丹酚酸B和昔布类药物联合用药的抗肿瘤效果
阅读：86发布：2020-05-11
专利汇可以提供丹酚酸B和昔布类药物联合用药的抗肿瘤效果专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了一种药物组合物，其含有1-99重量％的 丹酚酸 B和1-99重量％的昔布类药物，和药物学上可接受的载体；以及该药物组合物用于制备抗 肿瘤 药的用途。，下面是丹酚酸B和昔布类药物联合用药的抗肿瘤效果专利的具体信息内容。
丹酚酸B和昔布类药物联合用药的抗肿瘤效果
技术领域
背景技术
[0002] 唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge)，为多年生草本植物，是我国的传统中药，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效。现代临床中，广泛将其用于预防和治疗心血管疾病，肾病，肝病等。近些年的研究发现，水溶性成份是丹参中重要有效成份，由于丹参酚酸难于获得纯品，而丹参素和原儿茶醛较易分离和合成，所以大多数制药厂把丹参素和原儿茶醛作为丹参注射剂的质量控制指标。也有部分制药厂将丹酚酸B盐用于预防心脑血管疾病、预防老年性痴呆，治疗肾衰竭，改善尿毒症状、抗氧化、抗血栓、抗心脑缺血、保护肝脏及调节血脂等药物中。丹酚酸B是丹参的水溶性有效成分之一。丹酚酸B镁盐(Magnesium Lithospermate B)是从丹参中分离得到的一种水溶性酚酸类物质，其分子式为C36H28O16Mg，结构式为：
[0003]
[0004] 在中国专利申请02136970.4“丹酚酸B在制备治疗肿瘤药物中的应用”、200510026457.0“丹酚酸B在制备预防肿瘤发生的药物中的应用”、200510026456.6“丹参在制备预防前列腺癌发生的药物中的应用”中公开了丹酚酸B在体外研究中对多种肿瘤细胞的抑制杀伤作用和动物体内试验中对肿瘤的预防治疗作用，并公开了丹酚酸B对肝癌的治疗作用。但是，对于丹酚酸B与其它药物联合给药的功效还需要进一步研究。
[0005] 塞来昔布，又名塞 来考昔，商品名为西乐 葆，属于非甾体抗炎药(non-steroidalanti-inflammatory drugs，NSAIDs)，能高度选择性的抑制环氧化酶-2的活性而不抑制环氧化酶-1的活性，1999年经美国FDA批准上市，作为类风湿关节炎和骨关节炎的治疗药。该药具有良好的抗炎、止痛和解热作用，同时明显降低了传统NSAIDs具有的导致胃溃疡、出血和穿孔等严重的胃肠道不良反应。
[0006] 近二十多年来，国内外大量流行病学、临床和实验研究表明，非甾体类消炎药具有预防和抑制人类肿瘤的作用，虽然其机理尚在探讨之中，但目前主要认为与抑制环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的活性有关。昔布类药物作为一种高选择性COX-2抑制剂，由于其靶向性强、副作用小，在胃肠道肿瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌和口腔癌等肿瘤的预防和治疗中将发挥重要作用，相关的体内体外研究已经部分证明了其抗肿瘤活性，从而成为近年的研究热点。目前研究认为，昔布类药物可能通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞调亡、抑制肿瘤新血管生成、阻断致癌物质的代谢及减弱肿瘤介导的免疫抑制表达等COX-2依赖或非依赖途径，达到抗肿瘤的目的。近年研究还发现其具有γ射线和化疗药物对肿瘤的增敏作用。值得注意的是，近年的研究表明，包括塞来昔布在内的昔布类药物在作为骨关节炎和类风湿关节炎治疗药物长期使用时可能会增加患者的不良心血管事件。当前，当昔布类药物作为抗肿瘤药物应用时其用量高于其作为抗风湿药物的用量，因此，作为抗癌药治疗的昔布类药物也同样存在着不良心血管事件增加的风险。本领域仍然在寻找减少昔布类药物不良副作用的方法。
[0007] 据WHO统计，恶性肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一，全球每年新确诊的肿瘤病人在1000万以上，死亡约700多万人；我国每年新增肿瘤患者约有200多万，死亡130多万人。手术、化疗及放疗是治疗恶性肿瘤的三大传统疗法。然而，恶性肿瘤手术后复发率却一直居高不下，化疗及放疗不仅给患者带来摧毁性的副作用，而且往往由于耐药性的产生及敏感性不强等问题而使疗效有限。因此，本领域迫切需要提供新的可长期使用、无毒副作用且安全有效的恶性肿瘤治疗药物或治疗药物的联合。具有抗肿瘤或潜在有抗肿瘤作用的物质往往在联合作用中可能产生相互作用，因此并不是所有的联合给药都能达到与两种药物单独给药相当的抗肿瘤效果和/或更低的毒性。目前，尚未有任何丹酚酸B和昔布类药物联合给药治疗恶性肿瘤的报道。
[0008] 本领域需要更安全可靠且有效的治疗肿瘤的药物。
发明内容
[0009] 因此，本发明的一个目的是提供更安全有效的治疗肿瘤的药物组合。
[0010] 在本发明的一个方面，提供了一种药物组合物，含有1-99重量％的丹酚酸B和1-99％重量％的化疗药，和药物学上可接受的载体。化疗药优选昔布类药物，更优选昔布类药物选自塞来昔布、罗非昔布、伐地昔布、依托昔布、和氯美昔布。更优选的，昔布类药物是塞来昔布。
[0012] 在该方面的另一个优选例中，该药物组合物含有丹酚酸B 1-300μM，塞来昔布1-300μM。
[0013] 在该方面的还有一个优选例中，丹酚酸B和塞来昔布的浓度比为1∶10-10∶1。优选丹酚酸B和塞来昔布的浓度比为1∶1。
[0014] 在本发明的第二个方面，提供了上述药物组合物用于制备抗肿瘤药的用途。优选抗肿瘤药的剂型选自液体剂型、注射剂型、散剂型、眼用剂型、输液剂型、片剂型、丸剂型、软膏剂型、硬膏剂型、栓剂、气雾剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、浸出剂、长效制剂、膜剂、海棉剂、微型胶囊、脂质体、贮库制剂、和放射性同位素制剂。
[0015] 在该方面的优选例中，肿瘤选自上皮组织癌、间叶组织癌、神经组织癌、淋巴及造血组织癌。
[0017] 图1显示了不同浓度的丹酚酸B、塞来昔布、及其组合对HNSCC细胞增殖的影响。
[0018] 图2A-C分别显示了不同浓度的丹酚酸B、塞来昔布、及其组合对HNSCC细胞中COX-2表达的抑制作用。
[0019] 图3A显示了LPS对前列腺素E2(PGE2)表达的随时间刺激作用。图3B显示了不同剂量的丹酚酸B对于LPS刺激的PGE2表达的抑制作用，其中分别使用了。图3C显示了单独使用丹酚酸B、塞来昔布、联合使用丹酚酸B和塞来昔布对PGE2表达的抑制。
[0020] 图4显示了对照、单独使用丹酚酸B、塞来昔布、和联合给药对体内肿瘤抑制随事件的曲线。
[0021] 图5A和图5B分别显示了显示了用LPS刺激的BPH1和BPH1C1细胞中COX-2表达的western印迹分析结果。其中分别显示了使用LPS阳性对照，单独使用丹酚酸B、塞来昔布、和联合给药的效果。
[0022] 图6显示了丹酚酸B和/或塞来昔布单独或联合给药在BPH1和BPH1C1细胞中对于LPS诱导的PGE2表达的影响。
[0023] 图7显示了未处理组、丹酚酸B处理组、塞来昔布处理组和联合给药组治疗荷瘤小鼠对其肿瘤体积的影响。
具体实施方式
[0024] 为了帮助理解和实施本发明，以下提供本文所用某些术语的定义。
[0025] 如本文所用，“化疗药”指通过化学作用影响肿瘤细胞生长增殖或阻断其生长周期的药物。这些药物包括细胞毒类药物，如烷化剂类，破坏细胞DNA和RNA、酶、蛋白质而导致细胞死亡，如氮芥、卡莫斯汀、白消安等；抗代谢类药，影响和阻断核酸合成，例如氟尿嘧啶、阿糖胞苷等；抗生素类，例如放线菌素D、丝裂霉素、光辉霉素等；生物碱类，用于干扰细胞内纺锤体的形成，使细胞停留在有丝分裂中期，例如长春新碱、鬼臼霉素、依托泊苷等；技术类，用于改变内环境而影响肿瘤生长，例如他莫昔芬、黄体酮、地塞米松等；以及其它类型的化疗药。
[0026] 如本文所用，药物或药理学活性的药物的“有效”量或“治疗有效量”是指无毒性，但足够量的提供所需的作用的药物或药剂。在本发明的联合治疗中，联合中一种成分的“有效量”是指该化合物在和其他成分联合应用时有效提供所需效应的量。“有效”量会因受试者的不同而不同，依据年龄和个体的一般情况，特定的活性药物等等。因此，不可能总是指定精确的“有效量”。然而，任何个体病例中合适的“有效”量可以由本领域的普通技术员应用常规的实验方法来测定。
[0027] 本文所用的术语“治疗”指症状的严重程度减轻和/或频率的减少，症状和/或引起症状原因的消除，症状的发生和/或它们引起症状的原因的预防，损害的改善或纠正。因此，例如“治疗”病人包括预防特定的病症或易感个体中有害的生理事件，以及处理有临床症状的个体。
[0028] 本文所用的术语“不良心血管事件”指心血管系统突然发生的病症或疾病；它也指这种病症或疾病的突然恶化。心血管事件的例子包括，但不局限于：心脏搏动停止、心肌梗塞、缺血、中风、心绞痛恶化、充血性心力衰竭。
[0029] 如本文 所用，术 语“丹酚酸B”指如上文 所述的 唇形科 植物丹 参(Salviamiltiorrhiza Bge.)的水溶性酚酸酚酸类物质的金属盐，其纯度高于90％。其中成盐金属离子包括但不限于镁离子、钠离子、钙离子、铁离子、钾离子等。
[0030] 如本文所用，术语“昔布类药物”为一种特异性COX-2抑制剂，其可以为原料药，也可以为任何一种药剂学上可接受的剂型。现有的昔布类药物具有共同的化学特征，均为三环组成的化合物，呈大体平面三角形排布，A环的对位连接氨磺酰基或甲磺酰基苯基；B环为苯基或取代的苯基；C环为五元或六元芳香环、芳杂环或脂肪(杂)环，连接AB两环。为保障活性要求，A环和B环与C环的邻位相联，并呈顺式构型。塞来昔布、罗非昔布和依托考西的化学结构和昔布类药效团示意如下：
[0031]
[0032] 如本文所用的术语“联合给药”指的是以某种给药方案将药物组合给予对象，如本文所述。丹酚酸B可与昔布类药物同时给予。或者可在给予昔布类药物之前给予丹酚酸B。此外，在分别给予两种药物的实施方式中，可延迟给予第二种药物，以提供更大的联合疗法治疗效果。药理学和医学领域技术人员将熟悉适用于确定给予非同时疗法中的暂时因素的概念、方法和材料。相关因素的例子包括但不限于：患者的生理节律、与待治疗疾病相关的细胞周期特征(例如，肿瘤细胞类型)、以及所用药物的药动学参数。
[0033] 本发明提供了药物组合物，所述组合物包含丹酚酸B与昔布类药物以及药学上可接受的载体。丹酚酸B和昔布类药物以合适的比例存在，以提供两种药物对补入动物联合施用的安全有效的治疗剂量。
[0034] 丹酚酸B和昔布类药物可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，从而形成药物组合物。
[0035] 固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括：无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合活性成分的特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂，如维生素E、维生素C、2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)和叔丁基羟基茴香醚(BHA)。
[0036] 通常，本发明的药物组合物包括以下剂型：液体剂型、注射剂型、散剂型、眼用剂型、输液剂型、片剂型、丸剂型、软膏剂型、硬膏剂型、气雾剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、浸出剂、长效制剂、膜剂、海棉剂、微型胶囊、脂质体、贮库制剂、和放射性同位素制剂等。口服给药的片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(混悬剂)(含有如约0.05％-5％悬浮剂(助溶剂))、糖浆(含有如约10％-50％糖)和酏剂(含有约20％-50％乙醇)，直肠或阴道给药的栓剂，或者以无菌可注射溶液或混悬剂形式(在等渗介质中含有约0.05％-5％助溶剂)进行非肠胃给药。这些药物制剂通常可含有与载体混合的约0.01％-99.9wt％，较佳地0.1％-99.5wt％，更佳地1％-99wt％(重量)的丹酚酸B和昔布类药物，按组合物的总重量计。
[0037] 另一方面，本发明还提供了试剂盒，使用单独药物形式的丹酚酸B和昔布类药物以使联合疗法更为便利。在一个实施方式中，该试剂盒包括两种药物独立的药物组合物，即包含丹酚酸B的第一药物组合物和包含昔布类药物的第二药物组合物。这些药物组合物可以是浓缩物或冻干物，其包含适当量的丹酚酸B或昔布类药物以及所需的辅料，备用于注射入患者之前用水性介质稀释，或者它们可以是备用于直接注射入患者的脂质乳剂。
[0038] 本发明所用的丹酚酸B和昔布类药物、本发明的药物组合物可通过口服、静脉内、肌内或皮下途径给药。优选口服给药方式。
[0040] 在使用本发明所述的丹酚酸B和昔布类药物时，还可与其它预防肿瘤的手段或其它药物(如托瑞米芬)联用。
[0041] 所用的活性成分的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明药物每天以约0.1-8000mg/kg动物体重(较佳地1-1000mg/kg体重，更佳地1-500mg/kg体重给药)的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1-4次的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为
1-16000mg或更高，较佳地10-8000mg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体混合的约0.1-8000mg的药物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
1-16000mg或更高，较佳地10-8000mg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体混合的约0.1-8000mg的药物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
[0042] 从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态或液态组合物。
[0043] 本发明包括治疗以下癌症或肿瘤的方法：上皮组织癌、间叶组织癌、神经组织癌、淋巴及造血组织癌；在具体实施方式中，肿瘤选自、鼻咽癌、食道癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、胶质瘤、和白血病。
[0044] 临床上，实施本发明的治疗和应用本发明组合物或药盒将导致癌性生长的大小或数量的降低和/或相关症状的降低(可适用时)。病理学上，实施本发明方法和应用本发明组合物可产生病理学相关效应，例如，抑制癌细胞增殖、减小癌或肿瘤的大小、防止进一步转移和抑制肿瘤血管发生。治疗这些疾病的方法包括将治疗有效量的本发明组合给予对象。需要时可重复该方法。实施本发明的治疗和应用本发明组合物或药盒还同时降低了药物的毒副作用，如昔布类药物的不良心血管事件的发生危险，因此提高了安全性。
[0045] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0046] 实施例1 体外检测丹酚酸B、塞来昔布或二者联合处理对头颈鳞状细胞癌细胞生长的影响
[0047] 1.克隆形成及繁殖率测定
[0048] 利用克隆形成及繁殖率实验检测丹酚酸B(Sal-B)、塞来昔布(Cel)联合处理对头颈鳞状细胞癌细胞(HNSCC，来自约翰霍普金斯大学头颈癌研究室的原代HNSCC培养物)细胞生长的影响。
[0049] HNSCC细胞以200个细胞/孔的密度接种在BD Falcon 6孔组织培养板上(PaloAlto，CA)。将细胞过夜吸附。培养物用Sal-B(1.25-250mM)或Cel(10-40mM)或Sal-B+Cel处理24小时。从每个孔中移除培养基，将细胞用PBS缓冲液漂洗。将新鲜的无药培养基加入到培养物中，放回孵箱孵育，10日内形成克隆。任何含有超过50个细胞的克隆代表了1种有活力的克隆原细胞。孔中的克隆在用次甲基蓝染色后进行计数。每1种处理进行3次这样的实验。
[0050] 计数结果统计证明(数据未提供)，Sal-B或Cel对细胞克隆形成有抑制作用且呈量效关系。Sal-B最低抑制浓度低于1.25mM，当浓度高于或等于250mM、处理时间为24hr时可彻底抑制HNSCC细胞形成克隆。Cel最低抑制浓度低于10mM，当浓度高于或等于40mM处理时间为24hr时可彻底抑制HNSCC细胞形成克隆。在125mM Sal-B和20mM Cel联合应用时，其抑制细胞繁殖率的作用明显大于相同浓度的Sal-B或Cel单独应用时的作用，呈现协同作用的效果，在250mM Sal-B和40mM Cel联合应用时，其抑制细胞繁殖率的作用显著大于相同浓度的Sal-B或Cel单独应用时的作用(见图1)。
[0051] 2.流式细胞法检测Sal-B和/或Cel处理对LPS诱导的COX-2表达的影响[0052] HNSCC细胞接种到含有2％胎牛血清的25cm2细胞瓶中，并暴露在100ng/ml脂多糖(LPS，一种COX-2刺激剂)和各种浓度的Sal-B或Cel或Sal-B+Cel中6小时，如图2所示。然后，细胞被收集，漂洗并悬浮在冰冷的PBS中。细胞在预冷的80％甲醇中固定，然后，用含有COX-2-FITC(1∶200)(Cayman ChemicalCompany，Ann Arbor，MI)的溶液在暗处室温下孵育30min。COX-2水平通过FACStar流式细胞仪(Becton Dickinson & Co.，San Jose，CA)进行测定。分析1万个细胞。
[0053] 实验结果表明，Sal-B或Cel能拮抗LPS刺激COX-2表达的作用，对COX-2的表达有抑制作用且呈量效关系(图2A和图2B)。在100ug/ml Sal-B和10mM Cel联合应用时，其抑制COX-2表达的作用明显大于相同浓度的Sal-B或Cel单独应用时的作用，呈现协同作用的效果(图2C)。
[0054] 3.酶免疫法检测Sal-B和/或Cel处理对LPS诱导的前列腺素E2(PGE2)表达的影响
[0055] HNSCC细胞分别用处于2％胎牛血清培养基中的100ng/ml LPS处理2、4、6、8小时，或用100ng/ml LPS以及不同浓度(以μM计)的Sal-B或Cel或其联合处理6小时。收集培养基，PGE2浓度用PGE2酶免疫试剂盒进行测定(Correlate-EIATMPGE2酶免疫试剂盒)。
[0056] 如图3A-C所示，结果表明，在没有其他干扰因素存在时，LPS刺激可以诱使PGE2浓度迅速升高(如图3A)。当LPS和不同浓度的Sal-B联合使用时，随着Sal-B浓度的增高，PGE2的浓度迅速降低，这表明Sal-B可拮抗LPS的作用(图3B)。当100ug/ml的Sal-B和10uM的Cel联合应用时，其抑制PGE2表达的作用显著大于单独应用Sal-B的作用，表明二者有明显的协同作用(图3C)。
[0057] 实施例2
[0058] 利用体内试验检测Sal-B或Cel或二者联合处理对HNSCC细胞生长的影响[0059] 4周龄、雌性、无胸腺裸鼠(Nu/Nu)从北京维通利华公司获得。它们在使用前用给定的含有101mg/kg生育酚和充足用水的啮齿类动物饮食方法喂养1周。鼠被喂养在温度可控的每12小时变换明暗的房间内(23土1℃)。小鼠被分成4组(每组5只)：Sal-B处理组，Cel处理组，联合处理组和未处理对照组。体重和食物/水吸收1周测量2次。6
JHU-013癌细胞(2×10 个细胞/100μl/鼠)用25标准度量的针头皮下注射到小鼠的下背部，得到鼠人异种嫁接肿瘤模型。在注射JHU-013细胞后，小鼠每日分别通过腹膜内注射接受Sal-B(100mg/kg)或Cel(5mg/kg)或Sal-B+Cel(50mg/2.5mg/kg)。处理每日进行，持续21d。
JHU-013癌细胞(2×10 个细胞/100μl/鼠)用25标准度量的针头皮下注射到小鼠的下背部，得到鼠人异种嫁接肿瘤模型。在注射JHU-013细胞后，小鼠每日分别通过腹膜内注射接受Sal-B(100mg/kg)或Cel(5mg/kg)或Sal-B+Cel(50mg/2.5mg/kg)。处理每日进行，持续21d。
[0060] 分别在第7日、第14日用游标卡尺测量肿瘤结节的长径和短径，肿瘤体积V＝1/22
长径×短径 ，最后在第21日时采用宰杀实验动物剥离接种肿瘤，体外测量肿瘤体积的方法获得数据。
长径×短径 ，最后在第21日时采用宰杀实验动物剥离接种肿瘤，体外测量肿瘤体积的方法获得数据。
[0061] 如图4所示，Sal-B和Cel处理均可抑制体内肿瘤的发育，而且二者联合应用的作用大于单独应用Sal-B或Cel的作用，呈明显的时效关系。
[0062] 实施例3 体外检测丹酚酸B、塞来昔布或二者联合处理对前列腺增生症上皮细胞生长的影响
[0063] 1.Western Blot法检测丹酚酸B和/或塞来昔布处理对LPS诱导的COX-2表达的抑制作用
[0064] BPH1和BPH1C1细胞(来自ATCC)接种到含有2％胎牛血清的25cm2细胞瓶中，并暴露在100ng/ml脂多糖(LPS)和125μM Sal-B或20μM Cel或Sal-B+Cel中6小时。然后，细胞被收集，漂洗并悬浮在冰冷的PBS中。细胞在预冷的80％甲醇中固定，然后，COX-2水平利用HRP标记的COX-2抗体通过Western Blot进行定性分析。
[0065] 如图5A和图5B所示，实验结果表明，Sal-B或Cel能拮抗LPS刺激COX-2表达的作用，在125μM Sal-B和20μM Cel联合应用时，其抑制BPH1细胞COX-2表达的作用明显大于相同浓度的Sal-B或Cel单独应用时的作用，呈现协同作用的效果，BPH1C1的结果与此类似。
[0066] 2.酶免疫法检测Sal-B和/或Cel处理对LPS诱导的PGE2表达的影响
[0067] BPH1和BPH1C1细胞分别用处于2％胎牛血清培养基中的100ng/ml LSP处理2、4、6、8小时，或用100ng/ml LPS以及125μM Sal-B或20μM Cel或Sal-B+Cel中处理6小时。收集培养基，PGE2浓度用PGE2酶免疫试剂盒进行测定(Correlate-EIATM前列腺素E2酶免疫试剂盒)。
[0068] 图6表明，在没有其他干扰因素存在时，LPS刺激可以诱使PEG2浓度迅速升高，当LPS和Sal-B联合使用时，PGE2的浓度不变，当LPS和Cel联合使用时，PGE2的浓度不变，当Sal-B和Cel联合应用时，其抑制BPHl细胞PEG2表达的作用显著大于单独应用Sal-B或Cel的作用，表明二者有明显的协同作用，BPH1C1的结果不明显。
[0069] 实施例4 利用体内试验检测Sal-B或Cel或二者联合处理对BPH1和BPH1C1细胞生长的影响
[0070] 4周龄、雌性、无胸腺裸鼠(Nu/Nu)从北京维通利华公司获得。它们在使用前用给定的含有101mg/kg生育酚和充足用水的啮齿类动物饮食方法喂养1周。鼠被喂养在温度可控的每12小时变换明暗的房间内(23±1℃)。小鼠被分成4组(每组5只)：Sal-B处理组，Cel处理组，联合处理组和未处理对照组。体重和食物/水吸收1周测量2次。BPH16
或BPH1C1细胞(2×10 个细胞/100μl/鼠)用25标准度量的针头皮下注射到小鼠的下背部，得到鼠人异种嫁接肿瘤模型。在注射BPH1或BPH1C1细胞后，小鼠每日分别通过腹膜内注射接受Sal-B(100mg/kg)或Cel(5mg/kg)或Sal-B+Cel(50mg/2.5mg/kg)。处理每日进行，持续7天。在第7日时采用宰杀实验动物剥离接种肿瘤，体外测量肿瘤体积的方法获得数据。
或BPH1C1细胞(2×10 个细胞/100μl/鼠)用25标准度量的针头皮下注射到小鼠的下背部，得到鼠人异种嫁接肿瘤模型。在注射BPH1或BPH1C1细胞后，小鼠每日分别通过腹膜内注射接受Sal-B(100mg/kg)或Cel(5mg/kg)或Sal-B+Cel(50mg/2.5mg/kg)。处理每日进行，持续7天。在第7日时采用宰杀实验动物剥离接种肿瘤，体外测量肿瘤体积的方法获得数据。
[0071] 图7的结果表明，Sal-B和Cel处理均可抑制体内肿瘤的发育，而且二者联合应用的作用大于单独应用Sal-B或Gel的作用，呈明显的协同效应。
[0072] 因此，上述试验证明了丹酚酸B和昔布类药物在体内和体外对于肿瘤细胞增殖和发育的协同抑制作用。揭示了该药物组合在治疗癌症和肿瘤的药物中的意义。
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