本发明的领域

本发明涉及一种新的方法，以表明白细胞介素-2受体α (IL-2Rα)的表达与非淋巴肿瘤转移瘤(转移可能性)发生可能 性之间的关系，该方法中利用对肿瘤细胞所表达的IL-2Rα的测 定以建立一种对转移瘤的预测方法；有助于转移位置的诊断； 对转移前区域施以治疗措施，并对肿瘤，特别是转移肿瘤细胞 ，或具有高度转移可能性的肿瘤细胞的治疗效果进行监测。本 发明还涉及由实体非淋巴肿瘤表达T-细胞受体β链(TcRβ)或 其肿特异性变异体，以及治疗措施的实施方法，和对这些肿瘤 治疗效果的监测方法。 本发明的技术背景 1.肿瘤转移

肿瘤转移是指恶性肿瘤向远离原发灶的第二部位的扩散。 肿瘤转移给肿瘤科临床医带来了诊断和治疗恶性肿瘤的困难， 因为(a)转移瘤可以是非常少的细胞甚至是一个细胞，从而在 临床上即使是用现代技术也可能出现漏诊；(b)通常在病人被 诊断为是一种恶性非淋巴肿瘤的同时已经接种了转移灶 (Silverberg et al.，1989，CA Cancer  J.Clin.39：3-21)； (c)在治疗上比原发肿瘤的简单外科切除更为复杂；(d)对于转 移性非淋巴肿瘤，如肾细胞癌(Rosenberg et al.，1985，N. Engl.J.Med.313：1485-1492)，的系统性治疗效果不佳，存 活率很低；和(e)不是所有的恶性肿瘤具有相同的转移可能性， 并且尚没有建立起确定任何特定非淋巴瘤会发生转移的直接联 系。 2.T-细胞表面分子，白细胞介素-2，和IL-2受体

已经利用单克隆抗体对T细胞表面分子如人白细胞抗原分 化簇(CD)进行了特征化和分类。T细胞受体(TCR)是在T淋巴细 胞表面上表达的一种完整膜蛋白，表现为一种连接与CD3非共 价相连的杂二聚体的二硫键。TCR被认为与自身免疫性疾病相 关，因为抗TCR抗体表现出对自身免疫性疾病有治疗效果(Basi et al.，1992，J.Immunol.Methods 155：175-191)。在T细 胞表面分子中，Kung等人公开了儿童血清中可溶性CD8浓度的增 加与非何杰金氏(Hodgkins)淋巴瘤相关(美国专利No.5,006, 459)。CD8含量水平的升高表明与淋巴瘤的发生及对治疗的反 应相关。

IL-2和IL-2受体(IL-2R)相互作用调节T细胞免疫反应。IL -2R的存在根据其对IL-2的结合亲和力及两种结合蛋白(α和β 链)的不同组合而分为三种类型。高亲和性IL-2R含有α和β链 ，中等亲和性的IL-2R含有β链，而低亲和性的IL-2R含有α链 (Leonard等人，1990，Prog.Clir.Biol.Res.，352：179- 187)。IL-2Rα只在活化T细胞上被表达，已经表明IL-2通过刺 激α链而表现出其T细胞生长促进效果。Kung等人(如前所述) 公开了患有活性淋巴癌如白血病和淋巴癌的病人血清IL-2受体 (IL2R)的升高；并且可溶性ILR2的浓度代表了与淋巴癌的严重 程度及预防的直接关系。他们还公开了患有非淋巴性肿瘤的病 人一般可溶性ILR2受体不升高。另外，可溶性ILR2的含量水平 与循环的带有IL-2R的淋巴细胞数量相关性不太大。

利用淋巴激活素的免疫疗法已被用来作为一种系统性的抗 癌疗法以试图激活宿主抗肿瘤细胞的免疫反应。已公开了各种 不同的含有IL-2的组合物，包括：Grimm等人的美国专利No. 5,229,109公开了低活性IL-2类似物；Nitecki等人的美国专利 No.5,089,261公开了与一种聚合物共轭结合的IL-2以降低致 免疫性和增加可溶性及循环半衰期；Wiltrout等人的美国专利 No.5,061,488和5,126,129描述了黄酮-8-乙酸和重组IL-2的 组合物及结合方法；Zimmerman等人的美国专利No.5,098,702 公开了一种IL-2和/或干扰素-β与抗肿瘤细胞的肿瘤坏死因子 的组合物；McGrogan等人的美国专利No.4,939,093公开了制 备人IL-2样多肽的方法；和Yoshimoto等人的美国专利No.4, 789,658公开了人IL-2的生产及在治疗疾病包括肿瘤在内方面 的应用。Rosenberg的美国专利No.4,690,915公开了惯用的免 疫疗法，包括用免疫细胞，淋巴激活素激活的淋巴细胞，和IL -2免疫疗法一起治疗病人。

因此，技术背景和相关现有技术中并没有公开IL-2Rα的 存在与实体非淋巴瘤的转移或转移可能性之间的相关性。而且 ，并没有已知的方法来利用IL-2Rα的存在建立对非淋巴肿瘤转 移可能性的预测方法；或用于诊断或将抗癌药输送作用于其转 移灶。除了惯用的系统给药方法之外，背景技术和相关现有技 术中并没有公开将抗非淋巴转移瘤细胞的抗癌治疗药直接给药 到器官发生转移的区域中(转移前区域)的方法。另外，一直没 有公开在非淋巴瘤上表达TCRβ及TCRβ代表在抗能表达TCRβ 的肿瘤方面直接抗肿瘤疗法的靶器官。本发明方法一般有助于 对患有非淋巴肿瘤及其转移瘤或具有高度转移可能性的非淋巴 瘤的诊断和抗癌方法。 本发明的概述

本发明的一个基本目的是提供一种通过测定IL-2Rα的肿 瘤细胞相关表达来确定非淋巴肿瘤转移可能性的方法。

本发明的另一个目的是提供了一种将抗癌药物靶作用到非 淋巴肿瘤及其转移灶或具有高度转移可能性的非淋巴肿瘤的方 法。本发明的相关目的是提供了将抗癌转移细胞的抗癌疗法靶 作用于受累器官前转移区域的方法和化合物。

本发明的另一个目的是提供一种对抗非淋巴瘤及其转移灶 或具有高度转移可能性的肿瘤的抗癌疗法有效性的监测方法。 附图的简要说明

图1是一种表示转移灶次数与每个黑素瘤细胞平均荧光强 度(IL-2Rα表达)关系曲线的坐标图，其中圆圈A、B、D和E代 表不同治疗前组别的细胞和接受该相关组细胞的动物转移灶。

图2是一种表示肝脏中转移灶的数目与整个样本的平均强 度(与IL-2Rα的表达相关)关系曲线的坐标图，其中圆A-E代表 不同治疗前组别的细胞及接受该相关组别细胞的动物的转移灶。

图3是一种表示肝脏中转移灶的数目与表达IL-2Rα的细胞 百分率相关曲线的坐标图，其中圆圈A-E代表不同治疗前组别 的细胞，和接受该相关组别细胞的动物的转移瘤。

图4是一种表示用若丹明标记的小麦胚凝集素对前转移区( 亮区)中1型内皮细胞结合亲和力与肝脏其他结构(暗区)的肝脏 切片照片。

图5表示对应于IL-2的细胞生长。

图5A是B16F10细胞增殖与IL-2浓度的相关曲线图。

图5B是CTLL-2细胞增殖与IL-2浓度相关曲线图。 本发明的详细说明

本发明涉及对TCRβ，或其保瘤特异性变异体，和/或由非淋 巴癌细胞表达的IL-2Rα的测定。利用对IL-2Rα的测定可有助 于诊断转移肿瘤和确定实体非淋巴肿瘤的转移可能性。利用对 IL-2Rα或TCRβ的测定可以将抗癌药靶作用于表达该相关受体 的非淋巴肿瘤；和对能表达该受体的这种肿瘤的抗癌疗法效果 的监测。本发明由分为三组的前述成份组成：

1.肿瘤转移可能性的预测方法及转移肿瘤的定位方法。

2.用抗癌治疗剂对前转移区域局部治疗的方法，包括将化 合物直接靶作用于肿瘤转移集落形成细胞并使转移的肿瘤细胞 处于不活动状态，和监测该治疗的效果。

3.用抗癌疗法直接治疗表达TCRβ的非淋巴肿瘤细胞，或 肿瘤一特异性β链变异体。 1.肿瘤转移可能性(肿瘤转移的潜在危险)的预测方法和转移 肿瘤位置的诊断 1.1 IL-2Rα表达与肿瘤转移可能性之间的关系。

本发明提供了检测由实体、非淋巴肿瘤表达的IL-2Rα的 方法。在本发明的一个实施方案中，在实体，非淋巴肿瘤上/ 中测定IL-2Rα的细胞相关性表达。实验表明人和实验性非淋 巴肿瘤上的转移肿瘤细胞表达的IL-2Rα与其肿瘤转移的潜在 可能性相关。而且，所获得的转移肿瘤的数目与表达IL-2Rα 的肿瘤细胞百分率直接成比例关系。下的的A至E章节中的实施 例表述了使用选自下列一组方法中的一种或几种方法对人和实 验性肿瘤中的细胞相关性IL-2Rα的检测：荧光显微技术(测定 表面IL-2Rα)，Western印迹分析(测定内部和膜IL-2Rα部分)， mRNA Northern和狭槽(Slot)印迹分析(测定IL-2Rα m-RNA表 达)，mRNA的酶放大和分析(测定IL-2Rα m-RNA表达)，和荧光 激活细胞分类(FACS，测定表面IL-2Rα)分析方法。按下述获 得人和实验性肿瘤：由Dr.MF Poupon(Pairs)提供B16F10黑素 瘤细胞。结肠51B和结肠51B Lim10细胞由Dr.R.Bresalier( 美国)提供。MCA-26细胞由Dr.I.Fidler(美国)提供。MMC -7489和细胞由Dr.J.Vaageard(美国)提供。SW480，SW480E， SW480R和SW620由Dr.I.B.Weinstein提供。人活组织检查由 Dr.Alonso和Dr.Pellin(西班牙)提供。所有肿瘤细胞系在 塑料T型瓶中生长，T型瓶置于5％CO2潮湿空气中，在足够的培养 基中补充10％FBS，并含有青霉素和链霉素。 A. IL-2Rα的荧光显微检查

使含有非淋巴肿瘤的肿瘤活体组织或外科样本分解，并制 备得适用于荧光分析。或者，将肿瘤细胞培养在8孔载玻片 (Bitek)中培养48小时，然后除去上清液，用PBS轻轻冲洗培养 孔，并在Carnoy在固定液中固定。三次PBS冲洗之后，在含有 4μl/ml FITC-鼠抗小鼠-IL-2RαIgG2单克隆抗体(AMT克隆， Boehringer Manheim)的PBS溶液中将该细胞于37℃下培养30分 钟。孵化培养之后，用PBS冲洗培养孔两次。只用FITC鼠抗小 鼠-IgG2单克隆抗体(Boehringer Manheim)制备对照样本。用 激光扫描荧光显微镜观察细胞。 B.对IL-2Rα进行Western印迹分析

为了进行Westen印迹分析，将5×106肿瘤细胞和对照组细 胞(ConA激活的脾细胞和CTLL-2细胞)收集在含有/1mM PMSF的 PBS中。冲洗之后，使用一种50次冲击(Stroks)的Dounce均浆 器在含有0.25M蔗糖，1mM MgCl2，5mM CaCl2和蛋白酶抑制剂 混合物的10m Tris-HC pH7.4缓冲液中将该细胞于冰上均浆。 离心沉淀细胞(以6000xg离心10分钟)之后，将除去细胞核的上 清液再以100,000xg离心1小时得到细胞质部分和粗制细胞膜部 分。进行聚丙烯酰胺凝胺电泳。通过在40V下进行电泳迁移2小 时将蛋白迁移到硝化纤维素滤纸上。然后将滤纸在含有3％普通 血清的抗生物素蛋白D阻过溶液中孵育，之后用TTBS洗涤三次。 以1∶40的稀释度向TTBS中加入单克隆抗体抗小鼠白细胞介素-2 受体，并孵育2小时。洗涤三次之后，以1∶200的稀释度向TTBS 中加入生物素化的兔抗鼠IgG保持1小时。用TTBS洗涤三次之后 ，将印迹与抗生物蛋白DH和生物素化的辣根过氧化酶H一起保温 孵育30分钟。然后将印迹与DAB一起孵化，棕色沉淀表明抗体结 合部位。分子量(MW)标记物蛋白是：β-半乳糖苷酶(116Kd)， 牛血清(66Kd)，蛋血清(45Kd)和碳酸酐酶(29Kd)。

也可以通过使用IL-2Rα作为抗原的检测方法检测这种细 胞的膜部分或细胞质提取物中由非淋巴细胞表达的细胞相关IL -2Rα的物理存在。这种检测包括现有技术中已知的任何免疫 检测系统，包括，但不限于，放射免疫测定，酶联免疫吸附测 定(ELISA)，″夹层(Sandwich)″检测，沉淀素反应，凝集作用检 测，和荧光免疫测定。 C.mRNA Northern和狭槽(slot)印迹分析

由脾细胞，ConA活化的脾细胞和肿瘤细胞获得mRNA。对未 处理的和体外预处理的肿瘤细胞进行检查。将癌细胞在常规的 含有125U/ml IL-2培养基中于5％CO2中，或在含有10U/ml IL-1 β的培养基中，或含有5μg/ml ConA的培养基中孵育24小时来 完成对肿瘤细胞的预处理。通过将细胞简单地暴露于0.1％胰蛋 白酶和2mMEDTA，然后在加有10％FBS的DMEM中于离心瓶中在5％ CO2下孵育48小时，对细胞进行分离。

在对mRNA进行提取和定量之后(通过0.7％琼脂糖凝胶电泳 表明是完整未受损的)，在含有2.2M甲醛的1.2％琼脂凝胶上分离 到总量为20μg的纯化RNA。在80V下进行电泳。从凝胶上切下 含有标准分子量的泳道，并测定迁移距离。洗涤凝胶并转移到 硝化纤维素滤纸上。或者，用狭槽(Slot)印迹设备将RNA样本印 迹到预选用10×SSC浸透的硝化纤维素滤纸上。将2微克的mRNA 稀释于最终体积为100μl的10×SSC-甲醛中，并在印迹反应之 前在65℃下加热10分钟使其变性。用UV辐射将mRNA交联到硝化 纤维素滤纸上。将印迹在6×SSC，0.5SDS，5×Denhardt’s， 10mMEDTA，50μg/ml剪切的鲑精子DNA，和50μg/ml的大肠杆菌 tRNA中于45℃进行预杂交4小时。同时根据常规方法对5毫纤摩 尔的鼠或人IL-2Rα和IL-2的DNA探针(Amgen Biologicals)通 过用γ-32P ATP5’末端标记寡聚核苷酸探针的方法进行标记。 通过随机引导对100μg的人β-肌动蛋白DNA探针(Clontech)进 行标记。使用放射性标记的探针(2×109cpm/μl特异性放射 活性)在45℃下进行mRNA印迹杂交反应24小时。然后在杂交温 度下用5×SSC-0.1SDS洗涤印迹20分钟。将印迹暴光于X线胶 片上并在-70℃下对各种不同阶段进行强度扫描筛选。通过在 100℃的无菌水中将滤纸孵化10分钟从滤纸上除去探针，并将该 滤纸与其他探针再杂交。用图像密度测定法对10个放射自显影 照片进行定量分析。 D.肿瘤细胞mRNA的酶放大反应

通过从非淋巴肿瘤细胞中提取和纯化mRNA，并将纯化的 mRNA进行酶放大反应获得足够量的用于分析和检测的mRNA以 检测IL-2RαmRNA的表达。可以使用的酶放大技术包括本领域 中已知的那些方法，如PCRTM(聚合物酶链反应)，QB复制酶 (replicase)，和NASBA(核酸序列基础性放大)。对放大的核酸 的检测方法包括本领域中已知的技术，包括，但不限于，琼脂糖 凝胶电泳和Northern印迹反应；荧光基础性杂交反应检测，和 捕获性杂交反应微效价检测。可以由IL-2Rα基因的核酸序列 合成寡聚核苷酸引物和探针(Leonard等人，1984，Nature 311 ：626-631)。可以用本领域中熟练技术人员已知的方法合成探 针，并结合上非同位素或同位素标记物。或者，可以将标记物 直接结合到放大产物上。

在这个实施例中，使用从商业上买到的IL-2R和IL-2Rα基 因的引物通过PCRTM对由提取的肿瘤细胞mRNA通过反转录而获 得的单链cDNA进行放大。在1.2％琼脂凝胶上分离放大产物，并 用溴化乙锭对阳性和阴性对照进行染色。用Photoquant Sys- temTM(BAF，Spain)进行定量测定。 E.FACS分析

将肿瘤细胞在24孔培养板上培养48小时，然后除去上清液， 用PBS轻轻洗涤各培养孔，并从组织培养板上轻轻刮下细胞，在 含有1μg/ml鼠抗小鼠-IL-2Rα单克隆抗体的PBS溶液中于4℃ 下孵育30分钟。洗涤之后，将细胞在含有20μg/ml FITC-兔抗 鼠Ig抗体的PBS溶液中于4℃孵育30分钟，用1％对甲醛固定，并 用FACS(Coulter)在48小时内分析。在所有情况下，只用第二 种抗体制备对照组。用脾细胞作为阴性对照，用ConA活化的脾 细胞作为抗原表达的阳性对照。用荧光活化细胞分类仪对肿瘤 细胞上IL-2Rα表达进行定量分析。

表1包括了人和实验性非淋巴肿瘤中癌转移可能性与其细 胞相关性IL-2Rα表达的比较。通过临床观察测定人肿瘤的体 内转移可能性。通过体内肿瘤细胞生长和转移效率分析确定实 验性肿瘤的转移可能性(在下面1.1，F章节进行了描述)。

表1表明了IL-2Rα细胞相关性表达与已确定了转移可能性 的实验和人非淋巴肿瘤的癌转移可能性有良好的相关性。

                  表1

    非淋巴肿瘤细胞的IL-2Rα表达与转移可能性 肿瘤        描述         转移      mRNA  表面  内部

                    可能性    IL-2α IL-2Rα IL-2Rα 小鼠肿瘤 3LLp100     Lewis肺癌     低        无    -     无 MMC4908     乳腺癌        低        ND    -    10％* MMC7849     乳腺癌        高        ND    +    100％* MCA26       结肠癌        高        ND    +    100％* MCA38       结肠癌        低        ND    -    75％* 51B         结肠癌        低(1)     ND    -    10％* 51B-Lim10   结肠癌        高(1)     ND    +    100％* B16F10      黑素瘤        高        高    +    100％* B16F10LM(B) 肝转移小病灶  转移瘤    ND    ND   100％*

        黑素瘤 人肿瘤 SW480E        结肠癌        低(2)    低    -    ＜1％*

          原发癌(CL) SW480         结肠癌        低(2)    低    +    10％*

          原发癌(CL) SW480R        结肠癌        高(2)    高    +    100％*

          原发癌(CL)     SW620         结肠癌        高(2)    高    +    100％*

          转移瘤(CL) PC3           前列腺癌(CL)  ND       ND    +    75％* MCF7          乳腺癌(CL)    ND       ND    -    50％* A549          肝癌(CL)      ND       ND    -    50％* HepG2         肝癌(CL)      ND       ND    -    75％* LS174T        结肠癌(CL)    ND       ND    -    50％* VA59P(B)      骨肉瘤        原发癌   低    ND VA59M(B)      淋巴非转移癌  转移     高    ND

          (VA59P) BICO5P(B)     结肠癌        原发癌   ND    ND   5％** BIC52MH(B)    肝转移癌      转移     ND    ND   75％**

          (BIO5P) BIM01MG(B)    淋巴非转移癌  转移     ND    ND   75％**

          黑素瘤 BIM02MG(B)    淋巴非转移癌  转移     ND    ND   75％**

          黑素瘤 (CL)培养的细胞系(B)从病人身上获得的组织样本 *    以非常显著量(荧光强度大于阴性对照强度的10倍)表达

IL-2Rα的肿瘤细胞百分率。 **  以定量荧光显微技术测定的肿瘤组织切片中由阳性细胞

覆盖的表面区域的百分率。 (1) Bresalier等人，1987，Cancer Research 47：1389-1406 (2) Tomita等人，1992，Cancer Research 52：6480-6487 F.转移灶数目与表达细胞相关性IL-2Rα的肿瘤细胞百分率的

相关性

为了说明这个实施方案，在不同条件下处理B16F10黑素瘤 细胞，以便将转移灶数目与表达IL-2Rα的转移瘤细胞的密度或 百分率进行比较。体外预处理包括在下述溶液中于37℃5％CO2中孵育不同组的细胞：A)在常规生长培养其中保温24小时(对 照)；B)在含有125U/ml IL-2的培养基中保温24小时(激活转移 瘤细胞的生长)；C)在含有10U/ml IL-1β的培养基中保温24小 时(激活细胞生长)；D)在含有5μg/ml ConA的培养基中保温24 小时(激活细胞生长)；或E)通过大致暴露于0.1％胰蛋白酶和 2mM EDTA中来分离细胞，并在离心(Spinner)瓶中的DMEM加10％ FBS中孵育细胞48小时(加强细胞生长)。

在体外预处理之后，从含有代表5个组中每个组的细胞的 平板中除去上清液；用PBS轻轻洗涤细胞；从组织培养平板上轻 轻刮下附着的细胞；将该细胞在含有1μg/ml鼠抗小鼠IL-2Rα 单克隆抗体的PBS溶液中于4℃下保温30分钟。洗涤之后，将细 胞在含有20μg/ml FITC-兔抗-鼠Ig抗体的PBS溶液中于4℃下 保温30分钟。然后用1％对甲醛固定细胞，并在48小时通过FACS 对IL-2Rα表达进行定量分析。为了进行抗原表达，用脾细胞作 为阴性对照，用ConA活化的脾细胞作为阴性对照。

将体积为0.05毫知的来源于5个不同预处理组中每个组的 总量为5×105的存活癌细胞注射到麻醉小鼠脾脏的上段。将来 源于每个不同预处理组的细胞注射到一组20个小鼠中。5分钟 后对动物进行脾切除。在肿瘤细胞注射7天之后颈脱位处死一 组件的20个动物；取出其肺脏和肝脏，并冷冻在液态氮中。以 200μm的间隔用恒冷切片机切下10和40μm肝脏连续切片。对 这些切片进行琥珀酸脱氢酶染色(SDH-染色)；于-20℃下在丙 酮中浸45秒钟，然后在PBS中洗涤2次5分钟。用带有成像分析 设备的显微镜检查切片。通过透射光(SDH-染色)获得每个区域 的成像。单个病灶被清楚地描述为肝脏组织的非SDH染色区。 根据所述的立体学判断标准(Aherne & Dunnill，Morphometry ，ed.Edward Arnold，London，1982)，使用特别修改的软件 (DPLAN，Spain)由成像分析数据计算每个肝脏中的单个病灶的 出现频率和体积以及总瘤体积。

图1和2描述了结果。图1表示的是每个不同预处理组中细 胞的转移灶数目与每个细胞(10,000个细胞的平均数)表达的 IL-2Rα数量的相关曲线，结果表明IL-2Rα细胞表达的增加与 转移灶数目的增加呈相关性。例如，在暴露于ConA的那些细胞 中发现每个细胞表达出最大量的IL-2Rα受体。ConA活化的黑 素瘤细胞也是一组转移灶数目最大的细胞(图1，圆圈D)。图2 表示的是肝脏中转移灶的数量与整个样本中IL-2Rα表达(与由 LISA测定的表达相似)的相关曲线，结果表明显示出IL-2Rα 表达平均强度的样本与肝脏中转移灶数目相对应。例如，具有 最高IL-2Rα表达强度的黑素瘤细胞样本，暴露于ConA的细胞， 也是产生最高数量转移灶的细胞样本(图2，圆圈D)。 1.2非淋巴肿瘤IL-2Rα细胞相关性表达的测定在临床上的

应用 A.确定肿瘤转移的预后

由于在非淋巴肿瘤的诊断和治疗方面存在转移的问题，希 望有一种确定癌转移预后的方法。用于确定癌转移预后的一种 方案包括下列步骤：

(a)获得原发肿瘤的样本(手术前活组织检查或手术中活组 织检查)

(b)使用在上面1.1 A-E章节中所述的任何一种方法或它们 的组合获得具有IL-2Rα的非淋巴细胞百分率。非淋巴肿瘤活 组织检查及肿瘤类型将影响适合于确定该样本中IL-2Rα细胞 相关性表达的最佳方法选择。例如，包括有进行荧光显微方法 试剂的临床诊断药盒最适合于测定冷冻非淋巴肿瘤组织的组织 学切片或固定和包埋肿瘤组织的组织学切片中的IL-2Rα细胞 相关性表达。用于测定分离的非淋巴肿瘤组织细胞中IL-2Rα 细胞相关性表达的临床诊断试剂盒可以含有用于ELISA的试剂 和微滴定板；用于FACS分析的试剂，或用于PCRTM分析的试剂， 包括特定的引物和探针。临床诊断药盒一般基本上含有两种成 份：(1)偶合到一种报告化合物如荧光色素、发色团或酶上的抗 IL-2Rα抗体。这类化合物的例子包括碱性磷酸酶，荧光素-5- 异硫氰酸盐，过氧化物酶，藻红蛋白，和若丹明；(2)本领域熟练 技术人员已知的抗与特定肿瘤类型相关的癌细胞标记物(TCM) 的抗体。可以用于本发明方法的抗与特定肿瘤类型相关的癌细 胞标记物的抗体包括但不限于下述表2中所列举的那些。

                  表2 抗-TCM抗体                             特定肿瘤类型 HEA 125 MAb，HT29-15 MAb或B72.3 MAb    结肠直肠癌 BCD-B4 MAb或NCRC-11 MAb                乳腺癌 抗PSA抗体或PD41 MAb                    前列腺癌 ALT-04 MAb                             肺癌 B72.3 MAb，HMD4 MAb或COC183B2          卵巢癌 HEA-125 MAb，MM46 MAb，或9.2.27MAb     黑素癌 MGb 2 MAb，或ZCE 025 MAb               胃癌 BW494 MAb                              胰腺癌 CEB9 MAb                               宫颈癌 HSAN 1.2 MAb                           成神经细胞瘤 HISL-19 MAb                            神经内分泌瘤 TRA-1-60 MAb                           精原细胞瘤 MAb-单克隆抗体

使抗-TCM抗体偶合到一种可以与偶合到抗IL-2Rα抗体上 的荧光色素、发色团或酶区分开的荧光色素、发色团或酶。

为了确定肿瘤转移的可能性，对非淋巴肿瘤测定两种百分 率。第一种百分率是测定表示两种抗原(IL-2Rα+，TCM+细胞) 的肿瘤细胞百分率或肿瘤组织表面的百分率。第二种百分率是 测定可通过表型(包括大小、形状特征、流动血细胞计数前角 光散射(FACS))识别的，并且是IL-2Rα阳性(肿瘤细胞表型+， IL-2Rα)的肿瘤细胞的百分率。两种百分率之和是转移集落形 成细胞的系数(Met-CFC系数)。Met-CFC系数与肿瘤转移可能性 成比例关系。实验性测定如下：

Met-CFC系数    转移可能性

    0％            0％

 ＜10％         ＜30％

 ＞45％          100％

注意IL-2Rα表达本身可以用来实验性确定肿瘤转移，因为 T细胞被排除在纯化肿瘤之外。尽管如此，为了从肿瘤活组织查 中排除T细胞IL-2Rα表达，要将抗TCM和肿瘤表型与IL-2Rα同 时使用。

为了说明这个实施方案，并且只以IL-2Rα表达为依据，在 不同条件下处理B16F10黑素瘤细胞以对比肿瘤转移效率和IL -2Rα表达。按照上面F章节所述体外预处理B16F10细胞，不同 的是预处理包括在下列溶液中孵育不同组的细胞：A)在常规生 长培养基中孵育24小时(对照)；B)在含有125U/ml IL-2的培养 基中孵育24小时(激活肿瘤转移细胞的生长)；C)在含有10U/ml IL-4的培养基中孵育24小时(阻过IL-2Rα的表达)；D)在含有5 μg/ml ConA的培养基中孵育24小时(激活细胞生长)；或E)通 过大致暴露于0.1％胰蛋白酶和2mM EDTA来分离细胞，然后在 Spinner瓶中的DMEM和10％ FBS中将细胞孵育48小时(加强细胞 生长)。按照上面F部分所述进行FACS分析以分析IL-2表达和体 内肿瘤细胞生成，以及进行肿瘤转移效率分析，不同的是每组由 6个小鼠组成而不是20只。结果表示在表3中，结果显示如果细 胞表达IL-2Rα小于10％，大约30％的小鼠发生肿瘤转移(B16F10， 未处理的；和IL-2处理的细胞)；如果没有细胞表达IL-2Rα， 任何鼠中都没有出现肿瘤转移(0％小鼠，用IL-4处理的细胸)； 如果35％的细胞表达IL-2Rα，发生肿瘤转移的小鼠大于80％(生 长在混悬液中的B16F10)；而如果大于50％的细胞表达IL-2Rα， 则有100％的小鼠出现肿瘤转移(用ConA处理的B16F10)。

                表3 预处理            细胞的表面IL-2Rα            肿瘤转移小鼠数 B16F10(未处理)        7.4±5.7                2/6 B16F10+IL-4           0                       0/6 B16F10+IL-2           9.8±6.3                2/6 B16F10+ConA           59.5±4.8               6/6 混悬液中的B16F10      35.4±2.2               5/6

已发现高的原数与本文所述的″前转移区域″优先相关，或 甚至表明有全部肿瘤转移。 2.对前转移区域局部使用抗癌疗法治疗，包括将化合物直接   靶作用于转移集落形成细胞，并使转移肿瘤细胞处于非活化   状态，和监测该疗法的效果 2.1前转移区域

用IL-2融合毒素有效地处理血液恶性肿瘤，包括白血病和 淋巴癌，该毒素可选择性地结合带有高亲合性IL-2受体的细胞， 并使其中毒(LeMaistre等人，1992，Immunol-Res.，11，42- 53；和Waldmann等人，1992，Ann Intern Med.116：148- 160)；和用抗高亲和力IL-2受体的人抗体(hIL-2R)或用连接有 毒素或放射核素(Waldmann等人，1992，如前所述)的抗-hIL- 2R处理该血液恶性肿瘤。本发明在治疗实体非淋巴肿瘤的转移 灶和冶疗具有高度转移可能性的实体非淋巴肿瘤方面，其治疗 方法在几个重要方面有所不同。血液恶性肿瘤表达能够被IL-2 和抗-hIL-2R有效结合的hIL-2R(含有α和β链)。而且，根据恶 性肿瘤的性质，用IL-2-毒素或抗-hIL-2R-毒素或抗-hIL-2R的 治疗包括系统性输注。由于本发明已表明在实体非淋巴肿瘤的 转移潜在危险性与IL-2-毒素或抗-hIL-2R-毒素或抗-hIL-2R的 结合亲合力较低。因此，本发明用于治疗实体非淋巴肿瘤的转 移灶和具有高度转移可能性的实体非淋巴肿瘤的抗癌疗法之一 是包括给药一种有效治疗量的连接有毒素、放射性核素，或化 疗药的分子，其中该分子对IL-2Rα有特异性(即，具有高度的 结合亲和力)，如人抗-IL-2Rα抗体。

尽管IL-2Rα对IL-2的亲和力较低，在前转移区域聚集相 对小剂量的IL-2可以激活休止的转移肿瘤细胞，使其对抗肿瘤 药物更敏感。因此，根据本发明，用于治疗转移集落形成细胞 和休止转移肿瘤细胞的另一种方法包括对前转移区域同时给药 IL-2和抗肿瘤药物。注意根据本发明此实施方案的抗癌疗法不 包括系统性给药，但还包括将治疗药物直接靶作用于前转移区 域。

可以通过区域的血管系统、末端糖浓度、和从该区域中获 得的细胞表面表达的细胞外粘性分子(ICAMS)的浓度来识别本 发明抗癌药物靶作用的前转移区域。实体非淋巴肿瘤的转移肿 瘤细胞只在含有靶器官如肝脏和肺脏独特毛细血管区的权预测 部位发展成为转移灶核(″聚集″)(Barbera-Guillem等人，1989 ，Cancer Research 49：4003-4010；Barbera-Guillem等人， 1992，Int.J.Cancer 53：298-301；Barbera-Guillem等人， 1993，Int.J.Cancer 54：880-884)。例如，在肝脏中，前转 移区位于肝静脉的门静脉延伸的第一半(基本上在该半区的第 二个四分之一区处)窦状区。肝窦的这个区域也被称作是窦状 门静脉周区。在肺脏中，前转移区位于末端前肺泡小静脉和胸 膜末端毛细血管。在其他器官包括肾上腺中也表现出了类似区 域。

所有特征前转移区的共同要素是该区域内的毛细血管含有 特定亚群的内皮细胞，称作″1型内皮细胞″(Vidal-Vanachlocha 等人，1993，Hepatology 18：328-339)。1型细胞在其细胞表 面表现出一种鉴别性特征，它含有带高浓度特定末端糖(N-乙酰 基半乳糖胺；Gal NAC)的低聚糖，它比其他毛细血管区中的细 胞高6-10倍(Barbera-Guillem)等人，1991，Hepatology 14： 131-139；Vidal-Vanachlocha等人，1993，如前所述)。这些 特定糖的较高表达其结果是当在前转移区的前循环部位注射植 物血凝素时，能够与这些糖特异性结合的植物血凝素优先与1 型内皮细胞结合。因此，注射的植物血凝素，如小麦胚凝集素 (WGA)，在前转移区被捕获，并且被布散开。这在图4中表示出 ，其中肿瘤细胞没有聚集和发展的肝脏区域则没有若丹明标记 的WGA(暗区)；而含有前转移区域的毛细血管1型内皮细胞被若 丹明标记的WGA所结合(亮区)。因此，在肿瘤细胞聚集和发生 转移的肝脏靶区域中出现植物血凝素荧光分子的布散。在含有 前转移区的毛细血管区中所含较高浓度的植物血凝素反映了在 这些区域中有较高末端糖(Gal NAC)浓度的毛细血管1型内皮细 胞。

在前转移区域中的肝脏内皮细胞也含有较高浓度的ICAMs。 因此，可用对ICAM有特异结合性的配体或抗体作为对这些细胞 亚群有特异性靶试剂。肺前转移区也含有含较高浓度ICAMs的 内皮细胞(Zhu等人，1993，Int.J.Cancer 53：628-633；Zhu 等人，1992，J.Clin.Invest.89：1718-1724)，并且，可以 用对ICAM有结合特异性的配体或抗体作为对这些细胞亚群有特 异性的靶试剂。

捕获在前转移区的癌转移细胞进入一种休止状态，或处于 一种低增殖状态(假休止)，该状态对NK细胞和抗癌药物具有高 度抵抗性。在局部低浓度的IL-2和IL-1影响下这些细胞脱离这 种状态。当激发引起肿瘤转移细胞的未成熟细胞增殖时，这些 细胞则变得对抗肿瘤药和NK细胞更为敏感。

为了说明细胞激动素(Cytokine)浓度与对非淋巴肿瘤细胞 生长所产生的效果之间的相关性，将B16F10黑素瘤细胞暴露于 不同浓度的IL-L和IL-2，并记录所带来的生长反应。为了测定 IL-2对B16F10黑素瘤细胞生长的作用，将104个成活的癌细胞 加入到96孔培养板的每个孔中，在不含血清或含有浓度范围为 10～200U/ml的小鼠重组IL-2；或20，125或250U人重组IL-2 (hrIL-2)的10％FBS补充常规培养基中于5％CO2下将培养物孵育 48小时。然后，每孔中加入1μCi的[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷， 6小时之后收集，并接着测定其中的放射活性。测定IL-1对 B16F10黑素瘤细胞生长的作用的技术方案是，将104个成活的 癌细胞加入到96孔培养板的每个孔中，在不含血清或含有1.10 或20U/ml小鼠IL-1β的10％FBS补充常规培养基中于5％CO2下 将培养物孵育48小时。在某些情况下，与IL-1β一起同时加入 抗IL-2Rα抗体。每孔中加入1μCi的[3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷 ，6小时之后收集，并接着测定其中的放射活性。图5显示高浓 度(大于75U/ml)的IL-2诱导死亡或未成熟细胞的细胞生长抑 制，但对假休止状态的B16F10癌转移细胞没有影响。在治疗方 面重要的是要注意到IL-2浓度大于75U/ml对癌转移细胞的细 胞生长具有抑制作用，而浓度在75U/ml和100U/ml之间时对 以类似方法制备的淋巴细胞(图5，由CTLL-2代表)没有毒性。 表4显示了低浓度的IL-2和IL-1诱导出从假休止到未成熟的步 骤，并诱导未成熟细胞的增殖。

                表4 细胞激动素/浓度     B16F10反应(平均值，cpm) 对照组              60.12±28.5 抗-IL-2Rα抗体      40.60±7.9 小鼠IL-2(10U/ml)    2057.40±540.7 小鼠IL-2(20U/ml)    3619.60±116.2 IL-1(1U/ml)         61.85±20.5 IL-1(10U/ml)               1083.30±70.5 IL-1(20U/ml)               2045.60±448.2 IL-1(10U/ml)+ 抗-IL-2Rα抗体(1μg/ml)    571.19±78.2 IL-1(10U/ml)+ 抗-IL-2Rα抗体(4μg/ml)    98.64±16.8 FCS(10％)对照              1594.30±301.3 抗-IL-2Rα抗体(4μg/ml)    565.40±66.9 小鼠IL-2(20U/ml)           2556.60±566.2 FCS(10％)对照              2135.32±245.5 hrIL-2(20U/ml)             2012.52±347.2 hrIL-2(125U/ml)            2452.22±298.3 hrIL-2(250U/ml)            3181.62±231.6

因此，本发明治疗实体非淋巴肿瘤转移灶的方法包括直接 对前转移区域施以抗癌疗法。这种方法的优点包括该抗癌疗法 是直接靶作用于特定器官的前转移区中的细胞，从而将治疗浓 度的抗肿瘤药或毒性剂输送到实体非淋巴肿瘤细胞转移灶所在 区域，而尽可减少对免疫和造血系统的损害。 2.2直接针对前转移区的抗癌疗法

特别是，根据本发明的抗癌疗法包括一种或几种下列实施 方案：

方案(A)将一种含有治疗有效量IL-2或IL-1的化合物，和 抗肿瘤药(化疗药)给药到前转移区以避免IL-2对未成熟癌细胞 的细胞生长抑制作用，并活化假休止态的肿瘤转移细胞以避免 其抗药性，提供足够浓度的抗肿瘤药物使前转移区摄取以达到 使转移肿瘤细胞死亡。

在这个实施方案中，可以使用本领域中熟练技术人员已知 的方法(如美国专利No.5,284,934)将IL-1或IL-2连接到植物 血凝素分子上，也可以将抗肿瘤药物连接到一种植物血凝素分 子上，如WGA，并且将这些成分以治疗有效比率混合，提供一 种对抗癌疗法的靶部位前转移区域具有高度亲和性的化合物。 或者，也可以将抗-ICAM抗体连接到IL-1或IL-2上，以及将相 同抗体连接到抗肿瘤药物上，并使这些成份以治疗有效的比例 混合，提供一种对前转移区域具有高度亲和力的化合物。可以 使用本领域中熟练技术人员已知的方法将这些化合物结合到载 体脂质体上以增加该化合物在前转移区的滞留时间。为了实施 这个技术方案，构建一种脂质体使其在内部含有若丹明，并在 表面结合WGA。向肝门静脉注射这些脂质体可以引起如图4所示 的相同荧光分布。另外还注意到1型内皮细胞并不在植物血凝 素脂质体中，使它们暴露于相近的肿瘤转移细胞。尽管如此， 但是有一种可能的限制因素是通过荧光分析似乎枯否细胞吞噬 一小部分植物血凝素脂质体组合物。 实施方案(B)向前转移区给药一种化合物，该化合物含有一种 连接到毒素、放射性核素、或化疗药上的治疗有效量的分子， 该分子对IL-2Rα具有特异性，如人抗-IL-2Rα抗体，从而使 所给药的化合物结合被聚集在该区中的转移肿瘤细胞，导致转 移肿瘤细胞死亡。

在(A)和(B)两个实施方案中，通过一种导管给药该化合物 ，以便将该化合物直接导入前转移区的血管途径。也可以在两 种实施方案中使用上体1.1章节A-E中所述的任何一种方法或其 方法组合，测定IL-2Rα的细胞相关性表达，以监测治疗效果 ，与治疗开始之前表达细胞相关性IL-2Rα的转移肿瘤细胞数 目相比，如果表达细胞相关性IL-2Rα的非淋巴肿瘤的转移癌 细胞数目减少，则表明了该抗癌疗法的效果。 3.对表示TCRβ，或肿瘤特异性β链变异体的非淋巴肿瘤细胞 直接施以抗癌疗法。 3.1 TCRβ表达与非淋巴肿瘤之间的关系。

在本发明的这个实施方案中，对于非淋巴肿瘤的抗癌疗法 取决于这些肿瘤对T-细胞受体β(TCRβ)和/或β链变异体的表 达。

基本上，肿瘤细胞可以表达TCRβ链的几种可变区(最多见 的是Vβ8)，它表现出一种高可变性区域成分以表达一种组织 和/或肿瘤特异性。不管怎样，由于它与淋巴细胞TCR的功能相 似性，即使这些序列具有组织特异性，也不具有致免疫性。但 是，它们表现为免疫抑制或无反应性的诱导体成分。因此，根 据本发明的一种方法是将抗癌疗法靶作用于表达TCRβ的非淋 巴肿瘤细胞。

在本发明的一个实施方案中，测定实体，非淋巴肿瘤上的 TCRβ细胞相关性表达。该实验表明，人和实验性非淋巴肿瘤 表达TCRβ。在下面A至D部分中的实施例中，描述了使用选自 下列一组方法中的一种或几种对人和实验性肿瘤中细胞相关性 TCRβ的检测，这些方法包括荧光显微技术(测定表面TCRβ)， mRNA Northern和狭槽印迹分析(测定TCRβm-RNA表达)，mRNA 的酶放大和分析(测定TCRβ m-RNA表达)，和定量荧光分析(测 定表面TCRβ)。按如下所述获得人和实验性肿瘤：B16F10黑素 瘤细胞由Dr.MF Poupon(巴黎)提供。结肠51B和结肠51B lim 10细胞由Dr.R.Bresalier(美国)提供。MCA-26细胞由 Dr.I.Fidler(美国)提供。MMC-7489和细胞由Dr.J. Vaageand(美国)提供。SW480，8W480E，SW480R和SW620由 Dr.I.B.Weinstein提供。人活组织检查由Dr.Alonso和Dr. Pellin(西班牙)提供。其他的肿瘤细胞系从ATCC获得。使所 有肿瘤细胞系在塑料T型瓶中的足量10％ FBS补充培养基中于 5％CO2的潮湿空气中生长，该培养基还含有素霉素和链霉素。 为了消除人肿瘤细胞样本的可能性淋巴细胞污染，按如下制备 样本。在手术条件下从病人身上切下肿瘤样本；在含有青霉素 和链霉素的培养基中洗涤；在含有0.02％链霉蛋白酶E(Sigma， 美国)和0.05％I型胶原酶的20ml GBSS中于37℃pH为7.4条件下 绞碎并搅拌10分钟。然后通过尼龙沙布过滤细胞混悬液，以 250xg离心两次10分钟。将分离的细胞皮下植入裸鼠中。肿 瘤生长21天之后，取肿瘤细胞样本以进行TCRβ表达研究。 A.TCRβ的荧光显微检测

将含有非淋巴肿瘤的肿瘤活检组织或外科样本分解，并直 接制备成可用于荧光分析的样本。或者，将肿瘤细胞在8孔的 载玻片(Biotek)培养48小时，然后除去上清液，用PBS轻轻洗 涤培养孔，并用Carnoy氏固定液固定。三次PBS洗涤之后，将 细胞在含有4μl/ml FITC-鼠抗-人-TCRβ(不变区和可变区)单 克隆抗体(Genzyme，Boehringer Manheim)的PBS溶液中于37℃ 下保温30分钟。保温之后，用PBS洗涤培养孔两次。只用FITC 鼠抗-鼠-IgG2单克隆抗体(Boehringer Manheim)制备对照组。 用激光扫描荧光显微镜观察细胞。 B.mRNA Northern和狭槽(Slot)-印迹分析

从脾细胞，ConA-活化的脾细胞，和肿瘤细胞中获得mRNA 。在提取mRNA并定量之后(通过0.7％琼脂糖凝胶电泳分析表明 是完整未受损的)，在含有2.2M甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上制备 总量为20μg的纯化RNA。在80V下进行电泳。从凝胶上切下含 有分子大小标准的泳道，并测定迁移距离。洗涤凝胶，并转移 到硝化纤维素滤纸上。将2μg的mRNA稀释在最终体积为100μl 的10xSSC-甲醛中，并在印迹点样之前于65℃下加热10分钟使 其变性。用UV辐射将mRNA交联到硝化纤维素滤纸上。将印迹在 6xSSC，0.5SDS，5x Denhardt’s，10mM EDTA，50μg/ml 剪切 的鲑精子DNA和50μg/ml的大肠杆菌tRNA中于45℃下预杂交4小 时。同时用γ-32P APT根据常规方法通过5’端标记寡聚核苷 酸探针来标记鼠或人TCRβ(Clontech)的5微微摩尔DNA探针。 通过随机引导来标记100μg的人β-肌动蛋白DNA探针 (Clontech)。用放射性标记的探针(2×109cpm/μl特异性放 射活性)与m RNA印迹在45℃下杂交24小时。然后在杂交温度下 用5xSSC-0.1 SDS洗涤印迹20分钟。将印迹在x-光胶片上曝光， 并于-70℃下对各不同阶段进行强度扫度。在100℃的无菌水 中保温10分钟从滤纸上除去探针，使滤纸与其他探针再杂交。 用影像密度测定仪对10个放射自显影照片进行定量分析。 C.肿瘤细胞mRNA的酶放大反应。

通过从非淋巴肿瘤细胞中提取和纯化的mRNA，并将纯化的 mRNA进行酶放大反应以获得足够量用于分析和检测，可以对 TCRβ mRNA的表达进行检测。可以使用的酶放大反应技术包括 本领域中已知的那些方法，如TCRTM(聚合酶链反应)，QB复制 酶技术，和NASBA(核酸序列基础性放大反应)。对放大核酸的 检测方法包括本领域中已知的方法，包括但不局限于，琼脂糖 凝胶电泳和Northern印迹分析；荧光基础性杂交分析；化学 发光基础性杂交分析，和捕获性杂交微滴定分析。可以从本领 域中证实的TCRβ基因的核酸序列合成寡聚核苷酸引物和探针 (Waters等人，1992，Diabetes 41：308-312)。可以用本领域 熟练技术人员已知的方法合成探针以结合上非同位素或同位素 标记物。或者，也可以将标记物直接结合到放大产物中。

在这个实施例中，对从提取的肿瘤细胞mRNA通过反转录而 获得的单股cDNA，使用从商业上购得的TCRβ基因的引物通过 PCRTM进行放大。在1.2％琼脂糖凝胶上分离放大产物，并用溴 化乙锭与阳性和阴性对照平行染色。用Photoquant SystemTM (BAF，西班牙)进行定量分析。 D.定量荧光分析

将肿瘤细胞在24孔培养板上培养48小时，然后除去上清液 ，用PBS轻轻洗涤该孔，从组织培养板上轻轻刮下细胞，并在 含有1μg/ml鼠FITC偶合的抗小鼠-TCRβ单克隆抗体的PBS溶液 于4℃下保温30分钟，然后用1％对甲醛固定，并用一种显微荧光 测定方法在48小时内分析。在所有情况下，只用第二种抗体制 备对照组。用脾细胞作为抗原表达的阴性对照，用ConA-活化 的脾细胞作为抗原表达的阳性对照。使用专用软件(ImageI， 美国；和Photoquant，西班牙)对肿瘤细胞上的TCRβ表达进行 定量分析。

表5表示的是与人非淋巴性肿瘤相关性较好的TCRβ细胞相 关性表达。

                表5

    人非淋巴性肿瘤细胞上的TCRβ表达 建立的肿瘤细胞系 肿瘤    肿瘤类型            TCRβmRNA LS174T   结肠癌                + T84      结肠癌                + SW620    结肠癌                + SW480    结肠癌                + R2       结肠癌                + E8       结肠癌                + A549     肺癌                  - SEPPLO   肾癌                  - HELA     宫颈癌                - HL-60    早幼粒细胞白血病      + HepG2    肝癌                  - 原发肿瘤活组织检查 BVal50         骨肉瘤            - BVal21         骨肉瘤            + BVal84         骨肉瘤            + BVal8          骨肉瘤            + BVal46         骨肉瘤            + BVal76         骨肉瘤            - BVal102        骨肉瘤            + BVal56         骨肉瘤            + BVal88         骨肉瘤            + BVal100        骨肉瘤            + BVal154        骨肉瘤            + BVal-C1594     成视网膜细胞瘤    + BVal-C-700     成视网膜细胞瘤    + BVal611        骨肉瘤            - 3.2人实体非淋巴肿瘤的TCRβ细胞相关性表达的临床应用。 3.2.1免疫调节

本发明提供了通过TCRβ特异性将化合物直接靶作用于转 移肿瘤集落形成细胞以使转移肿瘤细胞处于休眠状态。葡萄球 菌肠毒素(SEA，SEB，等)将肿瘤细胞的TCR可变β链连接到带抗 原的细胞的CMH II上，接着产生了对免疫系统和肿瘤细胞的共 同调节。这些反应与抗大多数肿瘤的免疫反应缺乏有关，并且 与变化为保守状态的肿瘤细胞相关，这些细胞即使在原发肿瘤 根除多年之后，在偶然的炎症环境下能够被转换过来。

本发明直接向集落形成肿瘤转移细胞、休眠细胞和癌细胞 的TCRβ-靶作用方法一般包括下列实施方案所述的免疫调节： 实施方案(A)一种调节免疫反应的方法是，提供能够识别每 个特定来源(器官、组织、细胞群，等)肿瘤细胞TCRβ-特异性 序列的分子，该分子可被免疫系统细胞所识别，控制引导所希 望的免疫过程相互作用。这些分子包括葡萄球菌肠毒素或连接 到IL-1或IL-2上的抗-TCRβ基因型。实施方案(B)。一种肿瘤 增殖调节方法；该方法是提供能够识别每个特定来源(器官、 组织、细胞群，等)的肿瘤细胞TCRβ-特定序列的分子，该分 子可被免疫系统细胞所识别，控制引导所希望的免疫过程相互 作用。

免疫调节或肿瘤增殖调节通过下述过程完成，即根据肿瘤 的器官特异性，制备抗不同种类的非淋巴肿瘤细胞的抗-TCRβ 基因型单克隆抗体，以用于诊断和药理学用途。或者，根据 Basi等人的方法(1992，J.of Immunol.Methods 155：175 -191)，制备抗从特定非淋巴肿瘤分离的可溶性人TCRβ的抗体 ，其中所产生的可以识别由该非淋巴肿瘤表达的细胞表面TCR 上的多个表位。使用本领域中熟练技术人员已知的方法将IL-2 或IL-1连接到抗-TCRβ基因型抗体上，含有治疗有效量的这 IL-2或IL-1的化合物使得该化合物具有有效实现免疫调节的特 性。该化合物可以含有被包含在载体脂质体中的IL-1或IL-2， 使用本领域中熟练技术人员已知的方法将抗-TCRβ基因型抗体 结合到脂质体表面上。这种化合物可以系统给药。 3.2.2 TCRβ-靶给药抗肿瘤药物疗法

具体讲，根据本发明的TCRβ-靶给药抗肿瘤药物疗法包括 一种含有治疗有效量的连接到毒素、放射性核素、或化疗药物 上的分子的化合物，其中该分子是可系统给药的人性化的抗- TCRβ基因型抗体。这种化合物可以含有被包含在载体脂质体 中的化疗药物，使用本领域熟练技术人员已知的方法将抗-TCR  β基因型抗体结合到脂质体表面上。使用上面3.1部分A-D所 述的任何一种方法或其组合测定TCRβ的细胞相关性表达可以 监测治疗效果，或者也可以使用临床诊断药盒测定，该药盒包 括使用抗-TCRβ基因型抗体免疫测定方法，其中与治疗开始之 前表达TCRβ的非淋巴肿瘤细胞数目相比，表达细胞相关性TCR β的非淋巴肿瘤细胞数目减少表明了该疗法的抗癌效果。

可以将与肿瘤细胞的抗-TCRβ基因型对应的肽结合到APC 的MHCII上下以用于其药理学用途。

为了靶给药以结合TCRβ，考虑到β链的肿瘤特异性变异 体的因素，必须从病人身上分离肿瘤细胞以激发抗肿瘤变异体 的特异性抗-TCRβ基因型抗体，或确定该变异体的核酸序列， 以合成相应肽。    

尽管本发明为了清楚和易懂的目的，通过实施例和说明较 为详细地描述了本发明，但是从前面的描述和图示可知，各种 变化方案对于相关领域中的熟练技术人员是显而易见的。这些 变化倾向于包括在本申请的精神范围之内，并包括在附带的权 利要求范围之内。

              根据PCT条约第十九条修改                     权利要求的声明     相信新的权利要求25和26不会引入新的内容，因为它们得 到了申请说明书的支持。美国专利局审查员已同意权利要求25 和26被允许(见重新编号的权利要求10和11)。特别是，在25页 29～30行至26页的1～2行，可以注意到使用由其本身的IL-2Rα表 达预测实体非淋巴肿瘤的转移可能性。在26页23～29行至27页 1～11行中所公开的是使用标准动物模型系表示表达IL-2Rα的 肿瘤细胞百分率与体内转移瘤发生之间相关性的结果。还提交 了在美国专利申请中已提交的Dr.Barbera-Guillem的细则132 的声明(附证据)，进一步支持权利要求25和26。该声明提供了 其他的证据，包括对人原发肿瘤活检组织的回顾性双盲研究， 支持权利要求25中所公开的方法，即，可以单独肿瘤细胞相关 性IL-2Rα(即，不使用如表2中所公开的其他肿瘤细胞标记物) 即可预测人原发肿瘤的转移可能性。权利要求26公开了用于测 定申请说明书中所公开的，在，例如，原始权利要求2和14中也引 用的肿瘤细胞相关性IL-2Rα的方法。

权利要求书

按照条约第19条的修改

1.一种确定实体非淋巴肿瘤的转移肿瘤可能性之预后的方 法，包括下列步骤：

(a)测定细胞相关性IL-2α，分别测定对来自所说肿瘤样 本的该肿瘤类型的特异性的肿瘤细胞标记物；

(b)计算包括肿瘤细胞或表示IL-2Rα存在的肿瘤组织表面 和所说肿瘤标记物的第一种百分率；

(c)计算包括过表使用选自下列一组中的一个或几个特征 而能够别识的肿瘤细胞的第二种百分率，该组特征包括大小，形 状特性，FALS，也表现有IL-2Rα存在的所说肿瘤；和

(d)使第一种百分率与第二种百分离相加，获得一种转移 肿瘤集落形成细胞(Met-CFC)系数，所说系数与转移肿瘤潜在 危险性的预后以下述关系成比例关系：

Met-CFC系数    肿瘤转移潜在危险性

    0％                0％

 ＜10％             ＜30％

 ＞45％              100％

2.权利要求1的方法，其中使用选自下列一组中的一种方法 测定细胞相关性IL-2Rα，该方法包括荧光显微方法，Western 印迹分析，m-RNA Northern和狭槽印迹分析，m-RNA的酶放大 和分析，荧光活化细胞分类，和免疫测定。

3.权利要求1的方法，其中使用对该肿瘤细胞标记物有结合 特异性的抗体测定对该肿瘤细胞类型有特异性的肿瘤细胞标记 物，所说的抗体选自根据表2的一组抗体。

4.一种对实体非淋巴肿瘤的转移肿瘤细胞或休眠转移肿瘤 细胞的抗癌疗法，所说疗法是直接作用于靶器官的前转移区域， 并包括用选自下列一组的化合物治疗该前转移区域，以有效的 导致转移肿瘤细胞死亡，该化合物包括： 抗体被连接到选自毒素、放射性核素或化疗剂的一种第二组份 上。

25.一种预测实体非淋巴肿瘤转移可能性的方法，包括获 得实体非淋巴肿瘤细胞的样本，并测定所说肿瘤细胞中IL-2Rα 的肿瘤细胞相关性表达，其中实体非淋巴肿瘤的转移可能性被 预测为：

(a)在没有肿瘤细胞被测定为表达IL-2Rα时为0％；

(b)当大约1％至大约10％的肿瘤细胞被测定为表达IL-2Rα 时，转移可能性大约为30％；和

(c)当大约大于35％的肿瘤细胞被检测为表达IL-2Rα时， 转移可能性大于大约80％。

26.权利要求25的方法，其中通过选自下列一组中的方法 测定细胞相关性IL-2Rα，这些方法包括荧光显微技术，Western 印迹分析，m-RNA Northern印迹和狭槽印迹分析，m-RNA的酶 放大和分析，荧光活化细胞分类法，和一种免疫测定方法。