一种建立双启动子甲醇酵母高效表达重组人金属硫蛋白系
统的方法及该蛋白的制备纯化
技术领域
[0001] 本
发明涉及一种建立嵌入甲醇应答元件及金属应答元件的双启动子甲醇酵母高效表达基因重组人金属硫蛋白(rhMT)系统的方法，以及利用该系统表达、制备、纯化该目的蛋白-金属硫蛋白的技术，属于
生物制药领域，其关键是将一种含甲醇应答元件AOX，以及含或不含金属应答元件MRE的外源金属硫蛋白基因的载体质粒pPICZα-MT，通过
磷酸钙转染(transformation)、电击转染或同源重组(double crossover recombination)等方式，将该含双启动子的外源基因引入相关宿主酵母细胞，其目的是提供一种适合工业化大规模低成本生产人金属硫蛋白的可行性实施方案。
背景技术
[0002] 1957年，美国科学家Margoshes在研究金属在生物学上的作用时，从
马肾中首次发现I-型与II-型镉金属硫蛋白(Margoshes M.，Vallee B.L.A cadmium protein from equine kidney cortex.J.Ame.Chem.Soc.79：4813-4814(1957))。金属硫蛋白是一类富含半胱
氨酸基团，对多种重金属有高度
亲和性，在一定的酸
碱度(pH值)及细胞
氧化-还原电位环境(可藉细胞器某处谷胱甘肽有还
原型和氧化型比例，GSH/GSSG比例显示)条件下易与多个镉、锌等
金属离子结合的多肽
蛋白质。
哺乳动物的金属硫蛋白由约61个氨基酸组成，含有20个半胱氨酸和7个金属离子。金属硫蛋白作为一种应 激蛋白、抗自由基
氧化剂、细胞锌离子介导剂等，具有提高人体免疫
力、抵抗重金属中毒、参与微量元素的贮存、运输和代谢、排铅补锌、抗
辐射、延缓衰老、保护人体心
肺各器官等多种独特有效的生物学功能。 [0003] 可是迄今为止普遍缺少一种高效表达分泌基因重组哺乳动物尤其是人源金属硫蛋白或其类似物的制药工业可行的生产制备及纯化方法。复旦大学在
专利CN01131966.6上公开了一种金属硫蛋白的制备方法，但属于猴而非人金属硫蛋白，且需要柱上凝血酶
切除用于亲和层析的谷胱甘肽GST片断，成本太高，不具工业生产价值；北京大学在专利CN96100897.0上公开了一种
酿酒酵母金属硫蛋白产生菌的选育
发酵与提取工艺，用
铜盐诱导制备Cu-MT；暨南大学在专利CN201110028345.4上公开了一种用IPTG诱导大肠杆菌表达可溶性融合蛋白酿酒酵母金属硫蛋白成熟肽CBD-intrin1-MT的表达方法，很好地利用了intrin1片断的自剪切功能；但这两个专利涉及非人金属硫蛋白；暨南大学在专利CN200610112960.2上公开了生产利用小分子泛素相关修饰因子成熟肽(Small Ubiquitin-related Modifier，SUMO)进行融合表达生产人I型金属硫蛋白hMT-I的方法，使该融合片断可被泛素相关修饰因子蛋白酶1(Ubiquitin-like protease 1)在原核生物体内
水解，以释放可溶性hMT-I，但属于在原核生物中使用昂贵的IPTG诱导下表达，故将此述目的蛋白用于医药时存在细菌内毒素污染
风险；另有专利CN200910246446.1一种将人金属硫蛋白接到人表皮生长因子的C端的生产人表皮生长因子和金属硫蛋白的融合蛋白的方法，仅用于制备
治疗烧伤、或者烫伤、或者创伤、或者溃疡的药物中的应用和在制备
皮肤护理药物中的应用，不具有普遍性；美国专利US5824512描述了一种表达Mal-MT融合蛋白的表达，其用途仅为环保
废物处理。综上所述，一种普遍适合医药用大规模工业化低成本的表达、制备、纯化、检测人金属硫蛋白的产业化技术迫切 需要开发，尤其考虑到人源金属硫蛋白hMT-3在治疗神经退行性
疾病上的广阔前景。hMT-3主要分布于中枢神经系统的星性胶质细胞，集中存在于细胞体和突起中，其次存在于神经元细胞中。通过鼠刺伤模型和缺血模型的研究发现，hMT-3参与中枢神经系统损伤修复。
帕金森病(PD)的一种机理是由于6一羟基多巴胺等因子诱导自由基而产生的，而脑中某些金属硫蛋白异构体尤其是hMT-3的诱导剂，如氧化压力、细胞因子和
炎症过程等能防止这种神经毒害，这与金属硫蛋白清除自由基有关。
[0004] 分子生物学技术的发展为利用
生物反应器生产外源蛋白提供了许多方法和手段。到目前为止，已发展出了大肠杆菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞、转基因
植物等多种蛋白表达系统，其中酵母细胞表达系统是最近发展起来的新型表达系统。最先使用的是酿酒酵母。1981年Hitzeman等用酿酒酵母成功地表达了人干扰素，但该系统具有一定的局限性，如缺乏强有力的启动子，分泌效率差，质粒不稳定等。因此，人们在此
基础上又寻找了新的酵母表达系统——毕赤酵母，即甲醇营养型表达系统。目前该表达系统被广泛应用。此系统不仅具有高表达、高稳定、高分泌的特点，而且其宿主甲醇酵母-巴斯德毕赤酵母(Picchia pastoris)具有高
密度生长的特性。甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一
碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三种，其中毕赤酵母(Pichia Pastoris)作为基因表达系统使用得最多、最广泛。与以往的基因表达系统相比，它具有无可匹敌的高表达特性，已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。因此近年来此表达系统的研究得到迅速发展，在其中表达了多种具有商业价值的外源蛋白，包括人类蛋白HuMOR、hTopoI、hGM-CSF、SAP、C1-Inh、SolRII。早在1995年，已有四十多种外源蛋白在该宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几 十种，且一年比一年多。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的与大肠杆菌比低毒或无毒、与哺乳动物细胞CHO培养比生产成本低等特点外，还具有含有很多特有的优点：含目前最强的启动子-AOX(醇
氧化酶基因)、表达水平高、易分泌表达、翻译后易加工处理、高密度培养、发酵工艺成熟、易放大、产物易分离、外源蛋白基因遗传稳定等。
[0005] 启动子(promoter)是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点。如将启动子和其上游远处的转录调控蛋白的结合位点包括在一起，叫做启动子区(promoter region)。启动子对于重组蛋白的表达非常重要。一个真核基因通常有多个
调控序列，主要存在于启动子区域。使重组蛋白被高效表达的启动子通常具有能够有效地启动外源基因转录以及调控诱导表达两个特点。金属巯蛋白基因启动子区含有多个金属应答元件和类金属应答元件，金属应答元件(MRE)和类金属应答元件(MLS，MRE-like sequence)。有趣的是，在金属调控基因中，对重金属起反应是不依赖与MRE的
位置和方向，但至少需要2个以上的拷贝。金属巯蛋白保护细胞对抗过多的重金属，在一般情况下此基因只在基本水平表达，但在重金属离子的诱导下则以高水平表达。金属巯蛋白基因启动子区的多个MRE序列担负对金属的诱导性应答作用。 发明内容
[0006] 本发明的主要创新是将含甲醇应答元件AOX1，以及含或不含金属应答元件MRE的外源金属硫蛋白基因的质粒，通过转染(transformation)或同源重组(double crossover recombination)的方式，将该含双启动子的外源基因引入 相关宿主酵母细胞。这样，在插入不含金属硫蛋白本身启动子如MRE等的基因片断的情况下，外源金属硫蛋白基因只由甲醇应答元件AOX1调控转录；当插入的为含金属硫蛋白本身启动子如MRE等的情况下，外源金属硫蛋白基因将由甲醇应答元件AOX1和金属硫蛋白本身启动子如金属应答元件共同调控转录。与单启动子相比，双启动子显著地增强了金属硫蛋白的表达效率与调控的灵活性。 [0007] 更具体地说，本发明提供了一种建立双启动子甲醇酵母高效表达基因重组人金属硫蛋白系统的方法及该目的蛋白的制备纯化技术。
[0008] 进一步，所述目的蛋白为人金属硫蛋白(hMT)，包括人金属硫蛋白异构体(hMT-1，hMT-2，hMT-3，hMT-4)及其类似物、片断。
[0009] 进一步，所述的人金属硫蛋白异构体(hMT-1，hMT-2，hMT-3，hMT-4)具有如下蛋白质序列：
[0010] SEQ ID NO.1，I-型人金属硫蛋白(metallothionein-1，hMT-1)： [0011] 1 mdpncscatg gsctctgsck ckeckctsck ksccsccpms cakcaqgcic kgasekcscc61a [0012] SEQ ID NO 2，II-型人金属硫蛋白(metallothionein-2，hMT-2)： [0013] 1 mdpncgcaag dsctcagsck ckeckctsck ksccsccpvg cakcaqgcic kgasdkcscc61a [0014] SEQ ID NO.3，III-型人金属硫蛋白(metallothionein-3，hMT-3)： [0015] 1 mdpetcpcps ggsctcadsc kcegckctsc kksccsccpa ecekcakdcv ckggeaaeae61 aekcsccq
[0016] SEQ ID NO 4.IV-型人金属硫蛋白(metallothionein-4，hMT-4)： [0017] 1 mdprecvcms ggicmcgdnc kcttcncktc rksccpccpp gcakcargci ckggsdkcsc61 cp
[0018] 进一步，为取得所述目的基因序列、含启动子调控序列、分泌引导
信号表达序列，以及引入合适的限制性核酸内切酶位点的方法，以制造所述的含双启动子甲醇酵母高效分泌表达基因重组人金属硫蛋白系统，包括以下步骤：
[0019] a)采用基因工程技术或直接直接DNA化学合成的方法，引入端头符合
附图中所示载体质粒pPICZα的一种或两种以上限制性核酸内切酶 (XhoI、Cla I、Pst I、EcoR I、Pml I、Sfi I、Bsmb I、Asp718 I、Kpn I、Xho I、Sac II、Not I、Xba I)酶切位点位点插入要求的，且涵盖编码
权利要求2、3中所述的一种人金属硫蛋白的氨基酸序列所对应的DNA成熟基因片断和/或含其启动子DNA片断的一条DNA双螺旋长链(MT基因片断)。所采用的基因工程技术包括但不限于本领域技术人员所知的基因克隆方法，例如，从人体某组织提取全RNA、设计PCR引物、进行RT-PCR反应获得cDNA、基因测序、琼脂糖凝胶色谱检测确认、基因定点突变，或DNA片断或质粒的克隆、酶切、连接、提取、纯化、PCR扩增、转化等。 [0020] b)使用DNA连接酶，将MT基因片断插入载体质粒pPICZα上相应限制性核酸内切酶酶切位点，使MT基因片断与含一种巴斯德毕赤酵母菌来源的5’调控区(内含启动子元件)的醇氧化酶(AOX1)基因启动子的重组甲醇酵母分泌表达系统整合(嵌合)，构建载体质粒pPICZα-MT。
[0021] c)将上一步骤所构建的载体质粒pPICZα-MT上的目的基因片断，包括引导肽表达序列、目的蛋白质编码基因片断、启动子等调控子序列，通过转染(transformation)或同源重组(double crossover recombination)的常规方法，优选同源重组方法，将该含双启动子的外源基因引入相关宿主酵母细胞，构建了含双启动子甲醇酵母高效分泌表达基因重组人金属硫蛋白系统。
[0022] 进一步，所构建载体质粒pPICZα-MT含有基因表达结构式：5’--S—T—3’，式中：S为引导肽表达序列，其编码氨基酸序列为EAEAEFR，或EAEFR，或EFR，或酿酒酵母来源的α交配因子基因引导肽序列(即AMF prepro序列，其序列为一种编码85个氨基酸的基因
片段，内含有酵母菌KEX-2蛋白酶 加工位点Lys-Arg两个密码子)；T为编码权利要求2、3中所述的一种人金属硫蛋白的氨基酸序列所对应的DNA成熟基因片断，该片断含或不含金属应答元件(MRE)和/或类金属应答元件(MLS，MRE-like sequence)。
[0023] 进一步，所述的甲醇酵母为毕赤酵母属(Pichia)、或汉森酵母属(Hansenula)、或球拟酵母属(Torulopsis)，优选毕赤酵母属；采用宿主菌为GS115、GS190、GS200、JC220、JC227、JC254、JC304、JC305，或SMD16、SMD1163、SMD1165、SMD1168，或X33，或KM71，优选GS115。
[0024] 本发明还研究硫目的蛋白基因重组人金属硫蛋白的制备纯化技术，即采用优化发酵工艺技术，包括选择含双启动子的金属硫蛋白分泌表达基因工程菌株，经适合生长培养与表达培养，获得分泌表达目的蛋白的发酵液；进一步将含目的蛋白的发酵液通过优化的蛋白纯化技术，获得纯度大于60％的粗品、或纯度大于90％的精品、或纯度大于99％的纯品。
[0025] 进一步，所述发酵工艺技术包括：1).运用发酵代谢流、
能量流、氧传递模型分析
软件或仿真软件、或单因素试验设计、或
正交试验设计等优化影响酵母菌发酵的接种量、接种时间、溶氧量、最适合重组菌株蛋白表达的发酵培养基选择、pH值、
温度等工艺参数，以提高发酵效率及目的蛋白的表达量；2).发酵工艺参数为：发酵温度为15-30℃，优选28-30℃；pH值为3-7，优选pH＝4-6；溶氧量DO大于20％，优选30％；
葡萄糖或甘油耗尽后限制性流加2-30小时，优选12-15小时，再限制性流加甲醇，直到发酵结束；葡萄糖或甘油耗尽到发酵结束的整个过程
温度控制在15-30℃，优选19-23℃；pH值控制在3-7，优选pH＝4-6。
[0026] 进一步，所述蛋白纯化技术，包括使用金属螯合层析柱(Metal Chelating Chromatography)、
超滤、分子量切分膜(Molecular Weight Cut-Off Membrane)、 酶切或化学切割、反相液相色谱(Reverse Phase HPLC)、阳离子交换柱、大孔
树脂柱、疏水层析分离柱、
透析、离心分离等方法的至少一种或一种以上组合，纯化制备出纯度合乎要求的金属硫蛋白作为医药或其它用途。
[0027] 本发明的效果作用是：
[0028] 提供了一种高效表达分泌基因重组哺乳动物尤其是人源金属硫蛋白或其类似物的制药工业可行的生产制备及纯化方法，其特征为，通过将一种含甲醇应答元件AOX1，以及含或不含金属应答元件MRE的外源金属硫蛋白基因的载体质粒pPICZα-MT，通过转染(transformation)或同源重组(double crossover recombination)的方式，将该含双启动子的外源基因引入相关宿主酵母细胞，构建了含双重启动子的甲醇酵母宿主基因工程菌；运用发酵代谢流、能量流、氧传递模型分析软件或仿真软件、或单因素试验设计、或正交试验设计等优化影响酵母菌发酵的接种量、接种时间、溶氧量、最适合重组菌株蛋白表达的发酵培养基选择、pH值、温度等工业参数的优化，大幅提高发酵效率，使目的产物的表达量得到显著提高；通过优化目的蛋白质制备纯化工艺，包括使用金属螯合层析柱(Metal Chelating Chromatography)、超滤、分子量切分膜(Molecular Weight Cut-Off Membrane)、酶切或化学切割、反相液相色谱(Reverse Phase HPLC)、阳离子交换柱、大孔树脂柱、疏水层析分离柱、透析、离心分离等方法的至少一种或一种以上组合，纯化制备出纯度合乎要求的金属硫蛋白作为医药或其它用途。本发明有效地避免了传统金属硫蛋白制备方法中生产成本高，以及对动物大量宰杀与器官摘取、动物源病毒污染、细菌源内毒素污染、非人源化蛋白的免疫原等诸多问题。
附图说明
[0029] 附图为双启动子甲醇酵母高效表达载体质粒图。
具体实施方式
[0030] 挑选经酵母
浸出粉胨葡萄糖培养基(YEPD)平板培养的带双启动子分泌表达基因重组II-型人金属硫蛋白(rhMT-2)的GS115甲醇酵母单菌落，在置于30℃摇床的摇瓶中震荡培养12-24小时至OD600nm＝0.20-0.60，后转移到1.5L摇瓶，继续培养过夜，然后以5-10％的接种量进行补料、分批发酵。
发酵罐(B.Bran，Germany)的工作体积为30L，加15L基础盐培养基、微量元素溶液及一定的碳源。甘油期发酵全程通过调节搅拌速度(500-900rpm)使溶氧浓度维持在30％，溶氧
电极为INPRO6100/120/T/N(Metler-Toledo，瑞士)，通过流加
氨水，控制pH＝6.5，pH电极为405-DPAS-SC-K8S/120(Metler-Toledo，瑞士)。在OD600nm＝0.30-0.50时，进入甲醇诱导表达阶段，在2小时内将甲醇加到0.2％。当甲醇开始被利用时将其浓度逐步提高到0.5-1％，并逐步降低培养温度至19-25℃，pH调至6.8-7.0，同期使用或不使用金属(Zn、Cu等)诱导剂。发酵过程维持罐压力为
0.04-0.06MPa。甘油、甲醇、氨水均用校正好的
蠕动泵(Watson-Marlow101U/R，英国)进行流加。当OD600nm＝0.60时、巯基活性达到0.08时，进行放料、补料。放料、补料后，OD600nm＝0.30-0.35左右，培养基装料量为15L左右，然后进行连续培养，继续诱导200-300小时。
用RP-HPLC(Agilent，美国)测目的蛋白质含量。当发酵液中目的蛋白浓度(大于110mg/L)不再增加时，合并前述放料液，经前述优化目的蛋白质制备纯化工艺，含微滤除菌、疏水层析等步骤等，得到纯度95％以上的基因重组人金属硫蛋白rhMT-2总产量大于2.5克。 [0031] 实施例二：
[0032] 以下所述设备、仪器、工具、检测方法等如在实施例一已出现，则两者相同。 [0033] 挑选经YEPD平板培养的带双启动子分泌表达基因重组I-型人金属硫蛋白rhMT-1的GS115甲醇酵母单菌落，在置于30℃摇床的摇瓶中震荡培养12-24小时至OD600nm＝0.20-0.60，后转移到含1.5L酵母氮源基础培养基及
种子培养基的摇瓶中，于28-30℃发酵培养24小时。然后以5-10％的接种量转移到30L发酵罐进行培养。向该发酵罐中添加13.5L盐培养基，该培养基每升含27mlH3PO4，0.9g CaSO4.2H2O，18g K2SO3，15g MgSO4.7H2O，4.13g KOH，40g甘油，4.4ml微量矿物质溶液。在发酵过程中，用氨水调pH值，使其维持在5.0-5.5。于30℃通氧气、搅拌，搅拌速度为900-1000rpm，并添加适量消泡剂，使溶氧浓度维持在30％以上。发酵24小时后，加入含12ml/L的微量矿物质溶液的甘油，溶氧浓度继续维持在30％以上。继续培养10小时。当碳源饥饿30分钟后，加入甲醇，诱导表达。刚开始5小时加入甲醇(100％甲醇，含12ml/L的微量矿物质溶液)的速度低，且不供氧，以使酵母菌适应甲醇。后加入更多甲醇，并逐步降低培养温度至19-25℃，pH调至6.8-7.0，配合使用一定浓度的金属(Zn、Cu等)诱导剂。发酵过程维持罐压力为
0.04-0.06MPa。甘油、甲醇、氨水均用校正好的
蠕动泵进行流加。当OD600nm＝0.60时、巯基活性达到0.08时，进行放料、补料。放料、补料后，OD600nm＝0.30-0.35左右，培养基装料量为15L左右，然后进行连续培养，继续诱导200-300小时。用RP-HPLC测目的蛋白质含量。当发酵液中目的蛋白浓度(大于90mg/L)不再增加时，合并收集发酵液，经前述优化目的蛋白质制备纯化工艺，含微滤除菌、疏水层析、4℃10000rpm离心、金属螯合柱亲和层析等，得到纯度95％以上的金属硫蛋白rhMT-1总产量大于2.0克。
[0035] SEQ ID NO.1，I-型人金属硫蛋白(metallothionein-1，hMT-1)： [0036] 1 mdpncscatg gsctctgsck ckeckctsck ksccsccpms cakcaqgcic kgasekcscc61 a [0037] SEQ ID NO 2，II-型人金属硫蛋白(metallothionein-2，hMT-2)： [0038] 1 mdpncgcaag dsctcagsck ckeckctsck ksccsccpvg cakcaqgcic kgasdkcscc61 a [0039] SEQ ID NO.3，III-型人金属硫蛋白(metallothionein-3，hMT-3)： [0040] 1 mdpetcpcps ggsctcadsc kcegckctsc kksccsccpa ecekcakdcv ckggeaaeae61 aekcsccq
[0041] SEQ ID NO 4.IV-型人金属硫蛋白(metallothionein-4，hMT-4)： [0042] 1 mdprecvcms ggicmcgdnc kcttcncktc rksccpccpp gcakcargci ckggsdkcsc61 cp
