过继细胞治疗的方法
阅读：655发布：2020-05-11
专利汇可以提供过继细胞治疗的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于 治疗 患有乳腺病症或有患乳腺病症 风 险的受试者的过继 细胞疗法 的组合物和经 乳头 方法。，下面是过继细胞治疗的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于治疗患有乳腺病症或有患乳腺病症风险的受试者的过继细胞治疗的经乳头方法，其包括将细胞施用到受试者的乳腺管中。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞包括T细胞、NK细胞、CTL、TIL、单核细胞、粒细胞或其祖细胞。
3.权利要求1的方法，其中所述细胞包含表达结合乳腺细胞上的靶抗原的一种或多种重组受体的经修饰的细胞。
4.权利要求3的方法，其中所述一种或多种重组受体包括嵌合抗原受体(CAR)或工程化或疾病特异性TCR。
5.权利要求3的方法，其中所述经修饰的细胞表达两种或更多种CAR。
6.权利要求3至5中任一项的方法，其中所述一种或多种重组受体独立地是单特异性的、双特异性的或多特异性的。
7.权利要求3至6中任一项的方法，其中所述一种或多种重组受体是组成型、瞬时或可开关表达的，或条件活性的。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其中所述经修饰的细胞包含安全性开关，所述安全开关选自死亡基因开关、基于FITC的开关和基于PNE的开关。
9.权利要求8的方法，其中死亡基因开关是HSV-tk、iCaspase9或FADD。
10.权利要求3至9中任一项的方法，其中所述靶抗原是肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、多谱系肿瘤相关抗原、癌胚抗原、新抗原或免疫抑制抗原。
11.权利要求3至10中任一项的方法，其中所述靶抗原选自转化相关分子，诸如MUC，诸如MUC1、c-met、细胞角蛋白诸如CK5、CK6、CK14、CK7、CK8、CK14、CK17、CK18、CK19、p53、糖苷、Tn、TF和唾液酸Tn(STn)、Lewis x、Lewis a、Lewis y和神经节苷脂诸如GM3、GD3、9-0-乙酰基GD3、9-0-乙酰基GT3和N-羟基-GM3、叶酸受体α、ROR1、新抗原、肿瘤特异性抗原和癌胚抗原、肿瘤相关抗原诸如癌胚抗原(CEA)、L1细胞粘附分子(L1CAM)、CAF相关蛋白诸如成纤维细胞活化蛋白(FAP)、FAP-α、FSP-1/S100A4和PDGFR-β、二神经节苷酯GD2、间皮素、IL-13受体IL13R、IL-13受体α、ephrinB2、IGFR1、ELIGHT、WT1、TAG-72、Ep-CAM、LFA-1、EGFR、雌激素受体(ER)、孕酮受体、MAGE1、MAGE-3、MAGE-A3/6、MAGE-A家族成员诸如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A12、MAGE-A9、MAGE-A11、MAGE-C1和MAGE-C2、RAGE、BCR-ABL、蛋白酪氨酸激酶诸如PRL-2和PRL3、肿瘤相关糖蛋白诸如TAG-72、CA 19-9、CA 27.29、CA 72-4、CA 50、PD-1、CTLA-4 CD47、受体酪氨酸激酶诸如H4-RET、Ki-67、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白E、p16、p21、p27、p53、Bcl-2、Bax、存活素、c-myc、Rb、VEGF、HPR1、HER1、HER2、HER3、HER4、CD10、SPARC、COX-2、基底细胞角蛋白、CK5/6、CK14和CK17、表皮生长因子受体、c-kit、c-erbB-2、IL-10、TGF-β、CCL17、CCL22和CCL24基质释放因子诸如EGF、HGF、MCP-1、CSF-1、VEGF、细胞因子诸如IL1、IL-8、TNF-α、酶诸如MM2、MMP7、MMP8、MMP9、MMP12、MMP13和COX2。
12.权利要求3至11中任一项的方法，其中所述重组受体是HER2-CAR、FR-α-CAR或FAP-CAR。
13.权利要求3至12中任一项的方法，其中所述重组受体包含选自以下的初级信号传导分子：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD8、CD16、CD22、CD25、CD79a、CD79b和CD66d。
14.权利要求3-13中任一项的方法，其中所述重组受体包含一种或多种共刺激分子。
15.权利要求3至14中任一项的方法，其中所述共刺激分子选自MHC I类分子，BTLA和Toll配体受体、免疫球蛋白超家族(IgSF)诸如CD28、B7受体家族成员(B7-H2/B7RP-1/LICOS/GL50、B7-DC/PD-L2、B7-H3)、CD226、TIM、CD2/SLAM、BTN、LAIR、肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)诸如OX40、CD27、CD30、DR3、GITR以及T细胞上的HVEM、CD2和SLAM、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、粘附分子(CD54、CD58、CD70)、ICOS、CD40、CD40L、4-1BB(CD137)、CD70、CD80、CD86、DAP10和其他孤儿受体家族诸如LAG3(CD223)和CD160。
16.权利要求3至14中任一项的方法，其中所述重组受体包含CD28和4-1BB作为共刺激分子。
17.权利要求3至16中任一项的方法，其中所述经修饰的细胞包括T细胞、NK细胞、CTL、单核细胞、粒细胞或其祖细胞。
18.权利要求3-17中任一项的方法，其中所述经修饰的细胞还包含选自下述的染料或造影剂：钆螯合物、超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)、19F全氟化碳纳米颗粒和其他磁性报告基因诸如基于金属蛋白的MRI探针。
19.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述细胞配制在组合物中，所述组合物还包含药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂或其组合。
20.权利要求19的方法，其中所述载体是乳酸林格氏溶液。
21.权利要求19的方法，其中所述组合物还包含胶凝剂。
22.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳腺病症是良性乳腺病症、乳腺癌、乳头Paget病或叶状瘤。
23.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳腺病症是增生、异型性、导管增生、小叶增生、非典型导管增生(ADH)或非典型小叶增生(ALH)。
24.前述权利要求中任一项的方法，其中所述乳腺病症是选自以下的乳腺癌：原位导管癌(DCIS)、原位小叶癌(LCIS)、侵入性(或浸润性)小叶癌(ILC)、侵入性(或浸润性)导管癌(IDC)、微浸润性乳腺癌(MIC)、炎性乳腺癌、ER阳性(ER+)乳腺癌、孕酮受体阳性(PR+)乳腺癌、ER+/PR+乳腺癌、ER阴性(ER-)乳腺癌、HER2+乳腺癌、三阴性乳腺癌(即，ER-/PR-/Her2-乳腺癌；“TNBC”)、腺样囊性(腺囊性)癌、低度腺鳞癌、髓样癌、粘液(或胶样)癌、乳头状癌、小管癌、化生性癌和微乳头状癌。
25.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳腺癌是癌变前期、早期癌症、非转移性癌症、转移前癌症、局部晚期癌症、转移性癌症或复发性癌症。
26.前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞以单剂量或多剂量施用。
27.权利要求26的方法，其中所述多剂量包括第一剂量和一个或多个后续剂量。
28.权利要求26的方法，其中一个或多个剂量以分散单位剂量施用。
29.前述权利要求中任一项的方法，其中向所述受试者施用单位剂量的细胞，所述单位剂量的范围为1×103至1×109个经修饰的细胞/kg体重、1×103至5×108个经修饰的细胞/kg体重、0.5×103至1×107个经修饰的细胞/kg体重、1×104至0.5×106个经修饰的细胞/kg
4 6 5 6
体重、0.5×10 至1×10个经修饰的细胞/kg体重、1×10至0.5×10 个经修饰的细胞/kg体重。
30.权利要求27的方法，其中所述第一剂量是低剂量，诸如小于1×103个细胞/kg、小于
0.5×104个细胞/kg、小于1×104个细胞/kg、小于0.5×105个细胞/kg、小于1×105个细胞/kg、小于0.5×106个细胞/kg或小于1×106个细胞/kg。
31.权利要求27的方法，其中所述第一剂量是高剂量，诸如大于0.5×105个细胞/kg、大于1×105个细胞/kg、大于0.5×106个细胞/kg、大于1×106个细胞/kg、大于0.5×107个细胞/kg、大于1×107个细胞/kg、大于0.5×108个细胞/kg、大于1×108个细胞/kg或大于5×
108个细胞/kg。
32.权利要求27的方法，其中在第一剂量开始后7至28天之间施用后续剂量。
33.权利要求27的方法，其中后续剂量与所述第一剂量相同，低于所述第一剂量或高于所述第一剂量。
34.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述细胞作为主要疗法、新辅助疗法或辅助疗法施用。
35.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞的施用降低了所述受试者的乳腺病症的疾病负担。
36.前述权利要求中任一项的方法，包含重组受体的经修饰的细胞的施用减轻了受试者的肿瘤负荷。
37.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞的施用减轻了肿瘤负荷。
38.前述权利要求中任一项的方法，其中经修饰的细胞的施用减轻了肿瘤负荷。
39.前述权利要求中任一项的方法，其中施用降低了CRS相关后果、MAS相关后果、TLS相关后果、神经毒性相关后果或宿主免疫应答相关后果的风险。
40.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞的施用降低细胞因子诸如IFNγ、TNFα、IL-2、GM-CSF、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、Flt-3、不规则趋化因子、MIP1、sIL-2Rα和IL-5的循环或乳腺组织水平。
41.前述权利要求中任一项的方法，其中所述经修饰的细胞的施用降低细胞因子诸如IFNγ、TNFα、IL-2、GM-CSF、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、Flt-3、不规则趋化因子、MIP1、sIL-2Rα和IL-5的循环或乳腺组织水平。
42.前述权利要求中任一项的方法，其中在施用所述细胞之前用淋巴细胞清除剂或化学治疗剂预处理所述受试者。
43.权利要求42的方法，其中所述淋巴细胞清除剂或化学治疗剂选自环磷酰胺、环孢菌素、氟达拉滨、苯达莫司汀、来那度胺、泊马度胺、吉西他滨、BTK抑制剂诸如依鲁替尼、溶瘤腺病毒及其组合。
44.前述权利要求中任一项的方法，其中向所述受试者施用另外的治疗剂或疗法。
45.权利要求44的方法，其中所述另外的治疗剂选自天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱、溶瘤病毒诸如溶瘤腺病毒、抗雌激素诸如他莫昔芬、N-甲基-内昔芬、炔诺昔芬、内昔芬、雷洛昔芬、氟维司群和/或芳香酶抑制剂诸如阿那曲唑、来曲唑和依西美坦。
46.一种用于治疗患有乳腺病症或有患乳腺病症风险的受试者的过继性细胞疗法的经乳头方法，其包括将表达HER2-CAR、FAP-CAR或FR-α的经修饰的细胞施用至受试者的乳腺管中。
47.权利要求46的方法，其中所述HER2-CAR与图2中公开的SEQ ID NO:1或其变体或功能部分具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少
87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和100％的同源性。
48.权利要求46的方法，其中所述FAP-CAR与图2中公开的SEQ ID NO:2或其变体或功能部分至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少93％、至少94％、至少
95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和100％的同源性。
49.一种制品，其包含一个或多个容器、包装材料、标签或包装插页以及任选地装置。
50.权利要求49的制品，其中所述装置是针和注射器、套管、导管、微导管、渗透泵或包封装置。
过继细胞治疗的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2016年9月28日提交的美国申请No.62/401040的权益，该申请通过引用整体并入本文。
[0004] 与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质拷贝，并且由此通过引用并入本说明书中。包含序列表的文本文件的名称是64721_ST25.txt。文本文件为15KB；创建于2017年9月21日；并且通过EFS-Web以规范的文档提交。
技术背景
技术背景
[0005] 使用表达各种重组受体诸如嵌合抗原受体(CAR)的工程化细胞的过继细胞疗法已被开发来用于治疗癌症。过继细胞疗法已被证明在治疗血源性癌症方面取得了一定的成功(很显著的是在白血病中使用CD19CAR)，并且正在研究淋巴瘤和骨髓瘤患者的适应症。由于各种原因，实体瘤的治疗问题多得多。物理屏障的存在使得跨内皮穿过此类细胞的实体瘤以及所述实体瘤的靶向和浸润(即，肿瘤内迁移)变得困难。
[0006] 另外，恶劣的肿瘤微环境的存在导致施用细胞难以进入靶细胞并导致肿瘤逃逸。肿瘤微环境包括高组织压力、缺氧、营养饥饿(例如由于葡萄糖和其他代谢物减少)、乳酸生成增加和所造成的酸中毒、调节性CD4+T细胞(T-reg)、髓源性抑制细胞(MDSC)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的浸润增加、免疫抑制细胞因子(诸如IL-10和TGF-β)的存在，以及靶向由活化T细胞表达的免疫抑制受体的配体(诸如CTLA4和PD-1)的表达和减少的T细胞增殖，这有助于建立免疫抑制性微环境，从而允许肿瘤保护它们自己免受免疫识别，保持耐受性，并逃避消除。在实体瘤患者中偶尔观察到的其他攻击是“细胞因子风暴”，也称为细胞因子释放综合征(CRS)、巨噬细胞活化综合征(MAS)、肿瘤溶解综合征(TLS)、神经毒性、宿主对转移细胞的免疫应答，这导致来自同步激活和快速增殖的CAR-T细胞和巨噬细胞的细胞因子不受控制地释放，尽管在患有实体瘤的受试者中与患有血癌的受试者相比较少见。过继细胞疗法(例如CAR-T细胞疗法)后观察到的不良事件诸如CRS突出了使用CAR-T细胞时需要谨慎。
CRS相关不良事件的极端实例包括在输注靶向ERBB2(HER-2/neu)抗原的CAR-T细胞后5天用环磷酰胺预处理的结肠癌受试者的死亡(Morgan等，Molecular therapy:J.Am.Soc.of Gene Therapy.28(4):843–51)。在该情况下，毒性导致促炎细胞因子的临床显著释放、肺毒性、多器官衰竭和最终患者死亡。该细胞因子风暴被认为归因于CAR-T细胞对正常肺上皮细胞(已知其表达低水平的ERBB2)的细胞毒性(“肿瘤外靶(on-target-off-tumor)”)。另外的挑战仍然是由CAR细胞产生的肿瘤外靶的攻击，例如心脏毒性、神经毒性和过敏反应。
CRS相关不良事件的极端实例包括在输注靶向ERBB2(HER-2/neu)抗原的CAR-T细胞后5天用环磷酰胺预处理的结肠癌受试者的死亡(Morgan等，Molecular therapy:J.Am.Soc.of Gene Therapy.28(4):843–51)。在该情况下，毒性导致促炎细胞因子的临床显著释放、肺毒性、多器官衰竭和最终患者死亡。该细胞因子风暴被认为归因于CAR-T细胞对正常肺上皮细胞(已知其表达低水平的ERBB2)的细胞毒性(“肿瘤外靶(on-target-off-tumor)”)。另外的挑战仍然是由CAR细胞产生的肿瘤外靶的攻击，例如心脏毒性、神经毒性和过敏反应。
[0007] 过继细胞疗法治疗的此类挑战仍然存在，因此，治疗实体瘤的新颖治疗策略是未满足的医疗需求。
[0008] 概述
[0009] 提供本概述以介绍简化形式的概念选择，其将在下列详述中进一步描述。本概述并不旨在表征要求保护的主题的关键特征，也不旨在用于帮助确定要求保护的主题的范围。
[0011] 在各个方面，本公开提供过继细胞疗法的经乳头方法，用于治疗患有乳腺病症或有患乳腺疾病症风险的受试者，包括将细胞施用至受试者的乳腺导管中。细胞可以是T细胞、NK细胞、CTL、TIL、单核细胞、粒细胞或其祖细胞。
[0012] 在一个方面，所述细胞包含表达一种或多种重组受体的经修饰的细胞，所述重组受体结合受试者乳腺细胞上的靶抗原。重组受体可以是嵌合抗原受体(CAR)或工程化或疾病特异性T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，工程化受体是转基因TCR。在一些实施方案中，疾病特异性TCR是肿瘤特异性TCR。
[0013] 在一些实施方案中，经修饰的细胞表达两种或更多种CAR。在其他实施方案中，重组受体，诸如CAR，可以独立地是单特异性的、双特异性的或多特异性的。在其他实施方案中，组成型地、瞬时地或可开关地表达重组受体或者重组受体是条件活性的。
[0014] 在另一方面，本公开提供了经修饰的细胞包含安全开关，其能够关闭表达重组受体的经修饰的细胞的表达。在一些实施例中，安全开关选自死亡基因开关、基于FITC的开关和基于PNE的开关。在至少一个实施例中，安全开关是死亡基因开关。在其他实施方案中，死亡基因开关是HSV-tk、iCaspase9或FADD。
[0015] 在一个方面，本公开提供了重组受体的Ag结合结构域结合的靶抗原是肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、多谱系肿瘤相关抗原、癌胚抗原、新抗原或免疫抑制抗原。在一些实施方案中，靶抗原选自转化相关分子，诸如MUC，诸如MUC1、c-met、细胞角蛋白诸如CK5、CK6、CK14、CK7、CK8、CK14、CK17、CK18、CK19、p53、糖苷、Tn、TF和唾液酸Tn(STn)、Lewis x、Lewis a、Lewis y和神经节苷脂诸如GM3、GD3、9-0-乙酰基GD3、9-0-乙酰基GT3和N-羟基-GM3、叶酸受体α、ROR1、新抗原、肿瘤特异性抗原和癌胚抗原、肿瘤相关抗原诸如癌胚抗原(CEA)、L1细胞粘附分子(L1CAM)、CAF相关蛋白诸如成纤维细胞活化蛋白(FAP)、FAP-α、FSP-1/S100A4和PDGFR-β、二神经节苷酯GD2、间皮素、IL-13受体IL13R、IL-13受体α、ephrinB2、IGFR1、ELIGHT、WT1、TAG-72、Ep-CAM、LFA-1、EGFR、雌激素受体(ER)、孕酮受体、MAGE1、MAGE-3、MAGE-A3/6、MAGE-A家族成员诸如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A12、MAGE-A9、MAGE-A11、MAGE-C1和MAGE-C2、RAGE、BCR-ABL、蛋白酪氨酸激酶诸如PRL-2和PRL3、肿瘤相关糖蛋白诸如TAG-72、CA 19-9、CA 27.29、CA 72-4、CA 50、PD-1、CTLA-4、CD47、受体酪氨酸激酶诸如H4-RET、Ki-67、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白E、p16、p21、p27、p53、Bcl-2、Bax、存活素、c-myc、Rb、VEGF、HPR1、HER1、HER2、HER3、HER4、CD10、SPARC、COX-2、基底细胞角蛋白、CK5/6、CK14和CK17、表皮生长因子受体、c-kit、c-erbB-2、IL-10、TGF-β、CCL17、CCL22和CCL24基质释放因子诸如EGF、HGF、MCP-1、CSF-1、VEGF、细胞因子诸如IL1、IL-8、TNF-α、酶诸如MM2、MMP7、MMP8、MMP9、MMP12、MMP13和COX2。在一些实施方案中、重组受体是HER2-CAR、FR-α-CAR或FAP-CAR。
[0016] 在一个方面，重组受体包含选自以下的初级信号传导分子：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD8、CD16、CD22、CD25、CD79a、CD79b和CD66d。在另一方面，重组受体包含一种或多种共刺激分子。在一些实施方案中，一种或多种共刺激分子独立地选自MHC I类分子，BTLA和Toll配体受体、免疫球蛋白超家族(IgSF)诸如CD28、B7受体家族成员(B7-H2/B7RP-1/LICOS/GL50、B7-DC/PD-L2、B7-H3)、CD226、TIM、CD2/SLAM、BTN、LAIR、肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)诸如OX40、CD27、CD30、DR3、GITR以及T细胞上的HVEM、CD2和SLAM、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、粘附分子(CD54、CD58、CD70)、ICOS、CD40、CD40L、4-1BB(CD137)、CD70、CD80、CD86、DAP10和其他孤儿受体家族诸如LAG3(CD223)和CD160。在至少一个实施方案中，重组受体包含CD28和4-1BB作为共刺激分子。
[0017] 在一个方面，本公开提供了经修饰的细胞是T细胞、NK细胞、CTL、单核细胞、粒细胞或其祖细胞。
[0018] 另一方面，本公开提供了经修饰的细胞还包含选自钆螯合物、超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)、19F全氟化碳纳米颗粒和其他磁性报告基因(诸如基于金属蛋白的MRI探针)的染料或造影剂。染料或造影剂使得能够监测所施用细胞的迁移和肿瘤浸润速率以及细胞在血液和其他组织中的出现。
[0019] 在另一方面，本公开提供了将细胞配制在适于经乳头施用至受试者的乳腺导管中的组合物中。这种组合物还包含药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂或其组合。在至少一个实施方案中，载体是乳酸林格氏溶液。在一些实施方案中，组合物还包含胶凝剂。
[0020] 在另一方面，本公开提供乳腺病症是良性乳腺疾病、乳腺癌、乳头Paget病或叶状瘤。在一些实施方案中，乳腺病症是增生、异型性、导管增生、小叶增生、非典型导管增生(ADH)或非典型小叶增生(ALH)。
[0021] 在其他实施方案中，乳腺病症是选自以下的乳腺癌：原位导管癌(DCIS)、原位小叶癌(LCIS)、侵入性(或浸润性)小叶癌(ILC)、侵入性(或浸润性)导管癌(IDC)、微浸润性乳腺癌(MIC)、炎性乳腺癌、ER阳性(ER+)乳腺癌、孕酮受体阳性(PR+)乳腺癌、ER+/PR+乳腺癌、ER阴性(ER-)乳腺癌、HER2+乳腺癌、三阴性乳腺癌(即，ER-/PR-/Her2-乳腺癌；“TNBC”)、腺样囊性(腺囊性)癌、低度腺鳞癌、髓样癌、粘液(或胶样)癌、乳头状癌、小管癌、化生性癌和微乳头状癌。
[0022] 在其他实施方案中，乳腺癌是癌变前期、早期癌症、非转移性癌症、转移前癌症、局部晚期癌症、转移性癌症或复发性癌症。
[0023] 在一个方面，本公开提供了以单剂量或多剂量施用细胞。当细胞以多剂量施用时，多剂量包含第一剂量和一个或多个后续剂量。本公开还提供了一个或多个剂量以分次单位剂量施用。
[0024] 另一方面，向受试者施用单位剂量的细胞，所述剂量范围为1×103至1×109个经修饰的细胞/kg体重、1×103至5×108个经修饰的细胞/kg体重、0.5×103至1×107个经修饰的细胞/kg体重、1×104至0.5×106个经修饰的细胞/kg体重、0.5×104至1×106个经修饰的细胞/kg体重、1×105至0.5×106个经修饰的细胞/kg体重。在一些实施方案中，第一剂量是低3 4 4
剂量，诸如小于1×10个细胞/kg体重、小于0.5×10个细胞/kg体重、小于1×10个细胞/kg体重、小于0.5×105个细胞/kg体重、小于1×105个细胞/kg体重、小于0.5×106个细胞/kg体重或小于1×106个细胞/kg体重。
剂量，诸如小于1×10个细胞/kg体重、小于0.5×10个细胞/kg体重、小于1×10个细胞/kg体重、小于0.5×105个细胞/kg体重、小于1×105个细胞/kg体重、小于0.5×106个细胞/kg体重或小于1×106个细胞/kg体重。
[0025] 在其他实施方案中，第一剂量是高剂量，诸如大于0.5×105个细胞/kg体重、大于15 6 6
×10个细胞/kg体重、大于0.5×10个细胞/kg体重、大于1×10个细胞/kg体重、大于0.5×
107个细胞/kg体重、大于1×107个细胞/kg体重、大于0.5×108个细胞/kg体重、大于1×108个细胞/kg体重或大于5×108个细胞/kg体重。
×10个细胞/kg体重、大于0.5×10个细胞/kg体重、大于1×10个细胞/kg体重、大于0.5×
107个细胞/kg体重、大于1×107个细胞/kg体重、大于0.5×108个细胞/kg体重、大于1×108个细胞/kg体重或大于5×108个细胞/kg体重。
[0026] 在其他实施方案中，在第一剂量开始后，在7至28天之间(包括第7天和第28天)施用后续剂量。在另外的实施方案中，后续剂量与第一剂量相同，低于第一剂量或高于第一剂量。
[0027] 在一个方面，经乳头过继疗法可以是基本疗法(primary therapy)、新辅助疗法或辅助疗法。在一些实施方案中，将细胞作为基本疗法、新辅助疗法或辅助疗法施用。
[0028] 在一个方面，本公开提供了细胞的施用减少了受试者中乳腺病症的疾病负担。在一些实施方案中，细胞的施用减少了肿瘤负荷。在其他实施方案中，包含重组受体的经修饰的细胞的施用减轻了受试者的肿瘤负荷。在其他实施方案中，细胞的施用降低了CRS相关结果、MAS相关结果、TLS相关结果、神经毒性相关结果或宿主免疫应答相关结果的风险。在其他实施方案中，经修饰的细胞的施用降低了CRS相关结果、MAS相关结果、TLS相关结果、神经毒性相关结果或宿主免疫应答相关结果的风险。细胞诸如经修饰的细胞的施用降低了细胞因子(诸如IFNγ、TNFα、IL-2、GM-CSF、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、Flt-3、不规则趋化因子(fractalkine)、MIP1、sIL-2Rα和IL-5)的循环或乳腺组织水平。
[0029] 本公开还提供了在施用细胞之前用淋巴细胞清除剂(lymphodepleting agent)或化学治疗剂预处理受试者。在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂或化学治疗剂选自环磷酰胺、环孢菌素、氟达拉滨、苯达莫司汀、来那度胺、泊马度胺、吉西他滨、BTK抑制剂诸如依鲁替尼、溶瘤腺病毒及其组合。
[0030] 在一个方面，所述方法包括向受试者施用另外的治疗剂或疗法。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂选自天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱、溶瘤病毒诸如溶瘤腺病毒、抗雌激素诸如他莫昔芬、N-甲基-内昔芬、炔诺昔芬(norendoxifen)、内昔芬、雷洛昔芬、氟维司群和/或芳香酶抑制剂诸如阿那曲唑、来曲唑和依西美坦。
[0031] 本文提供了用于治疗患有乳腺病症或有患乳腺病症风险的受试者的过继性细胞疗法的经乳头方法，其包括将表达HER2-CAR、FAP-CAR或FR-α的经修饰的细胞施用至受试者的乳腺导管中。在一些实施方案中，HER2-CAR与图2中公开的SEQ ID NO:1或其变体或功能部分具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和100％同源性。
[0032] 在其他实施方案中，FAP-CAR与图2中公开的SEQ ID NO:2或其变体或功能部分至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和100％同源性。
[0035] 通过参考以下详细描述并结合附图，本发明的前述方面和许多附带优点将变得更容易理解，其中：
[0036] 通过参考以下详细描述并结合附图，本发明的前述方面和许多附带优点将变得更容易理解，其中：
[0037] 图1示意性地说明了用于转导外周血淋巴细胞的ErbB2(HER2)CAR载体(γ-逆转录病毒载体MSGV1-4D5-CD8-28BBZ)(Morgan等，Molecular Therapy,2010,18(4),843–851)。
[0038] 图2是具有HER2-CAR载体和FAP-CAR结构域序列的表。
[0039] 详述
[0040] 治疗方法
[0041] 本文提供了使用过继细胞疗法治疗受试者的乳腺病症的新型方法。该方法包括向患有乳腺病症或有患乳腺病症风险的受试者的母乳导管(breast milk duct)施用过继细胞疗法。用于过继细胞疗法的细胞包括但不限于经遗传修饰的细胞诸如T淋巴细胞(T细胞)、自然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、单核细胞、粒细胞、正常免疫细胞及其祖细胞。本文提供的治疗乳腺病症的方法还包括施用另外的治疗剂或疗法。
[0042] 如本文中所用，“经修饰的细胞”是表达至少一种重组受体的遗传工程化的细胞，所述重组受体被设计来识别与疾病或病症相关的“靶抗原”分子和/或与其特异性结合并导致应答，诸如在与靶抗原分子结合后针对此类分子的免疫应答。重组受体包括例如“嵌合抗原受体”(CAR)和其他工程化和疾病特异性抗原受体，诸如肿瘤特异性和转基因T细胞受体(TCR)。
[0043] 尽管迄今为止在各种临床试验中已通过静脉内、瘤内和肠胃外注射用经遗传修饰的细胞治疗过受试者以治疗实体瘤，但由于细胞成功迁移和渗透实体瘤并与靶肿瘤细胞迅速接触的能力有限，利用此类组合物的治疗仍然具有挑战性(Guo等，J.Immunol.Res.2016,Article ID.3850839)。这可归因于通过组织进行的屏障功能、施用后经修饰的细胞的低持久性以及在物理和代谢方面的恶劣肿瘤微环境(Newick等，Molecular Therapy–Oncolytics.(2016)3,16006)。因此，经常观察到细胞的低抗肿瘤细胞毒性。虽然在经修饰的细胞中包含共刺激分子可以缓解一些限制，但更好的乳腺病症治疗方法将更有益并且仍然是未满足的需要。
[0044] 本文公开了过继细胞疗法的新型方法，其中将细胞或组合物经乳头施用于受试者的至少一个母乳导管(下文中的“乳腺导管”或“导管”)。在一个方面，过继细胞疗法的施用途径是经乳头的。
[0045] 如本文中所用，术语“经乳头的”和“经乳头地(transpapillarily)”是指一种治疗方法，其中将用于过继细胞疗法的细胞通过乳房乳头上的乳头中的乳导管开口(导管口)递送至受试者的至少一个母乳导管的内腔中，以到达乳腺的内部深处。
[0047] 在另一方面，经乳头施用是指通过乳房乳头的乳头中的导管开口将用于过继细胞疗法的细胞直接导管内递送至母乳导管腔中。出于本发明的目的，术语“导管内”和“导管内地”是指其中不将组合物施加于乳头的经乳头递送。本领域技术人员将理解，本文公开的经乳头方法包括通过受试者乳腺中的母乳导管的天然开口递送用于过继细胞疗法的细胞，并且为了本发明的目的的导管内递送是经乳头递送的形式。本发明的一个有利方面是，经乳头递送通常不涉及故意破坏受试者的皮肤或组织或细胞层。
[0048] 乳腺病症，诸如乳腺癌，通常起源于个体的乳导管(Wellings SR.Pathol.Res.Prac.1980；166:515-535；Love和Barsky.Cancer.2004,101(9):1947-
1957)。因此，非常需要在母乳导管(乳腺导管)内的受累部位附近局部递送细胞，例如表达重组受体诸如CAR和工程化TCR的经修饰的细胞。提供局部、有效、易于施用的疗法的此类细胞或包含此类细胞的组合物的经乳头施用，通过减少对包含经修饰的细胞的组合物的全身性暴露，可以避免全身性治疗的副作用。这将具有降低肿瘤外靶(on-target-off-tumor)效应的可能性/风险的额外益处。通过导管内施用局部递送至乳腺导管还将允许细胞更大的局部扩张，减少迁移时间，并且在更短的时间内更快地进入受累组织，从而提高细胞毒性活性和功效。
1957)。因此，非常需要在母乳导管(乳腺导管)内的受累部位附近局部递送细胞，例如表达重组受体诸如CAR和工程化TCR的经修饰的细胞。提供局部、有效、易于施用的疗法的此类细胞或包含此类细胞的组合物的经乳头施用，通过减少对包含经修饰的细胞的组合物的全身性暴露，可以避免全身性治疗的副作用。这将具有降低肿瘤外靶(on-target-off-tumor)效应的可能性/风险的额外益处。通过导管内施用局部递送至乳腺导管还将允许细胞更大的局部扩张，减少迁移时间，并且在更短的时间内更快地进入受累组织，从而提高细胞毒性活性和功效。
[0049] 如本文中所用，“乳腺病症”是指乳腺中的任何畸变或一系列畸变。这种畸变可以是增殖性的、非增殖性的、良性的或恶性的。乳腺病症包括乳腺的良性病变(例如，增生)、乳头Paget病、叶状瘤和乳腺癌。良性乳腺病变包括但不限于增生、异型性、导管增生、小叶增生、非典型导管增生(ADH)和非典型小叶增生(ALH)。虽然不是癌性的，但ADH和ALH可能指示乳腺癌的易感性。
[0050] 如本文中所用，“乳腺癌”意指乳腺细胞的任何恶性肿瘤。乳腺癌可处于乳腺癌的任何阶段，包括癌变前期、早期癌症、非转移性癌症、转移前癌症、局部晚期癌症和转移性癌症。存在几种类型的乳腺癌。示例性乳腺癌包括但不限于原位导管癌(DCIS)、原位小叶癌(LCIS)、侵入性(或浸润性)小叶癌(ILC)、侵入性(或浸润性)导管癌(IDC)、微浸润性乳腺癌(MIC)、炎性乳腺癌、ER阳性(ER+)乳腺癌、孕酮受体阳性(PR+)乳腺癌、ER+/PR+乳腺癌、ER阴性(ER-)乳腺癌、HER2+乳腺癌、三阴性乳腺癌(即，ER-/PR-/Her2-乳腺癌；“TNBC”)、腺样囊性(腺样囊性)癌、低度腺鳞癌、髓样癌、粘液(或胶样)癌、乳头状癌、小管癌、化生性癌和微乳头状癌。单个乳腺癌肿瘤可以是这些类型的任何组合或混合物，或者是侵入性和原位癌的混合物。
[0051] DCIS是最常见的非侵入性乳腺癌。其涉及衬在乳腺导管上的细胞。在DCIS中，细胞没有扩散到导管壁外进入周围的乳腺组织。约1/5的新乳腺癌病例将是DCIS。几种生物标志物与DCIS相关。示例性生物标志物包括但不限于雌激素受体、孕酮受体、雄激素受体、Ki-67、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白E、p16、p21、p27、p53、Bcl-2、Bax、存活素、c-myc、Rb、VEGF、HPR1、HER1、HER2、HER3、HER4、CD10、SPARC、COX-2、基底细胞角蛋白、CK5/6、CK14和CK17、表皮生长因子受体、Tn、ER+和c-kit。DCIS被认为是IDC的非专性前体(non-obligate precursor)。分泌某一HGF和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的基质细胞(诸如癌相关成纤维细胞(CAF))的参与有助于DCIS细胞变得具有侵入性并发展成IDC。
[0052] LCIS是一种癌前肿瘤。其可能指示侵入性癌症的倾向。LCIS仅占原位(导管或小叶)乳腺癌的约15％。LCIS生物标志物包括但不限于E-钙粘蛋白、ER、PgR、c-erbB-2、p53和Ki-67。
[0053] IDC是最具侵袭性的乳腺癌。顾名思义，其为从乳腺导管开始然后侵入周围脂肪组织的癌。约8到10种侵入性乳腺癌是浸润性导管癌。IDC通常通过手术切除癌组织和放射疗法来治疗。另外，化疗联合免疫疗法(例如，他莫昔芬和曲妥珠单抗)通常用于治疗IDC。如果肿瘤大于4cm，则可进行根治性乳房切除术。IDC的生物标志物包括但不限于碳水化合物抗原，诸如Tn、Tf、唾液酸-Tn、Lewis x、Lewis a、Lewis y和神经节苷脂诸如GM3、GD3、9-0-乙酰基GD3、9-0-乙酰基GT3、N-乙醇酰-GM3。
[0054] ILC是在乳腺小叶中发展并已侵入周围组织的癌症。约1/10的侵入性乳腺癌是ILC。ILC通过手术切除癌组织和放射疗法来治疗。另外，化学疗法联合免疫疗法(例如，他莫昔芬和曲妥珠单抗)常用作治疗ILC的辅助疗法。与借助于由癌症相关成纤维细胞(CAF)释放的生长因子和细胞因子为侵入性的IDC一样，ILC也得到CAF相关蛋白FAP-α、FSP-1/S100A4和PDGFR-β帮助。
[0055] 炎性乳腺癌约占所有乳腺癌的1％至3％。在炎性乳腺癌中，癌细胞阻断皮肤中的淋巴管，导致乳房变红并感觉温暖。受累乳腺可能会变大或变硬、变软或发痒。炎性乳腺癌通过化学疗法、免疫疗法、放射疗法以及在一些情况下通过手术来进行治疗。
[0056] 雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌的特征在于癌细胞表面上存在雌激素受体。ER+癌细胞的生长与雌激素(激素依赖性或激素敏感性乳腺癌)的可用性相关。约80％的所有乳腺癌是ER+乳腺癌。ER+乳腺癌的治疗选择包括阻断雌激素的化学治疗剂(例如，他莫昔芬)。
[0057] 三阴性乳腺癌的特征在于不存在雌激素受体、孕酮受体和HER2受体，并且在约10％-20％的诊断的乳腺癌中发生。TNBC可极具攻击性，并且受试者有复发的风险。治疗选择通常包括新辅助化疗(但非抗雌激素诸如他莫昔芬，或抗HER2诸如曲妥珠单抗)，然后进行手术，诸如乳房肿瘤切除术。另外，TNBC是一个高度多样化的癌症组，并且已被分成至少6个展示独特基因表达和起源的TNBC亚型，包括2种基底样(BL1和BL2)亚型、免疫调节(IM)型、间充质(M)亚型、间充质干样(MSL)亚型和腔雄激素受体(luminal androgen receptor)(LAR)亚型(Lehrmann等，J.Clin.Invest,2011,121(7),2750–2767，其通过引用整体并入本文)。已经描述了可特异性靶向TNBC亚型(同上)的突变和标志物。TNBC的其他生物标志物包括但不限于表皮生长因子受体、叶酸受体-α、血管内皮生长因子、c-Myc、C-kit和基底细胞角蛋白、聚(ADP-核糖)聚合酶-1、p53、酪氨酸酶激酶、m-TOR、热和休克蛋白和TOP-2A。另外，肿瘤周围的基质细胞(癌相关成纤维细胞(CAF)和免疫细胞诸如肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和肿瘤相关中性粒细胞(TAN))在通过增加细胞外基质沉积和释放各种促纤维化生长因子(诸如TGFβ、bFGF)和影响癌细胞增殖、侵入和转移(例如通过促进上皮向间充质的转化)的其他因子(诸如成纤维细胞活化蛋白(FAP)、EGF、HGF、MCP-1、CSF-1、VEGF、细胞因子诸如IL1、IL-
8、TNF-α、酶诸如MM2、MMP7、MMP8、MMP9、MMP12、MMP13和COX2)产生针对治疗药物渗透的屏障中起重要作用。TAM通过分泌有利于募集T-reg细胞和产生免疫抑制性微环境的细胞因子和趋化因子(例如IL-10、TGF-β、CCL17、CCL22和CCL24)进一步抑制抗肿瘤免疫应答。
8、TNF-α、酶诸如MM2、MMP7、MMP8、MMP9、MMP12、MMP13和COX2)产生针对治疗药物渗透的屏障中起重要作用。TAM通过分泌有利于募集T-reg细胞和产生免疫抑制性微环境的细胞因子和趋化因子(例如IL-10、TGF-β、CCL17、CCL22和CCL24)进一步抑制抗肿瘤免疫应答。
[0058] 在一些实施方案中，受试者的乳腺病症是乳腺癌、乳头Paget病或叶状肿瘤。在其他实施方案中，乳腺癌是癌变前期、早期癌症、非转移性癌症、转移前癌症、局部晚期癌症或转移性癌症。
[0059] 在其他实施方案中，受试者患有选自以下的乳腺癌：原位导管癌(DCIS)、原位小叶癌(LCIS)、侵入性(或浸润性)小叶癌(ILC)、侵入性(或浸润性)导管癌(IDC)、微浸润性乳腺癌(MIC)、炎性乳腺癌、ER阳性(ER+)乳腺癌、孕酮受体阳性(PR+)乳腺癌、ER+/PR+乳腺癌、ER阴性(ER-)乳腺癌、HER2+乳腺癌、三阴性乳腺癌(即，ER-/PR-/Her2-乳腺癌；“TNBC”)、腺样囊性(腺样囊性)癌、低度腺鳞癌、髓样癌、粘液(或胶样)癌、乳头状癌、小管癌、化生性癌和微乳头状癌。
[0060] 在一些实施方案中，受试者患有持续性或复发性疾病，即在用另一种治疗性干预包括化疗(诸如吉西他滨、他莫昔芬、曲妥珠单抗等)或辐照治疗后。在其他实施方案中，受试者已对另一种治疗药物产生抗性。如本文中所用，术语“抗性”是指两类抗性：(a)从头抗性，即，从治疗开始对疗法或治疗剂的无反应性，和(b)获得性抗性，在初始反应性后对疗法或治疗剂无反应性，或治疗剂依赖性生长/刺激的生长同时继续表达受体(或配体，在治疗剂适用的情形下)。
[0061] 在一些实施方案中，受试者是他莫昔芬抗性或他莫昔芬难治性的。如本文中所用，术语“他莫昔芬难治性”是指每天给予他莫昔芬至少进行2天并且具有小于15nM(例如，小于20n M、小于25nM、小于30nM)的血浆内西芬水平的受试者。对他莫昔芬的获得性抗性可能早在3个月至1年至晚至5至10年发生。在一个方面，经乳头治疗方法特别适用于治疗癌变前期、早期癌症、非转移性癌症、转移前癌症和局部晚期癌症。在另一方面，经乳头治疗方法也适用于治疗转移性癌症。
[0062] 因此，本文首次公开了用于治疗患有乳腺病症或有患乳腺病症风险的受试者的过继细胞疗法的经乳头方法。将本文公开的细胞或组合物施用于受试者的母乳导管腔。在一个新颖的方面，本文公开的经乳头治疗方法是非侵入性的或极低侵入性的，并且通常不涉及破坏皮肤或组织屏障。相反，将细胞通过受试者自己的乳房乳头的乳头中的天然导管开口(乳腺癌诸如DCIS通常起源于其中)施用于受试者。
[0063] 在另一个新颖方面，本发明包括将本文公开的细胞或组合物递送至母乳导管中的肿瘤的顶端表面。在乳腺中，乳腺导管具有双层上皮细胞；内层由极化的腔细胞制成，所述腔细胞被外部肌上皮细胞层包围，所述外部肌上皮细胞层与基底膜接触。乳房上皮细胞的顶端表面面向导管的中央管腔，在妊娠期间乳汁分泌到其中。基底外侧区域与邻近的腔细胞以及肌上皮细胞和基底膜接触(Chatterjee和McCaffrey.Breast Cancer:Targets&Therapy.2014:6 15–27)。施用到乳腺导管腔中的细胞可以在导管的腔(和/或微腔)内迁移穿过顶端，进入乳腺或肿瘤组织。因此，在一些实施方案中，经修饰的细胞接近肿瘤并对肿瘤进行顶端攻击而不是进行基底外侧攻击。如本文所公开的经修饰的细胞的顶端攻击特别适用于治疗转移前癌症。目前的治疗方法通常包括肠胃外(通过注射和输注，通常为静脉内或瘤内)施用过继细胞疗法(诸如CAR-T细胞)。本领域已知的其他递送方法包括皮下、鼻内、腹膜内、肺内、动脉内、肌内和腹膜内等(参见，例如，US 2016/0045551；美国专利第9,365,641号、US 2016/0206656)。在这些情况中的每一种情况下，需要转移的细胞长距离迁移并存活足够长的时间以接触受累组织。这些方法中的途径是肿瘤的基底侧攻击。
[0064] 本文公开了向患有乳腺病症或有患乳腺病症风险的受试者的母乳导管施用细胞或包含经修饰的细胞的组合物的经乳头方法。在一些实施方案中，将细胞或组合物施用到一个母乳导管中。在其他实施方案中，将本文公开的细胞或组合物施用至2至5个乳腺导管、4至8个乳腺导管或7至11个乳腺导管中。
[0065] 可通过本领域已知的任何方法将细胞或包含细胞的组合物经乳头递送至乳腺导管中。这些包括但不限于使用注射器/针头的注射(Krause等人，J.Vis.Exp.2013；(80):50692)；套管、导管、探针以及美国专利第6,413,228号、6,689,070号、6,638,727号、专利申请PCT/US2015/010808中公开的那些)、定时释放胶囊和包封装置等。
[0066] 作为非限制性实例，在一些实施方案中，可向受试者的母乳导管施用本文公开的细胞或组合物，其包括(a)使包含在装置的治疗室内的包含经修饰的细胞的组合物与乳腺的乳头接触；和(b)对组合物施加正压。在一些实施方案中，组合物由于正压而被迫进入乳腺导管。优选地，将组合物压入一个或多个乳腺导管中。在其他实施方案中，将组合物压入2至5个乳腺导管、4至8个乳腺导管或7至11个乳腺导管中。
[0067] 例如，美国专利第6,413,228号公开了一种导管进入装置，其能够收集导管液并用洗涤液灌注导管。为了本公开的目的，这种装置可被适当地调适或配置用于本发明的细胞或组合物的经乳头递送。
[0068] 在一些实施方案中，该装置是套管。
[0069] 作为导管内施用的替代方法，可以在导管中或在进入导管的乳头的表面处安装小泵，以便将经修饰的细胞缓慢连续地施用到导管区域，例如，可将泵安装在输乳窦中以用于施用其中的经修饰的细胞并使细胞扩散到导管的其余部分，或者可将泵安装在进入导管的乳头表面上。安装在乳头表面上的泵可以是成形的，例如如大头钉(或具有顶部或钉部分的顶针形部分，其余部分在乳头表面上，其中一部分延伸到需要治疗或有需要治疗的风险的导管中。泵机械可以包括例如 渗透(微型)泵(Viadur)(由Johnson&Johnson,IntelliDrug获得的Alza Corp制造的)、 (Durect Corp.)、Ivomec bolus等
(Herrlich等，Advanced Drug Delivery Reviews,2012，第1617-1626页)。
(Herrlich等，Advanced Drug Delivery Reviews,2012，第1617-1626页)。
[0070] 渗透泵也可以基本上如美国专利第5,531,736号、美国专利第5,279,608号、美国专利第5,562,654号、美国专利第5,827,538号、美国专利第5,798,119号、美国专利第5,795,591号、美国专利第4,552,561号或美国专利第5,492,534号中所述的泵一样组装或配置，其中对尺寸和体积进行适当修改以用于向乳腺的导管施用，例如用于放入导管(例如输乳窦)或放置在乳头表面上。尖端(进入导管的)可以能够旋转，以便容纳乳头表面上的各种位置的导管。单个平头泵(tack-head pump)可具有一个或多个放置在平头下方的尖端，以便进入特定的一个或多个导管，例如当需要进入乳腺中的两个或更多导管时。如此配置并装载有包含用于导管内施用的细胞的适当配制的组合物的泵可如所述施用经修饰的细胞，但还可包含和施用除细胞外的试剂以用于治疗乳腺导管中的癌前或癌症病况的适当治疗目的。可以想象，泵可被配置成向位于乳腺中的所有导管施用，其中进行一些尺寸和体积改变。
[0071] 细胞包封装置是另一种吸引人的方法，包括微包囊化和宏包囊化装置。已开发了自折叠免疫保护性细胞包囊化装置，其中通过用合成半透性纳米多孔膜包围细胞来免疫分离细胞，所述纳米多孔膜允许营养物和治疗剂的选择性渗透。这种包囊化装置包括小袋、纤维、珠粒和由半透性材料制成的任何装置，其中容纳有细胞。此类装置可被配置用于过继细胞疗法。例如，装置可以用可生物降解的材料制备，以便在导管内释放细胞。
[0072] 可用于本发明目的的装置可以是可植入的。例如，Stephan等已描述了用于递送过继细胞疗法的生物聚合物植入物(Stephan等，Nature Biotechnology,2015,33,97-101)。在一个方面，本文提供了可植入的装置，例如套管、导管、微导管、珠粒、包囊化装置等。可植入装置例如可被配置成靠近受累组织施用本发明的细胞和组合物，并减少它们与正常细胞的接触。
[0074] 预调理
[0075] 用免疫耗竭(例如，淋巴细胞清除)疗法预调理受试者导致施用细胞的扩增。例如，T细胞可以扩增并获得可改善过继细胞疗法(ACT)效果的记忆表型。利用淋巴细胞清除剂诸如环磷酰胺、环孢菌素、氟达拉滨、苯达莫司汀、来那度胺、泊马度胺、吉西他滨、BTK抑制剂诸如依鲁替尼、溶瘤病毒诸如溶瘤腺病毒，包括其组合的预调理已经有效地改善了转移的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的在细胞疗法中的功效，包括改善转移细胞的应答和/或持久性。通过消除称为“细胞因子退去(cytokine sink)”的现象，根除T-reg细胞的抑制影响以及增强APC活化和可用性而增加对稳态细胞因子(诸如IL-7和IL-15)的获取，似乎是这种范式所涉及的潜在机制。参见，例如，Dudley等，2002 Science,298,850-54；Rosenberg等，Clin Cancer Res 2011,17(13):4550-4557。同样，在CAR-T细胞的背景下，若干研究已掺入了淋巴细胞清除剂，最常见的是环磷酰胺、氟达拉滨、苯达莫司汀或其组合，有时伴有低剂量辐照。参见Han等，Journal of Hematology&Oncology 2013,6:47；Kochenderfer等，Blood
2012；119:2709-2720；Kalos等，Sci Transl Med 2011,3(95):95ra73；临床试验研究记录号：NCT02315612、NCT01822652。可以进行这种预调理，目的是降低可能降低治疗功效的各种结果中的一种或多种的风险。这些包括细胞因子退去，由此T细胞、B细胞、NK细胞与TIL竞争稳态和活化细胞因子诸如IL-2、IL-7和/或IL-15；通过调节性T细胞、NK细胞或免疫系统的其他细胞抑制TIL；负调节因子对肿瘤微环境的影响。Muranski等，Nat Clin Pract Oncol.2006December；3(12):668-681。
2012；119:2709-2720；Kalos等，Sci Transl Med 2011,3(95):95ra73；临床试验研究记录号：NCT02315612、NCT01822652。可以进行这种预调理，目的是降低可能降低治疗功效的各种结果中的一种或多种的风险。这些包括细胞因子退去，由此T细胞、B细胞、NK细胞与TIL竞争稳态和活化细胞因子诸如IL-2、IL-7和/或IL-15；通过调节性T细胞、NK细胞或免疫系统的其他细胞抑制TIL；负调节因子对肿瘤微环境的影响。Muranski等，Nat Clin Pract Oncol.2006December；3(12):668-681。
[0076] 因此，在一些实施方案中，所述方法包括在第一或后续剂量之前向受试者施用预调理剂，诸如淋巴细胞清除剂或化学治疗剂，例如环磷酰胺、环孢菌素、氟达拉滨、苯达莫司汀、来那度胺、泊马度胺、吉西他滨、BTK抑制剂诸如依鲁替尼、溶瘤病毒诸如溶瘤腺病毒或其组合。例如，可在第一或后续剂量之前至少2天，诸如至少3天、4天、5天、6天或7天向受试者施用预调理剂。在一些实施方案中，在第一或后续剂量之前不超过7天，例如不超过6天、5天、4天、3天或2天向受试者施用预调理剂。
[0077] 可以以0.5g/m2至5g/m2，诸如1g/m2g至4g/m2、1g/m2至3g/m2或2g/m2至4g/m2的淋巴细胞清除剂向受试者施用本文所述的淋巴细胞清除剂。在一些方面，向受试者施2g/m2环磷酰胺。在一些实施方案中，用20mg/kg至100mg/kg，诸如40mg/kg至80mg/kg的剂量的环磷酰胺预处理受试者。在一些方面，用60mg/kg环磷酰胺预处理受试者。施用的淋巴细胞清除剂的量将由主治医师确定。
[0078] 在一些实施方案中，当淋巴细胞清除剂包含氟达拉滨时，以1g/m2至100g/m2，诸如10g/m2至75g/m2、15g/m2至50g/m2、20g/m2至30g/m2或24g/m2至26g/m2的剂量向受试者施用氟达拉滨。在一些情况下，以25g/m2向受试者施用氟达拉滨。在一些实施方案中，氟达拉滨可以以单剂量施用或者可以以多个剂量施用，诸如每天给药，隔天给药或每三天给药。例如，在一些情况下，施用药剂(例如氟达拉滨)1至5次或约1次至5次，诸如3至5次或约3至5次。在一些实施方案中，这样的多个剂量在同一天施用，诸如每天1至5次或3至5次。
[0079] 在一些实施方案中，淋巴细胞清除可以用一种或多种淋巴细胞清除剂进行。例如，受试者在第-7天和第-6天经1个小时静脉内接受环磷酰胺，并且在第-7天至第-3天经30分钟背驮式静脉内接受磷酸氟达拉滨。然后在第0天，向受试者施用本文公开的细胞或组合物。
[0080] 给药
[0081] 通常设计细胞和组合物给药的时间安排和大小以降低毒性结果的风险或最小化毒性结果和/或提高功效，诸如例如随时间推移提供受试者对细胞的更快和增加的暴露。施用的量和频率将由诸如患者的状况、年龄、体重、肿瘤大小和分期以及受试者疾病的严重程度等因素确定，尽管适当的剂量可由主治医师确定。
[0082] 通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定最佳剂量和给药方案。细胞或组合物可以这些剂量进行多次施用。因此，该方法可包括在一段时间内的单一剂量或多个剂量或者例如通过输注进行的连续剂量。在一些实施方案中，剂量可以是单个单位剂量。在其他实施方案中，单个剂量可以是分散的单位剂量。如本文中所用，术语“分散单位剂量”是指分散的，使得其在一天内(包括在超过一天内)施用超过一次的单位剂量。因为用于本发明目的的分散单位剂量被认为是单个剂量，即一个单位剂量。分散剂量的示例性方法包括在第一天施用25％的剂量并在第二天施用剩余的剂量。在另一个实施方案中，可将单位剂量分成2份(每份50％)以在连续的2天中递送。在另一个实施方案中，可以隔天施用分散单位剂量。在另一个实施方案中，可将单位剂量分成3份以在连续的3天中等量施用。
[0083] 本文公开的方法包括将一个或多个连续剂量的细胞施用到可能已经接受第一剂量的受试者的乳腺导管中，和/或施用第一剂量和一个或多个后续剂量。剂量以特定的量并按照特定时间安排和参数施用。
[0084] 在另一方面，经乳头施用第一剂量，并通过任何合适的方式(包括经乳头，通过注射和通过输注，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、横穿隔膜注射(trans-septal injection)、巩膜下注射、脉络膜内注射、前眼房注射、结膜下注射、结膜下注射(subconjuntival injection)、筋膜下注射(sub-Tenon's injection)、球后注射、球周注射或巩膜后注射(posterior juxtascleral delivery))施用任何后续剂量。在一些实施方案中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内施用，以及局部治疗需要时，则通过病变内递送。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、胸腔内、颅内或皮下施用。
[0085] 在一些实施方案中，该方法通常涉及施用第一剂量的细胞，从而减轻疾病负担。这之后可以在相对于第一剂量的窗口的特定时间内施用后续剂量的细胞，或者向接受第一剂量的受试者施用后续剂量。在一些实施方案中，第一剂量相对较低。设计施用的细胞数和细胞剂量的时间安排以改善一个或多个结果，诸如降低毒性诸如CRS、MAS、TLS、神经毒性等的可能性或程度。
[0086] 在一些实施方案中，本文公开了涉及以比第一/初始剂量更多的数量施用后续剂量的细胞并因此施用更高剂量的方法。
[0087] 在给药方案涉及多剂量的情况下，可以每日1次、每隔1日1次、每2日1次、每3日1次、每5日1次、每7日1次、每14日1次、每15日1次、每28日1次、每月1次、每季度1次、每6个月1次、每年1次施用每个剂量。
[0088] 在一些方面，从初始(第一)剂量开始至下一剂量开始之间衡量初始剂量后的用药时间(timing of doses)。在其他实施方案中，从初始(第一)剂量完成开始衡量初始剂量后的用药时间。
[0089] 本发明包括初始剂量可以是分散单位剂量，然后是其后施用的第二剂量。在一些实施方案中，第二剂量或后续剂量可以是分散单位剂量。作为非限制性实例，分散单位剂量可以在三天内施用，并且第二单位剂量在第二天施用，或者可以在一年后施用。初始剂量意在针对需要这种剂量的受试者设置任何限制，暗指所述受试者之前从未接受细胞疗法的剂量，或者甚至受试者之前并未接受表达相同重组受体或靶向相同抗原的相同细胞的剂量。
[0090] 通常，可以以在以下范围内的单位剂量施用细胞或包含细胞诸如本文所述的经修饰的细胞的组合物：1×103至5×108个经修饰的细胞/kg体重、0.5×103至1×107个经修饰4 6 4 6
的细胞/kg体重、1×10至0.5×10个经修饰的细胞/kg体重、0.5×10 至1×10个经修饰的细胞/kg体重、1×105至0.5×106个经修饰的细胞/kg体重(每一个范围均包括端值)。第一剂量可小于1×103个细胞/kg、小于0.5×104个细胞/kg、小于1×104个细胞/kg、小于0.5×105个细胞/kg、小于1×105个细胞/kg、小于0.5×106个细胞/kg、小于1×106个细胞/kg、小于
7 7 8 8
0.5×10个细胞/kg、小于1×10个细胞/kg、小于0.5×10个细胞/kg、小于1×10个细胞/
kg、小于5×108个细胞/kg。
的细胞/kg体重、1×10至0.5×10个经修饰的细胞/kg体重、0.5×10 至1×10个经修饰的细胞/kg体重、1×105至0.5×106个经修饰的细胞/kg体重(每一个范围均包括端值)。第一剂量可小于1×103个细胞/kg、小于0.5×104个细胞/kg、小于1×104个细胞/kg、小于0.5×105个细胞/kg、小于1×105个细胞/kg、小于0.5×106个细胞/kg、小于1×106个细胞/kg、小于
7 7 8 8
0.5×10个细胞/kg、小于1×10个细胞/kg、小于0.5×10个细胞/kg、小于1×10个细胞/
kg、小于5×108个细胞/kg。
[0091] 在一些方面，第一剂量是低剂量，诸如小于1×103个细胞/kg、小于0.5×104个细胞/kg、小于1×104个细胞/kg、小于0.5×105个细胞/kg、小于1×105个细胞/kg、小于0.5×6 6 5
10个细胞/kg或小于1×10个细胞/kg。在至少一些实施方案中，第一剂量小于1×10个细胞/kg。
10个细胞/kg或小于1×10个细胞/kg。在至少一些实施方案中，第一剂量小于1×10个细胞/kg。
[0092] 在其他实施方案中，第一剂量是高剂量，例如大于0.5×105个细胞/kg、大于1×105个细胞/kg、大于0.5×106个细胞/kg、大于1×106个细胞/kg、大于0.5×107个细胞/kg、大于1×107个细胞/kg、大于0.5×108个细胞/kg、大于1×108个细胞/kg、大于5×108个细胞/kg。
[0093] 在一些实施方案中，例如，在确定毒性和/或疾病负担的风险为低的情况下，第一剂量可以是相对高剂量的细胞，诸如大于0.5×105个细胞/kg、大于1×105个细胞/kg、大于0.5×106个细胞/kg、大于1×106个细胞/kg、大于0.5×107个细胞/kg、大于1×107个细胞/kg、大于0.5×108个细胞/kg、大于1×108个细胞/kg和大于5×108个细胞/kg。此类细胞可以是表达一种或多种重组受体诸如CAR或工程化TCR的经修饰的细胞。此类经修饰的细胞可以是T细胞、NK细胞、CTL、单核细胞、粒细胞或其祖细胞。在至少一个实施方案中，第一剂量可以是相对高的剂量，诸如大于1×107个细胞/kg体重。
[0094] 在一些实施方案中，例如，在确定毒性和/或疾病负担的风险为高的情况下，第一剂量可以是相对低剂量的细胞，诸如小于1×103个细胞/kg、小于0.5×104个细胞/kg、小于1×104个细胞/kg、小于0.5×105个细胞/kg、小于1×105个细胞/kg、小于0.5×106个细胞/kg和小于1×106个细胞/kg。此类细胞可以是表达一种或多种重组受体诸如CAR或工程化TCR的经修饰的细胞。此类经修饰的细胞可以是T细胞、NK细胞、CTL、单核细胞、粒细胞或其祖细5
胞。在至少一个实施方案中，第一剂量可以是相对低的剂量，诸如小于1×10个细胞/kg体重。
胞。在至少一个实施方案中，第一剂量可以是相对低的剂量，诸如小于1×10个细胞/kg体重。
[0095] 在一些实施方案中，第一剂量足够大以有效减轻疾病负担。在一些实施方案中，第一剂量足够大以在体内扩增和减轻疾病。在至少一个实施方案中，第一剂量足够大以减小肿瘤负荷。在另一个实施方案中，第一剂量减小肿瘤尺寸。
[0096] 在一些实施方案中，数量和/或浓度是指表达嵌合受体的经修饰的细胞的数量。在其他实施方案中，数量和/或浓度是指所有施用细胞的数量。
[0097] 在一些实施方案中，在第一剂量相对高的情况下，后续剂量可低于第一剂量。在其他实施方案中，在第一剂量相对低的情况下，后续剂量可以高于第一剂量。在其他实施方案中，初始剂量之后的剂量可以是逐渐升高的剂量。在其他实施方案中，第二剂量高于初始剂量，并且后续剂量保持与第二剂量相同。在另外的实施方案中，在第一剂量是相对较高的剂量的情况下，后续剂量可以是逐渐降低的剂量。
[0098] 副作用和毒性结果
[0099] 过继细胞疗法(诸如利用表达嵌合受体的经修饰的细胞的治疗)的施用可以诱导严重的毒性结果或副作用，诸如细胞因子释放综合征(CRS)、巨噬细胞活化综合征(MAS)、肿瘤溶解综合征(TLS)、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答(Bonifant等，Mol.Ther.–Oncolytics(2016)3,16011)。CRS的症状(诸如发热和CRP蛋白水平升高)在第一剂量后不久数小时内出现，同时细胞因子(诸如肿瘤坏死因子α(TNFα)、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和IL-10)的表达增加。治疗通常包括抗IL-6治疗。
[0100] 在一些方面，初始剂量和/或后续剂量的大小基于一个或多个标准(诸如受试者对先前治疗例如化学疗法的应答、疾病负担、肿瘤负荷、体积大小或程度、范围(extent)和类型转移、毒性副作用(诸如CRS相关结果、MAS相关结果、TLS相关结果、神经毒性相关结果和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答相关结果)的阶段和可能性)来测定。当受试者具有大的疾病负担时，可以向受试者施用低剂量的包含经修饰的细胞的组合物。
当受试者具有低疾病负担时，可以向受试者施用更大剂量的包含经修饰的细胞的组合物。
另外，剂量可以根据肿瘤负荷而变化。
当受试者具有低疾病负担时，可以向受试者施用更大剂量的包含经修饰的细胞的组合物。
另外，剂量可以根据肿瘤负荷而变化。
[0101] 在一个方面，本文公开的经乳头方法随着时间的推移增加细胞暴露，从而减少毒性结果。高剂量的初始施用不一定在具有高疾病负担(例如，高肿瘤负荷)的受试者中产生更高的效力。高剂量也不需要转化为施用的细胞的持久性。本文公开的经乳头方法提供优于旨在降低毒性结果的风险和/或提高功效的其他方法的有利方面。
[0102] 在一些实施方案中，所述方法包括施用初始剂量的表达重组受体(例如，可在靶抗原存在下扩增并减轻疾病负担和/或降低毒性结果的CAR)的经修饰的细胞。此类扩增可局限在乳腺导管或小叶中或靠近受累组织。在施用初始剂量后可以监测受试者状况。
[0103] 通常，后续剂量可在第一剂量开始后7至28天(第7天和第28天包括在内)施用。例如，在第一剂量或先前剂量开始后至少7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天或27天，或在第一剂量或先前剂量开始后超过14天或15天或21天。在一些实施方案中，后续用药时间将由副作用的风险或毒性结果(诸如CRS、MAS、TILS、神经毒性、宿主免疫应答(体液或适应性))等确定。后续用药时间将通过监测和/或评估症状、副作用、毒性结果和/或宿主免疫应答以及此类病症、副作用、毒性结果、宿主免疫应答的可接受水平等中的一种或多种的存在来确定。在此类症状、副作用、毒性结果、宿主免疫应答等处于可接受的水平之后，向受试者施用后续剂量。在一些实施方案中，可在受试者对第一剂量产生宿主免疫应答之前或在宿主免疫应答可检测或达到某一水平、程度或阶段之前施用后续剂量。在一些实施方案中，在第一剂量的经修饰的细胞之后28天、35天或42天之前，不能检测到宿主免疫应答(体液或适应性)。在其他实施方案中，在第一剂量或先前剂量后28天内或35天内或在第一剂量或先前剂量开始后24天、25天、26天或27天之前施用后续剂量。
[0104] 在一些实施方案中，第一剂量包含足以减轻疾病负担的量的细胞，并且在受试者中指示CRS的因子的血清水平不高于在即将施用第一剂量时该指示剂的血清水平10倍或25倍时，和/或在CRS相关结果已达到其峰值水平并在施用第一剂量后开始下降后的时候，以及受试者未表现出可检测的对由第一剂量的经修饰的细胞表达的重组受体特异的适应性宿主免疫应答时，施用后续剂量。
[0105] 细胞暴露和持久性
[0106] 在一些实施方案中，将剂量的量和/或用药时间设计为促进受试者暴露于细胞，例如通过促进其随时间的扩增和/或持久性。在一些实施方案中，本文提供的经乳头方法缩短了用于浸润受累乳腺组织的迁移期。在一些实施方案中，本文提供的经乳头方法增加受试者对施用的细胞或组合物的暴露和/或提高其在过继细胞疗法中的功效和治疗结果。在一些方面，与其他方法相比，对经修饰的细胞的更大和更快的暴露改善了治疗结果。此类结果可包括患者的生存和缓解和/或降低的毒性结果。
[0107] 在一个方面，可用造影剂，诸如基于钆的试剂诸如钆螯合物、钆富勒烯醇、超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)、19F全氟化碳纳米颗粒和其他磁性报告基因(诸如基于金属蛋白的MRI探针)标记经修饰的细胞。这将允许跟踪经修饰的细胞迁移和定位经修饰的细胞。在19
一些实施方案中，用造影剂诸如钆螯合物、超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)、F全氟化碳纳米颗粒或其他磁性报告基因(诸如基于金属蛋白的MRI探针)标记经修饰的细胞。在至少一个实施方案中，造影剂是钆螯合物。钆螯合物是临床上批准的造影剂，其已被用于在实验细胞MRI研究中标记细胞。可以通过文献中已知的方法(例如，通过电穿孔)将它们加载到细胞中。
一些实施方案中，用造影剂诸如钆螯合物、超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)、F全氟化碳纳米颗粒或其他磁性报告基因(诸如基于金属蛋白的MRI探针)标记经修饰的细胞。在至少一个实施方案中，造影剂是钆螯合物。钆螯合物是临床上批准的造影剂，其已被用于在实验细胞MRI研究中标记细胞。可以通过文献中已知的方法(例如，通过电穿孔)将它们加载到细胞中。
[0108] 在一些实施方案中，检测在第一次剂量后和/或一个或多个后续剂量后受试者中表达重组受体(例如CAR)的细胞的存在和/或量。表达重组受体的细胞的存在和/或量可通过本领域已知的任何方法检测。例如，检测可以是通过测量编码受体的DNA或质粒的拷贝数/微克DNA或经修饰的细胞的数量/微升样品(例如，血液、血清、乳头吸出液，每PBMC的总数)的定量PCR(qPCR)测定或下一代测序方法，或通过基于细胞的测定(诸如针对表达重组受体的经修饰的细胞的ELISA)。在一些实施方案中，至少50个、至少100个、至少500个、至少1×103个、至少0.5×104个、至少1×104个、至少0.5×105个、至少1×105个、至少0.5×106个、至少1×106个或至少1×107个、至少1×108个细胞是可检测的。
[0109] 在一些实施方案中，通过一个或多个后续剂量后和/或第一剂量施用后的方法产生的受试者中表达受体(例如CAR)的细胞的持久性与通过本领域已知的其他递送途径施用的所述细胞的持久性相比更长。在一些实施方案中，通过一次或多次后续剂量之后和/或在施用第一剂量之后的方法产生的受试者中表达受体(例如CAR)的细胞的持久性与通过替代给药方案施用的那些相比更长。在一些实施方案中，施用的细胞向乳腺组织(例如受累组织)中的迁移和/或浸润可通过MRI扫描或者通过乳腺组织的切除(通过乳房切除术或通过术后乳房肿瘤切除术)经免疫组织化学法来检测。
[0110] 在另一个方面，受试者对所施用的细胞的暴露增加包括如通过存在于乳头液(nipple fluid)(通过抽吸或导管灌洗收集的)中的细胞的流式细胞术定量测得的细胞的体内扩增增加。已公开和描述了用于收集乳头抽吸物或导管灌洗液的装置(例如，和Fullcyte)(US6,689,070；US6,585,706)。
[0111] 在一些实施方案中，在施用第一剂量后至少15天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天或60天或更多天，或在施用后续剂量至少4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、20周、21周、22周、23周、24周后，可在乳腺导管中检测到经修饰的细胞。
[0112] 细胞
[0113] 可用于本发明目的的过继细胞疗法的细胞包括基因工程化细胞(经修饰的细胞)和未修饰的免疫细胞，例如外周血单核细胞(PBMC)、T细胞、NK细胞、CTL、TIL、其祖先等。
[0114] 如本文中所用，“经修饰的细胞”是表达至少一种重组受体的基因工程化细胞，所述重组受体被设计为识别和/或特异性结合与疾病或病症诸如乳腺病症相关的靶分子，并产生应答，诸如在与这此类分子结合后对此类分子的免疫应答。
[0115] 用于本发明目的的经修饰的细胞通常是真核细胞，诸如哺乳动物细胞。通常，哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴样器官。细胞通常是来自免疫系统的细胞，诸如适应性或先天免疫的细胞。此类细胞可以是淋巴样细胞或髓样细胞，包括T淋巴细胞(T细胞)、自然杀伤细胞(NK细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、细胞毒性淋巴细胞(CTL)及其祖细胞。细胞可以是干细胞诸如多能干细胞和亚全能干细胞(pluripotent stem cell)，包括可诱导型亚全能干细胞(iPSC)。细胞通常是原代细胞，诸如从受试者分离的细胞，和/或从受试者分离并冷冻的细胞。
[0116] 经修饰的细胞可包括T细胞亚群或其他细胞类型中的一种或多种，诸如全T细胞群、CD4+、CD8+T细胞及其亚群。T细胞和/或CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的亚群包括原初T细胞、效应T细胞、记忆T细胞及其亚型(诸如干细胞记忆T细胞、中枢记忆T-细胞、效应记忆T细胞或终末分化记忆T细胞)、肿瘤浸润性T细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞(诸如TH1细胞、TH2细胞和TH3细胞、TH17细胞、TH19细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞)、细胞毒性T细胞(CTL)、粘膜相关不变T细胞(MAIT细胞)、天然存在和适应性调节性T细胞(T-regs)、α/βT细胞和δ/γT细胞。经修饰的细胞还可包括TCR缺陷型T细胞。
[0117] 细胞亚群可以通过功能、活化、状态、成熟度、分化潜力、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、在特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌谱和/或分化程度来定义。在一些实施方案中，经修饰的细胞包括倾向于定位在乳腺组织中的细胞。
[0118] 在一些实施方案中，经修饰的细胞是T细胞。在其他实施方案中，经修饰的细胞是CTL。在其他实施方案中，经修饰的细胞是天然杀伤(NK)细胞。在其他实施方案中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如髓样细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。经修饰的细胞也可以是本文公开的任何细胞的祖细胞。在一些实施方案中，经修饰的细胞是T细胞、NK细胞、CTL、单核细胞和粒细胞的祖细胞。
[0119] 关于受试者，经乳头施用的经修饰的细胞可以是自体的、异源的(同种异体的)或异种的。如本文中所用，“自体的”是指源自与其随后被引入到其中的个体相同的个体的任何材料(诸如细胞)。如本文中所用，“异源的”和“同种异体的”是指源自与材料被引入到其中的个体属同一物种的不同动物的任何材料(诸如细胞)。当一个或多个基因座处的基因不相同时，两个或更多个体被认为是彼此同种异体的。在一些方面，来自同一物种的个体的同种异体材料对于抗原性相互作用在遗传上可以充分不同。一些细胞可以是从健康供体获得的“现成的”或“通用的”供体细胞(Torikai等，Blood 2012 119:5697-5705)。如本文中所用，“异种的”是指源自不同物种的动物的材料(诸如细胞)。
[0120] 在一些实施方案中，细胞可源自细胞系例如T细胞系和NK细胞系。在一些实施方案中，细胞来自异种来源，例如来自猪、小鼠、大鼠和非人灵长类动物。在其他实施方案中，细胞可源自脐带血。
[0121] 从循环血液中分离细胞并通过例如基于非亲和力的技术(诸如单采血液成分术或白细胞去除术)和基于密度的细胞分离方法(诸如，percoll或ficoll梯度离心)，通过基于亲和力或免疫亲和性的技术(诸如通过一种或多种特定分子(诸如细胞表面分子)在细胞上的表达或存在进行的分子)来收获细胞。在基于亲和力的分离的情况下，分离可以是正选择(细胞与其配偶体保持结合)或负选择，其中细胞未与抗体或其结合配偶体结合并得以保留。如果针对标志物的抗体是不可获得的，则后者是有用的。分离不一定导致一种或多种特定细胞群的100％富集或去除。可进行一轮或多轮分离以获得所需的富集群体。与磁珠例如DYNABEADS或MACS珠缀合的结合配偶体或抗体可用于分离和富集细胞。分离和/或富集也可以通过流式细胞术、FAC、流控技术、MEM方法进行。可使用ExPact Treg珠、TransAct珠、Expamer和/或使用基于细胞的T细胞活化(诸如抗原呈递细胞(APC)，诸如树突状细胞、人工APC等)进一步进行细胞选择。已由Wang和Riviere在Molecular Therapy–Oncolytics(2016)3,16015(其通过引用整体并入本申请)中描述了用于临床制造细胞的方法。
[0122] 可通过在单个步骤中使用多种结合配偶体或抗体来同时选择多个细胞类型。诸如，在一些方面，可通过基于亲和力的正或负选择方法分离T细胞的特定亚群，诸如表达高水平的一种或多种细胞表面标志物(诸如CD3+、CD4+、CD8+、CD27+、CD28+、CD45RA+、CD45RO+和/或CCR7+)的细胞。
[0123] 在一些实施方案中，通过鉴定具有适当的细胞表面抗原的细胞群，将CD4+辅助细胞富集并分选为原初细胞(具有CD45RO/CD45RA+/CD62L+抗原)、中枢记忆细胞(具有CD62L+/CD45RO+抗原)和效应细胞(具有CD62L-/CD45RO-抗原)。
[0124] 重组受体
[0125] 经修饰的细胞表达重组受体，其包括嵌合受体，诸如嵌合抗原受体(CAR)，和其他转基因抗原受体，包括疾病特异性T细胞受体(TCR)和工程化TCR，诸如转基因TCR。在一个方面，本文公开的经修饰的细胞可包括一种或多种重组受体。诸如，经修饰的细胞可表达第一CAR、第二CAR、第三CAR等，其中每一种可以独立地是单特异性的、双特异性的或多特异性的。在至少一个实施方案中，经修饰的细胞可以表达至少两种嵌合受体，每种嵌合受体识别不同的靶抗原。
[0126] 另一方面，经乳头表达的经修饰的细胞可包括为表达不同重组受体的细胞混合物的细胞，例如，经修饰的细胞包括表达HER2-CAR的第一细胞和表达FAP-CAR或PD-1-CAR的第二细胞。重组受体的表达可以是组成型的、诱导型的、瞬时的或可开关的(switchable)。在一个方面，重组受体，包括CAR和工程化或疾病特异性TCR，包含至少一种包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含功能信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的嵌合重组蛋白。
[0127] 可以从罕见的肿瘤活性T细胞中分离为疾病特异性(例如，乳腺癌特异性)的TCR，或者在不可能的情况下，可以采用替代技术来产生高活性的抗肿瘤T细胞抗原。在一些实施方案中，可以免疫转基因小鼠以产生表达针对HLA限制性人肿瘤抗原的TCR的T细胞(Stanislawski等，Nat.Immunol.2001,2,962–970)。
[0128] 在一些实施方案中，其中从经历肿瘤缓解的患者中分离肿瘤特异性T细胞的同种异体TCR基因转移，并且将反应性TCR序列从共有疾病但无反应的宿主T细胞转移至T细胞(Gao等，Blood.2000,95,2198–2203；de Witt et al.,2006,Blood,108,870–877)。在其他实施方案中，体外技术可用于改变TCR的序列，通过增加弱反应性肿瘤特异性TCR与靶抗原的相互作用强度(亲合力)来增强它们的肿瘤杀伤活性(Robbins等，2008,J.Immunol.180,6116–6131)。在一些实施方案中，表达TCR的经修饰的细胞缺乏自身TCR，即TCR被转移至TCR缺陷型细胞。
[0129] 如本文中所用，术语“嵌合抗原受体”和“CAR”是指包含细胞外抗原结合结构域(Ag结合结构域)、跨膜(Tm)结构域和细胞内细胞质信号传导结构域(其包含源自如下面定义的刺激性分子的功能性信号传导结构域)的重组多肽构建体。CAR结合了抗体样识别和T细胞激活功能。
[0130] 重组受体诸如CAR或者工程化或疾病特异性TCR可靶向细胞表面分子、细胞内抗原(例如，通过HLA限制性呈递)或两者。
[0131] 在重组受体的(例如，CAR的)Ag结合结构域与其靶抗原结合后，细胞质信号传导结构域激活诱导持久性、运输和效应子功能的细胞内信号传导。例如，Ag结合结构域可以利用抗体的抗原结合特性，以非MHC限制性方式将T细胞特异性和反应性重定向到选定的靶标。非MHC限制性抗原识别赋予表达CAR的T细胞以识别抗原的能力而不依赖于抗原加工，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR提供了不与内源性TCRα和β链二聚化的额外益处。
[0132] Ag结合结构域
[0133] 用于为重组受体(作为说明性实例，CAR)确定抗原靶向基序的序列通常源自单克隆抗体，但也可使用配体。诸如，HER2-CAR Ag结合结构域可源自任何与HER2结合的单克隆抗体，诸如4D5(赫赛汀)。在一个方面，细胞外抗原结合结构域(Ag结合结构域)识别并结合靶抗原。Ag结合结构域可包括抗体的Ag结合结构域。抗体的此种Ag结合结构域可包含抗体分子的一部分，通常是抗体的可变重链(VH)区和/或可变轻链(VL)区或抗体片段(例如scFv抗体片段)。
[0134] 如本文中所用，术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是多克隆或单克隆抗体、多链或单链抗体，或完整的免疫球蛋白，并且可源自天然来源或来自重组来源。抗体(诸如IgG)通常是免疫球蛋白分子的四聚体。
[0135] 术语“抗体片段”是指完整抗体的至少一部分或其重组变体，并且是指抗原结合结构域，例如完整抗体的抗原决定可变区，其足以赋予抗体片段对靶标(诸如抗原)的识别和特异性结合。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv、线性抗体、单结构域抗体诸如sdAb(VL或VH)、骆驼科动物VHH结构域，以及由抗体片段形成的多特异性抗体。术语“scFv”是指融合蛋白，其包含至少一个包含轻链的可变区的抗体片段和至少一个包含重链的可变区的抗体片段，其中轻链与重链可变区通过短的柔性多肽接头连续地连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留了其所源自的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则如本文中所用，scFv可以以任一顺序具有VL和VH可变区，例如相对于多肽的N末端和C末端，scFv可包含VL-接头-VH或可包含VH-接头-VL。
[0136] 在一些实施方案中，Ag结合结构域是scFV抗体片段。
[0137] 重组受体诸如CAR的Ag结合结构域可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的(即，结合3种或更多种不同的抗原)或其任何组合。ScFv、Fab、Fab2、Fab'可包含源自靶向期望的靶抗原(诸如HER2)的抗体的表位，因此，scFV、Fab、Fab2、Fab'可包含抗HER2/neu抗体曲妥珠单抗的表位，其识别和结合乳腺细胞上的HER2。
[0138] 在一个方面，Ag结合结构域可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的，这意味着Ag结合结构域可以结合单种靶抗原、2种靶抗原或3种或更多种靶抗原。因此，本发明包括重组受体如CAR的Ag结合结构域，其包含一个或多个串联的靶抗原结合序列。作为非限制性实例，重组受体诸如CAR的双特异性Ag结合结构域可以是任何ScFv，其还包含串联的来自抗HER2和抗IL-13Rα的序列，并且能够结合HER2和IL-13两者。已描述了三特异性单克隆抗体及其制备方法(Castoldi等，Protein Engineering,Design,and Selection(2012)第25卷25(10):551-559；Wang等，J Biochem.2004Apr；135(4):555-65；Dimasi等，
Mol.Pharmaceutics,2015,12(9)，第3490–3501页)。作为另一个说明性实例，三特异性Ag结合结构域可以是ScFv或Fab结构域，其包含源自靶向ErbB2(HER2)、c-Met和IGF1R的三特异性单克隆抗体的序列。含有此类双特异性和多特异性Ag结合结构域的重组受体对于更高的肿瘤特异性是非常需要的。
Mol.Pharmaceutics,2015,12(9)，第3490–3501页)。作为另一个说明性实例，三特异性Ag结合结构域可以是ScFv或Fab结构域，其包含源自靶向ErbB2(HER2)、c-Met和IGF1R的三特异性单克隆抗体的序列。含有此类双特异性和多特异性Ag结合结构域的重组受体对于更高的肿瘤特异性是非常需要的。
[0139] 在另一个方面，重组受体(诸如CAR)的Ag结合结构域包含一个或多个HLA限制性表位。
[0140] 前导序列
[0141] 重组受体的Ag结合结构域还可在Ag结合结构域的N末端处包含前导序列。在CAR的细胞加工和至细胞膜的定位期间，前导序列可以从Ag结合结构域切除，诸如从scFv结构域切除。在一些实施方案中，前导序列从Ag结合结构域(并因此从嵌合受体，诸如CAR)切下。在至少一个实施方案中，前导序列不被切下并且仍然是Ag结合结构域的一部分。保留的前导序列不会干扰Ag结合结构域的功能，因此也不会干扰重组受体的功能。
[0142] 间隔子/铰链
[0143] 在一些实施方案中，Ag结合结构域，重组受体诸如CAR还可包括间隔子。间隔子可包括免疫球蛋白恒定区(恒定结构域)的至少一部分或其变体或经修饰的形式，诸如铰链区。此类铰链区的实例是本领域已知的(诸如，IgG1或IgG4铰链，CH1/CL等)。在至少一个实施方案中，铰链区是人铰链区，诸如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在另一个实施方案中，间隔子是铰链区的人源化形式。在另一个实施方案中，间隔子是抗原识别部位与跨膜结构域之间的恒定结构域。
[0144] 间隔子可具有为细胞提供在抗原结合时作出反应的能力的任何合适的长度。间隔子可包含多达300个氨基酸。在一些实施方案中，间隔子为10至150个氨基酸。在其他实施方案中，间隔子为15至50个氨基酸。在其他实施方案中，间隔子为1-10个氨基酸。
[0145] 示例性间隔子包括但不限于单独的IgG4铰链、单独的IgG1铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4或仅与CH2结构域连接的IgG4或仅与CH3结构域连接的IgG4。在一些实施方案中，人IgG(诸如IgG1或IgG4)、IgM或IgA的恒定结构域或其部分。另外的间隔子是本领域已知的(参见，Hudeek等(2013).Clin.Cancer Res.19:3153；WO2014031687；US8822647、US20140271635)。
[0146] 跨膜结构域
[0147] 在一些实施方案中，重组受体(诸如CAR)的跨膜(Tm)结构域与Ag结合结构域融合。在其他实施方案中，Tm结构域通过间隔子与Ag结合结构域隔开。
[0148] Tm结构域可源自天然来源或来自合成来源。当Tm结构域源自天然来源时，其可来自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。作为非限制性实例，蛋白质诸如T细胞受体(TCR)的α、β或ζ链、CD28、CD3、CD3e、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64，CD80，CD86，CD134，CD154以及其含跨膜区的功能变体可用于本发明的目的。在一些实施方案中，Tm结构域是CD4、CD28、CD8或其功能变体的Tm结构域。本领域技术人员将理解，源自天然来源的Tm结构域序列的突变和其他修饰被认为在本发明内。
[0149] 在至少一个实施方案中，Tm结构域是合成的。合成的跨膜结构域是本领域已知的并且已有描述(US7052906)。在一些方面，合成的Tm结构域主要包含疏水性残基，诸如缬氨酸和亮氨酸、亮氨酸-拉链。
[0150] 在其他实施方案中，Tm结构域通过接头或间隔子与信号传导结构域连接。接头可具有任何适合细胞内信号传导的长度。在一些实施方案中，接头长度为1至15个氨基酸。
[0151] 信号传导结构域
[0152] 重组受体(例如CAR)通常包括至少一个细胞内信号传导结构域。细胞内信号传导结构域可包括仅通过天然抗原受体模拟信号、通过抗原受体与一种或多种共刺激受体组合模拟信号，或仅通过共刺激受体模拟信号的信号传导结构域。在一些实施方案中，信号传导结构域包含初级刺激分子。本文在重组受体(诸如CAR)的上下文中可互换使用的“初级刺激分子”和“初级刺激结构域”是指由经修饰的细胞表达的提供初级细胞质信号传导序列的分子或其部分、变体或修饰，所述初级细胞质信号传导序列在T细胞信号传导途径的至少一些方面以刺激方式调节TCR复合物的初级活化。
[0153] 在一个方面，初级信号通过例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合而启动，并且这导致T细胞应答的介导，包括但不限于增殖、激活、分化、细胞因子释放等。以刺激方式起作用或诱导刺激的初级细胞质信号传导结构域可包括但不限于源自免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的那些初级细胞质信号传导结构域，诸如源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD8、CD16、CD22、CD25、CD79a、CD79b和CD66d的那些初级细胞质信号传导结构域。本文提供的刺激分子仅作为实例列出。该列表无意是排他性的，并且进一步的实例对于本领域技术人员来说是显而易见的。
[0154] 在一些实施方案中，重组受体(例如CAR)包括TCR复合物的细胞内组分，诸如介导T细胞活化和细胞毒性的CD3链，例如CD3ζ链。因此，在至少一个实施方案中，刺激分子是与T细胞受体复合物缔合的CD3ζ链。在一些实施方案中，受体包含CD3Tm结构域和CD3ζ刺激结构域。在其他实施方案中，受体还包含Fc受体γ。
[0155] 虽然无意受任何特定操作理论束缚，但在经修饰的细胞的上下文中使用的术语“刺激”是指通过刺激分子(诸如，TCR/CD3复合物)与其同源配体的结合(从而介导信号传导事件，诸如但不限于通过TCR/CD3复合物的信号转导)诱导的应答。刺激可以介导某些分子的改变的表达，诸如TGF-β的下调，和/或细胞骨架结构的重新组织等。
[0156] 当经修饰的细胞是T细胞时，完全激活不仅需要通过其TCR复合物的信号，而且还需要抗原非特异性的共刺激信号(通常由在抗原呈递细胞和T细胞的膜上表达的共刺激分子提供)。
[0157] 一方面，重组受体包括一个或多个共刺激结构域。第一代CAR-T细胞包括单个共刺激结构域。第二代CAR-T细胞包括两个刺激结构域，第三代CAR-T细胞包括多个刺激结构域。因此，在一些实施方案中，经修饰的细胞包括一个或多个共刺激结构域。在一些实施方案中，细胞质信号传导结构域还包含源自至少一种共刺激分子的功能信号传导结构域。“共刺激分子”是指经修饰的细胞上的同源结合配偶体，其与如下定义的“共刺激配体”特异性结合，从而介导经修饰的细胞的共刺激应答，诸如但不限于增殖。共刺激分子通常是除靶抗原受体或其配体外的细胞表面分子，其是高效免疫应答所需的。
[0158] 在一些实施方案中，刺激结构域包含在一种重组受体(诸如CAR)中，并且共刺激结构域由第二种重组受体(诸如识别第二靶抗原的CAR)提供。在其他实施方案中，诸如包含初级刺激结构域的CAR的嵌合受体和诸如包含共刺激结构域的CAR的嵌合受体在同一经修饰的细胞中表达。在其他实施方案中，当在同一经修饰的细胞上表达时，刺激结构域和一个或多个共刺激结构域串联。
[0159] 用于本发明目的的共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体、免疫球蛋白超家族(IgSF)诸如CD28、B7受体家族成员(B7-H2/B7RP-1/LICOS/GL50、B7-DC/PD-L2、B7-H3)、CD226、TIM、CD2/SLAM、BTN、LAIR、肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)诸如OX40、CD27、CD30、DR3、GITR和HVEM、T细胞上的CD2和SLAM、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、粘附分子(CD54、CD58、CD70)、ICOS、CD40、CD40L、4-1BB(CD137)、CD70、CD80、CD86、DAP10以及其他孤儿受体家族诸如LAG3(CD223)和CD160。
[0160] 因此，在一些实施方案中，共刺激分子选自MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体、免疫球蛋白超家族(IgSF)诸如CD28、B7受体家族成员(B7-H2/B7RP-1/LICOS/GL50、B7-DC/PD-L2、B7-H3)、CD226、TIM、CD2/SLAM、BTN、LAIR、肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)诸如OX40、CD27、CD30、DR3、GITR和HVEM、T细胞上的CD2和SLAM，ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、粘附分子(CD54、CD58、CD70)、ICOS、CD40、CD40L、4-1BB(CD137)、CD70、CD80、CD86、DAP10和其他孤儿受体家族诸如LAG3(CD223)和CD160。本文提供的共刺激分子仅作为实例列出。该列表无意是排他性的，并且其他实例对于本领域技术人员来说是显而易见的。
[0161] “共刺激配体”是指提供对免疫细胞(例如T细胞)的完全激化重要的非抗原特异性信号的分子。共刺激配体包括但不限于肿瘤坏死因子(TNF)配体、免疫球蛋白超家族(IgSF)配体和细胞因子(诸如IL-2、IL-12、IL-15和IL21)。TNF是参与全身性炎症并刺激急性期反应的细胞因子。其主要作用是调节免疫细胞，TNF配体共有许多共同特征：大多数配体被合成为II型跨膜蛋白(细胞外C-末端)，含有短的细胞质区段和相对较长的细胞外区域。TNF配体包括但不限于神经生长因子(NGF)、CD40L、CD40L/CD154、CD137L/4-1BBL、TNF-α、CD134L/OX40L/CD252、CD27L/CD70、Fas配体(FasL)、CD30L/CD153、TNF-β(TNFβ)/淋巴毒素-α(LTα)、淋巴毒素-β(LTβ)、CD257/B细胞激活因子(NAFF)/Blys/THANK/Tall-1、糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)和TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)、LIGHT(TNFSF14)和SLAM。Ig超家族是一大组细胞表面和可溶性蛋白质，其参与细胞的识别、结合或粘附过程。这些蛋白质与免疫球蛋白如免疫球蛋白结构域(折叠)共享结构特征。IgSF配体包括但不限于CD80(B7-1)和CD86(B7-2)，各自为CD28的配体。另外的共刺激分子/配体是本领域已知的(Chen和Files.Nat.Rev.Immunol.2013Apr.13(4):227–242，通过引用整体并入本文)。
[0162] 靶抗原
[0163] 在一些实施方案中，与重组受体诸如CAR或者工程化或疾病特异性TCR(诸如肿瘤特异性TCR)的Ag结合结构域结合的靶抗原可以是细胞表面蛋白/标志物。在其他实施方案中，靶抗原可以是细胞内分子。靶抗原可以在乳腺细胞上表达，优选在受乳腺癌等疾病影响的乳腺细胞上表达。一些抗原靶抗原也可在非乳腺细胞和组织上表达。在一个实施方案中，嵌合受体的Ag结合结构域可被工程化以靶向与乳腺疾病诸如乳腺癌相关的抗原。在本公开中任何地方提及以及在文献中公开的生物标志物可以是用于本发明目的的靶抗原。本文提供的抗原仅作为实例列出。该列表无意是排他性的，并且其他实例对于本领域技术人员来说是显而易见的。抗原的选择将取决于待治疗的特定类型的疾病，例如乳腺癌的类型。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，其引发免疫应答，特别是T细胞介导的免疫应答。
[0164] 靶抗原包含与恶性肿瘤相关的一种或多种抗原表位，诸如抗原性癌表位。恶性肿瘤表达许多蛋白质，其可作为免疫攻击的靶抗原。另一组靶抗原是癌胚抗原，诸如癌胚抗原(cancinoembryonic antigen)(CEA)。本发明中提及的肿瘤抗原的类型还包括肿瘤特异性抗原(TSA)和肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是肿瘤细胞所独有的，并且不会在体内的其他细胞上表达。TAA抗原不是肿瘤细胞所独有的，并且可以在防止针对抗原的免疫耐受性和肿瘤逃逸的发展的条件下在正常细胞上表达。但TAA在肿瘤细胞上的存在可以允许免疫耐受性和肿瘤逃逸的发展。TAA可以是在胎儿发育期间(此时免疫系统尚未成熟并且不能响应)在正常细胞上表达的抗原，或者它们可以是通常以极低水平存在于正常细胞上但以较高水平在肿瘤细胞上表达的抗原。
[0165] TSA或TAA的非限制性实例包括肿瘤特异性多系抗原，诸如MAGE1、MAGE-3、MAGE-A3/6、MAGE-A家族成员诸如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A12、MAGE-A9、MAGE-A11、MAGE-C1和MAGE-C2、RAGE、BCR-ABL、蛋白酪氨酸激酶如PRL-2和PRL3、肿瘤相关糖蛋白诸如TAG-72、CA 19-9、CA 27.29、CA 72-4、CA 50、受体酪氨酸激酶诸如H4-RET等。
[0166] 在至少一个实施方案中，浸润性乳腺癌的靶抗原可以是MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6和/或MAGE-A12。在一些实施方案中，靶抗原是MAGE-A3/6。MAGE-A3/6对于受试者中具有激素受体(诸如雌激素受体和孕酮受体)阴性状态的原发性乳腺癌具有吸引力。在其他实施方案中，MAGE-A9和MAGE A11是ER+乳腺癌和HER2+乳腺癌的理想靶标。在一些实施方案中，用于治疗TNBC的理想靶标包括Lehrmann等(J.Clin.Invest.2011.121(7),2750–2767)描述的靶标。
[0167] 在至少一个实施方案中，靶抗原是HER2。本文提供的HER2靶向重组受体(诸如，HER2-CAR)与图2中公开的SEQ ID NO:1或其变体或功能部分具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少
98％、至少99％和100％的同源性。在一些实施方案中，HER2-CAR与图2中公开的SEQ ID NO:
1或其变体或功能部分具有至少80％至100％的同一性。在至少一个实施方案中，HER2-CAR与图2中公开的SEQ ID NO:1或其变体或功能部分具有至少95％的同一性。
98％、至少99％和100％的同源性。在一些实施方案中，HER2-CAR与图2中公开的SEQ ID NO:
1或其变体或功能部分具有至少80％至100％的同一性。在至少一个实施方案中，HER2-CAR与图2中公开的SEQ ID NO:1或其变体或功能部分具有至少95％的同一性。
[0168] 在一些实施方案中，HER2-CAR包含源自针对HER2表位的人源化4D5抗HER抗体的序列。可被CAR的Ag结合结构域靶向和结合的HER2上的各种表位已经在文献中描述并且可用于本公开的目的。在至少一个实施方案中，HER2-CAR直接与HER2的细胞外结构域的亚结构域IV上的表位结合。在一些实施方案中，HER2-CAR与HER2上的氨基酸残基557-561、570-573和593-603结合(Rockberg等，Molecular Oncology,3(2009)238–247，通过引用整体并入本文)。在其他实施方案中，HER2-CAR与HER2的细胞外结构域上的表位((N1:YNTDTFES,N2:NPEGRYTFGA和N3:VGSCTLVCPLHNQEVT,C1:LPESFDGD和C2:LQVF)(同上)结合。HER2-CAR可结合的另外表位包括Rongcun等(J Immunol 1999；163:1037-1044,通过引用整体并入本文)描述的那些。在一些实施方案中，HER2-CAR包含Fab结构域或源自针对HER2的4D5抗体的scFV、CD8铰链区、CD8间隔子、共刺激结构域CD28和4-1BB以及CD3z(作为细胞内信号传导结构域)。
[0169] 在其他实施方案中，CA 19-9是早期和复发性导管乳腺癌的理想靶标。在另一个实施方案中，叶酸受体-α(FR-α)、间皮素、ROR1、来自前列腺癌相关抗原的碳水化合物序列是三阴性乳腺癌、浸润性乳腺癌和转移性乳腺癌的理想靶标。
[0170] 已发表了靶向FR-α的重组受体。诸如，Song等(Blood.2012Jan 19；119(3):696-706；Oncoimmunology.2012Jul 1；1(4):547–549；J.Hematology&Oncology(2016)9:56)先前已经描述了制备基于针对FR-α的Mov18抗体的FR-α-CAR的方法。在一些实施方案中，FAP-CAR包含源自抗FR-α抗体MOv18抗原结合结构域的scFV、CD8铰链区、CD8Tm区以及包含CD27和CD3z细胞内结构域的共刺激结构域。重组受体的另外的Ag结合结构域可源自针对FR-α的单克隆抗体，诸如9F3、24F12、26B3、19D4(O'Shannessy等，Oncotarget.2011 Dec；2(12):
1227–1243)、单克隆抗体IMGN853(参见US2012/0282175)和法利珠单抗。已经作图并描述了FR-α-CAR可以结合的各种表位(同上)。在一些实施方案中，FR-α-CAR在经修饰的细胞中组成型表达、瞬时表达、诱导型表达或可开关地表达或具有条件活性。
1227–1243)、单克隆抗体IMGN853(参见US2012/0282175)和法利珠单抗。已经作图并描述了FR-α-CAR可以结合的各种表位(同上)。在一些实施方案中，FR-α-CAR在经修饰的细胞中组成型表达、瞬时表达、诱导型表达或可开关地表达或具有条件活性。
[0171] 成纤维细胞活化蛋白(FAP)是浸润性乳腺癌或涉及乳腺组织基质的任何癌症的理想靶标。本文提供的FAP靶向重组受体(诸如，FAP-CAR)与图2中公开的SEQ ID NO:2或其变体或功能部分具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和100％的同源性。先前(Kakarla等，Mol Ther.(2013),21 8,1611–1620；Wang等，Cancer Immunol Res.2014Feb；2(2):154–166),June等(美国专利公开2014/0099340)已经描述了制备FAP-CAR的方法。
[0172] 在另一方面，靶抗原包括但不限于具有免疫抑制活性的抗原。表达针对免疫抑制性靶抗原的CAR的细胞被称为抑制性CAR(iCAR)。示例性免疫抑制性靶抗原包括检查点抑制剂，诸如PD-1、CTLA-4、CD47及其配体。据报道，乳腺癌，诸如三阴性乳腺癌与PD-1配体(PD-1L)背景中的不良预后相关。因此，在至少一个实施方案中，靶抗原包括PD-L1。靶向PD-1、CTLA-4、CD47及其配体诸如PD-L1的CAR可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。表达抗原特异性抑制受体的经修饰的细胞(称为抑制性CAR-T细胞或iCAR-T)可用于减少免疫抑制、不友好的肿瘤微环境和转移脱靶免疫疗法(divert off-target immunotherapy)反应。
本领域已经描述了制备iCAR的方法(参见Cherkassy等，J.Clin.Invest.2016；126(8):
3130-3144；Federov等，Science Translational Medicine 11Dec 2013：第5卷，第215期，第215ra172页)。
本领域已经描述了制备iCAR的方法(参见Cherkassy等，J.Clin.Invest.2016；126(8):
3130-3144；Federov等，Science Translational Medicine 11Dec 2013：第5卷，第215期，第215ra172页)。
[0173] 由重组受体的细胞外Ag结合结构域识别的另外的示例性靶抗原包括但不限于转化相关分子，诸如HER2/neu或ErbB-2(HER2)、MUC诸如MUC1、c-met、细胞角蛋白诸如CK5、CK6、CK14、CK7、CK8、CK14、CK17、CK18、CK19、p53、糖苷、Tn、TF和唾液酸Tn(STn)、叶酸受体-α(FR-α)、ROR1、肿瘤相关抗原诸如癌胚抗原(CEA)、L1细胞粘附分子(L1CAM)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、diganglioside GD2、间皮素、IL-13受体IL13R、IL-13受体α、ephrinB2、IGFR1、eLIGHT、WT1、TAG-72、Ep-CAM、LFA-1、EGFR、雌激素受体(ER)、孕酮受体等。另外的抗原受体和用于将此类受体工程化并引入细胞的方法包括WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061、US2002131960、US2013287748、US20130149337、US20160206656、US20160045551、US20160158359、US20160151491、US9365641、US8906682等。另外的靶标和CAR包括Sadelain等，Cancer Discov.2013,April 3(4):388-398；Davila等(2013)PLoS One 8(4):e61338；Turtle等，Curr.Opinion.Immunol.2012October；24(5):633-39；Wu等，Cancer,2012March
18(2):160-75(各自通过引用整体并入)描述的那些。在一些方面，抗原受体包括如美国专利第7,446,190号中所述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668 A1中描述的那些。CAR的实例包括在任何上述出版物中公开的那些，诸如WO2014031687、美国专利第8,
339,645号、美国专利第7,446,179号、US 2013/0149337、美国专利第7,446,190号、美国专利第8,389,282号、Kochenderfer等，2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-
276(2013)；Wang等(2012)J.Immunother.35(9):689-701；以及Brentjens等，Sci Transl Med.2013 5(177)中公开的那些。也参见WO2014031687、美国专利第8,339,645号、美国专利第7,446,179号、US 2013/0149337、美国专利第7,446,190号和美国专利第8,389,282号。
18(2):160-75(各自通过引用整体并入)描述的那些。在一些方面，抗原受体包括如美国专利第7,446,190号中所述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668 A1中描述的那些。CAR的实例包括在任何上述出版物中公开的那些，诸如WO2014031687、美国专利第8,
339,645号、美国专利第7,446,179号、US 2013/0149337、美国专利第7,446,190号、美国专利第8,389,282号、Kochenderfer等，2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-
276(2013)；Wang等(2012)J.Immunother.35(9):689-701；以及Brentjens等，Sci Transl Med.2013 5(177)中公开的那些。也参见WO2014031687、美国专利第8,339,645号、美国专利第7,446,179号、US 2013/0149337、美国专利第7,446,190号和美国专利第8,389,282号。
[0174] 在另一方面，靶抗原是细胞内的。在一些实施方案中，需要表达CAR的细胞，例如T细胞和NK细胞，其中包含针对细胞内靶抗原的HLA-A2限制性表位。细胞内抗原可包括促凋亡因子/细胞死亡分子，BRCA1、BRCA2等。已在文献(Tassev等，Cancer Gene Ther.2011；Stewart-Jones等，Proc Natl Acad Sci U S A.2009；106:5784–5788)中描述了产生靶向细胞内抗原的CAR的方法。其他方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。
[0175] 在另一方面，受体可包括靶向FITC-缀合的治疗分子诸如单克隆抗体、适体、配体等的抗荧光素硫氰酸酯(FITC)结合结构域，其对乳腺细胞诸如乳腺癌细胞上的一种或多种FITC标记的靶抗原具有特异性。这种方法是靶向多种靶抗原所需的，靶向多种靶抗原可限制肿瘤通过下调单一靶抗原而逃避靶向的能力。这在追踪乳腺细胞上的靶抗原结合以及所施用的细胞在受累乳腺组织(诸如乳腺肿瘤)内迁移和浸润的速率/速度方面也是有利的。
[0176] 制备嵌合受体的方法是本领域已知的。在US 2016/0206656、US 2016/0045551、US 201/40314795、US 2014/0314795中已描述了示例性制备方法。制备RNA CAR的方法已由(Barrett等，Hum.Gene Ther.2011,22(12):1575-1586)描述。
[0177] 已经描述了另外的CAR及其制备方法：CEA(例如，结肠)(Nolan等，Clin Cancer Res.,5:3928-3941(1999))；EGFRvIII-Bullain等，J Neurooncol.(2009),Morgan等，Hum Gene Ther.,23:1043-1053(2012))；ErbB2(HER2)-Zhao等，J Immunol.,183:5563-5574(2009),Morgan等，Mol Ther.,18:843-851(2010),Pinthus等，114:1774-1781(2004),Teng等，Hum Gene Ther.,15:699-708(2004),Stancovski等，J Immunol.,151:6577-6582(1993),Ahmed等，Mol Ther.,17:1779-1787(2009),Ahmed等，Clin Cancer Res.,16:474-485(2010),Moritz等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.,91:4318-4322(1994)；ErbB receptor family-Davies等，Mol Med.,18:565-576(2012),Sun等，Breast Cancer Res.16:R61；
ErbB3/4-Muniappan等，Cancer Gene Ther.,7:128-134(2000),Altenschmidt等，Clin Cancer Res.,2:1001-1008(1996)；HLA-A1/MAGE1-Willemsen等，Gene Ther.,8:1601-1608(2001),Willemsen等，J Immunol.,174:7853-7858(2005))；HLA-A2/NY-ESO-1-Schuberth等，Gene Ther.,20:386-395(2013)；FR-α-Song等Blood.2012Jan 19；119(3):696-706；
Oncoimmunology.2012 Jul 1；1(4):547–549；J.Hematology&Oncology(2016)9:56；Hwu等，J Exp Med.,178:361-366(1993),Kershaw等，Nat Biotechnol.,20:1221-1227(2002),Kershaw等，Clin Cancer Res.,12:6106-6115(2006),Hwu等，Cancer Res.,55:3369-3373(1995)；FAP-Kakarla等，Mol Ther.(2013),21 8,1611–1620)；GD2-Pule等，Nat Med.,14:
1264-1270(2008),Louis等，Blood,118:6050-6056(2011),Rossig等，Int J Cancer.,94:
228-236(2001)；IL13R.alpha.2-Kahlon等，Cancer Res.,64:9160-9166(2004),Brown等，Clin Cancer Res.(2012),Kong等，Clin Cancer Res.,18:5949-5960(2012),Yaghoubi等，Nat Clin Pract Oncol.,6:53-58(2009))；Lewis Y-Peinert等，Gene Ther.,17:678-686(2010),Westwood等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.,102:19051-19056(2005),
Mezzanzanica等，Cancer Gene Ther.,5:401-407(1998)；Mesothelin-Lanitis等，Mol Ther.,20:633-643(2012),Moon等，Clin Cancer Res.,17:4719-4730(2011)；Muel-Wilkie等，J Immunol.,180:4901-4909(2008)；NKG2D ligands-Barber等，Exp Hematol.,36:
1318-1328(2008),Lehner等，PLoS One,7:e31210(2012),Song等，Gene Ther.,24:295-305(2013),Spear等，J Immunol.,188:6389-6398(2012)；TAG72(e.g.,colon)(Hombach等，Gastroenterology,113:1163-1170(1997),McGuinness等，Hum Gene Ther.,10:165-173(1999)。
ErbB3/4-Muniappan等，Cancer Gene Ther.,7:128-134(2000),Altenschmidt等，Clin Cancer Res.,2:1001-1008(1996)；HLA-A1/MAGE1-Willemsen等，Gene Ther.,8:1601-1608(2001),Willemsen等，J Immunol.,174:7853-7858(2005))；HLA-A2/NY-ESO-1-Schuberth等，Gene Ther.,20:386-395(2013)；FR-α-Song等Blood.2012Jan 19；119(3):696-706；
Oncoimmunology.2012 Jul 1；1(4):547–549；J.Hematology&Oncology(2016)9:56；Hwu等，J Exp Med.,178:361-366(1993),Kershaw等，Nat Biotechnol.,20:1221-1227(2002),Kershaw等，Clin Cancer Res.,12:6106-6115(2006),Hwu等，Cancer Res.,55:3369-3373(1995)；FAP-Kakarla等，Mol Ther.(2013),21 8,1611–1620)；GD2-Pule等，Nat Med.,14:
1264-1270(2008),Louis等，Blood,118:6050-6056(2011),Rossig等，Int J Cancer.,94:
228-236(2001)；IL13R.alpha.2-Kahlon等，Cancer Res.,64:9160-9166(2004),Brown等，Clin Cancer Res.(2012),Kong等，Clin Cancer Res.,18:5949-5960(2012),Yaghoubi等，Nat Clin Pract Oncol.,6:53-58(2009))；Lewis Y-Peinert等，Gene Ther.,17:678-686(2010),Westwood等，Proc Natl Acad Sci U.S.A.,102:19051-19056(2005),
Mezzanzanica等，Cancer Gene Ther.,5:401-407(1998)；Mesothelin-Lanitis等，Mol Ther.,20:633-643(2012),Moon等，Clin Cancer Res.,17:4719-4730(2011)；Muel-Wilkie等，J Immunol.,180:4901-4909(2008)；NKG2D ligands-Barber等，Exp Hematol.,36:
1318-1328(2008),Lehner等，PLoS One,7:e31210(2012),Song等，Gene Ther.,24:295-305(2013),Spear等，J Immunol.,188:6389-6398(2012)；TAG72(e.g.,colon)(Hombach等，Gastroenterology,113:1163-1170(1997),McGuinness等，Hum Gene Ther.,10:165-173(1999)。
[0178] 基因工程-表达重组受体的经修饰的细胞
[0179] 在一些实施方案中，细胞包含通过基因工程引入的一种或多种核酸，从而表达重组或基因工程产物，诸如此类核酸的重组嵌合受体(例如CAR)。基因工程通常涉及诸如通过逆转录病毒、慢病毒转导、转染或转化将编码重组嵌合受体的核酸转移到细胞中(参见，诸如，Wang等，(2012),J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等(2003),Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等(2009),Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等(2003),Blood.102(2):497-505；Chicaybam等,(2013),PLoS ONE 8(3):e60298和Van Tedeloo等(2000),Gene Therapy 7(16):1431-1437))。在一些实施方案中，细胞可以首先用诱导诸如增殖、存活或激活的反应的刺激物进行引发，即刺激。这种反应可以通过激活标志物的表达或细胞因子释放来测量。然后可通过活化细胞的转导、转染或转化来实现核酸转移，随后在细胞培养物中扩增至足以用于临床应用的数量。用于核酸转移的方法在本领域中是已知的。
[0180] 可通过使用重组感染性病毒颗粒诸如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体进行向细胞中的核酸转移。在一些实施方案中，核酸转移可使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体诸如γ-逆转录病毒载体进行(参见，诸如，Koste等(2014),Gene Therapy 2014 Apr.3.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等(2000),Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等(2013),Mol Ther Nucl Acids 2,e93；Park等，Trends Biotechnol.2011November 29(11):550-557。
[0181] 在一些实施方案中，逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的几种物种的宿主细胞。
在一个实施方案中，待表达的基因取代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多示例性逆转录病毒系统(例如，美国专利第5,219,740号、6,207,453号、5,219,740号；
Miller和Rosman(1989),BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990),Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等(1991),Virology 180:849-852；Burns等(1993),
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993),
Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。慢病毒转导的方法是已知的。在例如Wang等(2012),J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等(2003),Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等(2009),Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等(2003),Blood.102(2):497-505中描述了示例性方法。
在一个实施方案中，待表达的基因取代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多示例性逆转录病毒系统(例如，美国专利第5,219,740号、6,207,453号、5,219,740号；
Miller和Rosman(1989),BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990),Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等(1991),Virology 180:849-852；Burns等(1993),
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993),
Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。慢病毒转导的方法是已知的。在例如Wang等(2012),J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等(2003),Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等(2009),Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等(2003),Blood.102(2):497-505中描述了示例性方法。
[0182] 可用于本发明的核酸包括DNA(包括基因组和cDNA)、RNA(包括mRNA)。在一些实施方案中，重组嵌合受体的表达可以是组成型或诱导型的。在其他实施方案中，嵌合受体的表达可以是瞬时的，条件活性的或可开关的。
[0183] 可以如US20160207989中所述制备条件活性CAR。可如US20160046700中所述制备诱导型CAR。本文论述的诱导型嵌合信号传导分子允许对在细胞中共表达的嵌合抗原受体(CAR)进行持续的调节控制。诱导型嵌合信号分子包含本文论述的诱导型重组受体(诸如CAR)。设计用于靶向涉及乳腺病症的细胞抗原的靶抗原特异性细胞(诸如T细胞)的活化依赖于配体诱导物的施用。配体诱导剂通过使诱导型嵌合信号传导分子多聚化来激活表达CAR的细胞，其又激活NFkB信号传导和激活细胞(例如T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、天然杀伤细胞或天然杀伤T细胞)的其他细胞内信号传导途径。在配体诱导物不存在的情况下，经修饰的细胞是静止的，或具有基础活性水平。配体的给药决定了表达CAR的细胞增殖和活化的速率和程度。
[0184] 通常通过用RNA CAR瞬时修饰细胞来改造瞬时表达(参见US20160151491)。可将RNA转基因作为无需额外病毒序列的最低限度表达盒，在短暂的体外细胞活化后递送至细胞并在其中表达。RNA CAR序列可以保持在染色体外。体外转录的RNA(IVT-RNA)已成功用于修饰细胞，IVT-RNA载体也是本领域已知的(Barrett等，Hum.Gene Ther.2011,22(12):1575-1586)。RNA转移可通过转染、电穿孔和本领域技术人员已知的各种其他方法进行。(参见Singh等，Oncoimmunology 3:12.,e962974.December 2014；Schutsky等，Oncotarget
2015,6(3))28911-28)。可使用各种修饰来稳定IVT-RNA，以实现转移的IVT-RNA的延长表达。当以标准化方式用于体外转录时并且已经以产生稳定化RNA的方式进行遗传修饰的IVT载体在文献中是已知的。优化mRNA-疫苗技术以产生用于本发明的目的的稳定mRNA
(Schlake等，NA Biol.2012Nov 1；9(11):1319–1330；Sahin等，Nature Reviews Drug Discovery 13,759–780(2014))。
2015,6(3))28911-28)。可使用各种修饰来稳定IVT-RNA，以实现转移的IVT-RNA的延长表达。当以标准化方式用于体外转录时并且已经以产生稳定化RNA的方式进行遗传修饰的IVT载体在文献中是已知的。优化mRNA-疫苗技术以产生用于本发明的目的的稳定mRNA
(Schlake等，NA Biol.2012Nov 1；9(11):1319–1330；Sahin等，Nature Reviews Drug Discovery 13,759–780(2014))。
[0185] 与更常规的质粒或病毒方法相比，RNA具有几个有利方面。来自RNA来源的基因表达不需要转录，并且转染后迅速产生蛋白质产物。由于RNA不需要进入细胞核而是保留在细胞质中，因此转染效率通常很高。
[0186] CAR表达可以是可开关的，即当需要或必要时可以在细胞中关闭CAR表达和/或可通过在转移的核酸序列中包含如下所述的允许消除CAR表达和细胞本身的元件来消除细胞。
[0187] 任选地，核酸序列可以包含标签，诸如E-标签或FITC，其将允许细胞被分离和纯化(PLOS One.2014,9(4),e93745)。重组受体诸如CAR的表达可通过本领域已知的任何合适方法(例如，通过免疫组织化学、ELISA、FAC等)确认。
[0188] 在一个方面，经修饰的细胞可包含(例如通过与受体和蛋白质共转染)帮助其迁移至肿瘤细胞的病毒，诸如溶瘤病毒(van Seggelen等，Mol.Ther.—Oncolytics 2,Article number:15014(2015)。溶瘤病毒(OV)，诸如水泡性口炎病毒，具有诱导肿瘤细胞特异性裂解和通过血管关闭间接影响肿瘤生长的能力。由于经修饰的细胞例如T细胞，容易在全身循环，因此使用这些细胞将溶瘤病毒直接递送到肿瘤提供了理想的组合。van Seggelen(同上)已经描述了加载溶瘤病毒的方法。可在施用过继细胞疗法之前将OV加载到经修饰的细胞中。此类溶瘤病毒增强和/或协同表达重组受体诸如CAR的经修饰的细胞的免疫功能(Nishio等，Cancer Res.2014Sep 15；74(18):5195-205；Walker等2016.posted online May.30,2016；doi:http://dx.doi.org/10.1101/055988)。因此，在一些实施方案中，经修饰的细胞包括溶瘤病毒。在另一方面，靶抗原包括与相关肿瘤分泌的趋化因子诸如Gro-α、CCL17、CCL2匹配的特异性趋化因子受体。这些有利于帮助经修饰的细胞迁移至肿瘤细胞。靠近肿瘤部位的经乳头施用有利于减少体内迁移的时间和距离。
[0189] 细胞扩增
[0190] 在一些实施方案中，可将细胞离体扩增，并在使用前冷冻和储存或立即向受试者施用。在一些实施方案中，离体扩增经修饰的细胞，然后经乳头施用至受试者的乳腺导管中。通常，可通过将细胞添加到培养起始组合物饲养细胞(诸如非分裂PBMC)中(使得所得细胞群含有至少5个、10个、15个、20个、30个或40个或更多个PBMC饲养细胞/待扩增的初始群中的经修饰的细胞(诸如T细胞))来扩增细胞。还可通过添加非分裂的EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞来进行孵育。将培养物在至少25℃，至少30℃或通常在37℃孵育足以扩增经修饰的细胞的时间。可以对饲养细胞进行γ辐照以防止细胞分裂。
[0191] 文献中描述了细胞离体扩增的方法(Terakura等，2012,Blood,119；72-82；Cartellieri等，PLoS One,2014,第9卷(4),e93745)。作为非限制性实例，将表达重组受体诸如CAR的T细胞悬浮在γ-辐照的TM-LCL细胞中，并且每48小时补充IL-2和IL-15。受刺激的表达CAR的细胞可分叉成2个亚群。具有高CAR表达并且还表达CD25(即CAR+/CD25+)的细胞群是所需的(Chang等，J.of Trans.Med.(2015)13:161)。在以特定的效应子比靶标(E:T)比例(诸如1:1或2:1等)与靶细胞共孵育20小时后，通过FAC分离受刺激的高和低CAR表达群。
[0192] 在一些实施方案中，经修饰的细胞是重组受体诸如CAR的高表达者。在其他实施方案中，经修饰的细胞可以以不同水平表达重组受体，诸如CAR(即此类细胞可以是重组受体的高、中和低表达者的混合物)。
[0193] 可使用任何化学合成或重组诱变方法来产生CAR和表达CAR的经修饰的细胞。除非另有说明，否则本发明的实践可采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，所述技术在本领域技术人员的能力范围内。此类技术在文献中有充分说明。参见诸如Molecular Cloning A Laboratory Manual，第2版，由Sambrook,Fritsch and Maniatis编辑(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989)；DNA Cloning，第I和II卷(D.N.Glover，编辑，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，编辑，1984)；Mullis等，美国专利第4,683,195号；Nucleic Acid
Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins，编辑1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins，编辑1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；论文，Methods In Enzymology
(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells
(J.H.Miller和M.P.Cabs，编辑，1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，第154和155卷(Wu等，编辑),Immunochemical Methods In Cell And
Molecular Biology(Mayer and Walker，编辑，Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第1-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编辑，1986)；
Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。
Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins，编辑1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins，编辑1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；论文，Methods In Enzymology
(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells
(J.H.Miller和M.P.Cabs，编辑，1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，第154和155卷(Wu等，编辑),Immunochemical Methods In Cell And
Molecular Biology(Mayer and Walker，编辑，Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology，第1-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编辑，1986)；
Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。
[0194] 安全性
[0195] 施用过继细胞疗法，诸如利用表达嵌合受体诸如CAR的经修饰的细胞的治疗可引发严重的毒性结果或副作用，诸如细胞因子释放综合征(CRS)、巨噬细胞活化综合征(MAS)、肿瘤溶解综合征(TLS)、神经毒性和/或宿主对所施用的细胞和/或重组受体的免疫应答(Bonifant等，Mol.Ther.–Oncolytics(2016)3,16011)。
[0196] 因此，希望控制嵌合受体在经修饰的细胞上的表达(例如，降低CAR的表达)或消除表达嵌合受体诸如CAR的经修饰的细胞(可开关的CAR表达)。在一些实施方案中，受体的表达可以是组成型的、诱导型的、瞬时的或可开关的。在至少一个实施方案中，经修饰的细胞上的嵌合受体是条件活性的。在一些实施方案中，CAR是可开关的CAR。在其他实施方案中，CAR是抑制性CAR(iCAR)。在其他实施方案中，CAR是自限性CAR(因为它们通过RNA转移表达并且它们的表达是瞬时的)。
[0197] 因此，工程化细胞可包括细胞安全开关，例如使细胞诸如在过继细胞疗法中施用时易于在体内进行负选择的基因区段。例如，在一些方面，对细胞进行工程改造，使得它们由于施用了其的受试者的体内条件的变化而被消除。负选择表型可由插入死亡基因或自杀基因而引起，所述死亡基因或自杀基因赋予对所施用的试剂的敏感性。诸如，可以将介导更昔洛韦转化为对分裂细胞有毒的更昔洛韦三磷酸的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)插入经修饰的供体细胞中。将HSVtk插入经修饰的供体细胞使得能够通过向受试者施用更昔洛韦(细胞外转换信号)来消除它们。另外的示例性死亡基因或自杀基因包括各种凋亡相关基因，诸如诱导型半胱天冬酶9(iC9)和FADD，其可用于消除响应于二聚化的化学诱导物(CID)(诸如AP20187(可从ARIAD Pharmaceuticals获得)和/或AP1903(一种对人受试者给药安全的小分子))的经修饰的细胞(Siok-Keen Tey.Clin.Translational Immunology(2014)3,e17；Straathof等Blood,2005Jun 1；105(11):4247–4254)。此类安全开关也可用于基于多能干细胞的疗法(Wu等，Molecular Therapy—Methods&Clinical Development 1,Article number:14053(2014)doi:10.1038/mtm.2014.53)。
[0198] 在另一个方面，可将安全开关嵌入由经修饰的细胞表达的嵌合受体的细胞外Ag结合结构域中，所述安全开关允许切断经修饰的细胞的活性或消除这些细胞(诸如，可开关的CAR-T细胞、CAR-NK细胞或CAR-CTL)。开关可以是半合成开关或完全重组开关。在适当的时间对引入的可溶性试剂(细胞外开关信号)起反应的示例性开关包括基于FITC的半合成开关和短肽新表位(PNE)完全重组细胞内开关。已经描述了开关及其制备和使用方法(Cao等，Cancer Immunotherapy,Angew Chem.Int.Ed.2016,55,1–6；Cao等，Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,7520–7524；Rodgers等，2016,Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A.vol 113(4),E459-E468；Flemming,Alexandra,Nature Reviews Drug Discovery,15,157(2016)；Ma等，PNAS.2016.113(4):
E450-E458，各自通过引用整体并入本文)。例如，FITC和PNE开关已包括在抗HER2CAR中以研究抗HER2CAR的可开关表达(Cao等，Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,7520–7524)。因此，过继细胞疗法可以是可开关的。在一些实施方案中，安全开关包括但不限于死亡基因或自杀基因，诸如HSVtk、iC9和FADD，以及基于FITC的合成开关和PNE开关。
E450-E458，各自通过引用整体并入本文)。例如，FITC和PNE开关已包括在抗HER2CAR中以研究抗HER2CAR的可开关表达(Cao等，Angew.Chem.Int.Ed.2016,55,7520–7524)。因此，过继细胞疗法可以是可开关的。在一些实施方案中，安全开关包括但不限于死亡基因或自杀基因，诸如HSVtk、iC9和FADD，以及基于FITC的合成开关和PNE开关。
[0199] 表达CAR的经修饰的细胞可以是自限性的，例如，嵌合受体(CAR)可以在经修饰的细胞中瞬时表达。瞬时表达重组蛋白的方法是本领域已知的，例如，利用编码嵌合受体的RNA转基因的转染。
[0200] 本文公开了导致较低程度的毒性、毒性结果或症状、毒性促进特征谱、因子或性质(诸如与CRS、MAS、TLS和神经毒性相关或指示CRS、MAS、TLS和神经毒性的症状或结果)的方法。在一些实施方案中，毒性结果是CRS或与CRS相关。在其他实施方案中，毒性与MAS相关。在其他实施方案中，毒性是神经毒性。患有乳腺病症或有患乳腺病症风险的受试者的经乳头治疗对于减少这种毒性作用是想要的。在一些方面，在经乳头施用了本公开的组合物的受试者中观察到较低程度的毒性、结果、症状、特征谱、因子或性质。
[0201] 与CRS、MAS、TLS等相关的示例性结果在本领域中是已知的，并且对于医学技术人员而言是显而易见的。例如，CRS可在过继细胞疗法和其他生物制品施用后的某些情况下发生，并且常见地CRS通常在输注表达CAR的细胞后6-20天发生(Davila等，Sci.Transl.Med.6,224ra25(2014)；Brentjens等，Sci.Transl.Med.5,177ra38(2013)；Xu等，Cancer Letters.343(2014)172-178)。此类副作用或结果与高水平的循环细胞因子诸如IFNγ、TNFα和IL-2并行，这可能是观察到的毒性的基础。也升高的另外的细胞因子包括但不限于GM-CSF、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、Flt-3、CX3C趋化因子(fractalkine)、MIP1、sIL-2Rα和IL-5。
[0202] 本发明设想了将监测所治疗的受试者的细胞因子水平，并且如果细胞因子水平升高大于2倍，则主治医师可相应地调整剂量。在一些实施方案中，第一剂量以不会引起毒性或毒性结果或者降低毒性或毒性结果的可能性的量包含细胞，所述毒性或毒性结果为诸如CRS相关结果、MAS相关结果或TLS相关结果，或宿主对所施用的细胞和/或重组受体的免疫应答、持续3天或更多天的至少38℃的发热以及20mg/dL的血浆CRP水平，和/或神经毒性。在其他实施方案中，剂量可取决于副作用或毒性结果(诸如CRS相关结果、MAS相关结果或TLS相关结果，以及初始剂量后的神经毒性)的水平。
[0203] CRS可以用抗炎疗法诸如抗IL6疗法治疗。这种疗法包括针对IL-6受体的抗IL-6抗体(诸如司妥昔单抗和托珠单抗)或抗生素。在一些实施方案中，可以在治疗方案期间的任何时间用这种疗法治疗受试者。在至少一个实施方案中，可以在初始剂量后用此类疗法治疗受试者。在其他实施方案中，在完成所有剂量后，可以用此类疗法来治疗受试者。
[0204] 在过继细胞疗法中观察到的CRS、MAS、TLS、神经毒性等也可以通过向受试者施用本文公开的CID或PNE触发剂(或本领域已知的)而关闭施用的细胞(和体内扩增的细胞)的CAR表达和/或消除所述细胞来治疗。
[0205] 联合治疗
[0206] 本发明设想了本文公开的经乳头方法还包括联合治疗法。在一个方面，所述经乳头方法还包括向所述受试者施用一种或多种另外的治疗剂或疗法。可通过本领域已知的任何合适的方式向受试者施用另外的治疗剂，所述方法包括但不限于经乳头、口服、鼻内、胃肠外(通过注射或输注)、皮下等施用。另外的治疗剂可以包含在本文公开的组合物中或可以独立配制。治疗剂和/或疗法的施用顺序可以是任何施用顺序。例如，可将本文公开的细胞或组合物与治疗剂共同施用，或者可以首先施用治疗剂，或者可以在施用本发明的细胞或组合物后施用治疗剂。
[0207] 所述另外的治疗剂可以是对于所公开的方法的目的有用的的任何治疗剂。
[0208] 示例性的另外的治疗剂包括但不限于天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、长春碱、长春新碱、溶瘤病毒、抗雌激素诸如他莫昔芬、内昔芬(endoxifen)、N-甲基-内昔芬、炔诺昔芬、雷洛昔芬、氟维司群和/或芳香酶抑制剂诸如阿那曲唑、来曲唑和依西美坦。
[0209] 另外的疗法可包括手术、辐照、化学疗法、针灸、非经乳头过继细胞疗法等。本文公开的方法可以用作主要疗法、新辅助疗法(诸如，在手术(诸如乳房切除术或乳房肿瘤切除术)或化学疗法之前)或辅助疗法(仅用于说明目的，在化学疗法或利用其他过继细胞疗法的治疗之后)。
[0210] 组合物和制剂
[0211] 本文还提供了包含用于施用的经修饰的细胞的组合物，包括药物组合物和制剂，诸如单位剂型组合物，包括以给定剂量或其部分施用的细胞数。药物组合物和制剂通常包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，组合物包含至少一种另外的治疗剂。所述另外的治疗剂选自天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱、溶瘤病毒、抗雌激素如他莫昔芬、内昔芬、雷洛昔芬、氟维司群和/或芳香酶抑制剂诸如阿那曲唑、来曲唑和依西美坦。
[0212] 如本文中所用，术语“药学上可接受的制剂”是指这样的制剂，其形式允许本文包含的活性成分的生物活性有效，并且不含对向其施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分。
[0213] 如本文中所用，术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”意指与制剂的其他成分相容并且当向受试者施用时它们基本上不产生不良反应(例如，毒性、过敏性或免疫反应)的材料、组合物或媒介物。它们可由例如美国联邦或州政府的管理机构批准，或者在美国药典或其他公认的药典中列出，用于在动物中，更特别地在人中使用。
[0214] 如本文中所用，术语“药学上可接受的载体”或“载体”意指对受试者无毒的药学上可接受的材料或成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0215] 用于经乳头施用的制剂可以是适于施用至母乳导管中的任何制剂。出于本文公开的经乳头施用的目的，制剂可以是溶液、凝胶、悬浮液或乳液。待选择的载体可以部分地由特定细胞和/或由施用方法确定。载体例如由Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.Ed.(1980)描述。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间-甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂诸如聚乙二醇(PEG)。
[0216] 合适的防腐剂可包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以约0.0001重量％至约2重量％的总组合物的量存在。
[0217] 在一些方面，在组合物中包含缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物的约0.0001重量％至约4重量％的量存在。制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中。
[0218] 制剂可包括水溶液。制剂或组合物还可含有不止一种对细胞治疗的特定适应症、疾病或病症有用的活性成分，优选那些具有与细胞互补活性的活性成分，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分适合以对预期目的有效的量组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物还包含其他药物活性剂或药物，诸如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶，白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、长春碱、长春新碱、溶瘤病毒、抗雌激素诸如他莫昔芬、非内昔芬、内昔芬、雷洛昔芬、氟维司群和/或芳香酶抑制剂诸如阿那曲唑、来曲唑和依西美坦。
[0219] 在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗或预防乳腺病症的量，诸如治疗或预防有效量的细胞。在一些实施方案中，通过定期评估治疗的受试者来监测治疗或预防功效。
[0220] 可通过单次推注施用细胞，通过多次推注施用细胞(分散单位剂量)或通过连续施用细胞而经乳头施用所需剂量。细胞的施用可以是自体的或异源的/同种异体的。例如，细胞可获自一个受试者，并且将其施用于同一受试者或不同的相容受试者。可经乳头施用外周血来源的免疫细胞或其祖细胞(无论是体内、离体还是体外衍生的)。
[0221] 以无菌液体制剂(例如，通过无菌滤膜过滤灭菌的)(例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物(包括凝胶))的形式提供待经乳头递送的制剂，可将所述制剂缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶和其它粘性组合物更容易制备。另外，对于经乳头施用，液体组合物稍微更方便。
[0222] 可将粘性组合物(包括凝胶)配制在适当的粘度范围内，以提供与特定组织(诸如乳腺导管衬里)的更长接触时间。液体或粘性组合物(包含凝胶)可包含载体，其可以是含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、TRIS缓冲盐水、乳酸林格氏溶液(USP)、多元醇(例如甘油、丙烯甘油、聚丙烯甘油、液体聚丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。
[0223] 可以通过将细胞掺入溶剂(诸如与合适的载体、稀释剂或赋形剂诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等的混合物)中来制备无菌可经乳头施用的溶液。该组合物还可包含另外的物质，诸如润湿剂、分散剂或乳化剂诸如甲基纤维素、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强剂、防腐剂、调味剂、颜料或其任何组合。
[0224] 胶凝剂可选自聚丙烯酸( B.F.Goodrich Specialty Polymers and Chemicals Div.of Cleveland,Ohio)、羧聚乙烯(carboxypolymethylene)、羧甲基纤维素等，包括 聚合物的衍生物，诸如 Ultrez 10、
940、 941、 954、 980、
981、 ETD 2001、 EZ-2和 EZ-3、羧
乙烯基聚合物(卡波姆)，polloxomers、泊洛沙胺、壳聚糖、葡聚糖、果胶、天然树胶、聚合乳化剂和 聚卡波非、丙烯酸共聚物诸如丙烯酸酯/烷基丙烯
酸酯共聚物，聚丙烯酰胺、纤维素衍生物，乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)和羧甲基纤维素(CMC)、膨润土、脂肪酸金属盐诸如硬脂酸铝和疏水二氧化硅，或乙基纤维素和聚乙烯。另外的增稠剂、增强剂和佐剂通常可见于Remington's The Science and Practice of Pharmacy,Meade Publishing Co.,United States
Pharmacopeia/National Formulary中。亲水性胶凝剂包括聚丙烯酸(卡波姆)、多糖如羟丙基纤维素、天然树胶和粘土，以及作为亲脂性胶凝剂，代表性的是改性粘土。在一些实施方案中，胶凝剂是HPMC。在其他实施方案中，胶凝剂是CMC。在其他实施方案中，胶凝剂是卡波普。在另一个实施方案中，胶凝剂是藻酸盐/酯或明胶。
940、 941、 954、 980、
981、 ETD 2001、 EZ-2和 EZ-3、羧
乙烯基聚合物(卡波姆)，polloxomers、泊洛沙胺、壳聚糖、葡聚糖、果胶、天然树胶、聚合乳化剂和 聚卡波非、丙烯酸共聚物诸如丙烯酸酯/烷基丙烯
酸酯共聚物，聚丙烯酰胺、纤维素衍生物，乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)和羧甲基纤维素(CMC)、膨润土、脂肪酸金属盐诸如硬脂酸铝和疏水二氧化硅，或乙基纤维素和聚乙烯。另外的增稠剂、增强剂和佐剂通常可见于Remington's The Science and Practice of Pharmacy,Meade Publishing Co.,United States
Pharmacopeia/National Formulary中。亲水性胶凝剂包括聚丙烯酸(卡波姆)、多糖如羟丙基纤维素、天然树胶和粘土，以及作为亲脂性胶凝剂，代表性的是改性粘土。在一些实施方案中，胶凝剂是HPMC。在其他实施方案中，胶凝剂是CMC。在其他实施方案中，胶凝剂是卡波普。在另一个实施方案中，胶凝剂是藻酸盐/酯或明胶。
[0225] 可以调节胶凝剂的浓度以改变凝胶的粘度。例如，在一些实施方案中，制剂包含小于0.1％，0.5％，1％，小于2％，小于3％，小于4％，小于5％，小于10％的胶凝剂。或者，胶凝剂可在组合物的0.1％至80％w/w的范围内。
[0227] 通过使用延迟吸收的试剂，诸如单硬脂酸铝、聚乙二醇和明胶，可以延长吸收经乳头药物形式。
[0228] 在另一方面，组合物包含钆螯合物、超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)、19F全氟化碳纳米颗粒和其他磁性报告基因，诸如基于金属蛋白的MRI探针。
[0229] 制品
[0230] 本文还提供了用于施用本文公开的用于过继性细胞疗法的细胞和组合物，以及用于细胞和组合物的储存和施用的制品，诸如试剂盒和装置。
[0231] 制品包括一个或多个容器，通常一个或多个容器、包装材料和标签或包装说明书，通常包括向受试者施用细胞的说明书。
[0232] 容器含有一个或多个单位剂量的待施用的细胞和组合物。在一些实施方案中，制品包含一个或多个容器，每个容器包含单个单位剂量的细胞。单位剂量可以是在第一剂量中向受试者施用的细胞的量或数量，或者是在第一剂量或后续剂量中施用的细胞的数量的两倍(或更多)。其可以是与施用方法有关的向受试者施用的细胞的最低剂量或最低可能剂量。
[0233] 在一些实施方案中，单位剂量是可根据本文的方法以单个剂量向任何受试者施用的最少细胞数量或细胞数量。在一些实施方案中，单位剂量中的细胞数量是在第一剂量中期望施用于特定受试者(诸如所述细胞所源自的受试者)的细胞数或表达重组受体或表达CAR的细胞的数量。
[0234] 在一些实施方案中，细胞源自待通过本文提供的方法治疗的或有此需要的受试者。
[0235] 在一些实施方案中，一个或多个单位剂量含有表达相同受体例如CAR的细胞。在一些方面，一个或多个单位剂量含有表达与一个或多个另外的单位剂量不同的受体(例如CAR)的细胞。
[0236] 在一些实施方案中，每个容器各自包含单位剂量的表达第一或第二或第三等受体的细胞，所述容器含有相同或基本上相同数量的细胞。因此，在一些实施方案中，每个容器包含相同或大致相同或基本上相同的细胞数量或表达重组受体的细胞数量。在一些实施方案中，单位剂量包括少于1×103个、少于0.5×104个、少于1×104个、少于0.5×105个、少于1×105个、少于0.5×106个、少于1×106个、少于0.5×107个、少于1×107个、少于0.5×108个、少于1×108个、少于5×108个经修饰的细胞、总细胞、T细胞、NK细胞、CTL、巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、PBMC或其祖细胞。
[0237] 在一些实施方案中，制品还包括一种或多种另外的其他药物活性剂或药物，诸如化学治疗剂，诸如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、长春碱、长春新碱、溶瘤病毒、抗雌激素诸如他莫昔芬、内考昔芬、雷洛昔芬、氟维司群和/或芳香酶抑制剂诸如阿那曲唑、来曲唑和依西美坦。
[0238] 合适的容器包括但不限于例如瓶子、小瓶、注射器和柔性袋诸如输液袋。容器可由多种材料诸如玻璃或塑料形成。在一些实施例中，容器具有一个或多个端口，例如无菌接入端口，例如用于将配管或插管连接到一个或多个管，例如用于经乳头递送和/或用于连接以将诸如细胞培养物和/或储存袋或其他容器转移到其它容器和从其他容器转入所述细胞培养物和/或储存袋或其他容器。
[0239] 制品还可包括具有一条或多条标识信息和/或使用说明的包装说明书或标签。在一些实施方案中，信息或说明指示内容可以或应该用于治疗乳腺疾病和/或为其提供指导。标签或包装说明书可指示制品的内容物将用于治疗乳腺疾病。在一些实施方案中，标签或包装说明书提供了通过涉及施用(例如，根据所提供方法的任何实施方案)第一和一个或多个后续剂量的细胞的方法治疗受试者(诸如，所述细胞所源自的受试者)的说明。在一些实施方案中，说明书指定以第一剂量施用一个单位剂量，例如制品中单个个体容器的内容物，然后在指定时间点或在指定时间窗口内和/或在检测受试者中一种或多种因子或结果的存在或不存在或量或程度之后施用一个或多个后续剂量。
[0240] 如本文中所用，除非上下文另有指示，否则术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数指代物。
[0241] 如本文中所用，术语“约”是指可测量的值(诸如量、持续时间等)意在包括与指定值相差±20％，或在一些情况下±10％，或在一些情况下±5％，在一些情况下±1％，以及在一些情况下±0.1％的变化，因为此类变化适合于进行所公开的方法。
[0242] 如本文中所用，“活化”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞的状态。活化还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“活化的T细胞”尤其是指经历细胞分裂的T细胞。
[0243] 如本文中所用，“辅助疗法”是指在主要疗法之后并且被施用于具有复发风险的受试者的疗法。这些受试者是具有乳腺疾病史并且已经用另一种治疗方式治疗的受试者。乳腺癌的辅助全身性治疗通常在主要疗法后不久开始，以延迟复发，延长生存期或治愈受试者。如本文中所用，“主要疗法”是指在受试者初始诊断乳腺病症时的一线治疗。非限制性的示例性主要疗法可涉及手术，多种化学疗法和放射疗法。
[0244] 如本文中所用，术语“有……的风险”包括有发生乳腺病症的风险以及有乳腺病症复发的风险。
[0245] 如本文中所用，术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指哺乳动物，诸如人。哺乳动物还包括宠物动物，诸如狗、猫，实验动物，诸如大鼠、小鼠和农场动物，诸如牛和马。除非另有说明，否则哺乳动物可以是任何性别(gender)或性别(sex)。
[0246] 如本文所用，用于本公开内容的过继细胞疗法或组合物的“施用途径”或“递送途径”是指将本公开的细胞或组合物递送至受试者的途径。
具体实施方式
[0247] 1.一种用于治疗患有乳腺病症或有患乳腺病症风险的受试者的过继细胞疗法的经乳头方法，其包括将细胞施用到受试者的乳腺导管中。
[0249] 3.权利要求1的方法，其中所述细胞包含表达结合乳腺细胞上靶抗原的一种或多种重组受体的经修饰的细胞。
[0250] 4.权利要求3的方法，其中所述一种或多种重组受体包括嵌合抗原受体(CAR)或工程化或疾病特异性TCR。
[0251] 5.权利要求3的方法，其中所述经修饰的细胞表达两种或更多种CAR。
[0252] 6.权利要求3至5中任一项的方法，其中所述一种或多种重组受体独立地是单特异性的、双特异性的或多特异性的。
[0253] 7.权利要求3至6中任一项的方法，其中所述一种或多种重组受体是组成型、瞬时或可开关表达的，或条件活性的。
[0254] 8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其中所述经修饰的细胞包含安全性开关，所述安全开关选自死亡基因开关、基于FITC的开关和基于PNE的开关。
[0255] 9.权利要求8的方法，其中死亡基因开关是HSV-tk、iCaspase9或FADD。
[0256] 10.权利要求3至9中任一项的方法，其中所述靶抗原是肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原、多谱系肿瘤相关抗原、癌胚抗原、新抗原或免疫抑制抗原。
[0257] 11.权利要求3至10中任一项的方法，其中所述靶抗原选自转化相关分子，诸如MUC，诸如MUC1、c-met、细胞角蛋白诸如CK5、CK6、CK14、CK7、CK8、CK14、CK17、CK18、CK19、p53、糖苷、Tn、TF和唾液酸Tn(STn)、Lewis x、Lewis a、Lewis y和神经节苷脂诸如GM3、GD3、9-0-乙酰基GD3、9-0-乙酰基GT3和N-羟基-GM3、叶酸受体α、ROR1、新抗原、肿瘤特异性抗原和癌胚抗原、肿瘤相关抗原诸如癌胚抗原(CEA)、L1细胞粘附分子(L1CAM)、CAF相关蛋白诸如成纤维细胞活化蛋白(FAP)、FAP-α、FSP-1/S100A4和PDGFR-β、二神经节苷酯GD2、间皮素、IL-13受体IL13R、IL-13受体α、ephrinB2、IGFR1、ELIGHT、WT1、TAG-72、Ep-CAM、LFA-1、EGFR、雌激素受体(ER)、孕酮受体、MAGE1、MAGE-3、MAGE-A3/6、MAGE-A家族成员诸如MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A12、MAGE-A9、MAGE-A11、MAGE-C1和MAGE-C2、RAGE、BCR-ABL、蛋白酪氨酸激酶诸如PRL-2和PRL3、肿瘤相关糖蛋白诸如TAG-72、CA 19-9、CA 27.29、CA 72-4、CA 50、PD-1、CTLA-4CD47、受体酪氨酸激酶诸如H4-RET、Ki-67、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白E、p16、p21、p27、p53、Bcl-2、Bax、存活素、c-myc、Rb、VEGF、HPR1、HER1、HER2、HER3、HER4、CD10、SPARC、COX-2、基底细胞角蛋白、CK5/6、CK14和CK17、表皮生长因子受体、c-kit、c-erbB-2、IL-10、TGF-β、CCL17、CCL22和CCL24基质释放因子诸如EGF、HGF、MCP-1、CSF-1、VEGF、细胞因子诸如IL1、IL-8、TNF-α、酶诸如MM2、MMP7、MMP8、MMP9、MMP12、MMP13和COX2。
[0258] 12.权利要求3至11中任一项的方法，其中所述重组受体是HER2-CAR、FR-α-CAR或FAP-CAR。
[0259] 13.权利要求3至12中任一项的方法，其中所述重组受体包含选自以下的初级信号传导分子：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD8、CD16、CD22、CD25、CD79a、CD79b和CD66d。
[0260] 14.权利要求3-13中任一项的方法，其中所述重组受体包含一种或多种共刺激分子。
[0261] 15.权利要求3至14中任一项的方法，其中所述共刺激分子选自MHC I类分子，BTLA和Toll配体受体、免疫球蛋白超家族(IgSF)诸如CD28、B7受体家族成员(B7-H2/B7RP-1/LICOS/GL50、B7-DC/PD-L2、B7-H3)、CD226、TIM、CD2/SLAM、BTN、LAIR、肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)诸如OX40、CD27、CD30、DR3、GITR以及T细胞上的HVEM、CD2和SLAM、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、粘附分子(CD54、CD58、CD70)、ICOS、CD40、CD40L、4-1BB(CD137)、CD70、CD80、CD86、DAP10和其他孤儿受体家族诸如LAG3(CD223)和CD160。
[0262] 16.权利要求3至14中任一项的方法，其中所述重组受体包含CD28和4-1BB作为共刺激分子。
[0263] 17.权利要求3至16中任一项的方法，其中所述经修饰的细胞包括T细胞、NK细胞、CTL、单核细胞、粒细胞或其祖细胞。
[0264] 18.权利要求3-17中任一项的方法，其中所述经修饰的细胞还包含选自下述的染料或造影剂：钆螯合物、超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)、19F全氟化碳纳米颗粒和其他磁性报告基因诸如基于金属蛋白的MRI探针。
[0265] 19.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述细胞配制在组合物中，所述组合物还包含药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂或其组合。
[0266] 20.权利要求19的方法，其中所述载体是乳酸林格氏溶液。
[0267] 21.权利要求19的方法，其中所述组合物还包含胶凝剂。
[0268] 22.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳腺病症是良性乳腺病症、乳腺癌、乳头Paget病或叶状瘤。
[0269] 23.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳腺病症是增生、异型性、导管增生、小叶增生、非典型导管增生(ADH)或非典型小叶增生(ALH)。
[0270] 24.前述权利要求中任一项的方法，其中所述乳腺病症是选自以下的乳腺癌：原位导管癌(DCIS)、原位小叶癌(LCIS)、侵入性(或浸润性)小叶癌(ILC)、侵入性(或浸润性)导管癌(IDC)、微浸润性乳腺癌(MIC)、炎性乳腺癌、ER阳性(ER+)乳腺癌、孕酮受体阳性(PR+)乳腺癌、ER+/PR+乳腺癌、ER阴性(ER-)乳腺癌、HER2+乳腺癌、三阴性乳腺癌(即，ER-/PR-/Her2-乳腺癌；“TNBC”)、腺样囊性(腺囊性)癌、低度腺鳞癌、髓样癌、粘液(或胶样)癌、乳头状癌、小管癌、化生性癌和微乳头状癌。
[0271] 25.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳腺癌是癌变前期、早期癌症、非转移性癌症、转移前癌症、局部晚期癌症、转移性癌症或复发性癌症。
[0272] 26.前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞以单剂量或多剂量施用。
[0273] 27.权利要求26的方法，其中所述多剂量包括第一剂量和一个或多个后续剂量。
[0274] 28.权利要求26的方法，其中一个或多个剂量以分散单位剂量施用。
[0275] 29.前述权利要求中任一项的方法，其中向所述受试者施用单位剂量的细胞，所述单位剂量的范围为1×103至1×109个经修饰的细胞/kg体重、1×103至5×108个经修饰的细胞/kg体重、0.5×103至1×107个经修饰的细胞/kg体重、1×104至0.5×106个经修饰的细胞/kg体重、0.5×104至1×106个经修饰的细胞/kg体重、1×105至0.5×106个经修饰的细胞/kg体重。
[0276] 30.权利要求27的方法，其中所述第一剂量是低剂量，诸如小于1×103个细胞/kg、小于0.5×104个细胞/kg、小于1×104个细胞/kg、小于0.5×105个细胞/kg、小于1×105个细胞/kg、小于0.5×106个细胞/kg或小于1×106个细胞/kg。
[0277] 31.权利要求27的方法，其中所述第一剂量是高剂量，诸如大于0.5×105个细胞/kg、大于1×105个细胞/kg、大于0.5×106个细胞/kg、大于1×106个细胞/kg、大于0.5×107个细胞/kg、大于1×107个细胞/kg、大于0.5×108个细胞/kg、大于1×108个细胞/kg或大于5×108个细胞/kg。
[0278] 32.权利要求27的方法，其中在第一剂量开始后7至28天之间施用后续剂量。
[0279] 33.权利要求27的方法，其中后续剂量与所述第一剂量相同，低于所述第一剂量或高于所述第一剂量。
[0280] 34.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述细胞作为主要疗法、新辅助疗法或辅助疗法施用。
[0281] 35.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞的施用降低了所述受试者的乳腺病症的疾病负担。
[0282] 36.前述权利要求中任一项的方法，包含重组受体的经修饰的细胞的施用减轻了受试者的肿瘤负荷
[0283] 37.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞的施用减轻了肿瘤负荷。
[0284] 38.前述权利要求中任一项的方法，其中经修饰的细胞的施用减轻了肿瘤负荷。
[0285] 39.前述权利要求中任一项的方法，其中施用降低了CRS相关后果、MAS相关后果、TLS相关后果、神经毒性相关结果或宿主免疫应答相关后果的风险。
[0286] 40.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞的施用降低细胞因子诸如IFNγ、TNFα、IL-2、GM-CSF、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、Flt-3、不规则趋化因子、MIP1、sIL-2Rα和IL-5的循环或乳腺组织水平。
[0287] 41.前述权利要求中任一项的方法，其中所述经修饰的细胞的施用降低细胞因子诸如IFNγ、TNFα、IL-2、GM-CSF、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、Flt-3、不规则趋化因子、MIP1、sIL-2Rα和IL-5的循环或乳腺组织水平。
[0288] 42.前述权利要求中任一项的方法，其中在施用所述细胞之前用淋巴细胞清除剂或化学治疗剂预处理所述受试者。
[0289] 43.权利要求42的方法，其中所述淋巴细胞清除剂或化学治疗剂选自环磷酰胺、环孢菌素、氟达拉滨、苯达莫司汀、来那度胺、泊马度胺、吉西他滨、BTK抑制剂诸如依鲁替尼、溶瘤腺病毒及其组合。
[0290] 44.前述权利要求中任一项的方法，其中向所述受试者施用另外的治疗剂或疗法。
[0291] 45.权利要求44的方法，其中所述另外的治疗剂选自天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱、溶瘤病毒诸如溶瘤腺病毒、抗雌激素诸如他莫昔芬、N-甲基-内昔芬、炔诺昔芬、内昔芬、雷洛昔芬、氟维司群和/或芳香酶抑制剂诸如阿那曲唑、来曲唑和依西美坦。
[0292] 46.一种用于治疗患有乳腺病症或有患乳腺病症风险的受试者的过继性细胞疗法的经乳头方法，其包括将表达HER2-CAR、FAP-CAR或FR-α的经修饰的细胞施用至受试者的乳腺导管中。
[0293] 47.权利要求46的方法，其中所述HER2-CAR与图2中公开的SEQ ID NO:1或其变体或功能部分具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和100％的同源性。
[0294] 48.权利要求46的方法，其中所述FAP-CAR与图2中公开的SEQ ID NO:2或其变体或功能部分至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％和100％的同源性。
[0295] 49.一种制品，其包含一个或多个容器、包装材料、标签或包装插页以及任选地装置。
[0296] 50.权利要求49的制品，其中所述装置是针和注射器、套管、导管、微导管、渗透泵或包封装置。
[0297] 贯穿本公开内容，所要求保护的主题的各个方面以范围形式或以绝对值或参数呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应该被解释为对所要求保护的主题的范围的难以改变的限制。因此，应该认为范围的描述已具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，在提供一系列值的情况下，应理解，在该范围的上限与下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值均包含在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在要求保护的主题内，受所述范围内的任何特别排除的限制。在所述范围包括一个或两个端值的情况下，排除那些包括的端值中的一个或两个的范围也包括在所要求保护的主题中。无论范围的广度如何，这都适用。在提及绝对值或参数的情况下，绝对值或参数旨在包括本技术领域的技术人员容易知道的相应值或参数的通常误差范围。对本文中的绝对值或参数的引用包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。
[0298] 本文提到的所有出版物，包括专利文献、科学论文和数据库为了所有目的通过引用整体并入，其程度如同每个单独出版物单独地通过引用并入。如果本文所示的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中阐述的定义相反或不一致，则本文所示的定义优先于通过引用并入本文的定义。
[0299] 本文中使用的章节标题仅用于组织目的，不应解释为限制所描述的主题。
[0300] 实施例
[0301] 本公开中提供的实施例仅用于说明而非意图限制本发明的范围。
[0302] 实施例1
[0303] 经乳头过继细胞治疗后经修饰的细胞运输的动力学
[0304] 如下招募计划接受手术治疗乳腺癌的八(8)名受试者来研究经修饰的细胞在经乳头过继细胞疗法后迁移和转移离开乳腺的动力学：
[0305] 对照细胞。用载体盒模拟转导经修饰的T细胞，所述载体盒包括标签诸如Strep-tag II或抗荧光素-scFV(对照细胞)。将剂量范围为1X 102至5×109的对照细胞经乳头施用至四(4)名受试者的一个或多个乳腺导管中。在将对照细胞经乳头施用至乳腺导管中之后的零(0)小时、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、36小时、48小时、72小时和7天，从受试者获得血液样品。按照制造商的说明，使用淋巴细胞分离培养基(Mediatech Inc,Manassas,VA)分离外周血单核细胞(PBMC)。将分离的外周血单核细胞(PBMC)与10μl的1.2％人IgG溶液(Baxter,Deerfield,IL)一起孵育以阻断非特异性抗体结合。通过FACS对PBMC进行细胞分选，并对对照细胞进行分离和计数。确定外周循环中对照细胞出现的数量和时间。
[0306] 表达重组受体的经修饰的细胞诸如CAR-T细胞：将剂量范围为1X 102至5×109的表达HER1-CAR的T细胞经乳头施用至四(4)个受试者的乳腺导管中，以测定外周循环中迁移和出现的动力学。与对照细胞相比，预期经修饰的细胞在血液中显示延迟的出现并且数量减少。
[0307] 对一些受试者施用的对照细胞和表达HER2的经修饰的细胞也载有钆螯合物。施予加载有钆螯合物的对照细胞和表达HER2的经修饰的细胞的受试者在第0天和第7天进行MRI扫描以追踪经乳头施用的细胞的迁移。
[0308] 在计划的最终手术(如由主治医生推荐的乳房肿瘤切除术或乳房切除术)之后，获取乳腺组织样品。对乳房组织样品进行使用HER2的ELISA，并测定T细胞表型和局部细胞应答诸如细胞因子释放。任选地收获前哨淋巴结或其他淋巴结并测试施用细胞向组织样品中的迁移。预期T细胞在体内扩增，表现为记忆表型和/或具有抗肿瘤细胞毒活性。
[0309] 实施例2
[0310] 利用表达HER2-CAR的淋巴细胞治疗局部乳腺癌
[0311] 临床试验：使用淋巴清除预处理，然后导管内施用抗HER-2基因转导的淋巴细胞(经修饰的细胞)，对患有表达HER-2的局部乳腺癌的受试者进行I/II期临床试验。
[0312] 受试者纳入标准包括以如在临床实验室改进修正案(Clinical Laboratory Improvement Amendments)(CLIA)批准的实验室中通过免疫组织化学评估以≥2+水平表达ErbB2(HER-2)并且在导管内施用经修饰的细胞后对其进行乳房切除术的乳腺癌。受试者年龄≥18岁。遵循赫尔辛基协议声明并将从受试者获得书面知情同意书。
[0313] 在接受经修饰的细胞(转导的外周血淋巴细胞(PBL))治疗之前，使用非清髓性淋巴细胞清除方案，通过静脉内施用60mg/kg的环磷酰胺2天，然后以25mg/m2施用氟达拉滨5天对受试者进行短暂淋巴清除术。在淋巴清除方案完成后一天，受试者接受使用导管经导管内施用的经修饰的细胞，然后每8小时接受高剂量(720,000U/kg)IL-2(Aldesleukin；Chiron,Emeryville,CA)以诱导耐受。该方案被设计为小组(每个小组三名患者)中的细胞剂量递增。最低细胞剂量小组是≤103个细胞/导管内施用。最高剂量为5x 109。
[0314] 基因转移程序：如文献(Zhao Y，等，J Immunol.2009；183:5563–5574及其增刊S1)中所述，制备设计用于表达基于赫赛汀mAb的HER2特异性单链Fv片段(4D5-CD8-28BBZ)的γ-逆转录病毒载体质粒构建体。简而言之，将来自mAb 4D5的单链Fv片段与CD8α-链铰链和跨膜区与连接，其带有CD28、4-1BB和CD3ζ细胞内信号传导结构域。将该盒插入MSGV-1γ-逆转录病毒载体中。
[0315] 选择高滴度的基于PG13细胞的生产细胞系并使用目前的良好制造实践进行转导，收集逆转录病毒载体上清液。测试载体上清液，所述上清液符合目前所需的美国食品和药物管理局关于生产用于临床应用的重组γ-逆转录病毒载体的指南。
[0316] 转导程序：在含有5％人血清(Surgery Branch,NCI)的AIM-V培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中用终浓度为50ng/ml的抗-CD3 mAb OKT3(Ortho Diagnostic Systems,Raritan,NJ)和终浓度为300IU/ml的重组人IL-2刺激PBMC。第2天收获细胞用于逆转录病毒转导，将所述细胞重悬于不含OKT3的相同培养基中。将逆转录病毒载体上清液解冻并用两份培养基稀释，然后加载到RetroNectin(CH-296；Takara Bio,Ohtsu,Japan)涂覆的(用10mg/ml CH-296涂覆的)非组织培养物处理的六孔板。通过在<32℃下以2,000g离心2小时，将载体上清液“旋涂”至涂覆的板上。从孔中吸出逆转录病毒载体，每孔加入1×106至2×106个活化的PBMC，然后以1,000g离心10分钟。将平板在37℃孵育过夜，第二天收集所有孔，合并，并重复转导程序。在第二次转导后，收集细胞并在刺激后以0.5×106至2.0×106个细胞/ml维持在培养基中，持续总共10天。在刺激后第10天，使用6,000IU/ml IL-2和50ng/ml抗CD3mAb OKT3以及100倍过量的5Gy照射的同种异体PBL饲养细胞，使细胞进行另外14天的快速扩增程序。在输注前用盐水洗涤处理细胞，并将其重悬于含有300IU/ml IL-2的125ml中，然后将其向患者进行导管内施用。
[0317] 体外测定：在输注前2至4天，使用ERBB2-Fc融合蛋白或作为对照使用VEGFR2-Fc(R&D Systems,Minneapolis,MN)，然后使用缀合有藻红蛋白的抗人IgG Fc抗体(eBioscience,San Diego,CA)评估CAR转导的PBL的ERBB2特异性CAR表达。将免疫荧光作为活细胞的相对对数荧光进行分析，并使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)测量。通过与表达HER2和不表达HER2的靶细胞(1×105个靶标加1×105个效应T细胞)过夜共培养，然后进行IFN-γ的酶联免疫吸附测定(ELISA)测量(Pierce Endogen,Rockford,IL)来评估细胞功能。HER2+靶细胞诸如黑素瘤细胞系526、624、888、938(在Surgery Branch,NCI产生的)和肿瘤细胞系SK-OV3、SK-BR3、MDA361(美国典型培养物保藏中心，Rockville,MD)以及获自ATCC的HER2-肿瘤细胞系MDA468和CCRF-CEM(CEM)。将所有肿瘤细胞系在由补充有10％热灭活的胎牛血清(Biofluids,Rockville,MD)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素(Invitrogen)的RPMI-1640组成的培养基中培养。购买可从Lonza(Walkersville，MD)商购获得的未转化的人细胞培养物并将其保持在供应商推荐的培养基中。从受试者的PBMC获得自体树突状细胞和巨噬细胞培养物(Lassus H等，
J.Mol.Med.2006；84:671–681)。
J.Mol.Med.2006；84:671–681)。
[0318] 按照制造商的说明，使用Maxwell 16Tissue DNA Purification试剂盒(Promega,Madison,WI)从快速冷冻的组织样品中分离基因组DNA。将100纳克的每种DNA用于实时定量PCR测定(TaqMan；Applied Biosystems,Foster City,CA)。使用ABI 7500Fast Real-time PCR系统仪器(Applied Biosystems)进行所有PCR。TaqMan基因特异性测定由ABI Assays-by-Designs软件(Applied Biosystems)设计。用于检测HER2-CAR载体的引物和探针是：4D5BBCD3Z-F TGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAG(SEQ ID NO:9),4D5BBCD3Z-R
TGCGCTCCTGCTGAACT(SEQ ID NO:10),4D5BBCD3Z-M FAM探针CACTCTCAGTTCACATCCT(SEQ ID NO:11)。使用从输注到受试者的细胞中提取的DNA建立参考标准曲线，将未稀释的输注DNA的值设为100作为参考。TaqManβ-肌动蛋白对照试剂盒(Applied Biosystems)用于标准化对输入DNA量的反应。使用商购可得的PCR序列特异性引物试剂盒(Cytokine Genotype Tray；One Lambda,Canoga Park,CA)按供应商的指示测定细胞因子基因型。
TGCGCTCCTGCTGAACT(SEQ ID NO:10),4D5BBCD3Z-M FAM探针CACTCTCAGTTCACATCCT(SEQ ID NO:11)。使用从输注到受试者的细胞中提取的DNA建立参考标准曲线，将未稀释的输注DNA的值设为100作为参考。TaqManβ-肌动蛋白对照试剂盒(Applied Biosystems)用于标准化对输入DNA量的反应。使用商购可得的PCR序列特异性引物试剂盒(Cytokine Genotype Tray；One Lambda,Canoga Park,CA)按供应商的指示测定细胞因子基因型。
[0319] 将使用商购可得的酶联免疫吸附测定试剂盒[IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和IL-6(Endogen,Cambridge,MA)]或Searchlight细胞因子阵列(Aushon Biosystems,Billerica,MA)测定血清细胞因子水平。在稀释至测定的线性范围内的样品中测量细胞因子分泌。
[0320] 经修饰的细胞的导管内施用
[0321] 乳头准备。在受试者脱去衣服后，临床医生清洁待研究的乳房上的乳头。这包括用微粒状凝胶或软膏将乳头擦拭干净，以疏松并去除任何死皮细胞和积聚的油脂。这是在医疗操作之前经常在医院使用的清洁剂。然后，将一些麻醉膏(numbing cream)涂在乳头上。
[0322] 乳头麻醉剂。将与0.1-0.2mL蓝色染料混合的1mL利多卡因用非常小的针头注入乳头基部。
[0323] 管(duct)标识。在染料注射之后并且在导管放置之前，将小的柔性线插入开口中约1/2英寸以进一步标识和扩张管开口。一旦标别了管，就将一小块打结的缝合材料插入管中以对其进行标记。这在至少3个管开口和多达5个管上完成。如果临床医生不能找到至少3个管开口，则受试者不能继续进行研究并且被撤出。这些受试者被新招募的受试者替代。
[0324] 导管放置、转染的T细胞的滴注和X射线检查。一旦标记了所有乳头管开口，临床医生将导管通过管开口插入并放置在如此标记的每个标记的乳腺导管中。一旦导管就位，临床医生可任选地缓慢(超过30秒)将少于1mL的不透射线的染料灌注到管中以允许管成像。
[0325] 在染料滴注之后并且取决于所鉴定的管的数量，将至多2mL(通常范围为0.5至2mL)的转染细胞的悬浮液缓慢(超过1分钟)注射到每个导管中。仅治疗包含侵入性癌症的乳腺。根据待治疗的管数量，将细胞分批或成组地以高达10mL的体积经乳头施用至受累乳腺导管中。尝试根据所标识的受累管或小叶的数量，逐个管地均匀地分配剂量。
[0326] 导管通常在每个管中保留约1-5分钟。在操作期间，要求受试者使用视觉模拟量表评估他们的疼痛。在滴注染料和细胞后，拍摄图像以证明将经修饰的细胞充分注入导管中。当受累管数量多于2个导管时，可成组进行经乳头过继细胞疗法程序。将导管从第一组管(例如2个相邻管)中移除，并且这些管各自用一小块打结的缝合材料标记。此时，使用疼痛评估的疼痛量表评估受试者的疼痛。
[0327] 随后，将新导管插入剩余的标记管中。在乳头管的下半部分插入导管并且注入染料和细胞后，用荧光镜拍摄另一张图像以记录管。再次要求受试者评估他们的疼痛。移除导管并且用一小块打结的缝合材料单独标记管。将安息香软膏和透明塑料敷料(生物闭合(bio-occlusive))置于乳头上以使标记物保持在适当位置直至手术。整个操作花费0.5至1.5小时。拍摄过程的照片。
[0328] 如果在评估疼痛期间，受试者报告不会在输注经修饰的细胞后10分钟内消退的3级或4级乳房疼痛，则中断对该受试者的研究相关程序。根据本方案进行如本文所述的血液抽取和随访评估以及病理评估。在这种情况下，为了统计目的，在研究组中替换受试者。
[0329] 如果在初始X射线检查时发现穿孔，则立即评估副作用。如果受试者没有报告任何不良反应，则将剩余的管插管并施予经修饰的细胞。根据方案进行如下所述的研究相关的血液抽取和评估以及病理评估。
[0330] 实施例3
[0331] 用表达HER2-CAR的自体T细胞治疗原位导管癌
[0332] 该研究被设计来确定自体T细胞的经乳头施用的安全性和可行性，所述自体T细胞将遗传物质转移至细胞中以将其重定向而靶向乳腺癌细胞而非其通常的靶标。符合条件的受试者具有对一种标准疗法具有抗性的HER2+和/或复发性乳腺癌，或者具有新诊断的HER2+乳腺癌。
[0333] 以逐步方式招募15名年龄为18岁以上且基线ECOG状态为0或1的可评估患者。步骤1招募具有对至少一种标准疗法(诸如他莫昔芬或其他化学疗法)具有抗性的HER2+和/或复发性乳腺癌的受试者，步骤2招募新诊断的DCIS中的受试者。受试者接受表达嵌合抗原受体(iC9-Her2scFV-CD8a铰链-CD28Tm-CD28共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域)的经修饰的T细胞，其包含自杀安全开关、诱导型半胱天冬酶9(iC9)，并且与在受试者的DCIS细胞(HER2-CAR-T细胞)上表达的HER2特异性结合。
[0334] 通过基于免疫亲和力的富集，用DCIS从招募的人受试者的外周血中分离T细胞，培养所述细胞并用包含连接于由Sun等(Breast Cancer Research,2014,16:R61)描述的HER2scFV-CD8a铰链-CD28Tm-CD28-CD3ζ构建体的死亡基因安全开关iC9的载体转导。将表达HER2-CAR(iC9-HER2scFV-CD8a铰链-CD28Tm-CD28-CD3ζ)的经修饰的细胞在个体套管(e)中的培养基中冷冻保存，每个套管包含单个单位剂量的细胞，其为约1×105个细胞/kg受试者体重、1×106个细胞/kg受试者体重和1×107个细胞/kg受试者体重。在经乳头递送之前，将细胞维持在低于-130℃的温度。
[0335] 在施用HER2-CAR-T细胞之前，在第-7天，第-2天，用环磷酰胺(剂量范围在40mg/kg至80mg/kg的受试者体重)预处理受试者。
[0336] 就在第0天开始细胞治疗之前，从受试者获得血液，并且任选地，通过ELISA测定血清中指示细胞因子释放综合征(CRS)的一种或多种血清因子诸如TNF-α、干扰素-γ和IL-6的水平。任选地通过测量(诸如通过PET或CT扫描)癌的大小或质量或通过在治疗开始之前测量诸如乳头抽吸物或导管灌洗液中与癌症相关的患者的细胞数量来评估肿瘤负荷。对受试者的乳腺和躯干进行MRI扫描以建立基线，以便以后测定施用细胞的迁移程度。
[0337] 通过加温至约37℃将细胞在床边解冻。如实施例1中所述准备受试者的乳房乳头，并用酒精擦拭物擦拭并从受累乳房的乳房乳头中除去角质栓(如果有的话)。然后通过在5至15分钟的时间内将细胞经乳头施用至乳房管腔中，向受试者施用约1mL体积的一定剂量的细胞。对于一些受试者，剂量的量是单个单位剂量。对于其他受试者，剂量是分散单位剂量。在需要体积限制的情况下，这是所希望的。在2天内以两个等分试样施用5×104个细胞/kg体重的这种分散单位剂量。对于被认为具有低肿瘤负荷的受试者，可以递送超过一个单位剂量，例如，额外的单个单位剂量。
[0338] 在剂量施用后，对受试者进行体格检查并监测发热、缺氧和神经紊乱。在接下来的36小时内定期抽取血液样品以测定细胞因子、c-反应蛋白(CRP)和其他血清因子的水平，并将这些水平与表达HER-2 CAR的经修饰的细胞剂量的剂量施用前观察到的水平进行比较。
如果给药后水平高于给药前水平，则根据副作用或CRS的严重程度，向受试者施用抗IL6疗法或CID分子诸如AP1903或AP20187。
如果给药后水平高于给药前水平，则根据副作用或CRS的严重程度，向受试者施用抗IL6疗法或CID分子诸如AP1903或AP20187。
[0339] 施用细胞的迁移和/或肿瘤浸润通过例如在向受试者给药后1周、2周、3周和/或4周进行一次或多次MRI扫描来测定。通过PET、CT或MRI扫描测量由此类细胞实现的肿瘤负荷减轻百分比。
[0340] 在施用细胞后，例如在施用后1周、2周、3周或4周，例如通过检测(例如通过对获自乳腺的切开性或切除性活组织检查样本进行免疫染色)针对CAR的抗体是否存在来任选地检测受试者中是否存在抗CAR免疫应答。
[0341] 一些受试者接受如上所述的第一剂量，然后接受一个或多个后续剂量的表达HER2-CAR的经修饰的细胞。后续剂量的大小是患者特异性的。在一些受试者中，在第一剂量开始后3周，在约10-30分钟内，将1×106个细胞/kg受试者体重的后续剂量经乳头施用至受试者的乳腺导管中。在第一剂量后监测受试者，并且对于任何毒性结果和/或DCIS的复发，监测可持续数年。任选地，一些受试者可以接受第二后续剂量的1×107个细胞/kg体重。
[0342] 评估对表达HER2-CAR的细胞和/或CRS、MAS、TLS、神经毒性等的宿主免疫应答的发展。将通过MRI评估施用的细胞向肿瘤的迁移，并测定肿瘤负荷。
[0343] 在受试者具有CRS相关事件的情况下，将向受试者施用CID分子诸如AP1903或AP20187，以关闭HER2-CAR表达并消除表达HER2-CAR的经修饰的细胞。还可根据CRS相关事件的严重度施用抗IL-6疗法，诸如托珠单抗(Actemra)、阿替珠单抗(RoActemra)。
[0344] 虽然已经说明和描述了说明性实施方案，但应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可在其中进行各种改变。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 用于检测单个T细胞受体亲和力和序列的方法和组合物 | 2020-05-17 | 575 |
| 与髓源性抑制细胞相关的病症的治疗方法 | 2020-05-21 | 377 |
| 重定向T细胞以治疗HIV感染的方法 | 2020-05-20 | 796 |
| 表达嵌合细胞内信号传导分子的细胞的方法和组合物 | 2020-05-17 | 542 |
| 用于治疗癌症的RNA改造的T细胞 | 2020-05-15 | 935 |
| TGFβ信号转换器 | 2020-05-19 | 883 |
| 使用过继细胞疗法治疗B细胞恶性肿瘤的方法 | 2020-05-12 | 54 |
| 使用精氨酸耗竭剂的组合癌症免疫疗法 | 2020-05-18 | 974 |
| 改进的用于过继细胞治疗的细胞培养方法 | 2020-05-13 | 996 |
| IL-36β的应用 | 2020-05-18 | 802 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈