具有非常低的效率。干细胞集落通过碱性磷酸酶染色是可见的。与小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)一起使用的基于FGF的培养基在这个早期阶段看起来相对有效，但是只有约15％的挑选的集落继续成为真正的干细胞系(图19A)。另外，小鼠饲养层将非人类不可定量的和非人类的物种引入不允许细胞或其后代在人类中的最终治疗使用的方法。mTeSR是基于FGF的培养基，通过将细胞铺在人工基底膜上可以无饲养细胞使用，但是这种方法效率非常低，如图19B的稀疏和小集落所见。相比之下，iPS在NME7-AB中抗MUC1*抗体层上的重编程是高度有效的，其中大量的干细胞集落比基于FGF的方法更快并且生长更快(图19C)。另外，从NME7产生的iPS集落中挑取的集落中超过
86％继续成为真正的幼稚状态的iPS干细胞系。干细胞处于幼稚状态的另一个标志是雌性源细胞的第二个X染色体是否仍然活跃。干细胞做出的最早的分化决定之一是在雌性细胞中将关闭哪条X染色体。为了关闭一条X染色体的表达，组蛋白3的赖氨酸27三甲基化。图20A显示在FGF培养基中衍生并生长的雌源胚胎干细胞。每个细胞的细胞核中的红色焦点是与组蛋白3中三甲基化赖氨酸27结合的荧光抗体，表明在启动状态干细胞中第二个X染色体已关闭，称为XaXi。图20B显示在NME7-AB中培养这些相同细胞后，第二个X再活化(XaXa)，导致红点焦点消失。在NME1二聚物中培养后获得相同的结果。对于干细胞是否处于幼稚状态的一个更有争议的测量是，它们是否可以掺入另一物种的桑椹胚或囊胚的内细胞团中。图
21A-21D显示了掺入小鼠囊胚的内细胞团中的我们人类的NME7-AB干细胞的荧光图像。幼稚状态干细胞的另一个标志是，它们是否在没有自发分化的情况下生长，并且它们的生长速度是否比启动状态的细胞更快。图20A-20B显示人NME7-AB生长的干细胞具有比启动的干细胞快得多的生长速率。它们在4天内经历了10-20倍的扩增，比启动状态的细胞快2-3倍。
86％继续成为真正的幼稚状态的iPS干细胞系。干细胞处于幼稚状态的另一个标志是雌性源细胞的第二个X染色体是否仍然活跃。干细胞做出的最早的分化决定之一是在雌性细胞中将关闭哪条X染色体。为了关闭一条X染色体的表达，组蛋白3的赖氨酸27三甲基化。图20A显示在FGF培养基中衍生并生长的雌源胚胎干细胞。每个细胞的细胞核中的红色焦点是与组蛋白3中三甲基化赖氨酸27结合的荧光抗体，表明在启动状态干细胞中第二个X染色体已关闭，称为XaXi。图20B显示在NME7-AB中培养这些相同细胞后，第二个X再活化(XaXa)，导致红点焦点消失。在NME1二聚物中培养后获得相同的结果。对于干细胞是否处于幼稚状态的一个更有争议的测量是，它们是否可以掺入另一物种的桑椹胚或囊胚的内细胞团中。图
21A-21D显示了掺入小鼠囊胚的内细胞团中的我们人类的NME7-AB干细胞的荧光图像。幼稚状态干细胞的另一个标志是，它们是否在没有自发分化的情况下生长，并且它们的生长速度是否比启动状态的细胞更快。图20A-20B显示人NME7-AB生长的干细胞具有比启动的干细胞快得多的生长速率。它们在4天内经历了10-20倍的扩增，比启动状态的细胞快2-3倍。
[0397] NME蛋白促进胚胎和iPS细胞的生长和多能性以及诱导细胞恢复至干细胞样状态或幼稚状态。在优选的实施例中，NME家族成员蛋白是NME1或NME蛋白，其与NME1具有大于30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％的序列同一性，其中所述蛋白是二聚物。在更优选的实施例中，NME家族成员蛋白是NME7或NME蛋白，其与NME7结构域A或B中的至少一个具有大于30％、35％、40％、45％、50％、55％、
60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％的序列同一性，并且能够二聚化MUC1*生长因子受体。
60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％的序列同一性，并且能够二聚化MUC1*生长因子受体。
[0398] 在这里，我们报道了以二聚物形式的NME1、NME7-AB或NME7-X1能够：a)完全支持人类ES或iPS的生长和多能性，同时抑制分化；b)将体细胞恢复成更干细胞样或幼稚的状态；和c)产生能够整合到其他物种的囊胚中的幼稚状态人类干细胞。在第2.5天将NME7-AB幼稚人类干细胞注射到小鼠桑椹胚中。图22A-22D显示48小时后，当桑椹胚发育成囊胚时，人细胞(黄色)位于小鼠幼稚细胞所在的内细胞团(圆圈)内。为了形成嵌合动物，需要这种掺入到内细胞团中。图23A-23J和图24A-24J显示了其他小鼠囊胚的共焦图像，在第2.5天向其中注射了人NME7-幼稚细胞，并且还显示整合入内细胞团。图25A-25D和图26A-26H显示了启动状态的FGF生长的人类干细胞在相同条件下没有掺入小鼠囊胚的内细胞团中。图27A-27F、图28A-26J、图29A-29J和图30A-30J显示了在2.5天注射到小鼠桑椹胚中的人NME7-AB生长的幼稚干细胞，发现在4.5天的48小时后集中于囊胚的内细胞团。
[0399] 我们制造了重组人NME1，其携带稳定二聚物的S120G突变的二聚物。我们以前曾报道人NME1二聚物与MUC1*受体胞外结构域的PSMGFR部分结合(Smagghe et al.2013)。我们还制造了重组人NME7-AB和NME7-X1，它们作为单体与多能干细胞上的MUC1*受体的胞外结构域的PSMGFR部分结合并二聚化，其刺激生长和多能性并诱导干细胞恢复最早的幼稚状态。
[0400] NME是通用的干细胞生长因子
[0401] NME7和截短形式是跨许多物种的通用的干细胞和多能生长因子。例如，我们已经能够使用人NME7-AB增殖恒河猴和食蟹猴干细胞，包括胚胎干细胞和iPS干细胞。在使用抗MUC1*抗体MN-C3而不存在饲养细胞的情况下，我们还成功地使用NME7-AB以及Yamanaka或Thomson的重编程因子在恒河猴和食蟹猴中产生iPS细胞以促进表面附着。猕猴NME7的序列与人NME7 98％相同，以及靶生长因子受体，MUC1*胞外结构域与人PSMGFR 90％相同。图31A-31F显示在NME7-AB培养6天但不转导Yamanaka多能因子OCT4、SOX2、NANOG和c-Myc的情况下，包含来自食蟹猴的成纤维细胞的对照板的照片。图32A-32C、图33A-33F和图34A-34F显示了由Yamanaka因子和NME7-AB重编程的来自食蟹猴的成纤维细胞。在第6天后，将新出现的iPS集落转移到抗MUC1*抗体表面，在那里它们继续扩增直至大约第14-17天，当挑选并扩增单个克隆时。据我们所知，这是第一次在没有小鼠或人饲养细胞的情况下，科学家成功地产生非人灵长类iPS细胞。研究人员在培养非人灵长类干细胞方面遇到极大困难。它们自发分化，并且在基于FGF的培养基中不能良好生长。当我们将非人灵长类细胞移入NME7-AB培养基时，我们克服了所有这些问题，如图35A-35D、图36A-36D、图37A-37B和图38A-38H所示。在图39A-39C、图40A-40C、图41A-41D、图42A-42B、图43A-43E、图44A-44F、图45A-45H、图
46A-46H、图47A-47G和图48A-48D中显示了产生恒河猴iPS细胞的各种阶段，其通过MN-C3抗体表面或MEF上的无血清，无FGF，NME7-AB培养基中的Yamanaka因子或Thomson因子的转导产生。
46A-46H、图47A-47G和图48A-48D中显示了产生恒河猴iPS细胞的各种阶段，其通过MN-C3抗体表面或MEF上的无血清，无FGF，NME7-AB培养基中的Yamanaka因子或Thomson因子的转导产生。
[0402] 在本发明的另一方面，胚胎干细胞或iPS干细胞通过培养受精卵或胚胎或使用含有NME蛋白的培养基重编程细胞而在其他非人类物种中增殖、维持或产生。NME蛋白可以是NME1二聚物或NME6二聚物、NME7、NME7-AB或NME7-X1。在一些情况下，NME蛋白的序列可以是人类序列。在其他情况下，NME蛋白的序列是非人类物种的序列，来自其的干细胞、胚胎或细胞用于重编程。如果非人类物种的NME7序列与人NME7相差太远，那么使用与非人类目标物种具有更高序列同一性的序列的NME蛋白或具有该物种的天然NME蛋白的序列的NME蛋白会得到更好的结果。在本发明的一个方面，NME蛋白可以是NME1或NME6二聚物、NME7、NME7-AB或NME7-X1。确定特定NME蛋白作为多能生长因子将作用于哪些物种的方法是测试NME蛋白是否与具有目标物种的序列的PSMGFR肽结合。如果NME蛋白与目标物种的PSMGFR肽结合，则NME蛋白将作为干细胞生长因子或多能因子起作用。
[0403] 在本发明的一个方面，通过在含有该非人类物种的NME蛋白的培养基中培养细胞来增殖或维持非人类干细胞。在本发明的另一个方面，通过在含有NME蛋白的培养基中培养细胞来增殖或维持非人类干细胞，所述NME蛋白具有与非人类物种干细胞至少40％同源的序列。在本发明的另一个方面，通过在含有NME蛋白的培养基中培养细胞来增殖或维持非人类干细胞，所述NME蛋白能够结合于具有该物种的MUC1*胞外结构域，也称为PSMGFR肽的序列的肽。在本发明的另一个方面，通过在含有人类序列NME蛋白的培养基中培养细胞来增殖或维持非人类干细胞。NME蛋白可以是NME1或NME6二聚物、NME7、NME7-AB或NME7-X1。
[0404] 在本发明的另一个方面，使用重编程技术产生非人类干细胞，所述重编程技术诸如在包含该非人类物种的NME蛋白的培养基的存在下，引入包括Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28的基因或基因产物的组合。在本发明的另一个方面，在含有NME蛋白的培养基中使用重编程技术来产生非人类干细胞，所述NME蛋白具有与非人类物种干细胞至少40％同源的序列。在本发明的另一个方面，在含有NME蛋白的培养基中使用重编程技术来产生非人类干细胞，所述NME蛋白能够结合于具有该物种的MUC1*胞外结构域，也称为PSMGFR肽的序列的肽。在本发明的另一个方面，在含有人类序列NME蛋白的培养基中使用重编程技术来产生非人类干细胞。NME蛋白可以是NME1或NME6二聚物、NME7、NME7-AB或NME7-X1。
[0405] 在本发明的另一个方面，通过在含有该非人类物种的NME蛋白的培养基中培养受精卵或胚胎来产生非人类胚胎干细胞。在本发明的另一个方面，通过在含有NME蛋白的培养基中培养受精卵或胚胎来产生非人类胚胎干细胞，所述NME蛋白具有与非人类物种干细胞至少40％同源的序列。在本发明的另一个方面，通过在含有NME蛋白的培养基中培养受精卵或胚胎来产生非人类胚胎干细胞，所述NME蛋白能够结合于具有该物种的MUC1*胞外结构域，也称为PSMGFR肽的序列的肽。在本发明的另一个方面，通过在含有人类序列NME蛋白的培养基中培养受精卵或胚胎来产生非人类胚胎干细胞。NME蛋白可以是NME1二聚物、或NME6二聚物、NME7、NME7-AB或NME7-X1。
[0406] 在本发明的另一方面，当期望将人类干细胞掺入发育中的囊胚或非人类物种的胚胎中，所述非人类物种的NME蛋白或MUC1*蛋白与人具有低序列同一性时，将所述非人类物种人源化。用能够表达人NME蛋白和或人MUC1*蛋白的载体转导受精或未受精的卵细胞或非人类物种的干细胞，其中它们的表达可以是诱导型或抑制型的。
[0407] 嵌合动物中潜在药剂的测试
[0408] 目前在小鼠和其他动物中测试癌症药物的实践是将人类癌细胞注射到动物中，并立即或在移植几天或几周后，向动物注射测试药物。然而，这种方法存在根本性的缺陷，因为宿主自然不会产生人类癌细胞需要生长或移植的生长因子。此外，由于宿主不产生生长因子或生长因子的相同水平或人类形式的生长因子，在动物中进行测试的药物将不会具有与人类相同的效果。小鼠NME7与人NME7只有84％同源并且不在成人中表达。因此，目前用于抗癌药物测试的异种移植方法在预测人类对这些药物的反应方面通常不足。这个问题可以通过将NME1二聚物或NME7引入小鼠中来解决，以便人类肿瘤细胞具有其同源生长因子来饲养肿瘤。NME1二聚物或NME7可以通过多种方法引入动物体内。它可以在植入前与肿瘤细胞混合，也可以注射到带有肿瘤的动物体内。
[0409] 在优选的实施例中，产生表达人NME7或其片段的转基因动物。NME7可以携带诱导型启动子，使得动物可以自然发育，但是在植入人类肿瘤的过程中或者用于评估药物功效或毒性，可以开启NME7或NME7片段的表达。在优选的实施例中，引入测试动物的NME7种类是NME7-AB。
[0410] 或者，可以制备转基因动物，其中动物表达人MUC1、MUC1*、NME7和/或NME1或NME2，优选二聚物形成的NME1或NME2的变体，单链构建体或形成二聚物的其它变体。因为NME蛋白和MUC1是人类中反馈环的一部分，其中一个的表达可引起另一个的上调，所以产生表达人NME蛋白和MUC1或切割形式MUC1*的转基因动物可能是有利的。自然或工程NME种类可通过多种方法中的任何一种引入动物，例如小鼠，所述方法包括产生转基因动物，将自然或重组NME蛋白或NME蛋白变体注射给动物，其中优选NME1、NME6和NME7蛋白或变体，特别优选NME1、NME6和NME7蛋白或能够二聚化MUC1*的变体，特别是PSMGFR肽。在优选的实施例中，NME物种是具有33kDa的近似分子量的NME7的截短形式。在较优选的实施例中，NME7物种在其N末端缺乏DM10结构域。在更优选的实施例中，NME7物种是人。
[0411] NME家族蛋白，尤其是NME1、NME6和NME7在人类癌症中表达，其中它们作为促进人类癌症生长和转移的生长因子起作用。因此，人NME蛋白或NME蛋白的活性形式应该存在用于适当的生长、进化和评估人类癌症并确定它们对化合物、生物制剂或药物的反应。
[0412] 人源化动物
[0413] 在一些情况下，期望能够控制NME蛋白的表达的时机。在这些情况下，蛋白表达可以链接于可诱导的遗传元件诸如可调控的启动子。在优选的实施例中，引入动物以增加人类干细胞或癌细胞移植的NME蛋白是人NME7。在另一优选的实施例中，NME蛋白是～33kDa的片段。在更优选的实施例中，NME蛋白是人NME7-AB。
[0414] 其他人已经报道了称为‘2i’(Silva J et al 2008)和‘5i’(Theunissen TW et al 2014)的抑制剂能够将干细胞维持在幼稚状态。用‘2i’抑制剂或‘5i’抑制剂治疗导致干细胞恢复到更幼稚状态。2i是指MAP激酶途径的抑制剂和GSK3抑制剂，例如PD0325901和CHIR99021。然而，取决于使用生物化学抑制剂的这些和其他方法不能满足成为幼稚的标准，诸如能够整合到其他物种的内细胞团中，另外他们报道说如果没有严重的自发分化或异常核型或两者，它们不能将干细胞繁殖10代或更多的传代。
[0415] 幼稚状态
[0416] 报道了将干细胞维持于幼稚状态或将已启动的干细胞恢复到幼稚状态的试剂。最近报道了染色质重排因子MBD3和CHD4阻断多能性的诱导(Rais Y et al,2013)。例如，染色质重排因子MBD3和CHD4的siRNA抑制已证明是将人启动干细胞恢复至幼稚状态的方法的关键组分。据报道转录因子BRD4和辅助因子JMJD6抑制NME7并上调NME1(Lui W et al,2013)。我们发现这些因子在幼稚干细胞中的表达水平低于在晚期启动干细胞中。我们观察到在NME1二聚物、NME7或NME7-AB或NME7-X1(图3)中培养的癌细胞中，这四种(4)基因MBD3、CHD4、BRD4和JMJD6被自然抑制。
[0417] 我们已经证明，也称为NM23-H1的人NME1二聚物、细菌NME1、NME6、NME7-X1和NME7-AB的促进胚胎干细胞的生长并诱导多能干细胞，抑制它们的分化并将它们维持在幼稚状态，如整体遗传分析所证明的那样，如果干细胞供体是人类并且通过具有在宿主动物中形成畸胎瘤的能力，则两个X染色体处于活化状态。
[0418] 这里已经提出了几个实例，指示了将细胞与能够将干细胞从启动状态恢复到不太成熟的幼稚状态的试剂或多种试剂接触也能够将多种细胞类型恢复到不太成熟状态：将体细胞恢复成干细胞或祖细胞以及将干细胞后退到幼稚状态。
[0419] 在优选的实施例中，产生表达人NME7或NME7-AB的转基因动物。因为人类或细菌NME1和NME7抑制干细胞的分化，所以使用可以控制转基因动物中NME蛋白，优选NME7或NME7抗体的表达时机的技术可能是有利的。在诱导型启动子上具有人NME7将是有利的，例如以避免在动物发育过程中NME7表达的潜在问题。用于使外源基因的表达在宿主动物中是可诱导的方法是本领域技术人员已知的。NME7或NME7-AB的表达可以使用本领域已知的用于控制转基因表达的许多方法中的任何一种来诱导。
[0420] 或者，NME7的表达或表达时机可以通过哺乳动物可以自然表达的另一种基因的表达来控制。例如，可能希望在某个组织(例如心脏)中表达NME7或NME7变体。然后将NME7的基因与心脏中表达的蛋白如MHC的表达可操作地连接。在这种情况下，当表达MHC基因产物时，NME7的表达关闭。类似地，人们可能希望在前列腺中打开或关闭人NME1、NME6或NME7的表达，使得其表达的位置和时间受到例如前列腺特异性蛋白的表达控制。类似地，非人类哺乳动物中人NME6或NME7的表达可以通过在乳腺组织中表达的基因来控制。例如，在转基因小鼠中，从催乳素启动子或类似基因表达人NME6或人NME7。以这种方式，将有可能以位点特异性的方式诱导或抑制人NME蛋白的表达。
[0421] 用人肿瘤异种移植也注射了人NME7的动物产生了转移性癌症。因此，通过制备表达人NME7或更优选NME7-AB的转基因动物来产生用于发生癌转移的动物模型。NME7最好在诱导型启动子上，以允许动物正确发育。或者，通过制备表达人NME或人NME7或NME7-AB的转基因动物来制备转移动物模型，优选啮齿动物。或者，该动物是转基因动物，通过诱导型启动子或试剂抑制由2i或5i抑制的激酶以抑制给予试验动物的激酶。然后使用转移动物模型来研究癌症发展或进展的基础科学，以及测试化合物、生物制剂、药物等对癌症发展的影响。
[0422] 表达人体组织的动物的产生
[0423] 可以设想其他应用，其中将人NME1、细菌NME1或人NME7，优选NME7-AB的转基因动物植入或移植人体细胞，所述人体细胞可以是干细胞或祖细胞或初始中胚层细胞。例如，在某些情况下，需要产生能够在其心脏、肝脏、皮肤或其他器官中生长人体组织的动物，如小鼠、猪、绵羊、牛动物和灵长类动物。
[0424] 这样做的一种方法是通过将人类干细胞植入已经制成表达人NME7或人NME7-AB的动物中来产生一种嵌合动物。可以在动物发育的各个阶段，在发育的囊胚、胚胎或胎儿阶段植入人类干细胞或祖细胞，包括体外和体内。由于NME7抑制分化，因此NME7或NME7-AB转基因将与其表达时机可控的方法相关联。方法对于本领域技术人员是已知的，其可以被使用，使得在期望发生分化或成熟的时机或位置关闭或减少人NME7或NME7-AB的表达。一种使转基因，优选NME7，诱导或抑制的方法是将其表达或抑制链接于仅在发育中的晚期表达的基因的表达。在这种情况下，人们会制造一种转基因动物，其中NME7或NME7-AB的表达链接于在心脏或心脏祖细胞中表达的晚期基因的表达。因此，通过哺乳动物可以自然表达的另一种基因的表达来控制NME7的表达或表达时机。例如，可能希望在某个组织(例如心脏)中表达NME7或NME7变体。然后将NME7的基因与心脏中表达的蛋白如MHC的表达可操作地连接。在这种情况下，当表达MHC基因产物时，NME7的表达被关闭。类似地，人们可能希望在前列腺中打开或关闭人NME1、NME6或NME7的表达，使得其表达的位置和时机受到例如前列腺特异性蛋白的表达的控制。类似地，非人类哺乳动物中人NME1或NME7的表达可以通过在乳腺组织中表达的基因来控制。例如，在转基因小鼠中，通过催乳素启动子或类似基因表达或抑制人NME1或人NME7。
[0425] 通过这种方式，可以允许人NME7或NME7-AB的转基因动物生长至一定程度，然后植入人类干细胞或祖细胞，在那里它们因与人NME蛋白接触而增殖。然后关闭人NME的表达，使得动物中的特定器官或器官的一部分将发育为人体组织。
[0426] 另外，还预期灵长类动物或与人类具有接近的整体序列同一性的任何动物可能不是良好的宿主动物候选，因为可能发生跨物种的相互作用并且因此可能出现道德问题。
[0427] 本发明考虑了人NME1、细菌NME1或人NME7或NME7-AB的转基因动物的许多应用。在本发明的一个方面，将人类干细胞或祖细胞植入NME转基因动物或将成为转基因动物的生殖细胞中。NME的表达可以是可诱导的或可抑制的。取决于植入干细胞或祖细胞的位置和时机，可以使得到的动物表达人心脏、肝脏、神经元细胞或皮肤。
[0428] 因此可以在转基因非人类哺乳动物中产生人体组织，其中所述哺乳动物在生殖细胞和体细胞中表达人MUC1或MUC1*或NME蛋白，其中所述生殖细胞或体细胞含有引入到所述哺乳动物中的重组人MUC1或MUC1*或NME基因序列，其中所述基因序列的表达可以通过外部化合物的引入或通过将其表达或抑制链接于宿主动物的自然发生的基因的表达或抑制来诱导或抑制。将源自非人类哺乳动物的异种干细胞或祖细胞转移至转基因动物中，以使得该基因被诱导表达以便使干细胞或祖细胞繁殖，并随后抑制基因表达以从异种移植的干细胞产生组织。实施抑制转基因的一种方法是将干细胞或祖细胞与组织分化因子接触。在哺乳动物中也自然地进行转基因抑制，以响应自然产生的宿主组织分化因子。
[0429] 这些动物可以用于药物开发。它们也可用于毒性测试，使用动物来确定化合物、生物制品或药物对人体组织或人体组织发育的影响。或者，植入人类干细胞或祖细胞的转基因动物用于生长人体组织以移植入人类患者。在一些情况下，植入的干细胞或祖细胞来自将成为从转基因动物收获的人体组织的受体的患者。
[0430] 在一个方面，可以诱导MUC1、MUC1*或NME蛋白表达，直到转移的干细胞或祖细胞的量足够大。然后可通过向宿主哺乳动物注射抑制MUC1、MUC1*或NME蛋白表达的物质来关闭MUC1、MUC1*或NME蛋白表达。干细胞或祖细胞群可以通过自然方法诱导分化，诸如通过用于特定组织或器官类型的分化诱导因子在小鼠中的表达，或者将化学品或蛋白物质在干细胞或祖细胞转移的部位注射入宿主以导致分化成期望的组织类型。
[0431] 用于内胚层细胞组织的诱导、分化/转化剂可以包括但不限于以下试剂：肝细胞生长因子、抑瘤素-M、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子-4、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、转铁蛋白、硒脲酸(Selenious Acid)、BSA、亚油酸、抗坏血酸2-磷酸酯、VEGF和地塞米松，用于以下细胞类型：肝、肺、胰腺、甲状腺和肠细胞。
[0432] 用于中胚层组织的诱导，分化/转化剂包括但不限于以下试剂：胰岛素、转铁蛋白、硒脲酸(Selenious Acid)、BSA、亚油酸、TGF-β1、TGF-β3、抗坏血酸2-磷酸、地塞米松、β-甘油磷酸、抗坏血酸2-磷酸盐、BMP和吲哚美辛，用于以下细胞类型：软骨、骨骼、脂肪、肌肉和血细胞。
[0433] 用于外胚层组织的诱导，分化/转化剂包括但不限于以下试剂：二丁酰基细胞周期蛋白AMP、异丁基甲基黄嘌呤、人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-8、脑源性神经营养因子和/或其他神经营养性生长因子，用于以下细胞类型：神经、皮肤、脑和眼细胞。
[0434] NME蛋白的调节子或NME蛋白的下游效应子可以替代NME蛋白
[0435] 这些研究已经表明NME蛋白发挥促进干细胞样或癌样生长功能的一种方式是通过结合MUC1跨膜蛋白的截短形式，本文称为MUC1*，其主要由PSMGFR序列组成。MUC1*胞外结构域的二聚化刺激体细胞，干细胞和癌细胞的生长和去分化，使其更具转移性。
[0436] NME蛋白发挥其作用的另一种方式是通过将其运输至细胞核，在那里它们直接或间接起作用以刺激或抑制其他基因。之前已有报道(Boyer et al,2005)OCT4和SOX2与MUC1的启动子位点及其切割酶MMP16结合。同一研究报道SOX2和NANOG与NME7的启动子位点结合。我们得出结论，根据我们的实验，这些‘Yamanaka’多能因子(Takahashi和Yamanaka，2006)上调MUC1、其切割酶MMP16及其激活配体NME7。先前也有报道BRD4抑制NME7，而其辅助因子JMJD6上调NME1(Thompson et al)，我们已经证明这是一种自我调节的干细胞生长因子，其在胚胎发生中晚于NME7表达。最近还有其他报道称，Mbd3或Chd4的siRNA抑制大大降低了对iPS产生的抗性(Rais Y et al 2013 et al.)并且能够将干细胞维持在幼稚状态。
这里呈现的证据表明存在相互反馈回路，其中NME7抑制BRD4和JMJD6，同时也抑制多能Mbd3和CHD4的抑制剂。我们注意到，在幼稚的人类干细胞中，这四种因子BRD4、JMJD6、Mbd3和CHD4与其在晚期“启动的”干细胞中的表达相比被抑制。我们还注意到2i抑制剂(Gsk3β和MEK的抑制剂)将小鼠启动的干细胞恢复至幼稚状态，也下调了相同的四种因子BRD4、JMJD6、Mbd3和CHD4。
这里呈现的证据表明存在相互反馈回路，其中NME7抑制BRD4和JMJD6，同时也抑制多能Mbd3和CHD4的抑制剂。我们注意到，在幼稚的人类干细胞中，这四种因子BRD4、JMJD6、Mbd3和CHD4与其在晚期“启动的”干细胞中的表达相比被抑制。我们还注意到2i抑制剂(Gsk3β和MEK的抑制剂)将小鼠启动的干细胞恢复至幼稚状态，也下调了相同的四种因子BRD4、JMJD6、Mbd3和CHD4。
[0437] 我们还发现了，NME7上调SOX2(>150X)、NANOG(～10X)、OCT4(～50X)、KLF4(4X)和MUC1(10X)。重要的是，我们显示了，NME7上调包括CXCR4(～200X)和钙黏蛋白(CDH1)的癌干细胞标志物。总之，这些多重证据一起指向以下结论：NME7是最原始的干细胞生长和多能介质，并且它是将体细胞转化为癌症状态以及将癌细胞转化为更具转移性的癌干细胞的强有力的因子。
[0438] 因此，本发明考虑用增加NME7表达的基因和基因产物代替NME7。类似地，本发明考虑用NME7的下游效应器代替NME7。例如，抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6的单独或组合试剂可在本文所述的任何方法中被取代，对于NME7，我们已经显示了其抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6。
[0439] 基于干细胞的器官和组织产生
[0440] 本发明公开了用于产生、维持或增殖处于幼稚状态的人类干细胞并在非人类宿主动物或非人类动物的受精卵、囊胚或胚胎中使用所得细胞的方法，以便产生由非人类宿主的DNA和人供体干细胞的DNA组成的嵌合生物或动物。可以收获含有一些人类DNA的嵌合物种的肢体、神经、血管、组织、器官或由它们制造或从它们分泌的因子用于多种用途，包括植入人类，给予人类以获得药物效益，包括抗衰老和科学实验，所述科学实验包括药物测试和疾病建模。
[0441] 在第一种方法中，通过使人启动的状态干细胞与NME家族蛋白或使MUC1*生长因子受体二聚化的试剂接触，而产生、维持或增殖人幼稚状态干细胞。
[0442] 在第二种方法中，诸如通过使用iPS技术通过诱导体细胞恢复至较不成熟状态来产生、维持或增殖人幼稚状态干细胞，其中细胞在NME家族蛋白或使MUC1*生长因子受体二聚化的试剂的存在下重编程。
[0443] 在第三种方法中，通过在NME家族蛋白或使MUC1*生长因子受体二聚化的试剂存在下培养从人类胚胎、囊胚或受精卵获得的细胞来产生、维持或增殖人幼稚状态干细胞。
[0444] 所述NME蛋白或二聚化MUC1*的试剂将人类启动状态干细胞转化为幼稚状态。所述NME蛋白或二聚化MUC1*的试剂也支持来自取自人胚胎的细胞的幼稚状态胚胎干细胞系的衍生。所述NME蛋白或二聚化MUC1*的试剂支持幼稚状态诱导的多能干细胞系的产生，其中将分化的细胞重编程为干细胞状态。
[0445] 在优选的实施例中，NME家族蛋白是NME7。在更优选的实施例中，NME家族成员是NME7-AB或NME7-X1或其他同种型或NME7的截短。在另一实施例中，NME家族成员是二聚的NM23、aka NME1。在又一实施例中，NME家族成员是NME6。在优选的实施例中，使MUC1*二聚化的试剂是结合MUC1*胞外结构域的PSMGFR肽的抗体。
[0446] 在本发明的一个方面，通过包括使人体细胞与NME1二聚物、NME6二聚物、NME7、NME7-AB或NME7-X1接触的方法产生的幼稚状态人类干细胞，然后将所述细胞插入或注射到非人类动物的桑椹胚、囊胚、胚胎或胎儿中。产生嵌合动物，其具有一些组织、器官或其他身体部位，这些组织，器官或其他身体部位至少部分是人源的并且是从插入囊胚或胚胎的人类干细胞发出的。当完全发育或在发育的任何较早阶段时，从宿主动物收获组织、器官或其他身体部位。然后将由这些人体部位产生的组织、器官或身体部位或因子移植入需要新器官或需要再生性质的因子的人类受体，所述因子是由非人类宿主的人体组织或器官分泌的。
[0447] 在本发明的一个方面，例如用生物化学抑制剂从基因上改变或处理非人类动物的细胞，使得发育中的非人类动物不能够产生某些组织或器官。在这方面，嵌合动物将产生发自人供体干细胞或者人供体干细胞具有重要作用的某些组织或器官，并且将部分或完全是人的。
[0448] 在本发明的一个方面，供体干细胞来自需要在非人类动物中产生的组织或器官的供体，并且在发育的某个阶段或动物成熟后，收获组织或器官并移植到供体人体内。在本发明的另一方面，供体干细胞来自不是在嵌合物种中产生的组织、器官或其它物质的预期受体的供体。一方面，供体干细胞是iPS细胞，并且另一方面，干细胞是胚胎干细胞。
[0449] 在本发明的一个方面，通过在含有NME蛋白的培养基中培养干细胞。NME蛋白可以是二聚的NME1、二聚的NME6、NME7的二聚的B结构域、NME7-X1或NME7-AB。在优选的实施例中，NME蛋白是二聚的NME1。
[0450] 在较优选的实施例中，NME蛋白是NME7-X1。在更优选的实施例中，NME蛋白是NME7-AB。在一些情况下，通过用抗MUC1*抗体包被表面来促进干细胞与所述表面的附着，其中所述抗体具有与包含PSMGFR序列的至少15个连续氨基酸的肽结合的能力。在另一种情况下，通过用NME蛋白包被表面来促进干细胞与所述表面的附着，所述NME蛋白在一些情况下可以是组氨酸标记的，并包被到呈现金属-螯合物-金属部分诸如腈-三乙酸酸-镍的表面，又称为NTA-Ni++。在其他情况下，通过用整合蛋白或整合蛋白片段包被表面促进干细胞与所述表面的附着，其中整合蛋白是玻连蛋白、纤粘蛋白(fibrinectin)、胶原蛋白等。在其他情况下，通过用肽、小分子或聚合物包被表面可促进干细胞与所述表面附着。在某些情况下，将Rho I激酶抑制剂添加到培养基中以进一步增强表面附着。
[0451] 根据上述部分或全部方法实现干细胞的产生、诱导或维持。但是，对于非人类干细胞的产生、诱导或维持，有利的是将细胞与NME蛋白接触，所述NME蛋白的序列是非人类物种的序列。例如，为了产生、诱导或维持猪的干细胞，有利的是使用NME蛋白，其序列是天然猪的NME6、NME1、NME7、NME7-X1或NME7-AB的序列。促进表面附着，有利的是用抗体包被表面，所述抗体出于其结合于包含MUC1*胞外结构域的PSMGFR区域的至少15个连续氨基酸的肽的能力而选择，其中所述肽的序列是猪的MUC1*胞外结构域的天然序列。
[0452] 实例
[0453] 实例1
[0454] 基本培养基
[0455] 包含以下成分的无血清的基本培养基500mL：
[0456] 394mL DMEM/F12、GlutaMAX；100mL KnockoutTM血清替代品；5.0mL 100x MEM非必须氨基酸溶液；
[0457] 0.9mLβ-巯基乙醇；55mM母液。
[0458] 当加入rho激酶抑制剂，“Ri”或“ROCi”，在使用前，立即加入来自Stemgent(Cambridge,MA)的Y27632至10uM的最终浓度。
[0459] 实例2
[0460] 在NME培养基中培养干细胞
[0461] 向实例1中描述的的无血清的基本培养基中加入下述NME蛋白中的一种：8nM(最终浓度)二聚的rhNME1(aka NM23)，优选具有S120G突变以确保稳定的二聚物，8nM二聚的NME6、8nM细菌HSP593重组NME1、4nM NME7AB或4nM NME7-X1。能够在NME培养基中的混悬液或在细胞培养板上生长干细胞。如果在用诸如MN-C3的抗MUC1*抗体涂覆的细胞培养板上培养干细胞，随后加入Rho激酶诸如Y-26732至10uM的最终浓度。
[0462] 在干细胞铺板前至少1天制备细胞培养板。用含有～12.5ug/mL的MN-C3抗MUC1*抗体的溶液涂覆细胞培养板。在将干细胞铺到板上并且没有预洗步骤之前，将涂覆的板在4℃下温育过夜。将干细胞以广泛地对应于当6孔板的每孔上铺有100,000个细胞至300,000个细胞时获得的密度而接种。将细胞悬浮于添加了Rho激酶抑制剂的NME培养基中。将细胞在5％CO2/5％O2温育箱中不受干扰地温育48小时。此后，每24或48小时更换培养基，直到细胞达到～80％汇合(图20B)。使用胰蛋白酶/EDTA或TryplE将多个细胞解离为单细胞。重复进行从开始到展开的过程。
[0463] 实例3
[0464] 在NME培养基中产生iPS
[0465] 第2天(重编程前48小时)：以每个成纤维细胞培养基(含有谷氨酰胺的DMEM高葡萄糖，10％FBS)的孔2mL将成纤维细胞铺到标准组织培养处理6孔板上，每孔25,000-100,000个细胞。在5％CO2中培养48小时。
[0466] 第0天：将成纤维细胞培养基更换为NME培养基(实例2)。根据标准方案，用主要重编程因子诸如Yamanaka因子或Thomson因子转导成纤维细胞。如果需要，转导将导致OCT4、SOX2、NANOG或KLF4和c-Myc表达的核酸的任何方法都是可以的。通用方法使用非整合病毒递送系统，诸如慢病毒、仙台病毒、γ逆转录病毒或诸如睡美人(Sleeping Beauty)的转座子。
[0467] 第1天：用基本培养基洗涤细胞以移除病毒和细胞碎片，随后用没有Rho激酶抑制剂的每孔2mL-4mL的NME培养基替换。
[0468] 第3天：用没有Rho激酶抑制剂的每孔2mL-4mL的NME培养基替换培养基。
[0469] 第5天：用没有Rho激酶抑制剂的每孔2mL-4mL的NME培养基替换培养基。
[0470] 第6天：用抗MUC1*抗体(诸如涂覆在细胞培养板上的MN-C3)制备细胞培养板，浓度为3.25ug/mL至24ug/mL，优选约12.5ug/mL，并在4℃下将抗体涂覆的板温育过夜。
[0471] 第7天：将此时形态改变为干细胞形态的转导细胞用胰蛋白酶/EDTA解离，通过细胞滤过器，并接种到NME培养基中的MN-C3涂覆的加有Rho激酶抑制剂(如10μMY-26732)的平板上。然后将重编程的细胞以每孔5×104-1×105进行铺板。从此之后，在具有Rho激酶抑制剂(如加有10uM Y-26732)的NME培养基中培养细胞，并在5％CO2/5％O2中温育第一个48小时不受干扰。
[0472] 第9天及以后：每天用相同的NME培养基更换培养基，全部过程加Rho激酶抑制剂诸如10uM Y-26732。
[0473] 第16-21天：当植入动物并具有正常的核型时，在对干细胞进行表征并发现表达所有正常多能基因、幼稚基因、形成畸胎瘤之后，挑取集落并将每个克隆在MN-C3涂覆的表面上培养，首先在96孔板中，然后在24孔，然后在12孔，然后在6孔和更大的形式中。
[0474] 也使用与第1天及以后相同的过程从血液中产生iPS细胞。
[0475] 在图21A、21B和21C所示的细胞中，使用新生雄性成纤维细胞。在图21C中，使用的NME培养基是具有4nM NME7-AB的基本培养基。
[0476] 实例4
[0477] 在缺乏主要多能调节子OCT4、SOX2、KLF4或c-Myc的情况下，重编程NME蛋白的能力。
[0478] 在该实例中，将成纤维细胞在基本培养基中培养，向其中加入重组人NME1/NM23二聚物，细菌HSP593NME1二聚物或人重组NME7-AB。作为对照，将成纤维细胞在其正常培养基中培养，培养基为500mL，445mL DMEM高葡萄糖基础培养基，5mL GlutaMAX和50mL胎牛血清(FBS)。参见图1，在具有NME1/NM23二聚物，细菌HSP593NME1二聚物或NME7-AB的基本培养基中培养15-20天后，RT-PCR显示所得细胞显着增加了干细胞标志物基因OCT4和NANOG的表达。就像癌细胞所具有的，它们也降低了BRD4、JMJD6、MBD3和CHD4的表达。图2显示了编码染色质重排因子BRD4、JMJD6、MBD3和CHD4的基因表达的RT-PCR测量图。图3显示了编码染色质重排因子BRD4、JMJD6、MBD3和CHD4以及NME蛋白的多能基因表达的RT-PCR测量图。这里，“减去ROCi”是指变得不附着并浮出表面的细胞。细胞的形态也完全改变，它们不再被认为是成纤维细胞并且看起来像干细胞(图8-11)。
[0479] 实例5
[0480] NME7-AB培养的人类干细胞掺入小鼠桑椹胚的内细胞团中。体外使小鼠卵细胞受精。在受精后的2.5天，将在NME7-AB中产生并培养的10个人类干细胞分别注射到受精卵中。第2.5天是在内细胞团形成之前。48小时后，在第4.5天，用染色人Tra 1-81的荧光抗体染色桑椹胚，在一些图中，箭头指向掺入内细胞团的人幼稚NME7-AB细胞，其指示了嵌合动物的发育。参见图22A-22D、图23A-23J和图24A-24J，其显示了其他小鼠囊胚的共焦图像，在第
2.5天向其中注射了人NME7幼稚细胞，并且还显示了在4.5天整合入囊胚的内细胞团中。同样参见图27A-27F、图28A-26J、图29A-29J和图30A-30J，其显示了在2.5天注射到小鼠桑椹胚中的人NME7-AB生长的幼稚干细胞，发现在4.5天的48小时后集中于囊胚的内细胞团。作为对照，将FGF生长的启动状态的人类干细胞注射到在第2.5天和第4.5天用抗人Tra 1-81以及CDX2染色的受精卵中，其染色称为滋养层(Trophoectoderm)的非内细胞团区域。图
25A-25D和图26A-26H显示了这些启动状态的细胞并没有掺入内细胞团中而是在滋养层中。
2.5天向其中注射了人NME7幼稚细胞，并且还显示了在4.5天整合入囊胚的内细胞团中。同样参见图27A-27F、图28A-26J、图29A-29J和图30A-30J，其显示了在2.5天注射到小鼠桑椹胚中的人NME7-AB生长的幼稚干细胞，发现在4.5天的48小时后集中于囊胚的内细胞团。作为对照，将FGF生长的启动状态的人类干细胞注射到在第2.5天和第4.5天用抗人Tra 1-81以及CDX2染色的受精卵中，其染色称为滋养层(Trophoectoderm)的非内细胞团区域。图
25A-25D和图26A-26H显示了这些启动状态的细胞并没有掺入内细胞团中而是在滋养层中。
[0481] 实例6
[0482] 用称为番茄红或TDtomato的红色荧光团转染NME7-AB培养的人类干细胞。将这些荧光人幼稚细胞注射到2.5天的小鼠受精卵中并在第4.5天成像。用DAPI和染色trophectederm的荧光抗体染色桑椹胚。参见图27A-27F、图28A-26J、图29A-29J和图30A-
30J，其显示了在2.5天注射到小鼠桑椹胚中的人NME7-AB生长的幼稚干细胞，发现在4.5天的48小时后集中于囊胚的内细胞团。箭头指示了人体细胞掺入内细胞团中的地点，指示了嵌合动物的形成。
30J，其显示了在2.5天注射到小鼠桑椹胚中的人NME7-AB生长的幼稚干细胞，发现在4.5天的48小时后集中于囊胚的内细胞团。箭头指示了人体细胞掺入内细胞团中的地点，指示了嵌合动物的形成。
[0483] 实例7
[0484] 在不存在bFGF的情况下，在NME7-AB培养基中产生非人灵长类物种干细胞。在含有NME7-AB的培养基中并在不存在bFGF或饲养细胞的情况下，用核多能因子转染恒河猴和食蟹猴成纤维细胞。在这种情况下，使用Yamanaka因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，但可以替代其他多能因子、基因或基因产物。在基因转染后的第5天和第7天之间，当细胞开始从表面分离时，将细胞重新铺到涂覆有抗MUC1*抗体的表面上，在这种情况下为MN-C3。对于食蟹猴从第6天，对于猕猴从第14天，开始出现集落。图31A-31F显示了包含来自食蟹猴的成纤维细胞的对照板的照片，其在NME7-AB中培养6天但没有用Yamanaka多能因子OCT4、SOX2、NANOG和c-Myc转导。图32A-32C、图33A-33F和图34A-34F显示了由Yamanaka因子和NME7-AB重编程的来自食蟹猴的成纤维细胞。在第6天后，将出现的iPS集落转移到抗MUC1*抗体表面，在那里它们继续扩增直至大约第14-17天，当挑选并扩增单个克隆时。据我们所知，这是第一次在没有小鼠或人饲养细胞的情况下，科学家成功地产生非人灵长类iPS细胞。研究人员在培养非人灵长类干细胞方面遇到极大困难。它们自发分化，并且在基于FGF的培养基中不能良好生长。当我们将非人灵长类细胞移入NME7-AB培养基时，我们克服了所有这些问题，如图35A-35D、图36A-36D、图37A-37B和图38A-38H所示。在图39A-39C、图40A-40C、图41A-41D、图
42A-42B中显示了产生恒河猴iPS细胞的各种阶段，其通过MN-C3抗体表面或MEF上的无血清，无FGF，NME7-AB培养基中的Yamanaka因子或Thomson因子的转导产生。成纤维细胞是否在MN-C2抗体表面或MEF上重编程并不重要，但当表面是抗MUC1*抗体表面时产生更多的集落。
42A-42B中显示了产生恒河猴iPS细胞的各种阶段，其通过MN-C3抗体表面或MEF上的无血清，无FGF，NME7-AB培养基中的Yamanaka因子或Thomson因子的转导产生。成纤维细胞是否在MN-C2抗体表面或MEF上重编程并不重要，但当表面是抗MUC1*抗体表面时产生更多的集落。
[0485] 实例8
[0486] 灵长类物种胚胎干细胞在NME7-AB培养基中增殖并维持。挑取集落后，将它们重新铺在MN-C3抗体涂覆的表面上或MEF上，并可在含有浓度为2nM至32nM的NME7-AB的无血清培养基中无限制地连续传代，其中4nM效果最佳。参见图43A-43E、图44A-44F、图45A-45H、图46A-46H、图47A-47G和图48A-48D。
[0487] 本文中所引用的所有参考文献以其整体通过引用并入本文。
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