医药组合物
阅读：38发布：2021-11-13
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1.医药组合物，其特征在于，作为有效成分含有下述通式(1)所表示的 旋光性化合物或其药理学上允许的盐，改善伴随NF-κB活化产生的症状，
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基。
2.如权利要求1所述的医药组合物，其特征还在于，所述化合物是下式(2) 表示的化合物。
3.如权利要求1或2所述的医药组合物，其特征还在于，所述症状是由肿瘤细 胞引起的。
4.如权利要求3所述的医药组合物，其特征还在于，所述医药组合物通过抑 制所述肿瘤细胞的增殖，改善所述症状。
5.如权利要求1所述的医药组合物，其特征还在于，所述医药组合物通过抑 制血管内皮细胞的细胞粘附活性，改善所述症状。
6.如权利要求1所述的医药组合物，其特征还在于，所述症状为选自免疫疾 病、过敏性疾病、炎症性疾病、肿瘤转移、疫病、动脉硬化、白血病的症状。
7.医药组合物，其特征在于，作为有效成分含有下述通式(1)所表示的 旋光性化合物或其药理学上允许的盐，所述化合物通过抑制使NF-κB活化的治 疗引起的NF-κB的所述活化，可以增强所述治疗的效果，
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基。
8.如权利要求7所述的医药组合物，其特征还在于，所述化合物是下式(2) 表示的化合物。
9.如权利要求7或8所述的医药组合物，其特征还在于，所述的使NF-κB活 化的治疗是使用抗肿瘤剂的治疗。
10.如权利要求7或8所述的医药组合物，其特征还在于，所述的使NF-κB活 化的治疗是通过对肿瘤细胞照射放射线而进行的治疗。
11.如权利要求9所述的医药组合物，其特征还在于，作为有效成分含有所 述抗肿瘤剂。
12.如权利要求9所述的医药组合物，其特征还在于，所述抗肿瘤剂是喜树 碱或者柔红霉素。
13.医药组合物，其特征在于，作为有效成分含有下述通式(1)所表示 的旋光性化合物或其药理学上允许的盐，改善由TNF-α引起的疾病，
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基。
14.如权利要求13所述的医药组合物，其特征还在于，所述化合物是下式(2) 表示的化合物。
15.如权利要求13或14所述的医药组合物，其特征还在于，所述的由TNF-α 引起的疾病是伴随胰岛素抗性产生的疾病。
16.如权利要求13或14所述的医药组合物，其特征还在于，所述的由TNF-α 引起的疾病是糖尿病引起的疾病。
17.如权利要求13或14所述的医药组合物，其特征还在于，所述的由TNF-α 引起的疾病是肌营养不良。
18.肿瘤细胞增殖抑制剂，其特征在于，作为有效成分含有下述通式(1) 所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐，用于抑制肿瘤细胞增殖，
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基。
19.如权利要求18所述的肿瘤细胞增殖抑制剂，其特征还在于，所述化合物 是下式(2)表示的化合物。
20.细胞粘附抑制剂，其特征在于，作为有效成分含有下述通式(1)所 表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐，用于抑制血管内皮细胞的细胞粘 附，
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基。
21.如权利要求20所述的细胞粘附抑制剂，其特征还在于，所述化合物是下 式(2)表示的化合物。
22.细胞凋亡诱导剂，其特征在于，作为有效成分含有下述通式(1)所 表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐，用于诱导肿瘤细胞的凋亡，
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基。
23.如权利要求22所述的细胞凋亡诱导剂，其特征还在于，所述化合物是下 式(2)表示的化合物。
24.细胞凋亡诱导剂，其特征在于，作为有效成分含有下述通式(1)所 表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐，用于诱导肥大的脂肪细胞的凋 亡，
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基。
25.如权利要求24所述的细胞凋亡诱导剂，其特征还在于，所述化合物是下 式(2)表示的化合物。
26.如权利要求24或25所述的细胞凋亡诱导剂，其特征还在于，含有TNF- α作为有效成分。
27.肥胖预防·防止剂，其特征在于，作为有效成分含有下述通式(1) 所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐，
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基。
28.如权利要求27所述的肥胖预防·防止剂，其特征还在于，所述化合物是 下式(2)表示的化合物。
29.降血糖剂，其特征在于，作为有效成分含有下述通式(1)所表示的 旋光性化合物或其药理学上允许的盐，
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基。
30.如权利要求29所述的降血糖剂，其特征还在于，所述化合物是下式(2) 表示的化合物。
31.解除细胞分化诱导的抑制的药剂，其特征在于，作为有效成分含有下 述通式(1)所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐，
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基。
32.如权利要求31所述的解除细胞分化诱导的抑制的药剂，其特征还在于， 所述化合物为下式(2)表示的化合物。
33.如权利要求31或32所述的解除细胞分化诱导的抑制的药剂，其特征还在 于，所述的细胞分化诱导的抑制是由TNF-α引起的肌细胞分化的抑制。
34.旋光性化合物的制造方法，其特征在于，通过对式(3)：
所示的化合物的外消旋体进行直接光学拆分，制造式(2)：
或者式(4)：
所示的旋光性化合物。
35.如权利要求34所述的旋光性化合物的制造方法，其特征还在于，所述 光学拆分使用光学活性色谱柱。
36.如权利要求35所述的旋光性化合物的制造方法，其特征还在于，所述 光学活性色谱柱填充以被下式(5)所表示的基团取代了的多糖的芳香族氨基 甲酸酯衍生物作为有效成分的拆分剂，
式中，R3～R7为氢原子或者碳原子数1～8的烷基。
37.如权利要求36所述的旋光性化合物的制造方法，其特征还在于，所述 多糖的芳香族氨基甲酸酯衍生物是直链淀粉三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸 酯)。
38.直接拆分方法，其特征在于，对式(3)
所示的化合物的外消旋体，通过以被下述式(5)所表示的基团取代了的多糖 的芳香族氨基甲酸酯衍生物作为有效成分的拆分剂直接进行光学拆分，
式中，R3～R7为氢原子或者碳原子数1～8的烷基。
39.如权利要求38所述的直接拆分方法，其特征还在于，所述多糖的芳香 族氨基甲酸酯衍生物是直链淀粉三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。
40.治疗方法，其特征在于，使用下述通式(1)所表示的旋光性化合物 或其药理学上允许的盐以改善伴随NF-κB活化产生的疾病，
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基。
41.如权利要求40所述的治疗方法，其特征还在于，所述化合物是以下式 (2)表示的化合物。
42.如权利要求40或41所述的治疗方法，其特征还在于，所述症状是由肿 瘤细胞引起的。
43.如权利要求42所述的治疗方法，其特征还在于，所述治疗方法通过抑 制所述肿瘤细胞的增殖，改善所述疾病。
44.如权利要求40所述的治疗方法，其特征还在于，所述治疗方法通过抑 制血管内皮细胞的细胞粘附活性，改善所述疾病。
45.如权利要求40所述的治疗方法，其特征还在于，所述疾病为选自免疫 疾病、过敏性疾病、炎症性疾病、肿瘤转移、疫病、动脉硬化、白血病的疾病。
46.治疗方法，其特征在于，包括使NF-κB活化的治疗的步骤，和投以作 为有效成分含有下述通式(1)所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐 的医药组合物的步骤，
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基。
47.如权利要求46所述的治疗方法，其特征还在于，所述化合物是以下式 (2)表示的化合物。
48.如权利要求46或47所述的治疗方法，其特征还在于，所述的使NF-κB 活化的治疗是施以抗肿瘤剂的治疗。
49.如权利要求46或47所述的治疗方法，其特征还在于，所述的使NF-κB 活化的治疗是通过对肿瘤细胞照射放射线而进行的治疗。
50.治疗方法，其特征在于，使用下述通式(1)所表示的旋光性化合物 或其药理学上允许的盐，用于改善由TNF-α引起的疾病，
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基。
51.如权利要求50所述的治疗方法，所述化合物是下式(2)表示的化合 物。
52.如权利要求50或51所述的治疗方法，其特征还在于，所述的由TNF-α引 起的疾病是伴随胰岛素抗性产生的疾病。
53.如权利要求50或51所述的治疗方法，其特征还在于，所述的由TNF-α引 起的疾病是糖尿病引起的疾病。
54.如权利要求50或51所述的治疗方法，其特征还在于，所述的由TNF-α引 起的疾病是肌营养不良。
技术领域
本发明涉及医药组合物、肿瘤细胞增殖抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞凋 亡诱导剂、肥胖预防·防止剂、降血糖剂、解除分化诱导抑制的药剂，以及这 些医药组合物、药剂作为有效成分含有的具有旋光性的化合物，即5-脱羟基 甲基环氧醌霉素C的旋光物的直接拆分方法和治疗方法。
背景技术
由于缺乏对于癌症和白血病，以及风湿症、胰腺炎、肝炎、消化器类炎症 等炎症性疾病有效的治疗药物，需要经新的作用机制发挥作用的新的化学疗 法。此外，对于免疫疾病、过敏性疾病、肿瘤转移、疫病、动脉硬化、血管新 生性疾病等，也需要经新的作用机制发挥作用的新的化学疗法。近年来，已知 NF-κB在肿瘤和炎症部位被活化。而且最近发现的NF-κB抑制剂5-脱羟基甲 基环氧醌霉素C(通称dehydroxymethylepoxyquinomicin(DHMEQ))在细胞水平 上强烈抑制NF-κB(A.Ariga et al.，J.Biol.Chem.277，24625-24630， 2002)，在动物的个体水平上强烈抑制前列腺癌(Cancer Res.2003，Jan 1；63(1)：107-10)和乳癌(2002年度日本癌症学会大会记录，p157)的增大， 也抑制风湿症的模式小鼠的症状(N.Matsumoto et al.，Bioorg.Med.Chem. Lett.10，865-869，2000)。DHM2EQ对这些肿瘤细胞等特异性高，毒性低。 因此，期待DHM2EQ作为新的抗肿瘤剂、抗炎症剂发挥作用。
DHMEQ的旋光物以往的制造方法如图1所示。首先，将以甲硅烷基暂时保护 了消旋体DHM2EQ(式(2))的酚羟基的化合物(式(16))通过手性色谱柱 拆分，得到旋光化合物(式(17)和式(18))，接着通过分别脱保护得到作 为目标的旋光性(-)-DHM2EQ(式(2))和(+)-DHM2EQ(式(4))。但是 本方法被指出有工艺过程长而造成收率损失的问题(N.Matsumoto et al.， Bioorg.Med.Chem.Lett.10，865-869，2000)。
因此，本发明的主要目的是提供为了使医药组合物含有所述化合物作为有 效成分，能够迅速且高收率地得到既有优良的药理作用、特异性又高的化合物 的方法。此外，本发明的目的还在于提供以所述化合物作为有效成分的医药组 合物。
发明的揭示
本发明人为了克服上述的问题进行了深入的探讨，结果发现使用以式(5) 所表示的基团取代了的多糖的芳香族氨基甲酸酯衍生物作为有效成分的拆分 剂填充的光学活性色谱柱，通过高效液相色谱(HPLC)可以直接光学拆分式(3) 所表示的化合物的外消旋体得到旋光性的化合物(式(2)，式(4))(图2)。
此外，本发明人为了考察旋光性化合物(式(2)，式(4))是否具有比 具有式(3)所表示的化合物的外消旋体的血管内皮细胞的粘附抑制作用更优 异的作用，分别使用式(2)、式(3)、式(4)表示的化合物，考察了人脐 带静脉内皮细胞(HUVEC)和人急性骨髓性白血病细胞HL-60的粘附。结果发 现，式(2)所表示的化合物表现出比式(3)和式(4)所表示的化合物更优 异的血管内皮细胞的粘附抑制作用。
本发明人进一步发现，式(2)所表示的化合物可以抑制多发性骨髓瘤、 甲状腺癌等的肿瘤细胞的增殖。
此外，本发明人发现，通过以式(2)所表示的化合物处理肥大的脂肪细 胞可以诱导肥大的脂肪细胞凋亡。
本发明人进一步发现，对于肥胖或2型糖尿病的模式动物，式(2)所表示 的化合物可以抑制由高脂肪食物引起的体重增加。
此外，本发明人发现，式(2)所表示的化合物可以解除细胞培养中成肌 细胞向肌细胞的分化诱导的抑制。由此，本发明人完成了本发明。
即，本发明所述的医药组合物的特征在于，作为有效成分含有下述通式(1) 所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐，可改善伴随NF-κB活化产生的 症状。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。
此外，所述化合物以下式(2)表示的化合物为佳。
本发明所述的医药组合物的特征在于，通过引起肿瘤细胞凋亡，改善至少 一个症状，或者不使肿瘤细胞凋亡的情况下，改善至少一个由肿瘤细胞引起的 症状。
所述的伴随NF-κB活化产生的症状，例如，也可以是由肿瘤细胞引起的。 所述医药组合物的特征还在于，通过抑制所述肿瘤细胞的增殖，改善所述症状。
此外，所述医药组合物的特征还在于，通过抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞 的粘附，改善所述症状。
所述症状为，例如，选自免疫疾病、过敏性疾病、炎症性疾病、肿瘤转移、 疫病、动脉硬化、血管新生性疾病(肿瘤内的血管新生性疾病)、白血病的症 状。
所述肿瘤为，例如，骨髓瘤、甲状腺癌、乳癌、胰腺癌、恶性肿瘤、前列 腺癌等。
此外，本发明所述的医药组合物的特征还在于，作为有效成分含有下述通 式(1)所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐，所述化合物通过抑制 使NF-κB活化的治疗引起的所述NF-κB的活化，可以增强所述治疗的效果。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。
此外，所述化合物以下式(2)表示的化合物为佳。
所述的使NF-κB活化的治疗可以是使用抗肿瘤剂的治疗，也可以是对肿瘤 细胞通过放射线照射的治疗。还可以作为有效成分含有所述医药组合物和所述 抗肿瘤剂。所述抗肿瘤剂是，例如，喜树碱或者柔红霉素等。
此外，本发明所述的医药组合物的特征还在于，作为有效成分含有下述通 式(1)所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐，改善由TNF-α引起的 疾病。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。此外，所述化合物以下式(2) 表示的化合物为佳。
所述由TNF-α引起的疾病可以是，例如，伴随胰岛素抗性产生的疾病、糖 尿病引起的疾病、肌营养不良等。
上述医药组合物的特征还在于，作为有效成分含有具有优异药理作用的左 旋的化合物，事实上不含右旋的化合物为佳。
本发明所述的用于抑制肿瘤细胞增殖的肿瘤细胞增殖抑制剂的特征在于， 作为有效成分含有下述通式(1)所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的 盐。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。
本发明所述的用于抑制肿瘤细胞增殖的肿瘤细胞增殖抑制剂的特征在还 于，作为有效成分含有具有优异药理作用的左旋的化合物，事实上不含右旋的 化合物为佳。
此外，所述化合物的特征可以在于，是下式(2)表示的化合物。
本发明所述的用于抑制血管内皮细胞的粘附分子的表达的粘附分子表达 抑制剂的特征在于，作为有效成分含有下述通式(1)所表示的旋光性化合物 或其药理学上允许的盐。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。
本发明所述的用于抑制血管内皮细胞的粘附分子的表达的粘附分子表达 抑制剂的特征在还于，作为有效成分含有具有优异药理作用的左旋的化合物， 事实上不含右旋的化合物为佳。
此外，所述化合物的特征可以在于，是下式(2)表示的化合物。
本发明所述的用于诱导肿瘤细胞的凋亡的细胞凋亡诱导剂的特征在于，作 为有效成分含有下述通式(1)所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。
本发明所述的用于诱导肿瘤细胞的凋亡的细胞凋亡诱导剂的特征在还于， 作为有效成分含有具有优异药理作用的左旋的化合物，事实上不含右旋的化合 物为佳。
此外，所述化合物的特征可以在于，是下式(2)表示的化合物。
本发明所述的用于诱导肥大的脂肪细胞的凋亡的诱导剂的特征在于，作为 有效成分含有下述通式(1)所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。所述化合物以下式(2)表 示的化合物为佳。
本发明所述的用于诱导肥大的脂肪细胞的凋亡的诱导剂的特征在还于，作 为有效成分含有具有优异药理作用的左旋的化合物，事实上不含右旋的化合物 为佳。本发明所述的用于诱导肥大的脂肪细胞的凋亡的诱导剂还可以含有TNF- α作为有效成分。
本发明所述的肥胖预防·防止剂的特征在于，作为有效成分含有下述通式 (1)所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。所述化合物以下式(2)表 示的化合物为佳。
本发明所述的肥胖预防·防止剂的特征在还于，作为有效成分含有具有优 异药理作用的左旋的化合物，事实上不含右旋的化合物为佳。
本发明所述的降血糖剂的特征在于，作为有效成分含有下述通式(1)所 表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。所述化合物以下式(2)表 示的化合物为佳。
本发明所述的降血糖剂的特征在还于，作为有效成分含有具有优异药理作 用的左旋的化合物，事实上不含右旋的化合物为佳。
本发明所述的解除细胞分化诱导的抑制的药剂的特征在于，作为有效成分 含有下述通式(1)所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。所述化合物以下式(2)表 示的化合物为佳。
所述的细胞分化诱导的抑制可以是，例如，由TNF-α引起的肌细胞分化的 抑制。本发明所述的解除细胞分化诱导的抑制的药剂的特征在还在于，作为有 效成分含有具有优异药理作用的左旋的化合物，事实上不含右旋的化合物为 佳。
本发明还可以提供通过对式(3)：
所示的化合物的外消旋体直接进行光学拆分，制造式(2)：
或者式(4)：
所示的旋光性化合物的方法。所述光学拆分可以使用光学活性色谱柱。
所述光学活性色谱柱是填充以被下式(5)所表示的基团取代了的多糖的 芳香族氨基甲酸酯衍生物作为有效成分的拆分剂的即可。
式中，R3～R7可以是氢原子或者碳原子数1～8的烷基，也可以是碳原子数 1～8的烷氧基、碳原子数6～14的芳基或者卤素原子等。
所述多糖的芳香族氨基甲酸酯衍生物可以是直链淀粉三(3，5-二甲基苯 基氨基甲酸酯)，也可以是纤维素三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。尤其 以直链淀粉三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)作为有效成分的拆分剂填充的 DAICEL CHIRALPAK AD(ダイセル化学工业(株))为佳。
通过本发明的方法，可以高效地、大量地制造旋光性的DHMEQ。
通过本发明的方法，可以制造式(2)或式(4)所示的旋光性的DHMEQ， 在后述的实施例中揭示了，这些旋光物中，式(2)所示的化合物比式(4)所 示的化合物生物学活性(药理活性)高。
此外，本发明所述的直接拆分方法的特征可以在于，对式(3)
所示的化合物的外消旋体，通过以由下述式(5)所表示的基团取代了的多糖 的芳香族氨基甲酸酯衍生物作为有效成分的拆分剂直接光学拆分。
式中，R3～R7可以是氢原子或者碳原子数1～8的烷基，也可以是碳原子数 1～8的烷氧基、碳原子数6～14的芳基或者卤素原子等。
所述多糖的芳香族氨基甲酸酯衍生物可以是直链淀粉三(3，5-二甲基苯 基氨基甲酸酯)，也可以是纤维素三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。
本发明所述的治疗方法中，使用下述通式(1)所表示的旋光性化合物或 其药理学上允许的盐，改善伴随NF-κB活化产生的症状。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。
此外，所述化合物以下式(2)表示的化合物为佳。
本发明所述的治疗方法，可以通过引起肿瘤细胞凋亡，改善至少一个症状， 也可以在不使肿瘤细胞凋亡的情况下，改善至少一个由肿瘤细胞引起的症状。
所述的伴随NF-κB活化产生的症状，例如，也可以是由肿瘤细胞引起的。
所述治疗方法，可以通过抑制所述肿瘤细胞的增殖，改善所述症状，也可 以通过抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的粘附，改善所述症状。
所述疾病为，例如，选自免疫疾病、过敏性疾病、炎症性疾病、肿瘤转移、 疫病、动脉硬化、血管新生性疾病(肿瘤内的血管新生性疾病)、白血病的症 状。
所述肿瘤为，例如，骨髓瘤、甲状腺癌、乳癌、胰腺癌、恶性肿瘤、前列 腺癌等。
此外，本发明所述的治疗方法中，使用作为有效成分含有下述通式(1) 所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐的医药组合物，所述医药组合物 通过抑制使NF-κB活化的治疗引起的所述NF-κB的活化，可以增强所述治疗的 效果。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。
此外，所述化合物以下式(2)表示的化合物为佳。
所述的使NF-κB活化的治疗可以是使用抗肿瘤剂的治疗，也可以是对肿瘤 细胞通过放射线照射的治疗。还可以作为有效成分含有所述医药组合物和所述 抗肿瘤剂。所述抗肿瘤剂是，例如，喜树碱或者柔红霉素等。
此外，本发明所述的治疗方法中，使用下述通式(1)所表示的旋光性化 合物或其药理学上允许的盐，用于改善由TNF-α引起的疾病。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。此外，所述化合物以下式(2) 表示的化合物为佳。
所述由TNF-α引起的疾病可以是，例如，伴随胰岛素抗性产生的疾病、糖 尿病引起的疾病、肌营养不良等。
上述的治疗方法中，使用具有优异药理作用的左旋的化合物，事实上不含 右旋的化合物为佳。
附图的简单说明
图1是DHM2EQ的旋光物的以往的制造方法的反应流程图。
图2是本发明的旋光性的DHM2EQ(式(2)，式(4))的制造方法的反应 流程图。
图3是(-)-DHM2EQ和(+)-DHM2EQ的HPLC特点图。
图4是(-)-DHM2EQ对HUVEC和HL-60细胞的粘附的抑制效果图。
图5是(-)-DHM2EQ对骨髓瘤模式小鼠的抗肿瘤效果图。
图6是(-)-DHM2EQ对甲状腺癌模式小鼠的抗肿瘤效果图。
图7是(-)-DHM2EQ对于肥大的脂肪细胞的凋亡诱导作用的分析结果的图 示。
图8是(-)-DHM2EQ对肥胖型糖尿病模式小鼠的体重增加的抑制作用的图 示。
图9是(-)-DHM2EQ解除从成肌细胞向肌细胞的分化诱导抑制的效果图。
实施本发明的最佳方式
以下，例举实施例的同时，对基于上述认知而完成的本发明的实施方式进 行详细说明。实施方式和实施例中没有特别说明的情况下，使用记载于以下标 准操作程序集中的方法，或者对其进行改进或修改后的方法：J.Sambrook， E.F.Fritsch &T.Maniatis(Ed.)，Molecular cloning，a laboratory manual (3rd edition)，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York(2001)；F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman， J.A.Smith，K.Struhl(Ed.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons Ltd.等。此外，在使用市场上销售的试剂盒和测定装置的情况 下，没有特别的说明时，则使用它们所附的操作程序。
本发明的目的、特征、优点和其思路通过本说明书的记载，从业者可以了 解，从本说明书的记载，只要是从业者就可以容易地再现本发明。以下记载的 发明的实施方式和具体的实施例等是本发明的优选实施方式，是为了示例或说 明而例举的，本发明并不局限于这些实施方式。在本说明书中所揭示的本发明 的意图及范围内，基于本说明书的记载，可以进行各种改进和修改，这一点对 于从业者是可以了解的。
已知NF-κB是与机体防御反应相关的核转录因子，通过NF-κB诱导的基因 除了免疫球蛋白之外，还有细胞因子(IL(白细胞介素)-1、IL-2、IL-6、 IL-8、TNF(肿瘤坏死因子)-α等)、细胞粘附因子(E-选择蛋白、ICAM (细胞间粘附分子)-1、VCAM(血管细胞粘附分子)-1等)、一氧化氮(NO) 合成酶、Fas配体等许多与免疫应答和炎症反应关系密切的基因(Cell，87， 13-20，1996)。此外，在膀胱癌、乳癌、黑色素瘤等中所报道的NF-κB通常 被活化，这被认为与凋亡的抑制、细胞增殖的促进、细胞分化的抑制等肿瘤形 成的各个方面相关，促进肿瘤形成(J.Clin.Invest.107，241-246，2001)。 另一方面，报道了通过导入抑制NF-κB活化的蛋白IκB的基因特异地诱导细胞 凋亡，所以希望具有NF-κB活化抑制作用的化合物能够成为具有抗炎症作用和 抗肿瘤活性的药品和药剂。
具有NF-κB活化抑制作用的化合物过去已知有水杨酰胺衍生物 (WO01/12588A1)、泛顶环氧菌素(panepoxydone；Biochem.Biophys.Res. Commun.226，214-221，1996)、环顶环氧菌素(cycloepoxydon；J.Antibiot. 51，455-463，1998)、SN-50(J.Biol.Chem.270，14255-14258，1995) 等。
上述水杨酰胺衍生物是以无毒性的抗菌素环氧醌霉素(epoxyquinomicin) 的结构为基础设计的，近年来本发明人了解到该化合物的外消旋体具有抗炎症 作用、免疫抑制作用、抗肿瘤活性、抗动脉硬化作用、肿瘤转移抑制作用、抗 疫病作用、抗过敏作用和血管新生抑制作用。
外消旋体中2种对映体((+)-体和(-)-体)共同存在，一般这些对映 体的沸点、熔点等物理性质几乎完全相同。但是，(+)-体和(-)-体通常对 机体的作用不同。例如，已知像“沙利度胺(反应停)的悲剧”，一个对映体 具有催眠作用和镇静作用，而另一个对映体具有致畸作用(诱发胎儿畸形的作 用)。此外，已知药品和农药中，通过使用含有外消旋体中的一个对映体作为 有效成分的药剂，可以得到更好的效果，而且副作用少。因此，对于药品等， 制备光学纯的化合物成为非常重要的课题。
本发明人已经尝试将前述水杨酰胺衍生物的外消旋体拆分为(+)-体和(-) -体(Bioorg.Med.Chem.Lett.10，865-869，2000)。但是，所述化合物 的拆分方法必须制成将所述化合物的外消旋体的酚羟基以甲硅烷基暂时保护 的化合物。因此，本发明人使用填充将各种衍生物作为有效成分的拆分剂的光 学活性色谱柱，考察是否可以将所述化合物的外消旋体直接拆分为(+)-体和 (-)-体。结果发现，通过使用将以式(6)
所表示的基团取代了的多糖的芳香族氨基甲酸酯衍生物作为有效成分的拆分 剂，可以将所述化合物的外消旋体直接光学拆分为(+)-体和(-)-体。
如果从取代基团使分子的形状发生变化，或者取代基团本身具有的物理化 学性质和取代基团对芳环的π电子的影响等复杂组合考虑分离和吸附的特性 的显著变化和取代的关系，下述通式(5)
所示的取代基团(-R3、-R4、-R5、-R6和-R7)可以是氢原子或者碳原子数1～ 8的烷基，也可以是碳原子数1～8的烷氧基、碳原子数6～14的芳基或者卤素原 子等。
作为多糖的芳香族氨基甲酸酯衍生物的原料的多糖可以是合成多糖、天然 多糖和天然改性多糖中的任一种，但具有旋光性的多糖为佳，更好为容易得到 高纯度多糖的直链淀粉和纤维素等。此外，作为容易得到高纯度多糖的原料， 较好是β-1，4-壳聚糖、壳多糖、β-1，4-甘露聚糖、β-1，4-木聚糖， 菊粉、凝胶多糖(Curdlan)等。此外，在本实施例中，使用直链淀粉三(3， 5-二甲基苯基氨基甲酸酯)作为多糖的芳香族氨基甲酸酯衍生物进行本发明 的直接拆分方法，也可以适用纤维素三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。
在这里，对在拆分剂中作为有效成分所含有的多糖的氨基甲酸酯衍生物进 行说明，还可以使用酯类衍生物和醚类衍生物、除芳香族氨基甲酸酯外的氨基 甲酸酯衍生物等多糖衍生物。
承载这些拆分剂的载体一般使用有机载体或者无机载体，无机载体较好。 这样的无机载体有例如硅胶、氧化铝、氧化镁、氧化钛、玻璃、硅酸盐、高岭 土等。载体的粒径随使用的色谱柱的大小而不同，一般为0.5μm～10mm，较好 为1μm～300μm，更好为5μm～20μm。此外，其性状以多孔质为佳，这样的 情况下孔的平均细孔径较好为10～100μm，更好为50～50000。将所述多糖 的芳香族氨基甲酸酯衍生物承载于载体的方法，可以使用例如将多糖的芳香族 氨基甲酸酯衍生物溶解于溶剂中制作胶浆，将其一边搅拌一边慢慢滴入载体， 使其在载体上均匀包覆的方法等常规的方法。
此外，通过适用上述直接拆分方法，可以由式(3)所示的化合物的外消 旋体简便地制造旋光性化合物(式(2)和式(4))。以下对该方法进行详细 叙述。
＝＝＝式(2)和式(4)所示的化合物的制造方法＝＝＝
通式(12)所示的化合物可以按照Wipf等的合成法(Synthesis，12号，1549 -561页，1995年)制造。
对通式(12)所示的化合物的制造方法的一例基于下述的反应方程式进行 说明。
在下述的反应方程式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举 乙酰基、丙酰基、丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。R2为C1～4 的烷基，烷基可以例举甲基、乙基、丙基、丁基及它们的异构体基团，以甲基、 乙基为佳，更好为甲基。此外，X为卤素原子，卤素原子可以例举氟原子、氯 原子、溴原子和碘原子，氯原子、溴原子为佳，更好为氯原子。
步骤(a)：N-(2-烷酰基苯甲酰基)-2，5-二甲氧基苯胺的制造
将2，5-二甲氧基苯胺溶解于溶剂(例如吡啶等)中，在-78℃～50℃下， 较好在冰浴冷却下，加入式(7)的O-烷酰基水杨酰卤的乙酸乙酯溶液，边搅 拌边反应。加水停止反应后，加入乙酸乙酯，依次以盐酸、水、碳酸氢钠溶液、 水洗涤，干燥后通过减压浓缩和真空干燥，得到式(8)所示的N-(2-烷酰 基苯甲酰基)-2，5-二甲氧基苯胺。该化合物不纯化，可以在接着的步骤中 使用。
步骤(b)：3-(O-烷酰基水杨酰胺基)-4，4-二烷氧基-2，5-环己二烯 酮的制造
将上述得到的式(8)的化合物溶解于溶剂(例如甲醇、乙醇等)中，在 -20℃～50℃下，较好在冰浴冷却下，加入二乙酰氧基碘苯，在室温下边搅拌 边反应。减压浓缩后，加入乙酸乙酯，依次以碳酸氢钠溶液、氯化钠溶液洗涤， 减压浓缩溶剂层，所得残渣以柱色谱法精制，得到式(9)所示的3-(O-烷 酰基水杨酰胺基)-4，4-二烷氧基-2，5-环己二烯酮。
步骤(c)：5，6-环氧基-4，4-二烷氧基-3-烷酰基水杨酰胺基-2-环己 烯酮的制造
将式(9)的化合物溶解于溶剂(例如四氢呋喃、甲醇等)中，在-20℃～ 50℃下，较好在冰浴冷却下，加入过氧化氢溶液和氢氧化钠，边搅拌边反应。 向反应液中加入乙酸乙酯，依次以盐酸溶液、硫代硫酸钠溶液、氯化钠溶液洗 涤，在空气中干燥后真空干燥。为了除去残存的原料化合物，将残渣溶解于丙 酮中，加入对甲苯磺酸，在室温下搅拌，分解原料化合物。减压蒸馏除去甲醇 得到的残渣中加入乙酸乙酯，用水洗涤。将干燥乙酸乙酯层得到的残留物用柱 色谱法纯化，得到式(10)所示的5，6-环氧基-4，4-二烷氧基-3-烷酰基 水杨酰胺基-2-环己烯酮。
步骤(d)：5，6-环氧基-2-烷酰基卤化水杨酰胺-2-环己烯-1，4-二酮 的制造
将式(10)的化合物溶解于溶剂(例如二氯甲烷等)中，冰浴冷却下加入 无机酸或有机酸(例如三氟化硼二乙醚配位体等)，边搅拌边反应。向反应液 中加入溶剂(例如乙酸乙酯等)，以水洗涤，浓缩溶剂层后，将得到的残渣以 甲醇洗涤得到式(11)所示的化合物5，6-环氧基-2-烷酰基水杨酰胺基-2 -环己烯-1，4-二酮。
步骤(e)：5，6-环氧基-4-羟基-3-烷酰基水杨酰胺基-2-环己烯酮的 制造
将式(11)的化合物悬浮于溶剂(例如甲醇、乙醇、THF等)中，在-78 ℃～50℃下，较好在冰浴冷却下，加入还原剂(例如硼氢化钠等)使其反应。 向反应液中加入溶剂(例如乙酸乙酯、二氯甲烷等)，依次以盐酸、水洗涤， 干燥溶剂层后减压浓缩，以甲醇悬浮、搅拌、洗涤，得到式(12)所示的5，6 -环氧基-4-羟基-3-烷酰基水杨酰胺基-2-环己烯酮。
通过使用O-乙酰基水杨酰氯作为式(7)的O-烷酰基水杨酰卤，在步骤 (b)中使用甲醇作为溶解式(8)的化合物的溶剂，可以制造式(3)所示的 化合物((±)-DHM2EQ；“DHM2EQ”亦称“DHMEQ”)。
式(3)的化合物的光学拆分通过使用光学活性色谱柱的高效液相色谱 (HPLC)进行。由此，得到式(2)和式(4)的化合物。光学活性色谱柱可以 使用以由通式(5)所示基团取代了的多糖的芳香族氨基甲酸酯衍生物作为有 效成分的拆分剂，例如DAICEL CHIRALPAK AD(10mm i.d.×250mm)。使用DAICEL CHIRALPAK AD的情况下，可以将添加0.1～0.9v/v％乙酸的甲醇作为流动相(例 如流速：0.5～2.5ml/min)，来配制式(3)的化合物的甲醇溶液(例如浓度5～ 20mg/ml)，将其以每次50～200μl分5～20次注射，制备式(2)和式(4)的 化合物。
通过JASCO DIP-360旋光仪测定式(2)和式(4)的化合物的旋光度，可 以算出光学纯度。式(2)所示的化合物的旋光性为左旋，所以将其记作(-) -体。式(4)所示的化合物的旋光性为右旋，所以将其记作(+)-体。
＝＝＝关于式(2)所示化合物的药理作用＝＝＝
(-)-DHM2EQ可以改善(包括预防和抑制进展)，伴随NF-κB活化产生的 症状、伴随胰岛素抗性产生的疾病、糖尿病引起的疾病和肌营养不良，具体地 伴随NF-κB活化产生的症状有乳癌、胰腺癌、恶性淋巴瘤、前列腺癌、甲状腺 癌、骨髓瘤等肿瘤细胞引起的症状，和免疫疾病、过敏性疾病、炎症性疾病、 肿瘤转移、疫病、动脉硬化、血管新生性疾病(尤其是肿瘤内的血管新生性疾 病)、白血病(尤其是成人T细胞白血病(Adult T cell leukemia))等的症 状，具有比(±)-DHM2EQ更好的效果。
因此，(-)-DHM2EQ被用作肿瘤细胞增殖抑制剂、粘附分子的表达抑制剂、 细胞凋亡诱导剂、肥胖预防·防止剂、降血糖剂、解除分化诱导抑制的药剂等 时，比(±)-DHM2EQ更有效。
此外，对于肿瘤细胞引起的症状的改善，引起或不引起肿瘤细胞的凋亡都 可以。不引起凋亡的情况可以例举，例如抑制细胞粘附引起的肿瘤转移抑制、 不伴随凋亡的肿瘤增殖抑制、癌症疫病改善、血管新生抑制引起的肿瘤细胞坏 死等，但并不局限于此。不引起肿瘤细胞的凋亡是指，即使向病灶投以(-) -DHM2EQ，其效果不依赖于该病灶的肿瘤细胞的凋亡，除了不依赖于凋亡的效 果，发生肿瘤细胞的凋亡也可以。
以下，对(-)-DHM2EQ的各种作用效果进行详细说明。
<细胞粘附抑制作用>
如果对血管内皮细胞施加炎症性刺激或物理刺激等，则血管内皮细胞膜上 的细胞粘附分子的表达增强，白细胞粘附于血管内皮细胞的表面上，向血管外 移动。这是因为，在血管内皮细胞内，通过活化转录因子NF-κB，ICAM-1、 VCAM-1、E-选择蛋白等粘附分子的表达增强。白细胞向血管壁的粘附通过脂类 的积聚等引起动脉硬化，所以-直认为只要抑制了白细胞和血管内皮细胞的粘 附，就可以实现动脉硬化的预防/抑制。
此外，已知肿瘤细胞的粘附引起从血管的穿出、转移。报道有例如，转移 能力强的大肠癌中E-选择蛋白的配体唾液酸路易斯寡糖-X有高表达，认为如 果在血管内皮细胞中活化NF-κB，则血管内皮细胞膜上的E-选择蛋白的表达增 强，大肠癌细胞粘附到血管内皮细胞的表面上，变得容易向血管外穿出，转移 被促进。
如果抑制血管内皮细胞的细胞粘附活性，可能实现动脉硬化和肿瘤转移的 预防/抑制，那样的NF-κB抑制剂被认为可能对动脉硬化和肿瘤细胞的转移的 预防和抑制是有用的。
因此，本发明人使用由上述制造方法得到的式(2)的化合物(下称“(-) -DHM2EQ”)和式(4)的化合物(下称“(+)-DHM2EQ”)、以及式(3)的 化合物(下称“(±)-DHM2EQ”)，考察这些化合物对人脐带静脉内皮细胞 (HUVEC)的细胞粘附活性的影响。考察了各化合物对于经TNF-α刺激了的血 管内皮细胞与肿瘤细胞粘附的影响，结果(-)-DHM2EQ比(+)-DHM2EQ强约10 倍，比(±)-DHM2EQ强约3倍，抑制了血管内皮细胞与肿瘤细胞的粘附。由此， 可以知道(-)-DHM2EQ具有比(±)-DHM2EQ更好的血管内皮细胞粘附抑制作 用。因此，(-)-DHM2EQ作为血管内皮细胞粘附抑制剂比(±)-DHM2EQ更有 用，作为抗动脉硬化剂和肿瘤转移抑制剂也更有用。
<抗炎症作用和免疫疾病抑制作用>
本发明人向通过II型胶原诱发关节炎的慢性风湿性关节炎的模式小鼠投 以(±)-DHM2EQ，观察症状，发现(±)-DHM2EQ对关节炎的症状的抑制是有 效的。认为这可能是(±)-DHM2EQ通过NF-κB的活性抑制表现出的效果，具 有比(±)-DHM2EQ强数倍～十数倍的活性抑制效果的(-)-DHM2EQ作为抗炎 症剂对于关节炎的症状在预防/抑制方面更有效。
如上所述，可以期待(-)-DHM2EQ成为对于免疫疾病、炎症性疾病(也包 括过敏性炎症疾病)等症状有效的免疫疾病抑制剂和抗炎症剂。
<肿瘤细胞增殖抑制作用和抗肿瘤作用>
近年来，本发明人了解到(±)-DHM2EQ抑制NF-κB活化的何杰金氏淋巴 瘤细胞的增殖，但不抑制NF-κB未活化的髓细胞性白血病细胞的增殖。因此， 认为(±)-DHM2EQ可以用作NF-κB活化的肿瘤细胞的增殖抑制剂，通过NF-κ B的抑制发挥作用。
此外，本发明人了解到(±)-DHM2EQ在体外和体内可以不依赖细胞凋亡 地抑制人乳癌细胞的增殖。因此，认为(±)-DHM2EQ可以用作乳癌的预防·治 疗剂。
此外，本发明人了解到(-)-DHM2EQ对于骨髓瘤的模式小鼠可以抑制肿瘤 的增殖(参见实施例3)。多发性骨髓瘤伴随骨破坏引起的痛楚，非常痛苦， 目前还没有根本性的治疗方法。因此，可以期待(-)-DHM2EQ成为针对多发性 骨髓瘤等骨髓瘤的抗肿瘤剂。
本发明人还了解到(-)-DHM2EQ对于甲状腺癌的模式小鼠可以抑制肿瘤的 增殖(参见实施例4)。甲状腺癌作为-种难以治疗的癌症，目前还没有有效 的治疗方法。因此，可以期待(-)-DHM2EQ成为针对甲状腺癌的抗肿瘤剂。
综上所述，可以期待与(±)-DHM2EQ相比NF-κB的活化抑制效果更强的 (-)-DHM2EQ成为更好的肿瘤细胞增殖抑制剂。本发明所适用的肿瘤细胞可以 例举例如甲状腺癌细胞、前列腺癌细胞、乳癌细胞、恶性肿瘤细胞、胰腺癌细 胞等，但并没有特别限定，只要是NF-κB活化的肿瘤细胞都可以。所述恶性肿 瘤细胞较好是以恶性淋巴瘤细胞为治疗对象，其中更好为何杰金氏淋巴瘤细 胞、骨髓瘤细胞。此外，无法作为激素疗法的治疗对象的激素非敏感性的肿瘤 可以成为(-)-DHM2EQ的治疗对象，所以这是与激素疗法相比的巨大优点。 <细胞凋亡诱导作用以及抗肥胖作用和抗胰岛素抗性作用>
近年来，本发明人了解到(±)-DHM2EQ可以诱导NF-κB活化的白血病细 胞的凋亡。因此，可以期待NF-κB的活化抑制效果强的(-)-DHM2EQ具有比(±) -DHM2EQ更好的细胞凋亡诱导作用。
以往的化学疗法对于细胞以普遍的增殖机制作为目标，不仅是肿瘤细胞， 对正常细胞的影响也很大，未必是有效的治疗手段。但是，本发明人得到的实 验结果是(±)-DHM2EQ以与诱导白血病细胞凋亡同样的浓度完全不诱导人正 常白细胞的凋亡，表明对肿瘤细胞的特异性高。因此，认为比活性更高的(-) -DHM2EQ对于白血病细胞等恶性淋巴瘤细胞特异性更高，对正常细胞的副作用 更小。由此，本发明所述的细胞凋亡诱导剂可以适用于恶性淋巴瘤细胞、白血 病细胞或骨髓瘤细胞的凋亡诱导，对于恶性淋巴瘤、白血病或骨髓瘤特异性高， 所以可以期待优异的治疗效果。
作为治疗对象的恶性肿瘤可以例举恶性淋巴瘤、白血病或骨髓瘤等。所述 恶性淋巴瘤包括非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤等，骨髓瘤包括多发性骨 髓瘤等浆细胞性肿瘤等，白血病包括急性淋巴性白血病、成人T细胞白血病淋 巴瘤、慢性淋巴性白血病等。
此外，如果以(-)-DHM2EQ处理肥大的脂肪细胞，可以诱导细胞凋亡。因 此，可以用作诱导肥大的脂肪细胞凋亡的细胞凋亡诱导剂。
另一方面，具体的机制还不清楚，但已知从由于肥胖等而肥大(大型化) 的脂肪细胞向血液分泌出炎症性细胞因子TNF-α，由于该TNF-α抑制通过胰岛 素受体的信号传导通路，产生胰岛素抗性(胰岛素敏感性下降)。通过胰岛素 受体的信号传导通路，通常使存在于骨骼肌细胞内的糖转运载体(GLUT)快速 地在细胞膜上移动，也具有促进糖(葡萄糖等)向骨骼肌细胞内的摄入的功能， 因此作为产生胰岛素抗性的一个原因，认为是由于TNF-α抑制了糖转运载体在 细胞膜上的移动，抑制了糖被细胞摄入。
因此，如果(-)-DHM2EQ诱导肥大的脂肪细胞的凋亡，则由于从脂肪细胞 向血液中分泌的TNF-α的量减少，防止糖向细胞内的摄入作用的抑制，不仅可 以作为肥胖预防·防止剂、降血糖剂，还可以带来伴随胰岛素抗性产生的疾病、 或者糖尿病引起的疾病等的症状的改善。伴随胰岛素抗性产生的疾病有例如2 型糖尿病、高胰岛素血症、脂类代谢异常、肥胖、高血压、动脉硬化性疾病等， 糖尿病引起的疾病有例如糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经障 碍，可以期待(-)-DHM2EQ对这些症状有优异的治疗效果。
<抗ATL作用>
本发明人使用(±)-DHM2EQ考察了其对成人T细胞白血病淋巴瘤(ATL) 细胞的NF-κB的活化的影响。发现(±)-DHM2EQ抑制ATL细胞的NF-κB的活化。 此外，使用(±)-DHM2EQ考察了其对ATL细胞增殖的影响，发现(±)-DHM2EQ 可以不抑制正常细胞的增殖，而特异性地抑制ATL细胞的增殖。进一步，考察 了对ATL细胞的凋亡诱导的影响，发现(±)-DHM2EQ可以不诱导正常细胞的凋 亡而诱导ATL细胞的凋亡。由此，认为(±)-DHM2EQ具有抗ATL活性(作用)。
综上所述，认为与(±)-DHM2EQ相比NF-κB的活化抑制效果强的(-) -DHM2EQ可以作为更有效的抗ATL剂。
<抗疫病作用>
疫病(cachexia；亦称恶液质)是在恶性肿瘤、结核、糖尿病、血液疾病、 内分泌·代谢疾病等慢性病中，表现出以食欲不振、进行性体重减轻、贫血、 皮肤干燥、浮肿等为主要症状的全身不良的疾病。它是尤其在恶性肿瘤的末期 患者等中常见的症状，表现出以体重减少、贫血为主的全身机能的下降。如果 癌症患者出现疫病，则并发症的可能性增加，对于化学疗法的反应变差。而且 有时由于全身衰弱，对于癌症的化学疗法和放射线治疗的副作用变大，也有因 为疫病而导致死亡的。
目前为止，发生疫病的具体机理并不完全清楚，但近年来终于得到关于该 机理的，包括白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等一些细胞 因子参与的线索(最新医学1999年第54卷10号第2502-2507页)。例如， 疫病中各种症状的出现机理为，由于疫病诱导表达，过度表达的细胞因子作用 于中枢神经系统，引起进食减少、发热、低血压、无力等症状，还导致糖类、 蛋白质、脂类的分解代谢亢进的状态。
对于抑制这样的疫病中的症状施予类固醇是有效的。如果给疫病患者服用 类固醇，则通过类固醇的免疫反应抑制作用和由其引起的抗炎症作用，还有对 疫病诱导的细胞因子生成的抑制作用，癌症疫病的代谢异常得到调整，体重减 轻、食欲不振、无力、味觉异常、贫血等疫病症状得到减轻、改善。但是，长 期服用类固醇，其巨大的副作用成为大问题。由于类固醇是原来人体具有的激 素，摄入的类固醇表现出与过量的激素同样的作用效果，例如因为与肾脏中的 盐的再吸收相关，作为副作用有时会出现浮肿和高血压。
另一方面，利用ω3不饱和脂肪酸抑制IL-6等炎症性细胞因子的生成，影 响急性期反应蛋白的合成，施予EPA(二十碳五烯酸)对疫病的改善有一定效 果的提高。但是这样的营养制剂的作用是间接的，所以难以期待显著而实际的 效果。
因此，需要开发与类固醇那样具有广谱作用的药剂不同的，对疫病具特异 性的，效果显著的药剂。在这样的需求下，本发明人向诱发疫病的症状的模式 小鼠投以(±)-DHM2EQ，观察其症状，发现(±)-DHM2EQ对于疫病症状的预 防/改善是有效的。所以，认为与(±)-DHM2EQ相比NF-κB的活化抑制效果 强的(-)-DHM2EQ对于疫病症状的预防/改善是更有效的。
<血管新生抑制作用>
由于(±)-DHM2EQ能够抑制NF-κB的活化，所以认为能够抑制由NF-κB 的活化引起的环氧合酶-2(COX-2)的基因表达。此外，由于抑制环氧合酶- 2的基因表达，认为能够抑制位于COX-2下游的前列腺素的合成。在肿瘤内，NF- κB的活化通过促进前列腺素的合成致使血管新生活跃，认为(±)-DHM2EQ通 过NF-κB的活化抑制能够抑制由前列腺素促进的肿瘤血管的新生。因此，认为 (±)-DHM2EQ可以用作通过抑制肿瘤内血管的新生，抑制向肿瘤的氧和营养 的供给表现出抗肿瘤作用的癌症治疗药物。
综上所述，认为与(±)-DHM2EQ相比NF-κB的活化抑制效果强的(-) -DHM2EQ作为肿瘤内的血管新生的抑制剂更有效。
<抗肌营养不良作用>
本发明人了解到通过使用(-)-DHM2EQ可以解除由成肌细胞向肌细胞的分 化诱导的抑制。因此，(-)-DHM2EQ可以用作解除由成肌细胞向肌细胞的分化 诱导的抑制的药剂。此外，(-)-DHM2EQ可以用于改善由成肌细胞向肌细胞的 分化诱导的抑制引起的肌营养不良，可以期待好的治疗效果。
<本发明所述医药组合物和活化NF-κB的治疗的合用效果>
以往，作为肿瘤的治疗方法已知化学疗法和放射疗法等。但是，如果使用 化学疗法和放射疗法，则肿瘤细胞中NF-κB被活化，癌症治疗的效果降低(J. Clin.Invest.107，241-246，2001)。例如，放射疗法是为杀死肿瘤细胞而 进行的，但是由于放射线照射引起的氧化应激反应NF-κB被活化，肿瘤细胞变 得难以诱导凋亡而抵抗放射线治疗。由此，如果对肿瘤细胞照射放射线，有时 放射线渐渐变得难以见效。因此，需要开发解除这样的对于癌症治疗的抗性。
近年来，本发明人通过将(±)-DHM2EQ用于化学疗法和放射疗法等活化 NF-κB的肿瘤治疗，发现该肿瘤治疗的效果提高。因此，认为通过将与(±) -DHM2EQ相比NF-κB的活化抑制效果强的(-)-DHM2EQ与化学疗法和放射疗法 等活化NF-κB的治疗合用，对进一步加强该治疗的效果是有效的。
用于上述化学疗法的抗肿瘤剂只要是活化NF-κB的药剂即可，有例如喜树 碱(CPT)和柔红霉素(DNR或DM)等抗肿瘤剂。
与(-)-DHM2EQ合用的药剂并不局限于抗癌剂，只要是由于施药引起NF- κB活化并因此对治疗产生抗性的药剂都可以。例如，通过(-)-DHM2EQ与对 用于感染性疾病、过敏性疾病、免疫疾病、炎症性疾病、肿瘤转移、疫病、动 脉硬化、血管新生性疾病(尤其是肿瘤内的血管新生性疾病)、白血病(尤其 是成人T细胞白血病(Adult T cell leukemia))等疾病的治疗合用，可以期 待提高治疗的效果。关于投药的时机，(-)-DHM2EQ可以在活化NF-κB的治疗 的同时施药，也可以在活化NF-κB的治疗后用于抑制NF-κB的活化。此外，为 了抑制NF-κB的活化还可以预先施药。治疗对象可以是患有上述疾病的人或其 他哺乳动物。
＝＝＝式(13)所示的化合物的外消旋体的制造方法＝＝＝
以上的叙述中，对通过将式(3)所示的化合物的外消旋体直接拆分，从 而制造旋光性的(-)-体和(+)-体的化合物的方法进行了说明，还可以将式 (13)
所示的化合物的外消旋体((±)-DHM3EQ)同样地直接拆分，制造式(14)
所示的(-)-体的化合物((-)-DHM3EQ)和式(15)
所示的(+)-体的化合物((+)-DHM3EQ)。以下，对式(13)所示的化合物 的外消旋体的制造方法用下述的反应式进行说明。在下述的反应式中，R2为C1～ 4的烷基，烷基可以例举甲基、乙基、丙基、丁基及它们的异构体基团，较好 为甲基、乙基，更好为甲基。
步骤(f)：3，3-二烷氧基-4，5-环氧基-6-羟基-2-水杨酰胺基环己烯 的制造
将式(16)所示的5，6-环氧基-4，4-二烷氧基-3-水杨酰胺基-2-环 己烯酮溶解于甲醇等溶剂和碳酸氢钠溶液的混合溶剂中，在-78℃～50℃下， 较好在冰浴冷却下，加入还原剂(硼氢化钠等)，边搅拌边反应。向该反应液 中加入溶剂(乙酸乙酯等)，依次以盐酸、水洗涤，干燥溶剂层后减压浓缩、 真空干燥，用柱色谱法等纯化，得到式(17)所示的3，3-二烷氧基-4，5-环 氧基-6-羟基-2-水杨酰胺基环己烯化合物。
步骤(g)：5，6-环氧基-4-羟基-2-水杨酰胺基-2-环己烯酮(式(13)， DHM3EQ)的制造
将式(17)的化合物溶解于溶剂(丙酮等)，加入p-甲苯磺酸，在室温 下边搅拌边反应。向反应液中加入溶剂(乙酸乙酯等)，以水洗涤，将溶剂层 干燥、减压浓缩、纯化，可以得到式(13)的5，6-环氧基-4-羟基-2-水 杨酰胺基-2-环己烯酮(DHM3EQ)。
这样制造的(±)-DHM3EQ也可以通过使用将以被下式(5)所表示的基团 取代了的多糖的芳香族氨基甲酸酯衍生物作为有效成分的拆分剂填充的光学 活性色谱柱，或间歇式使用所示拆分剂，直接光学拆分为(+)-DHM3EQ和(-) -DHM3EQ。光学活性色谱柱以使用可以将(±)-DHM2EQ直接光学拆分为(+) -DHM2EQ和(-)-DHM2EQ的色谱柱为佳，拆分剂使用可以将(±)-DHM2EQ直接 光学拆分为(+)-DHM2EQ和(-)-DHM2EQ的拆分剂为佳。
这样纯化了的(-)-DHM3EQ(式(14))或(+)-DHM3EQ(式(15))具 有与(-)-DHM2EQ同样的比外消旋体的化合物更优异的药理作用，对于改善伴 随NF-κB活化产生的症状更有效。
＝＝＝其他的实施方式＝＝＝
在以上的叙述中，对通式(1)所示的化合物的R1为乙酰基的化合物的药理 作用进行了说明，但是认为通式(1)所示的化合物的R1为氢原子、丙酰基或丁 酰基或它们的异构体基团的化合物也具有同样的药理作用。
本发明的化合物的形态也可以是药理学上允许的盐，例如季铵盐等有机 盐、或碱金属等金属盐。这样的化合物的盐可以以公知的方法制造。
<实施例1>
通过上述的方法合成(±)-5-脱羟基甲基环氧醌霉素C (dehydroxymethyl derivatives of epoxyquinomicin C；DHM2EQ)。得到的 (±)-DHM2EQ的光学拆分通过将添加0.5v/v％乙酸的甲醇作为流动相(流速： 1.0ml/min)，使用DAICEL CHIRALPAK AD(10mm i.d.×250mm)的高效液相色 谱(HPLC)(检测波长：315nmUV，柱温：40℃)进行。将20mg(±)-DHM2EQ 溶解于2ml甲醇，将其分为20次，每次100μl注射，分取3.8分和5.7分的峰的 部分，以85％的回收率得到(+)-DHM2EQ和(-)-DHM2EQ。分离的情况如图3 所示。
这样得到的两物质的旋光度((-)-DHM2EQ：[α]20 D-241°(c0.1MeOH)， (+)-DHM2EQ：[α]20 D+239°(c0.1MeOH))与文献(Bioorg.Med.Chem.Lett. 10，865-869，2000)记载的一致，光学纯度(ee)在99％以上。
<实施例2>
在本实施例中，考察了(-)-和(+)-DHM2EQ对于由TNF-α刺激了的血 管内皮细胞和肿瘤细胞的粘附的效果。
(1)细胞培养
将正常人脐带静脉内皮细胞(HUVEC；Cell systems，Lake Kirland，WA) 使用以I型胶原(株式会社高研，东京，日本)覆盖的塑料烧瓶(Costar，纽 约，美国)，使用含有灭活的10％牛胎血清(FBS；JRH BIOSCIENCES，Lenexa，KS)、 10μg/ml bFGF(Pepro Tech ED LTD，Lodon，UK)的MCDB-131培养基(Sigma， St.Louis，MO)，在37℃、5％CO2的恒温箱中培养。将人急性早幼粒细胞性白 血病细胞株HL-60细胞(Japanese Collection of Research Bioresources) 使用含有灭活的10％FBS的RPMI 1640培养基(日水制药株式会社，东京，日本)， 在37℃、5％CO2的恒温箱中培养。
(2)细胞粘附实验
将HUVEC以4.0×104细胞/孔(500μl/孔)点样于48孔板(Costar)培养过 夜。第二天，将培养的HUVEC以稀释到各浓度的(-)-DHM2EQ、(±)-DHM2EQ 或(+)-DHM2EQ处理，在37℃、5％CO2下恒温培养2小时。然后，再加入10ng/ml TNF-α(Genzyme-Techne，Cambridge，MA)，在37℃、5％CO2下恒温培养2小 时(并将未用TNF-α处理的作为对照)。6小时后，用加温至37℃的PBS (phosphate buffered saline；磷酸缓冲生理盐水)将每个孔洗涤2次，向每 个孔加入新的培养基(200μl/孔)。接着，向每个孔以6.0×104细胞/孔(20 μl/孔)的浓度点样HL-60细胞，在37℃、5％CO2下恒温培养1小时。接着，用 加热至37℃的PBS将每个孔洗涤3次，除去未粘附的HL-60细胞，加入新的培养 基(200μl/孔)。然后，用显微镜确认与HUVEC粘附的HL-60细胞，通过测定 显微镜视野内的粘附细胞数评价细胞粘附能力。其结果如图4所示。图中表示 了使用各个DHM2EQ时的IC50的值。如图4所示，发现(-)-DHM2EQ比(+)-DHM2EQ 和(±)-DHM2EQ细胞粘附抑制活性分别强10倍和3倍。
<实施例3>
接着，考察(-)-DHM2EQ对于多发性骨髓瘤的抗肿瘤效果。将4×107个的 多发性骨髓瘤细胞株KMS-12-PE(Ohtsuki T.et al.，Br.J.Hematol.73， 199-204，1989)溶解于0.2ml PBS，将其在CB17/1cr-SCID小鼠的左背部进行 皮下注射使其形成肿瘤，将5mm立方的该肿瘤片移植到10只小鼠中。移植肿瘤 后，观察16天，确认肿瘤片的生长、增殖趋势，对5只小鼠以8mg/kg体重向腹 腔内投以(-)-DHM2EQ的溶液(RPMI1640)。投药每天进行，持续14天。对 照组的5只小鼠投以同样量的溶剂(对照)。肿瘤直径的测量每周进行2次(肿 瘤容量＝(短径)2×(长径)×0.52)。其结果如图5所示，发现(-)-DHM2EQ 与对照相比显著地抑制了肿瘤的增殖。
<实施例4>
考察(-)-DHM2EQ对人甲状腺癌的抗肿瘤效果。将未分化的人甲状腺癌 细胞悬液FRO(5×106细胞；200μl的RPMI-1640)皮下注射到8周龄的雄性 BALB/cnu/nu小鼠(Charles River Japan公司制)的胁腹部。然后，用卡钳每 隔一天测定一次肿瘤的大小，通过肿瘤容量＝(a；肿瘤的短径)2×(b；与a 垂直的直径)×0.4计算肿瘤容量。肿瘤容量达到100mm3、皮下注射14天后作为 0天，向一组9只小鼠以10mg/kg体重向腹腔内在10天内每天投以(-)-DHM2EQ 的溶液(Cremophore(BASF公司)∶PBS∶DMSO(2∶1∶1))(○：(-)-DHM2EQ)。 对照组的9只小鼠投以同样量的溶剂(■：对照)。其结果如图6所示，发现(-) -DHM2EQ与对照相比显著地抑制了肿瘤的增殖。
<实施例5>
伴随胰岛素抗性的疾病，如上所述，被认为是由肥大的脂肪细胞分泌的 TNF-α引起的。于是，为了确认(-)-DHM2EQ是否可以诱导肥大的脂肪细胞 的凋亡，考察了(-)-DHM2EQ对于将前体脂肪细胞长期培养并经分化诱导得 到的肥大的脂肪细胞的影响。
将前体脂肪细胞株3T3-L1(7.5×104细胞；1ml含有10％FBS的DMEM)点样 于12孔板中的玻璃盖片上，达到融合后的2、3天之后换成含有500μM IBMX(3 -异丁酰-1-甲基黄嘌呤)、1μM Dex(地塞米松：dexamethasone)和1μ g/ml胰岛素的培养基。培养3天后，换成含有1μg/ml胰岛素的培养基，再3天 后换成普通的培养基(含有10％FBS的DMEM)。以后每隔3天换-次培养基，直 至50天。
分化诱导第50天更换培养基，24小时后将肥大的脂肪细胞用(-)-DHM2EQ (10μg/ml)预处理30分钟，接着再添加TNF-α(10ng/ml)进行刺激(作为 对照，以不添加(-)-DHM2EQ、不添加TNF-α和两者均不添加的各种条件进 行实验)。再过24小时后，去除培养基将肥大的脂肪细胞以500μl的荧光抗体 用PBS(8g/l NaCl、0.45g/l NaH2PO4·2H2O、1.28g/l Na2HPO4)洗涤3次，用500 μl 4％多聚甲醛在4℃下固定15分钟。然后，用500μl荧光抗体用PBS洗涤3次， 用含有0.2％BSA和0.5％Tween-20的荧光抗体用500μl PBS处理15分钟。
然后，用500μl蒸馏水洗涤3次，在遮光的150mm2的培养皿中的石蜡片上使 细胞面朝上地放置玻璃盖片。此外，从其上将TUNEL溶液(TdT buffer II /FITC-dUTP/TdT＝45μl/2.5μl/2.5μl)每次45μl地滴下，在37℃下恒温 培养1小时。最后将玻璃盖片放回遮光的12孔板，以1ml的荧光抗体用PBS洗涤3 次后，将玻璃盖片取出，在载玻片上用50％甘油固定，用荧光显微镜观察。
其结果如图7所示，发现预先用10mg/ml(-)-DHM2EQ处理的肥大的脂肪 细胞经10ng/mlTNF-α的刺激诱导凋亡。用10mg/ml(-)-DHM2EQ或10ng/mlTNF- α之一单独处理的肥大的脂肪细胞没有诱导凋亡。
综上所述，认为(-)-DHM2EQ对由分泌TNF-α的肥大的脂肪细胞引起的 胰岛素抗性症候群(例如2型糖尿病、高胰岛素血症、脂类代谢异常、肥胖、 高血压、动脉硬化性疾病等)的改善(包括预防、治疗)是有用的。此外，认 为(-)-DHM2EQ也可以作为肥胖预防剂、减肥剂、降血糖剂。更进一步，认 为(-)-DHM2EQ对糖尿病引起的疾病(例如糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜 病、糖尿病性神经障碍等)的改善(包括预防、治疗)也是有用的。
<实施例6>
接着，使用肥胖·2型糖尿病模式动物KKAy小鼠，考察(-)-DHM2EQ对糖 尿病的效果。
将4周龄的雌性KKAy小鼠分为2组((-)-DHM2EQ投药组5只，对照组4只)， 将高脂肪食物(CRF-1，オリエンタル酵母(株))作为基本饲料，让未添加 组(○：未添加(-)-DHM2EQ)、(-)-DHM2EQ投药组(●：添加(-)-DHM2EQ) 自由摄食，饲养4周，每周测定体重。向小鼠投药的(-)-DHM2EQ用研钵研细， 加0.5％CMC溶液悬浮或溶解，将其添加到高脂肪食物中。其结果如图8所示， 未添加组由于高脂肪食物的摄入呈现出显著的体重增加，而(-)-DHM2EQ组 在高脂肪食物的情况下体重的增加受到抑制。综上所述，认为(-)-DHM2EQ 可以作为抗肥胖剂(抗肥胖预防·防止剂(包括减肥剂))、抗糖尿病剂。
<实施例7>
以杜兴型为主的肌营养不良患者中的肌营养不良疾病的进展，认为由从成 肌细胞向肌细胞的分化诱导的抑制引起的肌细胞再生不良是一个发病机制(医 学のめゅみ，199：1045-1048，2001)。杜兴型肌营养不良的模式动物mdx小 鼠尽管与人类杜兴型肌营养不良的患者同样地缺失肌营养不良蛋白基因的表 达，但由于肌再生活跃，几乎没有发现肌肉力量下降。其原因认为是在人类患 者中，在一旦受损的肌细胞的再生过程中，TNF-α等炎症性因子抑制了肌分化。
于是，本发明人使用成肌细胞株C2C12的分化诱导系，考察(-)-DHM2EQ 的添加是否可以解除由TNF-α引起的肌肉分化抑制反应。
使用含有10％FBS的DMEM(培养用培养基)，将小鼠骨骼肌来源的成肌细 胞株C2C12(从理研细胞库购入)调整至7.5×104细胞/ml，向设有玻璃盖片(松 浪硝子工业株式会社，大阪，日本)的塑料制12孔板的各孔中分别点样1ml。 然后，当各孔中增殖到细胞融合的时候，将培养基换成含有2％加热灭活的马 血清的DMEM(分化用培养基)。对于使TNF-α(1ng/ml)和/或(-)-DHMEQ (3μg/ml)作用的组，在这时加入各种药剂。6天后，确认多核肌细胞的出现 这一肌细胞分化的标志，除去培养基。作为对照，准备用培养以培养基培养的 细胞，使其在第6天正好融合。
将这些细胞用PBS-(不含Ca2+、Mg2+的PBS；8.0g/l NaCl、0.2g/l KCl、2.3g/l NaHPO4·12H2O、0.2g/l KH2PO4)洗涤2次后将玻璃盖片从孔中取出，用冷风干 燥机使细胞干燥。然后，将玻璃盖片再放回12孔板的孔中，每孔加入约300μl May-Grünwald溶液(Merck公司，Darmstadt，Germany)，浸没玻璃上的细胞， 静置2～3分钟，固定、染色。经2～3分钟后，迅速在各孔中加入等量pH调整至 6.7的PBS-，一边向各孔的溶液吹入空气，一边使细胞再固定·染色2～3分钟。 接着，将玻璃盖片从孔中取出后，水洗，用干燥机的冷风使玻璃干燥。
将玻璃盖片再放回12孔板的孔中，加入基姆萨染色液(在1ml PBS-(pH： 6.7)中加入45μl Giemsa液(Merck)的溶液)浸没玻璃盖片。然后，向各孔 的溶液再吹入空气，对核染色10～15分钟。然后，与上述同样地将玻璃盖片从 孔中取出后，水洗，用干燥机的冷风使玻璃干燥。
这样制作的样品放于载玻片上，用荧光显微镜(Nikon UFX-DX；相位差用 的40倍物镜，设为Ph2。)以400倍的倍率拍摄照片。其结果如图9所示，发现1 ng/ml TNF-α抑制了从成肌细胞向肌细胞的分化诱导，但1～3μg/ml(-)- DHM2EQ解除了该分化诱导的抑制。没有分化诱导的C2C12细胞的分化率为0％。
综上所述，可期望通过对以杜兴型为主的肌营养不良患者投以(-)- DHM2EQ，解除TNF-α引起的肌分化抑制，诱导肌再生，改善肌营养不良疾病。
产业上利用的可能性
通过本发明可以提供对于免疫疾病、过敏性疾病、炎症性疾病、肿瘤转移、 疫病、动脉硬化等症状有用的医药组合物，以及医药组合物中作为有效成分含 有的旋光性化合物的制造方法和直接拆分方法。
与相关文献的关系
本申请要求基于2003年2月14日提出申请的日本专利特愿2003-37167号、 2003年2月18日提出申请的日本专利特愿2003-39098号和2003年8月6日提出申请 的日本专利特愿2003-288281号的优先权。这些文献在本说明书中被引用。
DHMEQ的旋光物以往的制造方法如图1所示。首先，将以甲硅烷基暂时保护 了消旋体DHM2EQ(式(2))的酚羟基的化合物(式(16))通过手性色谱柱 拆分，得到旋光化合物(式(17)和式(18))，接着通过分别脱保护得到作 为目标的旋光性(-)-DHM2EQ(式(2))和(+)-DHM2EQ(式(4))。但是 本方法被指出有工艺过程长而造成收率损失的问题(N.Matsumoto et al.， Bioorg.Med.Chem.Lett.10，865-869，2000)。
因此，本发明的主要目的是提供为了使医药组合物含有所述化合物作为有 效成分，能够迅速且高收率地得到既有优良的药理作用、特异性又高的化合物 的方法。此外，本发明的目的还在于提供以所述化合物作为有效成分的医药组 合物。
发明的揭示
本发明人为了克服上述的问题进行了深入的探讨，结果发现使用以式(5) 所表示的基团取代了的多糖的芳香族氨基甲酸酯衍生物作为有效成分的拆分 剂填充的光学活性色谱柱，通过高效液相色谱(HPLC)可以直接光学拆分式(3) 所表示的化合物的外消旋体得到旋光性的化合物(式(2)，式(4))(图2)。
此外，本发明人为了考察旋光性化合物(式(2)，式(4))是否具有比 具有式(3)所表示的化合物的外消旋体的血管内皮细胞的粘附抑制作用更优 异的作用，分别使用式(2)、式(3)、式(4)表示的化合物，考察了人脐 带静脉内皮细胞(HUVEC)和人急性骨髓性白血病细胞HL-60的粘附。结果发 现，式(2)所表示的化合物表现出比式(3)和式(4)所表示的化合物更优 异的血管内皮细胞的粘附抑制作用。
本发明人进一步发现，式(2)所表示的化合物可以抑制多发性骨髓瘤、 甲状腺癌等的肿瘤细胞的增殖。
此外，本发明人发现，通过以式(2)所表示的化合物处理肥大的脂肪细 胞可以诱导肥大的脂肪细胞凋亡。
本发明人进一步发现，对于肥胖或2型糖尿病的模式动物，式(2)所表示 的化合物可以抑制由高脂肪食物引起的体重增加。
此外，本发明人发现，式(2)所表示的化合物可以解除细胞培养中成肌 细胞向肌细胞的分化诱导的抑制。由此，本发明人完成了本发明。
即，本发明所述的医药组合物的特征在于，作为有效成分含有下述通式(1) 所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐，可改善伴随NF-κB活化产生的 症状。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。
此外，所述化合物以下式(2)表示的化合物为佳。
本发明所述的医药组合物的特征在于，通过引起肿瘤细胞凋亡，改善至少 一个症状，或者不使肿瘤细胞凋亡的情况下，改善至少一个由肿瘤细胞引起的 症状。
所述的伴随NF-κB活化产生的症状，例如，也可以是由肿瘤细胞引起的。 所述医药组合物的特征还在于，通过抑制所述肿瘤细胞的增殖，改善所述症状。
此外，所述医药组合物的特征还在于，通过抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞 的粘附，改善所述症状。
所述症状为，例如，选自免疫疾病、过敏性疾病、炎症性疾病、肿瘤转移、 疫病、动脉硬化、血管新生性疾病(肿瘤内的血管新生性疾病)、白血病的症 状。
所述肿瘤为，例如，骨髓瘤、甲状腺癌、乳癌、胰腺癌、恶性肿瘤、前列 腺癌等。
此外，本发明所述的医药组合物的特征还在于，作为有效成分含有下述通 式(1)所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐，所述化合物通过抑制 使NF-κB活化的治疗引起的所述NF-κB的活化，可以增强所述治疗的效果。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。
此外，所述化合物以下式(2)表示的化合物为佳。
所述的使NF-κB活化的治疗可以是使用抗肿瘤剂的治疗，也可以是对肿瘤 细胞通过放射线照射的治疗。还可以作为有效成分含有所述医药组合物和所述 抗肿瘤剂。所述抗肿瘤剂是，例如，喜树碱或者柔红霉素等。
此外，本发明所述的医药组合物的特征还在于，作为有效成分含有下述通 式(1)所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐，改善由TNF-α引起的 疾病。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。此外，所述化合物以下式(2) 表示的化合物为佳。
所述由TNF-α引起的疾病可以是，例如，伴随胰岛素抗性产生的疾病、糖 尿病引起的疾病、肌营养不良等。
上述医药组合物的特征还在于，作为有效成分含有具有优异药理作用的左 旋的化合物，事实上不含右旋的化合物为佳。
本发明所述的用于抑制肿瘤细胞增殖的肿瘤细胞增殖抑制剂的特征在于， 作为有效成分含有下述通式(1)所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的 盐。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。
本发明所述的用于抑制肿瘤细胞增殖的肿瘤细胞增殖抑制剂的特征在还 于，作为有效成分含有具有优异药理作用的左旋的化合物，事实上不含右旋的 化合物为佳。
此外，所述化合物的特征可以在于，是下式(2)表示的化合物。
本发明所述的用于抑制血管内皮细胞的粘附分子的表达的粘附分子表达 抑制剂的特征在于，作为有效成分含有下述通式(1)所表示的旋光性化合物 或其药理学上允许的盐。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。
本发明所述的用于抑制血管内皮细胞的粘附分子的表达的粘附分子表达 抑制剂的特征在还于，作为有效成分含有具有优异药理作用的左旋的化合物， 事实上不含右旋的化合物为佳。
此外，所述化合物的特征可以在于，是下式(2)表示的化合物。
本发明所述的用于诱导肿瘤细胞的凋亡的细胞凋亡诱导剂的特征在于，作 为有效成分含有下述通式(1)所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。
本发明所述的用于诱导肿瘤细胞的凋亡的细胞凋亡诱导剂的特征在还于， 作为有效成分含有具有优异药理作用的左旋的化合物，事实上不含右旋的化合 物为佳。
此外，所述化合物的特征可以在于，是下式(2)表示的化合物。
本发明所述的用于诱导肥大的脂肪细胞的凋亡的诱导剂的特征在于，作为 有效成分含有下述通式(1)所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。所述化合物以下式(2)表 示的化合物为佳。
本发明所述的用于诱导肥大的脂肪细胞的凋亡的诱导剂的特征在还于，作 为有效成分含有具有优异药理作用的左旋的化合物，事实上不含右旋的化合物 为佳。本发明所述的用于诱导肥大的脂肪细胞的凋亡的诱导剂还可以含有TNF- α作为有效成分。
本发明所述的肥胖预防·防止剂的特征在于，作为有效成分含有下述通式 (1)所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。所述化合物以下式(2)表 示的化合物为佳。
本发明所述的肥胖预防·防止剂的特征在还于，作为有效成分含有具有优 异药理作用的左旋的化合物，事实上不含右旋的化合物为佳。
本发明所述的降血糖剂的特征在于，作为有效成分含有下述通式(1)所 表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。所述化合物以下式(2)表 示的化合物为佳。
本发明所述的降血糖剂的特征在还于，作为有效成分含有具有优异药理作 用的左旋的化合物，事实上不含右旋的化合物为佳。
本发明所述的解除细胞分化诱导的抑制的药剂的特征在于，作为有效成分 含有下述通式(1)所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。所述化合物以下式(2)表 示的化合物为佳。
所述的细胞分化诱导的抑制可以是，例如，由TNF-α引起的肌细胞分化的 抑制。本发明所述的解除细胞分化诱导的抑制的药剂的特征在还在于，作为有 效成分含有具有优异药理作用的左旋的化合物，事实上不含右旋的化合物为 佳。
本发明还可以提供通过对式(3)：
所示的化合物的外消旋体直接进行光学拆分，制造式(2)：
或者式(4)：
所示的旋光性化合物的方法。所述光学拆分可以使用光学活性色谱柱。
所述光学活性色谱柱是填充以被下式(5)所表示的基团取代了的多糖的 芳香族氨基甲酸酯衍生物作为有效成分的拆分剂的即可。
式中，R3～R7可以是氢原子或者碳原子数1～8的烷基，也可以是碳原子数 1～8的烷氧基、碳原子数6～14的芳基或者卤素原子等。
所述多糖的芳香族氨基甲酸酯衍生物可以是直链淀粉三(3，5-二甲基苯 基氨基甲酸酯)，也可以是纤维素三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。尤其 以直链淀粉三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)作为有效成分的拆分剂填充的 DAICEL CHIRALPAK AD(ダイセル化学工业(株))为佳。
通过本发明的方法，可以高效地、大量地制造旋光性的DHMEQ。
通过本发明的方法，可以制造式(2)或式(4)所示的旋光性的DHMEQ， 在后述的实施例中揭示了，这些旋光物中，式(2)所示的化合物比式(4)所 示的化合物生物学活性(药理活性)高。
此外，本发明所述的直接拆分方法的特征可以在于，对式(3)
所示的化合物的外消旋体，通过以由下述式(5)所表示的基团取代了的多糖 的芳香族氨基甲酸酯衍生物作为有效成分的拆分剂直接光学拆分。
式中，R3～R7可以是氢原子或者碳原子数1～8的烷基，也可以是碳原子数 1～8的烷氧基、碳原子数6～14的芳基或者卤素原子等。
所述多糖的芳香族氨基甲酸酯衍生物可以是直链淀粉三(3，5-二甲基苯 基氨基甲酸酯)，也可以是纤维素三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。
本发明所述的治疗方法中，使用下述通式(1)所表示的旋光性化合物或 其药理学上允许的盐，改善伴随NF-κB活化产生的症状。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。
此外，所述化合物以下式(2)表示的化合物为佳。
本发明所述的治疗方法，可以通过引起肿瘤细胞凋亡，改善至少一个症状， 也可以在不使肿瘤细胞凋亡的情况下，改善至少一个由肿瘤细胞引起的症状。
所述的伴随NF-κB活化产生的症状，例如，也可以是由肿瘤细胞引起的。
所述治疗方法，可以通过抑制所述肿瘤细胞的增殖，改善所述症状，也可 以通过抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的粘附，改善所述症状。
所述疾病为，例如，选自免疫疾病、过敏性疾病、炎症性疾病、肿瘤转移、 疫病、动脉硬化、血管新生性疾病(肿瘤内的血管新生性疾病)、白血病的症 状。
所述肿瘤为，例如，骨髓瘤、甲状腺癌、乳癌、胰腺癌、恶性肿瘤、前列 腺癌等。
此外，本发明所述的治疗方法中，使用作为有效成分含有下述通式(1) 所表示的旋光性化合物或其药理学上允许的盐的医药组合物，所述医药组合物 通过抑制使NF-κB活化的治疗引起的所述NF-κB的活化，可以增强所述治疗的 效果。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。
此外，所述化合物以下式(2)表示的化合物为佳。
所述的使NF-κB活化的治疗可以是使用抗肿瘤剂的治疗，也可以是对肿瘤 细胞通过放射线照射的治疗。还可以作为有效成分含有所述医药组合物和所述 抗肿瘤剂。所述抗肿瘤剂是，例如，喜树碱或者柔红霉素等。
此外，本发明所述的治疗方法中，使用下述通式(1)所表示的旋光性化 合物或其药理学上允许的盐，用于改善由TNF-α引起的疾病。
式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举乙酰基、丙酰基、 丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。此外，所述化合物以下式(2) 表示的化合物为佳。
所述由TNF-α引起的疾病可以是，例如，伴随胰岛素抗性产生的疾病、糖 尿病引起的疾病、肌营养不良等。
上述的治疗方法中，使用具有优异药理作用的左旋的化合物，事实上不含 右旋的化合物为佳。
附图的简单说明
图1是DHM2EQ的旋光物的以往的制造方法的反应流程图。
图2是本发明的旋光性的DHM2EQ(式(2)，式(4))的制造方法的反应 流程图。
图3是(-)-DHM2EQ和(+)-DHM2EQ的HPLC特点图。
图4是(-)-DHM2EQ对HUVEC和HL-60细胞的粘附的抑制效果图。
图5是(-)-DHM2EQ对骨髓瘤模式小鼠的抗肿瘤效果图。
图6是(-)-DHM2EQ对甲状腺癌模式小鼠的抗肿瘤效果图。
图7是(-)-DHM2EQ对于肥大的脂肪细胞的凋亡诱导作用的分析结果的图 示。
图8是(-)-DHM2EQ对肥胖型糖尿病模式小鼠的体重增加的抑制作用的图 示。
图9是(-)-DHM2EQ解除从成肌细胞向肌细胞的分化诱导抑制的效果图。
实施本发明的最佳方式
以下，例举实施例的同时，对基于上述认知而完成的本发明的实施方式进 行详细说明。实施方式和实施例中没有特别说明的情况下，使用记载于以下标 准操作程序集中的方法，或者对其进行改进或修改后的方法：J.Sambrook， E.F.Fritsch &T.Maniatis(Ed.)，Molecular cloning，a laboratory manual (3rd edition)，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York(2001)；F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman， J.A.Smith，K.Struhl(Ed.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons Ltd.等。此外，在使用市场上销售的试剂盒和测定装置的情况 下，没有特别的说明时，则使用它们所附的操作程序。
本发明的目的、特征、优点和其思路通过本说明书的记载，从业者可以了 解，从本说明书的记载，只要是从业者就可以容易地再现本发明。以下记载的 发明的实施方式和具体的实施例等是本发明的优选实施方式，是为了示例或说 明而例举的，本发明并不局限于这些实施方式。在本说明书中所揭示的本发明 的意图及范围内，基于本说明书的记载，可以进行各种改进和修改，这一点对 于从业者是可以了解的。
已知NF-κB是与机体防御反应相关的核转录因子，通过NF-κB诱导的基因 除了免疫球蛋白之外，还有细胞因子(IL(白细胞介素)-1、IL-2、IL-6、 IL-8、TNF(肿瘤坏死因子)-α等)、细胞粘附因子(E-选择蛋白、ICAM (细胞间粘附分子)-1、VCAM(血管细胞粘附分子)-1等)、一氧化氮(NO) 合成酶、Fas配体等许多与免疫应答和炎症反应关系密切的基因(Cell，87， 13-20，1996)。此外，在膀胱癌、乳癌、黑色素瘤等中所报道的NF-κB通常 被活化，这被认为与凋亡的抑制、细胞增殖的促进、细胞分化的抑制等肿瘤形 成的各个方面相关，促进肿瘤形成(J.Clin.Invest.107，241-246，2001)。 另一方面，报道了通过导入抑制NF-κB活化的蛋白IκB的基因特异地诱导细胞 凋亡，所以希望具有NF-κB活化抑制作用的化合物能够成为具有抗炎症作用和 抗肿瘤活性的药品和药剂。
具有NF-κB活化抑制作用的化合物过去已知有水杨酰胺衍生物 (WO01/12588A1)、泛顶环氧菌素(panepoxydone；Biochem.Biophys.Res. Commun.226，214-221，1996)、环顶环氧菌素(cycloepoxydon；J.Antibiot. 51，455-463，1998)、SN-50(J.Biol.Chem.270，14255-14258，1995) 等。
上述水杨酰胺衍生物是以无毒性的抗菌素环氧醌霉素(epoxyquinomicin) 的结构为基础设计的，近年来本发明人了解到该化合物的外消旋体具有抗炎症 作用、免疫抑制作用、抗肿瘤活性、抗动脉硬化作用、肿瘤转移抑制作用、抗 疫病作用、抗过敏作用和血管新生抑制作用。
外消旋体中2种对映体((+)-体和(-)-体)共同存在，一般这些对映 体的沸点、熔点等物理性质几乎完全相同。但是，(+)-体和(-)-体通常对 机体的作用不同。例如，已知像“沙利度胺(反应停)的悲剧”，一个对映体 具有催眠作用和镇静作用，而另一个对映体具有致畸作用(诱发胎儿畸形的作 用)。此外，已知药品和农药中，通过使用含有外消旋体中的一个对映体作为 有效成分的药剂，可以得到更好的效果，而且副作用少。因此，对于药品等， 制备光学纯的化合物成为非常重要的课题。
本发明人已经尝试将前述水杨酰胺衍生物的外消旋体拆分为(+)-体和(-) -体(Bioorg.Med.Chem.Lett.10，865-869，2000)。但是，所述化合物 的拆分方法必须制成将所述化合物的外消旋体的酚羟基以甲硅烷基暂时保护 的化合物。因此，本发明人使用填充将各种衍生物作为有效成分的拆分剂的光 学活性色谱柱，考察是否可以将所述化合物的外消旋体直接拆分为(+)-体和 (-)-体。结果发现，通过使用将以式(6)
所表示的基团取代了的多糖的芳香族氨基甲酸酯衍生物作为有效成分的拆分 剂，可以将所述化合物的外消旋体直接光学拆分为(+)-体和(-)-体。
如果从取代基团使分子的形状发生变化，或者取代基团本身具有的物理化 学性质和取代基团对芳环的π电子的影响等复杂组合考虑分离和吸附的特性 的显著变化和取代的关系，下述通式(5)
所示的取代基团(-R3、-R4、-R5、-R6和-R7)可以是氢原子或者碳原子数1～ 8的烷基，也可以是碳原子数1～8的烷氧基、碳原子数6～14的芳基或者卤素原 子等。
作为多糖的芳香族氨基甲酸酯衍生物的原料的多糖可以是合成多糖、天然 多糖和天然改性多糖中的任一种，但具有旋光性的多糖为佳，更好为容易得到 高纯度多糖的直链淀粉和纤维素等。此外，作为容易得到高纯度多糖的原料， 较好是β-1，4-壳聚糖、壳多糖、β-1，4-甘露聚糖、β-1，4-木聚糖， 菊粉、凝胶多糖(Curdlan)等。此外，在本实施例中，使用直链淀粉三(3， 5-二甲基苯基氨基甲酸酯)作为多糖的芳香族氨基甲酸酯衍生物进行本发明 的直接拆分方法，也可以适用纤维素三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)。
在这里，对在拆分剂中作为有效成分所含有的多糖的氨基甲酸酯衍生物进 行说明，还可以使用酯类衍生物和醚类衍生物、除芳香族氨基甲酸酯外的氨基 甲酸酯衍生物等多糖衍生物。
承载这些拆分剂的载体一般使用有机载体或者无机载体，无机载体较好。 这样的无机载体有例如硅胶、氧化铝、氧化镁、氧化钛、玻璃、硅酸盐、高岭 土等。载体的粒径随使用的色谱柱的大小而不同，一般为0.5μm～10mm，较好 为1μm～300μm，更好为5μm～20μm。此外，其性状以多孔质为佳，这样的 情况下孔的平均细孔径较好为10～100μm，更好为50～50000。将所述多糖 的芳香族氨基甲酸酯衍生物承载于载体的方法，可以使用例如将多糖的芳香族 氨基甲酸酯衍生物溶解于溶剂中制作胶浆，将其一边搅拌一边慢慢滴入载体， 使其在载体上均匀包覆的方法等常规的方法。
此外，通过适用上述直接拆分方法，可以由式(3)所示的化合物的外消 旋体简便地制造旋光性化合物(式(2)和式(4))。以下对该方法进行详细 叙述。
＝＝＝式(2)和式(4)所示的化合物的制造方法＝＝＝
通式(12)所示的化合物可以按照Wipf等的合成法(Synthesis，12号，1549 -561页，1995年)制造。
对通式(12)所示的化合物的制造方法的一例基于下述的反应方程式进行 说明。
在下述的反应方程式中，R1为氢原子或者C2～4的烷酰基，烷酰基可以例举 乙酰基、丙酰基、丁酰基及它们的异构体基团，尤其以乙酰基为佳。R2为C1～4 的烷基，烷基可以例举甲基、乙基、丙基、丁基及它们的异构体基团，以甲基、 乙基为佳，更好为甲基。此外，X为卤素原子，卤素原子可以例举氟原子、氯 原子、溴原子和碘原子，氯原子、溴原子为佳，更好为氯原子。
步骤(a)：N-(2-烷酰基苯甲酰基)-2，5-二甲氧基苯胺的制造
将2，5-二甲氧基苯胺溶解于溶剂(例如吡啶等)中，在-78℃～50℃下， 较好在冰浴冷却下，加入式(7)的O-烷酰基水杨酰卤的乙酸乙酯溶液，边搅 拌边反应。加水停止反应后，加入乙酸乙酯，依次以盐酸、水、碳酸氢钠溶液、 水洗涤，干燥后通过减压浓缩和真空干燥，得到式(8)所示的N-(2-烷酰 基苯甲酰基)-2，5-二甲氧基苯胺。该化合物不纯化，可以在接着的步骤中 使用。
步骤(b)：3-(O-烷酰基水杨酰胺基)-4，4-二烷氧基-2，5-环己二烯 酮的制造
将上述得到的式(8)的化合物溶解于溶剂(例如甲醇、乙醇等)中，在 -20℃～50℃下，较好在冰浴冷却下，加入二乙酰氧基碘苯，在室温下边搅拌 边反应。减压浓缩后，加入乙酸乙酯，依次以碳酸氢钠溶液、氯化钠溶液洗涤， 减压浓缩溶剂层，所得残渣以柱色谱法精制，得到式(9)所示的3-(O-烷 酰基水杨酰胺基)-4，4-二烷氧基-2，5-环己二烯酮。
步骤(c)：5，6-环氧基-4，4-二烷氧基-3-烷酰基水杨酰胺基-2-环己 烯酮的制造
将式(9)的化合物溶解于溶剂(例如四氢呋喃、甲醇等)中，在-20℃～ 50℃下，较好在冰浴冷却下，加入过氧化氢溶液和氢氧化钠，边搅拌边反应。 向反应液中加入乙酸乙酯，依次以盐酸溶液、硫代硫酸钠溶液、氯化钠溶液洗 涤，在空气中干燥后真空干燥。为了除去残存的原料化合物，将残渣溶解于丙 酮中，加入对甲苯磺酸，在室温下搅拌，分解原料化合物。减压蒸馏除去甲醇 得到的残渣中加入乙酸乙酯，用水洗涤。将干燥乙酸乙酯层得到的残留物用柱 色谱法纯化，得到式(10)所示的5，6-环氧基-4，4-二烷氧基-3-烷酰基 水杨酰胺基-2-环己烯酮。
步骤(d)：5，6-环氧基-2-烷酰基卤化水杨酰胺-2-环己烯-1，4-二酮 的制造
将式(10)的化合物溶解于溶剂(例如二氯甲烷等)中，冰浴冷却下加入 无机酸或有机酸(例如三氟化硼二乙醚配位体等)，边搅拌边反应。向反应液 中加入溶剂(例如乙酸乙酯等)，以水洗涤，浓缩溶剂层后，将得到的残渣以 甲醇洗涤得到式(11)所示的化合物5，6-环氧基-2-烷酰基水杨酰胺基-2 -环己烯-1，4-二酮。
步骤(e)：5，6-环氧基-4-羟基-3-烷酰基水杨酰胺基-2-环己烯酮的 制造
将式(11)的化合物悬浮于溶剂(例如甲醇、乙醇、THF等)中，在-78 ℃～50℃下，较好在冰浴冷却下，加入还原剂(例如硼氢化钠等)使其反应。 向反应液中加入溶剂(例如乙酸乙酯、二氯甲烷等)，依次以盐酸、水洗涤， 干燥溶剂层后减压浓缩，以甲醇悬浮、搅拌、洗涤，得到式(12)所示的5，6 -环氧基-4-羟基-3-烷酰基水杨酰胺基-2-环己烯酮。
通过使用O-乙酰基水杨酰氯作为式(7)的O-烷酰基水杨酰卤，在步骤 (b)中使用甲醇作为溶解式(8)的化合物的溶剂，可以制造式(3)所示的 化合物((±)-DHM2EQ；“DHM2EQ”亦称“DHMEQ”)。
式(3)的化合物的光学拆分通过使用光学活性色谱柱的高效液相色谱 (HPLC)进行。由此，得到式(2)和式(4)的化合物。光学活性色谱柱可以 使用以由通式(5)所示基团取代了的多糖的芳香族氨基甲酸酯衍生物作为有 效成分的拆分剂，例如DAICEL CHIRALPAK AD(10mm i.d.×250mm)。使用DAICEL CHIRALPAK AD的情况下，可以将添加0.1～0.9v/v％乙酸的甲醇作为流动相(例 如流速：0.5～2.5ml/min)，来配制式(3)的化合物的甲醇溶液(例如浓度5～ 20mg/ml)，将其以每次50～200μl分5～20次注射，制备式(2)和式(4)的 化合物。
通过JASCO DIP-360旋光仪测定式(2)和式(4)的化合物的旋光度，可 以算出光学纯度。式(2)所示的化合物的旋光性为左旋，所以将其记作(-) -体。式(4)所示的化合物的旋光性为右旋，所以将其记作(+)-体。
＝＝＝关于式(2)所示化合物的药理作用＝＝＝
(-)-DHM2EQ可以改善(包括预防和抑制进展)，伴随NF-κB活化产生的 症状、伴随胰岛素抗性产生的疾病、糖尿病引起的疾病和肌营养不良，具体地 伴随NF-κB活化产生的症状有乳癌、胰腺癌、恶性淋巴瘤、前列腺癌、甲状腺 癌、骨髓瘤等肿瘤细胞引起的症状，和免疫疾病、过敏性疾病、炎症性疾病、 肿瘤转移、疫病、动脉硬化、血管新生性疾病(尤其是肿瘤内的血管新生性疾 病)、白血病(尤其是成人T细胞白血病(Adult T cell leukemia))等的症 状，具有比(±)-DHM2EQ更好的效果。
因此，(-)-DHM2EQ被用作肿瘤细胞增殖抑制剂、粘附分子的表达抑制剂、 细胞凋亡诱导剂、肥胖预防·防止剂、降血糖剂、解除分化诱导抑制的药剂等 时，比(±)-DHM2EQ更有效。
此外，对于肿瘤细胞引起的症状的改善，引起或不引起肿瘤细胞的凋亡都 可以。不引起凋亡的情况可以例举，例如抑制细胞粘附引起的肿瘤转移抑制、 不伴随凋亡的肿瘤增殖抑制、癌症疫病改善、血管新生抑制引起的肿瘤细胞坏 死等，但并不局限于此。不引起肿瘤细胞的凋亡是指，即使向病灶投以(-) -DHM2EQ，其效果不依赖于该病灶的肿瘤细胞的凋亡，除了不依赖于凋亡的效 果，发生肿瘤细胞的凋亡也可以。
以下，对(-)-DHM2EQ的各种作用效果进行详细说明。
<细胞粘附抑制作用>
如果对血管内皮细胞施加炎症性刺激或物理刺激等，则血管内皮细胞膜上 的细胞粘附分子的表达增强，白细胞粘附于血管内皮细胞的表面上，向血管外 移动。这是因为，在血管内皮细胞内，通过活化转录因子NF-κB，ICAM-1、 VCAM-1、E-选择蛋白等粘附分子的表达增强。白细胞向血管壁的粘附通过脂类 的积聚等引起动脉硬化，所以-直认为只要抑制了白细胞和血管内皮细胞的粘 附，就可以实现动脉硬化的预防/抑制。
此外，已知肿瘤细胞的粘附引起从血管的穿出、转移。报道有例如，转移 能力强的大肠癌中E-选择蛋白的配体唾液酸路易斯寡糖-X有高表达，认为如 果在血管内皮细胞中活化NF-κB，则血管内皮细胞膜上的E-选择蛋白的表达增 强，大肠癌细胞粘附到血管内皮细胞的表面上，变得容易向血管外穿出，转移 被促进。
如果抑制血管内皮细胞的细胞粘附活性，可能实现动脉硬化和肿瘤转移的 预防/抑制，那样的NF-κB抑制剂被认为可能对动脉硬化和肿瘤细胞的转移的 预防和抑制是有用的。
因此，本发明人使用由上述制造方法得到的式(2)的化合物(下称“(-) -DHM2EQ”)和式(4)的化合物(下称“(+)-DHM2EQ”)、以及式(3)的 化合物(下称“(±)-DHM2EQ”)，考察这些化合物对人脐带静脉内皮细胞 (HUVEC)的细胞粘附活性的影响。考察了各化合物对于经TNF-α刺激了的血 管内皮细胞与肿瘤细胞粘附的影响，结果(-)-DHM2EQ比(+)-DHM2EQ强约10 倍，比(±)-DHM2EQ强约3倍，抑制了血管内皮细胞与肿瘤细胞的粘附。由此， 可以知道(-)-DHM2EQ具有比(±)-DHM2EQ更好的血管内皮细胞粘附抑制作 用。因此，(-)-DHM2EQ作为血管内皮细胞粘附抑制剂比(±)-DHM2EQ更有 用，作为抗动脉硬化剂和肿瘤转移抑制剂也更有用。
<抗炎症作用和免疫疾病抑制作用>
本发明人向通过II型胶原诱发关节炎的慢性风湿性关节炎的模式小鼠投 以(±)-DHM2EQ，观察症状，发现(±)-DHM2EQ对关节炎的症状的抑制是有 效的。认为这可能是(±)-DHM2EQ通过NF-κB的活性抑制表现出的效果，具 有比(±)-DHM2EQ强数倍～十数倍的活性抑制效果的(-)-DHM2EQ作为抗炎 症剂对于关节炎的症状在预防/抑制方面更有效。
如上所述，可以期待(-)-DHM2EQ成为对于免疫疾病、炎症性疾病(也包 括过敏性炎症疾病)等症状有效的免疫疾病抑制剂和抗炎症剂。
<肿瘤细胞增殖抑制作用和抗肿瘤作用>
近年来，本发明人了解到(±)-DHM2EQ抑制NF-κB活化的何杰金氏淋巴 瘤细胞的增殖，但不抑制NF-κB未活化的髓细胞性白血病细胞的增殖。因此， 认为(±)-DHM2EQ可以用作NF-κB活化的肿瘤细胞的增殖抑制剂，通过NF-κ B的抑制发挥作用。
此外，本发明人了解到(±)-DHM2EQ在体外和体内可以不依赖细胞凋亡 地抑制人乳癌细胞的增殖。因此，认为(±)-DHM2EQ可以用作乳癌的预防·治 疗剂。
此外，本发明人了解到(-)-DHM2EQ对于骨髓瘤的模式小鼠可以抑制肿瘤 的增殖(参见实施例3)。多发性骨髓瘤伴随骨破坏引起的痛楚，非常痛苦， 目前还没有根本性的治疗方法。因此，可以期待(-)-DHM2EQ成为针对多发性 骨髓瘤等骨髓瘤的抗肿瘤剂。
本发明人还了解到(-)-DHM2EQ对于甲状腺癌的模式小鼠可以抑制肿瘤的 增殖(参见实施例4)。甲状腺癌作为-种难以治疗的癌症，目前还没有有效 的治疗方法。因此，可以期待(-)-DHM2EQ成为针对甲状腺癌的抗肿瘤剂。
综上所述，可以期待与(±)-DHM2EQ相比NF-κB的活化抑制效果更强的 (-)-DHM2EQ成为更好的肿瘤细胞增殖抑制剂。本发明所适用的肿瘤细胞可以 例举例如甲状腺癌细胞、前列腺癌细胞、乳癌细胞、恶性肿瘤细胞、胰腺癌细 胞等，但并没有特别限定，只要是NF-κB活化的肿瘤细胞都可以。所述恶性肿 瘤细胞较好是以恶性淋巴瘤细胞为治疗对象，其中更好为何杰金氏淋巴瘤细 胞、骨髓瘤细胞。此外，无法作为激素疗法的治疗对象的激素非敏感性的肿瘤 可以成为(-)-DHM2EQ的治疗对象，所以这是与激素疗法相比的巨大优点。 <细胞凋亡诱导作用以及抗肥胖作用和抗胰岛素抗性作用>
近年来，本发明人了解到(±)-DHM2EQ可以诱导NF-κB活化的白血病细 胞的凋亡。因此，可以期待NF-κB的活化抑制效果强的(-)-DHM2EQ具有比(±) -DHM2EQ更好的细胞凋亡诱导作用。
以往的化学疗法对于细胞以普遍的增殖机制作为目标，不仅是肿瘤细胞， 对正常细胞的影响也很大，未必是有效的治疗手段。但是，本发明人得到的实 验结果是(±)-DHM2EQ以与诱导白血病细胞凋亡同样的浓度完全不诱导人正 常白细胞的凋亡，表明对肿瘤细胞的特异性高。因此，认为比活性更高的(-) -DHM2EQ对于白血病细胞等恶性淋巴瘤细胞特异性更高，对正常细胞的副作用 更小。由此，本发明所述的细胞凋亡诱导剂可以适用于恶性淋巴瘤细胞、白血 病细胞或骨髓瘤细胞的凋亡诱导，对于恶性淋巴瘤、白血病或骨髓瘤特异性高， 所以可以期待优异的治疗效果。
作为治疗对象的恶性肿瘤可以例举恶性淋巴瘤、白血病或骨髓瘤等。所述 恶性淋巴瘤包括非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤等，骨髓瘤包括多发性骨 髓瘤等浆细胞性肿瘤等，白血病包括急性淋巴性白血病、成人T细胞白血病淋 巴瘤、慢性淋巴性白血病等。
此外，如果以(-)-DHM2EQ处理肥大的脂肪细胞，可以诱导细胞凋亡。因 此，可以用作诱导肥大的脂肪细胞凋亡的细胞凋亡诱导剂。
另一方面，具体的机制还不清楚，但已知从由于肥胖等而肥大(大型化) 的脂肪细胞向血液分泌出炎症性细胞因子TNF-α，由于该TNF-α抑制通过胰岛 素受体的信号传导通路，产生胰岛素抗性(胰岛素敏感性下降)。通过胰岛素 受体的信号传导通路，通常使存在于骨骼肌细胞内的糖转运载体(GLUT)快速 地在细胞膜上移动，也具有促进糖(葡萄糖等)向骨骼肌细胞内的摄入的功能， 因此作为产生胰岛素抗性的一个原因，认为是由于TNF-α抑制了糖转运载体在 细胞膜上的移动，抑制了糖被细胞摄入。
因此，如果(-)-DHM2EQ诱导肥大的脂肪细胞的凋亡，则由于从脂肪细胞 向血液中分泌的TNF-α的量减少，防止糖向细胞内的摄入作用的抑制，不仅可 以作为肥胖预防·防止剂、降血糖剂，还可以带来伴随胰岛素抗性产生的疾病、 或者糖尿病引起的疾病等的症状的改善。伴随胰岛素抗性产生的疾病有例如2 型糖尿病、高胰岛素血症、脂类代谢异常、肥胖、高血压、动脉硬化性疾病等， 糖尿病引起的疾病有例如糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经障 碍，可以期待(-)-DHM2EQ对这些症状有优异的治疗效果。
<抗ATL作用>
本发明人使用(±)-DHM2EQ考察了其对成人T细胞白血病淋巴瘤(ATL) 细胞的NF-κB的活化的影响。发现(±)-DHM2EQ抑制ATL细胞的NF-κB的活化。 此外，使用(±)-DHM2EQ考察了其对ATL细胞增殖的影响，发现(±)-DHM2EQ 可以不抑制正常细胞的增殖，而特异性地抑制ATL细胞的增殖。进一步，考察 了对ATL细胞的凋亡诱导的影响，发现(±)-DHM2EQ可以不诱导正常细胞的凋 亡而诱导ATL细胞的凋亡。由此，认为(±)-DHM2EQ具有抗ATL活性(作用)。
综上所述，认为与(±)-DHM2EQ相比NF-κB的活化抑制效果强的(-) -DHM2EQ可以作为更有效的抗ATL剂。
<抗疫病作用>
疫病(cachexia；亦称恶液质)是在恶性肿瘤、结核、糖尿病、血液疾病、 内分泌·代谢疾病等慢性病中，表现出以食欲不振、进行性体重减轻、贫血、 皮肤干燥、浮肿等为主要症状的全身不良的疾病。它是尤其在恶性肿瘤的末期 患者等中常见的症状，表现出以体重减少、贫血为主的全身机能的下降。如果 癌症患者出现疫病，则并发症的可能性增加，对于化学疗法的反应变差。而且 有时由于全身衰弱，对于癌症的化学疗法和放射线治疗的副作用变大，也有因 为疫病而导致死亡的。
目前为止，发生疫病的具体机理并不完全清楚，但近年来终于得到关于该 机理的，包括白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等一些细胞 因子参与的线索(最新医学1999年第54卷10号第2502-2507页)。例如， 疫病中各种症状的出现机理为，由于疫病诱导表达，过度表达的细胞因子作用 于中枢神经系统，引起进食减少、发热、低血压、无力等症状，还导致糖类、 蛋白质、脂类的分解代谢亢进的状态。
对于抑制这样的疫病中的症状施予类固醇是有效的。如果给疫病患者服用 类固醇，则通过类固醇的免疫反应抑制作用和由其引起的抗炎症作用，还有对 疫病诱导的细胞因子生成的抑制作用，癌症疫病的代谢异常得到调整，体重减 轻、食欲不振、无力、味觉异常、贫血等疫病症状得到减轻、改善。但是，长 期服用类固醇，其巨大的副作用成为大问题。由于类固醇是原来人体具有的激 素，摄入的类固醇表现出与过量的激素同样的作用效果，例如因为与肾脏中的 盐的再吸收相关，作为副作用有时会出现浮肿和高血压。
另一方面，利用ω3不饱和脂肪酸抑制IL-6等炎症性细胞因子的生成，影 响急性期反应蛋白的合成，施予EPA(二十碳五烯酸)对疫病的改善有一定效 果的提高。但是这样的营养制剂的作用是间接的，所以难以期待显著而实际的 效果。
因此，需要开发与类固醇那样具有广谱作用的药剂不同的，对疫病具特异 性的，效果显著的药剂。在这样的需求下，本发明人向诱发疫病的症状的模式 小鼠投以(±)-DHM2EQ，观察其症状，发现(±)-DHM2EQ对于疫病症状的预 防/改善是有效的。所以，认为与(±)-DHM2EQ相比NF-κB的活化抑制效果 强的(-)-DHM2EQ对于疫病症状的预防/改善是更有效的。
<血管新生抑制作用>
由于(±)-DHM2EQ能够抑制NF-κB的活化，所以认为能够抑制由NF-κB 的活化引起的环氧合酶-2(COX-2)的基因表达。此外，由于抑制环氧合酶- 2的基因表达，认为能够抑制位于COX-2下游的前列腺素的合成。在肿瘤内，NF- κB的活化通过促进前列腺素的合成致使血管新生活跃，认为(±)-DHM2EQ通 过NF-κB的活化抑制能够抑制由前列腺素促进的肿瘤血管的新生。因此，认为 (±)-DHM2EQ可以用作通过抑制肿瘤内血管的新生，抑制向肿瘤的氧和营养 的供给表现出抗肿瘤作用的癌症治疗药物。
综上所述，认为与(±)-DHM2EQ相比NF-κB的活化抑制效果强的(-) -DHM2EQ作为肿瘤内的血管新生的抑制剂更有效。
<抗肌营养不良作用>
本发明人了解到通过使用(-)-DHM2EQ可以解除由成肌细胞向肌细胞的分 化诱导的抑制。因此，(-)-DHM2EQ可以用作解除由成肌细胞向肌细胞的分化 诱导的抑制的药剂。此外，(-)-DHM2EQ可以用于改善由成肌细胞向肌细胞的 分化诱导的抑制引起的肌营养不良，可以期待好的治疗效果。
<本发明所述医药组合物和活化NF-κB的治疗的合用效果>
以往，作为肿瘤的治疗方法已知化学疗法和放射疗法等。但是，如果使用 化学疗法和放射疗法，则肿瘤细胞中NF-κB被活化，癌症治疗的效果降低(J. Clin.Invest.107，241-246，2001)。例如，放射疗法是为杀死肿瘤细胞而 进行的，但是由于放射线照射引起的氧化应激反应NF-κB被活化，肿瘤细胞变 得难以诱导凋亡而抵抗放射线治疗。由此，如果对肿瘤细胞照射放射线，有时 放射线渐渐变得难以见效。因此，需要开发解除这样的对于癌症治疗的抗性。
近年来，本发明人通过将(±)-DHM2EQ用于化学疗法和放射疗法等活化 NF-κB的肿瘤治疗，发现该肿瘤治疗的效果提高。因此，认为通过将与(±) -DHM2EQ相比NF-κB的活化抑制效果强的(-)-DHM2EQ与化学疗法和放射疗法 等活化NF-κB的治疗合用，对进一步加强该治疗的效果是有效的。
用于上述化学疗法的抗肿瘤剂只要是活化NF-κB的药剂即可，有例如喜树 碱(CPT)和柔红霉素(DNR或DM)等抗肿瘤剂。
与(-)-DHM2EQ合用的药剂并不局限于抗癌剂，只要是由于施药引起NF- κB活化并因此对治疗产生抗性的药剂都可以。例如，通过(-)-DHM2EQ与对 用于感染性疾病、过敏性疾病、免疫疾病、炎症性疾病、肿瘤转移、疫病、动 脉硬化、血管新生性疾病(尤其是肿瘤内的血管新生性疾病)、白血病(尤其 是成人T细胞白血病(Adult T cell leukemia))等疾病的治疗合用，可以期 待提高治疗的效果。关于投药的时机，(-)-DHM2EQ可以在活化NF-κB的治疗 的同时施药，也可以在活化NF-κB的治疗后用于抑制NF-κB的活化。此外，为 了抑制NF-κB的活化还可以预先施药。治疗对象可以是患有上述疾病的人或其 他哺乳动物。
＝＝＝式(13)所示的化合物的外消旋体的制造方法＝＝＝
以上的叙述中，对通过将式(3)所示的化合物的外消旋体直接拆分，从 而制造旋光性的(-)-体和(+)-体的化合物的方法进行了说明，还可以将式 (13)
所示的化合物的外消旋体((±)-DHM3EQ)同样地直接拆分，制造式(14)
所示的(-)-体的化合物((-)-DHM3EQ)和式(15)
所示的(+)-体的化合物((+)-DHM3EQ)。以下，对式(13)所示的化合物 的外消旋体的制造方法用下述的反应式进行说明。在下述的反应式中，R2为C1～ 4的烷基，烷基可以例举甲基、乙基、丙基、丁基及它们的异构体基团，较好 为甲基、乙基，更好为甲基。
步骤(f)：3，3-二烷氧基-4，5-环氧基-6-羟基-2-水杨酰胺基环己烯 的制造
将式(16)所示的5，6-环氧基-4，4-二烷氧基-3-水杨酰胺基-2-环 己烯酮溶解于甲醇等溶剂和碳酸氢钠溶液的混合溶剂中，在-78℃～50℃下， 较好在冰浴冷却下，加入还原剂(硼氢化钠等)，边搅拌边反应。向该反应液 中加入溶剂(乙酸乙酯等)，依次以盐酸、水洗涤，干燥溶剂层后减压浓缩、 真空干燥，用柱色谱法等纯化，得到式(17)所示的3，3-二烷氧基-4，5-环 氧基-6-羟基-2-水杨酰胺基环己烯化合物。
步骤(g)：5，6-环氧基-4-羟基-2-水杨酰胺基-2-环己烯酮(式(13)， DHM3EQ)的制造
将式(17)的化合物溶解于溶剂(丙酮等)，加入p-甲苯磺酸，在室温 下边搅拌边反应。向反应液中加入溶剂(乙酸乙酯等)，以水洗涤，将溶剂层 干燥、减压浓缩、纯化，可以得到式(13)的5，6-环氧基-4-羟基-2-水 杨酰胺基-2-环己烯酮(DHM3EQ)。
这样制造的(±)-DHM3EQ也可以通过使用将以被下式(5)所表示的基团 取代了的多糖的芳香族氨基甲酸酯衍生物作为有效成分的拆分剂填充的光学 活性色谱柱，或间歇式使用所示拆分剂，直接光学拆分为(+)-DHM3EQ和(-) -DHM3EQ。光学活性色谱柱以使用可以将(±)-DHM2EQ直接光学拆分为(+) -DHM2EQ和(-)-DHM2EQ的色谱柱为佳，拆分剂使用可以将(±)-DHM2EQ直接 光学拆分为(+)-DHM2EQ和(-)-DHM2EQ的拆分剂为佳。
这样纯化了的(-)-DHM3EQ(式(14))或(+)-DHM3EQ(式(15))具 有与(-)-DHM2EQ同样的比外消旋体的化合物更优异的药理作用，对于改善伴 随NF-κB活化产生的症状更有效。
＝＝＝其他的实施方式＝＝＝
在以上的叙述中，对通式(1)所示的化合物的R1为乙酰基的化合物的药理 作用进行了说明，但是认为通式(1)所示的化合物的R1为氢原子、丙酰基或丁 酰基或它们的异构体基团的化合物也具有同样的药理作用。
本发明的化合物的形态也可以是药理学上允许的盐，例如季铵盐等有机 盐、或碱金属等金属盐。这样的化合物的盐可以以公知的方法制造。
<实施例1>
通过上述的方法合成(±)-5-脱羟基甲基环氧醌霉素C (dehydroxymethyl derivatives of epoxyquinomicin C；DHM2EQ)。得到的 (±)-DHM2EQ的光学拆分通过将添加0.5v/v％乙酸的甲醇作为流动相(流速： 1.0ml/min)，使用DAICEL CHIRALPAK AD(10mm i.d.×250mm)的高效液相色 谱(HPLC)(检测波长：315nmUV，柱温：40℃)进行。将20mg(±)-DHM2EQ 溶解于2ml甲醇，将其分为20次，每次100μl注射，分取3.8分和5.7分的峰的 部分，以85％的回收率得到(+)-DHM2EQ和(-)-DHM2EQ。分离的情况如图3 所示。
这样得到的两物质的旋光度((-)-DHM2EQ：[α]20 D-241°(c0.1MeOH)， (+)-DHM2EQ：[α]20 D+239°(c0.1MeOH))与文献(Bioorg.Med.Chem.Lett. 10，865-869，2000)记载的一致，光学纯度(ee)在99％以上。
<实施例2>
在本实施例中，考察了(-)-和(+)-DHM2EQ对于由TNF-α刺激了的血 管内皮细胞和肿瘤细胞的粘附的效果。
(1)细胞培养
将正常人脐带静脉内皮细胞(HUVEC；Cell systems，Lake Kirland，WA) 使用以I型胶原(株式会社高研，东京，日本)覆盖的塑料烧瓶(Costar，纽 约，美国)，使用含有灭活的10％牛胎血清(FBS；JRH BIOSCIENCES，Lenexa，KS)、 10μg/ml bFGF(Pepro Tech ED LTD，Lodon，UK)的MCDB-131培养基(Sigma， St.Louis，MO)，在37℃、5％CO2的恒温箱中培养。将人急性早幼粒细胞性白 血病细胞株HL-60细胞(Japanese Collection of Research Bioresources) 使用含有灭活的10％FBS的RPMI 1640培养基(日水制药株式会社，东京，日本)， 在37℃、5％CO2的恒温箱中培养。
(2)细胞粘附实验
将HUVEC以4.0×104细胞/孔(500μl/孔)点样于48孔板(Costar)培养过 夜。第二天，将培养的HUVEC以稀释到各浓度的(-)-DHM2EQ、(±)-DHM2EQ 或(+)-DHM2EQ处理，在37℃、5％CO2下恒温培养2小时。然后，再加入10ng/ml TNF-α(Genzyme-Techne，Cambridge，MA)，在37℃、5％CO2下恒温培养2小 时(并将未用TNF-α处理的作为对照)。6小时后，用加温至37℃的PBS (phosphate buffered saline；磷酸缓冲生理盐水)将每个孔洗涤2次，向每 个孔加入新的培养基(200μl/孔)。接着，向每个孔以6.0×104细胞/孔(20 μl/孔)的浓度点样HL-60细胞，在37℃、5％CO2下恒温培养1小时。接着，用 加热至37℃的PBS将每个孔洗涤3次，除去未粘附的HL-60细胞，加入新的培养 基(200μl/孔)。然后，用显微镜确认与HUVEC粘附的HL-60细胞，通过测定 显微镜视野内的粘附细胞数评价细胞粘附能力。其结果如图4所示。图中表示 了使用各个DHM2EQ时的IC50的值。如图4所示，发现(-)-DHM2EQ比(+)-DHM2EQ 和(±)-DHM2EQ细胞粘附抑制活性分别强10倍和3倍。
<实施例3>
接着，考察(-)-DHM2EQ对于多发性骨髓瘤的抗肿瘤效果。将4×107个的 多发性骨髓瘤细胞株KMS-12-PE(Ohtsuki T.et al.，Br.J.Hematol.73， 199-204，1989)溶解于0.2ml PBS，将其在CB17/1cr-SCID小鼠的左背部进行 皮下注射使其形成肿瘤，将5mm立方的该肿瘤片移植到10只小鼠中。移植肿瘤 后，观察16天，确认肿瘤片的生长、增殖趋势，对5只小鼠以8mg/kg体重向腹 腔内投以(-)-DHM2EQ的溶液(RPMI1640)。投药每天进行，持续14天。对 照组的5只小鼠投以同样量的溶剂(对照)。肿瘤直径的测量每周进行2次(肿 瘤容量＝(短径)2×(长径)×0.52)。其结果如图5所示，发现(-)-DHM2EQ 与对照相比显著地抑制了肿瘤的增殖。
<实施例4>
考察(-)-DHM2EQ对人甲状腺癌的抗肿瘤效果。将未分化的人甲状腺癌 细胞悬液FRO(5×106细胞；200μl的RPMI-1640)皮下注射到8周龄的雄性 BALB/cnu/nu小鼠(Charles River Japan公司制)的胁腹部。然后，用卡钳每 隔一天测定一次肿瘤的大小，通过肿瘤容量＝(a；肿瘤的短径)2×(b；与a 垂直的直径)×0.4计算肿瘤容量。肿瘤容量达到100mm3、皮下注射14天后作为 0天，向一组9只小鼠以10mg/kg体重向腹腔内在10天内每天投以(-)-DHM2EQ 的溶液(Cremophore(BASF公司)∶PBS∶DMSO(2∶1∶1))(○：(-)-DHM2EQ)。 对照组的9只小鼠投以同样量的溶剂(■：对照)。其结果如图6所示，发现(-) -DHM2EQ与对照相比显著地抑制了肿瘤的增殖。
<实施例5>
伴随胰岛素抗性的疾病，如上所述，被认为是由肥大的脂肪细胞分泌的 TNF-α引起的。于是，为了确认(-)-DHM2EQ是否可以诱导肥大的脂肪细胞 的凋亡，考察了(-)-DHM2EQ对于将前体脂肪细胞长期培养并经分化诱导得 到的肥大的脂肪细胞的影响。
将前体脂肪细胞株3T3-L1(7.5×104细胞；1ml含有10％FBS的DMEM)点样 于12孔板中的玻璃盖片上，达到融合后的2、3天之后换成含有500μM IBMX(3 -异丁酰-1-甲基黄嘌呤)、1μM Dex(地塞米松：dexamethasone)和1μ g/ml胰岛素的培养基。培养3天后，换成含有1μg/ml胰岛素的培养基，再3天 后换成普通的培养基(含有10％FBS的DMEM)。以后每隔3天换-次培养基，直 至50天。
分化诱导第50天更换培养基，24小时后将肥大的脂肪细胞用(-)-DHM2EQ (10μg/ml)预处理30分钟，接着再添加TNF-α(10ng/ml)进行刺激(作为 对照，以不添加(-)-DHM2EQ、不添加TNF-α和两者均不添加的各种条件进 行实验)。再过24小时后，去除培养基将肥大的脂肪细胞以500μl的荧光抗体 用PBS(8g/l NaCl、0.45g/l NaH2PO4·2H2O、1.28g/l Na2HPO4)洗涤3次，用500 μl 4％多聚甲醛在4℃下固定15分钟。然后，用500μl荧光抗体用PBS洗涤3次， 用含有0.2％BSA和0.5％Tween-20的荧光抗体用500μl PBS处理15分钟。
然后，用500μl蒸馏水洗涤3次，在遮光的150mm2的培养皿中的石蜡片上使 细胞面朝上地放置玻璃盖片。此外，从其上将TUNEL溶液(TdT buffer II /FITC-dUTP/TdT＝45μl/2.5μl/2.5μl)每次45μl地滴下，在37℃下恒温 培养1小时。最后将玻璃盖片放回遮光的12孔板，以1ml的荧光抗体用PBS洗涤3 次后，将玻璃盖片取出，在载玻片上用50％甘油固定，用荧光显微镜观察。
其结果如图7所示，发现预先用10mg/ml(-)-DHM2EQ处理的肥大的脂肪 细胞经10ng/mlTNF-α的刺激诱导凋亡。用10mg/ml(-)-DHM2EQ或10ng/mlTNF- α之一单独处理的肥大的脂肪细胞没有诱导凋亡。
综上所述，认为(-)-DHM2EQ对由分泌TNF-α的肥大的脂肪细胞引起的 胰岛素抗性症候群(例如2型糖尿病、高胰岛素血症、脂类代谢异常、肥胖、 高血压、动脉硬化性疾病等)的改善(包括预防、治疗)是有用的。此外，认 为(-)-DHM2EQ也可以作为肥胖预防剂、减肥剂、降血糖剂。更进一步，认 为(-)-DHM2EQ对糖尿病引起的疾病(例如糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜 病、糖尿病性神经障碍等)的改善(包括预防、治疗)也是有用的。
<实施例6>
接着，使用肥胖·2型糖尿病模式动物KKAy小鼠，考察(-)-DHM2EQ对糖 尿病的效果。
将4周龄的雌性KKAy小鼠分为2组((-)-DHM2EQ投药组5只，对照组4只)， 将高脂肪食物(CRF-1，オリエンタル酵母(株))作为基本饲料，让未添加 组(○：未添加(-)-DHM2EQ)、(-)-DHM2EQ投药组(●：添加(-)-DHM2EQ) 自由摄食，饲养4周，每周测定体重。向小鼠投药的(-)-DHM2EQ用研钵研细， 加0.5％CMC溶液悬浮或溶解，将其添加到高脂肪食物中。其结果如图8所示， 未添加组由于高脂肪食物的摄入呈现出显著的体重增加，而(-)-DHM2EQ组 在高脂肪食物的情况下体重的增加受到抑制。综上所述，认为(-)-DHM2EQ 可以作为抗肥胖剂(抗肥胖预防·防止剂(包括减肥剂))、抗糖尿病剂。
<实施例7>
以杜兴型为主的肌营养不良患者中的肌营养不良疾病的进展，认为由从成 肌细胞向肌细胞的分化诱导的抑制引起的肌细胞再生不良是一个发病机制(医 学のめゅみ，199：1045-1048，2001)。杜兴型肌营养不良的模式动物mdx小 鼠尽管与人类杜兴型肌营养不良的患者同样地缺失肌营养不良蛋白基因的表 达，但由于肌再生活跃，几乎没有发现肌肉力量下降。其原因认为是在人类患 者中，在一旦受损的肌细胞的再生过程中，TNF-α等炎症性因子抑制了肌分化。
于是，本发明人使用成肌细胞株C2C12的分化诱导系，考察(-)-DHM2EQ 的添加是否可以解除由TNF-α引起的肌肉分化抑制反应。
使用含有10％FBS的DMEM(培养用培养基)，将小鼠骨骼肌来源的成肌细 胞株C2C12(从理研细胞库购入)调整至7.5×104细胞/ml，向设有玻璃盖片(松 浪硝子工业株式会社，大阪，日本)的塑料制12孔板的各孔中分别点样1ml。 然后，当各孔中增殖到细胞融合的时候，将培养基换成含有2％加热灭活的马 血清的DMEM(分化用培养基)。对于使TNF-α(1ng/ml)和/或(-)-DHMEQ (3μg/ml)作用的组，在这时加入各种药剂。6天后，确认多核肌细胞的出现 这一肌细胞分化的标志，除去培养基。作为对照，准备用培养以培养基培养的 细胞，使其在第6天正好融合。
将这些细胞用PBS-(不含Ca2+、Mg2+的PBS；8.0g/l NaCl、0.2g/l KCl、2.3g/l NaHPO4·12H2O、0.2g/l KH2PO4)洗涤2次后将玻璃盖片从孔中取出，用冷风干 燥机使细胞干燥。然后，将玻璃盖片再放回12孔板的孔中，每孔加入约300μl May-Grünwald溶液(Merck公司，Darmstadt，Germany)，浸没玻璃上的细胞， 静置2～3分钟，固定、染色。经2～3分钟后，迅速在各孔中加入等量pH调整至 6.7的PBS-，一边向各孔的溶液吹入空气，一边使细胞再固定·染色2～3分钟。 接着，将玻璃盖片从孔中取出后，水洗，用干燥机的冷风使玻璃干燥。
将玻璃盖片再放回12孔板的孔中，加入基姆萨染色液(在1ml PBS-(pH： 6.7)中加入45μl Giemsa液(Merck)的溶液)浸没玻璃盖片。然后，向各孔 的溶液再吹入空气，对核染色10～15分钟。然后，与上述同样地将玻璃盖片从 孔中取出后，水洗，用干燥机的冷风使玻璃干燥。
这样制作的样品放于载玻片上，用荧光显微镜(Nikon UFX-DX；相位差用 的40倍物镜，设为Ph2。)以400倍的倍率拍摄照片。其结果如图9所示，发现1 ng/ml TNF-α抑制了从成肌细胞向肌细胞的分化诱导，但1～3μg/ml(-)- DHM2EQ解除了该分化诱导的抑制。没有分化诱导的C2C12细胞的分化率为0％。
综上所述，可期望通过对以杜兴型为主的肌营养不良患者投以(-)- DHM2EQ，解除TNF-α引起的肌分化抑制，诱导肌再生，改善肌营养不良疾病。
产业上利用的可能性
通过本发明可以提供对于免疫疾病、过敏性疾病、炎症性疾病、肿瘤转移、 疫病、动脉硬化等症状有用的医药组合物，以及医药组合物中作为有效成分含 有的旋光性化合物的制造方法和直接拆分方法。
与相关文献的关系
本申请要求基于2003年2月14日提出申请的日本专利特愿2003-37167号、 2003年2月18日提出申请的日本专利特愿2003-39098号和2003年8月6日提出申请 的日本专利特愿2003-288281号的优先权。这些文献在本说明书中被引用。
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