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一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法及其应用

阅读：711发布：2021-11-16

专利汇可以提供一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种自体自然杀伤细胞增殖培养的制备方法，其中包括如下特征：来自于癌症患者自身的单个核细胞，在使用3- 磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122 转染并稳定表达的K562细胞作为滋养层细胞和白介素2作用下扩增激活获得自然杀伤细胞，自然杀伤细胞增殖倍数达到2500倍以上，CD16+/CD56+表型为90％以上，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性；本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的自体自然杀伤细胞增殖培养的试剂盒，具有高效的抗肿瘤功能。，下面是一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法，其特征在于，来自于癌症患者自身的单个核细胞，在使用3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122转染并稳定表达的K562细胞作为滋养层细胞和白介素2作用下扩增激活获得自然杀伤细胞，使自然杀伤细胞得以大量增殖；
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培养至21天细胞增殖倍数达到2500倍以上，NK细胞数达到3×10以上；CD16+/CD56+表型为90％以上；所述自然杀伤细胞具有抗肿瘤杀伤毒性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中以K562细胞系转染稳定表达
3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的表达载体，载体中含有病毒启动子和选择标记基因，可以得到在K562细胞膜上的3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122多肽，K562细胞经培养增殖后仍稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122；经培养后的K562细胞膜上具有表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的细胞，通过强酸，强碱和/或辐照、及通过高速离心收集K562细胞进行纯化收集。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，所述稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562细胞与来源于患者自体外周血的单个核细胞首先共培养5天，所述K562细胞与淋巴细胞的用量比例为K562细胞数：淋巴细胞数＝
1∶0.1-1∶10；更优选地，K562细胞数：淋巴细胞数＝1∶1-1∶5；
共培养5天后，将自然杀伤细胞用5mL移液管吸出至新培养瓶中，并补充10-20mL新鲜细胞培养基，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3天；继续补充20-40mL新鲜细胞培养基，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3天；然后自然杀伤细胞连续增殖培养到18-21天，使得NK细胞大量增殖；所述新鲜细胞培养基含50-2000活性单位/mL白介素2。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中来源30ml外周血单个核细胞诱导培养获得自然杀伤细胞，增殖倍数达2500倍以上，培养到21天自然杀伤
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细胞数达3×10以上。
5.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中培养获得自然杀伤细胞，高表达其特异标志物CD16+/CD56+，阳性率高于90％以上，而CD3+阳性率低于7％以下。
6.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中培养获得自然杀伤细胞，体内体外试验具有很强抗肿瘤杀伤毒性。
7.一种制备自体自然杀伤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(1)经强酸，强碱和/或辐照处理的权利要求1-6任一项所述的稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562细胞；
(2)白介素2；
(3)淋巴细胞培养基；
(4)组织消化液；
(5)淋巴细胞分离液；
(6)生理盐水；
(7)使用说明书；
其中，所述使用说明书包括权利要求1-6中任一项所述的方法。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562细胞，优选地，还包括强酸，强碱和/或辐照处理后含稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562滋养层细胞的培养板，所述培养板选自24孔细胞培养板、12孔细胞培养板或6孔细胞培养板。
9.一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法，其特征在于，
步骤一、转染稳定表达PDK1和CD122的K562细胞系的制备
以K562细胞系转录稳定表达PDK1和CD122的表达载体，载体中含有病毒启动子和选择标记基因；当外源表达载体进入宿主细胞后，激活启动子，培养K562细胞一段时间，即得到在细胞膜上的3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122多肽；经培养后的K562细胞膜上具有表达PDK1和CD122的细胞，通过强酸，强碱和/或辐照、及通过高速离心收集K562细胞进行纯化收集；
步骤二、自体自然杀伤细胞的制备
采集晚期乳腺癌患者和正常健康人30ml，加入等量1×PBS稀释，沿离心管管壁轻轻叠加于淋巴细胞分离液上，形成明显界面，室温下2000rpm离心20min，吸取界面层的PBMC，用
7
1×PBS洗涤两次；苔盘兰计数后，用CellGro SCGM调整单个核细胞浓度为1×10/ml；
取步骤一所述稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562细胞与自然杀伤细胞首先共培养5天，所述K562细胞与淋巴细胞的用量比例为K562细胞数：单个核细胞数＝1∶5；
共培养5天后，将自然杀伤细胞用5mL移液管吸出至新培养瓶中，并补充20mL新鲜细胞培养基，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3天；继续补充40mL新鲜细胞培养基，在
37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3天；然后自然杀伤细胞连续增殖培养到21天，使得细
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胞数达到3×10以上；其中，所述新鲜细胞培养基含1000活性单位/mL白介素2；
使用活细胞计数仪分别在第0天、6天、9天、12天、15天、18天和21天进行计数，分析NK细胞活率和增殖倍数；结果显示，随着体外培养天数增加，NK细胞数不断提高，到第21天
9 9
时乳腺癌患者NK细胞数达到3.34×10个，正常人为4.06×10 个；随着体外培养天数增加，NK细胞扩增倍数也不断提高，为乳腺癌患者NK细胞扩增倍数为2594.75倍，正常人扩增倍数为2629.59倍；两者在NK细胞计数和增殖倍数上均无明显差异，表明癌症患者来源NK细胞具有同样的增殖效果；
步骤三、自体NK细胞表型流式细胞检测
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取步骤二制备的乳腺癌患者和正常健康人来源第14天培养获得的1×10NK细胞，进行流式抗体染色检测分析；NK细胞一组分别为20μL鼠抗人CD16-FITC、20μL鼠抗人CD56-PE和20μL鼠抗人CD8-PerCP；另一组分别为20μL鼠抗人CD3-FITC、20μL鼠抗人CD25-PE和20μL鼠抗人CD4-PerCP；同型对照组为20μLmIgG1-FITC、20μLmIgG1-PE和
20μLmIgG1-PerCP；放置4℃冰箱染色30分钟后用PBS洗涤3次，然后在FACS Calibur仪器上机检测和分析；结果显示，乳腺癌患者NK细胞CD56和CD16阳性率为94.4％；正常人NK细胞CD56和CD16阳性率为93.4％；乳腺癌患者CD3阳性率仅为5.9％；正常人CD3阳性率仅为6.4％，表明两者体外培养的细胞主要为NK细胞，含T淋巴细胞数量很低。
10.权利要求1-9中任一项所述自然杀伤细胞的应用。

说明书全文

一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法，其中包括如下特征：来自于癌症患者外周血来源分离得到的单个核细胞，在使用3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122转染并稳定表达的K562细胞和白介素2作用下扩增激活，获得自然杀伤细胞；本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的自体自然杀伤细胞的试剂盒，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的多个疗程的免疫治疗。

背景技术

[0002] 自然杀伤细胞(Natural Killer cells，NK)数量和功能异常与肿瘤和持续性病毒感染的发生密切相关。目前NK细胞在体外加白介素2(interleukin-2，IL-2)培养扩增后，其抗肿瘤作用比LAK细胞强50-100倍，而且只需要小量的IL-2就可以发挥作用，并且因其对自身肿瘤靶细胞具有特异性，成为国内外肿瘤生物研究的热点，并在临床治疗中得到使用。

[0003] NK细胞主要表达CD16+、CD56+表型，治疗对黑色素瘤、肺癌、肾癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和白血病等肿瘤治疗有明显疗效。NK细胞数量和杀伤功能与疗效直接相关，治8
疗中存在的问题在于获得大量NK细胞有限和培养时间过长。NK细胞体外扩增至5×10平
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均需59天，扩增至5×10则平均需80天，NK在含IL-2的培养基中经过一段时间培养后出+ + +
现选择性扩增T淋巴细胞，CD3占80％以上，CD4 和CD8 占50％以上，NK细胞扩增低下，占不到10％左右。因而传统使用的小剂量白介素2激活生长倍数有限，端粒酶活性降低，培养时间过长引起了NK细胞杀伤功能低下。

[0004] 本发明提供了以3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122转染并稳定表达的K562细胞为滋养层细胞，在小剂量IL-2作用下大量扩增NK细胞，培养至21天细胞增殖倍数达到2500倍以上，NK细胞杀瘤活性在21天达到最佳，为患者临床治疗大大节约了时间，并发挥出最好的抗肿瘤作用，有助于提高临床疗效和延长患者生存期，而且可以大大降低细胞培养成本。

发明内容

[0005] 本发明针对现有技术增殖培养NK细胞的不足，特别是因NK细胞扩增到临床治疗需要的细胞数量而培养时间过长，含IL-2的培养基选择性扩增T淋巴细胞以及NK细胞占有比例很低，因而产生的杀瘤活性低下。本发明通过前期研究实验发现转染了3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3′-phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1)和CD122并稳定表达的K562细胞，作为滋养层细胞和低剂量IL-2作用下培养NK细胞，培养至21天细胞增9
殖倍数达到2500倍以上，NK细胞数达到3×10以上足以满足临床抗肿瘤的作用，保证癌症患者临床治疗疗效。

[0006] K562细胞转染了3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的表达载体，细胞膜上可稳定表达PDK1和CD122的多肽。PDK1为AGC蛋白激酶家族的主要调节器，研究发现PDK1是NK细胞早期发育关键分子，激活了白介素15表达升高，也活化了CD122分子表达提高，使得NK细胞能够在不受外界“致敏”的情况下自发杀死机体中异常的细胞。因而应用3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122转染并稳定表达的K562细胞可以作为人工抗原递呈细胞，可以促进NK细胞发育和大量增殖，抑制NK细胞中T淋巴细胞的增殖和产生，延长NK细胞端粒酶活性，可产生对肿瘤细胞最佳的杀伤活性。

[0007] 本发明涉及一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法，其特征在于，使用PDK1和CD122转染并稳定表达的K562细胞和白介素2，扩增激活自然杀伤细胞，使自然杀伤细胞得以大量增殖。

[0008] 本发明所述的K562细胞系转染稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的表达载体，载体中含有病毒启动子和选择标记基因，可以得到在K562细胞膜上的PDK1和CD122多肽，K562细胞经培养增殖后仍稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122。经培养后的K562细胞膜上具有表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的细胞，通过强酸，强碱和/或辐照、及通过高速离心收集K562细胞进行纯化收集。

[0009] 本发明所述方法中单个核细胞来源于癌症患者采集的外周血或骨髓等，经淋巴细胞分离液，连续密度梯度离心获得的。优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。

[0010] 本发明所述稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562细胞与自然杀伤细胞首先共培养5天，所述K562细胞与单个核细胞的用量比例为K562细胞数∶单个核细胞数＝1∶0.1-1∶10，更优选地，为K562细胞数∶单个核细胞数＝1∶1-1∶5。

[0011] 共培养5天后，将自然杀伤细胞用5mL移液管吸出至新培养瓶中，并补充10-20mL新鲜细胞培养基(含50-500活性单位/mL白介素2)，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3天；继续补充20-40mL新鲜细胞培养基(含50-500活性单位/mL白介素2)，在37℃、
5％CO2培养箱中继续培养2-3天；然后自然杀伤细胞连续增殖培养到18-21天，使得细胞
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数达到3×10以上。

[0012] 本发明所述方法中来源30ml外周血单个核细胞诱导培养获得自然杀伤细胞，增9
殖倍数达2500倍以上，培养到21天自然杀伤细胞数达3×10以上。

[0013] 本发明所述方法中培养获得自然杀伤细胞，高表达其特异标志物CD16+/CD56+，阳性率高于90％以上，而CD3+阳性率低于7％以下。

[0014] 本发明所述方法中培养获得自然杀伤细胞，体内体外试验具有很强抗肿瘤杀伤毒性。

[0015] 本发明使用的细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基或RPMI 1640培养基加入50-2000活性单位/mL白介素2和10％(体积比)自体血清或胎牛血清，优选地，细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基，如CellGro SCGM、AIM-V、X-VIVO和GT-T551等，含有1000活性单位/mL白介素2。

[0016] 本发明还提供了一种制备自体自然杀伤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

[0017] (1)经强酸，强碱和/或辐照处理的稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562细胞；

[0018] (2)白介素2；

[0019] (3)淋巴细胞培养基；

[0020] (4)组织消化液；

[0021] (5)淋巴细胞分离液；

[0022] (6)生理盐水；

[0023] (7)使用说明书；

[0024] 其中，所述使用说明书包括权利要求1-6所述的方法。

[0025] 所述稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562细胞，优选地，还包括强酸，强碱和/或辐照处理后含稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562滋养层细胞的培养板，如24孔细胞培养板、12孔细胞培养板和6孔细胞培养板等。

[0026] 本发明还提供了上述方法及其试剂盒制备NK细胞，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的多个疗程的免疫治疗。附图说明

[0027] 图1表示为实施例二体外培养的晚期乳腺癌患者和正常人来源NK细胞数变化曲线图；

[0028] 图2表示为实施例二体外培养的晚期乳腺癌患者和正常人来源NK细胞增殖倍数变化曲线图；

[0029] 图3表示为实施例二制备的晚期乳腺癌患者NK细胞流式细胞检测结果图；

[0030] 图4表示为实施例二制备的正常人NK细胞流式细胞检测结果图；

[0031] 图5表示为实施例二制备的晚期乳腺癌患者和正常人来源NK细胞对MCF-7的杀伤毒性曲线图；

[0032] 图6表示为实施例二制备的晚期乳腺癌患者和正常人来源NK细胞对HepG2的杀伤毒性曲线图；

[0033] 图7表示为荷乳腺癌MCF-7小鼠模型实施例二制备的NK细胞治疗完之后肿瘤大小变化曲线图。

具体实施方式

[0034] 本发明发现通过3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122转染并稳定表达的K562细胞可以作为人工抗原递呈细胞，可以促进NK细胞大量增殖，抑制NK细胞中T淋巴细胞的增殖和产生，延长NK细胞端粒酶活性，产生对肿瘤细胞最佳的杀伤活性。NK细胞培养至219
天细胞增殖倍数达到2500倍以上，NK细胞数达到3×10以上满足临床治疗需要，可用于多次抗肿瘤的临床应用。

[0035] 对本发明涉及的一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法进行具体说明。本发明涉及采用PDK1和CD122转染并稳定表达的K562细胞和白介素2，扩增激活自然杀伤细胞，使得NK细胞大量扩增，获得具有抗肿瘤作用的NK细胞。

[0036] 本发明涉及一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法，其特征在于，使用PDK1和CD122转染并稳定表达的K562细胞和白介素2，扩增激活自然杀伤细胞，使自然杀伤细胞得以大量增殖。

[0037] 本发明所述的K562细胞系转染稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的表达载体，载体中含有病毒启动子和选择标记基因，可以得到在K562细胞膜上的PDK1和CD122多肽，K562细胞经培养增殖后仍稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122。经培养后的K562细胞膜上具有表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的细胞，通过强酸，强碱和/或辐照、及通过高速离心收集K562细胞进行纯化收集。

[0038] 本发明所述方法中单个核细胞来源于癌症患者采集的外周血或骨髓等，经淋巴细胞分离液，连续密度梯度离心获得的。优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。

[0039] 本发明所述稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562细胞与自然杀伤细胞首先共培养5天，所述K562细胞与单个核细胞的用量比例为K562细胞数∶单个核细胞数＝1∶0.1-1∶10，更优选地，为K562细胞数∶单个核细胞数＝1∶1-1∶5。

[0040] 共培养5天后，将自然杀伤细胞用5mL移液管吸出至新培养瓶中，并补充10-20mL新鲜细胞培养基(含50-500活性单位/mL白介素2)，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3天；继续补充20-40mL新鲜细胞培养基(含50-500活性单位/mL白介素2)，在37℃、
5％CO2培养箱中继续培养2-3天；然后自然杀伤细胞连续增殖培养到18-21天。

[0041] 本发明所述方法中来源30ml外周血单个核细胞诱导培养获得自然杀伤细胞，增9
殖倍数达2500倍以上，培养到21天自然杀伤细胞数达3×10以上。

[0042] 诱导培养获得自然杀伤细胞，高表达其特异标志物CD16+/CD56+，阳性率高于90％以上，而CD3+阳性率低于7％以下；体内体外试验具有很强抗肿瘤杀伤毒性。

[0043] 本发明使用的细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基或RPMI 1640培养基加入50-2000活性单位/mL白介素2和10％(体积比)自体血清或胎牛血清，优选地，细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基，如CellGro SCGM、AIM-V、X-VIVO和GT-T551等，含有1000活性单位/mL白介素2。

[0044] 本发明还提供了一种制备自体自然杀伤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

[0045] (1)经强酸，强碱和/或辐照处理的稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562细胞；

[0046] (2)白介素2；

[0047] (3)淋巴细胞培养基；

[0048] (4)组织消化液；

[0049] (5)淋巴细胞分离液；

[0050] (6)生理盐水；

[0051] (7)使用说明书；

[0052] 其中，所述使用说明书包括权利要求1-6所述的方法。

[0053] 所述稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562细胞，优选地，还包括强酸，强碱和/或辐照处理后含稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562滋养层细胞的培养板，如24孔细胞培养板、12孔细胞培养板和6孔细胞培养板等。

[0054] 作为本发明NK细胞扩增培养中使用的细胞培养板、细胞培养皿、培养瓶、细胞培2 2
养袋，可例举，为75cm细胞培养瓶、175cm 细胞培养瓶、250mL细胞培养袋等细胞培养用器材(容器)，均可用于本发明，优选细胞培养袋。

[0055] 本发明的制造方法中对NK细胞进行冻存，对冻存液无特殊限制，但优选例如为50％小牛血清、40％细胞培养液和10％二甲基亚砜，其中细胞培养液更优选为NK细胞培养液。

[0056] 在培养基中可以添加血清或血浆进行培养。它们在培养基中的添加量不受特殊限制，如大于0容量％至20容量％，且可以根据不同的培养阶段而改变血清或血浆的用量，优选为5％(体积比)。例如，可以阶段性减少血清或血浆浓度来使用。另外，作为血清或血浆的来源，可以是自己(意味着与所培养的细胞来源相同)或非自己(意味着与所培养的细胞的来源不同)中的任一种，从安全性的观点出发，优选自己来源的血清或血浆。另外，也可以添加如人血清白蛋白之类经分离纯化的血清成分。

[0057] 本发明的自体NK细胞增殖的制备使用上述各种成分及培养基来实施。本发明中使用的培养培养条件也没有特殊限制，可以使用通常的细胞培养中使用的条件。例如，可在37℃、5％CO2等条件下培养。还可以实施如下等操作：间隔适当的时间添加新鲜培养基来稀释细胞培养液，或更换培养基，或更换细胞培养用器材等。

[0058] 本发明还提供NK细胞在临床应用中多次的抗肿瘤治疗，更好地在生物体内发挥抗肿瘤免疫应答，达到很好的治疗效果。此外，上述NK细胞还具有如下优点，多次NK细胞治疗将更好地引发NK细胞杀瘤活性，抑制调节性T淋巴细胞免疫抑制活性，产生高效、长效地抗肿瘤免疫效应，因此非常利于患者疗效的提高和生存期的延长。

[0059] 以下，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。

[0060] 实施例一

[0061] 转染稳定表达PDK1和CD122的K562细胞系的制备

[0062] 以K562细胞系转录稳定表达PDK1和CD122的表达载体，载体中含有病毒启动子和选择标记基因；当外源表达载体进入宿主细胞后，激活启动子，培养K562细胞一段时间，即可以得到在细胞膜上的3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122多肽；经培养后的K562细胞膜上具有表达PDK1和CD122的细胞，通过强酸，强碱和/或辐照、及通过高速离心收集K562细胞进行纯化收集。

[0063] 实施例二

[0064] 自体自然杀伤细胞的制备

[0065] 采集晚期乳腺癌患者和正常健康人30ml(与其签署知情同意书)，加入等量1×PBS稀释，沿离心管管壁轻轻叠加于淋巴细胞分离液上，形成明显界面，室温下2000rpm离心20min，吸取界面层的PBMC，用1×PBS(pH值为7.4)洗涤两次。苔盘兰计数后，用
7
CellGro SCGM调整单个核细胞浓度为1×10/ml。

[0066] 稳定表达3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1和CD122的K562细胞与自然杀伤细胞首先共培养5天，所述K562细胞与淋巴细胞的用量比例为K562细胞数∶单个核细胞数＝1∶5。

[0067] 共培养5天后，将自然杀伤细胞用5mL移液管吸出至新培养瓶中，并补充20mL新鲜细胞培养基(含1000活性单位/mL白介素2)，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养2-3天；继续补充40mL新鲜细胞培养基(含1000活性单位/mL白介素2)，在37℃、5％CO2培9
养箱中继续培养2-3天；然后自然杀伤细胞连续增殖培养到21天，使得细胞数达到1×10以上。

[0068] 使用活细胞计数仪(美国Millipore公司)分别在第0天、6天、9天、12天、15天、18天和21天进行计数，分析NK细胞活率和增殖倍数。

[0069] 图1中随着体外培养天数增加，NK细胞数不断提高，到第21天时乳腺癌患者NK细9 9
胞数达到3.34×10个，正常人为4.06×10 个；图2随着体外培养天数增加，NK细胞扩增倍数也不断提高，为乳腺癌患者NK细胞扩增倍数为2594.75倍，正常人扩增倍数为2629.59倍；两者在NK细胞计数和增殖倍数上均无明显差异，表明癌症患者来源NK细胞具有同样的增殖效果。BC-NK为乳腺癌患者来源NK细胞，NB-NK为正常健康人来源NK细胞。

[0070] 实施例三

[0071] 自体NK细胞表型流式细胞检测

[0072] 取实施例二制备的乳腺癌患者和正常健康人来源第14天培养获得的1×106NK细胞，进行流式抗体染色检测分析。NK细胞一组分别为20μL鼠抗人CD16-FITC、20μL鼠抗人CD56-PE和20μL鼠抗人CD8-PerCP；另一组分别为20μL鼠抗人CD3-FITC、20μL鼠抗人CD25-PE和20μL鼠抗人CD4-PerCP；同型对照组为20μL mIgG1-FITC、20μL mIgG1-PE和20μL mIgG1-PerCP；放置4℃冰箱染色30分钟后用PBS洗涤3次，然后在FACS Calibur仪器(美国BD公司)上机检测和分析。

[0073] 图3实施例二制备的乳腺癌患者NK细胞流式细胞检测。乳腺癌患者NK细胞CD56和CD16表型，CD16CD56阳性率为94.4％；含有的T淋巴细胞极少，CD3阳性率仅为5.9％；图4实施例二制备的正常人NK细胞流式细胞检测。正常人NK细胞CD56和CD16表型，CD16/CD56阳性率为93.4％；T淋巴细胞CD3阳性率仅为6.4％，表明两者体外培养的细胞主要为NK细胞，含T淋巴细胞数量很低。

[0074] 实施例四

[0075] NK细胞体外杀瘤试验

[0076] 分别以乳腺癌细胞系MCF-7和肝癌细胞系HepG2为靶细胞，以实施例二中制备的NK细胞作为效应细胞，按效靶比40∶1、20∶1、10∶1、5∶1和2.5∶1分别加入96孔培养板中，然后置于37℃、5％CO2条件下培养4h，均设3个复孔。采用LDH细胞毒实验法测定NK活性：吸取上清液50μL，置于96孔板中，加入LDH基液50μL，室温避光30min，加入50μL终止液终止反应，490nm 波长处测吸光度(OD)值。按下列公式分别计算MCF-7和HepG2细胞的杀伤率∶杀伤率＝(实验组OD值-效应细胞自然释放组OD值-靶细胞自然释放组OD值)/(靶细胞最大释放组OD值-靶细胞自然释放组OD值)×100％。

[0077] 图5为晚期乳腺癌患者和正常人来源NK细胞对MCF-7的杀伤活性，随着效靶比提高，细胞毒性活性也不断提高，晚期乳腺癌患者NK细胞抗MCF-7杀伤毒性略高于正常人的，但两者无明显差异。图6为晚期乳腺癌患者和正常人来源NK细胞对HepG2的杀伤活性，正常人NK细胞抗MCF-7杀伤毒性略高于晚期乳腺癌患者的，但两者之间抑瘤效果也无明显差异，揭示了乳腺癌患者来源的NK细胞体外抗肿瘤作用于正常人的相似。

[0078] 实施例五

[0079] NK细胞体内杀瘤实验中的作用

[0080] 18只8周SCID裸鼠腹部侧翼皮下注射5×106乳腺癌细胞系MCF-7，饲养7天后，随机分为A、B和C 3组，每组6只：A组为实施例二制备的乳腺癌患者来源NK细胞治疗组；B组为实施例二制备的正常人来源NK细胞治疗组；C组为生理盐水安慰剂组。A组在乳腺
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癌患者来源NK细胞培养到第14天和第16天尾静脉注射2×10细胞/克，B组在正常人患
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者来源NK细胞培养到第14天和第16天尾静脉注射2×10细胞/克，C组与A和B治疗组同时间，尾静脉注射同体积的生理盐水，各1mL。治疗后分别于7d、14d、21d、28d和35d拉颈处死，取荷MCF-7小鼠模型肿瘤组织，计算鼠模型荷瘤大小。

[0081] 图7荷乳腺癌MCF-7小鼠模型NK细胞治疗完之后肿瘤大小变化曲线，生理盐水组C和BC-NK治疗组A与NB-NK治疗组B相比，治疗组A与治疗组B中乳腺癌肿瘤大小大大缩少，但两者NK细胞的杀伤活性无差异，表明乳腺癌患者来源NK细胞引发了与正常人NK细胞同样的体内杀瘤活性。

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