技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，具体涉及一种大肠癌HK2报告基因细胞系及其建立方法。
背景技术
[0002] 细胞生存所需要的
能量主要来自
细胞质的糖酵解和线粒体的有
氧氧化。上世纪20年代德国生物学家Otto Warburg发现
肿瘤细胞在有氧条件下却会利用
葡萄糖进行糖酵解并产生乳酸，这就是著名的Warbrg效应，肿瘤细胞异常的能量代谢研究为肿瘤的
治疗提供了一种新的思路。Gillies RJ等人的研究结果显示，在正常组织中细胞合成总ATP的10％由糖酵解途径提供，线粒体提供其余90％的能量，而在肿瘤细胞中糖酵解途径提供的能量占50％-70％，另外的能量来自于线粒体(Cancer and Metastasis Reviews，2007.26(2):
311-317.2)。现有研究已证明，己糖激酶是糖酵解途径中的首个限速的关键酶，在肿瘤细胞中主要是己糖激酶2型(Hexokinase 2，HK2)表达，并且是过度表达。HK2基因编码917个
氨基酸，分子量为102380 Da,在
哺乳动物中高度保守，有研究表明，HK2在肿瘤细胞通过抑制细胞凋亡而促进肿瘤细胞的生长与增值的过程中扮演着重要
角色，多种肿瘤癌基因和抑癌基因共同调控着HK2的转录和表达。Wolf A等人证实了HK2在胶质母细胞瘤中过度表达，敲除HK2基因后细胞的有氧糖酵解途径会被抑制，而氧化磷
酸化途径的代谢会增强，因而肿瘤细胞中HK2表达增高及HK2与VDAC结合的特性是肿瘤细胞Warburg效应的主要原因之一(The Journal of experimental medicine，2011.208(2):313-326)。因而HK2被认为是肿瘤治疗的重要分子靶点来进行药物的设计和筛选。
[0003] 报告基因是分子生物学研究领域中一种重要的工具，经常被用做标记所要研究的目标基因，使得报告基因的表达
水平与目标基因的表达水平相一致，从而可以通过对报告基因的表达来观察目标基因的表达调控。报告基因具有便捷、可靠、灵敏度高和高通量检测等优点。目前常用到的报告基因有β-半乳糖苷酶、
荧光素酶和荧光蛋白等。作为无毒无害的检测工具，荧光素酶和荧光蛋白在检测细胞基因表达方面占据着主导地位。
[0004] CRISPR-Cas是一种细菌及古细菌的成簇规律间隔短回文重复序列组成的适应性免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵。Cas蛋白有若干种，具有内切核酸酶活性。CRISPR-Cas系统拥有三种类别，其中CRISPR-Cas9是目前研究最深入、应用最成熟的一种类别；其具有操作简便，作用位点选择灵活性强，活性高等优势。在人为设计的sgRNA的指导下，表达的具有核酸内切酶活性的Cas蛋白会向基因靶点
位置移动，最终结合于基因靶点处发挥作用，当细胞基因组完整性被Cas蛋白酶破坏，细胞自身的自我修复系统便会被激活，在带有基因组同源
片段的外源目标基因存在的情况下，细胞则会以一定概率的同源重组方式对自身基因组进行修复，从而实现外源基因的插入。
[0005] 然而，目前尚没有建立大肠癌HK2报告基因的稳定细胞系的快速且高效的构建方法，本研究着手于大肠癌HK2报告基因领域，利用CRISPR-Cas9技术构建了带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的大肠癌HK2报告基因的细胞系，为HK2基因及其
信号通路的研究、相关
疾病致病机理的研究、药物筛选与评价工作提供了有利工具。
发明内容
[0006] 本发明的目的之一在于提供一种大肠癌HK2报告基因细胞系，其特征在于，所述细胞系的HK2基因与下游报告基因通过2A肽连接实现共表达。
[0007] 优选地，所述大肠癌细胞为HCT116、Caco-2、SW480、SW620、LOVO、HT29或DLD-1，进一步优选为HCT116。
[0008] 优选地，所述报告基因为GFP、EGFP、Luciferase或RFP。
[0009] 本发明的目的之二在于提供了一种建立大肠癌HK2报告基因细胞系的方法，包括以下步骤：
[0010] 步骤1：HK2基因下游位点特异性HK2-sgRNA序列设计及评估；
[0011] 步骤2：构建pX459/HK2-sgRNA质粒；
[0012] 步骤3：整合HK2基因的同源重组序列和EGFP片段；
[0013] 步骤4：将上述质粒pX459/HK2-sgRNA和绿色荧光蛋白整合片段按1:1的比例共同电击转化大肠癌细胞系HCT116；
[0014] 步骤5：通过流式细胞仪单细胞筛选EGFP表达的细胞，并扩增单克隆细胞系；
[0015] 步骤6：筛选获得的EGFP表达的细胞系进一步通过基因组PCR及免疫印迹方法鉴定HK2报告基因细胞系。
[0016] 优选地，步骤1中，设计并筛选出至少两组HK2-sgRNA序列，HK2-sgRNA1和HK2-sgRNA2，所述HK2-sgRNA1的序列如SEQ ID NO：1所示，所述HK2-sgRNA2的序列如SEQ ID NO：2所示。
[0017] 优选地，步骤2中，构建pX459/HK2-sgRNA质粒的方法如下：根据所述HK2-sgRNA1或所述HK2-sgRNA2的序列，经生物公司合成后直接获得正确的sgRNA序列的质粒pX459/HK2-sgRNA1或pX459/HK2-sgRNA2。
[0018] 优选地，步骤3中，整合HK2基因的同源重组序列和EGFP片段的方法如下：根据HK2基因的同源重组序列和EGFP序列，经生物公司合成后直接获得正确的整合片段L-EGFP-R。
[0019] 优选地，所述片段L-EGFP-R的序列如SEQ ID NO.3所示。
[0020] 本发明的目的之三在于提供了一种所述大肠癌HK2报告基因细胞系在肿瘤细胞发生、发展或能量代谢研究中的应用。
[0021] 优选地，所述肿瘤为大肠癌。
[0022] 本发明的目的之四在于提供了一种所述大肠癌HK2报告基因细胞系在细胞模型中的应用。
[0023] 优选地，所述细胞模型为肿瘤细胞模型，进一步优选为大肠癌细胞模型。
[0024] 本发明的目的之五在于提供了一种所述大肠癌HK2报告基因细胞系在研究HK2基因中的应用。
[0025] 本发明的目的之六在于提供了一种所述大肠癌HK2报告基因细胞系在筛选调控HK2基因变化的分子或药物中的应用。
[0026] 优选地，所述药物为抗癌药物。
[0027] 在符合本领域常识的
基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
[0028] 非另有具体的说明，本发明中所使用的技术和科学术语具有与本领域的技术人员所理解的意义相同。本发明中使用的命名法和描述的实验方法是广泛所知的，并在本领域中常用到的。
[0029] 与
现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0030] (1)本发明经过层层筛选确定能够高效地靶向结合目标位点的HK2-sgRNA，并直接将构建好的质粒pX459/HK2-sgRNA与EGFP整合片段按一定比例共同电击转化大肠癌细胞系HCT116中，确保了可以后续快速检测具EGFP表达的大肠癌HK2报告基因细胞及建立稳定细胞系的目的。
[0031] (2)本发明所述方法简单易行且高效，通过精心设计筛选的报告基因插入位点，利用sgRNA精准
定位基因位点快速获得目标基因插入的稳定细胞系，具有耗时少、成功率高的优点。结果显示，EGFP敲进效率达到7-8％，本实验每96孔板可筛选7-10株，比本领域通常1％的敲进效率有显著提高，而且该细胞系稳定传代30代后测序显示，基因敲进序列依然保持遗传稳定。
[0032] (3)HK2基因与报告基因EGFP通过自剪切肽2A肽连接，构建为一个操纵子，通过2A肽的自我剪切功能保证了HK2基因与EGFP的在细胞中能够共表达，互不干扰，实现了报告基因对HK2基因的示踪作用。
[0033] (4)本发明所述细胞系可进行实时监测，简易直观，将大大促进相关药物代谢评价及相关基因功能的研究，极具临床推广潜
力和应用价值。
附图说明
[0034] 图1为绿色荧光蛋白靶基因敲入机理示意图。
[0035] 图2为流式细胞仪筛选绿色荧光蛋白表达的单细胞克隆。
[0036] 图3为筛选获得的阳性HK2报告基因细胞系表达绿色荧光蛋白。
[0037] 图4为PCR鉴定HK2报告基因细胞系。
[0038] 图5为免疫印迹法鉴定HK2报告基因细胞系。
[0039] 图6为shRNA抑制HK2与EGFP的表达。
[0040] 图7为2-MeOE2对HK2和EGFP的表达抑制。
具体实施方式
[0041] 以下通过具体
实施例对本发明作进一步详细说明，以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施，但实施例并不作为本发明的限定。
[0042] 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、
试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043] 实施例1大肠癌HK2报告基因细胞系的建立
[0044] 步骤1：设计合适的HK2-sgRNA序列，并进行评估：
[0045] 通过筛选和评估，得到两段sgRNA序列，分别为：
[0046] HK2-sgRNA1：TAGAACCCCTGAAATCGGAA(chr2:74890939-74890958)，如SEQ ID NO.1所示。
[0047] HK2-sgRNA2：TGTGTCAGAGACAGACCCCT(chr2:74891015-74891034)，如SEQ ID NO.2所示。
[0048] 步骤2：构建pX459-sgRNA质粒，包括以下步骤：
[0049] 根据HK2-sgRNA1或HK2-sgRNA2的序列，经生物公司合成后直接获得正确的sgRNA序列的质粒pX459/HK2-sgRNA1或pX459/HK2-sgRNA2。
[0050] 步骤3：整合L-EGFP-R片段，包括以下步骤：
[0051] 根据HK2基因的同源臂和EGFP序列，经生物公司合成后直接获得正确的整合片段L-EGFP-R，序列如SEQ ID NO.3所示；构建流程如附图1所示。
[0052] 步骤4：筛选具绿色荧光的大肠癌HK2报告基因细胞系，包括以下步骤：
[0053] 将上述质粒pX459/HK2-sgRNA和绿色荧光蛋白整合片段L-EGFP-R按1:1的比例共同电击转化大肠癌细胞系HCT116；
[0054] 先用96孔板在流式细胞仪单细胞筛选(见图2)，每个96孔板可获得7-10个具有EGFP表达的细胞株，EGFP敲进效率达到7-8％，比本领域通常1％的敲进效率有显著提高。
[0055] 扩增培养挑选的单克隆细胞系(见图3)，提取并获得具有EGFP表达的细胞的基因组DNA，进行基因组PCR，获得阳性扩增说明插入成功，为HK2报告基因细胞系。PCR鉴定引物序列如下所示：
[0056] 正向引物F-GT：GAGTCCTGGTCCTGGTCTCCC，如SEQ ID NO.4所示；
[0057] 反向引物R-GT：CCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGC，如SEQ ID NO.5所示。
[0058] 野生型细胞同样进行基因组PCR，PCR鉴定引物序列如下所示：
[0059] 正向引物F-WT：GAGTCCTGGTCCTGGTCTCCC，如SEQ ID NO.6所示；
[0060] 反向引物R-WT：GGAGAACCAATGGGAATGGTTATGATGC，如SEQ ID NO.7所示。
[0061] 通过PCR鉴定比对结果如图4所示，获得了4株HK2报告基因细胞系；
[0062] 最后再将筛选获得的EGFP表达的细胞通过免疫印迹方法进一步鉴定阳性HK2基因报告细胞系，鉴定结果如图5所示，最终获得了4株HK2报告基因细胞系。
[0063] HK2报告基因细胞系稳定传代30代后，测序显示，基因敲进序列依然保持遗传稳定。
[0064] 实施例2大肠癌HK2报告基因细胞系的功能验证
[0065] 设计3条不同的特异靶向HK2基因小分子干扰RNA，如图6所示shRAN-1、shRAN-2、shRAN-3，分别
转染HK2报告细胞系，72小时后，转录水平分析显示相对于未敲减对照，三条特异小分子干扰RNA均有效降低HK2基因表达水平(大约敲减掉了70-80％)；同时EGFP基因表达也随着HK2基因敲减而相应的降低了70-80％。该实验结果从分子水平证明了本发明构建的大肠癌HK2报告基因细胞系中报告基因EGFP与HK2基因能够同步共表达，受到shRNA同步抑制，可以用于HK2基因的抑制或过表达的示踪。
[0066] 实施例3药物筛选及评价验证
[0067] 2-Methoxyestradiol(2-MeOE2)是HIF
抑制剂，目前已经进入抗肿瘤临床二期试验阶段。利用该抑制剂处理HK2细胞系，结果发现EGFP与HK2的表达共同受到抑制，见图7。HK2细胞系在2-MeOE2(10uM)处理24h,48h后，分析HK2和EGFP转录水平与未处理作为对照的相对表达变化，结果显示HK2表达水平受到明显抑制，同样EGFP的表达也受到协同抑制；该实验结果进一步证明了，本发明构建大肠癌HK2报告基因细胞系可以用来筛选及评价相关抗癌药物。
[0068] 最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行
修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0069]
[0070]
[0071]
[0072]
