本发明涉及一种新的蛋白，肽片段及其结合体(conjugate)，以及编码此蛋白及其 片段的核酸，它们都能用于肿瘤疾病的诊断和治疗，尤其是食管癌的诊断和治疗。

人食管癌(EC)是最常见的遍及世界的癌症之一，中国、南非、乌拉圭、 法国和意大利(见图1和2)发病率很高。美国EC发病率较低，大多数发生 在美国黑人。

中国食管癌的死亡率是全世界最高的，占全世界死亡人数的50％。河南边 界的太行山南部地区、山西和湖北省食管癌死亡率高，尤其是河南省林县年龄 相关死亡率最高，男性为151/100 000，女性为115/100 000(见图3)。以往对 中国的研究表明许多肿瘤抑制基因和癌基因参与此病的发病和进展过程，然而 没有确定与EC直接相关的基因。

本发明人分离了四个不同的基因片段，并用mRNA差异显示技术将其克 隆，比较正常食管上皮和EC之间异常基因表达的不同之处。

在GenBank数据库中进行序列同源性分析发现这些片段与已知序列无显著 相似性，因而这四个片段可能是新的基因。用5’-RACE(cDNA末端快速扩增) 技术测定了一个序列的全长，称为食管癌相关基因-1(ECRG-1)。对这些基因 研究表明，它们的失活或删除将促使食管形成肿瘤，这对EC基础和临床研究 有很强的重要性，使得将其用于制备抗体、设计新的药物、基因诊断、基因治 疗和抑制或清除基因产物方面的进展成为可能。

用逆转录酶PCR确定ECRG1在正常食管上皮和食管癌上皮表达有明显的 不同。Northern杂交分析发现正常食管细胞出现长约1kb的ECRG1阳性信号， 而食管癌细胞未出现此信号(见图4：N＝正常，C＝食管癌)。此外，还将ECR G1的融合蛋白在体外和体内应用于肿瘤细胞，能显著抑制肿瘤生长。

本发明的第一个方面提供了分离或纯化的编码含有SEQ ID NO 2的氨基 酸序列，与之有至少50％同源性的氨基酸序列或其片段的蛋白的核酸序列，其 中所说的蛋白或肽片段具有抑制食管上皮细胞肿瘤生长速度的活性。

该蛋白优选分子量在43和47kD之间。更优选是丝氨酸蛋白酶型。更优选 该蛋白具有SEQ ID NO 3(NLKPWMIAVLIVLSLTVVAVTIGLLVHFLVFDQ) 或其保守取代突变体的氨基酸序列的跨膜位点。更优选该蛋白具有下列一个或 优选全部的位点：N-糖基化位点、蛋白激酶糖基化位点、酪氨酸激酶II磷酸化 位点、N-豆蔻酰化位点、酰胺化位点、异戊二烯基组结合位点(CAAX盒)、 微体C-末端靶信号、细胞粘附序列和丝氨酸蛋白酶(胰岛素型)组氨酸位点。 更优选的的位点显示于下面的表1中。

该蛋白可包括前面所述的与一个或更多编码标记序列的区域联结或相连的 活性蛋白或片段序列，例如GST或GFP融合序列，或与能增强细胞膜，尤其 是食管上皮细胞膜穿透力的序列联结或相连。

优选的核酸序列是能够在标准严格杂交条件下与SEQ ID NO 1的核酸序 列杂交的核酸序列，标准严格杂交条件是2×SSC，65℃；更优选的高度严格条 件是0.2×SSC，65℃。杂交步骤优选按照Church和美国国家科学院院报(USA) (1984)81，1991-1995(通过引用被在此合并)。

更优选的核酸是mRNAs和cDNAs，尽管用于诊断食管癌的探针和引物在 下述本发明更进一步的方面也能想到。

本发明更优选的核酸是DNAs，尤其是cDNAs，它与启动序列及其他选择 性调控序列可操纵地连接，这些序列允许DNA表达，从而在细胞内产生本发 明所述的能抑制食管肿瘤生长的蛋白或片段，从中分离并纯化作为抗肿瘤试 剂、疫苗或poart fo诊断试剂盒。这类细胞可以是原核细胞，但优选是真核细 胞，更优选是哺乳动物细胞，尤其是人细胞。这些细胞可以替换为靶肿瘤细胞， 靶肿瘤细胞需要该蛋白或片段抑制其分裂，从而抑制肿瘤生长。

本发明的第二个方面提供了一种分离纯化、无菌或无热原质形式的含有SE Q ID NO 2的氨基酸序列，或与之有至少50％同源性的氨基酸序列或片段的 蛋白，其中蛋白或肽片段具有抑制食管上皮细胞肿瘤生长速度的活性。

该蛋白优选分子量在43和47kD之间，更优选约47kD。更优选是丝氨酸 蛋白酶型。更优选该蛋白具有SEQ ID NO 3(NLKPWMIAVLIVLSLTVVAVT IGLLVHFLVFDQ)或其保守取代突变体的跨膜位点的氨基酸序列。更优选该 蛋白具有下列一个或最好全部的位点：N-糖基化位点、蛋白激酶糖基化位点、 酪氨酸激酶II磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、酰胺化位点、异戊二烯基组结合 蛋白(CAAX盒)、微体C-末端靶信号、细胞粘附序列和丝氨酸蛋白酶(胰岛 素型)组氨酸位点。更优选的的位点显示于下面的表1中。

该蛋白可能包括前面所述的活性蛋白或与一个或更多编码标记序列的区域 结合或侧接的片段序列，例如GST或GFP融合序列，或与能增强细胞膜，尤 其是食管上皮细胞膜穿透力的序列联结或相连。

同源性是指氨基酸或核酸序列同一性的百分比，或对于氨基酸来说，相同 或保守取代氨基酸同一性的百分比。同一性是指氨基酸序列相同的百分比。这 两个百分比术语允许在序列缺失时仍能进行下述的比对。

特别是，术语同一性是指当进行选择性序列排列比较时，要求保护的氨基 酸或碱基序列在参考文献中序列的同一相应位点出现的百分比，尽管实际上序 列可能在一定位点有缺失或增加，此时在该位点需要加入缺口来排列比较氨基 酸或碱基相同的最高百分比。尤其是在序列排列比较是使用了20或20个以下 缺口，即加入到两个序列之间的所有缺口总数之和为20或20以下，更优选是 10或小于10。这些缺口的长度不是非常重要，只要两个有关E2F结合和E2F DNA结合调节的中一个或另一个的确定活性存在，但一般不超过50个氨基酸， 优选不超过10个，或不超过150个碱基，优选不超过30个碱基。

前述突变形式序列优选保守取代。关于氨基酸“保守取代”涉及用同一族 中有相同物理化学特性的氨基酸取代一给定的氨基酸。这样当某氨基酸有一个 疏水性基团时，它被另一个也含有疏水性基团的氨基酸保守取代；其他这类族 是特性基团包括亲水、阳离子、阴离子或含有一个硫醇或硫醚的族。这样的取 代只是在预计取代后的蛋白具有DP肽或蛋白活性时，讨论有关E2F异二聚化 和E2F-DNA结合或转录活化调节。

氨基酸或核苷酸序列排列比较以及计算序列同源性或同一性的适当运算法 和软件都是本领域技术人员熟知的。这类工具的主要例子是Pearson和基于FA ST的Lipman以及BLAST程序。具体可在Altschul et al(1990)，J.Mol.Biol. 215：403-10；Lipman D J and Pearson W R(1985)Science 227，p143541中找 到。公众可在互联网‘http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast-help.html’中得 到BLAST详情。因而可经商业、公众可得软件包，例如FASTA和BLASTn 软件或通过网络计算机服务商来确定同源性和同一性百分比。前者的例子是G CG程序包(Devereux et al Nucelic Acids Research(1984)12(1)：387)和Bestfit 程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，eg.Version 8 for Unix or IBM e quivalent，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Dri ve，Madison，WI 53711)，他们使用Smith和Waterman当地同源性算法，Adva nces in Mathematics 2：482-489(1981)。许多国际机构，例如GenBank(见http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)和EMBL：(见http：//www.embl-heidelberg.de/Blast2) 提供网络服务。

软件包使用的参数和网络服务商应该与适当的序列长度和前述缺口特性一 起应用。排列比较策略在W098/40483第39-41页有叙述，此文献通过引用被 在此合并。

BLAST检索中方便的参数时缺省值，即对EMBL Advanced Blast2：Blast p Matrix BLOSUMS 62，Filter缺省值，Echofilter X，Ecpect 10，Cutoff缺省 值，双链，描述50，排列比较50。优选使用BLASTn的缺省值。GCG Wisco nsin软件包的缺口缺省值为12，长度缺省权值4。更优选的同源性算法的FAST DB参数时错配罚值＝1.00，缺口罚值＝1.00，缺口大小罚值＝0.33及增加碱基罚 值＝30.0。

关于氨基酸“保守取代”涉及用同一族中有相同物理化学特性的氨基酸取 代一给定的氨基酸。这样当某氨基酸有一个疏水性基团时，它被另一个也含有 疏水性基团的氨基酸保守取代；其他这类族是特性基团包括亲水、阳离子、阴 离子或含有一个硫醇或硫醚的保守取代。此种取代被具体描述在参考文献US5 380712中。

本发明的核酸可被序列列表中的例子变性取代。‘变性取代’涉及核苷酸被 编码相同氨基酸的密码子核苷酸序列取代；这些在细胞或载体表达蛋白时具有 优越性的变性取代的类型与源生物细胞DNA不同，它含有与源细胞cDNA不 同的转录/翻译优选密码子。这类变性取代由此可能成为宿主特异性取代。

本发明的第三个方面是提供了寡核苷酸探针和引物，它用于第一个方面所 述的核酸的鉴定、分离和复制，以及在研究食管肿瘤和食管肿瘤细胞时，用于 鉴定组织中ECRG1基因的存在和/或缺失。

该探针的长度足够在标准或严格杂交条件下与ECGR1基因特异性结合。 它们可能是SEQ ID NO 1序列相应的全长探针，但其长度为10-100个碱基可 能更合适一些，更优选是15-30个碱基，每一探针含有与前述长度片段邻近的 序列。

同样地，用于扩增DNA的引物本身可被鉴定来检测是否存在活性ECRG1 基因或其他的关键序列。本领域技术人员熟知引物的合适长度，例如长度为8- 30个碱基。特别优选的引物和探针是那些通过用标记核苷酸进行连接酶链式反 应来检测单一核苷酸表现的多肽性，例如位点直接突变，使有关肿瘤生长抑制 的蛋白发生失活或与此处公开的野生型蛋白相比活性降低。

本发明的第四个方面是提供了可表达本发明的蛋白或蛋白片段的表达载 体，该蛋白或蛋白片段包括本发明第一个方面所述的与启动子和其他可引起蛋 白或片段在靶肿瘤细胞表达或产生蛋白的选择性调节区域可操纵连接的核酸。

优选载体被用于所谓的基因治疗，包括突变病毒形式的载体，所述病毒能 感染食管上皮并在食管表达该蛋白或片段。此病毒可方便地是腺病毒、腺病毒 相关病毒或细小病毒，但也包括其他治疗病毒是本领域技术人员熟知的适合用 于基因治疗的病毒。特别优选的病毒是在非靶细胞中复制的能力比它们在靶细 胞中弱。因此，优选定向到达上皮细胞的病毒突变体。

本发明的第五个方面是提供了被本发明的核酸转染的细胞。

本发明的第六个方面提供了本发明的蛋白或片段的抗体，例如在实施例中 提供的。这些抗体可能与纯化分离SEQ ID NO 1蛋白或与其抗原结合片段结 合，如实施例中所列，或与联接着标记蛋白(例如谷光苷肽-S-转移酶(GST) 或绿荧光蛋白(GFP))的蛋白或片段结合。这些抗体可能由各种动物产生， 例如猪、兔、小鼠或大鼠，也可能是多克隆抗体，但更优选的为单克隆抗体， 例如由熟知的杂交瘤技术产生的单克隆抗体。

本发明的第七个方面是提供了一种诊断编码异常食管肿瘤生长抑制蛋白的 基因ECRG1存在的方法，包括确定患者食管组织样本中是否存在所述基因序 列，并与已知SEQ ID NO 2及其突变体序列比较，该序列能诱导或增强抑制 食管上皮细胞肿瘤生长的效果，确定所述基因序列丢失或具诱导活性的ECRG 1丢失的患者存在发生食管肿瘤的高危因素。用本发明的探针或引物能方便地 作出诊断。

本发明的第八个方面提供了一种治疗可疑癌症患者的方法，包括给药于患 者有效量的本发明第二个方面的蛋白或片段，抑制肿瘤的生长。该可疑癌症优 选食管肿瘤。

本发明的第九个方面提供了一种治疗可疑癌症患者的方法，包括给患者施 与有效量的本发明第四个方面的病毒载体，感染任何肿瘤细胞，并在细胞内产 生有效量的蛋白或蛋白片段来抑制肿瘤的生长。该可疑癌症优选食管癌。

本发明的第十个方面提供了一种延长癌细胞的细胞周期的方法，包括用本 发明第二或第四个方面的蛋白或片段或载体处理该细胞。

本发明的第十一个方面提供了一种药物组合物，包括第二个方面的蛋白或 片段与药物可接受的载体、稀释液或赋形剂。优选无菌和无热原质形式的组合 物。

本发明的第十二个方面提供了第二个方面所述蛋白或片段在制备治疗癌 症，尤其是食管肿瘤的药物中的应用。

本发明的第十三个方面提供了一种药物组合物，其包含第四方面的载体， 尤其是病毒载体，与药物可接受的载体、稀释液或赋形剂。优选无菌和无热原 质形式的组合物。更优选该组合物与类固醇或其它抗细胞因子，例如TNF受 体，联合进行治疗，以减轻炎症反应。

下面用下列非限制的附图、序列表和实施例对本发明作进一步的描述。进 一步体现对于本领域技术人员按照这些描述所作的改动都落入本发明的保护范 围。

附图：

附图1：食管癌在全世界的发病率地图。

附图2：遍及世界的各种癌症的死亡率。

附图3：食管癌在中国的分布。

附图4：正常和异常食管癌组织的Northern杂交结果。

附图5：本发明全长ECRG1蛋白在各个pH值的净电荷。

附图6：全长ECRG1蛋白的抗原决定部位分析，SEQ ID NO 2中所列氨 基酸序列位于水平轴。

附图7：本发明蛋白的稳定构型。

附图8：ECRG1基因染色体4q22-25上的位置。

附图9：在 E coli中表达融合蛋白所用质粒pGEX-4T-1-ECRG1的构建步 骤。

附图10和11：蛋白表达的Western杂交杂交凝胶图谱。

附图12：抗BALB/C小鼠来源的纯化蛋白的抗体与GST融合蛋白的抗血 清免疫反应活性。

附图13：与GST的抗血清免疫反应活性，其显示与蛋白的不同。

附图14：一个能在人细胞中表达GST-ECRG1的真核表达质粒pcDNA3-E CRG1的构建步骤。

附图15：GST-ECRG1通过pcDNA-ECRG1质粒在NEC细胞中表达。

附图16：用GST融合蛋白处理过的NEC细胞的生长曲线。

附图17：NEC细胞接触GST融合蛋白后的抑制率。

附图18：体外培养的NEC细胞的幻灯片，证明加入编码质粒的GST-ECR G1融合蛋白后对生长的作用。

附图19：GST-ECRG1融合蛋白剂量从0.05mg/ml增加到0.4mg/ml的作用。

附图20：ECRG1基因转染的NEC细胞生长抑制图。

附图21：ECRG1基因转染的NEC细胞生长抑制速度。

附图22：细胞数与DNA含量的细胞周期测定，表明NEC细胞的细胞周 期各个阶段的细胞比例。

附图23：细胞数与DNA含量的细胞周期测定，表明经GST融合蛋白处理 的NEC细胞的细胞周期各个阶段的细胞比例。

附图24：细胞数与DNA含量的细胞周期测定，表明经pcDNA3-ECRG1 转染的NEC细胞的细胞周期各个阶段的细胞比例。

附图25：细胞数与DNA含量的细胞周期测定，表明经pcDNA3-ECRG1 转染的NEC细胞诱导肿瘤后，肿瘤细胞的细胞周期各个阶段的细胞比例。

附图26：细胞数与DNA含量的细胞周期测定，表明用无ECRG1基因的p cDNA3转染的NEC细胞的细胞周期各个阶段的细胞比例。

附图27：细胞数与DNA含量的细胞周期测定，表明经pcDNA3转染的N EC细胞诱导肿瘤后，肿瘤细胞的细胞周期各个阶段的细胞比例。

附图28：细胞数与DNA含量的细胞周期测定，表明经pcDNA3-ECRG1 转染的NEC细胞诱导肿瘤后，肿瘤细胞的细胞周期各个阶段的细胞比例。

实施例1

使用设计而成的长引物利用cDNA末端(RACE)5’快速扩增法获得全长 ECRG 1，并测定全部核苷酸序列。Northern杂交分析ECRG-1 mRNA得到约1. 2kb的单一信号。GENBANK中序列同源性分析表明现登录号AF071882的新 序列没有与其高度同源的序列，由此鉴定出该序列是新的序列。

逆转录酶PCR(RT-PCR)法检测ECRG-1在EC中的表达。在正常胎儿大 脑、成人大脑、肝脏、肾脏、睾丸、骨髓和骨骼肌7个cDNA文库以及8个人 胎儿组织，例如脑、肺、肌肉、皮肤、肾脏、肠道和腺体中，发现ECRG-1的 表达。ECRG-1在7个正常食管上皮的表达100％阳性，但在44个EC患者中 仅4.55％，p＜0.01。在26个肿瘤附近组织，其表达为46.15％，p＜0.05。这些结 果表明ECRG-1基因产物是肿瘤抑制基因，其在EC发病和进展过程中起着重 要的作用。

实施例2

用放射杂交法测定ECRG-1基因在染色体上的位置。发现此基因位于染色 体4q22-25。

实施例3

通过生物信息来预测ECRG-1蛋白产物的结构和功能，表明它是一种与丝 氨酸蛋白酶类似的跨膜蛋白。蛋白分子量约为45kD，三维晶体结构同丝氨酸 蛋白酶。

表1 ECRG-1蛋白的功能位点 主题 氨基酸位点 N-糖基化位点 153-156；304-307 蛋白激酶C磷酸化位点 54-56；280-282；374-376；378-380 酪氨酸激酶II磷酸化位点 107-110；165-168；284-287；321-324  N-豆蔻酰化位点 67-72；351-356；360-365 酰胺化位点 175-178 异戊二烯基组结合位点(CAAX盒) 388-391 微体C-末端靶信号 185-187；281-283；388-390 细胞粘附序列 366-368 丝氨酸蛋白酶(胰岛素型)组氨酸位点 223-228

信息肽和跨膜位点被鉴定为NLKPWMIAVLIVLSLTVVAVTIGLLVHFLVFD Q。

实施例3

将ECRG-1 cDNA插入到可被ITPG诱导的表达质粒中，用Western杂交法 鉴定表达蛋白。用纯化蛋白免疫BLAB/C小鼠，产生多克隆抗体。直接ELISA 测定抗体的效价是1∶3200。

用质粒PGEX型PGEX-4T-ECRG-1在 E.coli中表达GST-ECRG-1蛋白。

实施例4

构建含ECRG-1基因的真核表达质粒，转染先前缺乏ECRG-1表达活性的 NEC细胞。通过RT-PCR和Western杂交鉴定ECRG-1基因转染克隆。

与未被ECRG-1基因转染的细胞相比，ECRG-1基因转染的细胞的增殖率 降低，肿瘤重量和体积也降低。当ECRG-1基因转染到NEC细胞中，NEC细 胞的增殖率降低(表2)。还发现ECRG-1基因转染的NEC细胞较未被转染的 细胞相比，肿瘤重量和体积显著降低。我们的发现表明ECRG-1基因在体外和 体内都能显著抑制NEC细胞的生长。

表2 ECRG-1基因转染和无ECRG-1基因转染的细胞肿瘤抑制速度   细胞     24小时     48小时     72小时    96小时    120小时  Necneo1  1.06±4.17  1.28±2.59  0.80±0.02  5.06±0.89  7.34±0.28  Necneo2  0.95±0.29  0.95±0.59  11.67±0.97  10.90±0.84  19.37±0.19  NecECRG1a  0.63±7.78  3.11±0.71  45.68±0.92  48.37±0.81  37.12±0.42  NecECRG1b  17.93±1.29  31.82±0.26  57.69±0.63  55.03±0.38  43.17±0.59

实施例5

ECRG-1基因编码的蛋白能抑制食管癌细胞增殖。经NMBA2A(NEC)诱 导的人胎儿的食管癌细胞与融合蛋白培养，将NEC细胞肿瘤移植到裸鼠，然 后注射ECRG-1融合蛋白。重组融合蛋白在体外和体内都能显著抑制肿瘤生长。

与未被ECRG-1基因转染的细胞相比，ECRG-1基因转染的NEC细胞的增 殖率降低，肿瘤重量和体积也显著降低。这些结果表明ECRG-1及其蛋白在体 外和体内均可调节细胞周期G2期延长。此外，被ECRG-1基因转染的NEC 细胞肿瘤血管形成减少。

表2经GST-ECRG-1蛋白处理的NEC肿瘤重量和体积 组 处理天数   肿瘤质量(g)  肿瘤体积(cm3) 对照 28   0.956±0.494  1.103±0.432 透膜 28   0.850±0.409  0.877±0.479 细菌 28   0.972±0.410  1.016±0.442 质粒 28   0.866±0.339  0.979±0.365 融合蛋白 28   0.659±0.317  0.680±0.358

融合蛋白组与对照组P＜0.05

表3融合蛋白对NEC细胞周期的影响 组    G0±G1(％)   体外  体内      S(％)   体外   体内    G2±M(％)   体外  体内 对照   54.6   88.0   35.6   12.0   9.8    0 透膜   52.5   61.4   36.3   23.4   11.3   15.2 细菌蛋白   46.2   57.9   37.2   16.4   16.2   25.7 质粒   46.8   67.0   38.2   0   15.0   33.0 融合蛋白   39.8   39.8   30.2   13.4   30.0   46.8

表4 ECRG-1转染NEC细胞对细胞周期的影响  组   G0+G1(％)   体外  体内     S(％)   体外  体内     G2+M(％)   体外   体内  NEC   39.5   86.2   50.9  0   9.5    13.8  NEC-neo1   35.5   35.8   58.9  4.7   5.6    59.4  NEC-neo2   32.0   9.5   62.5  0   5.4    90.5  NEC-ECRG-1   45.1   18.2   53.6  0   1.3    81.8  NEC-ECRG-2   51.6   17.9   36.0  4.2   12.4   77.9

序列表

SEQ ID NO 1表示ECRG1的cDNA序列，其5’端有80个碱基，3’端有1 22个碱基，包括多聚腺苷酸尾。

SEQ ID NO 2表示ECRG1蛋白的氨基酸序列。

                           序列表 <110>BTG国际有限公司 <120>药用蛋白和核酸 <130>ECRG1 <140> <141> <160>2 <170>PatentIn Ver.2.1 <210>1 <211>1375 <212>DNA <213>Homo sapiens <220> <221>CDS <222>(81)..(1253) <400>1 atcacgagat gtcatatagt tgattagtta gttgagttca gtgggtgcag acctgcaaga 60 tcatattctt cctcctgtac atg atg tat cgg aca gta gga ttt ggc acc cga 113

                  Met Met Tyr Arg Thr Val Gly Phe Gly Thr Arg

                  1                 5                  10 agc aga aat ctg aag cca tgg atg att gcc gtt ctc att gtg ttg tcc   161 ser Arg Asn Leu Lys Pro Trp Met Ile Ala Val Leu Ile Val Leu Ser

         15                  20                  25 ctg aca gtg gtg gca gtg acc ata ggt ctc ctg gtt cac ttc cta gta   209 Leu Thr Val Val Ala Val Thr Ile Gly Leu Leu Val His Phe Leu Val

     30                  35                  40 ttt gac caa aaa aag gag ttc tat cct ggc tcc ttt aaa att tta gat   257 Phe Asp Gln Lys Lys Glu Phe Tyr Pro Gly Ser Phe Lys Ile Leu Asp

 45                  50                  55 ccg caa atc aat aac aat ttc gga caa agc aac aca tat caa ctt aag   305 Pro Gln Ile Asn Asn Asn Phe Gly Gln Ser Asn Thr Tyr Gln Leu Lys  60                  65                  70                  75 gac tta cga gag acg acc gaa aat ttg gtg gat gag ata ttt ata gat   353 Asp Leu Arg Glu Thr Thr Glu Asn Leu Val Asp Glu Ile Phe Ile Asp

             80                  85                  90 tca gcc tgg aag aaa aat tat atc aag aac caa gta gtc aga ctg act   401 ser Ala Trp Lys Lys Asn Tyr Ile Lys Asn Gln Val Val Arg Leu Thr

         95                 100                 105 cca gag gaa gat ggt gtg aaa gta gat gtc att atg gtg ttc cag ttc   449 Pro Glu Glu Asp Gly Val Lys Val Asp Val Ile Met Val Phe Gln Phe

    110                 115                 120 ccc tct act gaa caa agg gca gta aga gag aag aaa atc caa agc atc   497 Pro Ser Thr Glu Gln Arg Ala Val Arg Glu Lys Lys Ile Gln Ser Ile

125                 130                 135 tta aat cag aag ata agg aat tta aga gcc ttg cca ata aat gcc tca   545 Leu Asn Gln Lys Ile Arg Asn Leu Arg Ala Leu Pro Ile Asn Ala Ser 140                 145                 150                 155 tca gtt caa gtt aat gca atg agc tca tca aca ggg gag tta att gtc   593 Ser Val Gln Val Asn Ala Met Ser Ser Ser Thr Gly Glu Leu Ile Val

            160                 165                 170 caa gca agt tgt ggt aaa cga gtt gtt cca cta aac gtc aac aga ata   641 Gln Ala Ser Cys Gly Lys Arg Val Val Pro Leu Asn Val Asn Arg Ile

        175                 180                 185 gca tct gga gtc att gca ccc aag gcg gcc tgg cct tgg caa gct tcc   689 Ala Sar Gly Val Ile Ala Pro Lys Ala Ala Trp Pro Trp Gln Ala Ser

    190                 195                 200 ctt cag tat gat aac atc cat cag tgt ggg gcc acc ttg att agt aac   737 Leu Gln Tyr Asp Asn Ile His Gln Cys Gly Ala Thr Leu Ile Ser Asn

205                 210                 215 aca tgg ctt gtc act gca gca cac tgc ttc cag aag tat aaa aat cca   785 Thr Trp Leu Val Thr Ala Ala His Cys Phe Gln Lys Tyr Lys Asn Pro 220                 225                 230                 235 Cat caa tgg act gtt agt ttt gga aca aaa atc aac cct ccc tta atg   833 His Gln Trp Thr Val Ser Phe Gly Thr Lys Ile Asn Pro Pro Leu Met

            240                 245                 250 aaa aga aat gtc aga aga ttt att atc cat gag aag tgc cgc tct gca   881 Lys Arg Asn Val Arg Arg Phe Ile Ile His Glu Lys Cys Arg Ser Ala

        255                 260                 265 cca aga aag tac gac att gct gtt gtg cag gtc tct tcc aga gtc acc   929 Pro Arg Lys Tyr Asp Ile Ala Val Val Gln Val Ser Ser Arg Val Thr

    270                 275                 280 ttt ccg gat gac ata cgc cgg att tgt ttg cca gaa gcc tct gca tcc   977 Phe Pro Asp Asp Ile Arg Arg Ile Cys Leu Pro Glu Ala Ser Ala Ser

285                 290                 295 ttc caa cca aat ttg act gtc cac atc aca gga ttt gga gca ctt tac   1025 Phe Gln Pro Asn Leu Thr Val His Ile Thr Gly Phe Gly Ala Leu Tyr 300                 305                 310                 315 tat ggt ggg gaa tcc caa aat gat ctc cga gaa gtc aga gtg aaa atc   1073 Tyr Gly Gly Glu Ser Gln Asn Asp Leu Arg Glu Val Arg Val Lys Ile

            320                 325                 330 ata agt gat gat gtc tgc aag caa cca cag gtg tat ggc aat gat ata   1121 Ile Ser Asp Asp Val Cys Lys Gln Pro Gln Val Tyr Gly Asn Asp Ile

        335                 340                 345 aaa cct gga atg ttc tgt gcc gga tat atg gaa gga att tat gat gcc   1169 Lys Pro Gly Met Phe Cys Ala Gly Tyr Met Glu Gly Ile Tyr Asp Ala

    350                 355                 360 tgc agg ggt gat tcc tgg ggg acc ttt agt cac aag gga tct gaa aga   1217 Cys Arg Gly Asp Ser Trp Gly Thr Phe Ser His Lys Gly Ser Glu Arg

365                 370                 375 tac gtg gta tct cat tgg aat tgt aag ctg ggg aga taactgtggt        1263 Tyr Val Val Ser His Trp Asn Cys Lys Leu Gly Arg 380                 385                 390 caaaaggaca agcctggagt ctacacacaa gtgacttatt accgaaactg gattgcttca 1323 aaaacaggca tctaattcac aataaaagtt aaacaaagaa aaaaaaaaaa aa         1375 <210>2 <211>391 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>2 Mat Met Tyr Arg Thr Val Gly Phe Gly Thr Arg Ser Arg Asn Leu Lys   1               5                  10                  15 Pro Trp Met Ile Ala Val Leu Ile Val Leu Ser Leu Thr Val Val Ala

         20                  25                  30 Val Thr Ile Gly Leu Leu Val His Phe Leu Val Phe Asp Gln Lys Lys

     35                  40                  45 Glu Phe Tyr Pro Gly Ser Phe Lys Ile Leu Asp Pro Gln Ile Asn Asn

 50                  55                  60 Asn Phe Gly Gln Ser Asn Thr Tyr Gln Leu Lys Asp Leu Arg Glu Thr  65                  70                  75                  80 Thr Glu Asn Leu Val Asp Glu Ile Phe Ile Asp Ser Ala Trp Lys Lys

             85                  90                  95 Asn Tyr Ile Lys Asn Gln Val Val Arg Leu Thr Pro Glu Glu Asp Gly

        100                 105                 110 Val Lys Val Asp Val Ile Met Val Phe Gln Phe Pro Ser Thr Glu Gln

    115                 120                 125 Arg Ala Val Arg Glu Lys Lys Ile Gln Ser Ile Leu Asn Gln Lys Ile

130                 135                 140 Arg Asn Leu Arg Ala Leu Pro Ile Asn Ala Ser Ser Val Gln Val Asn 145                 150                 155                 160 Ala Met Ser Ser Ser Thr Gly Glu Leu Ile Val Gln Ala Ser Cys Gly

            165                 170                 175 Lys Arg Val Val Pro Leu Asn Val Asn Arg Ile Ala Ser Gly Val Ile

        190                 185                 190 Ala Pro Lys Ala Ala Trp Pro Trp Gln Ala Ser Leu Gln Tyr Asp Asn

    195                 200                 205 Ile His Gln Cys Gly Ala Thr Leu Ile Ser Asn Thr Trp Leu Val Thr

210                 215                 220 Ala Ala His Cys Phe Gln Lys Tyr Lys Asn Pro His Gln Trp Thr Val 225                 230                 235                 240 Ser Phe Gly Thr Lys Ile Asn Pro Pro Leu Met Lys Arg Asn Val Arg

            245                 250                 255 Arg Phe Ile Ile His Glu Lys Cys Arg Ser Ala Pro Arg Lys Tyr Asp

        260                 265                 270 Ile Ala Val Val Gln Val Ser Ser Arg Val Thr Phe Pro Asp Asp Ile

    275                 280                 285 Arg Arg Ile Cys Leu Pro Glu Ala Ser Ala Ser Phe Gln Pro Asn Leu

290                 295                 300 Thr Val His Ile Thr Gly Phe Gly Ala Leu Tyr Tyr Gly Gly Glu Ser 305                 310                 315                 320 Gln Asn Asp Leu Arg Glu Val Arg Val Lys Ile Ile Ser Asp Asp Val

            325                 330                 335 Cys Lys Gln Pro Gln Val Tyr Gly Asn Asp Ile Lys Pro Gly Met Phe

        340                 345                 350 Cys Ala Gly Tyr Met Glu Gly Ile Tyr Asp Ala Cys Arg Gly Asp Ser

    355                 360                 365 Trp Gly Thr Phe Ser His Lys Gly Ser Glu Arg Tyr Val Val Ser His

370                 375                 380 Trp Asn Cys Lys Leu Gly Arg 385                 390