本发明针对与基因和由被鉴定基因的表达所代表的与这些基因相关的生物 通路的鉴定和表征相关的组合物和方法，以及该基因和生物通i?各相关的miRNA在治疗、预后和诊断应用中的应用，尤其是那些与评价和/或鉴定与miR-126表
在某些方面，本发明针对用于评价、分析和/或治疗细胞或受试者的方法， 在该细胞或受试者中，作为miR-126家族成员（包括但不限于SEQ ID NO:l至 SEQIDNO:24)的任意一员或组合的表达增加或减少的结果，某些基因的表达减 少或增加(相对于正常)和/或作为其表达增加或减少的结果，基因表达增加(相对 于正常）。表达谱和/或对miR-126表达或抑制的反应可作为指示疾病或具有病理 状态诸如癌症的个体的指标。
以所列举的miRNA或所列举的标志物（包括其核酸代表)的任意一种或组合 为特征的预后测定可用于评价患者以确定任何治疗方案是否合适。与上面提到 的诊断测定一样，规定低表达的绝对值将取决于用来测量miRNA的平台。说明 用于诊断测定的相同方法可用于预后测定。 I.治疗方法
本发明的实施方案涉及当被导入进细胞中时执行内源性miRNA的活性或抑 制内源性miRNA的核酸。在某些方面，核酸是合成的或非合成的miRNA。序 列特异性miRNA抑制剂可用来连续地或组合地抑制细胞中一种或多种内源性 miRNA的活性，以及由该内源性miRNA调控的那些基因和关联通路。
在一些实施方案中，本发明涉及在细胞中发挥miRNA或miRNA抑制剂的 功能的短核酸分子。术语"短"是指单个多聚核苷酸的长度为15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 50、 100、或150个核苷酸或更少的核苷酸，包 括其间的所有整数或派生的范围。核酸分子一般是合成的。术语"合成的"是 指在细胞中分离的且不是天然产生的核酸分子。在某些方面，序列（全部序列） 和/或化学结构与天然核酸分子诸如内源性前体miRNA或miRNA分子或其互补 序列有偏差。尽管在一些实施方案中，本发明的核酸不具有与天然核酸的序列
然而，可考虑给予细胞的合成核酸可以随后在细胞中被-修饰或改变使得其结构 或序列与非合成的或天然核酸诸如成熟miRNA序列相同。例如，合成核酸可以 具有与前体miRNA的序列不同的序列，但该序列可以在细胞中被改变一次以与 内源性、加工的miRNA或其抑制剂相同。术语"分离的"的意思是，本发明的 核酸分子最初从不同的(就序列或结构而言)和不需要的核酸分子中分离出来，使 得分离核酸的群体与其他多聚核苷酸分子至少大约90%同源，并且可以至少大约95、 96、 97、 98、 99或100%同源。在本发明的许多实施方案中，由于其已 经在体外被合成，核酸被分离而与细胞中的内源性核酸分开。然而，要理解的 是，分离核酸可以随后被混合或汇集在一起。在某些方面，本发明的合成miRNA 是RNA或RNA类似物。miRNA抑制剂可以是DNA或RNA、或其类似物。本 发明的miRNA和miRNA抑制剂总称为"合成核酸"。
在一些实施方案中，有长度在17和130个残基之间的miRNA或合成
miRNA。 本发明涉及长度为、至少为或至多为15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、
22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、
39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、
56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、
73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、
90、 91、 92、 93、 94、 95、 ％、 97、 98、 99、 100、 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107、 108、 109、 110、 111、 112、 113、 114、 115、 116、 117、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 126、 127、 128、 129、 130、 140、 145、 150、 160、 170、 180、 190、 200或更多个残基（包括其间的任意整数或任意范围）的 miRNA或合成miRNA分子。
在某些实施方案中，合成miRNA具有(a) "miRNA区"，其从5，至3'的序 列或结合区与成熟miRNA序列的所有序列或片段相同或互补，和(b)"互补区"， 其从5，至3，的序列与(a)中的miRNA序列的互补性在60%和100%之间。在某些 实施方案中，这些合成miRNA也如上所述净皮分离。术语"miRNA区"是指合 成miRNA上的与成熟、天然miRNA序列或其互补序列的全部序列至少75、 80、 85、 90、 95或100%(包括其间所有整数)相同的区域。在某些实施方案中，miRNA 区是天然miRNA或其互补序列的序列或与天然miRNA或其互补序列的序列至 少90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 99.1、 99.2、 99.3、 99.4、 99.5、 99.6、 99.7、 99.8、 99.9或】00%相同。
术语"互补区"或"互补序列，，是指成熟、天然miRNA序列或与成熟、天 然miRNA序列至少60%互补的核酸的区域或模拟物。互补区具有或至少具有 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 99.1、 99.2、 99.3、 99.4、 99.5、 99.6、 99.7、 99.8、 99.9或100%或其中派生的任意范围的互补性。对于单个多聚核苷酸序列，作为miRNA区和互补区之间化学键合的结果，可以有发夹环结构。在其他实施方案 中，互补区在不同的核酸分子上，而不是在miRNA区上，在此情况下，互补区 在互补链上，并且miRNA区在活性链上。
在本发明的其他实施方案中，有为miRNA抑制剂的合成核酸。miRNA抑 制剂的长度在大约17-25个核苷酸之间，并且包括与成熟miRNA的5'-3'序列至 少90%互补的5，-3，序列。在某些实施方案中，miRNA抑制剂分子的长度为17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、或25个核苷酸，或其间派生的任意范围。此外， miRNA抑制剂可具有与成熟miRNA ，尤其是成熟的、天然miRNA的5'-3，序 列的序列或与成熟的、天然miRNA的5，-3，序列是或至少是70、 75、 80、 85、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 99.1、 99.2、 99.3、 99.4、 99.5、 99.6、 99.7、 99.8、 99.9或100%(或其中派生的任意范围）互补的序歹'](从5，-3')。本领域 技术人员能够使用与成熟miRNA的序列互补的一部分miRNA序列作为 miRNA抑制剂的序列。此外，核酸序列的该部分可被改变使得它仍然包括与成 熟miRNA的序列的适当百分比的互补性。
在本发明的一些实施方案中，合成miRNA或抑制剂含有一个或多个设计元 件。这些设计元件包括但不限于：（i)在互补区的5'末端处核苷酸的磷酸根或羟 基的取代基团；（ii)在互补区的最前或最后l-6个残基中的一个或多个糖修饰； 或，（iii)在互补区的3，端处最后1-5个残基中一个或多个核苦酸与miRNA区的 相应核苷酸之间的非互补性。许多设计修饰作用在本领域中是公知的，见下。
在某些实施方案中，合成miRNA在其互补区的5，端处有一个其中磷酸根和 /或羟基基团已经被另一化学基团取代的核苦酸(称为"取代设计"）。在一些情 况下，磷酸根基团被取代，而在其他情况下，羟基基团被取代。在特定的实施 方案中，取代基团是生物素、胺基、低级烷胺基团、乙酰基、2'0-Me (2，氣-曱 基)、DMTO(具有氧的4,4，-二曱氧三苯甲基)、荧光素、硫醇或吖啶，尽管其他 取代基团对于本领域专业技术人员是公知的并也可使用。此设计元件也可用于 miRNA抑制剂。
其他的实施方案涉及在互补区的最前或最后1-6个残基中具有一个或多个 糖修饰的合成miRNA(称为"糖取代设计，，）。在某些情况下，在互补区的最前 1,2、 3、 4、 5、 6或更多个残基或其中派生的任意范围的残基中有一个或多个糖 修饰。在其他的情况下，在互补区的最后1, 2、 3、 4、 5、 6或更多个残基中有 一个或多个糖修饰，或在其中派生的任意范围的残基中有一个糖修饰。要理解的是，术语"最前"和"最后"是关于从该区的5，端至3，端的残基顺序。在特
定的实施方案中，糖修饰是2，0-Me修饰。在进一步的实施方案中，在互补区的 最前或最后2-4个残基或互补区的最前或最后4-6个残基中有一个或多个糖修 饰。此设计元件也可用于miRNA抑制剂。因此，如上所迷，miRNA抑制剂在5' 末端处的核苷酸上具有此设计元件和/或取代基团。
在本发明的其他实施方案中，有其中在互补区的3'端处的最后1-5个残基中 的一个或多个核香酸不与miRNA区的相应核香酸互补（"非互补性"）（称为"非 互补设计"）的合成miRNA或抑制剂。非互补性可以在互补miRNA的最后1、 2、 3、 4和/或5个残基中。在某些实施方案中，互补区中的至少2个核苷酸具有非 互补性。
可考虑本发明的合成miRNA具有一个或多个取代、糖^'爹饰或非互补性设计。 在某些情况下，合成RNA分子具有它们中的两个，而在其他这些分子中的适当 位置具有所有三种设计。
miRNA区和互补区可以在相同或单独的多聚核苷酸上。在它们包舍在相同 的多聚核香酸上或之中的情况下，将认为miRNA分子为单个多聚核苷酸。在不 同区域在不同的多聚核苷酸上的实施方案中，将认为合成miRNA由两个多聚核 香酸组成。
当RNA分子为单个多聚核苷酸时，在miRNA区和互补区之间可以有连4妄 子区。在一些实施方案中，作为miRNA区和互补区之间键合的结果，单个多聚 核香酸能够形成发夹环结构。连接子组成发夹环。可考虑在一些实施方案中， 连接子区的长度是、至少是或至多是2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39或40个残基，或其中派生的任意范 围的残基。在某些实施方案中，连接子的长度在3和30个(含)残基之间。
除了具有miRNA或抑制剂区和互补区以外，在该区域的5，或3'端处还可以 有侧翼序列。在一些实施方案中，在这些区域的一侧或两侧的侧翼有或至少有1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10个核苷酸或更多个核苷酸，或其中派生的任意范 围的核苦酸。
本发明的方法包括减少或消除细胞中 一种或多种miRNA的活性，该方法包 括将miRNA抑制剂（本文中通常可描述为miRNA，这样在适当的地方，miRNA 的描述也将指miRNA抑制剂）导入进细胞中；或在细胞中提供或增强一种或多种miRNA的活性。本发明也涉及通过为细胞提供特定的核酸，诸如特定的合成 miRNA分子或合成miRNA抑制剂分子来诱导某种细胞特性。然而，在本发明 的方法中，miRNA分子或miRNA抑制剂没有必要是合成的。它们可以具有与 天然miRNA相同的序列，或它们可以不具有任何设计修饰作用。在某些实施方 案中，如上所述，miRNA分子和/或miRNA抑制剂是合成的。
提供给细胞的特定核酸分子被理解为对应于细胞中的特定miRNA，并且由 此，细胞中的miRNA被称为"对应的miRNA"。在指定的miRNA分子被导入 进细胞的情况下，对应的miRNA将被理解为被诱导的或^皮抑制的miRNA或被 诱导的或抑制的miRNA功能。然而，可考虑被导入进细胞中的miRNA分子不 是成熟miRNA，而是能够在适当的生理条件下变成成熟miRNA或发挥成熟 miRNA的功能。在特定的对应的miRNA被miRNA抑制剂抑制的情况下，特定 的miRNA将被称为"靶miRNA"。可考虑可涉及多个对应的miRNA。 在特定 的实施方案中，多于一个的miRNA分子被导入进细胞中。此外，在其他实施方 案中，多于一个的miRNA分子被导入进细胞中。此外，（多个)miRNA分子和(多 个)miRNA抑制剂的组合可被导入进细胞中。本发明人考虑到miRNA的组合可 作用于具有异常表型的细胞的细胞通路中的一个或多个点，并且此类组合对于 靶细J包具有I交高的功效而不负面地影响正常细胞。由此，miRNA的组合可对受 试者或患者具有最小的不良反应，同时提供充分的治疗效应，诸如改善病情、 细胞的生长抑制、靶细胞的死亡、改变细胞表型或生理学、延緩细胞生长、提 高对第二治疗的敏感性、提高对特定治疗的敏感性、等等。
本发明的方法包括鉴定需要诱导那些细胞特性的细胞或患者。还要理解的 是，提供给细胞或生物体的一定量的合成核酸是"有效量"，其是指达到所需目 标，诸如诱导特定的(多种)细胞特性所需的用量(或足够的量)。
在本发明的方法的某些实施方案中，包括向细胞提供或导入能有效达到所 需生理学结果的量的对应于细胞中成熟miRNA的核酸分子。
此外，本发明的方法可涉及提供合成或非合成的miRNA分子。可考虑在这 些实施方案中，该方法可以或可不被限制于提供仅一种或多种合成miRNA分子 或仅一种或多种非合成的miRNA分子。由此，在某些实施方案中，本发明的方 法可涉及提供合成的和非合成的miRNA分子两者。在这种情况下，最可能向细 胞或多个细胞提供对应于特定miRNA的合成miRNA分子以及对应于不同 miRNA的非合成miRNA分子。此外，使用 一系列miRNA用马库什语言阐述的任何方法可不^f吏用马库什语言来阐述，可代替以可分离项（即，或)描述，反之亦然。
在一些实施方案中，有减少或抑制细胞增殖的方法，该方法包括向细胞导
入或提供有效量的(i) miRNA抑制剂分子或(ii)对应于miRNA序列的合成或非 合成的miRNA分子。在某些实施方案中，本发明的方法涉及向细胞中导入有效 量的(i)具有与一种或多种成熟miRNA的5，至3'序列至少90%互补的5，至3，序 列的miRNA抑制剂分子。
本发明的某些实施方案包括治疗病理状况，尤其是癌症，例如肺癌或肝癌 的方法。在一个方面，本发明的方法包括将靶细胞与一种或多种核酸、合成 miRNA或包括具有所有或部分miRNA序列的至少一个核酸片段的miRNA接 触。该片段可以是5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 30或更多个（包括其间的所有整数)核苷酸或核苷酸类 似物。本发明的一个方面包括在靶细胞，诸如癌细胞内调控基因表达、miRNA 表达或功能或mRNA表达或功能。
一般来说，内源性基因、miRNA或mRNA在细胞内被调控。在特定的实施 方案中，核酸序列包括至少 一个核酸序列与 一种或多种miRNA或基因序列至少 70、 75、 80、 85、 90、 95、或100%相同的片段。内源性基因、miRNA或mRNA 的表达或加工的调控可通过调控mRNA的加工来进行，此类加工包括细胞内的 转录、转运和/或翻译。调控作用也通过对细胞、组织或器官的miRNA活性的 抑制或增强实现。此类加工可影响mRNA的编码产物的表达或稳定性。仍然在 其他的实施方案中，核酸序列可包括修饰的核酸序列。在某些方面， 一种或多 种miRNA序列可包括或包含修饰的核碱基或核酸序列。
要理解的是在本发明的方法中，通过给予细胞或生物体以一旦进入细胞内 就以对应的miRNA发挥作用的核酸分子，可向细胞或其他生物物质诸如生物体 (包括患者)提供对应于特定miRNA的miRNA或miRNA分子。提供给细胞的分 子的形式可以不是一旦进入细胞内就作为miRNA发挥作用的形式。由此，可考 虑在一些实施方案中，提供合成的miRNA或非合成的miRNA，诸如一旦进入 至细胞的miRNA加工机器中就被加工称为成熟和活性miRNA的合成的miRNA 或非合成的miRNA。在某些实施方案中，具体来说可考虑提供给生物物质的 miRNA分子不是成熟miRNA分子，而是一旦进入至miRNA加工机器中就可被 加工为成熟miRNA的核酸分子。就miRNA而言术语"非合成的"的意思是，如本文所定义的那样，miRNA不是"合成的"。此外，可考虑在涉及合成miRNA 的应用的本发明的实施方案中，相应的非合成的miRNA的应用也一皮认为是本发 明的一个方面，并且反之亦然。将要理解的是术语"提供" 一种药剂用来包含 将药剂"给予"患者。
在某些实施方案中，本发明的方法也包括靶向miRNA以在细胞或生物体中 进行调控。术语"靶向miRNA以进行调控，，的意思是将采用本发明的核酸以便 调控所选择的miRNA。在一些实施方案中，使用对应于靶向的miRNA的合成 或非合成的miRNA来完成调控作用，该调控作用能有效地向细胞或生物体提供 耙向的miRNA (正向调控)。在其他实施方案中，使用miRNA抑制剂来完成调 控作用，该调控作用能有效地在细胞或生物体中抑制靶向的miRNA(负向调控）。
在一些实施方案中，被靶向的要被调控的miRNA是影响疾病、病症或通路 的miRNA。在某些实施方案中，miRNA被華巴向，因为通过靶向的miRNA的负 向调控可提供治疗作用。在其他的实施方案中，miRNA被靶向，因为通过靶向 的miRNA或其靶标的正向调控可提供治疗作用。
在本发明的某些方法中，进一步具有将所选择的miRNA调节物给予需要与
如关于特定的细胞通路或导致细胞活力的类似下降)的细胞、组织、器官或生物 体(总称为"生物物质，，）的步骤。因此，在本发明的一些方法中，具有鉴定需要 可由（多种)miRNA调节物提供的治疗的患者的步骤。可考虑在一些实施方案中 可给予有效量的miRNA调节物。在特定的实施方案中，具有赋予生物物质的治 疗益处，其中"治疗益处"是指与疾病或病症相关的一种或多种状况或症状的 改善或关于疾病的预后、持续时间或状态的改善。可考虑治疗益处包括但不限 于疼痛减轻、发病率下降、症状减轻。例如，关于癌症，可考虑治疗益处可以 是抑制肿瘤生长、预防转移、减少转移灶数目、抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞 死亡、抑制癌细胞附近的血管生成、诱导癌细胞的凋亡、疼痛减轻、减少复发 的危险度、诱导癌细胞的化学或放射敏感性、延长生命、和/或延緩与癌症直接 或间4妻相关的死亡。
此外，可考虑miRNA组合物可作为治疗的一部分结合以传统治疗或预防药 剂提供给患者。而且，可考虑在治疗的上下文中讨论的任何方法可预防性地应 用，尤其是在被鉴定有可能需要该治疗或处于需要治疗的病症或疾病的风险中 的患者中。另外，本发明的方法涉及应用对应于miRNA的 一种或多种核酸和治疗药物。 该核酸可增强药物的作用或功效、减少任何副作用或毒性、改变其生物利用度、 和/或减少用药量或所需的次数。在某些实施方案中，治疗药物是癌症治疗药物。 因此，在一些实施方案中，具有治疗患者癌症的方法，该方法包凌舌给予患者以 癌症治疗药物和有效量的能提高癌症治疗药物的功效或^呆护非癌细胞的至少一 种miRNA分子。癌症治疗也包括具有基于化疗和放疗两种治疗的多种联合治疗。 联合化疗包括但不限于，例如，5-氟尿嘧啶、阿仑单抗、氨柔比星、贝伐单抗、 博来霉素、硼替佐米、白消安、喜树碱、卡培他滨、顺4白(CDDP)、卡铂、西妥 昔单抗、苯丁酸氮芥、顺柏(CDDP)、 EGFR抑制剂（吉非替尼和西妥昔单抗)、 甲基苄肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、COX-2抑制剂（例如，塞来昔布(celecoxib))、 环磷酰胺、阿糖胞苷、异磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮齐、白消安、亚硝基脲、 更生霉素、达沙替尼、柔红霉素、地塞米杠、、多西他塞、多柔比星（阿霉素）、EGFR 抑制剂（吉非替尼和西妥昔单抗)、埃罗替尼、雌激素受体结合剂、博来霉素、 plicomycm、丝裂霉素、依托泊甙(VP16)、依维莫司、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌 激素受体结合剂、紫杉酚、多烯紫杉醇、吉西他滨、_诺维本、法呢基蛋白转移 酶抑制剂、吉非替尼、吉西他滨、吉妥单抗、替伊莫单4元、异磷酰胺、甲磺酸 伊马替尼、larotaxel、拉帕替尼、洛那法尼、氮芥、美法仑、反式铂、5-氟尿嘧 啶、长春新碱、长春碱和曱氨蝶呤、丝裂霉素、诺维本、亚硝基脲、诺考达唑、 奥沙利铂、紫杉醇、plicomycin、曱基苄肼、雷洛昔芬、利妥西单抗、西罗莫司、 索拉非尼、舒尼替尼、他莫昔芬、紫杉酚、多烯紫杉醇、西罗莫司脂化物、替 p比法尼、托西莫单抗、反式铂、曲妥珠单抗、长春碱、长春新;威或长春瑞滨或 前述药物的任意类似物或衍生变体。
一般来说，可给予miRNA的抑制剂以降低内源性miRNA的活性。例如， 可向细胞提供能增加细胞增殖的miRNA分子抑制剂以增加增殖或可向细胞提供 此类分子的抑制剂以减少细胞增殖。对于使用本文所7〉开的不同miRNA分子和 miRNA抑制剂所观察到的不同生理学效应，本发明考虑了这些实施方案。这些 实施方案包括但不限于下面的生理学效应：增加或减少细胞增殖、增加或减少 凋亡、增加转化、增加或减少细胞活力、活化或抑制激酶(例如，Erk)ERK、活 化/诱导或抑制hTert、抑制促生长通路的刺激(例如，Stat3信号传导）、减少或增 加活细胞数量、以及增加或减少在细胞周期的特定时期的细胞数量。通常考虑 本发明的方法要包括提供或导入对应于一种或多种不同的miRNA分子的一种或多种不同的核酸分子。可考虑可提供或导入下列的、至少下列的或至多下列的
数量的不同的核酸或miRNA分子： 1、 2、 3、 4、 5 、6、 7、 8、 9、 10 .11 、12
13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、
30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、
47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、
64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、
81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、
98、 99、 100或其中派生的任意范围。这也应用于可被提供或导入进细胞中的不 同miRNA分子的lt量。 II.药物制剂和递送
本发明的方法包括有效量的miRNA或编码其的表达载体的递送。药物制剂 的"有效量"通常被定义为足以可检测地和重复地达到所宣称的所需结果的量， 例如改善、减少或最小化或限制疾病或其症状的程度。可应用其他更严格的定 义，包括消除、根除或治愈疾病。
A.给药
在某些实施方案中，需要杀死细胞、抑制细胞生长、抑制转移、减少肿瘤 或组织大小、和/或逆转或减少细胞恶性或疾病表型。4艮自然地，给药途径将随 着要革巴向的病灶或部位的位置和特性而变化，并且包括，例如，皮内给药和制 剂、皮下给药和制剂、区域给药和制剂、胃肠外给药和制剂、静脉内给药和制 剂、肌内给药和制剂、鼻内给药和制剂、全身给药和制剂和口服给药和制剂。 对于散在、实体、易达到的肿瘤或其他易达到的靶区域，特别地考虑直接注射、 肿瘤内注射或注射入肿瘤血管中。也可以适合进行局部、区域或全身给药。对 于〉4 cm的胂瘤，要给药的体积将为大约4-10 ml (优选10 ml),而对于<4 cm的 肿瘤，将使用大约1-3 ml (优选3 ml)的体积。
作为单一剂量递送的多次注射包括大约0.1-大约0.5 ml体积。本发明的组合 物可向肿瘤或靶向部位多次注射给药。在某些方面，注射可以隔开大约lcm的 间隔。
在外科手术的情况下，本发明可在手术前使用以使不能手术的肿瘤受试者 能接受切除术。可选的是，本发明可在手术时、和/或之后使用以治疗残留病灶 或转移性疾病。例如，被切除的肿瘤床可用包括miRNA或其组合的制剂注射或 灌注。例如，可通过留置在手术部位植入的导管而在切除术后继续给药。也考虑手术后周期性治疗。也考虑连续灌注表达载体或病毒载体。
当适当时也可应用连续给药，例如，在肿瘤或其他不需要的受累区域被切 除时，并且治疗肺瘤床或靶向部位以消除残留的微小疾病。考虑经注射器或导
管的递送。在初始治疗之后，这种连续灌注可持续大约1-2小时、大约2-6小时、 大约6-12小时、大约12-24小时、大约1-2天、大约1-2周或更长的时段。通常， 经连续灌注的治疗组合物的剂量将等同于单次或多次注射所给予的剂量，在进 行灌注的时间段期间进行调整。
治疗方案也可以改变，并且经常取决于肿瘤类型、肿瘤位置、免疫状况、 輩巴部位、疾病进展以及患者的健康状况和年龄。某些肿瘤类型将需要更强力的 治疗。临床医生最适合于根据治疗制剂的已知功效和毒性(如果有的话)来作出这 种决定。
在某些实施方案中，被治疗的肿瘤或受累区域可以是，至少最初是不可切 除的。由于边缘处的收缩或通过消除某些特别的侵袭性部分，使用本发明的组 合物的治疗可增加肿瘤的可切除性。在治疗后，有可能实施切除术。切除术之 后的其他治疗可用来消除肺瘤或把向部位处的微小残留疾病。
治疗可包括各种"单位剂量"。单位剂量被定义为含有预定量的(多种)治疗 组合物。要被给药的量、以及特定途径和制剂是临床领域技术人员所公知的。 单位剂量不需要作为单次注射来进行给药，而是可包括在一定时间段内的连续 输注。关于本发明的病毒组分，单位剂量可适当地以pg或mg miRNA或miRNA 模拟物的方式来描述。可选的是，指定的量可以是作为每天的平均剂量、每周 的平均剂量或每月的平均剂量来给药的量。
miRNA可以大约或至少大约0.5、 1、 5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、
45、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、
190、 200、 210、 220、 230、 240、 250、 260、 270、 280、 290、 300、 310、 320、
330、 340、 350、 360、 370、 380、 390、 400、 410、 420、 430、 440、 450、 460、
470、 480、 490、 500、 510、 520、 530、 540、 550、 560、 570、 580、 590、 600、
610、 620、 630、 640、 650、 660、 670、 680、 690、 700、 710、 720、 730、 740、
750、 760、 770、 780、 7卯、 糊、 810、 820、 830、 840、 850、 860、 870、 880、
890、 900、 910、 920、 930、 940、 950、 960、 970、 980、 990、 瓶 1昭或 mg、
或其中派生的任意范围的剂量或更多的剂量给予患者。 可选的是， 指定的量可 以是作为每天的平均剂量、每周的平均剂量或每月的平均剂量来给药的量，或可以mg/kg的形式来表述，其中kg是指患者的重量，并且mg如上所指定。在 其他的实施方案中，指定的量是上面所讨论的任意数目，但表述为mg/m"关于 肺瘤大小或患者表面积）。 B.可注射组合物和制剂
在一些实施方案中，用于递送miRNA或编码其的表达载体或其组合的方法 是经全身给药的方法。然而，本文所公开的药物组合物也可经胃肠外、皮下、 直接、气管内、静脉内、皮内、肌内或甚至腹膜内给药，如美国专利第5,543,158 号；第5,641,515号和第5,399,363号中所述(每篇专利均具体地全部引入本文作 为参考)。
核酸的注射液可通过注射器或用于注射溶液的任何其他方法来递送，只要 核酸和任何相关的组分可通过注射所需的特定规格的针。注射系统也已被说明 用于基因治疗中，其允许在任何深度精确地多次注射预定量的溶液(美国专利第 5,846,225号）。
活性化合物作为游离碱或药理学可接受的盐类的溶液可在水中适当地与表 面活性剂诸如轻丙纤维素混合而制备。分散液也可在甘油、液体聚乙二醇、其 混合物以及油中进行制备。在普通的储存和应用条件下，这些制剂含有防腐剂 以防止微生物生长。适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液以及用 于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末(美国专利第5,466,468号，具体地 全部引入本文作为参考)。在所有情况下，剂型必须是无菌的，并且必须是达到 易于注射的程度的流体。在制造和储存的条件下，其必须是稳定的，并且必须 被防腐以避免微生物诸如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如，水、 乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等等)、其适当的混合物、 和/或植物油的溶剂或分散介质。例如，可通过使用包衣，诸如卯磷脂，在分散 液的情况下通过保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动 性。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟苯曱酸酯、氯丁醇、苯酚、山 梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如， 糖类或氯化钠。可通过在组合物中使用延緩吸收的药剂，例如，单硬脂酸铝和 明胶，来延长可注射组合物的吸收。
在某些制剂中，采用水基制剂，而在其他制剂中，其可以是脂基的。在本 发明的特定实施方案中，包括肿瘤抑制蛋白或其编码核酸的组合物是在水基制 剂中。在其^L的实施方案中，该制剂是脂质的。对水溶液的胃肠外给药，例如，如果需要溶液应当适当被緩沖，并且首先 使用足量的盐水或葡萄糖使液体稀释剂成为等渗的。这些特定的水溶液特别适 合用于静脉内、肌内、皮下、肿瘤内、病灶内和腹膜内给药。关于这一点，根 据本公开书，可采用的无菌水性介质是本领域专业技术人员所公知的。例如，
一个剂量可溶解在l ml等渗NaCl溶液中，并且加入至1000 ml皮下输液液体 中或在计划的输注部位注射，(参见，例如，"Remington's Pharmaceutical Sciences"第15版，第1035-1038页和第1570-1580页）。剂量的一些变化必然 地取决于被治疗的受试者的状况。无论如何，负责用药的人都要对单个受试者 确定合适的剂量。而且，对于人类的给药，制剂应当满足如FDA生物制品部所 要求的无菌性、致热原性、 一般安全性、以及纯度标准。
如本文所使用的，"载体"包括任意的和所有的溶剂、分散介质、运载体、 包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延緩剂、緩冲剂、载体溶液、 混悬剂、胶体等。这些介质和药剂在药物活性物质中的应用在本领域中是公知 的。除了任何常规介质或药剂与活性成分不相容以外，考虑其在治疗组合物中 的应用。也可将辅助活性成分掺入至组合物中。
短语"药学可接受的"是指当给予人体时不产生过敏反应或类似的不良反 应的分子实体和组合物。
(多种)核酸以与剂型相容的方式给药，并且其用量在治疗上是有效的。要给 药的量取决于要治疗的受试者，包括，例如，疾病或癌症的侵袭性、任何(多个) 肺瘤或病变的大小、先前的或其他的疗程。需要给药的活性成分的精确用量取 决于医生的判断。用于初始给药和后续给药的适宜方案也是可变的，但其代表 是初始给药后紧跟着其他的给药。作为单一剂量这种给药可以是全身给药，在 横跨IO、 20、 30、 40、 50、 60分钟，和/或1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24或更多小时，和/ 或1、 2、 3、 4、 5、 6、 7天或更长的时间段内连续给药。而且，给药可以通过 定时释放或緩释机制，由制剂和/或给药模式来实现。
C.联合治疗
在某些实施方案中，本发明的组合物和方法涉及miRNA或编码其的表达载 体。这些miRNA组合物可与第二治疗联合使用以增强miRNA治疗的效果，或 提高被采用的另 一治疗的疗效。这些组合物将以能有效达到预期效应的组合量 来提供，上述预期效应诸如杀死癌细胞和/或抑制细胞增殖。此过程可涉及将细胞与miRNA或第二治疗同时或在不同的时间接触。这可以通过将细胞与一种或 多种包括一种或多种药剂的组合物或药物制剂接触，或通过将细胞与两种或多 种不同的组合物或制剂接触来完成，其中一种组合物提供：（l)miRNA;和/或(2) 第二治疗。可给予的第二组合物或方法包括化学治疗、放射治疗、外科治疗、 免疫治疗或基因治疗。
可考虑可在相互之间大约12-24 h内，且更优选在相互之间大约6-12 h内为 患者提供miRNA治疗和第二治疗。然而，在一些情况下，可能需要显著地延长 治疗的时间期限，其中在分别给药之间经过几天(2、 3、 4、 5、 6或7)至几周（1、
2、 3、 4、 5、 6、 7或8)。
在某些实施方案中，疗程将持续1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、
30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、
47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54, 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、
64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、
81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90天或更长的时间。可考虑一种药剂
可在第1 、2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1K 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、
19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、
36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、
53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、
70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、
87、 88、 89、 和/或90天、 其任意组合时给予，并且另一药剂在第1、 2、 3、 4、
5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、
41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、
58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、
75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、和/或90天、
或其任意组合时给予。在一天(24小时时段)内，可给予患者一次或多次(多种)药 剂的给药。而且，在一段疗程之后，可考虑在哪一段时间不给予治疗。此时间 段可以持续l、 2、 3、 4、 5、 6、 7天，和/或l、 2、 3、 4、 5周，和/或l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12月或更长时间，取决于患者的状况，诸如其预 后、力量、健康状况等等。可采用各种组合，例如miRNA治疗为"A"，且第二治疗为"B": A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
本发明的任意化合物对患者的给药或治疗将遵循这些化合物给药的一般方 案，如果有的话，考虑载体或任何蛋白或其他药剂的毒性。因此，在一些实施 方案中，具有监测由联合治疗产生的毒性的步骤。期望如需要将重复治疗周期。 也可考虑各种标准治疗以及外科手术可与所述的治疗联合应用。
在具体的方面，如本文所述，可考虑采用第二治疗，诸如化学治疗、放射 治疗、免疫治疗、外科治疗或其他基因治疗与本文所述的miRNA治疗相结合。
l.化学治疗
根据本发明可使用很多种化学治疗药物。术语"化学治疗"是指使用药物 治疗癌症。'M匕学药物"用来表示在治疗癌症中^^药的化合物或组合物。这些药 剂或药物通过其在细胞内的活性^t式来分类，例如，它们是否影响细胞周期以 及它们影响细胞周期的哪个阶段。可选的是，可基于药剂直接交联DNA、嵌入 DNA中、或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力，来对药剂 进行定性。大多数化学药物分为下列的几类：烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤抗 生素、有丝分裂抑制剂和亚硝基脲。
a. 烷化剂
烷化剂是直接与基因组DNA相互作用以防止癌细胞增殖的药物。此类化学 药物代表了影响细胞周期的所有阶段的药剂，即，它们是非阶段特异性的。烷 化剂可被用来治疗慢性白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、 以及乳腺、肺和卵巢的特定癌症。它们包括：白消安、苯丁酸氮齐、顺铂、环 磷酰胺(环磷氮芥)、达卡巴溱、异磷酰胺、氮芥(mustargen)和美法仑。曲格列酮 可被用来与这些烷化剂的任意一种或多种联合治疗癌症。
b. 抗代谢药物
抗代谢药物破坏DNA和RNA合成。不象烷化剂，它们特定地在S期期间 影响细胞周期。除了乳腺、卯巢和胃肠道肿瘤以外，它们已经被用来对抗慢性 白血病。抗代谢药物包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷（Ara-C)、氟达拉滨、吉 西他滨、和甲氨蝶呤。
5-氟尿嘧啶(5-FU)的化学名称为5-氟-2,4(lH，3H)-嘧啶二酮。其作用机制被认为是通过阻断脱氧尿苷酸至胸腺嘧啶脱氧核苷酸的甲基化反应。因此，5-FU 千扰脱氧核糖核酸(DNA)的合成，并且较小程度地抑制核糖核酸(RNA)的形成。 由于DNA和RNA对于细胞分裂和增殖是必要的，因此认为5-FU的作用是产生 胸腺嘧啶核苷缺乏，导致细胞死亡。因此，5-FU的作用见于迅速分裂的细胞中， 迅速分裂是转移性癌症的特征。
c. 抗肺瘤抗生素
抗肿瘤抗生素同时具有抗菌活性和细胞毒活性。这些药物也通过化学性地 抑制酶类和有丝分裂或改变细胞膜来干扰DNA。这些药剂不是阶段特异性的， 因此它们在细胞周期的所有时期中均发挥作用。因此，它们广泛用于多种癌症。 抗肺瘤抗生素的实例包括博来霉素、更生霉素、柔红霉素、多柔比星（阿霉素)、 和伊达比星，它们中的一些在下面更详细地进行讨i仑。这些化合物广泛用于治 疗肺瘤的临床应用中，它们通过静脉推注给药，对阿霉素剂量范围为以21天间 隔的25-75 mg/m2,对依托泊戒剂量为静脉或口服35-100 mg/m2。
d. 有丝分裂抑制剂
有丝分裂抑制剂包括植物生物碱和可抑制细胞分裂或有丝分裂所需的蛋白 质合成的其他天然药剂。它们在细胞周期中的特定时期期间工作。有丝分裂抑
制剂包括多西他塞、依托泊戒(VP16)、紫杉醇、紫杉酚、多烯紫杉醇、长春碱、 长春新碱和长春瑞滨。
e. 亚硝基脲类
亚硝基脲类，类似烷化剂，抑制DNA修复蛋白。除了脑肺瘤以外，它们用 于治疗非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性黑素瘤。实例包括卡氮芥和洛莫 司汀。
2.放射治疗
i丈射治疗也称为放射线治疗，其采用电离放射治疗癌症和其他疾病。电离 放射沉积能量，通过损害细胞的遗传物质，损伤或破坏被治疗的区域中细胞， 使这些细胞不可能继续生长。尽管放射同时损害癌细胞和正常细胞，但后者能 够修复自身并且正常地发挥功能。放射治疗可用来治疗局限性实体肿瘤，诸如 皮肤、舌、喉、脑、乳腺或子宫颈的癌症。其也可用来治疗白血病和淋巴瘤(分 别为造血细胞和淋巴系统的癌症)。
根据本发明使用的放射治疗可包括但不限于应用"线、X-线和/或放射性同 位素至肿瘤细胞的定向递送。也考虑其他形式的DNA损害因子，诸如微波、质子束辐射(美国专利第5,760,395号和第4,870,287号)以及紫外线照射。最可能的 是，所有这些因子对DNA、 DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的组 装和维护产生大范围的损害。X-线的剂量范围从每天50-200伦琴的剂量持续较 长的时间段(3-4周）至2000-6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变 化范围很宽，并且取决于同位素的半衰期、发射的放射线的强度和类型，以及 肿瘤细胞的摄取。放射治疗可包括应用放射标记抗体以直接向癌症部位递送各 种剂量的放射线(放射免疫治疗）。 一旦注射入体内，抗体主动地搜索到癌细胞， 通过放射线的细胞杀伤（细胞毒)作用破坏癌细胞。这种方法可使放射线损害健康 细胞的风险降至最小。
角度的非常准;定向^Y放射治^射线束。仅需要二次放射治疗，需要大约:二 个小时。对于此种治疗，在头部安装一个专门制造的金属框架。然后，执行数 次扫描和x-线以找到需要治疗的准确区域。在脑肿瘤的放射治疗期间，患者躺 着，头置于一个大的头罩中，该头罩中有几百个洞允许放射治疗射线束通过。 相关的方法允许进行定位以治疗机体其他区域中的肿瘤。 3.免疫治疗
就癌症治疗而言，免疫治疗通常依赖于应用免疫效应细胞和分子以靶向和 破坏癌细胞。曲妥珠单抗(Herc印tinTM)是此类的一个实例。免疫效应物可以是， 例如，对胂瘤细胞表面上的一些标志物特异的抗体。抗体可单独地用作治疗的 效应物或其可募集其他细胞来实际地发挥细胞杀伤作用。抗体也可与药物或毒 素(化学药物、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百曰咳毒素等)交联，并 且仅用作靶向药剂。可选的是，效应物可以是携带有与肺瘤细胞靶标直接或间 接作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。 治疗模式的组合，即，直接细胞毒活性和ErbB2的抑制或减少，将在过度表达 ErbB2的癌症的治疗中提供治疗益处。
在免疫治疗的一个方面，肺瘤或疾病细胞必须带有一些易于靶向的标志物， 即，这些标志物不存在于大多数其他细胞上。存在有许多肿瘤标志物，并且就 本发明而言，这些标志物中的任意一个可适合用于靶向。常见的肺瘤标志物包 括癌胚抗原、前列腺特异抗原、泌尿肿瘤相关抗原、胚胎抗原、酪氨酸酶(p97)、 gp68、 TAG-72、 HMFG、唾液酸化路易斯抗原、MucA、 MucB、 PLAP、雌激素 受体、层粘连蛋白受体、erbB和pl55。免疫治疗的一个可选的方面是将抗癌效应与免疫刺激效应相结合。存在的免疫刺激分子也包括：细胞因子诸如IL-2、 IL-4、 IL-12、 GM-CSF、 y-IFN，和趋化因子诸如MIP-1 、 MCP-1、 IL-8，以及生 长因子诸如FLT3配体。已经显示将免疫刺激分子，作为蛋白或使用基因递送与 肿瘤抑制因子诸如MDA-7结合能增强抗肿瘤效应(Ju等人，2000)。而且，针对 这些化合物的任意一个的抗体可用来耙向本文所讨论的抗癌剂。
目前处于研究中或应用中的免疫治疗的实例是免疫佐剂，例如，牛分枝杆 菌、恶性疟原虫、二硝基氯苯和芳香族化合物（美国专利第5,801,005号和第 5,739,169号；Hui和Hashimoto, 1998; Christodoulides等人，1998)，细胞因子治 疗，例如千扰素a、 p和y; IL-1 、 GM-CSF和TNF (Bukowski等人，1998; Davidson 等人，1998;Hellstrand等人，1998)，基因治疗，例如，TNF、 IL-1、 IL-2、 p53 (Qin 等人，1998; Austin-Ward和Villaseca, 1998;美国专利第5,830,880号和第 5,846,945号）以及单克隆抗体，例如，抗神经节苷脂GM2、抗HER-2、抗pl85; Pietras等人，1998; Hanibuchi等人，1998;美国专利第5,824,311号)。赫赛汀(曲 妥珠单抗)是阻断HER2-neu受体的嵌合(鼠-人)单克隆抗体。其具有抗肿瘤活性， 并且已经被批准用于治疗恶性胂瘤(Dillman, 1999)。几种已知的抗癌免疫治疗剂
尼单抗(Panitumumab)(EGFR)、曲妥珠单抗(erbB2受体）、贝伐单抗（VEGF)、阿 仑单抗（CD52)、吉妥单抗奥唑米星(CD33)、利妥西单抗（CD20)、托西莫单抗 (CD20)、马妥珠单抗(Matuzumab) (EGFR)、替伊莫单抗(CD20)、托西莫单抗 (CD20)、 HuPAM4(MUCl)、 MORAb-009 (间皮素）、G250 (碳酸酐酶1X)、 mAb 8H9(8H9抗原）、M195(CD33)、 Ipilimumab (CTLA4)、 HuLuc63 (CS1)、阿仑单 抗(CD53)、依帕珠单抗(Epratuzumab) (CD22)、 BC8 (CD45)、 HuJ591 (前列腺特 异膜抗原）、hA20(CD20)、来沙木单抗(Lexatumumab) (TRAIL受体-2)、帕妥珠 单抗(HER-2受体）、Mik-(3陽1 (IL-2R)、 RAV12 (RAAG12)、 SGN-30 (CD30)、 AME-133v(CD20)、 HeFM (CD30)、 BMS-663513 (CD137)、 Volociximab (抗a5卩l 整合素）、GC1008(TGF卩）、HCD122(CD40)、希普利珠单抗(Siplizumab) (CD2)、 MORAb-003 (叶酸受体（x)、 CNTO 328 (IL-6)、 MDX-060 (CD30)、 Ofatumumab (CD20)、或SGN-33 (CD33)。可考虑这些治疗中的一种或多种与本文所述的 miRNA治疗可一起采用。
有许多不同的方法用于癌症的被动免疫治疗。它们可被宽泛地分为以下几 类：单独注射抗体；注射与毒素或化学治疗药物偶联的抗体；注射与放射性同位素偶联的抗体；注射抗独特型抗体；以及最后地，在除去骨髓中的肿瘤细胞。 4.基因治疗
还在另一个实施方案中，联合治疗涉及基因治疗，其中在给予一种或多种 治疗性miRNA之前、之后或同时给予治疗性多聚核苷酸。治疗性多肽或编码核 酸结合miRNA的递送可对靶组织具有综合的治疗效应。多种蛋白质包涵在本发 明内，其中一些在下面说明。可与本发明结合的被靶向用于一些形式的基因治 疗的各种基因包括但不限于细胞增殖的诱导物、程序性细胞死亡的调节剂、细 胞因子和其他治疗核酸或编码治疗蛋白的核酸。
肿瘤抑制癌基因的作用是抑制过度的细胞增殖。这些基因的失活破坏了其 抑制活性，导致无节制的增殖。可采用肺瘤抑制因子(例如，治疗多肽）p53、FHIT、 p16和C-CAM。
除了p53以外，另一个细胞增殖抑制剂是p16。真核细胞细胞周期的主要转 换过程是由细胞周期蛋白依赖性激酶或CDK来触发的。 一种CDK，细胞周期 蛋白依赖性激酶4 (CDK4)调节Gl的进程。该酶的活性可能是在Gl晚期磷酸化 Rb。 CDK4的活性由活化亚单位、D-型细胞周期蛋白和抑制性亚单位，pl6INK4 控制，后者已经被生化表征为特异地结合并抑制CDK4并且由此可调节Rb磷酸 化的蛋白（Serrano等人，1993; Serrano等人，1995)。由于pl6INK4蛋白是CDK4 抑制剂（Serrano, 1993),因此该基因的缺失可增加CDK4的活性，导致Rb蛋白 的过磷酸化。已知pl6也调节CDK6的功能。
pl61NK4属于一种刚^皮提到的CDK抑制蛋白类型，该类蛋白也包括pl6B、 p19、 p21WAFl和p27KIPl。 pl6INK4基因定位在9p21 ，在许多月中瘤类型中该 染色体区常常被缺失。pl6INK4基因的纯合子缺失和突变在人肿瘤细胞系中很 常见。该证据表明pl6INK4基因是肿瘤抑制基因。然而，这种解释已经受到了 挑战，因为观察到在原代未培养的肿瘤中，pl6INK4基因改变的频率比培养的 细胞系低得多（Caldas等人，1994; Cheng等人，1994; Hussussian等人，1994; Kamb等人，1994; Mori等人，1994; Okamoto等人，1994; Nobori等人，1995; Orlow等人，1994; Arap等人，1995)。通过使用质粒表达载体转染恢复野生型 pl6INK4功能能减少一些人癌细胞系的集落形成(Okamoto, 1994;Arap， 1995)。
根据本发明可采用的其他基因包括Rb、 APC、 DCC、 NF-1、 NF-2、 WT-1、 MEN-I、 MEN-II、 zacl、 p73、 VHL、 MMAC1/PTEN、 DBCCR-1、 FCC、 rsk-3、 p27、 p27/pl6融合体、p21/p27融合体、抗凝血基因（例如，COX-l、 TFPI)、 PGS、Dp、 E2F、 ras、 myc、 neu、 raf、 erb、 fms、 trk、 ret、 gsp、 hst、 abl、 E1A、 p300、 参与血管生成的基因（例如，VEGF、 FGF、血小板反应素、BAI-1、 GDAIF、或 其他受体)和MCC。
5. 外科手术
大约60%的癌症患者将经历一些类型的外科手术，包括预防、诊断性或分 期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术是可与其他治疗诸如本发明的治疗、化 学治疗、放射治疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或各种替代治疗结合使 用的癌症治疗。
治愈性手术包括切除术，其中所有或部分癌组织被物理性去除、切除和/或 破坏。肿瘤切除术是指物理去除至少部分肿瘤。处理肿瘤切除术以外，外科手 术治疗包括激光外科手术、冷冻外科手术、电外科手术和显微镜下控制性外科 手术(莫式外科手术(Mohs， surgery))。进一步考虑的是，本发明可与浅表癌、癌 前病变或附带量的正常组织的去除结合使用。
在切除全部癌细胞、组织或肿瘤的一部分时，在机体中可形成腔。可使用 其^f也的抗癌治疗通过灌注、直4妄注射或区i或的局部用药来完成治疗。可重复此 类治疗，例如，每l、 2、 3、 4、 5、 6、或7天，或每l、 2、 3、 4、和5周或每 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、或12月一次。这些治疗也可以使用不 同的用药量。
6. 其他药剂
可考虑其他药剂可与本发明联合使用以提高治疗的疗效。这些其他药剂包 括免疫调节剂、影响细胞表面受体的上调和缝隙连接的药剂、细胞生长抑制剂 和分化剂、细胞粘附抑制剂、增加增殖细胞对细胞凋亡诱导剂的敏感性的药剂 或其他生物制剂。免疫调节剂包括肿瘤坏死因子；干扰素a、 P和y; IL-2和其 他细胞因子；F42K和其他细胞因子类似物；或MIP-1 、MIP-1(3、MCP-1 、 RANTES 和其他趋化因子。进一步可考虑细胞表面受体或其配体诸如Fas/Fas配体、DR4 或DR5 / TRAIL (Apo-2配体)的上调将通过对增殖细胞建立自分泌或旁分泌效应 而增强本发明的凋亡诱导能力。通过增加缝隙连接的数目增加细胞间信号传导 将增加对邻近过度增殖细胞群的抗过度增殖效应。在其他实施方案中，细胞生 长抑制剂或分化剂可与本发明联合使用以提高治疗的抗过度增殖功效。细胞粘 附抑制剂被认为能提高本发明的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶 (FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑能增加过度增殖细胞对凋亡的^t感性的其他药剂，诸如抗体c225将与本发明联合使用以提高疗效。
Apo2配体(Apo2L，也称为TRAIL)是肺瘤坏死因子(TNF)细胞因子家族的成 员。TRAIL在许多类型的癌细胞中激活快速凋亡，然而对正常细胞没有毒性。 TRAIL mRNA出现在许多组织中。大多数正常细胞似乎对TRAIL的细胞毒作用 有耐受性，表明存在有可对抗TRAIL的凋亡诱导作用的机制。第一个被阐明的 TRAIL的受体称为死亡受体4 (DR4),其含有胞浆"死亡结构域"；DR4传递由 TRAIL携带的凋亡信号。已经鉴定了与TRAIL结合的其他受体。 一种受体，称 为DR5，非常类似DR4，其含有胞浆死亡结构域，并且传导凋亡的信号。DR4 和DR5 mRNA在许多正常组织和肿瘤细胞系中表达。近年来，已经鉴定了诱杀 受体诸如DcRl和DcR2，该受体防止TRAIL通过DR4和DR5诱导凋亡。由此 这些诱杀受体代表了直接在细胞表面处调节对促凋亡细胞因子的敏感性的新机 制。这些抑制性受体在正常细胞的优先表达表明TRAIL可用作抗癌剂，其诱导 癌细胞凋亡而保护正常细胞(Marsters等人，1999)。
在引入细胞毒化学治疗药物后在癌症治疗方面已经有许多进展。然而，化 学治疗的一个后果是发生/获得耐药表型以及发生多重耐药性。耐药性的发生仍 然是治疗此类肿瘤的主要障碍，并且因此，很显然有替代方法诸如基因治疗的需求。
用于与化学治疗、；改射治疗或生物治疗相结合的另一种治疗形式包括热疗 法，其是将患者的组织暴露于高温的操作(直至106°F)。外部或内部加热装置可 用于局部、区域或全身热疗法的应用中。局部热疗法涉及将热量应用于小区域， 诸如肿瘤。可从体外的装置采用高频波从外部生成热量来靶向肿瘤。内部热量 可涉及无菌探头，包括细的加热丝或充满温水的中空管、植入的微波天线或射 频电极。
对于区域治疗，加热患者的器官或肢体，其使用能产生高能量的装置诸如 磁体来完成。可选的是， 一些患者的血液在灌注至将被内部加热的区域之前可 被取出并加热。在癌症已在机体内扩散的情况下也可实施全身加热。为此目的， 可使用温水趁、热蜡、感应线圈和高温室。
激素治疗也可用来与本发明结合或与以前所述的任意的其他癌症治疗相组 合。在某些癌症诸如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或子宫颈癌的治疗中可采用激 素，以降低某些激素诸如睾酮或雌激素的水平或阻断其作用。这种治疗经常与此申请将以于2005年2月8日提交的美国临时申请系列号第60/650,807号 为优先权的2006年2月8日提交的美国申请系列号第11/349,727号的内容全部 引入本文作为参考。
III. MIRNA分子
微小分子("miRNA")的长度通常为21-22个核苷酸，尽管已报道有长度为19 以及直至23个核芬酸的miRNA分子。每个miRNA都是从较长的前体RNA分 子（"前体miRNA")加工而来的。前体miRNA从非蛋白编码基因转录而来。前 体miRNA具有两个互补区，它们能形成茎-环或折回样结构，在动物中其^皮称 为切酶的核糖核酸酶III样核酸酶切割。加工的miRNA —般是茎的部分。
加工的miRNA(也称为"成熟miRNA")变成大复合体的一部分以下调特定 的耙基因或其基因产物。动物miRNA的实例包括那些与耙标的碱基对不完全配 对的miRNA，其能中止翻译(01sen等人，1999; Seggerson等人，2002)。 siRNA 分子也被切酶加工，〗旦是从长的双链RNA分子上加工而来。siRNA不是在动物 细胞中天然发现的，但它们可通过RNA诱导沉默复合体(RISC)来指导mRNA靶 标的序列特异性切割(Denli等人，2003)。
A.阵列制备
本发明的某些实施方法涉及mRNA或核酸阵列、miRNA或核酸阵列、和/ 或miRNA或核酸探针阵列的制备和应用，这些阵列是与多个核酸、mRNA或 miRNA分子、前体miRNA分子或来源于由miR-126 miRNA调控的多种基因和
;且被i位在空间J分开的支持物或支持;i^料上^的核5酸分子(探针)^巨阵列
(macroarray)或微阵列。巨阵列一般是其上已点有探针的硝酸纤维素或尼龙片。 微阵列将核酸:深针更致密地定位使得直至10,000个核酸分子可被安装在一般为 l-4平方厘米的区域中。微阵列的制造可通过将核酸分子，例如，基因、寡核苷 酸等点在基质上或将寡核苷酸序列原位制造在基质上。被点上或制造的核酸分 子可以高密度矩阵模式来应用，该高密度矩阵模式为每平方厘米直至大约30个 不相同的核酸分子，或更多，例如，直至每平方厘米大约100或甚至1000个。 与硝酸纤维素基材料的滤膜阵列相比，微阵列一般使用涂层玻璃作为固体支持 物。采用具有标志物RNA和/或miRNA互补核酸样品的有序阵列，每个样品的 位置可被跟踪并且与原始样品相关联。
许多不同的阵列装置是本领域专业技术人员所公知的，这些装置中多种不同的核酸探针稳定地与固体支持物的表面相締合。用于阵列的基质包括尼龙、 玻璃、金属、塑料、乳胶和硅。这些阵列可以许多不同的方面发生变化，包括 平均探针长度、探针的序列或类型、探针和阵列表面之间的键的特性，例如， 共价键或非共价键，等等。本发明的标记和筛选方法以及阵列就任何参数而言
在其实用性方面不受限制，除了探针检测miRNA、或基因或代表基因的核酸以 外；因此，各方法和组合物可用于多种不同类型的核酸阵列。
制备微阵列的代表性的方法和仪器已有说明，例如，见美国专利第5,143,854; 第5,202,231号；第5,242,974号；第5，288,644号；第5,324，633号；第5,384,261 号；第5,405,783号；第5,412,087号；第5,424，186号；第5,429，807号；第 5,432,049号；第5,436,327号；第5,445,934号；第5,468,613号；第5,470,710号; 第5,472,672号；第5,492,806号；第5,525,464号；第5,503,980号；第5,510,270 号；第5,525,464号；第5,527,681号；第5,529,756号；第5,532，128号；第 5,545,531号；第5,547,839号；第5,554,501号；第5,556,752号；第5,561,071号; 第5,571,639号；第5,580,726号；第5,580,732号；第5,593,839号；第5,599,695 号；第5,599,672号；第5,610;287号；第5,624,711号；第5,631,134号；第 5,639,603号；第5,654,413号；第5,658,734号；第5,661,028号；第5,665,547号； 第5,667,972号；第5,695,940号；第5,700,637号；第5,744,305号；第5,800,992 号；第5,807,522号；第5,830,645号；第5,837,196号；第5,871,928号；第 5,847,219号；笫5,876,932号；第5,919,626号；第6,004,755号；第6,087,102号; 第6,368,799号；第6,383,749号；第6,617,112号；第6,638,717号；第6,720,138 号，以及WO 93/17126; WO 95/11995; WO 95/21265; WO 95/21944; WO 95/35505; WO 96/31622; WO 97/10365; WO 97/27317; WO 99/35505; WO 09923256; WO 09936760; WO0138580; WO 0168255; WO 03020898; WO 03040410; WO 03053586; WO 03087297; WO 03091426; WO03100012; WO 04020085; WO 04027093; EP 373 203; EP 785 280; EP 799 897和UK 8 803 000;这些专利文献 的公开内容所有都引入本文作为参考。
可考虑阵列可以是高密度阵列，使得它们含有2、 20、 25、 50、 80、 100或 更多种不同的探针。可考虑它们可含有1000、 16,000、65,000、250,000或1,000,000 或更多种不同的探针。探针可针对一种或多种不同的生物体或细胞类型中的 mRNA和/或miRNA靶标。在一些实施方案中寡核苷酸探针的长度范围是5-50、 5-45、 10-40、 9-34或15-40个核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸探针的长度为5、 10、 15、 20至20、 25、 30、 35、 40个核香酸，包括其间的所有整数和 范围。
在阵列中每条不同的探针序列的位置和序列通常是已知的。此外，大量的
不同探针可占据相对小的区域，提供具有通常超过大约60、 100、 600、 1000、 5,000、 10,000、 40,000、 100,000或400,000个不同的寡核苷酸探针/cm2的探针 密度的高密度阵列。阵列的表面积可以为大约或小于大约1、 1.6、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 il 10 cm2。
此外，本领域普通技术人员可很容易地分析使用阵列生成的数据。在上面 公开了此类使用方案，并且此类使用方案包括见于下列专利文献中的信息：WO 9743450; WO 03023058; WO 03022421; WO 03029485; WO 03067217; WO 03066906; WO 03076928; WO 03093810; WO 03100448A1,所有这些文献专门地 引入作为参考。
B. 才羊品制备
可考虑使用本发明的阵列、探针索引或阵列技术来分析许多种样品的RNA 和/或miRNA。尽管内源性miRNA考虑用于本发明的组合物和方法，但如本文 所述也可处理和分析重组miRNA-包括与内源性miRNA或前体miRNA互补的 或相同的核酸。样品可以是生物标本，在此情况下，它们可以来自活检标本、 细针抽吸、剥脱物、血液、组织、器官、精液、唾液、泪液、其他体液、毛嚢、 皮肤、或含有或构成生物细胞，尤其是癌细胞或增殖细胞的任何样品。在某些 实施方案中，样品可以是^旦不限于活检标本、或/人活纟企标本或其他体液或组织 中纯化或富集到一定程度的细胞。可选的是，样品可以不是生物标本，而是化 学混合物，诸如无细胞反应混合物(可含有一种或多种生物酶)。
C. 杂交
在制备一个阵列或一组探针和/或标记样品中的核酸或标记探针之后，靶核 酸群与该阵列或探针在杂交条件下接触，其中就被执行的具体测定而言，此类 条件可根据需要调整以提供最佳水平的特异性。适当的杂交条件是本领域专业 技术人员所熟知的，并且其综述见Sambrook等人（2001)和WO 95/21944。在 许多实施方案中具有特别注意的是在杂交期间使用严谨条件。严谨条件对本领 域专业技术人员是公知的。
具体地可考虑单个阵列或一组探针与多个样品接触。样品可用不同的标记 物标记以区分各样品。例如，单个阵列可与用Cy3标记的肺瘤组织标本以及用
66Cy5标记的正常组织标本接触。对于与阵列上的探针对应的特定miRNA，样品 之间的差异可以很容易地确定和定量。
阵列的小表面积允许均一的杂交条件，诸如温度调节和盐含量。此外，由 于高密度阵列占用的面积小，因此可以极小的的液体体积执行杂交(例如，大约 250 pl或更小的体积，包括大约或小于大约5、 10、 25、 50、 60、 70、 80、 90、 100pl的体积，或其中派生的任何范围）。以小的体积，杂交可非常迅速地进行。
D.差异表达分析
本发明的阵列可用来检测两个样品之间的差异。具体考虑的应用包括鉴定 和/或定量正常样品和非正常样品中miRNA或基因表达之间的差异、疾病或病 症和不显示这种疾病或病症的细胞之间的差异、或两种不同处理的样品之间的 差异。也可比较^皮i人为易患特定疾病或病症的样品和^皮i人为不易患或4氐抗该疾 病或病症的样品之间的miRNA或基因表达。非正常的样品是显示疾病或病症的 (多种)表型或基因性状的样品，或是就该疾病或病症而言被认为是非正常的样 品。其可与就该疾病或病症而言是正常的细胞相比较。表型性状包括疾病或病 症的症状或对该疾病或病症的易感性，该疾病或病症的构成因素是或可以是或 可以不是遗传因素，或由（多个)增殖或肿瘤细胞引起。
阵列包括固体支持物，核酸探针附着在支持物上。阵列一般包括多个不同 的核酸探针，探针偶联在基质的表面上不同的已知位置上。这些阵列也被称为 "微阵列"或俗称为"芯片"，它们在本领域中已有广泛的说明，例如，美国专 利第5,143,854号、第5,445,934号、第5,744,305号、第5,677,195号、第6,040,193 号、第5,424,186号和Fodor等人，（1991)，每篇文献都通用地全部引入本文作为 参考。使用机械合成法合成这些阵列的技术描述在，例如，美国专利第5,384,261 号中，该专利通用地全部引入本文作为参考。尽管在某些方面使用平面阵列表 面，但阵列可制造在实际上任意形状的表面或甚至多个表面上。阵列可以是在 珠子、凝胶、聚合表面、纤维诸如光纤、玻璃或任何其他合适的基质上的核酸， 参见美国专利第5,770,358号、第5,789,162号、第5,708,153号、第6,040,193 号和第5,800,992号，这些专利通用地全部引入本文作为参考。阵列可以允许所 有内含装置的诊断或其他操作的方式进行包装，参见，例如，美国专利第 5,856,174号和第5,922,591号，这些专利通用地全部引入本文作为参考。也参见 于2000年4月7日提交的美国专利申请系列号第09/545,207号中涉及阵列、其 制造以及其特性的附加信息，该申请通用地全部引入本文作为参考。
6具体来说，阵列可用来评价样品与病理状况诸如癌症和相关病症。具体考 虑本发明可用来评价疾病的分期或亚型分类之间的差异，诸如良性、癌性和转 移组织或肿瘤之间的差异。
要评价的表型性状包括诸如下列的特性：寿命、发病率、预期生存期、对 特定药物或治疗性处理的易感性或感受性(药物功效)、以及药物毒性的风险。在 这些表型性状中有差异的样品也可使用本发明所述的组合物和方法来评价。
在某些实施方案中，可生成miRNA和/或表达谱以评价这些表达谱并将其 与药代动力学或疗法相关联。例如，可在患者被治疗之前或治疗期间对患者肿 瘤和血液标本生成这些表达谱并评价以确定是否有其表达与患者治疗的后果相 关的miRNA或基因。差异miRNA或基因的鉴定可产生用于评价胂瘤和/或血液 标本的诊断测定，以确定应该给患者提供哪种用药方案。另外，其可用来鉴定 或选择适合特定临床实验的患者。如果表达谱被确定与药物功效或药物毒性相 关，则该表达谱与该患者是否是接受药物、接受药物组合、或接受特定剂量的 药物的合适患者有关。
除了上述预后测定以外，来自患有许多种疾病的患者的标本可被评价以确 定是否基于miRNA和/或相关基因表达水平可鉴定不同的疾病。基于表达谱可 建立诊断测定，医生可使用该测定来鉴定患有疾病的个体或谁处于发生疾病的 危险中。可选的是，可基于miRNA谱可设计治疗方法。此类方法和组合物的实 例描述在于2005年5月23日提交的题目为"涉及miRNA和miRNA抑制剂分 子的方法和纟且合物"的名为David Brown、 Lance Ford、 Angie Cheng禾口 Rich Jarvis 的美国临时专利申请中，该申请全部？ 1入本文作为参考。
E.其他测定
除了阵列和微阵列的应用以外，考虑可采用许多不同的测定来分析miRNA 或相关基因、其活性以及其效应。此类测定包括但不限于核酸扩增、聚合酶链 式反应、定量PCR、 RT-PCR、原位杂交、Northern杂交、杂交保护分析 (HPA)(GenProbe)、分支DNA(bDNA)测定(Chiron)、滚环扩增（RCA)、单分子杂 交检测(US Genomics),侵染测定(ThirdWave Technologies)、和/或桥接测定(Bridge Litigation Assay) (Genaco)。
IV.核酸
本发明涉及用于阵列分析中或在诊断、治疗或预后应用中釆用的核酸、修 饰的或模拟的核酸、miRNA、 mRNA、基因、及其可被标记的代表片段，尤其是与病理状况诸如癌症相关的那些分子。这些分子可以已经由细胞内源性地产 生，或已经被化学或重组合成或产生。它们可以是分离的和/或纯化的。本文所
述的各miRNA包括相应的SEQ ID NO以及这些miRNA序列的登录号。miRNA 的名称经常缩写并且被提到时没有"hsa-"前缀，并且根据上下文，其将照此理 解。除非另外指明，在本申请中提到的miRNA是被鉴定为miR-X或let-X的人 序列，其中X是数字和/或字母。
在某些方面，可使用注以后缀"5P"或"3P，，的miRNA探针。"5P"表示 成熟miRNA来自前体的5，端，并且相应的"3P"表示其来自前体的3，端，如全 球信息网的sanger.ac.uk上所述。此外，在一些实施方案中，使用的miRNA探 针不对应于已知的人miRNA。考虑这些非人miRNA探针可用于本发明的实施 方案中，或可存在有与非人miRNA同源的人miRNA。在其他实施方案中，可 采用任意的哺乳动物细胞、生物标本或其制剂。
在本发明的一些实施方案中，涉及miRNA的各方法和组合物可涉及 miRNA、标志物(例如，mRNA)、和/或其他核酸。核酸的长度可以是、至少是、
或至多是3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18, > 19、
20、 21、 22、 23 、24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、
37、 38、 39、 40 、41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、
54、 55、 56、 57 、58、 59、 60、 61、 62、 63. 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、
71、 72、 73、 74 、75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、
88、 89、 90、 91 、92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 101、 102、 103、
104、 105、 106、 107、 108、 109 、110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、
190、 200、 210、 220、 230、 240 、250、 260、 270、 280、 290、 300、 310、 320、
330、 340、 350、 360、 370、 380 、390、 400、 410、 420、 430、 440、 450、 460、
470、 480、 490、 500、 510、 520 、530、 540、 550、 560、 570、 580、 590、 600、
610、 620、 630、 640、 650、 660 、670、 680、 690、 700、 710、 720、 730、 740、
750、 760、 770、 780、 790、 訓 、810、 820、 830、 840、 850、 860、 870、 880、
890、 900、 910、 920、 930、 940, ,950、 960、 970、 980、 990或1000个核苷酸， 或其间派生的任意范围。这些长度覆盖了加工miRNA、 miRNA探针、前体 miRNA、含miRNA载体、mRNA、 mRNA探针、对照核酸和其他探针和引物的 长度。
在许多实施方案中，miRNA的长度为19-24个核苷酸，而miRNA纟果针的长度为19-35个核苷酸，取决于加工miRNA和添加的任意侧翼区的长度。在人体 中，miRNA前体的长度通常在62和110个核苷酸之间。
本发明的核酸具有与另 一核酸相同或互补的区域。考虑互补或相同的区域 可以是至少5个相邻残基，尽管具体地考虑该区域是、至少是、或至多是6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、
26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34 、35 、36、 37、 38、 39、 40 、41、 42、
43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51 、52 、53、 54、 55、 56、 57 、58、 59、
60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68 、69 、70、 7〗、 72、 73、 74 、75、 76、
77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85 、86 、87、 88、 89、 90、 91 、92、 93、
94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、
190、 200、 210、 220、 230、 240 、250、 260、 270、 280 、290、 300、 310、 320、
330、 340、 350、 360、 370、 380 、390、 400、 410、 420 、430、 440、 441、 450、
460、 470、 480、 490、 500、 510 、520、 530、 540、 550 、560、 570、 580、 590、
600、 610、 620、 630、 640、 650 、660、 670、 680、 690 、700、 710、 720、 730、
740、 750、 760、 770、 780、 790 、■、 810、 820、 830 、840、 850、 860、 870、
880、 890、 900、 910、 920、 930. .940、 950、 960、 970、 980、 990或1000个相 邻核苷酸。进一步要理解的是前体miRNA或其他核酸内或miRNA探针和 miRNA或miRNA基因之间的互补长度是这些长度。此外，互补性可以百分比 表示，其含义是在探针的长度上，探针与其靶标之间的互补性为90%或更高。 在一些实施方案中，互补性为或至少为90%、 95%或100%。具体来说，这些长 度可应用于包括本文所述的SEQ ID NO、登录号的任一个中鉴定的核酸序列、 或本文所公开的任何其他序列的任意核酸。 一般来说，给出了 miRNA和加工 miRNA序列的通用名（前缀为其鉴定来源，例如，对于人序列是"hsa")。除非 另外指明，没有前缀的miRNA将被理解为是指人miRNA。此外，miRNA名称 中的小写字母可以是或不是小写的；例如，1isa-mir-130b也可称为miR-130B。 术语"miRNA探针"是指可鉴定特定miRNA或结构上相关的miRNA的核酸探 针。
要理解的是一些核酸来源于基因组序列或基因。就此而言，为了简单起见， 对于指定miRNA或基因，术语"基因"用于指编码前体核酸或miRNA的基因 组序列。然而，本发明的实施方案可涉及参与其表达的miRNA的基因组序列， 诸如启动子或其他调控序列。
70可使用术语"重组"，并且其通常是指已经在体外被操作的分子或该分子的 复制或表达产物。
术语"核酸"在本领域中是公知的。本文所使用的"核酸"通常将指包括
核碱基的DNA、 RNA或其衍生物或类似物的分子(一条或多条链)。核碱基包括， 例如，见于DNA(例如，腺嘌呤"A"、鸟嘌呤"G"、胸腺嘧啶"T"或胞嘧啶"C") 或RNA(例如，A、 G、尿嘧啶"U"或C)中的天然噪呤或嘧咬碱基。术语"核 酸，，包含术语"寡核苷酸，，和"多聚核苷酸"，它们各自是术语"核酸"的亚属。
术语"miRNA"通常是指单链分子，但在特定的实施方案中，本发明中提 供的分子也将包含与同一单链分子的另一区域或与另一核酸部分地(横跨链的长 度，互补性在10和50%之间）、基本上(横跨链的长度，互补性大于50%但小于 100%)、或完全地互补的区域或另一链。因此，miRNA核酸分子可包含包括特 定序列的一条或多条互补或自补链或"互补序列"的分子。例如，前体miRNA 可具有自补区，其达到100%互补性。本发明的miRNA探针或核酸可包括、可 以具有或可以至少具有与其耙标60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 96、 97、 98、 99或100%的互补性。
要理解的是本发明的"合成核酸"是指核酸不具有天然核酸的所有或部分 化学结构或序列。因此，要理解的是术语"合成miRNA"是指在细胞中或在生 理条件下发挥天然miRNA的功能的"合成核酸"。
尽管本发明的实施方案可涉及合成miRNA或合成核酸，但在本发明的一些 实施方案中，（多个)核酸分子不需要是"合成的"。在某些实施方案中，在本发 明的方法和组合物中采用的非合成核酸或miRNA可以具有天然mRNA或 miRNA前体或成熟mRNA或miRNA的全部序列和结构。例如，在本发明的方 法和组合物中使用的非合成miRNA可以不具有一个或多个修饰的核苷酸或核芬 酸类似物。在这些实施方案中，非合成miRNA可以是或不是重组产生的。在特 定的实施方案中，本发明的方法和/或组合物中的核酸具体地是合成miRNA,不 是非合成miRNA(即，不是符合"合成的"的条件的miRNA);尽管在其他的实 施方案中，本发明具体地涉及非合成miRNA，不是合成miRNA。关于使用合成 miRNA讨论的任何实施方案可应用于非合成miRNA ，并且反之亦然。
要理解的是术语"天然的"是指存在于生物体中的人没有进行任何干预的 一些物质；其可指天然的野生型或突变分子。在一些实施方案中，合成miRNA 分子没有天然miRNA分子的序列。在其他实施方案中，合成miRNA分子具有天然miRNA分子的序列，而该分子的化学结构，尤其是在具体地与精确序列不 相关的部分中（非序列化学结构），与具有该序列的天然miRNA的化学结构不同。 在一些情况下，合成miRNA同时具有序列化学结构和在天然miRNA中不存在 的非序列化学结构。此外，合成分子的序列将识别哪种miRNA被有效提供或抑 制；内源性miRNA将被称为"对应的miRNA"。可在本发明的上下文中使用的 对应的miRNA序列包括但不限于本文所提供的SEQ ID中的那些序列的所有或 部分序列，以及任意的其他miRNA序列、miRNA前体序列或与其互补的任意 序列。在一些实施方案中，序列是或来源于或含有本文所鉴定的一条序列的所 有或部分序列以靶向该序列使用的特定miRNA(或一组miRNA)。可选择任意的 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、卯、100、 110、 120、 130 140、 150、 160、 170、 180、 190、 200、 210、 220、 230、 240、 250、 260条或其间任意数目或范围的序列以 排除所有未选择的序列。
如本文所使用的"杂交作用"、"杂交，，或"能够杂交"被理解为形成双链 或三链分子或具有部分双链或三链特性的分子。如本文所使用的术语"退火" 与"杂交"同义。术语"杂交作用"、"杂交"或"能够杂交"包含术语"严谨 条件"或"高度严谨度"以及术语"低严谨度"或"低严谨条件"。
如本文使用的"严谨条件，，或"高严谨度"是允许含有(多条)互补序列的一
件允许核酸和靶链之间有少量错配(如果有的话)。此类条件对于本领域普通技术 人员是公知的，并且优选用于需要高度选择性的应用。非限制性的应用包括分 离核酸，诸如基因或其核酸片段，或检测至少一种特异的mRNA转录物或其核 酸片段，等等。
严谨条件可包括低盐和/或高温条件，诸如由大约0.02 M-大约0.5 M NaCl 在大约42。C-大约70。C的温度下所提供的条件。要理解的是所期望的严谨度的 温度和离子强度部分地通过下列因素来确定：特定(多个)核酸的长度、（多条)靶 序列的长度和核碱基含量、（多个)核酸的电荷成分以及在杂交混合物中曱酰胺、 四甲基氯化铵或其他溶剂的存在或浓度。
也要理解的是，这些用于杂交的范围、组合物和条件仅通过非限制性的实 施例来说明，并且对于特定的杂交反应所期望的严谨度经常经验性地通过与一 个或多个阳性或阴性对照比较来确定。根据预期的应用，优选釆用多种杂交条件以达到核酸对耙序列的不同程度的选择性。在非限制性的实施例中，通过在 低温和/或高离子强度下杂交可完成对在严谨条件下不与核酸杂交的相关靶核酸 的鉴定或分离。此类条件称为"低严谨度"或"低严谨条件"，并且低严谨度的
非限制性实施例包括在大约0.15 M-大约0.9 M NaCl在大约20。C-大约50°C的 温度范围下执行的杂交。当然，进一步变更低或高严谨条件以适应具体的应用 是本领域专业技术人员力所能及的。
A.核威基、核苦、核苷酸和修饰的核苷酸
如本文所使用的"核碱基"是指杂环碱基，诸如，例如在至少一种天然核 酸(即，DNA和RNA)中存在的天然核碱基(即，A、 T、 G、 C或U)，以及此类 核碱基的天然或非天然衍生物和类似物。核碱基通常以可能取代天然产生的核 碱基配对的方式与至少一个天然产生的核碱基形成一个或一个以上氢键（"退 火"或"杂交"）（例如A与T、 G与C和A与U之间的氢键合）。
"嘌呤"和/或"嘧啶"核碱基包含天然的嘌呤和/或嘧啶核碱基，还有其衍 生物和类似物，包括但不限于，被一个或多个烷基、羧基烷基、氨基、羟基、 卣素（即，氟、氯、溴或碘)、硫醇或烷基硫醇部分取代的嘌呤或嘧啶。优选的烷 基(例如，烷基、羧基烷基等)部分由大约1、大约2、大约3、大约4、大约5至 大约6个碳原子组成。噪呤或嘧啶的其他非限制性实例包括脱氮嘌呤、2,6-二氨 基噤呤、5-氟尿嘧啶、黄噤呤、次黄嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、溴代胸腺 嘧啶、8-氨基鸟噤呤、8-羟基鸟嘌呤、8-甲基鸟噪呤、8-;克代鸟嘌呤、氮杂鸟嘌 呤、2-氨基嘌呤、5-乙基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、 5-碘尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、硫尿嘧啶、2-曱基腺噪呤、曱硫基腺 噪呤、N,N-二曱基腺噤呤、氮杂腺。票呤、8-溴腺噪呤、8-轻基腺噤呤、6-羟基氨 基噤呤、6-巯基噤呤、4-(6-氨基己基/胞嘧啶)等。其他实例是本领域专业技术人 员所熟知的。
如本文所使用的，"核苷"是指包括与核碱基连接子部分共价连接的核碱基 的单个化学单位。"核碱基连接子部分"的非限制性实例是包括5-碳原子的糖(即， "5-碳糖"），包括但不限于，脱氧核糖、核糖、阿拉伯糖、或5-碳糖的衍生物 或类似物。5-碳糖的衍生物或类似物的非限制性实例包括2'-氟-2'-脱氧核糖或其 中碳取代糖环中的氧原子的碳环糖。核碱基与核碱基连接子部分的不同类型的 共价结合在本领域中是公知的(Komberg和Baker, 1992)。
如本文所使用的"核苦酸"是指进一步包括"主链部分"的核苷。主链部分通常共价地连接核苷与包括核苷酸的另一分子、或另一核苷酸以形成核酸。 天然核苷酸中的"主链部分"通常包括磷部分，该部分与5-碳糖共价连接。主
链部分的连接通常发生在5-碳糖的3'-或5'-位上。然而，其他类型的连接在本领 域中是已知的，尤其当核苷酸包括天然5-碳糖或磷部分的衍生物或类似物时。
核酸可包括，或完全由核碱基的衍生物或类似物、核碱基连接子部分和/或 可存在于天然核酸中的主链部分组成。具有核酸类似物的RNA也可根据本发明 的方法标记。如本文所使用的"衍生物"是指天然分子的化学修饰或变化形式， 而术语'4莫拟物"或"类似物"是指在结构上可类似或不类似天然分子或部分， 而具有类似功能的分子。如本文所使用的，"部分"通常是指较大化学或分子结
构的较小化学或分子组分。核碱基、核苷和核苷酸类似物或衍生物在本领域中 是公知的，并且已有说明（参见，例如，Scheit, 1980,引入本文作为参考）。
核普、核苷酸或核酸的其他非限制性实例包括下列专利中的那些：美国专 利第5,681,947号、第5,652,099号和第5,763,167号、第5,614,617号、第5,670,663 号、第5,872,232号、第5,859,221号、第5,446,137号、第5,886,165号、第5,714,606 号、第5,672,697号、第5,466,786号、第5,792,847号、第5，223,618号、第5,470,967 号、第5,378,825号、第5,777,092号、第5,623,070号、第5，610,289号、第5,602，240 号、第5,858,988号、第5,214,136号、第5,700,922号、第5,708,154号、第5,728,525 号、第5,637,683号、第6,251,666号、第5,480,980号和第5,728,525号，每篇 专利都全部？ 1入本文作为参考。
本发明的标记方法和试剂盒具体地考虑被修饰用于连接标记并且可被合并 入miRNA分子中的核苷酸的应用。此类核苷酸包括可用染料（包括荧光染料)或 分子诸如生物素标记的那些。标记的核苷酸很容易获得；它们可从商业渠道获 得，或它们可通过本领域专业技术人员所知晓的反应来合成。
用于本发明中的修饰核苷酸不是天然核苷酸，反而是指其上具有反应性部 分的制备的核苷酸。感兴趣的具体反应官能团包括：氨基、巯基、亚砜氧基 (sulfoxyl)、氨基巯基、叠氮基、环氧化物、异硫氰酸酯、异氰酸酯、酐、 一氯 三溱、二氯三溱、 一或二卣素耳又代的吡咬、 一或二取代的二溱、马来酰亚胺、 环氧化物、氮丙啶、磺酰卣、酰基卣、烷基卣、芳基卣、烷基磺酸盐、N-羟基 琥珀酰亚胺酯、亚胺酯、肼、叠氮基硝基苯基、叠氮化物、3-(2-吡啶二硫基)-丙酰胺、乙二醛、醛、碘乙酰基、氰甲酯、对硝基苯酯、邻硝基苯酯、羟基吡 啶酯、羰基咪唑和其他此类化学基团。在一些实施方案中，反应官能团可直接与核苷酸键合，或其可通过连接基团与核苷酸键合。官能部分和任意的连接子
基本上不能损害核苷酸被添加到miRNA上或被标记的能力。代表性的连接基团 包括含碳连接基团，典型的范围为大约2-18,通常为大约2-8个碳原子，其中含 碳基团可以包括或不包括一个或多个杂原子，例如，S、 O、 N等，并且可以包 括或不包括一个或多个不饱和位点。在许多实施方案中特别感兴趣的是烷基连 接基团，典型的为1-16,通常为l-4个碳原子的低碳烷基连接基团，其中连接基 团可包括一个或多个不饱和位点。在上述生成官能化靶标的方法中使用的官能 化核苷酸(或引物)可使用已知的实验方案制造或从销售供应商，例如，Sigma、 Roche、 Ambion、 Biosearch Technologies和NEN购买。官能团可根据本领域专 业技术人员所知晓的方法来制备，包括美国专利第4,404,289号；第4,405,711 号；第4,337,063号和第5，268,486号和英国专利第1,529,202号中所述的代表性 信息，这些专利都引入作为参考。
胺修饰的核苷酸用于本发明的数个实施方案中。胺修饰的核苷酸是具有反 应性胺基团以连接标记的核苷酸。考虑任意的核糖核苷酸(G、 A、 U或C)或脱 氧核糖核苷酸(G、 A、 T或C)可被修饰用于标记。实例包括但不限于下列修饰的 核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸：5-(3-氨基烯丙基)-UTP; 8-[(4-氨基)丁基]-氨基 -ATP和8-[(6-氨基)丁基]-氨基-ATP; N6-(4-M)丁基-ATP, N6-(6-氨基)丁基-ATP, N4-[2,2-氧-二-(乙胺)]-CTP; N6曙(6-氨基）己基-ATP; 8-[(6-氨基）己基]-氨基-ATP; 5-炔丙基氨基-CTP、 5-炔丙基氨基-UTP; 5-(3-氨基烯丙基)-dUTP; 8-[(4-氨基)丁基]-氨基-dATP和8-[(6-氨基)丁基]-氨基-dATP; N6-(4-氨基)丁基-dATP, N6-(6-氨基) 丁基-dATP、 N4-[2,2-氧-二-(乙胺)]-dCTP; N6-(6-氨基）己基-dATP; 8-[(6-氨基）己 基]-氨基-dATP; 5-炔丙基氨基-dCTP和5-炔丙基氨基-dUTP。这些核苷酸可根据 本领域专业技术人员所知晓的方法来制备。此外，本领域普通技术人员能够制 备具有相同的胺修饰的其他核苷酸实体，诸如5-(3-氨基烯丙基)-CTP、GTP、ATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP或dUTP代替5-(3-氨基烯丙基)-UTP。
B.核酸的制备
核酸可通过本领域普通技术人员所知晓的任意技术来制备，诸如，例如， 化学合成、酶法生产或生物生产。具体考虑的是，本发明的miRNA探针被化学 合成。
在本发明的一些实施方案中，从生物标本中回收或分离miRNA。 miRNA可 以是重组的或其可以是细胞天然的或内源性的(从细胞的基因组产生）。考虑生物标本可以一定的方式处理以提高小RNA分子诸如miRNA的回收。美国专利申 请系列号第10/667,126号说明了此类方法，并且该申请具体地引入本文作为参 考。 一般来说，方法涉及用具有胍盐和去垢剂的溶液溶解细胞。
可选的是，根据标准方法执行核酸合成。参见，例如，Itakura和Riggs(1980) 以及美国专利第4,704,362号、第5,221,619号和第5,583,013号，每一篇文献都 引入本文作为参考。合成核酸(例如，合成寡核苷酸)的非限制性实例包括通过体 外化学合成使用磷酸三酯、亚磷酸酯或亚磷酰胺化学和固相技术（诸如EP 266,032中所述，该专利引入本文作为参考），或经如Froehler等人，1986和美国 专利第5,705,629号(每篇文献均引入本文作为参考)所述的脱氧核糖核苷氢磷酸 酯中间体制备的核酸。寡核苷酸合成的各种不同的机制已公开在：例如，美国 专利第4,659,774号、第4,816,571号、第5,141,813号、第5,264,566号、第4,959,463 号、第5,428,148号、第5,554，744号、第5,574,146号、第5,602,244号，每篇 专利都引入本文作为参考。
酶法产生的核酸的非限制性实例包括由在诸如PCRTM(参见，例如，美国专
利第4,683,202号和第4,682,195号，每篇专利均引入本文作为参考)的扩增反应 中通过酶或通过在美国专利第5,645,897号(该专利引入本文作为参考）中所述的 寡核苷酸合成所产生的核酸。也参见Sambrook等人，2001，该文引入本文作为参考。
寡核苦酸合成对于本领域专业技术人员是熟知的。寡核香酸合成的各种不 同的机制已公开在：例如，美国专利第4,659,774号、第4,816,571号、第5,141,813 号、第5,264,566号、第4,959,463号、第5,428,148号、第5,554,744号、第5,574,146 号、第5,602,244号，每篇专利都引入本文作为参考。
用于在细胞中产生核酸的重组方法对于本领域专业技术人员是熟知的。这 些方法包括使用载体(病毒和非病毒载体）、质粒、粘粒和用于向细胞递送核酸的 其他运载体，细胞可以是耙细胞(例如，癌细胞)或仅是宿主细胞(以产生大量的 期望的RNA分子）。可选的是，就无细胞系统而言，可使用此类运载体，只要 存在用于生成RNA分子的试剂。此类方法包括在Sambrook, 2003, Sambrook, 2001和Sambrook, 1989中所述的那些方法，上述方法引入本文作为参考。
C.核酸的分离
核酸可使用本领域专业技术人员所熟知的技术来分离，尽管在具体的实施 方案中，可釆用用于分离小核酸分子、和/或分离RNA分子的方法。色语法是经常用来从蛋白或从其他核酸中分开或分离核酸的方法。此类方法可涉及釆用凝 胶基质的电泳、滤柱、醇沉淀、和/或其他色谱法。如果要使用或评价来自细胞
的miRNA,方法通常涉及在实施用于分离特定群RNA的方法之前用离液剂（例 如，异硫氰酸胍)和/或去垢剂（例如，N-月桂酰肌氨S吏)溶解细胞。
在从其他核酸分离miRNA的特定方法中，使用聚丙烯酰胺制备凝胶基质， 但是也可使用琼脂糖。可通过浓度对凝胶进行分级或它们可以是均一的。可使 用板或管材来保持用于电泳的凝胶基质。通常应用一维电泳来分离核酸。使用 板来制备板凝胶，而管材(典型地为玻璃或橡胶)可用来制备管胶。短语"管电泳" 是指使用管或管材代替板来形成凝胶。用来实施管电泳的材料可很容易地由本 领域技术人员制备或购自，诸如C.B.S. Scientific Co., Inc.或Scie-Plas。
方法可涉及使用有机溶剂和/或醇来分离核酸，尤其是在本发明的方法和组 合物中使用的miRNA。 一些实施方案描述在美国专利申请系列号第10/667,126 号中，该申请引入本文作为参考。大体上，本公开书提供了用于有效地从细胞 中分离小RNA的方法，该方法包括：将醇溶液加入至细胞裂解产物中，并将醇 /裂解产物混合物施用于固体支持物上，然后从固体支持物上洗脱RNA分子。在 一些实施方案中，加入至细胞裂解产物中的醇量达到大约55%-60%的醇浓度。 尽管可使用不同的醇类，但乙醇的作用良好。固体支持物可以是任何结构，并 且它包括珠、滤器和柱，其可包括带有负电基团的矿物或聚合物支持物。对于 此类分离步骤，玻璃纤维滤器或柱运转特别良好。
在具体的实施方案中，miRNA分离方法包括：a)用包括胍盐的裂解溶液裂 解标本中的细胞，其中产生具有至少大约1M胍盐的浓度的裂解产物；b)用包 括苯酚的提取溶液从裂解产物中提取miRNA分子；c)向裂解产物中加入醇溶 液以形成裂解产物/醇混合物，其中混合物中醇的浓度为大约35%-大约70%之 间；d)将裂解产物/醇混合物施用于固体支持物上；e)使用离子溶液从固体支持 物洗脱miRNA分子；以及f)俘获miRNA分子。典型地，标本被千燥并以适于 随后操作的液体和体积重新悬浮。
V.才示i己和才示i己4支术
在一些实施方案中，本发明涉及被标记的miRNA。考虑miRNA可在标记 之前首先被分离和/或纯化。与其中miRNA在标记之前没有被分离或纯化的标 本中的其他RNA相反，这样完成的反应可更有效地标记miRNA。在本发明的 许多实施方案中，标记是非放射性的。 一般来说，可通过加入标记的核苷酸(一步法)或加入核普酸并标记加入的核苷酸(两步法)来标记核酸。
A, 标记^L术
在一些实施方案中，通过向核酸催化性地加入已经标记的核香酸或多个核
苷酸来标记核酸。 一种或多种标记的核苷酸可加入至miRNA分子中。参见美国 专利第6,723,509号，该专利引入本文作为参考。
在其他实施方案中，未标记的核苷酸或多个核苷酸被催化性地加入至
miRNA中，并且使用使其随后^i皮标记的化学部分修饰未标记的核苷酸。在本发 明的实施方案中，化学部分是活性胺，使得该核苷酸是胺修饰的核苷酸。胺修 饰的核苷酸的实例是本领域专业技术人员所熟知的，许多是市售的，诸如来自 Ambion、 Sigma、 Jena Bioscience和TriLink。
与cDNA在其合成期间的标记相比，标记miRNA的问题是如何标记已存在 的分子。本发明涉及应用能够使用二或三磷酸核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸底 物以将其加入至miRNA中的酶。此外，在具体的实施方案中，其涉及使用修饰 的二或三磷酸核糖核香酸，其被加入至miRNA的3，端。能够添加此核苷酸的酶 包括但不限于聚(A)聚合酶、末端转移酶和多聚核普酸磷酸化酶。在本发明的具 体实施方案中，考虑连接酶不是用来加入标记的酶，并且取而代之，采用非连 接酶的酶。末端转移酶催化核香酸添加至核酸的3'末端。多聚核香酸磷酸化酶 可聚合核苦酸二磷酸盐，而不需要引物。
B. 标记
包括荧光)、发光的、酶的或正电子放射的（包括放射性的）。标记可直接或间接 检测。放射性标记包括1251、 32P、 "P和"S。酶标记的实例包括碱性磷酸酶、荧 光素酶、辣根过氧化物酶和P-半乳糖苷酶。标记也可以是具有发光特性的蛋白 质，例如绿色荧光蛋白和藻红蛋白。
考虑用作结合物的比色和荧光标记包括但不限于Alexa Fluor染料、BODIPY 染料，诸如BODIPYFL; Cascade Blue; Cascade Yellow;香豆素及其衍生物， 诸如7-氨基-4-甲基香豆素、氨基香豆素和羟基香豆素；花菁染料，诸如Cy3和 Cy5;曙红和赤藓红；荧光素及其衍生物，诸如异硫氰酸荧光素；镧系离子的大 环螯合物，诸如Quantum Dye™; Marina Blue; Oregon Green;罗丹明染料，诸 如罗丹明红、四曱基罗丹明和罗丹明6G;得克萨斯红(TexasRed);荧光能量转 移染料，诸如噻唑橙-乙啶异二聚体；以及TOTAB。
78染料的具体实例包括但不限于，上面鉴定的那些和下列的染料：Alexa Fluor 350、 Alexa Fluor 405 、 Alexa Fluor 430、 Alexa Fluor 488、 Alexa Fluor 500. Alexa Fluor 514、 Alexa Fluor 532、 Alexa Fluor 546、 Alexa Fluor 555、 Alexa Fluor 568、 Alexa Fluor 594 、 Alexa Fluor 610、 Alexa Fluor 633 、 Alexa Fluor 647 、 Alexa Fluor 660、 Alexa Fluor 680、 Alexa Fluor 700、和Alexa Fluor 750;胺活性BODIPY染 料，诸如BODIPY 493/503、 BODIPY 530/550、 BODIPY 558/568、 BODIPY 564/570、 BODIPY 576/589、 BODIPY 581/591、 BODIPY 630/650、 BODIPY 650/655、 BODIPY FL、 BODIPY R6G、 BODIPY TMR、和BODIPY陽TR; Cy3 、 Cy5、 6-FAM、异碌b氰酸荧光素、HEX、 6-JOE、 Oregon Green 488 、 Oregon Green 500、 Oregon Green 514、 Pacific Blue、 REG、罗丹明绿、罗丹明红、肾造影剂 (Renographin) 、 ROX 、 SYPRO 、 TAMRA 、 2',4',5',7'-四溴砜荧光素 (Tetrabromosulfonefluorescein)、 和TET。
荧光标记的核糖核苷酸的具体实例购自Molecular Probes,并且这些实例包 括Alexa Fluor 488-5-UTP、荧光素-12-UTP、 BODIPY FL画14-UTP、 BODIPY TMR-14-UTP、四甲基罗丹明-6-UTP、 Alexa Fluor 546-14-UTP、 Texas Red-5-UTP、 和BODIPY TR-14-UTP。其他荧光核糖核苷酸购自Amersham Biosciences,诸如 Cy3-UTP和Cy5-UTP。
荧光标记的脱氧核糖核芬酸的实例包括二硝基苯基(DNP)-11 -dUTP 、 Cascade Blue-7-dUTP、 Alexa Fluor 488-5-dUTP、荧光素-12-dUTP、 Oregon Green 488-5-dUTP、 BODIPY FL-14-dUTP、罗丹明绿-5-dUTP、 Alexa Fluor 532-5-dUTP、 BODIPY T證-14誦dUTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、 Alexa Fluor 546-14-dUTP、 Alexa Fluor 568-5-dUTP 、 Texas Red-12-dUTP 、 Texas Red-5-dUTP 、 BODIPY TR画14-dUTP、 Alexa Fluor 594-5-dUTP、 BODIPY 630/650-14-dUTP、 BODIPY 650/665-14-dUTP; Alexa Fluor 488-7-OBEA-dCTP 、 Alexa Fluor 546-16-OBEA-dCTP 、 Alexa Fluor 594-7-OBEA-dCTP 、 Alexa Fluor 647-12-OBEA-dCTP。
考虑可用两种不同的标记物标记核酸。此外，在本发明的方法中可采用荧 光共振能量转移(FRET)(例如，Klostermeier等人，2002; Emptage, 2001; Didenko, 2001,每篇文献都引入作为参考)。
可选的是，标记本身可以不被检测到，但可间接被检测到，或允许分离或 分开被靶向的核酸。例如，标记可为生物素、地高辛、多价阳离子、鳌合基团和其他配体，包括-抗体的配体。
c.可视技术
用于显示或检测标记核酸的许多技术很容易得到。这些技术包括：显微镜 检查、阵列、荧光测定法、Light cycler或其他实时PCR仪器、FACS分析、闪 烁计数仪、磷光影像分析仪(Phosphoimager)、盖氏计数仪(Geiger counter) 、 MRI 、 CAT、基于抗体的检测方法(Western、免疫荧光、免疫组织化学）、组织化学技术、 HPLC (Griffey等人，1997)、光谱法、毛细管凝胶电泳(Cummins等人，1996)、 光谱法；质谱法；放射学技术；以及质量平衡技术。
当采用两种或多种颜色有差别的标记时，可采用荧光共振能量转移(FRET) 技术来表征一种或多种核酸的结合。此外，本领域普通技术人员熟知显示、鉴 定和表征标记核酸的方式，并且因此，此类方案可用作本发明的一部分。可使 用的工具的实例也包括荧光显微镜检查、BioAnalyzer、酶表仪、Storm (Molecular Dynamics),阵列扫描仪、FACS (荧光激活细胞分选器)或具有激发和检测荧光分 子的能力的任意仪器。
VI.试剂盒
本文所述的任意组合物可被包括在试剂盒中。在非限制性的实施例中，用 于使用阵列、核酸扩增、和/或杂交技术分离miRNA、标记miRNA、和/或评价 miRNA群的试剂，以及用于从血样制备样品的试剂可包括在试剂盒中。由此试 剂盒可进一步包括用于生成或合成miRNA探针的试剂。由此，试剂盒将包括， 在合适的容器中的、通过加入标记的核苷酸或随后被标记的未标记的核苷酸来 标记miRNA的酶。在某些方面，试剂盒可包括扩增试剂。在其他方面，试剂盒 可包括各种支持物，诸如玻璃、尼龙、聚合珠等等，和/或用于偶联任何探针和/ 或耙核酸的试剂。也可包括一种或多种緩冲液，诸如反应缓冲液、标记緩冲液、 洗涤緩冲液或杂交緩冲液、用于制备miRNA探针的化合物、和用于分离miRNA 的组分。本发明的其他试剂盒可包括用于制作包括miRNA的核酸阵列的组分， 并且由此，可包括，例如，固体支持物。
具体地考虑用于实施本文所述的本发明的方法的试剂盒。在一些实施方案 中，有用于制备用于多重标记的miRNA的试剂盒和用于制备miRNA探针和/ 或miRNA阵列的试剂盒。在这些实施方案中，试剂盒包括，在合适的容器装置 中，下列的1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12或更多种：（1)聚(A)聚 合酶；（2)未修饰的核苷酸(G、 A、 T、 C、和/或U); (3)修饰的核苷酸(标记的或未标记的)；（4)聚(A)聚合酶緩沖液；和(5)至少一种微滤器；（6)可与核苷酸 连接的标记物；（7)至少一种miRNA探针；（8)反应缓沖液；（9)miRNA阵列或 用于制作此种阵列的组分；（10)乙酸；（11)醇；（12)用于制备、分离、富集和 纯化miRNA或miRNA探针或阵列的溶液。其他试剂包括那些通常用于操作 RNA的试剂，诸如甲酰胺、负载染料、核糖核酸酶抑制剂和DNA酶。
如本申请中所述的，在具体的实施方案中，本发明的试剂盒包括含有miRNA 探针的阵列。阵列可具有与在特定状况下的生物体或特定组织或器官的所有已 知miRNA对应的、或与这些探针的亚组对应的探针。本发明的阵列上的探针的 亚組可以是或包括那些被鉴定与特定的诊断、治疗或预后应用相关的那些探针。 例如，阵列可含有一个或多个探针，该探针指示或提示：（1)疾病或病症(急性 髓性白血病），（2)对特定的药物或治疗的易感性或抗性；（3)对药物或物质的毒 性的易感性；（4)疾病或病症的发展阶段或严重性(预后）；和(5)对疾病或病症 的遗传易感性。
对于任何试剂盒实施方案，包括阵列，可以有含有或可以用于扩增序列的 核酸分子，该序列是本文所迷的任意一个SEQID的全部或部分的变异体、与本 文所述的任意一个SEQ ID的全部或部分相同或互补的序列。在某些实施方案
一个或多个探针。上面讨论的任意一个核酸可以用作试剂盒的 一部分。
试剂盒的各組分可以水介质或冻千形式包装。试剂盒的容器通常包括至少 一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器，组分可置于其中，并且优 选地，被适当地等分包装。在试剂盒中超过一个组分的情况下（标记试剂和标记 物可包装在一起)，试剂盒也通常含有第二个、第三个或其他附加的容器，其中 可单独地放置附加的组分。然而，各组分的不同组合可包括在一个小瓶中。本 发明的试剂盒也典型地包括用于容纳核酸的装置，以及为商业销售而封闭的任 何其他的试剂容器。这些容器可包括其中保留有所需小瓶的注塑或吹塑的塑料 容器。
当试剂盒的各组分以一种和/或多种液体溶液提供时，液体溶液是水溶液， 特别优选是无菌水溶液。
然而，试剂盒的各组分可作为干粉提供。当试剂和/或组分作为千粉提供时， 粉末可通过加入合适的溶剂而被重构。想象溶剂也可在另一容器中提供。在一 些实施方案中，标记染料作为干粉提供。考虑在本发明的试剂盒中提供IO、 20、
8130、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 120、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900、 1000 fig或至少或至多这些 量的干燥染料。染料可重新悬浮在任何合适的溶剂，诸如DMSO中。
此类试剂盒也可包括有助于标记的miRNA的分离的组分。其也可包括保存 或保持miRNA或防止其降解的组分。此类组分可以是无RNA酶的或防RNA酶 的。此类试剂盒通常将包括，以适当方式的用于各单个试剂或溶液的不同容器。
试剂盒也将包括用于使用试剂盒组分以及使用未包括在试剂盒中的任何其 他试剂的说明书。说明书可包括可实现的各种变化形式。
本发明的试剂盒也可包括下列的一种或多种：对照RNA;无核酸酶的水； 无RNA酶的容器，诸如1.5ml管；无RNA酶的洗脱管；PEG或葡聚糖；乙醇； 乙酸；醋酸钠；醋酸铵；胍盐；去垢剂；核酸分子量标志物；无RNA酶管吸头； 和RNA酶或DNA酶抑制剂。
考虑此类试剂是本发明的试剂盒的实施方案。然而，此类试剂盒不限于上 面确定的特定项，并且可包括用于miRNA的操作和表征的任何试剂。
VII.实施例
下面的实施例被包括以证明本发明的优选实施方案。本领域专业技术人员
明时效果良好的技术，并且由此可认为构成用于其实施的优选方式。然而，按 照本公开书，本领域专业技术人员要理解的是，在被公开的具体实施方案中可 作出许多变化，并且这些变化仍然获得类似或相似的结果，并没有背离本发明 的精神和范围。
实施例1:
用HSA-MIR-126转染后基因表达分析
相信miRNA通过结合靶向mRNA转录物，并且(1)启动转录物降解或(2)改 变从转录物的蛋白质翻译来调控基因表达。翻译调节引起蛋白质表达的向上或 向下改变可引起下游基因产物以及依次由这些蛋白调控的基因的活性和表达的 变化。这些众多的调控效应被揭示为总mRNA表达谱的变化。执行微阵列基因 表达分析以鉴定被hsa-miR-126表达误调节的基因。
对于三个时间点的各个时间点，合成前体miR-126 (Ambion)或两个阴性对 照miRNA (前体miR-NCI, Ambion cat. no. AM17110和前体miR-NC2, Ambion,cat. no. AM17111)被逆转染至A549细胞的四份样品中。使用siPORT NeoFX (Ambion)根据生产厂商的建议使用下列的参数转染细胞：6孔板中200,000细胞 /孔，5.0 pi NeoFX， 2.5 ml终浓度为30 nM的miRNA。在转染后4 h、 24 h和72 h收获细胞。使用RNAqueous-4PCR (Ambion)根据生产厂商的推荐方案提取总 RNA。
由Asuragen Services (Austin, TX)根据公司的标准操作步骤执行mRNA阵列 分析。使用MessageAmp™ 11-96 aRNA扩增试剂盒(Ambion, cat #1819), 2貼总 RNA用于輩巴标制备和生物素的标记。使用Agilent Bioanalyzer 2100毛细管电泳 方案来定量cRNA收率。标记的靶标与Affymetrix mRNA阵列（人HG-U133A2.0 阵列)使用生产厂商的推荐方案和下列的参数杂交。在Affymetrix 640型杂交炉 中在45。C下执行杂交16 hr。运行洗涤脚本Midi_euk2v3—450，在Affymetrix FS450流控台上洗涤阵列并染色。在Affymetrix GeneChip Scanner 3000上扫描 阵列。使用Affymetrix Statistical Algorithm MAS 5.0 (GCOS vl.3)对阵列上的每个 基因生成图像信号数据、组平均值、具有显著性标志的p-值、对数比和基因注 释的汇总。数据报告在含有Affymetrix数据和结果文件的文件(压缩)以及含有阵 列的初始图像和已处理的细胞强度的文件(.cel)中。对于观察到的效应，数据通 过两条阴性对照微小RNA序列的平均值进行标准化，然后一起平均以提交。汇 总表达水平比平均阴性对照值变化至少0.7 1og2的基因名单。微阵列基因表达分 析的结果显示在表l中。
控制表1中列举的基因的表达水平是对于癌症和其中hsa-miR-126的表达增 加或减少在疾病中具有一定作用的其他疾病的潜在有用的治疗方法。
实施例2: 受HSA-MIR-126影响的细胞通路
hsa-miR-126引起的基因表达误调节影响许多细胞通路(表1)，这些通路代 表了用于控制癌症和其他疾病和功能障碍的潜在治疗靶标。本发明人确定了由 hsa-miR-126表达诱导的调控级联反应所影响的细胞基因通路的名称和特性。使 用Ingenuity通^各分斗斤(Version 4.0, Ingenuity® Systems, Redwood City, CA)4丸4亍细 胞通路分析。通过Fisher精确检验(Fisher, 1922)确定指定通路的改变。在A549 细胞中hsa-miR-126过度表达后最明显受影响的通路显示在表2中。
这些数据证明hsa-miR-126直接或间接影响大量癌相关、细胞增殖相关、细胞发育相关、细胞信号传导相关和细胞周期相关基因的表达，并且因此主要影 响与癌症、细胞生长、发育和增殖相关的功能性通路。这些细胞过程在多种癌 症的发生和进展中都是不可缺少的。控制表2中所示细胞通路中的基因表达水
平是对于癌症和其中hsa-miR-126的表达增加或减少在疾病中具有一定作用的 其他疾病的潜在有用的治疗方法。
实施例3: HSA画MIR國126的预测基因把标
使用专有算法miRNATarget™ (Asuragen)(其实现Krek等人(2005)提出的方 法)预测结合hsa-miR-126和被hsa-miR-126调控的基因靶标。预测的靶标显示在 表3中。
在用前体miR hsa-miR-126转染后，在人癌细胞中表现mRNA表达水平改 变的预测基因靶标显示在下面的表4中。
其mRNA表达水平受hsa-miR-126影响的hsa-miR-126的预测基因靶标是通 过控制其表达水平治疗癌症以及治疗其他疾病的特别有用的候选物。
实施例4:
被HSA-MIR-126改变的癌相关基因表达
在肺瘤中细胞增殖和生存通路通常被改变(Hanahan和Weinberg, 2000)。本 发明人已经显示hsa-miR-126直接或间接调控在这些通路的调控中关键蛋白质 的转录物。这些靶标中的许多具有固有的致癌或肿瘤抑制活性。对于多种恶性 肿瘤的治疗具有预后和/或治疗价值的Hsa-miR-126靶标显示在表5中。
特别感兴趣的Hsa-miR-126靶标是在响应于有丝分裂或细胞凋亡刺激的细 胞内信号转导的调节中起作用的基因及其产物。当误调节时，这些蛋白中的许 多有助于体内和体外恶性表型的形成。Hsa-miR-126在多种层面上影响细胞内信 号传导，并且控制分泌性蛋白、跨膜生长因子受体以及胞浆信号分子的表达。 分泌性蛋白中有表皮调节素(EREG)和肿瘤坏死因子(TNF)配体超家族成员10 (TNFSF10;也称为TRATL; TNF-相关凋亡诱导配体)。膜关联受体是表皮生长 因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子受体1 (FGFR1)、 Met、视黄酸受体应答 因子1 (RARRES1)和转化生长因子（3 (TGF-P)受体2和3 (TGFBR2， TGFBR3)。 这些蛋白中的每个蛋白在肿瘤发生中均显示很明显的作用。EGFR是v-Erb-B癌蛋白的哺乳动物同源物，其最初从禽成红细胞增多症病 毒中分离（Roussel等人，1979)。 EGFR作为受体酪氨酸激酶发挥作用，该激酶属 于EGFR受体蛋白家族（Hynes和Lane, 2005)。作为同型二聚体或异源二聚体， EGFR传送有丝分裂信号，并活化丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷酸肌醇3-激 酶(PI3K)通路。在多种肺瘤类型中EGFR活性的增加很普遍，并且可由三种主要 机制来完成：（i)在胶质瘤和食管鳞状细胞癌中EGFR被扩增并过度表达；（ii) 在乳腺癌、肺癌和卵巢癌中表达缺少细胞外结构域的EGFR变异体；（iii)在非 小细胞肺癌(NSCLC)中常常发现体细胞EGFR激活突变(Hynes和Lane, 2005; Su叩aweravong等人，2005)。这些癌特异性EGFR突变为两种FDA批准的 NSCLC治疗药物，易瑞沙（吉非替尼)和特罗凯(埃罗替尼)的开发提供了基础 (Siegel-Lakhai等人，2005)。表皮调节素(EREG)属于表皮生长因子(EGF)家族， 并与EGF受体诸如EGFR结合(Shelly等人，1998)。表皮调节素表达在成人组织 中罕见，但在多种癌症类型中是增加的(Toyoda等人，1997)。表皮调节素在肿瘤 发生中也可具有直接的作用，因为它促进结肠癌细胞的肿瘤形成(Baba等人, 2000)。由于hsa-miR-126的转染降低了 EGFR和EREG转录物的水平， hsa-miR-126可能阻碍了癌症中EGFR信号传导的激活。被hsa-miR-126负性调 节的其他受体酪氨酸激酶是Met和FGFR-l，后者在多种癌症类型中通常是过度 表达的，并且似乎具有血管生成活性(Chandler等人，1999)。 Met作为肝细胞生 长因子(HGF)的受体发挥作用，并且从化学转化的人细胞系中作为癌基因被分离 (Cooper等人，1984; Dean等人，198"。在散发性乳头状肾癌、儿童肝细胞癌和 胃癌中发现有Met激活突变(Danilkovitch-Miagkova和Zbar, 2002)。这些体细胞 突变与多种癌中侵袭性增强和广泛转移有关。在数种其他的癌症类型中，自分 泌和旁分泌机制导致Met信号传导的激活。然而，Met活化的最常见机制是在 结肠直肠癌、肝细胞癌、胃泌素瘤以及胃癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌和乳 腺癌中发生的过度表达(Boccaccio和Comoglio, 2006)。 Met的过度表达与转移性 肺瘤表型和预后不良有关(Birchmeier等人，2003)。 Fas，也称为CD95或APO-l， 是一种跨膜细胞表面受体，其在凋亡信号的转导中响应于其配体FasL而发挥作 用（Houston和O'Connell, 2004)。 Fas表达减少是细胞对FasL介导的细胞死亡的 敏感性下降的常见机制。同样，许多不同类型的癌症显示缺失了 Fas的表达或 Fas表达水平降低(表5)。在结肠直肠癌中，在正常上皮向良性肿瘤、腺癌和转 移灶转化的过程中Fas表达进行性地减少(Moller等人，1994)。因此，不管FasL逃避FasL谦导的凋亡信号。在癌细胞中 hsa-miR-126的瞬时转染导致Fas转录物的增加，并且因此可恢复对FasL的敏感 性。同样，hsa-miR-126调控RARRES1、 TGFBR-2和TGFBR-3，它们都是推定 的肿瘤抑制因子。RARRES1是一种跨膜蛋白，其在数种类型的癌症中显示表达 水平缺失或降低(Wu等人，2006a和其中的参考文献)。TGFBR-2与TGFBR-1形 成功能复合体，并且是TGF-卩的主要受体（Massague等人，2000)。 TGF-(3的主 要作用是抑制大量细胞类型的细胞生长，诸如上皮细胞、内皮细胞、造血细胞、 神经细胞和间充质细胞。具有微卫星不稳定性的许多乳腺癌和结肠直肠癌携带 有TGFBR-2的失活突变，并且因此逃避TGF-P的生长抑制功能(Markowitz等 人，1995;Lucke等人，2001)。 TGFBR-3，也称为P-聚糖，其结合所有三种TGF-|3 同种型，并具有4艮高的亲和力。TGFBR-3与TGFBR-2相关耳关以将信号传导至下 游效应器分子(Blobe等人，2001)。类似于TGFBR-2,在多种癌症类型中TGFBR-3 常常下调(表5)。 TRAIL是促凋亡蛋白的另一实例，促凋亡蛋白直接或间接受 hsa-miR-126调控。TRAIL (也称为AP0-2L、 APO-2配体或AP02L)与其相应的 死亡受体相互作用以刺激胱天蛋白酶(caspase)活性和程序性细胞死亡(Fesik, 2005)。鉴于其功能，目前正在研究TRAIL和TRAIL受体激动剂在癌症中的治 疗反应。重组TRAIL在多种癌细胞系中诱导凋亡，并且在结肠癌、神经胶质瘤、 多发性骨髓瘤和肺癌和前列腺癌的代表性小鼠模型中显示抗肿瘤活性(Fesik, 2005和其中的参考文献)。被hsa-miR-126调控的其他分泌性蛋白，可以具有致 癌或生长抑制活性(取决于细胞的具体情况)，包括结締组织生长因子(CTGF)和中 性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)，也称为脂质运载蛋白-2 (LCN2) (Hishikawa等人，1999; Croci等人，2004; Fernandez等人，2005; Lin等人，2005; Yang等人，2005; Lee等人，2006)。
受hsa-miR-126影响的细胞内信号分子包括整合素连接激酶(ILK)、 polo样 激酶l (PLK1),蛋白激酶Ca(PRKCA)和磷脂酶C卩-l (PLCB1)。 PLCB1催化从 磷脂酰肌醇-二磷酸盐(PIP2)生成肌醇-l,4,5-三磷酸盐(IP3)和二酰基甘油(DAG)， 调节增殖信号和细胞周期的检查点(Lo Vasco等人，2004)。 ILK是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，其与结合细胞膜的整合素相联系以调节肌动蛋白聚合和细胞骨架 构造(Hannigan等人，2005)。 ILK的辅因子是桩蛋白，其直接与ILK相互作用并 促进ILK定位至粘着斑，协调细胞伸展。ILK将信号传导至多个通路，并且调 节贴壁不依赖性生长、生存通路、细胞周期进展、侵袭、迁移、细胞运动性和
86肿瘤血管发生。在大量癌症类型中ILK是过度表达的或组成性激活的(Hannigan 等人，2005)。针对桩蛋白的小干扰RNA抑制恶性黑素瘤细胞的侵袭，表明ILK-桩蛋白通路促进体内的胂瘤发生（Hamamura等人，2005)。数据显示将 hsa-miR-126瞬时导入进癌细胞中导致ILK和桩蛋白表达减少，并且因此可千扰 ILK和桩蛋白的功能。PLK1 (也称为丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶13; STPK13)是一种 调节有丝分裂纺锤体功能以维持染色体稳定性的蛋白激酶(Strebhardt和Ullrich, 2006)。在细胞周期期间，PLK1的表达被严密地调节，并且在M期达到峰值。 PLK1是固有的致癌因子，并且直接抑制p53的肿瘤抑制功能(Ando等人，2004)。 PLK1的过度表达诱导NIH3T3细胞的多核表型和细胞转化(Mundt等人，1997; Smith等人，1997)。同样，PLK1显示在大多数实体肿瘤中表达水平增加，包括 乳腺癌、结肠癌、肺癌、胃癌和前列腺癌(表5)。 PLK1的过度表达与疾病进展 有关，并且当被耗竭时，诱导癌细胞凋亡(Liu和Enkson, 2003; Strebhardt和Ullrich: 2006)。目前，PLK1正在被试验作为多种小分子抑制剂的靶标以用于未来的治 疗干预(Strebhardt和Ullrich, 2006)。 PRKCA属于丝氨酸-苏氨酸激酶家族，响应 于由受体酪氨酸激酶诱导的信号传导而活化。功能性研究已经证明PKC在恶性 表型的癌症发生和维持中具有一定作用（Koivunen等人，2006)。 PRKCA在子宫 内膜癌、前列腺癌和高度膀胱癌中过度表达(Koivimen等人，2006)。 PRKCA活 性与癌细胞较高的运动性和侵袭力有关，这是可通过抑制PRKCA而逆转的一种 表型(Koivunen等人，2004)。
其他被hsa-miR-126调控的生长相关基因是细胞周期蛋白Dl (CCNDl)和 G1(CCNG1)、 Jun、 p63 (TP73L)和程序性细胞死亡因子4 (PDCD4)。细胞周期蛋 白是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的辅因子，并且在细胞周期的进展中发挥作 用。对于从G1期至S期的转换，细胞周期蛋白Dl是必需的，并且其在大量癌 症类型中是过度表达的(Donnellan和Chetty, 1998)。 Hsa-miR-126负调节细胞周 期蛋白Dl表达，并且因此可能千扰依赖高水平的细胞周期蛋白Dl的异常细胞 生长。相反，细胞周期蛋白Gl具有生长抑制活性，并且被hsa-miR-126上调(Zhao 等人,2003)。 Jun属于碱性区/亮氨酸拉链(bZIP)类型的转录因子，并且是诱导乌 类肿瘤形成的禽癌蛋白v-Jun的细胞同源物(Maki等人，1987)。 p63是p53肿, 抑制蛋白的家族成员，其响应于DNA损害而调节细胞周期和凋亡(Moll和 Sladel, 2004)。相应的TP63基因定位在染色体3q27-28上的癌症中其常常被扩 增的区。这些肿瘤的大多数表达p63的显性负性形式，后者在棵鼠中的作用类似癌基因（Hibi等人，2000)。 PDCD4是肿瘤抑制因子，其在正常细胞的凋亡响应 时被谤导。PDCD4的生长抑制特性归因于PDCD4-介导的抑制c-Jim原癌蛋白、 抑制依赖帽的mRNA翻译和活化p21Wafl/Cipl CDK抑制剂（Yang等人，2003; Bitomsky等人，2004; Goke等人，2004)。在多种人类恶性肿瘤，诸如神经胶质瘤、 肝细胞癌、肺癌和肾细胞癌中，PDCD4经常显示表达减少或缺失(Jansen等人, 2004; Zhang等人，2006; Gao'等人，2007)。在小鼠模型中PDCD4的表达干扰皮 肤肿瘤发生并且抑制人结肠癌细胞的生长（Jansen等人，2005; Yang等人, 2006)。 PDCD4的缺失也与肺肿瘤进展相关(Chen等人，2003)。
基于这些把标的功能以及它们如何被hsa-miR-126调控，hsa-miR-126似乎 具有抗癌基因活性。如上所概括的，hsa-miR-126负调节善意(bona fide)的癌基因， 诸如EGFR、 Jun、 Met、 PLK1,并且刺激已知的或候选的肺瘤抑制因子的表达， 包括FAS、 TGFBR2/3、 TRAIL和RARRES。这种观点得到了我们的观察的支持， 即，hsa-miR陽126抑制多种癌细胞系的细胞增殖。然而，hsa画miR-126也以一定 方式调节癌相关基因，表明hsa-miR-126拮抗剂当适当时可能能够阻断肿瘤的发 生。在这些靶标中，有FGFR4 、 ERBB3以及潜在的肿瘤抑制因子肝配蛋白（ephrin) B2受体(EphB2)和Ras相关结构域家族蛋白2 (RASSF2)。 EphB2的失活加速了 结肠直肠癌的紳瘤发生(Guo等人，2006)。 RASSF2与K-Ras相互作用并促进细 胞周期停止和凋亡。因此，RASSF2在肺肿瘤细胞系中常常下调(Vos等人，2003)。 ERBB3 (也称为HER-3)属于EGFR的蛋白质家族，并且是禽类v-Erb癌蛋白的 同源物(Hynes和Lane, 2005)。与EGFR相反，仅当与其他的EGFR成员诸如 ERBB2络合为异源二聚体时ERBB3才传输有丝分裂信号。多种癌症类型显示 ERBB3的水平增加，并且因此活化EGFR通路(表5)。 Hsa-miR-126也调节肿瘤 抑制因子神经纤维瘤蛋白1和2(NF1/NF2),后者当缺失或突变时是神经纤维瘤 病的病因，神经纤维瘤病是最常见的遗传性肿瘤易感综合征之一(Rubin和 Gutmann, 2005)。 NF1作为GTP酶活化蛋白（GAP)对固有致癌RAS蛋白起作用， 通过将RAS-相关GTP催化为GDP^f吏RAS失活。仅次于神经纤维瘤病，在其他 恶性肿瘤，诸如星形细胞瘤、神经胶质瘤和白血病中也出现了 NF1功能的缺失 (Rubin和Gutmann, 2005)。
总之，hsa-miR-126决定着细胞增殖和肿瘤发生的关^:调节物的蛋白的活性。 这些靶标在人类癌症中经常被去调节。基于对被miR-126调节的基因和相关通 路的此观点，将hsa-miR-126或抑制性抗hsa-miR-126导入至多种类型癌细胞中将有可能产生治疗反应。
实施例5:
递送合成的HSA-MIR-126抑制肺癌细胞的增殖
本发明人以前已经证明hsa-miR-126参与了大量细胞活性的调控，这些细胞 活性代表治疗癌症和治疗其他疾病和功能障碍的干预点(于2005年5月31曰申 请的美国专利申请系列号第11/141,707号和于2005年11月14日申请的系列号 第11/273,640号）。例如，hsa-miR-126的过度表达减少了某些正常细胞系或癌 细月包系的增殖和/或活力。
开发有效的治疗方案需要证明在多种癌症模型和代表同一疾病的多种癌细 胞系中治疗药物的功效和实用性的证据。本发明人通过使用ll种单独的肺癌细 胞系评价了 hsa-miR-126对肺癌的治疗效应。为了测量肺癌细胞的细胞增殖，使 用下列的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞：来源于肺腺癌的细胞(A549、H1299、H522、 H838、 Calu-3、 HCC827、 HCC2935)、来源于肺鳞状细胞癌的细胞(H520、 H226)、 来源于肺细支气管肺泡癌的细胞(H1650)、以及来源于肺大细胞癌的细胞(H460)。 合成hsa-miR-126 (前体miRTM-hsa-miR-126， Ambion cat. no. AM17100)或阴性对 照(NC) miRNA (前体miR™微小RNA前体分子-阴性对照#2; Ambion cat. no. AM17111)经脂质转染被递送至A549、 H1299、 H522、 H838、 Calu-3、 HCC827、 HCC2935、 H520、 H1650和H460细胞中，并且经电穿孔递送至H226细胞中。
根据已发表的试验方案(Ovcharenko等人，2005)和下列的参数执行脂质逆 转染(重复三次)：细胞(5,000-12,000/96孔)、在20 ^ OptiMEM (lnvitrogen)中的 0.1-0.2 pi (月旨质转染胺)LipofectamineTM 2000 (cat. no. 11668-019, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA)、终浓度30 nM的miRNA 100 pi 。使用BioRad Gene Pulser Xcell™仪(BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)以下列设置执行H226细 胞的电穿孔：5 x 106细胞，在200 plOptiMEM中的5貼miRNA(1.6 miRNA)、 方波脉沖以250 V进行5 ms。电穿孔的H226细胞以7,000细胞/96孔接种在100 pi的总体积中。除了 Calu-3细胞以外，在转染或电穿孔后72小时收获所有细胞 用于评价细胞增殖。在转染后10天收获Calu-3细胞。使用Alamar Blue (Invitrogen) 根据生产厂商的说明书执行增殖测定。作为抑制细胞增殖的对照，使用针对马 达蛋白驱动蛋白ll(也称为Eg5)的siRNA。 Eg5对于大多数真核细胞的细胞生存 是至关重要的，并且其缺乏会导致细胞增殖减少和细胞死亡(Weil等人，2002)。 在脂质转染中使用s正g5，并使用应用于miRNA的相同试验参数。本发明人还使用终浓度为10 pM和50 的DNA拓朴异构酶II抑制剂依托泊甙作为 miRNA效力的内标准。依托泊戒是FDA批准的用于治疗肺癌的DNA拓朴异构 酶II抑制剂。对于各种肺癌细胞的IC50值的范围已有报道，对于SCLC和NSCLC 细胞的范围为表6.用hsa-miR-126、 Eg5-特异性siRNA(s正g5)、依托泊戒或阴性对照miRNA(NC)处理的 肺癌细胞系的增殖百分比(％)。将数值对从用阴性对照miRNA转染的细胞获得的值(100%增 殖)进行标准化。NC,阴性对照miRNA; siEg5， Eg5-特异性siRNA; SD，标准差；n.d.,未测定。

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