纤维素酶是一种多组分的酶系，此酶指的是能降解纤维素β-1，4-葡萄糖苷键的一类酶的总称，因此，纤维素酶又有纤维素酶复合物之称，是一个有多种水解酶组成的复杂酶系，主要来自真菌和细菌(高凤菊，李春香，真菌和细菌纤维素酶的研究进展，唐山师范学报)。在细菌的大部分属中都有菌株能降解利用纤维素，从生理学特性上它们可分为三个类群：厌氧发酵型，通常是革兰氏阳性菌、好氧型革兰氏阳性菌、好氧滑动型菌株(Lynd L R，Weimer P J，ZylW.H.V，et al.Microbial cellulose utilization：fundamentals andbiotechnology.Microbiology and Molecular Biology Reviews，2002，66(3).506-557)。能降解天然纤维素的纤维素酶都是复杂的多酶体系，高效分解纤维素需要三种酶的协同作用：①内切葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，简称EG)作用于纤维素分子内部的非结晶区，随即水解β-1，4-糖苷键，将纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；②外切葡聚糖纤维二糖水解酶(exo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91)又称纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，简称CBH)，它含有两种组分：CBH I和CBH II，作用于纤维素线状分子末端，水解β-1，4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子；③β-葡萄糖苷酶(β-1，4-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG)，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子(Tomme P，Warrenraj，Gilkes N R.Cellulosehydrolysis by bacteria and fungi.Adv Microbiol Physiol，，1995，37.1-81)。
好氧细菌的三种纤维素酶是以各自独立的形式分泌到细胞外来水解纤维素的，而厌氧细菌的三种纤维素则联合形成一种纤维小体，结合在细胞壁上对纤维素进行降解(Lynd L R，Weimer P J，Zyl W.H.V，et al.Microbial cellulose utilization：fundamentals and biotechnology.Microbiology and Molecular Biology Reviews，2002，66(3).506-557)。
β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系中的一种，是纤维素降解的限速酶。β-葡萄糖苷酶属于水解酶类，广泛存在于自然界的各种生物体中，从细菌到植物、动物都含有该酶，而且在其中行驶着不同的功能。在微生物(酵母、曲霉菌、木霉菌属及细菌)细胞内，它主要被作为纤维素酶的一种，水解结合于末端、非还原性的β-D-糖苷键，同时释放β-D-葡萄糖和相应的配基(王华夫、游小青，茶叶中β-葡萄糖苷酶活性的测定[J].中国茶叶，1996(3).16-17)。在纤维素的糖化作用中，β-葡萄糖苷酶功能是将纤维素二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖。β-葡萄糖苷酶的水解和糖化作用都能在工业生产中应用。但在纤维素组分中，β-葡萄糖苷酶含量少、活力低，成为纤维素降解的瓶颈(邵金辉，韩金祥，朱有名、吴围屏、吴坚美，β-葡萄糖苷酶在工农医领域的应用.生物化学，2005，25(1).22-24)。同时BGL在纤维素酶制剂中，酶蛋白含量最少，只占1％左右。
β-葡萄糖苷酶一个主要的应用就是用于纤维素降解。纤维素是葡萄糖以1，4糖苷键结合的聚合物，为细胞壁的构成成分，占植物干重的1/2-1/3，全球一年内由光合作用产生的纤维素达1000亿吨，是最丰富的可再生资源(潘利华，罗建平，β-葡萄糖苷酶的研究及应用进展，食品科学，2006，27(12).803-806)。要是能将纤维素应用于发酵食品工业原料，可以使我们摆脱了对谷物粮食的绝对依赖，缓解世界能源紧缺(许晶，、张永忠、孙艳梅，β-葡萄糖苷酶的研究进展，食品研究与开发，2005，26(6).183-186)。通过基因重组技术构建工程菌，分泌表达高活性β-葡萄糖苷酶对纤维素的有效降解具有重要的意义。
目前对β-葡萄糖苷酶的研究报道多数在好氧性真菌，主要是霉菌方面。近年来，细菌方面虽有研究，但研究非常少。原因有：一、和细菌产的纤维素酶在细胞中的位置有关。二、和细菌胞外酶的分泌量有关。同时由于细菌所产的纤维素酶绝大多数为胞外酶，活力也较低，因此，直接从细菌分泌物中提取纤维素酶基本是可行的(Pierre Beguin et al.Bacterial celluase.Biochemical society Transaction，1992(20).42-46)。但随着基因工程技术的发展，以细菌来生产纤维素酶的可行性日益增加(高凤菊、李春香，真菌和细菌纤维素酶研究进展，唐山师范学报，2005，27(2).7-10)。从环境保护和厌氧发酵等其他方面的应用来说，对细菌的研究尤其是厌氧菌及兼性厌氧菌是非常重要的。随着对厌氧菌及兼性厌氧菌产纤维素酶的研究，将进一步扩宽纤维素的利用范围。因此，从细菌中，尤其是从厌氧菌及兼性厌氧菌提取纤维素酶将可能并以其高效性而成为提取纤维素酶的一个重要方向。

本发明涉及一种新的编码β-葡萄糖苷酶的基因bgl(SEQ ID NO.1)，其是从本室保存的一株厌氧菌株Clostridium.sp WGC702的基因组文库中分离得到。该菌株文库的一个阳性克隆外源DNA(SEQ ID NO.1)由1344bp个碱基组成，含有完整的β-葡萄糖苷酶基因bgl的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，bgl基因的起始密码为ATG，终止密码子为TAG。
SEQ ID NO.2的蛋白质是基因bgl编码的β-葡萄糖苷酶产物BGL，由448个氨基酸组成，自N端的第2-446位氨基酸为家族1糖基水解酶(glycosylhydrolase)功能域，和bgl催化功能域同源性最高的为梭菌(Clostridium.celerecrescens AJ295659)的假设蛋白的催化功能域(e-值为0.0)，两者的相似性为84％。
基因bgl在大肠杆菌中表达的重组产物BGL能降解纤维素。
本发明还涉及含有本发明基因的表达载体，及用于转化本发明基因的宿主。
本发明提供了一种新的β-葡萄糖苷酶基因，该基因所编码的β-葡萄糖苷酶在纤维素的降解中具有广泛的用途。

下述实施方法是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。
在本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌(Escherichia coli)株系Tuner(DE3)、DH5α和表达载体pET-blue2(属购自Novagen公司的蛋白质表达与纯化试剂盒的组分)；克隆载体为购自Promega公司的克隆载体pGEM3zf(+)；购自Quigen公司的DNA纯化回收试剂盒，购自Promega、MBI的限制性内切酶、去磷酸化酶等试剂。
下面通过实施例对本发明作详细描述：
1)构建Clostridium.sp WGC702的基因组文库
提取Clostridium.sp WGC702的总DNA，分别用不同的限制性核酸内切酶(BamHI，HindIIII，EcoRI，PstI)酶切总DNA，酶切反应体系为：酶10u，总DNA 50ng，buffer 2uL，无菌水补至总体积为20uL。酶切条件为37℃水浴下反应3h，反应完全后，取10uL电泳检测其酶切的效果，选择不能将DNA片段消化为太小片段(大部分为3kb以下)的酶为最合适的酶，再选择合适的酶切体系以及酶切时间。最后发现用BamHI酶切后的DNA产物大小大部分在4-10Kb左右，所以选择BamHI酶作为构建文库用酶。
用BamHI不完全酶切总DNA，酶切体系为：酶20U；总DNA 1ug；buffer 30uL；最后用水补加至总体积300uL，反应体系在37℃水浴下反应1h，电泳，胶回收2-10Kb的酶切片段作为构建文库的外源DNA。
BamHI酶切pGEM-3zf(+)载体，再去磷酸化处理，处理条件为：0.5ug的载体DNA，加入10U的去磷酸化酶，buffer为5uL，加水至终体积为50uL，37℃水浴中反应1h 30min。反应完后，产物用pure-cycle kit PCR纯化柱进行纯化(去掉里面的杂质和酶)，再根据载体∶外源＝1∶4～1∶10的体系做连接反应，反应体系中含载体DNA 100ng，外源DNA 17ng，T4DNA连接酶0.1～1U，加水使终体积为10μl，于16℃下连接过夜。将连接产物纯化后，取10uL通过电转化转入到E.coli DH5α中，涂布于X-gal和IPTG以及含有氨卞青霉素的LA平板上进行蓝白筛选板37℃恒温箱中培养过夜，然后挑取白色重组子点七叶苷筛选板，37℃恒温箱中培养过夜后，挑取能够在七叶苷板上生成黑色水解圈的克隆，本发明只涉及其中一个克隆，命名为p-bgl，进一步将该克隆接种到液体LB培养基中，37℃摇床培养过夜后提取质粒。用BamHI酶切该阳性克隆的质粒，电泳检测酶切结果，经过BamHI酶切后，得到的是约为3.5Kb BamHI外源片段。
2)β-葡萄糖苷酶bgl序列的测定和序列分析
将p-bgl送交上海生工生物工程公司测定DNA核苷酸序列。测得的序列用NCBI(National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的软件如ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)，
Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)对DNA序列进行分析。基因bgl的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)由1344bp个碱基组成，含有完整的β-葡萄糖苷酶基因bgl的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，bgl基因的起始密码为ATG，终止密码子为TAG。
3)β-葡萄糖苷酶基因bgl编码的产物BGL的氨基酸序列分析
β-葡萄糖苷酶基因bgl编码一个含448个氨基酸的蛋白质，用DNAStar软件预测该蛋白质的理论分子量大小为53978.6道尔顿。
用简单组件结构研究工具(Simple Modular Architecture Research Tool，SMART，http://smart.embl-heidelberg.de)分析BGL的组件结构，结果是该氨基酸序列无明显信号肽，自N端的第2-446位氨基酸为家族1糖基水解酶(glycosyl hydrolase)功能域。
4)β-葡萄糖苷酶基因bgl的克隆和表达
使用上游引物5’-CAGGATCCGATGGGACAGAGACAGTTTC-3’下游引物5’-CGAAGCTTGTATACCGCATTCTGCTC-3’，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增β-葡萄糖苷酶基因bgl，反应条件为95℃4min，95℃40sec；55℃55sec；72℃2min30sec；总共30个循环，72℃5min30sec。用限制性内切酶BamHI和HindIII酶切β-葡萄糖苷酶基因bgl后，与经BamHI和HindIII酶切的表达载体pET-blue2进行连接。再将连接产物通过CaCl2法转化到大肠杆菌Tuner(DE3)中，涂布到含氨苄青霉素(100μg/mL)的LA平板上筛选克隆。进一步提取该克隆的质粒DNA并将其命名为pET-bgl，用限制性内切酶HindIII和BamHI酶切pET-bgl后，进行0.7％琼脂糖凝胶电泳分析，结果pET-bgl含有一个1.3kb左右的DNA外源片段。
将含有质粒pET-bgl的重组大肠杆菌Tuner(DE3)接种到20mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中，37℃振荡培养，待OD600为0.4时，加入IPTG使其终浓度为0.5mmol/L，37℃诱导4小时。11000转/分钟离心3分钟，收集菌体，用4mL pH7.0100mmol/L的磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破胞9分钟。12000转/分钟离心10分钟，上清即为含有的β-葡萄糖苷酶BGL粗酶液。
5)β-葡萄糖苷酶BGL酶活的测定
①吸取0.2ml酶液加入到2ml pH值为4.8的0.2mol·L-1Na2HPO4-0.1mol·L-1柠檬酸缓冲液中，与2ml 5mM PNPG溶液同时置于50℃水浴保温10min；
②将上述二者混合，50℃水浴精确保温10min；
③加入2ml 1M的Na2CO3终止酶反应，室温静置5min；
④根据对硝基苯酚标准曲线计算产物浓度。
酶活力单位定义：每min酶液水解PNPG生成1μmol对硝基苯酚的酶活力为一个酶活单位U。

序列表
<110>广西大学
<120>一种编码β-葡萄糖苷酶的基因及其应用
<160>2
<170>PatentIn Version 3.3
<210>1
<211>1344
<212>DNA
<213>梭菌属(Clostridium.sp)
<220>
<221>gene
<222>(1)...(1344)
<223>
<400>1
atgggacaga gacagtttcc ggaaggcttt gcatgggggg cggctactgc gtcataccag     60
attgaaggcg cttgggatga agacggaaga ggagaaacga tatgggacag gtattgccag    120
gttcccggta atgttttaaa tggagatgat ggaaaaatag catgtgacca ttatcacaga    180
tacaaagagg atgtagctct gatgaagcgt atgggaatca aggcttaccg gttctccatt    240
gcctggtcca ggatttttcc aaagggatat ggggaagtca atgaaaaggg gcttgaattt    300
tacagccgtc ttattgatga acttctggat gcgggaatcg aaccgtatat cacgttatac    360
cactgggatc ttcctcaggc cctgcaggat ataggcggat gggccaatcc ccagatgccg    420
gaatattttt tggaatacgc aaaggttgtt atagatgcat ttcatggcaa ggtgaagaaa    480
tggatcacat taaatgaacc ttattgcgct gcgtttctag gcaattccga ggggcgtcag    540
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cacggtcttg cagtggatta tttccgtaaa aaaggctgtg acggggaaat tggaattacc    660
ttaaacctga tgggaaggct tcctcttacg ggtaagccag aggatataca ggcagcagcc    720
agggcagatg ggtatttaaa ccgctggttt gctgagccta ttgtgtacgg cagatatcca    780
caggaaatgt tggagtttta ccgttccaaa ggtgtaagac ttccggaatt taaagaggag    840
cacatgaagc tcattggaca gaagctggat ttcatcggcc tgaattatta caatgacttt    900
catgtgaagg cggatgacag cgtatggcct cttgggttta agatagagaa tcccaaatac    960
gttcccgtca atgacaggaa ctggccggta acagagcaag gcctggtaac gatgctttta   1020
cggatgaaga atgagtatgg aatagacaag atctacataa cggaaaatgg cacttccttc   1080
ccggatgtgg tttccatgga aggaaaagta gaagacggcg caaggaagga ttatctccac   1140
aggcatttaa cagcactttg ggaggccatt tcccagggag ttaatgttca gggatatttt   1200
cagtggtctt tgtatgacaa ttttgagtgg tcattcggat atagcagccg tttcggaatc   1260
gtattcgtgg acttcaatac ccaggaaaga attattaagg aaagcggaca ctggtattca   1320
aatgtaattg agcagaatgc ggta                                        1344
<210>2
<211>448
<212>PRT
<213>梭菌属(Clostridium.sp)
<400>2
Met Gly Gln Arg Gln Phe Pro Glu Gly Phe Ala Trp Gly Ala Ala
1               5                   10                  15
Thr Ala Ser Tyr Gln Ile Glu Gly Ala Trp Asp Glu Asp Gly Arg
16              20                  25                  30
Gly Glu Thr Ile Trp Asp Arg Tyr Cys Gln Val Pro Gly Asn Val
31              35                  40                  45
Leu Asn Gly Asp Asp Gly Lys Ile Ala Cys Asp His Tyr His Arg
46              50                  55                  60
Tyr Lys Glu Asp Val Ala Leu Met Lys Arg Met Gly Ile Lys Ala
61              65                  70                  75
Tyr Arg Phe Ser Ile Ala Trp Ser Arg Ile Phe Pro Lys Gly Tyr
76              80                  85                  90
Gly Glu Val Asn Glu Lys Gly Leu Glu Phe Tyr Ser Arg Leu Ile
91              95                  100                 105
Asp Glu Leu Leu Asp Ala Gly Ile Glu Pro Tyr Ile Thr Leu Tyr
106             110                 115                 120
His Trp Asp Leu Pro Gln Ala Leu Gln Asp Ile Gly Gly Trp Ala
121             125                 130                 135
Asn Pro Gln Met Pro Glu Tyr Phe Leu Glu Tyr Ala Lys Val Val
136             140                 145                 150
Ile Asp Ala Phe His Gly Lys Val Lys Lys Trp Ile Thr Leu Asn
151             155                 160                 165
Glu Pro Tyr Cys Ala Ala Phe Leu Gly Asn Ser Glu Gly Arg Gln
166             170                 175                 180
Ala Pro Gly Ile Arg Asp Phe Ser Thr Ala Val Gln Val Ser Tyr
181             185                 190                 195
Tyr Leu Tyr Val Gly His Gly Leu Ala Val Asp Tyr Phe Arg Lys
196             200                 205                 210
Lys Gly Cys Asp Gly Glu Ile Gly Ile Thr Leu Asn Leu Met Gly
211             215                 220                 225
Arg Leu Pro Leu Thr Gly Lys Pro Glu Asp Ile Gln Ala Ala Ala
226             230                 235                 240
Arg Ala Asp Gly Tyr Leu Asn Arg Trp Phe Ala Glu Pro Ile Val
241             245                 250                 255
Tyr Gly Arg Tyr Pro Gln Glu Met Leu Glu Phe Tyr Arg Ser Lys
256             260                 265                 270
Gly Val Arg Leu Pro Glu Phe Lys Glu Glu His Met Lys Leu Ile
271             275                 280                 285
Gly Gln Lys Leu Asp Phe Ile Gly Leu Asn Tyr Tyr Asn Asp Phe
286             290                 295                 300
His Val Lys Ala Asp Asp Ser Val Trp Pro Leu Gly Phe Lys Ile
301             305                 310                 315
Glu Asn Pro Lys Tyr Val Pro Val Asn Asp Arg Asn Trp Pro Val
316             320                 325                 330
Thr Glu Gln Gly Leu Val Thr Met Leu Leu Arg Met Lys Asn Glu
331             335                 340                 345
Tyr Gly Ile Asp Lys Ile Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Thr Ser Phe
346             350                 355                 360
Pro Asp Val Val Ser Met Glu Gly Lys Val Glu Asp Gly Ala Arg
361             365                 370                 375
Lys Asp Tyr Leu His Arg His Leu Thr Ala Leu Trp Glu Ala Ile
376             380                 385                 390
Ser Gln Gly Val Asn Val Gln Gly Tyr Phe Gln Trp Ser Leu Tyr
391             395                 400                 405
Asp Asn Phe Glu Trp Ser Phe Gly Tyr Ser Ser Arg Phe Gly Ile
406             410                 415                 420
Val Phe Val Asp Phe Asn Thr Gln Glu Arg Ile Ile Lys Glu Ser
421             425                 430                 435
Gly His Trp Tyr Ser Asn Val Ile Glu Gln Asn Ala Val
436             440                 445         448