[0001] 技术领域
[0002] 本
发明涉及一种
生物技术制药工业中的基因工程生产免疫佐剂技术，特别是一种
亚单位疫苗免疫佐剂及应用。
背景技术
[0003] 抗菌肽是生物在长期进化过程中为适应环境、求得生存而最早产生的免疫活性分子，具有选择性效应和分子
质量小、无
抗原性等特点，被认为是天然免疫的重要介质，在宿主对抗病原入侵的免疫防御中起着极其重要的作用，因此被形象地称为“天然
抗菌剂”或 “阳离子宿主防御肽”，是病原体入侵的重要分子屏障。Tani研究发现，体外培养的小鼠脾细胞经人抗菌肽刺激后能增殖并增加细胞因子产物，而体内处理则引起IgG
抗体免疫应答能
力增强。若先天性免疫不足以消除感染，抗菌肽则通过
信号传递途径，起动并扩大宿主的特异性免疫反应，充当先天免疫和特异性免疫之间信号传导的
桥梁。抗菌肽可以作为免疫增强剂刺激
机体的免疫。
[0004] 疫苗是防控禽霍乱(病原为多杀性巴氏杆菌）的最为有效的措施，我国目前用于禽霍乱的疫苗是弱毒菌苗和灭活菌苗，存在保持能力不佳，并可能潜在
毒力反强等缺点，这使得基因工程亚单位疫苗逐渐成为禽霍乱疫苗研究的热点。研制安全、高效并具有自主知识产权的禽霍乱基因工程亚单位疫苗的要求越来越迫切。但是基因工程疫苗在诱导机体免疫反应方面还存在一些不尽如人意之处，因此，研究人员试图从多方面增强禽霍乱亚单位疫苗的免疫效果。
[0005] 免疫佐剂由于可以非特异性地通过物理的或者化学的方式与特意性免疫反应物质结合，从而诱导机体产生长期、高效的特异性免疫反应，提高机体的免疫保护力，同时能够减少抗原的用量，节约疫苗免疫成本，因而被广泛应用于生产和研究。很多研究表明，多肽可以被用于增强和提高抗原的免疫原性，或者减少抗原用量，这提示多肽可以作为一种强有力的佐剂应用于疫苗。
[0006] 囊素三肽（BS)作为法氏囊中第一个化学结构明确的生物活性分子，不仅对禽类具有免疫调节作用，而对
哺乳动物及人类淋巴细胞也具有明显的免疫学及生理学功能。天然囊素和人工合成囊素在体外均可诱导禽和哺乳动物的前体B淋巴细胞表型分化。抗菌肽 Protegrin-I是Cathlin家族中重要的一员，研究表明它是一种
蛋白质多肽，具有广谱抗菌性，在动物机体免疫上发挥着重要的作用。
发明内容
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种亚单位疫苗免疫佐剂及应用，该 亚单位疫苗免疫佐剂属于抗菌肽囊素三肽融合肽，为新型基因工程免疫佐剂，可有效提高禽多杀性巴氏杆菌亚单位疫苗免疫效果，并提供
酵母表达载体，并利于大规模、高效、快速生产，为防控鸡的巴氏杆菌病的大规模流行提供高效亚单位疫苗佐剂。
[0008] 为了实现解决上述技术问题的目的，本发明采用了如下技术方案：本发明的一种亚单位疫苗免疫佐剂，该佐剂为抗菌肽囊素三肽融合肽，其
氨基酸序列为SEQ. ID. NO. 1，核苷酸序列为：SEQ ID NO. 2。亚单位疫苗免疫佐剂的真核表达载体可以选择毕赤酵母表达系统的PPICZ α A。
[0009] 本发明的一种亚单位疫苗免疫佐剂，所述的氨基酸序列SEQ. ID. NO. 1是根据已在GeneBank中登录的猪抗菌肽Protegrin-Ι氨基酸序列和囊素三肽序列进行的设计，即采用氨基酸序列“GGGGS”将猪抗菌肽Protegrin-I与3拷贝囊素三肽进行
串联，即得到： “PG-1-GGGGS-3BS”，即为氨基酸序列SEQ. ID. NO. 1。这样设计是为了为不影响猪抗菌肽 Protegrin-I氨基酸序列和囊素三肽各自二级结构，及抗菌肽的天然活性。上述的3BS为3 拷贝囊素三肽，PG-I为猪抗菌肽Protegrin-I。
[0010] 本发明的一种亚单位疫苗免疫佐剂，所述的核苷酸序列SEQ. ID. NO. 2具体是以 PG-I- GGGGS -3BS的氨基酸序列为模板，参照毕赤酵母偏嗜密码设计的PG-I- GGGGS -3BS 融合肽核苷酸序列。具体可以依据Invitrogen公司的真核表达载体pPICZ-α-A上的多克隆酶切位点，在基因前端加入xho 酶切位点，后端加入Xba I酶切位点，并在Xba I酶切位点前加入终止密码子，来进行基因表达载体的构建。
[0011] 本发明的一种亚单位疫苗免疫佐剂，其基因是根据PG-I- GGGGS -3BS的核苷酸序列设计三条引物，用重叠拼接延伸PCR (SOE-PCR)的方法扩增获得。三条引物核苷酸序列为：F1 SEQ. ID. NO. 3、F2 SEQ. ID. NO. 4、F3 SEQ. ID. NO. 5。
[0012] 本发明的一种亚单位疫苗免疫佐剂，酵母表达载体的构建是将PG-I- GGGGS -3BS 的基因
片段和质粒PPICZ-α-A进行xho I , Xba I双酶切，然后将基因片段插入酵母表达载体pPICZ- α -Α。酵母表达载体pPICZ- α -A和酵母菌株X_33可购自Invitrogen公司。
[0013] 本发明的一种亚单位疫苗免疫佐剂，酵母表达菌株和融合蛋白获得方法是按照毕赤酵母表达系统使用
说明书，将构建好的融合蛋白表达载体线性化后，电转化酵母菌X-33， 通过酵母诱导表达，获得融合蛋白。
[0014] 本发明的一种亚单位疫苗免疫佐剂，所述的氨基酸序列SEQ. ID. NO. 1具体序列为：RGGRLCYCRRRFCVCVGRGGGGSKHGKHGKHG。
[0015] 本发明的一种亚单位疫苗免疫佐剂，所述的核苷酸序列SEQ ID N0. 2具体序列为： AGAGGTGGTAGATTGTGTTATTGTAGAAGAAGATTcTGTGTTTGTGTTGGTAGAGGTGGTGGTGGTTCTAAGCATGG TAAGCATGGTAAGCATGGT。
[0016] 本发明的一种亚单位疫苗免疫佐剂，所述的引物序列Fl SEQ. ID. NO. 3具体
序列表为：AGAGGTGGTAGATTGTGTTATTGTAGAAGAAGATTCTGTG。
[0017] 本发明的一种亚单位疫苗免疫佐剂，所述的引物序列F2 SEQ. ID. NO. 4具体序列表为：AACCACCACCACCTCTACCAACACAAACACAGAATCTTC。
[0018] 本发明的一种亚单位疫苗免疫佐剂，所述的引物序列F3 SEQ. ID. NO. 5具体序列表为:GTGGTGGTTCTAAGCATGGTAAGCATGGTAAGCATGGT。
[0019] 本
专利获得的基因工程产品即为亚单位疫苗免疫佐剂，是用基因工程菌株制备的可溶性表达产物。
[0020] 本发明的一种亚单位疫苗免疫佐剂制备方法为基因工程表达。[0021] 本专利的亚单位疫苗免疫佐剂在制备禽类、猪亚单位疫苗中的应用，可制备的疫苗为禽或猪多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、沙
门氏菌外膜蛋白抗原亚单位疫苗。具体应用方法是将PG-I- GGGGS -3BS免疫佐剂与亚单位疫苗等量混合，进行肌肉或腹膜内注射免疫，三周后按照同样方法第二次免疫。
[0022] 通过采用上述技术方案，本发明具有以下的有益效果：本发明应用PG-I- GGGGS -3BS融合肽作为分子佐剂，可以有效增强鸡多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H的免疫原性，将PG-I- GGGGS -3BS融合肽配合鸡多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H免疫BALB/c小鼠后，其体液免疫和细胞免疫都比单独的禽或猪多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H免疫效果好，并且未发现不良反应；目前研究亚单位疫苗佐剂一般采用原核表达载体，原核表达产物有可能形成包涵体，需变性，复性及纯化，并且有内毒素和LPS等不容易去除。本发明在获得PG-I- GGGGS -3BS融合肽时选择真核酵母表达载体，其优点在于融合蛋白易于表达，纯化，而且进行糖基化等修饰，易于实现大规模生产；酵母表达的融合蛋白具有真核细胞的修饰基因，与哺乳动物体内表达的PG-I结构相似，具有很好的生物学活性。
附图说明
[0023] 图1是本发明的一种亚单位疫苗免疫佐剂SOE-PCR产物的
电泳图，其中右侧为 DL2000核酸分子量标准，分子量从上到下依次为：2000，1000，750，500，250，IOObp ；左侧为 PG-I- GGGGS -3BS PCR 产物，约 140bp。
[0024] 图2是本发明的亚单位疫苗免疫佐剂酵母表达产物的SDS-PAGE电泳图，其中左侧为低分子量蛋白质标准，分子量从上到下依次为：99. 4，62. 0，43. 0，31. 2，20. 1，14. 4kD ；右侧为PG-I- GGGGS -3BS表达产物，分子量大约3. 44 kD。
[0025] 图3是本发明的亚单位疫苗免疫佐剂用于免疫的抗体
水平检测结果比较图。
[0026] 图4是本发明的亚单位疫苗免疫佐剂用于免疫的抗体亚型水平检测结果比较图。
[0027] 图5是本发明的亚单位疫苗免疫佐剂用于免疫的细胞因子水平检测结果比较图。
具体实施方式
[0028] 下面结合
实施例对本发明做进一步说明。
[0029] 1、PG-I- GGGGS -3BS融合肽核苷酸全序列的获得采用重叠延伸PCR (SOE)方法扩增PG-I- GGGGS -3BS融合肽全基因序列，用三条引物来扩增。三条引物为 Fl SEQ. ID. NO. 3，F2 SEQ. ID. NO. 4，F3 SEQ. ID. NO. 5。
[0030] PCR 反应体系 50μ1 :10XPCR Buffer5PL，dNTP (2. 5mM) 2μί，引物 Fl、F2、F3 各 ΐμΐ, rTeq DNA聚合酶0. 5μί，用去离子水补至50μί。
[0031] PCR 反应程序：95°C预变性 5min，扩增条件为：94°C 30 s，57°C 30s, 72 V 30s, 35循环，72 °C延伸lOmin。用大连Takara公司生产的核酸胶回收
试剂盒回收140bp大小的核苷酸片段。其SOE-PCR产物的电泳图，图右侧为DL2000核酸分子量标准，分子量从上到下依次为:2000，1000，750，500，250，IOObp ；左侧为 PG-I- GGGGS -3BS PCR 产物，约 140bp。
[0032] 2、酵母表达载体pPICZ- α -A-PB的构建及表达根据酵母表达载体系统手册完成， 将获得的表达载体pPICZ- α -A-PB线性化后，电转化酵母菌Χ-33，通过酵母诱导表达，获得融合肽PG-I- GGGGS -3BS。其酵母表达产物的SDS-PAGE电泳图，图左侧为低分子量蛋白质标准，分子量从上到下依次为=99.4,62. 0,43.0,31.2,20. 1,14. 4kD ；右侧为PG-I- GGGGS -3BS表达产物，分子量大约3. 44 kD。
[0033] 3、动物免疫用该PG-I- GGGGS -3BS融合肽与 鸡多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H联合应用，免疫Babl/c 小鼠。将4周龄健康雌性BALB/c小鼠随机分成3组，每组20只。分别用PBS液（0. Iml),鸡多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H (50 μ g)，鸡多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H (50μ g)+PG-l- GGGGS -3BS融合肽（50μ g)进行腹膜内注射免疫，三周后按照同样方法进行第二次免疫。分别于第二次免疫后的第7，14，21，28，35，42天随机眼眶
采血，分离血清，检测血清总IgG抗体水平，并且于第二次免疫后的第7天，随机眼眶采血，分离血清，检测血清中抗体亚型、细胞因子（IL-4和IFN- γ );分离脾脏细胞检测脾淋巴
细胞增殖，做攻毒保护试验来衡量融合肽对外膜蛋白H的免疫增强作用。攻毒保护试验使用的菌株禽多杀性巴氏杆菌（CVCC474)购自中国
微生物保藏中心，其LD5tl为474CFU，攻毒剂量用5 LD500
[0034] 4、酶联
免疫吸附试验（ELISA)结果抗体及抗体亚型分析结果表明，外膜蛋白H+PG-1- GGGGS -3BS融合肽免疫组的抗体最早达到最高水平，并且水平显著高于亚单位疫苗免疫组，具体结果见图3 ;IgG抗体亚型检测结果表明外膜蛋白H主要诱导产生IgGl产生，而外膜蛋白H+PG-1- GGGGS -3BS融合肽免疫组不仅能诱导产生高水平的IgGl，而且诱导IgG2a的能力强于外膜蛋白H单独免疫组， 具体结果见图4。
[0035] 5、血清中IL-4和IFN- γ的测定应用定量ELISA对血清中的IL-4和IFN-Y进行定量分析，发现亚单位疫苗免疫组主要产生IL-4，PG-1- GGGGS -3BS融合肽免疫组的IL-4和IFN-γ分泌明显高于亚单位疫苗免疫组，具体结果见图5。
[0036] 6、四甲基偶氮唑蓝法（MTT)PBS对照组0D570平均值为0. 15 士 0. 021，外膜蛋白H免疫组0D570平均值为 0. 43 士0. 018，外膜蛋白 H+PG-1- GGGGS -3BS 融合肽免疫组 0D570 平均值为 0. 52 士0. 015。 这三组数据进行统计学分析，外膜蛋白H+PG-1- GGGGS -3BS融合肽免疫组与其它两组差异显著（ρ<0.05)。外膜蛋白H+PG-1- GGGGS -3BS融合肽免疫组淋巴细胞增殖强于单独外膜蛋白H免疫组。
[0037] 7、攻毒试验攻毒实验结果显示PBS对照组死亡率为90%，外膜蛋白H免疫组死亡率为50%，外膜蛋白H+PG-1- GGGGS -3BS融合肽免疫组死亡率为5%。试验结果说明PG-I- GGGGS -3BS融合肽对外膜蛋白H亚单位疫苗有一定的免疫增强作用。
