SC
一种检测朊病毒蛋白(PrP )的方法和试剂盒
技术领域
[0001] 本
发明涉及朊病毒蛋白的分子
生物学纯化与检测技术，具体地说是通过表达重组SCG5P蛋白对朊病毒蛋白高度分离纯化富集，然后利用免疫印迹法检测朊病毒蛋白(PrP )。
背景技术
[0002] 朊病毒(prion)是由朊蛋白异常折叠形成的一种对理化作用抵抗
力极强，并具有SC传染性的
蛋白质颗粒，这种异常折叠朊蛋白(PrP )为蛋白质侵染因子，属于小分子疏
水性蛋白质，可侵染动物并在宿主细胞内复制，引起
哺乳动物和人的中枢神经系统病变如海绵SC
状脑病(疯
牛病)，临床诊断传染性海绵状脑炎(TSE)的确切指标是检测PrP 蛋白为阳性。
[0003] 免疫学方法目前已成为检测朊病毒蛋白的主要方法，例如组织印迹、斑点印迹、免疫印迹、免疫组化、ELISA等。但最重要也是最关键的环节是需要对样品蛋白进行适当的分SC离纯化及富集，才能提高检出率并排除
假阳性。目前，有关PrP 的分离纯化及抽提检测方SC
法有两大类型：一类是利用PrP 区别与其他蛋白的特殊理化性质完成富集或贫化过程，另SC
一类是利用特定的蛋白质间相互作用对PrP 加以捕获。例如：前者最初由Diringer提出SC
的1%sarco syl提取法，需用去垢剂来提取组织匀浆，配以高差速离心浓缩PrP ；后来建立的有利用离子交换层析纯化法(奥克塔法
马有限公司，
专利名称：分离和纯化靶蛋白使SC
其不含PrP 的方法，公开(公告)号：CN101842121A)，还有混合
有机溶剂提取法(ALPERT ANDREW J，SCHMERR MARYJO，
发明名称：Method and kit forextracting prion protein，公开(公告)号：HK1044588A1)以及多离子原料结合法(MICROSENS BIOPHAGE LTD，发明名称：
BINDING OF PATHOLOGICAL FORMS OFPRION PROTEINS，公开(公告)号：US2010184054A1)。
SC
而近几年国外针对PrP 的生物特性利用肽类或蛋白类对其富集检测亦建立了不同的方法，如配体法(NOVARTISVACCINES & DIAGNOSTIC，发明名称：Prion-specific peptide reagents，公开(公告)号：AU2009225337A1；PATHOGEN REMOVAL AND DIAGNOSTI，UNIV NORTHCAROLINA STATE，发明名称：Prion protein ligands and methods of use，公开(公 告) 号：AU2010201499A1)，结 合 法(PATHOGEN REMOVAL AND DIAGNOSTI，UNIV NORTHCAROLINA STATE，发明名称：PRION PROTEIN BINDING MATERIALS ANDMETHODS OF USE，公开(公告)号：KR20070117533A)，鸡尾酒法(US AGRICULTURE，发明名称：MONOCLONAL ANTIBODIES AND ANTIBODY COCKTAIL FORDETECTION OF PRION PROTEIN AS AN INDICATION OF TRANSMISSIBLESPONGIFORM ENCEPHALOPATHIES，公开(公告)号：BG106415A)等等，上SC
述各种利用生物蛋白相互作用建立的PrP 检测方法能够有效提高蛋白检测特异性，或可通过减少杂蛋白增强检测灵敏度。
[0004] 近年研究发现，丝状
噬菌体gV基因表达的pV蛋白能与PrPSC蛋白特异结合，而与正常的PrP的结合能力低(Jin-Der Wen，et al．Selection of genomic sequences that bindtightly to Ff gene 5protein：primer-free genomic．Nucleic Acids Research，2004，32(22)：e182；Wen Quan Zou，et al．Antibody to DNA detects scrapie but not normal prionprotein．PANS，2003，101(5)：1380-1385)。本发明拟利用丝状噬菌体gV基SC
因序列通过基因克隆高表达G5P蛋白，并将G5P偶联于固体介质上，利用G5P与PrP 高特SC
异性结合，以及正常PrP可被蛋白酶
水解而PrP 具有蛋白酶抗性的特性，对待测样品中的SC SC
PrP 蛋白进行分离纯化富集，洗脱后免疫印迹检测，建立一种有效针对样本PrP 的纯化富集或贫化的方法。
发明内容
[0005] 本发明的目的是：提供一种分离纯化富集PrPSC的方法及其检测试剂盒，即通过制SC SC备特异识别并富集PrP 的重组G5P蛋白，对生物样品中的PrP 进行纯化富集，洗脱后进行免疫检测。本发明的目的可以通过下述技术方案来达到。
[0006] 一种检测朊病毒蛋白(PrPSC)的方法，包括以下步骤：
[0007] 步骤一：将待测样本经10μM蛋白酶K消化，使样本中正常的PrP被水解，而PrPSC因其蛋白酶抗性不被水解，以消除正常PrP的影响；
[0008] 步骤二：将步骤一处理后的待测样本流经饱和偶联能与朊病毒蛋白(PrPSC)特异+识别并结合的重组G5P蛋白的Ni-NTA
树脂，利用重组G5P蛋白捕获待测样本中的朊病毒SC SC
蛋白(PrP )，所述的能与朊病毒蛋白(PrP )特异识别并结合的重组G5P蛋白是由
序列表中序列1基因编码表达的；
[0009] 步骤三：用洗脱缓冲液对经过步骤二后的饱和偶联能与朊病毒蛋白(PrPSC)特异+识别并结合的重组G5P蛋白的Ni-NTA树脂进行洗脱，收集洗脱液，所述的洗脱缓冲液体系的组成及浓度为：20mmol/L Tris-Cl，150mmol/LNaCl，500mmol/L咪唑，该洗脱缓冲液的pH为7.0；
[0010] 步骤四：用以下方法检测步骤三收集到的洗脱液中的朊病毒蛋白(PrPSC)：
[0011] (a)洗脱的PrPSC的为不溶性蛋白，量多则可见白色沉淀；或
[0012] (b)洗脱后凝胶
电泳经考马斯亮蓝
染色出现明显条带即为PrPSC；或[0013] (c)利用PrPSC单克隆
抗体进行PrPSC的Western blot检测。
[0014] 一种用于检测朊病毒蛋白(PrPSC)的试剂盒，包括：
[0015] (a)朊病毒蛋白(PrPSC)的富集洗脱体系：即饱和偶联能与朊病毒蛋白(PrPSC)+特异识别并结合的重组G5P蛋白的Ni-NTA树脂和洗脱缓冲液，所述的能与朊病毒蛋白SC
(PrP )特异识别并结合的重组G5P蛋白是由序列表中序列1基因编码表达的；所述的洗脱缓冲液体系的组成及浓度为：20mmol/L Tris-Cl，150mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，该洗脱缓冲液的pH为7.0；
[0016] (b)蛋白酶K，用于样本处理；
[0017] (c)PrPSC单克隆抗体，用于洗脱的朊病毒蛋白(PrPSC)免疫印迹检测；
[0019] 一种重组表达载体，其特征在于它与序列表中序列1所示的能与朊病毒蛋白SC(PrP )特异识别并结合的重组G5P蛋白的编码基因形成重组子可融合表达其所含的His-Tag标签，该载体为pET-28a(+)质粒。
[0020] 一种能与朊病毒蛋白(PrPSC)特异识别并结合的重组G5P蛋白的克隆表达方法，包括以下步骤：
[0021] 步骤1、G5P重组子的构建：
[0022] (1)参照GeneBank(Accession No.J02450)上G5P
氨基酸序列对应的基因序列，根据大肠杆菌BL21(DE3)密码子偏爱性设计出序列表中序列1所示的重组G5P蛋白表达基因；
[0023] (2)通过DNASTAR比对，用引物设计
软件设计合成序列表中序列1所示基因的8段引物，并在两端引入同pET-28a(+)质粒一样含有的EcoR I和Xho I酶切位点，以便酶切连接。8段引物如下：
[0024] Pr1:CGGAATTCATGATTAAAGTTGAAATT
[0025] Pr2:GAAACACCAGAACGGGTGGTGAACTGCGCCTGAGACGGTTTAATTTCAACTTTAATCAT[0026] Pr3:CACCCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAACCGTATTCAGTGAATGAGCAGCTGTGTT[0027] Pr4:AATCTTGACCAGCACCGGATACTGATTACCCAGATCAACGTAACACAGCTGCTCATTCA[0028] Pr5:CCGGTGCTGGTCAAGATTACCCTGGATGAAGGTCAGCCGGCCTATGCGCCGGGTCTGTA[0029] Pr6:AACCGAACTGACCAACTTTGAACGAGGACAGATGAACGGTGTACAGACCCGGCGCATAG[0030] Pr7:AAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTGATGATTGATCGTCTGCGCCTGGTTCCGGCGAAATAA[0031] Pr8:ATCTCGAGTTATTTCGCCGGAACCAG
[0032] 其中Pr1的划线部分是EcoR I酶切位点，Pr8的划线部分是Xho I酶切位点。
[0033] (3)利用重叠延伸PCR合成目的基因序列，并PCR扩增目的基因；
[0034] 重叠延伸PCR反应体系：
[0035]
[0036] PCR扩增目的基因的条件：
[0037]
[0038] (4)分 别 用Xho I 和EcoR I于37 ℃ 水 浴 双 酶 切 目 的 基 因 和 质 粒pET-28a(+)-c(+)4h，各自回收后，将两者用T4 DNA连接酶于16℃连接反应10h，得到重组子pET-28a(+)-c(+)-G5P，琼脂糖凝胶电泳鉴定；
[0039] 步骤2、G5P重组子的表达：
[0040] (1)将重组子pET-28a(+)-c(+)-G5P转化于E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜；
[0041] (2)取少量上述菌液按1：100比例转接到新鲜LB液体培养基中，于37℃、200r/min摇床培养至OD600=0.6~0.8；
[0042] (3)加入一定量的IPTG(0.2-1.2mM)诱导2-12h；
[0043] (4)将诱导后的菌液
冰浴30min，8000rpm离心20min，4℃，弃上清；
[0044] (5)裂解液(NaH2PO4 20mmol/L，NaCl 0.5mol/L，1%TritonX-100，pH7.4)重悬细菌沉淀，
超声波破碎，4℃，12000rpm离心20min，收集上清液；
[0045] (6)加入终浓度为5ug/ml的DNase和RNase，30℃水浴30min，消除核酸干扰，收集+上清，利用重组G5P蛋白融合表达的His标签与Ni-NTA树脂形成稳定的亲和偶联特性，使+
用Ni-NTA琼脂糖层析柱纯化上清液中相对分子
质量为9.5KD的重组G5P蛋白，并SDS-PAGE分析鉴定。
[0046] 本发明内容涉及有：
[0047] 克隆表达可与PrPSC特异识别并结合的重组G5P蛋白，建立分离纯化和富集生物样SC本中PrP 的方法，该重组蛋白与丝状噬菌体gV基因表达的pV蛋白性质相似，具有特异亲SC
和PrP 的能力，而与正常结构PrP结合力低；
[0048] 重组G5P蛋白的表达基因序列(GeneBank Accession No.J02450)如下：843-5’ATGATTAAAGTTGAAATTAAACCGTCTCAAGCGCAATTTACTACCCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAGCCTTATTCACTGAATGAGCAGCTTTGTTACGTTGATTTGGGTAATGAATATCCGGTGCTTGTCAAGATTACTCTCGACGAAGGTCAGCCAGCGTATGCGCCTGGTCTGTACACCGTGCATCTGTCCTCGTTCAAAGTTGGTCAGTTCGGTTCTCTTATGATTGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTAAGTAA3’-1106；
[0049] 与G5P基因序列重组的载体为含有EcoR I和Xho I酶切位点的pET-28a(+)质粒，宿主细胞为BL21(DE3)，诱导表达的条件为：0.2-1.2mM的IPTG诱导2-12h。表达的重组+G5P蛋白相对分子质量为9.5KD，结构上含有6×His标签，该标签与Ni-NTA树脂形成稳定的亲和偶联，该偶联可被凝血酶水解，酶切缓冲液为20mmol/L Tris-Cl，150mmol/L NaCl，
2.5mmol/LCaCl，PH8.0；
[0050] 待测样本经10μM蛋白酶K处理后，样本中正常的PrP被水解，而PrPSC因其蛋白酶抗性不被水解，消除正常PrP的影响。该处理样本温育或流经偶联树脂时G5P可捕获其SC SC中的PrP ；随后洗脱PrP ，洗脱缓冲液为：20mmol/L Tris-Cl，150mmol/L NaCl，500mmol/LSC
咪唑，PH7.0，获得纯化的PrP ；
[0051] 检测PrPSC方法包括：
[0052] (1)洗脱的PrPSC的为不溶性蛋白，量多则可见白色沉淀；
[0053] (2)洗脱后凝胶电泳经考马斯亮蓝染色出现明显条带即为PrPSC；
[0054] (3)利用PrPSC单克隆抗体进行PrPSC的Western blot检测。
[0055] 形成一种用于检测PrPSC的试剂盒，包括：
[0056] (1)PrPSC的富集洗脱体系，主要为饱和偶联重组G5P的Ni+-NTA树脂；
[0057] (2)蛋白酶K，用于样本处理；
[0058] (3)PrPSC单克隆抗体；
[0059] (4)说明书。
[0060] 本发明方法所涉及的流程为：
[0061] 1、通过基因工程构建G5P重组子
[0062] 2、G5P重组子的表达与诱导优化
[0063] 3、用树脂纯化并偶联重组G5P蛋白
[0064] 4、偶联重组G5P蛋白的树脂对经蛋白酶K处理的蛋白样本温育或层析[0065] 5、洗涤后洗脱靶蛋白，分析重组G5P蛋白和朊蛋白间的结合力
[0066] 6、对洗脱的朊蛋白电泳，染色或Western blot检测
[0067] 本发明通过以下步骤来实现：
[0068] 一、重组G5P的克隆表达与条件优化
[0069] 1、G5P重组子的构建
[0070] (1)参照GeneBank(Accession No.J02450)上G5P氨基酸序列对应的基因序列，根据大肠杆菌BL21(DE3)密码子偏爱性部分
修改基因序列
[0071] (2)通过DNASTAR比对，用引物设计软件设计引物并引入酶切位点
[0072] (3)利用重叠延伸PCR合成目的基因序列，并PCR扩增目的基因
[0073] (4)分 别 用Xho I 和EcoR I于37 ℃ 水 浴 双 酶 切 目 的 基 因 和 质 粒pET-28a(+)-c(+)4h，各自回收后，将两者用T4 DNA连接酶于16℃连接反应10h[0074] 2、G5P重组子的表达
[0075] (1)将重组子pET-28a(+)-c(+)-G5P转化于E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜
[0076] (2)取少量上述菌液按1：100比例转接到新鲜LB液体培养基中，于37℃、200r/min摇床培养至OD600=0.6~0.8
[0077] (3)加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导10h
[0078] (4)收集上清并提取菌体蛋白进行SDS-PAGE电泳鉴定
[0079] 3、优化诱导重组G5P蛋白表达条件
[0080] (1)IPTG浓度：从0.2mmol/L到1.2mmol/L确定最适浓度
[0081] (2)反应时间：从2h到12h确定最适反应时间
[0082] 4、重组G5P蛋白的纯化与偶联
[0083] (1)将诱导后的菌液冰浴30min，8000rpm离心20min，4℃，弃上清[0084] (2)裂解液重悬细菌沉淀，
超声波破碎，4℃，12000rpm离心20min，收集上清液[0085] (3)加入终浓度为5ug/ml的DNase和RNase，30℃水浴30min.，收集上清液[0086] (4)利用Ni+-NTA层析柱纯化并偶联上清液中带有6×His标签的重组G5P[0087] (5)凝血酶酶切24h水解偶联，离心取上清SDS-PAGE分析鉴定G5P
[0088] 二、偶联重组G5P的Ni+-NTA树脂对PrPSC的纯化富集
[0089] 1、生物样本处理
[0090] (1)称取适量兔脑样本、
研磨、离心收集蛋白并定量，以PrP27-30蛋白掺入其中配成浓度为0.5pmol/L、1pmol/L、2pmol/L、3pmol/L、4pmol/L的模拟检测样本[0091] (2)对上述模拟样本以终浓度为10μM蛋白酶K37℃消化1h，1mM的PMSF终止消化，可消化样本中可能存在的正常的朊蛋白
[0092] 2、纯化富集程序
[0093] (1)取1ml上述处理的蛋白样本和50ul的偶联有重组G5P蛋白的Ni+-NTA树脂于1.5mLEP管中震摇2h后8000g离心5min去上清液
[0094] (2)洗涤：EP管加入1ml洗涤Buffer，震摇10min，8000g离心1min，去上清，重复三次
[0095] (3)洗脱：EP管加入50uL洗脱Buffer，充分混匀，10000g 1min收集洗脱液，蛋白定量
[0096] 3、重组G5P与PrPSC蛋白间亲和力测定
[0097] (1)将一定含量的重组G5P与Ni+-NTA树脂偶联，依次加入不同浓度的PrP27-30蛋白，确定最大结合量，根据Seatchard方程计算结合常数Ka1
[0098] (2)同样，将克隆表达带有His标签的重组PrP27-30蛋白与Ni+-NTA树脂偶联固定，次加入不同浓度的被凝血酶
切除His标签的重组G5P蛋白，确定最大结合量，计算结合常数Ka2
[0099] (3)比较Ka1、Ka2，分析G5P与PrPSC间的亲和力
[0100] 三、PrPSC蛋白检测
[0101] 1、对定量后的洗脱液以10%聚丙烯酰胺凝胶电泳1h，
电流20~40mA，
电压60~120V[0102] 2、凝胶室温考马斯亮蓝染色2h左右，室温脱色4-8h，期间更换脱色液3-4次，直至能够区分蛋白条带
[0103] 3、或者对凝胶转膜，利用PrPSC单克隆抗体进行免疫印迹检测即Western blot检测
[0104] 四、PrPSC蛋白阳性结果判断
[0105] 1、如果PrPSC量多，离心后于EP管底可见沉淀物
[0106] 2、电泳后考马斯亮蓝染色相应
位置出现浓集单一蛋白条带
[0107] 3、抗体ECL显影出现唯一条带
附图说明
[0108] 图1重组G5P蛋白的表达及纯化
[0109] 泳道M：蛋白分子量标准；泳道1：未诱导的BL21(DE)-pET-28a-c(+)全菌蛋白；泳道2：未诱导的BL21(DE)-pET-28a-c(+)-G5P全菌蛋白；泳道3：经IPTG诱导的BL21(DE)-pET-28a-c(+)全菌蛋白；泳道4：经IPTG诱导的BL21(DE)-pET-28a-c(+)-G5P全菌蛋白；泳道5：纯化后的重组G5P蛋白
[0110] 图2重组G5P富集PrPSC蛋白后考马斯亮蓝染色
[0111] 泳道0：诱导表达pET-28a-c(+)-G5P全菌蛋白，泳道M：蛋白分子量标准；泳道SC1~7：分别偶联不同浓度G5P对同一浓度的PrP 富集后收集的洗脱液电泳。
[0112] 图3重组G5P蛋白富集PrPSC蛋白后Western blot检测
[0113] 泳道1~5：依次为掺入PrP27-30浓度为0.5，1，2，3，4pmol/L的兔脑样品富集后免疫印迹检测。
[0114] 本发明所具有的优点：
[0115] 该方法结合了PrPSC蛋白酶抗性和与G5P高亲和特性，有效消除正常PrP所致的假阳性，特异性强；蛋白纯化效果好，抗体免疫检测灵敏度高；该方法具有广泛的应用前景和价值。
具体实施方式
[0116] 为进一步详细阐述本发明，下面结合具体
实施例。
[0117] 实施例：
[0118] 材料
[0119] 1、菌株及动物：大肠杆菌BL21(DE3)菌株，DH5α菌株，质粒pET-28a(+)，1.5-2kg新西兰雄性大白兔
[0120] 2、试剂：限制性内切酶Xho I、EcoR I；T4连接酶；1 kbplus DNA Ladder；50bpDNA LadderMarker；DL100；PCR产物纯化试剂盒；DNA凝胶回收试剂盒；质粒小量制备试剂+盒；Pfu DNA聚合酶；中分子量标准蛋白；蛋白胨；
酵母浸提物；Ni-NTA树脂；咪唑；SDS；
IPTG；丙烯酰胺；甲叉双丙烯酰胺；Tris
碱；甘氨酸；考马斯亮蓝G-250；溶菌酶；TEMED；
TritonX-100；蛋白酶K；蛋白G琼脂糖凝胶；Tween-20；辣根过
氧化物酶(HRP)；标记羊抗兔IgG；PDVF膜；NC膜；ECL试剂
[0121] 3、仪器：高速冷冻离心机、自动凝胶成像分析系统、PCR仪、电泳仪、恒温水浴锅、恒温摇床、超净
工作台、生化
培养箱、双垂直电泳槽、脱色摇床、
化学发光成像系统、半湿转膜器
[0122] 方法与结果
[0123] 一：偶联重组G5P蛋白的Ni+-NTA树脂的制备
[0124] 1、G5P重组子的构建
[0125] (1)参照GeneBank上G5P氨基酸序列对应的基因序列，根据大肠杆菌BL21(DE3)密码子偏爱性部分修改基因序列
[0126] (2)通过DNASTAR比对，用引物设计软件设计引物并引入酶切位点
[0127] (3)利用重叠延伸PCR合成目的基因序列，并PCR扩增目的基因
[0128] (4)分别用Xho I和EcoR I于37℃水浴双酶切4h目的基因及 质粒pET-28a(+)-c(+)，各自回收后，将酶切回收的目的基因和质粒用T4 DNA连接酶于16℃进行连接反应10h
[0129] 2、G5P重组子的表达
[0130] (1)将重组子pET-28a(+)-c(+)-G5P转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜
[0131] (2)取少量上述菌液按1：100比例转接到新鲜LB液体培养基中，于37℃、200r/min摇床培养至OD600=0.6~0.8
[0132] (3)在含重组子的菌液中加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导10h
[0133] (4)收集菌体，提取蛋白进行SDS-PAGE电泳检测(图1)
[0134] 3、优化诱导表达重组G5P蛋白的条件
[0135] 诱导剂IPTG浓度从0.2mmo/L到1.2mmo/L诱导2h到12h，结果显示0.8mmol/LIPTG诱导6h表达量最高
[0136] 4、重组G5P蛋白的纯化与偶联
[0137] (1)将诱导后的菌液冰浴30min，8000r/min离心20min，4℃，弃上清[0138] (2) 细 菌 沉 淀 用 裂 解 液 (50mmoL/L Tris-Cl pH8.0，2mmoL/L EDTA，1%TritonX-100)重悬，超声波破碎(工作5s，间歇5s，功率200W，60次)，于4℃，12000r/min离心20min，收集细胞上清液
[0139] (3)加入终浓度为5ug/ml的DNase和RNase，30℃水浴30min
[0140] (4)利用Ni+-NTA亲和层析柱结合带有6×His标签的G5P性质，纯化并偶联上清液中的重组G5P目的蛋白
[0141] (5)重组G5P蛋白的鉴定：凝血酶水解偶联，酶切24h，10000g离心10min，取上清进行SDS-PAGE分析(图1)
[0142] 二、偶联重组G5P蛋白的Ni+-NTA树脂对PrPSC的纯化富集
[0143] 1、生物样本处理
[0144] (1)称取适量兔脑样本、研磨、离心收集蛋白并定量，以PrP27-30蛋白掺入其中配成浓度为0.5pmol/L、1pmol/L、2pmol/L、3pmol/L、4pmol/L的模拟检测样本[0145] (2)对上述模拟样本以终浓度为10μM蛋白酶K37℃消化1h，1mM的PMSF终止消化
[0146] 2、纯化富集程序
[0147] (1)取1ml上述处理的蛋白样本和50ul的偶联有重组G5P蛋白的Ni+-NTA树脂于1.5mLEP管中震摇2h后8000g离心5min去上清液
[0148] (2)洗 涤：EP管 加入 1ml洗涤 Buffer(20mmol/L Tris-Cl，150mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，PH7.0)，震摇10min，8000g离心1min，去上清，重复三次
[0149] (3)洗 脱：EP 管 加 入50uL洗 脱 Buffer(20mmol/L Tris-Cl，150mmol/LNaCl，500mmol/L咪唑，PH7.0)，充分混匀，10000g 1min收集洗脱液，即为纯化富集后的目的蛋白，进行蛋白定量
[0150] 3、重组G5P与PrPSC蛋白间结合力测定
[0151] (1)将一定含量的重组G5P与Ni+-NTA树脂偶联，依次加入不同浓度的PrP27-305
蛋白，确定最大结合量，根据Seatchard方程计算结合常数Ka1=1.019×10mol/L[0152] (2)同样，将克隆表达带有His标签的重组PrP27-30蛋白与Ni+-NTA树脂偶联固定，依次加入不同浓度的被凝血酶切除His标签的重组G5P蛋白，确定最大结合量，计算结
5
合常数Ka2=1.167×10mol/L
[0153] (3)分析比较Ka1、Ka2，重组G5P与PrPSC间的结合常数Ka值均较大，约为105，数SC值接近，可以判断重组G5P蛋白与PrP 间有较好的结合能力且结果可靠
[0154] 三、富集后PrPSC的免疫印迹检测
[0155] 1、SDS-PAGE电泳：取10~20ul富集后的样本蛋白煮沸5min，上样，60~120V电泳60min
[0156] 2、电转移：转膜仪中10mA，电转20min，将分离胶上蛋白转至PDVF或NC膜上[0157] 3、抗体封闭：TBS-Tween洗涤PVDF膜，37℃BSA封闭1h缓摇，然后PrPSC抗体(1：100~1000)4℃封闭过夜，一抗封闭完后TBS-Tween洗3次，用二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1：1000)37℃平摇封闭1h
[0158] 4、ECL显影：加入ECL显色液，置于化学发光成像系统中观察结果[0159] 四、PrPSC蛋白阳性结果判断：
[0160] 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳后考马斯亮蓝染色相应位置出现条带即为PrPSC蛋白(图2)
[0161] 2、ECL显影PDVF或NC膜上出现唯一条带时即为G5P富集后的PrPSC蛋白，纯化富集后，免疫印迹检出限为1pmol/L(图3)。
