本发明涉及由鲨鱼软骨提取的低分子量成分及其制备方法。本发 明还涉及在多种条件下分离和纯化该软骨提取物的方法。上述低分子 量成分表现出至少一种的抗基质金属蛋白酶(抗MMP)、抗血管生成和 抗肿瘤活性。

国际专利申请公开WO95/32722、WO96/23512和WO97/16197 中公开了制备鲨鱼软骨提取物的方法以及这些提取物本身。在多种实 验中测试了鲨鱼软骨的液体提取物的抗血管生成、抗溶胶原、直接抗 肿瘤增殖和抗炎作用。

WO95/32722公开了一种获得具有抗血管生成、体外直接抗肿瘤 增殖和体内抗肿瘤活性的鲨鱼软骨提取物的方法。该方法包括：将鲨 鱼软骨组织混合并且将其在水中的粒度减小至约500μm；将活性成分 提取到水中；并且分馏由此得到的提取物回收分子量小于约500kDa 的分子(0-500馏分)。在公称孔隙率约为1kDa的膜上浓缩该液体软骨 提取物，生成含有分子量低于约500kDa的分子的浓缩液体提取物。该 提取物富集了分子量在约1-500kDa之间的分子。将0-500馏分进一步 分馏生成多种含有分子量在约1-120kDa内的抗肿瘤增殖分子的提取 物。但专利申请公开WO95/32722没有描述对分子量低于约1kDa的 成分的具体回收。也未公开一种在含有机溶剂的溶液中获得软骨提取 物或馏分本身的方法。

国际专利申请公开WO96/23512公开了一种用于在水溶液中由任 何来源的软骨提取生物活性成分的方法。此外，该专利申请公开了与 液体鲨鱼软骨有关的其他生物活性，也就是抗溶胶原和抗炎活性。专 利申请公开WO96/23512既没有公开分子量小于约1kDa成分的回收 方法，也没有公开任何应用含有机溶剂溶液的方法。

国际专利申请公开WO97/16197公开了一种回收水提取物的方 法，所述水提取物中富集分子量在约0.1至500kDa内的分子。尽管该 方法可以回收分子量小于约1kDa的成分。但它未提供任何有关特定 低分子量成分的回收方法。也没有公开已分离或纯净形式的成分。

现有技术普遍公认，基质金属蛋白酶参与新血管形成的过程，促 进原发性肿瘤的生长和转移的形成。因此，具有抗血管生成和/或抗基 质金属蛋白酶的化合物或药物适用于至少一种的抑制新血管形成、抑 制肿瘤生长、抑制细胞的转移侵染、抑制转移的形成并且治疗血管生 成相关性疾病。

得自鲨鱼软骨的成分令人感兴趣，需要改进其制备方法以及用于 分离和纯化其他具有生物活性的未知成分的方法。

本发明提供一种用于制备由鲨鱼软骨获得的提取物的改进方法。

在一个方面中，本发明提供了一种方法，其中采用多种条件制备 软骨提取物及其含有生物活性成分的馏分。在一个实施方案中，本发 明提供一种用于制备含有至少具备抗MMP的活性成分的鲨鱼软骨提 取物的方法。

另一方面中，本发明提供一种方法，通过该方法衍生自软骨液体 提取物的生物活性成分的0-500分子量馏分被分离为两个单独馏分， 其中第一馏分含有分子量小于1kDa(0-1馏分)的成分，并且第二馏分含 有分子量在1-500kDa(1-500馏分)内的成分。

为了将组分聚集物的形成减至最小，为提高溶解和维持稳定可溶 的形式，蔗糖或一种或多种其他适当稳定剂如葡聚糖、FocollTM(蔗糖 和表氯醇共聚物)、果糖、明胶、葡萄糖、甘氨酸、肌醇、乳糖、甘露 糖醇和山梨糖醇可以以充分稳定的量加入任何0-500、0-1和1-500馏 分中，或可应用在制备过程的任何步骤中。在此有关馏分、溶液或提 取物所用的术语“含有1％w/v蔗糖”是指含有约1％w/v蔗糖的各个 馏分、溶液或提取物。0-1和1-500馏分中的生物活性成分具有抗 MMP、抗血管生成和抗肿瘤活性。

另一方面，本发明提供一种分子量约为244amu(原子质量单位)的 鲨鱼软骨衍生成分，在此称作I-E-986，该成分具有至少一种的抗MMP 和抗肿瘤活性。用于纯化I-E-986的方法和材料揭示出后者的一些物理 化学特征，这些特征能够使这种成分在不同的溶剂相和色谱体系中被 区分出来。本发明还提供一种用于分离和纯化I-E-986成分或由任何来 源软骨获得的等效成分的方法。

本发明的另一方面提供衍生自任意来源的软骨的纯生物活性化合 物，其相应于由鲨鱼软骨分离的分子量约为244amu且具有抗MMP 和抗肿瘤活性的化合物。

本发明的再一方面提供一种抑制MMP酶的方法，该方法包括将 由被所述酶裂解的底物与有效量的一种或多种本发明的软骨提取物或 其衍生馏分或I-E-986成分相接触的步骤。

本发明的又一方面提供一种抑制新血管形成和转移形成的方法， 所述方法包括使靶向组织与有效量的所述软骨衍生提取物，溶液，匀 浆，混悬液，馏分如0-500馏分、0-1馏分、1-500馏分或含有1％W.v 蔗糖的相同馏分，或成分如成分I-E-986相接触的步骤。

附图简述

下列附图是本发明说明书的组成部分，而且涉及进一步证明本发明 的一些方面。通过参考一个或多个这些附图结合本发明具体实施方案 的详细描述可更好地理解本发明。

图1a和1b描绘了在HPLCC18体系上利用甲酸铵缓冲液(pH7) 和等度洗脱由测定I-E-986获得的总离子色谱图和单离子色谱图(245 M+1)。

图2a和2b描绘了在HPLCC18体系上利用甲酸铵缓冲液(pH3) 和梯度洗脱由测定I-E-986获得的总离子色谱图和单离子色谱图(245 M+1)。

图3a和3b描绘了在HPLCC18体系上利用甲酸铵缓冲液(pH3) 和等度洗脱由I-E-986分析获得的总离子色谱图和单离子色谱图(245)。

图4a和4b描绘在HPLCNH2体系上利用甲酸铵缓冲液(pH3)和 梯度洗脱由I-E-986分析获得的总离子色谱图和单离子色谱图(245)。

图5描绘了I-E-986的MS/MS光谱，它表示损失相当于失去一个水 分子的失去18amu(主峰m/e227.1)的光谱。

图6描绘了离子227(245 M+1减去水分子)的特定碎片的MS/MS 光谱。

利用至少一个下列分析试验测定鲨鱼软骨提取物、其衍生馏分及 其成分I-E-986的生物性质： ·明胶酶抑制试验(GIA)：一种用于评价抗MMP活性的试验； ·胚胎血管形成试验(EVT)：一种评估抗血管生成活性的试验；和 ·Lewis肺癌转移小鼠模型(LLC)：一种评估抗肿瘤活性的试验。 GIA

采用市售试剂盒(Boehringer Mannheim)进行GIA。利用GIA测定 所述软骨衍生提取物中的成分、或其馏分或成分I-E-986抑制明胶酶， 即一种酶(MMP-2)的能力。 简单而言，GIA按照以下方式进行。将生物素标记明胶底物与明胶 酶A在液体软骨提取物或其衍生物不存在或存在的条件下温育。随 后，将反应混合物加样到链霉抗生物素涂层的微量滴定平板上。该生 物素标记明胶通过其游离生物素残基键合在链霉抗生物素涂层的微量 滴定平板上。如果底物、明胶没有被剪接，链霉抗生物素-过氧化物酶 (POD)偶联物可键合在明胶酶-生物素复合物上。随后POD使加入的 ABTS底物转化为绿色终产物，其在405nm下测定。然而，如果生物 素标记明胶被明胶酶剪接，则只有少量明胶片段形成。在附着在微量 滴定平板上后，这些片段不具有与链霉抗生物素-POD偶联物结合的能 力；因此，不发生着色反应。

所以，高明胶酶活性产生低信号，低明胶酶活性反而(例如通过加 入抑制剂)引起高信号。在软骨衍生提取物中的成分或其衍生馏分中寻 找到的活性可以是明胶酶的抑制活性或是竞争明胶酶与其明胶底物之 间的反应的拮抗活性(例如拮抗成分结合明胶)。 EVT

胚胎血管形成试验(EVT)用来测定鲨鱼软骨液体提取物中的成分 或其衍生馏分抑制新血管形成的能力(抗血管生成活性)。

鸡胚胎的正常发育包括位于卵黄膜内外部血管系统形成，卵黄膜 由卵黄(蛋黄)运送营养物以发育胚胎。当置于卵黄膜上时，抗血管生成 物质可以抑制在卵黄膜内发生的血管形成。

将含有不同量的得自鲨鱼软骨衍生液体提取物的成分，或其衍生 馏分或适当对照物的甲基纤维素圆盘(惰性固体和透明基质)置于卵黄 膜血管周边的外缘上，在此发生血管生成过程。阳性对照是由含有 1.5mg/ml2-甲氧基雌二醇的甲基纤维素圆盘构成。将对照和含样品圆 盘置于3天龄胚胎的卵黄膜上。在这一点，只有主血管开始侵袭卵黄。 同时将含有阴性对照或一定量的得自鲨鱼软骨衍生液体提取物的成分 或其衍生物馏分的甲基纤维素圆盘始终置于同一胚胎的卵黄膜上。两 个圆盘以相对于胚胎头尾轴对称的方式放置，以便在对比所述成分和 阴性对照的功效时减小个体之间的差异。在圆盘沉积后24小时评估血 管形成，结果表示为其中血管形成受到影响的胚胎的百分比。当与阴 性对照对比其生长途径出现偏离或减弱或当在圆盘下观察不到其生长 时可以认为血管形成受到影响。 LLC模型

利用Lewis肺癌小鼠模型(LLC)测定鲨鱼软骨液体提取物的成 分，或其衍生馏分或I-E-986抑制转移在肺内形成的能力。

细胞培养：通过P.Brodt博士(Brodt.P，《癌症研究》(Cancer Res.)， 46:2442,1986)建立对肺具有高转移潜能的Lewis肺癌结肠M27。这种 模型易于建立并且公认它可预测体外和体内活性之间的相关性。将细 胞维持在RPMI-1640培养基中和5％CO2下，该培养基中补充有10％ 胎牛血清和1％青霉素-链霉素，并且每周传代2次。生成细胞原液， 将其作为早代保藏。所有试验采用相同的传代。为诱导肿瘤，M27细 胞以70％融合率在完全培养基中生长，随后用胰蛋白酶-EDTA溶液 (0.05％胰蛋白酶，存在于HBSS中的0.53mM EDTA-4Na，无Ca++或 Mg++)收集。随后将细胞离心，洗涤并且重新悬浮(1×106LLC细胞 /200μl的PBS，无Ca++和Mg++)。通过台盼(trypan)蓝染色检测成活力， 并且只取其中存活率高于95％的烧瓶用于接种。

肿瘤的诱导：采用C57B/10雌性小鼠(15至20g)(Charles river Inc.) 诱导Lewis肺癌肿瘤。培育1周后，在第0天将LLC细胞皮下转移(5 ×105活细胞/100μl)到右胁腹的腋区。所有动物在相同位置接种。用卡 钳每天监测肿瘤的生长。利用下式计算相对肿瘤体积：长度(cm)×[宽 度(cm)]2/2，其中长度相当于肿瘤的纵轴且宽度相当于肿瘤的垂直最短 轴。当原发性肿瘤的大小达到0.5-1.0cm3(接种10天后)，将具有大致 相同尺寸的原发性肿瘤的小鼠随机分成单独试验组，每组15只动物， 用耳部穿孔法标记上编号。手术在灭菌条件下进行。在完成皮肤小切 口(0.5-1cm)后，小心地将肿瘤与周围健康组织分开。LLC细胞(处于生 长的早期阶段)可以形成良好的局部肿瘤，而且易于分离获得，同时对 正常组织无明显损害。实体镜试验显示，在肿瘤接种位置不存在任何 可目测到的残余肿瘤，并且在我们的条件下观察不到肿瘤的再生长。 取出后，将肿瘤称重并且用手术不锈钢夹闭合伤口，用吡咯烷酮 (providone)-碘消毒。

效能研究试验设计：在取出肿瘤后当天(接种后11天)开始用不同 的试验样品(衍生自试验软骨液体提取物的成分，其衍生馏分或I-E-986) 处理。软骨衍生产物的盐水通过口饲管每天给药2周。口饲管(0.5ml) 采用22G弯针进行。如上述试验表明，在原发性肿瘤取出后约2周期 间足以在肺表面获得平均30-50个结节，2周后在CO2室内处死动物。 尸体解剖后，取出两侧的肺，称重并且在10％布安氏固定剂中固定。 用立体显微镜(4X)计数肺表面转移物。

体重的测量：每2或3天监测体重直至处死为止。 制备软骨提取物的方法 用含有机溶剂的溶液由鲨鱼软骨提取活性成分

本发明提供一种制备软骨提取物和获得、分离或纯化其中生物活 性成分的方法。其中至少一部分的生物活性成分不是蛋白性质。然而， 本发明的方法中可采用有效提取含蛋白成分的离液剂。

在此所用术语“含有机溶剂溶液”是指含有至少部分有机溶剂的 溶液或混合物。该含有机溶剂溶液可以含有一种或多种有机溶剂并且 可以含有水。在此所用的有机溶剂或有机溶剂的混合物优选为极性。 在一个实施方案中，甲醇和乙醇中的至少一种可以用来制备鲨鱼软骨 液体提取物。其他有机溶剂如乙腈、丙醇、异丙醇和丙酮是可应用的 适当极性溶剂。所述有机溶剂可以包括一种或多种卤代、醚、质子、 非质子、极性、非极性、碱性、酸性、疏水性和亲水性溶剂。

适用的卤代溶剂包括：氯仿、二溴甲烷、氯丁烷、二氯甲烷。

适用的醚溶剂包括：二甲氧基甲烷、四氢呋喃、乙醚、乙二醇二甲 醚、乙二醇二乙醚、二甘醇二乙醚、三甘醇二甲醚、叔丁基乙基醚， 或叔丁基甲基醚。

适用的质子溶剂可以包括，例如但不限于：甲醇、乙醇、2-硝基乙 醇、2-氟乙醇、2,2,2-三氟乙醇、乙二醇、1-丙醇、2-丙醇、2-甲氧基乙 醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔丁醇、2-乙氧基乙醇、二甘醇、1-、 2-或3-戊醇、新戊醇、叔戊醇、二甘醇一甲醚、二甘醇一乙醚、环己 烷、苯甲醚、苄醇、苯酚或甘油。

适用的非质子溶剂可以包括，例如但不限于：二甲基甲酰胺 (DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2(1H)-嘧啶酮 (DMPU)、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮(DMI)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、甲 酰胺、N-甲基乙酰胺、N-甲基甲酰胺、乙腈、二甲基亚砜、丙腈、甲 酸乙酯、醋酸甲酯、丙酮、乙基甲基酮、乙酸乙酯、环丁砜、N,N-二 甲基丙酰胺、四甲基脲、硝基甲烷、硝基苯，或六甲基磷酰胺。

适用的碱性溶剂包括：2-、3-或4-甲基吡啶、吡咯、吡咯烷、吗啉、 吡啶或哌啶。

适用的酸性溶剂包括三氟乙酸、乙酸、丙酸或甲酸。

适用的烃类溶剂包括：苯、环己烷、戊烷、己烷、甲苯、环庚烷、 甲基环己烷、庚烷、乙基苯、辛烷、2,3-二氢化茚，壬烷，或萘。

含有机溶剂溶液可以含有有机溶剂的混合物和/或有机溶剂和水 的混合物。适当的质子溶剂和水的混合物包括，例如但不限于：水-甲 醇、水-丙醇、水-异丙醇、水-丁醇。适当的含有可有可无水的非质子 溶剂混合物可以包括，例如但不限于水-乙腈、水-二甲基亚砜、甲醇- 乙腈、甲醇-二甲基亚砜、乙醇-乙腈，和乙醇-二甲基亚砜。

有机溶剂在本发明中的含量可以根据由软骨提取的成分的本质或 物理性质变化。通常，含有机溶剂溶液应含有以总溶液体积计约1-100 ％v/v，约40-80％v/v，至少1％v/v，至少10％v/v，至少25％v/v， 至少50％v/v，至少90％v/v或至少99％v/v的有机溶剂。

所以，本发明提供一种制备鲨鱼软骨的提取物的方法，该方法包 括步骤： a)用一定量的含有机溶剂溶液处理鲨鱼软骨原料，生成含有鲨鱼软骨 的可溶成分的第一混合物； b)分离该第一混合物，生成含有该可溶成分的第一液体提取物和第一 固体物；和 c)由所述第一液体提取物除去有机溶剂。

所述方法可以进一步包括的步骤是： d)由第一液体提取物除去足够量的液体，生成基本上干燥的第二固体 物； e)向该第二固体物加入水，生成第二混合物；和 f)分离所述第二混合物，生成第一最终液体提取物和第三固体物。

用含有机溶剂溶液，或用水代替含有机溶剂的溶液，按照a)-c)所 述步骤另外提取一次或多次含有鲨鱼软骨原料的第一固体物，生成含 有至少剩余量的鲨鱼软骨可溶成分的第二和第三或进一步的最终液体 提取物。

在步骤b)中，固体和液体的分离可以按照任何那些所属领域普通 技术人员已知的多种方法进行，其中包括，例如但不限于：离心、过 滤、渗滤、超滤、微量过滤，和沉降固体并且除去上清液。

如步骤c)所述，有机溶剂的除去可以按照任何那些所属领域普通 技术人员已知的多种方法进行，其中包括，例如但不限于：蒸发、冷 冻干燥、蒸馏、干燥、加入有机溶剂吸收剂、液/液提取和旋转蒸发。

本发明所用鲨鱼原料应是固体并且可以是，例如粉末、颗粒、棒 状或微粒。在步骤a)之前，可以将鲨鱼原料均化。在此所用术语“均 化”“匀浆”和“搅匀”是指一种提高由软骨原料提取所需成分的功 效的方法，可以通过：a)增加软骨原料的总表面或比表面，或b)促使 软骨原料释放所需成分。均化可以通过一种或多种化学方法、物理方 法及其组合来进行。

用于均化软骨原料的化学方法包括一种或多种可溶胀软骨、破裂 或溶解软骨原料内的细胞或细胞外基质，和/或提高软骨原料的孔隙率 的化学试剂。所述化学试剂的非限定实例包括洗涤剂、表面活性剂、 离子性试剂、非离子试剂、还原剂、螯合剂、糖基化试剂、离液剂、 脲、胍、磷脂、糖脂、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、十二烷基硫酸钠、 三硝基甲苯溶液和其他所属领域技术人员已知的此类试剂，或由 Judith Neugebauer公开在“洗涤剂在生物学和生物活性中的性质和应 用指南”(Calbiochem-Novabiochem公司，1988)，该文献在此引入作为 参考。

用于均化软骨原料的物理方法一般是使鲨鱼原料的平均粒度减 小，由此增加其比表面积。粒度的减小可以通过一种或多种以下例举 的方法来进行，其中包括：粉碎、微粉化、碾磨、磨碎、截断、高速 下混合和其他所属领域技术人员已知的用于减小粒度的方法。

提取溶液可以含有提取增强剂，其可以增强由软骨提取所述成分 的提取作用。这些提取增强剂可包括无机或有机酸、无机或有机碱、 聚合物、缓冲剂、盐和其他所属领域技术人员已知的类似试剂。

按照一个实施方案，由软骨提取低分子量原料可以通过以下步骤 进行： a)用甲醇(1kg)处理均化的鲨鱼软骨原料(1kg)，生成含有鲨鱼软骨的可 溶成分的第一混合物； b)将该第一混合物离心，生成含有所述可溶成分的第一液体提取物和 第一固体物； c)蒸发该第一液体提取物中的甲醇； d)由该第一液体提取物蒸发足够量的液体，生成基本上干燥的第二固 体物； e)向该第二固体物中加入水(1kg)生成第二混合物；和 f)将所述第二混合物离心生成第一最终液体提取物和第三固体物。 上述步骤c)和d)可以任选地组合以使第一液体提取物直接生成第二固 体物。

所有由上述步骤对鲨鱼软骨的提取和再提取获得的液体提取物用 来分析它们的干重内容物和蛋白浓度(按照标准Bradford蛋白分析法 测定)，作为回收的可溶成分的一个指示。另外评价其抗MMP活性。 结果概括在表1中： 表1    试验馏分 干重(mg/ml)  蛋白浓度(μg/ml)  GIA(抑制％)    CTRL-S1     21.9       2133.8      72    CTRL-S2     12.1       1016.3      42    CTRL-S3      6.2        758.6      47   SU-MET-S1     14.3         54.8      52   SU-MET-S2      6.1         28.6      13   SU-MET-S3      3.4         48.5       0   SU-ETH-S1      5.5         30.8      16   SU-ETH-S2      7.1         79.5       4   SU-ETH-S3      2.9         63.7       0

如表1中所用，“CTRL”(对照样本)是指当用纯水作为提取溶剂 时所得的最终液体提取物。术语“SU-MET”是指用甲醇作为含有机 溶剂溶液所获得的最终液体提取物。术语“SU-ETH”是指用乙醇作为 含有机溶剂溶液所获得的最终液体提取物。“S1”、“S2”和“S3” 分别是指用指定溶剂作为含有机溶剂溶液或用纯水所获得的第一最终 液体提取物，第二最终液体提取物，和第三最终液体提取物。

结果证明，含水和非水的含有机溶剂溶液都可以用来回收鲨鱼软 骨中至少具有抗MMP作用的生物活性成分。此外，通过连续-反复 提取鲨鱼软骨的固体颗粒可以提取出其余活性。通过干重试验和蛋白 质回收率的测定，抗MMP活性和被分离原料的用量之间没有明显的 直接相关性。 软骨和纯水的比例对液体提取物制备的影响

按照本发明的第一种实施方案，用水制备粗品液体提取物，其中软 骨(C)和纯水(E)的比例分别约为1kg:1L。回收成分的方法包括步骤： a)在水溶液中均化鲨鱼软骨直至软骨粒度减小到平均粒度小于500μ， 生成匀浆； b)令该匀浆平衡以使生物活性成分被萃取至该含水溶液中生成第一混 合物，第一混合物包括第一固体物和含所述生物活性成分的第一液体 提取物(LE)； c)由该第一固体物分离出第一液体提取物； d)对该第一液体提取物进行分离处理，生成含有分子量小于约500kDa 的软骨分子的第二液体提取物(LE-0-500)； e)经孔隙率为0.22微米的微量过滤膜过滤该第二液体提取物，生成最 终液体提取物(P-C1-E1，其基本上等效于0-500馏分)；

本发明方法也采用了如下所示的不同软骨和水的比例进行：     馏分ID      软骨的量(kg)    纯水的量(L)    *P-C3-E1          3         1    P-C2-E1          2         1    P-C1-E1          1         1    P-C1-E2          1         2    P-C1-E3          1         3 *P是指在分离步骤中形成的渗透物

分析所有按照上述方法制备的第一液体提取物的干重内容物、蛋 白质浓度及其抗MMP活性。结果概括在表2中。 表2    试验馏分       干重     (mg/ml)   蛋白质浓度    (μg/ml)      GIA*  (百分抑制率)    P-C3-E1       25.2      482.5       55    P-C2-E1       22.1      379.4       52    P-C1-E1       15.0      324.3       54    P-C1-E2        9.9      191.5       32    P-C1-E3        6.3      157.8       24 *GIA以30μl等份试样的20X浓缩样品进行

这些结果表明，每1千克的鲨鱼软骨起始原料可以回收得到约20g 的可溶成分。在特定条件下可溶成分的最大回收率是19.8(9.9×2)和 18.9(6.3×3)g的可溶成分/千克鲨鱼软骨(P-C1-E2和P-C1-E3)。

这些结果还表明，利用不同的软骨和纯水比例可以有效回收干重内 容物、蛋白内容物以及具有抗MMP活性的成分。

由P-C1-E1提取回收的第一固体物用相同的软骨和纯水比例再提 取2次可以回收其中所含剩余量的成分。第一固体物的再提取方法包 括以下步骤： f)将由步骤c)回收的第一固体物用纯水处理，生成第二混合物，将该混 合物分离成为第二液体提取物(P-C1-E1-2)和第二固体物，其中可以按 照步骤d)和e)处理该第二液体提取物；和，任选地 g)对该第二固体物重复步骤f)，生成第三液体提取物(P-C1-E1-3)和第 三固体物，其中可以按照步骤d)和e)处理该第三液体提取物。

表3概括了上述步骤a)至g)所用水和鲨鱼软骨的量。 表3     馏分ID       软骨的量(Kg)    纯水的量(L)    P-C1-E1           1        1    P-C1-E1-2   回收P-C1-E1后的固体物        1    P-C1-E1-3  回收P-C1-E1-2后的固体物        1

分析所有由上述方法获得的液体提取物的干重内容物、蛋白质浓 度和抗MMP活性。结果概括在表4中。 表4    试验馏分      干重    (mg/ml)   蛋白质浓度    (μg/ml)      GIA*  (百分抑制率)    P-C1-E1      15.0      324.3       54    P-C1-E1-2       4.3       54.5       21    P-C1-E1-3       1.3       27.0       17 *GIA以30μl等份试样的20X浓缩样品进行

这些结果表明，按照上述步骤a)至c)一次或多次提取鲨鱼软骨可 以获得高回收率的鲨鱼软骨的可溶成分。此外，在将同一固体颗粒第 二次和第3次提取后仍然可以提取到剩余量的具有抗MMP活性的成 分。

对于所属领域技术人员很显然的是，改进提取参数，例如温度、 提取次数或提取溶剂，可以使回收固体、蛋白质和生物活性成分的量 最佳化。 用于制备不同分子量部分的衍生自软骨的成分的方法

0-500馏分：0-500馏分是含有分子量小于约500kDa的成分的鲨 鱼软骨液体提取物。制备0-500馏分的方法概括在国际专利号WO 95/32722、WO96/23512和WO97/16197，其相关公开内容在此引入作 为参考。这些现有技术的方法包括步骤： a)在与保持软骨中存在的生物活性成分的完整性相容的条件下将鲨鱼 软骨在水溶液中均化直至该软骨减小为粒度小于约500μm的固体颗 粒； b)将该生物活性成分提取到该含水溶液中，得到固体微粒和含生物活 性成分的粗品液体提取物(LE)的混合物； c)分离该液体提取物和固体微粒； d)进一步分离粗品液体提取物由此获得含有分子量小于约500kDa的 分子的最终液体提取物(0-500)；和 e)在微量过滤膜(0.22微米)上过滤该LE-0-500并且冷冻得到最终液体 提取物(0-500馏分)。

0-1和1-500馏分：0-1馏分是含有分子量小于约1kDa的成分的 鲨鱼软骨液体提取物。1-500馏分是含有分子量约为1-500kDa的成分 的鲨鱼软骨液体提取物。鲨鱼软骨提取物的0-1和1-500馏分是采用超 滤体系、利用分子量截止约为1kDa的膜制备。利用这种体系，经过 一个纯化循环(一个纯化循环的定义是该纯化步骤在回收50％的渗透 物时停止)后得到这两种软骨馏分。当用终体积等于提纯所用软骨提取 物的起始体积的纯水重组时，含保留物(R)的1-500馏分含有1X浓度 的分子量约1-500kDa的成分和0.5X浓度的分子量小于1kDa成分，以 纯化所用的初始提取物计。0-1馏分含有仅由分子量小于约1kDa且为 1X浓度的成分组成的渗透物(P)。利用该超滤体系，通过另外的纯化 循环可以进一步提纯1-500馏分，如表5证实。 表5                          在PMI上连续超滤后的理论浓度  纯化循环           渗透物(P)              保留物(R)    馏分ID   [＜1KDa]   馏分ID   [＜KDa]  [1-500KDa]     1    P1-0-1      1X  R1-1-500     0.5X      1X     2    P2-0-1     0.5X  R2-1-500     0.25X      1X     3    P3-0-1     0.25  R3-1-500     0.13X      1X     4    P4-0-1     0.13X  R4-1-500     0.06X      1X     5    P5-0-1     0.06X  R5-1-500     0.03X      1X     6    P6-0-1     0.03X  R6-1-500     0.02X      1X

按照上述方法制备多个批次的0-1和1-500馏分。为了减少聚集物 的形成和提高溶解作用并且维持稳定、可溶形式，用1％w/v蔗糖水溶 液作为提取的稳定剂。

通过首先按照现有技术所述方法制备一批LE-0-500馏分，并且其 次增加下列新的步骤来获得0-1和1-500馏分： e)任选地用含有终浓度约为1％(w/v)蔗糖的溶液制备LE-0-500提取 物，生成含有1％蔗糖的LE-0-500馏分； f)用具有公称分子量截止约为1kDa的膜过滤LE-0-500或含有1％蔗糖 的LE-0-500，生成含有分子量小于1kDa的软骨分子的液体提取物(分 别是Pn-0-1和含有1％蔗糖的Pn-0-1馏分，其中“n”是指表5的纯 化循环)，并且生成含有分子量高于约1kDa的软骨分子的鲨鱼软骨液 体提取物(分别是Rn-0-1和含有1％蔗糖的Rn-0-1馏分，其中“n”是 指表5的纯化循环)；和； g)通过孔隙率约0.22微米的微量过滤膜微量过滤保留物和渗透物液体 提取物。

上述过程可以不包括步骤e)从而制备无蔗糖的提取物。渗余物液 体提取物可以超滤一个或多个，优选4个或多个纯化循环以生成另外 的含有分子量小于约1kDa软骨成分的滤液提取物(P1-0-1至P6-0-1)并 且生成含有分子量在1至约500kDa软骨成分的保留物提取物(R-6-1- 500和含有1％蔗糖的R6-1-500)。可以将上述液体提取物任选地冷冻 保藏。

所以，上述方法可用来制备以下液体提取物。 1)由LE0-500制备的0-500馏分 2)由含有1％蔗糖的LE-0-500制备含有1％蔗糖的0-500馏分 3)由P1-0-1制备0-1馏分 4)由含有1％蔗糖的P1-0-1制备含有1％蔗糖的0-1馏分 5)由R6-1-500制备1-500馏分 6)由含1％蔗糖的R6-1-500制备含1％蔗糖的1-500馏分

可以用水反复提取第二固体物以回收额外量的鲨鱼软骨的可溶馏 分，所述第二固体物是通过分离在用水处理第一固体物过程中生成的 第二混合物而获得。

分析所有按照上述方法制备的液体提取物的干重和蛋白质含量。 此外，还测定各个馏分的抗MMP活性、抗血管生成和抗肿瘤活性。 结果概括在表6中。 表6        试验馏分    干燥   (mg/ml)  蛋白质浓度    (μg/ml)      GIA*  (百分抑制率)      EVT  (百分有效率)      LLC  (百分有效率)          盐水     -       -       -      -        0       0-500馏分    14.8     256.1       49      100      32.9        01-馏分    12.1      0.0       26       80      31.0       1-500馏分     0.2     163.9       21       0      20.5  含1％蔗糖的0-500馏分    24.7     274.5       59       75      42.5   含1％蔗糖的0-1馏分    20.3       0       29      100      29.2  含1％蔗糖的1-500馏分    11.1     212.6       14       20      32.8 *GIA以30μl等份试样的20X浓缩样品进行

分析结果证实，0-1馏分和含有1％蔗糖的相同馏分，在含有约90 ％的回收干重内容物的同时，含有极低量，几乎无法检测量的蛋白质。

然而，在0-1馏分和1-500馏分中观察到的抗MMP活性显示：1) 至少一种非蛋白成分产生抗MMP活性，和2)不止一种成分可能具有 抗MMP活性。活性成分可以是或可以不是蛋白或肽类本质。

此外，根据EVT的测定，仅在0-1馏分中观察到抗血管生成活性。 我们注意到蔗糖的存在可以在含有1％蔗糖的1-500馏分中引起抗血管 生成活性的轻度恢复。

针对用M27肿瘤细胞(LLC)接种的动物的治疗可以明显减少肺表 面上显微观察到的转移结节数量。0-1和0-500馏分均可以明显减少转 移结节的数量(约30％)。然而，1-500馏分的活性小于0-1或0-500馏 分，这表明0-1馏分中的活性成分至少部分导致抗肿瘤作用。这些结 果还揭示出在1-500馏分中存在另一种抗肿瘤成分。将一些另外组的 动物用含有1％w/v蔗糖的相同分子量的馏分处理。虽然本发明人未观 察到组之间有任何显著性差异，但是，蔗糖存在下的趋势是高分子量 的馏分活性较高(上表)。本发明人观察到动物体重无任何降低，这表明 软骨提取物在LLC模型中没有毒性。 抗MMP成分的分离和定性： 色谱分离和纯化

由于已经发现具有有效生物活性的多种成分存在于0-500馏分 中，特别是存在于0-1馏分中，下一步是从其中分离出这些活性成分。

我们开发出4种不同的方法用于由0-500馏分中分离和纯化出具 有抗MMP活性的成分。

方法1：

步骤1：

将通过上述详细过程获得的0-500馏分冷冻干燥并且在纯水中重 组(成为以初始体积计20倍的浓度)。将重组原料超声15分钟使生物活 性成分的溶解最佳化。分离步骤后，例如4℃在2200g下离心10分钟 后，保留上清液用于进一步纯化。

步骤2：

利用固相萃取柱(中性SPE-C18)进行吸附色谱。

装有500mg C18吸附剂(Supelco号5-7012，尺寸3cc)的SPE柱在 2ml甲醇(100％)中预处理2次并用2ml纯水预处理3次。将1ml2X重 组软骨提取物加样到该柱上。用1.5ml纯水冲洗吸附剂珠，用两个2.5ml 份的纯水洗脱出具有抗MMP活性的成分，将两份洗脱液合并得到第 一洗脱液。

在第一洗脱液中回收约50％的初始抗MMP活性。剩余50％在 柱加样和洗脱步骤中损失。因此中性条件可能产生了对具有抗MMP 活性成分的弱保留。当采用这种色谱介质时，成分的弱保留是极性 或离子成分的一个指标。

步骤3

对20X重组软骨提取物的多种样品重复多次上述处理后，分别 将第一洗脱液合并且在Speed Vac离心机上蒸发。由此获得的固体 在纯水中重组为200倍浓度，以所用0-500馏分的起始体积计。在超 声和离心之后，保留上清液用于下步纯化。

步骤4：

在中性条件中用低分辨半制备HPLC分离上清液中存在的生物 活性成分。采用Novapack C18HR(7.6×300mm；水)柱。所用流动相 是硫酸钠(0.01M pH7)/甲醇(92:8)。流量和温度分别维持在2mg/分钟 和30℃。将上述200X重组馏分(100μl)注射到柱上并且利用等度洗 脱条件和UV检测(205nm)收集2ml馏分。运行时间为30分钟。发 现洗脱馏分中具有抗MMP活性的成分相应于那些保留时间在11至 13分钟内的馏分。

步骤5 用不同的100μl等份试样的200X重组馏分重复步骤4并且合并 相应的所需洗脱液馏分，蒸发，重组在纯水中，浓度为500X，以所 用0-500馏分的初始体积计。超声并离心。保留上清液用于下一步 纯化。 步骤6： 高分辨半制备HPLC在中性条件下对步骤5获得的上清液进行层 析。该高分辨半制备HPLC的方法与步骤4的相同，但用磷酸盐缓 冲液(0.01M,pH7)/甲醇(97:3)作为流动相。发现洗脱馏分中具有抗 MMP活性的成分相应于那些保留时间在23至27分钟内的馏分。

步骤7

重复步骤6后，合并相应的含有活性成分的预期洗脱馏分， 蒸发溶剂，生成基本上固体的残余物，将残余物在纯水中重组为500 -2000X的浓度，以所用0-500馏分的初始体积计，超声和离心，进 一步进行分子量分析并且测定其抗MMP活性。将该生物活性成分 称作“I-E-986”。

方法2

在C18相色谱介质中在pH3下观察I-E-986通常其可更好地保 留。因此，改进SPE方法(上述步骤2)和半制备色谱体系(上述步骤4 和6)。下列条件允许在获得纯净最终提取物的SPE过程中和在省略 一个半制备纯化步骤(方法1的步骤4)中采用强洗脱剂溶液。 例如，重复方法1的步骤1至3。步骤4被以下步骤代替： 步骤4 采用和上述步骤2中相同的SPEC-18柱，但色谱介质用2ml甲 酸铵(0.01M,pH3)预处理3次。将由步骤3获得的1ml200X重组提 取物(在样品加样之前用甲酸调至pH3)加样到柱上。用2ml甲酸铵/ 甲醇(90:10,pH3)冲洗3次吸附床。用1ml甲醇(100％)进行I-E-986洗 脱。对于所属领域技术人员很显然，由甲醇洗脱色谱柱获得的馏分 将含有水。所以，这步中的洗脱溶剂可以是另一种有机溶剂，优选 极性和/或水可混溶有机溶剂，并且洗脱溶剂可以含有水。

步骤5：

重复方法1的步骤5，但重组抗MMP馏分的浓度为4000X。

步骤6：

此步与方法1的步骤6相同，除了流动相是甲酸铵/甲醇(75:25 pH3)以外。

步骤7：

步骤7与方法1的步骤7相同，但保持与上步6相同浓度的 4000X。

方法3：

该方法基本上与方法2相同，除了在步骤6中将甲酸盐的pH由 酸性(pH3)改变为中性条件(约pH7)。

方法4：

在此纯化方法中，自酸性流动相开始。

步骤1：    

原0-500馏分(1X浓度)的pH用甲酸调至3，随后在2200g下离 心10分钟。步骤2中使用上清液。

步骤2：

将上清液加样至在酸性条件下预处理的SPE C-18柱 (Supelco#5.-7136；体积60cc，装有10g固相载体)上。该柱用120ml 甲醇(100％)和120ml甲酸(0.01M,pH3)预处理。将500ml的1X酸化 软骨提取物加样在该柱上并用6个体积的100ml甲酸(0.01M(pH3)/ 甲醇90:10)洗脱。在洗脱馏分3、4和5中获得生物活性成分。

步骤3：

合并步骤2的洗脱液馏分3、4和5，将溶剂蒸至近干燥。随 后将馏分稀释至初始的4000X，生成含I-E-986的溶液。

步骤4：

在制备HPLC柱上在甲酸缓冲液pH 3中纯化I-E-986。将该色谱 柱(Prodigy OSD-prep,10u,250×50mm，得自Phenomenex)预处理并且 室温下运行。流动相的组成是甲酸(0.01M,pH3)/甲醇(70:30)且流 量为4ml/分钟。将4ml的SPEC-18馏分以4000X浓度注射在柱上 并且以等度方式洗脱柱子并用UV(205nm)检测。60分钟内每隔1分 钟收集馏分。在33至36分钟之间洗脱出抗MMP活性的I-E-986。

步骤5：

合并具有抗MMP活性的馏分并且蒸发得到10000X浓度馏分。

步骤6：

该步骤与方法2的步骤6相同，但流动相是甲酸(0.01M,pH3)/ 甲醇(75:25)。将500μl等份试样的10000X浓缩馏分加样在柱上。在 21至23分钟之间洗脱出含有抗MMP活性的成分。

步骤7：

步骤7与方法1的步骤7相同。保持与前面步骤6相同的浓度 4000X。

按照方法1制备的半纯化馏分：本发明人首次指出，HPLC纯 化的馏分(由上述方法1获得的馏分)含有具有抗MMP活性的成分。 由此纯化的成分也表现出如在上述体内模型LLC中证实的抗肿瘤活 性。通过用3个不同浓度的HPLC纯化馏分处理动物可以测定出抗 肿瘤活性。可观察到钟形剂量反应曲线，在2.5X浓度(该浓度基于纯 化步骤中100％的回收率并且以软骨提取物的初始体积计)剂量时最 大效能约为50％(p＜0.005)。

由于抗血管生成和基质金属蛋白酶活性与肿瘤增殖和转移进程 密切相关，含有抗MMP成分的HPLC纯化馏分可产生抗肿瘤作用。 因此，具有这些活性的成分在癌症治疗中是有效治疗剂(Yolnay,E等 人，《癌症研究和临床肿瘤学杂质》(J.Cancer Res Clin.Oncol.)123” 652-658,1997;Skobe,M.,等人《天然药物》3:1222-1227,1997)。

按照方法4制备的半纯化馏分：在这部分中馏分是按照上述方 法4制备，除了步骤2)和3)如下进行：

步骤2

上清液加样在已用酸性条件预处理的SPE C-18柱(Supelco#5.- 7012；体积3cc，装有500g固相载体)上。该色谱柱用4ml甲醇(100 ％)和6ml甲酸(0.01M,pH3)预处理。将10ml的1X酸化软骨提取物 加样到色谱柱上，用1.0ml体积的甲酸(0.01M(pH3)/甲醇90:1)冲洗 3次，用1.0ml甲醇洗脱出生物活性成分。

步骤3：

将步骤2的含有生物活性成分的洗脱馏分蒸发至干。随后将馏 分稀释至起始浓度的40X或20X，生成含I-E-986的溶液。

测定所有由这种方法获得的液体提取物的抗MMP活性。结果 概括在表7中。 表7         试验馏分      GIA(抑制率％)         CTRL-S1*           57         CTRL-S2*           16         CTRL-S3*            4        SU-MET-S1*           55        SU-MET-S2*           15        SU-MET-S3*            0        SU-ETH-S1*           14        SU-ETH-S2*            1        SU-ETH-S3*            0       0-500馏分**           64        0-1馏分**           56       1-500馏分**           16   0-500馏分在1％**蔗糖           74    0-1馏分在1％**蔗糖           40   1-500馏分在1％**蔗糖           16         P-C3-E1*           57         P-C2-E1*           60         P-C1-E1*           46         P-C1-E2*           39         P-C3-E3*           17        P-C1-E1-2*           16        P-C1-E1-3*            4 *GIA在80μl等份试样的20X浓缩样品上进行 **GIA在80μl等份试样的40X浓缩样品上进行

因此，本发明的方法提供了用于制备具有抗MMP活性的特定鲨 鱼软骨馏分的方法，另外，含水和含有机溶剂溶液可以用来制备具 有至少抗MMP活性的软骨提取物。虽然0-500和1-500馏分都 具有抗MMP活性，但通过本发明方法纯化的抗MMP组分主要含 在0-1kDa部分中。类似的结果可在含有1％w/v蔗糖的等效馏分中 观察到。最后，抗MMP活性可以利用不同的软骨与纯水的比例有 效回收。 通过LC/MS测定抗MMP组分的分子量

开发出5种多维色谱体系通过液体色谱/质谱(LC/MS)来测定鲨 鱼软骨馏分的分子量。5个体系的每一种如表8-12所述。

试验包括MS扫描的裂分(7:1)色谱柱洗脱以及由LC收集馏分， 用于运转后的抗MMP活性试验。MS和抗MMP生物活性之间的关 系具体决定于洗脱馏分和所用各色谱体系的所述化合物的保留时 间。 

对于MS阴离子检测，在向MS离子源引入之前向柱洗脱剂中加 入氢氧化铵溶液(0.75％v/v0.15ml/分钟)的溶液。混合物的pH是8- 10，由此改进MS阴离子的形成和检测。 表8．色谱体系：等度C18中性条件(甲酸铵)      柱      C18 ODS-2,5u,4.6×250mm,Phenomenex     柱温                     30℃     流量                  0.7ml/分钟   注射体积                100μl的纯馏分    洗脱剂      甲酸铵(0.01M,pH7)/甲醇(96:4)   洗脱方式                    等度     检测              UV:205nm,254nm,MS   运行时间                    25分钟  馏分的收集     每1分钟或30秒，具有不同的延迟时间 评价所收集馏分的抗MMP活性 表9．色谱体系：梯度C18酸性条件(甲酸铵)      柱     C18ODS-2,5u,4.6×250mm,Phenomenex     柱温                   30℃     流量                0.7ml/分钟   注射体积              100μl的纯馏分   洗脱剂A       甲酸铵(0.01M,pH3)/甲醇(96:4)   洗脱剂B                   甲醇    梯度  时间 洗脱剂A        洗脱剂B    0   100           0    2   100           0   22    20          80   25    20          80     检测           UV:205nm,254nm,MS   运行时间                 25分钟  馏分的收集    每1分钟或30秒，具体不同的延迟时间 评价所收集馏分的抗MMP活性 表10．色谱体系：等度C18酸性条件(甲酸铵)      柱      C18 ODS-2,5u,4.6×250mm,Phenomenex     柱温                     30℃     流量                 0.7ml/分钟   注射体积               100μl的纯馏分    洗脱剂       甲酸铵(0.01M,pH 3)/甲醇(75:25)  洗脱方式                    等度     检测              UV:205nm,254nm,MS   运行时间                  25分钟  馏分的收集     每1分钟或30秒，具有不同的延迟时间 评价所收集馏分的抗MMP活性 表11．色谱体系：梯度NH2酸性条件(甲酸铵)      柱     NH2,5u,4.6×250mm,Phenomenex     柱温                30℃     流量            0.7ml/分钟   注射体积         100μl的纯馏分   洗脱剂A   甲酸铵(0.01M,pH3)/甲醇(96:4)   洗脱剂B               甲醇    梯度  时间 洗脱剂A     洗脱剂B   0   100        0   2   100        0   22    20       80   25    20       80     检测         UV:205nm,254nm,MS   运行时间              25分钟  馏分的收集 每1分钟或30秒，具体不同的延迟时间 评价所收集馏分的抗MMP活性 表12．色谱体系：等度C18酸性条件(甲酸铵)      柱     C18 ODS-2,5u,4.6×250mm,Phenomenex     柱温                    30℃     流量                 0.7ml/分钟   注射体积              100μl的纯馏分    洗脱剂        甲酸铵(0.01M,pH3)/甲醇(75:25)   洗脱方式                    等度     检测             UV:205nm,254nm,MS   运行时间                   25分钟  馏分的收集     每1分钟或30秒，具有不同的延迟时间 评价所收集馏分的抗MMP活性

通过注射100μl的500至1000X纯化磷酸盐最终馏分(得自纯化 方法1的步骤7)进行多维色谱试验。在此浓度下，在MS扫描方式(全 部离子)中检测不到强和清晰的I-E-986信号。通过在感兴趣的区域内 运行后测定所有各个离子信号(100-1000amu)来发现感兴趣的峰。

注射的浓度至多2000X的纯馏分在总离子色谱及基底峰色谱中 显示出与I-E-986相应的小峰。

在阳离子检测方式(表13)中在感兴趣的区域(I-E-986)内仅能清晰 检测到离子245M+1和227。在LCQMS中的每个设计和操作中， 对于含有醇官能团的分析物通常并多次观测到相应于损失水分子的 离子和分子离子(M+1)。离子245M+1和227的共同洗脱曲线以及相 应于损失的水分子(H2O)的18amu，有力地表明了存在令人感兴趣的 单一成分，其分子量为244,245在阳离子方式中等于M+1形式。

由在不同色谱体系上注射半纯化I-E-986获得的总离子色谱(TIC) 和单离子色谱(245M+1m/e)表示在图1至4中。展开后分析的那些色 谱表明，在由不同色谱体系收集的各个馏分中存在离子245(M+1)， 其中含有具有抗MMP活性的成分。

由分析在HPLCC18体系(甲酸铵，中性pH ，等度)上分离的I-E -986获得的全离子色谱和单离子色谱(245M+1)表示在图1中。在13.5 至15.0分钟之间收集的馏分中检测I-E-986相应于洗脱保留时间14.4 分钟的m/e245M+1峰。

由分析在HPLC C18体系(甲酸铵，酸性pH3，梯度)上分离的I-E -986获得的全离子色谱和单离子色谱(245M+1)表示在图2中。在16.5 至17.0分钟之间收集的馏分中检测I-E-986相应于洗脱保留时间16.62 分钟的m/e245M+1峰。

由分析在HPLCC18体系(甲酸铵，酸性pH3，等度)上分离的I-E -986获得的全离子色谱和单离子色谱(245M+1)表示在图3中。在16 至18分钟之间收集的馏分中检测I-E-986相应于洗脱保留时间16.79 分钟的m/e245M+4峰。

由分析在HPLCNH2体系(甲酸铵，酸性pH3，梯度)上分离的I-E -986获得的全离子色谱和单离子色谱(245)表示在图4中。在14至16 分钟之间收集的馏分中检测I-E-986相应于洗脱保留时间14.28分钟的 m/e245M+1峰。

在阴离子方式(表14)中，在所有被评估色谱体系中在感兴趣的 区域(I-E-986)内仅检测到离子243和289。再进行这两种离子的共同 洗脱表明在离子243上形成甲酸盐加合物。当用甲酸铵作为流动相 中的缓冲剂时，在阴离子中常观测到这种现象。这可以通过在相同 pH下用醋酸铵缓冲剂代替甲酸铵缓冲剂来证实。醋酸铵流动相是在 MS检测之前用氢氧化铵溶液柱后碱化。两种体系显示出清晰的离子 243信号，但离子289仅能在甲酸盐体系中检测到，在第二中色谱体 系中检测到与醋酸盐聚合物相应的新离子(303)。所以，可以肯定I-E -986成分具有约244amu的分子量(在阴离子方式中243等价于M-1 形式)。 表13阳离子检测       说明                                              色谱条件      等度C18  中性条件(甲酸铵)      等度C18  中性条件(甲酸铵)       等度C18   中性条件(甲酸铵)       梯度C18   酸性条件(甲酸铵)      等度NH2  酸性条件(甲酸铵)      梯度C18  酸性条件(甲酸铵)        等度C18    酸性条件(甲酸铵)     馏分收集       收集2   F1:15至1.5分钟  F20:24.5至25分钟       收集3   F1:15至15.5分钟  F20:24.5至25分钟        收集5    F1:12至12.5分钟   F20:21.5至22分钟        收集7    F1:12至12.5分钟    F20:21.5至22分钟       收集9     F1:6至7分钟   F20:23至24分钟       F.P.4    F1:7至8分钟   F15:21至22分钟        收集10      F1:6至6.5分钟    F20:25.5.至26分钟     GIA活性        ND         N.E    13.5至14分钟：49    14至14.5分钟：24    14.5至15分钟：8   16.5至17分钟：36   16至17分钟：32   17至18分钟：13  14至15分钟：68  15至16分钟：8     16至16.5分钟：12    16.6至17分钟：29     17至17.5分钟：8     预期R.T.     13至15分钟     13至15分钟        14分钟       16.5分钟      16.8分钟     14.5分钟        16.8分钟     m/e检测        191         191         191          -         -        -           -        227         227         227         227         227       227           227        229         229         229         229         229        -           229        245         245         245         245         245       245           245        334         334         334            -           -            -        -            -        346         346          -          -         -        -            -        684         684         684         684         -        -            -        706         706         706         706         -        -            - 表14阴离子检测      说明                                                                                      色谱条件      等度C18  中性条件(甲酸铵)      等度C18  中性条件(甲酸铵)      等度C18  中性条件(甲酸铵)      等度C18  酸性条件(甲酸铵)      梯度NH2  酸性条件(甲酸铵)        梯度C18    酸性条件(甲酸铵)      等度C18 酸性条件(甲酸铵)   馏分收集       收集4   F1:15至15.5分钟  F20:24.5至25分钟       收集6   F1:12至12.5分钟   F20:21.5至22分钟       收集11     F1:6至7分钟    F18:23至24分钟      收集12   F1:6至6.5分钟  F34:22.5至23分钟       收集13     F1:6至7分钟   F22:27至28分钟         F.P.2      F1:7至8分钟     F17:23至24分钟    GIA活性         ND   14至14.5分钟：17   14.5至15分钟：10   15至15.5分钟：8    16至17分钟：27    17至19分钟：39  16至16.5分钟：7  16.6至17分钟：17  17至17.5分钟：18    13至14分钟：14    14至15分钟：1     18至19分钟：69       N.A    预期R.t.     13至15分钟        14分钟        17分钟        17分钟       14分钟          -        -    m/e检测        145         145          -          -          -          -        -        189         189          -          -         227          -        -        243         243         243         243         243         243       243        289         289         289         289         289         289        -        682         682          -          -          -          -        -        683         683          -          -          -          -        -

I-E-986的经验式和部分结构解释

LC-MS经验式的测定：采用质谱获得有关I-E-986的结构信息。 表15公开了在I-E-986的LC-MS分析试验中所用的条件。 表15.LC-MS部分经验式测定的色谱条件：      柱   C18ODS-2,5u,4.6×250mm,Phenomenex     柱温                  30℃     流量              0.7ml/分钟   注射体积            100μl的纯馏分    洗脱剂     甲酸铵(0.01M,pH3)/甲醇(75∶25)   洗脱方式                 等度     检测          UV:205nm,254nm,MS   运行时间               25分钟  馏分的收集   每1分钟或30秒，具有不同的延迟时间

对247、246、245的同位素比例的测定是以变焦扫描方式进行 从而提高记录那些离子峰信号的精密度。在下表中给出了由离子 246/245(A+1型)和247/245(A+2型)获得的同位素比例。

m/e峰高的5.9％的比例(A+2同位素比例)有力地表明分子上存 在硫和氧原子。

A+1单元(m/e246/245峰高)的11.8％的比例可以解释为在分子上 有至多10个碳原子或碳、氮和硫(1)的混合物。

对于244amu的分子量，只能有偶数(0、2、4)个氮存在于该分 子上。 LC/MSn结构解释：利用串联质谱实验对I-E-986的结构进行部分解 释。 表16．Msn实验所用的色谱条件如下所述：      柱   C18ODS-2,5u,4.6×250mm,Phenomenex     柱温                30℃    流量             0.7ml/分钟   注射体积           100μl的纯馏分    洗脱剂    甲酸铵(0.01M,pH3)/甲醇(75∶25)   洗脱方式                等度    检测          UV:205nm,254nm,MS   运行时间               25分钟  馏分的收集   每1分钟或30秒，具有不同的延迟时间

针对分子离子245m/e(M+1)的阳离子进行的串联质谱(MS/MP)实 验显示出18amu(m/e227.1)和36amu(m/e209)的损失。这些损失相应 于失去一个和两个水分子(分别-H2O和-2H2O)，表明在I-E-986中存在 醇，和/或多元醇部分。准确的MS/MS光谱在图5中给出。

针对m/e227进行的MS/MS实验得到一个复杂光谱，其具有许 多I-E-986结构的特征碎片。该光谱中出现的碎片应是得自一个或两 个m/e227离子的裂解或此光谱中其它强离子(即m/e166得自209离 子的裂解)裂解获得的碎片。所以，针对m/e227离子的选定碎片进 一步进行MS/MS实验。图6中绘出所得的MS/MS光谱。

针对209m/e离子(M+1-2H2O)的MS/MS实验由于失去60amu 产生m/e149，其特征是失去羧酸(-CH3COOH)部分。

随后离子149m/e(M+1-2H2O-CH3COOH)再进行MS/MS分析并 且获得下列碎片：m/e105,115,116和134。149失去15生成134 最可能是因失去CH3。33和34的损失是失去SH和H2S的特征，由 此有力揭示了I-E-986中存在含硫基团(硫醇或硫醚)。由m/e149失去 44生成105可能是因为失去若干个不同的基团。 化学衍生结构的解释：令I-E-986处于下列常用于羧酸酯化的详细条 件下。

甲基化(HCl/甲醇)

为了纯馏分甲基化，本发明人蒸发15μlI-E-986的纯馏分(4000X) 并且加入100μl装在密封瓶内的HCl(12N):MeOH/(1:99)的混合物。 将该混合物在45℃下保温60-90分钟，随后蒸发至干，将其溶解在 100μl水中。根据用于LC/MS结构解释的色谱条件注射此溶液。

甲基化(BF3/甲醇)

为了纯馏分的甲基化，本发明人蒸发15μlI-E-986的纯馏分(4000X) 并且加入100μl装在密封瓶内的BF3/甲醇溶液。将该混合物在45℃ 下保温60-90分钟，随后蒸发至干，将其溶解在100μl水中。根据 LC/MS结构鉴定所用的色谱条件注射此溶液。

纯化馏分的稀释(4000X)

为了检验衍生作用的回收率，本发明人用85μl水稀释15μlI-E-986 的纯馏分(4000X)。按照LC/MS鉴定所用的色谱条件分析该稀释溶 液。

结果

根据在预期的I-E-986保留时间测定的信号强度，用BF3/甲醇或 H+/甲醇在45℃下将I-E-986衍生1小时导致其色谱信号95％以上消 失。这两个反应已知是将羧酸转化为其相应甲酯。甲基化作用引起I-E -986分子量的增高及其在色谱体系上保留时间的增加。由此生成的I-E -986衍生物的浓度无法检测到该衍生产物。 物理化学性质：当甲酸盐缓冲液的pH由7降低至3时，通过其在 HPLCC18柱上保留时间的增加可以证实在I-E-986分子上存在弱酸 性官能团，例如羧酸。这有力地说明I-E-986中存在pKa约4或更高 的部分。

如果硫醇或硫醚官能团存在于I-E-986中，如MS/MS数据所提示 的，它将影响I-E-986由0-500馏分和软骨的回收。这似乎是只有I-E- 986的游离硫醇部分可以按照本发明的方法提取，因为硫醇与溶液中 其它含硫分子(例如蛋白质、肽、氨基酸)形成二硫(S=S)键。二硫加 合物的形成一般可改变含硫醇基团分子的物理化学性质及其提取的 回收率。这可能是因为I-E-986的二硫键无法通过直接提取0-500馏分 (20X)分离。通过在提取之前在pH7和室温下用三丁基磷酰胺处理 15分钟含有它的溶液可以减少I-E-986二硫键的形成，尤其是在pH 3(SPEC18pH3)下的那些。其它二硫键断裂试剂，例如二硫苏糖醇 和巯基乙醇，可用来将I-E-986二硫加合物的形成降至最小。

上述用于由鲨鱼软骨回收和分离生物活性的方法可适用于任何 来源的软骨(1)提取具有预期生物活性的馏分，和(2)提取具有那些生 物活性的特定成分。

由于本发明教导了可以由软骨在不同的亲水性溶剂中提取生物 活性成分，上述方法可适用于由不同物质的软骨提取生物活性成 分。分离自软骨原料，优选鲨鱼软骨并且：1)具有与I-E-986类似或相 同的生物活性性能；和/或2)具有244amu质量的成分被认为属于本

发明的范围内。

本发明在上文中参考具体实施方案作了详细说明。所属领域普 通技术人员熟知在不脱离上述教导下可以进行改进。这些改进属于 本发明在所附权利要求书中定义的范围内。