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一种抗肿瘤T细胞、其制备方法和抗肿瘤药物

阅读：371发布：2020-05-13

专利汇可以提供一种抗肿瘤T细胞、其制备方法和抗肿瘤药物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种体外通过DC(树突状细胞，即抗原提呈细胞)制备抗肿瘤 T细胞，所述抗肿瘤T细胞是以肿瘤总RNA负载的DC扩增和富集抗肿瘤T细胞。本发明还提供所述抗肿瘤T细胞的制备方法，以及以所述的抗肿瘤T细胞为活性成分的抗肿瘤药物或接种疫苗。本发明使用肿瘤总RNA负载的DC作为平台体外扩增特异性的抗肿瘤T细胞，实现体外利用少量肿瘤总RNA扩增至足够的量从而实现临床应用，并评价其在IC(颅内)荷瘤模型的体内抗肿瘤效果，包括DC的成熟状态和细胞因子组合如何调节抗肿瘤T细胞分化和它们在临床前实验模型中的协同抗肿瘤效果。，下面是一种抗肿瘤T细胞、其制备方法和抗肿瘤药物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述抗肿瘤T细胞是以肿瘤总RNA负载的树突状细胞DC特异性扩增和富集抗肿瘤T细胞。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述抗肿瘤T细胞中还包括细胞因子。
3.根据权利要求2所述的抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述细胞因子选自IL-4、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF、CD40L中的任意一种或多种组合。
4.根据权利要求2所述的抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述细胞因子选自IL-7、IL-12、IL-21的组合。
5.如权利要求1所述抗肿瘤T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、肿瘤总RNA的制备：来自经细胞培养的肿瘤细胞经体外合成为肿瘤总RNA；
步骤2、成熟肿瘤总RNA-DC的制备：将步骤1得到的肿瘤总RNA与分离的树突细胞DC通过电转导的方式导入DC内，随后在培养基中培养过夜，得到成熟的肿瘤总RNA-DC；
步骤3、将步骤2得到的成熟肿瘤总RNA-DC与T细胞共培养，得到如权利要求1所述的抗肿瘤T细胞。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1的肿瘤细胞来自人类或鼠的肿瘤细胞。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2的树突细胞来自人类或鼠的髓细胞或淋巴细胞。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2在培养基中加入CD40L或脂多糖LPS来实现DC的成熟。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3的共培养在细胞因子的存在下进行。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述细胞因子选自IL-4、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF、CD40L中的任意一种或多种组合。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述细胞因子选自IL-7、IL-12、IL-21的组合。
12.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3的T细胞来自人类或鼠的脾脏。
13.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3的T细胞为抗原应答细胞，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、效应T细胞、记忆T细胞。
14.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3的成熟肿瘤总RNA-DC与T细胞的数量比为1：(15-25)。
15.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物以权利要求1所述的抗肿瘤T细胞为活性成分。
16.根据权利要求15所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物为药剂或接种疫苗。

说明书全文

一种抗肿瘤T细胞、其制备方法和抗肿瘤药物

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抗肿瘤T细胞及其制备方法，以及以该抗肿瘤T细胞为活性成分的抗肿瘤药物或接种疫苗。

背景技术

[0002] 直接使用体外扩增抗肿瘤T细胞基于两个事实：1)有恶性脑肿瘤的患者具有很强的系统性免疫抑制，严重地阻碍了接种抗肿瘤疫苗方法的效果；2)与接种疫苗方法相比，使用包括肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrated lymphocytes,TIL)或基因工程外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBL)在内的体外扩增抗肿瘤T细胞的过继细胞转移(adoptive cell transfer,ACT)能更有力地根除黑素瘤患者中残存的肿瘤细胞(Dudley ME,Yang JC,Sherry R,Hughes MS,Royal R,et al.(2008)Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma:evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens.J Clin Oncol 26:5233-5239；Morgan RA,Dudley ME,Wunderlich JR,Hughes MS,Yang JC,et al.(2006)Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes.Science 314:126-129)，并彻底移除血液中及转移的肿瘤细胞(Porter DL,Levine BL,Kalos M,Bagg A,June CH(2011)Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.The New England journal of medicine 365:725-733)。然而，这两种体外产生抗肿瘤T细胞的方法不可避免地面对某些明显的限制。经TCR或CAR的基因工程修饰的T细胞只能靶向杀伤一种肿瘤抗原，而这种单一的靶向杀伤最终会由于肿瘤抗原的改变带来的治疗失败。而TIL代表多功能抗肿瘤T细胞，它的成功应用仅限于黑素色瘤。由于切除的肿瘤样本的尺寸很小，可以获得的TIL有限，所以没有应用TIL治疗恶性脑肿瘤的临床数据。有趣的是，在最近报道的519例恶性胶质瘤中患者发现，CD8T细胞的浸润与患者的长期存活有关(Yang I,Tihan T,Han SJ,Wrensch MR,Wiencke J,et al.(2010)CD8+T-cell infiltrate in newly diagnosed glioblastoma is associated with long-term survival.J Clin Neurosci 17:1381-1385)。由于实际临床治疗中存在着在脑肿瘤中获取TIL的困难，有必要寻求其它的方法获取类似TIL的抗肿瘤T细胞。

发明内容

[0003] 本发明为解决现有技术中的上述问题而提出的。本发明使用ttRNA(肿瘤总RNA)负载的树突细胞(dendritic cells,DC)作为平台体外扩增类似TIL的多靶点抗肿瘤T细胞，实现体外扩增少量ttRNA至足够的量而用于临床应用，并评价其在颅内(IC)荷瘤小鼠模型中的协同抗肿瘤效果。

[0004] 本发明提供了一种抗肿瘤T细胞及其制备方法。

[0005] 本发明还提供了一种以上述抗肿瘤T细胞为活性成分的抗肿瘤药物。

[0006] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0007] 本发明的第一个方面是提供一种抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述抗肿瘤T细胞是以肿瘤总RNA负载的树突状细胞DC特异性扩增和富集抗肿瘤T细胞。

[0008] 在上述抗肿瘤T细胞中，优选地，所述抗肿瘤T细胞中还包括细胞因子，所述细胞因子优选自但不限于IL-4、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF、CD40L中的任意一种或多种组合，更优选为IL-7、IL-12、IL-21的组合。

[0009] 在上述抗肿瘤T细胞中，优选地，所述树突细胞来自人类或鼠的髓细胞或淋巴细胞。

[0010] 本发明的第二个方面是提供如上述抗肿瘤T细胞的制备方法，包括如下步骤：

[0011] 步骤1、肿瘤总RNA的制备：来自经细胞培养的肿瘤细胞经体外合成为肿瘤总RNA；

[0012] 步骤2、成熟肿瘤总RNA-DC的制备：将步骤1得到的肿瘤总RNA与分离的树突细胞DC通过电转导的方式导入DC内，随后在培养基中培养过夜，得到成熟的肿瘤总RNA-DC；

[0013] 步骤3、将步骤2得到的成熟肿瘤总RNA-DC与T细胞共培养，得到如权利要求1所述的抗肿瘤T细胞。

[0014] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤1的肿瘤细胞系来自人类或鼠的肿瘤细胞，更优选自但不限于具有高度侵袭力的鼠的星形细胞瘤细胞系KR158和黑色素瘤细胞系B16F10OVA。

[0015] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤2的树突细胞来自人类或鼠的髓细胞或淋巴细胞。

[0016] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤2在培养基中加入CD40L或脂多糖LPS来实现DC的成熟。

[0017] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤3的共培养在细胞因子的存在下进行；更优选地，所述细胞因子选自IL-4、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF、CD40L中的任意一种或多种组合；最优选地，所述细胞因子选自IL-7、IL-12、IL-21的组合。

[0018] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤3的T细胞来自人类或鼠的脾脏，更优选地来自人类或鼠的脾脏。

[0019] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤3的T细胞为抗原应答细胞，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、效应T细胞、记忆T细胞。

[0020] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤3的成熟ttRNA-DC与T细胞的数量比为1：(15-25)，例如1：20。

[0021] 本发明的第三个方面是提供一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物以权利要求1所述的抗肿瘤T细胞为活性成分。

[0022] 在上述抗肿瘤药物中，优选地，所述抗肿瘤药物为药剂或接种疫苗。

[0023] 在上述抗肿瘤药物中，优选地，所述肿瘤包括例如脑癌的肿瘤。

[0024] 负载有总肿瘤抗原的DC提供所有需要以满足体外富集和扩增抗肿瘤T细胞。DC是强有力的刺激细胞，不断地监督宿主的抗原环境并特异性地活化T细胞和B细胞应答(Steinman RM(2001)Dendritic cells and the control of immunity:enhancing the efficiency of antigen presentation.The Mount Sinai journal of medicine,New York 68:160-166；Banchereau J,Steinman RM(1998)Dendritic cells and the control of immunity.Nature 392:245-252)。使用加载有多肽或肿瘤抗原提取物的DC的免疫疗法已经证明在脑肿瘤具有强有力的抗肿瘤活性(Iwami K,Shimato S,Ohno M,Okada H,Nakahara N,et al.(2012)Peptide-pulsed dendritic cell vaccination targeting interleukin-13receptor alpha2chain in recurrent malignant glioma patients with HLA-A*24/A*02allele.Cytotherapy 14:733-742；Yu JS,Wheeler CJ,Zeltzer PM,Ying H,Finger DN,et al.(2001)Vaccination of malignant glioma patients with peptide-pulsed dendritic cells elicits systemic cytotoxicity and intracranial T-cell infiltration.Cancer research 61:842-847；Liau LM,Black KL,Prins RM,Sykes SN,DiPatre PL,et al.(1999)Treatment of intracranial gliomas with bone marrow-derived dendritic cells pulsed with tumor antigens.Journal of neurosurgery 90:1115-1124；Labeur MS,Roters B,Pers B,Mehling A,Luger TA,et al.(1999)Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.Journal of immunology162:168-175)。有趣的是，发明人发现，在协同作用的肿瘤荷瘤模型中，负载肿瘤裂解产物的DC做为接种疫苗已显示出强烈的保护和治疗作用，并且发现DC的成熟状态直接关系到抗肿瘤免疫的效果；数据建议临床使用成熟的、而不是不成熟的肿瘤抗原负载DC作为有效的肿瘤接种疫苗。由于代表以RNA形式的肿瘤细胞的总抗原的ttRNA容易使用，本发明提供了一个创新方法使用ttRNA-DC作为主要平台体外产生多功能抗肿瘤T细胞。在本发明中，代替肿瘤裂解产物作为肿瘤抗原的来源，基于切除的来自脑肿瘤的肿瘤样本很小而不足以产生肿瘤裂解细胞这个事实，所以发明人使用ttRNA负载DC。而且，发明人已经建立标准的操作流程(SOP)实现体外扩增少量ttRNA而达到足够用于临床应用的方案。因此，在本发明中，基于ttRNA-DC作为治疗接种疫苗，发明人提高它的治疗潜力，直接体外产生抗肿瘤T细胞用于创新的肿瘤免疫治疗。

[0025] 为使用过继细胞疗法(ACT)用于癌症治疗，一个实际考量是T细胞在体外培养过程中的逐步终末分化，该分化产生强的体外效应抗肿瘤活性，但却相反地大大地降低了体内的抗肿瘤效果(Gattinoni L,Klebanoff CA,Palmer DC,Wrzesinski C,Kerstann K,et al.(2005)Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.The Journal of clinical investigation 115: 1616-1626)。T细胞的分化状态可以直接被下列因素调整：1)培养的过程；2)药物的加入；以及3)体内使用组合细胞因子 (Gattinoni L,Klebanoff CA,Palmer DC,Wrzesinski C,Kerstann K,et al.(2005)Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+T cells.The Journal of clinical investigation 115:1616-1626；Gattinoni L,Klebanoff CA,Restifo NP(2009)Pharmacologic induction of CD8+T cell memory:better living through chemistry.Science translational medicine；Hinrichs CS,Spolski R,Paulos CM,Gattinoni L,Kerstann KW,et al.(2008)IL-2and IL-21confer opposing differentiation programs to CD8+T cells for adoptive immunotherapy.Blood 111:5326-5333；Klebanoff CA,Gattinoni L,Torabi-Parizi P,Kerstann K,Cardones AR,et al.(2005)Central memory self/tumor-reactive CD8+T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102:9571-9576)。共享γc链受体的细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21，在体内免疫应答过程中起到关键作用，并有助于形成长期T细胞记忆。目前，一些临床的ACT流程使用IL-2用于抗肿瘤T细胞的体外扩增，尽管IL-2大量地扩增并活化具有免疫抑制的CD4+CD25+FoxP3+TRegs。
相比之下，IL-7直接抑制TRegs功能并通过处于自发的和记忆的TRegs上的高亲和IL-7R发出信号来释放对T细胞的自发控制。除了共享γc链受体的细胞因子外，IL-12是另一个重要的细胞因子，有助于T细胞分化和记忆形成，而且可以选择性地提高CD8+CD62Lhigh细胞的存活，该类细胞具有超强的抗肿瘤活性。另外，与IL-2相比，IL-7和IL-21能够降低效应T细胞的终末分化并且有助于针对肿瘤反应的CD8+T细胞的富集。目前，在源自ttRNA-DC-T系统的抗肿瘤T细胞上使用不同的细胞因子或它们的组合还没有被系统地研究，属于一个崭新的领域。

[0026] 使用ACT治疗脑肿瘤的一个优势在于T细胞可以通过阻止体液免疫成分进入脑部的血脑屏障(Hong JJ,Rosenberg SA,Dudley ME,Yang JC,White DE,et al.(2010)Successful treatment of melanoma brain metastases with adoptive cell therapy.Clinical cancer research:an official journal of the American Association for Cancer Research 16:4892-4898；Blankenhorn EP,Stranford SA,Smith PD,Hickey WF(1991)Genetic differences in the T cell receptor alleles of LEW rats and their encephalomyelitis-resistant derivative,LER,and their impact on the inheritance of EAE resistance.European journal of immunology 21:2033-2041)。因此，在本发明中，发明人建立创新方法，使用ttRNA-DC体外产生抗肿瘤T细胞，这些方法包括DC的成熟状态和细胞因子组合如何调节抗肿瘤T细胞分化和评估它们在临床前IC肿瘤模型中的抗肿瘤效果。附图说明

[0027] 图1为体外产生的小鼠DC的表型和功能。

[0028] A.成熟小鼠DC表面标记物的高度表达。根据标准方法制备小鼠DC。在第7天，在DC的培养基中添加CD40L(1μg/ml)或添加LPS(0.5μg/ml)过夜，促进DC分化成熟。使用一组抗体通过流式细胞仪分析表型。上栏：在柱状图中显示来自一个代表性实验的DC表面标记物的表达，以及来自三种不同实验的DC的数据用如下所述的归纳图谱：虚线代表DC是来自IL-4/GM-CSF培养液组；半实线代表DC是来自CD40L的加入；实线代表DC来自脂多糖(LPS)的加入组。下栏：代表来自5个独立实验的表面标记物的平均荧光强度(MFI)的平均值±标准偏差。星号表明与来自IL-4/GM-CSF组的DC相比较，p<0.001。

[0029] B.成熟DC自发地释放高水平细胞因子。在加入CD40L或LPS后，以每孔2*106个DC铺放在24孔板中，过夜，收集上清，并通过杜克大学核心实验室的试验平台完成的用小鼠10-Plex kit(Invitrogen公司)检测细胞因子。代表5个独立实验的数据作为平均值±标准偏差标绘。星号表明与来自IL-4/GM-CSF条件的DC相比较，p<0.001。

[0030] 图2为成熟ttRNA-DC调节平台的接种疫苗可以促进T细胞增殖。

[0031] A.促进体外培养的T细胞的增殖能力。用KR158-ttRNA(ttRNA-DC)将用上述条件制备的DC电穿孔并用于皮下(ID)接种疫苗。一周后，获取来自脾脏的T细胞并用羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)标记，单独培养或在IL-2存在下培养7天。分析CD3群体，来自每组1只小鼠的代表数据以CD3为y轴、以CFSE 为x轴标绘。上栏：T细胞在没有加入细胞因子的情况下培养；下栏：T细胞用IL-2培养。

[0032] B.成熟ttRNA-DC促进CD8T细胞的增殖。标绘了来自每组3只小鼠的代表平均值±标准偏差的数据，星号表明与来自IL-4/GM-CSF条件的DC相比较，p<0.001。

[0033] 图3为成熟ttRNA-DC加上细胞因子-cocktail产生具有低分化表型的T细胞。

[0034] A.来自每组1只代表性小鼠的表型。如图2所述，来自不同ttRNA-DC接种疫苗的小鼠的T细胞进一步用对应的ttRNA-DC体外扩增6天，T细胞表型通过流式细胞仪使用一组荧光标记抗体分析。ttRNA-DC的使用被标记在每张图片的顶部，并且培养是在IL-2的存在下进行。

[0035] B.不同类型的ttRNA-DC产生具有类似表型的T细胞。分析限于CD8群体，反映CD44高CD62L低(Tem)、CD44高CD62L高(Tcm)和CD44低CD62L高(Tn)的子集通过T细胞标记物CD44和CD62L来确定。包括来自每组3只小鼠的CD8、Tem和Tcm的每个子集的百分比作为平均值±标准偏差标绘。

[0036] C.来自1只小鼠的T细胞的代表性表型。在IL-2或细胞因子-cocktail存在下使用LPS-DC体外扩增6天后，来自1只代表性小鼠的表型被标绘。IL-2或细胞因子-cocktail的使用被标记在每张图片的顶部。

[0037] D.ttRNA-DC加上细胞因子-cocktail导致低分化的表型。基于如在C图所述的LPS-DC，反映来自每组5只小鼠的CD8、Tem、Tcm和Tn的百分比做为平均值±标准偏差标绘。星号表明与IL-2组相比较，p<0.001。

[0038] 图4为LPS-DC扩增的抗肿瘤T细胞加上细胞因子-cocktail导致荷瘤小鼠存活时间延长。

[0039] A.DC扩增的T细胞特定地识别抗原相关靶标。基于LPS-DC，不同类型的RNA-DC扩增T细胞被用作效应细胞，抗原相关靶标是来自RNA-DC作为替代靶标，或来自KR158肿瘤系。除了直接使用KR158肿瘤系，对照靶标为ctrl-DC或用OVA和KR158ttRNA；用这些RNA-DC扩增的T细胞分别命名为ctrl-T、OVA-T和KR158-T。细胞因子使用的浓度如下所5
述。扩增6-7天后，T细胞(每孔2.5*10个)与靶标以比例10:1在圆底96-孔板中共培养，IFNγ水平通过ELISA 试剂盒检测。数据从一式三孔作为平均值±标准偏差标绘。

[0040] B.LPS-DC显示出优越的抗肿瘤活性。雌性C57bl/6小鼠(每组7只小鼠)使用KR158细胞被植入IC肿瘤5天，ACT前1天接受5Gy的全身放疗。在第0天，在ttRNA-DC6
接种疫苗后静脉注射(IV)1*10个从不同ttRNA-DC并在细胞因子-cocktail存在下扩增的T细胞。ACT后，每周通过腹腔(IP)注射两次额外的ttRNA-DC接种疫苗。表明使用不同DC加上细胞因子-cocktail的各组被标记在图的右边。

[0041] C.LPS-DC扩增的抗肿瘤T细胞在IL-2的培养条件下不能延长存活时间。小鼠(每组7只小鼠)被植入IC肿瘤，表明仅使用DC或结合使用不同类型T细胞的各组被标记在图的右边。

[0042] D.LPS-DC加上细胞因子-cocktail表现出优越的抗肿瘤活性。简言之，如B和C实验，并在这些IC荷瘤小鼠模型中检测细胞因子或它们的组合使用。表明结合使用DC和不同培养的T细胞的各组被标记在图的右边。DC+T w/o DC enrichment：T细胞使用细胞因子-cocktail培养但没有加入LPS-DC的扩增；DC+IL-7/IL-21+IL-12T或IL-15T：使用LPS-DC、IL-7和IL-21扩增的T细胞先培养3天，补充IL-12或IL-15用于剩余时间段的培养。除IL-2补充至30IU/ml，其它细胞因子的浓度为20ng/ml。星号表示p<0.001。

[0043] 图5为细胞因子-cocktail培养提高了CD62L阳性子集的百分比，但没有提高OVAtetra+T细胞的百分比。

[0044] A.用OVA-RNA电穿孔的LPS-DC被称为OVA RNA-DC，来自WT或OT-1小鼠的1:1混合的脾脏T细胞与OVA RNA-DC以T细胞与DC比例为10:1共培养。在不同细胞因子或它们的组合的存在下体外培养6天后，使用流式细胞仪分析OVA Tetra+T细胞的百分比和表型。不同细胞因子或它们的组合标记在每张图片的顶部；线上面的细胞因子说明使用细胞因子的前3天，线下面的细胞因子表明在最后3天使用的细胞因子。

[0045] B.细胞因子的组合使用产生更高百分比的OVA Tetra+CD8+CD62L+T细胞。图中数值是基于流式细胞仪分析的来自每组3只小鼠的Tetra+CD8+T细胞的表型，并作为平均值±标准偏差标绘。星号表明与IL-2组相比较，p<0.001。

[0046] 图6为细胞因子体外扩增T细胞导致荷瘤小鼠的长期存活。

[0047] A.使用细胞因子扩增的T细胞的ACT导致存活延长。雌性C57bl/6小鼠(每组7只小鼠)使用B16F10OVA细胞植入IC肿瘤5天，ACT前1天接受5Gy全身放疗。来自WT小鼠和OT-1小鼠的1:1混合的脾脏T细胞使用OVA RNA-DC在IL-2或细胞因子-cocktail
6
存在下扩增；6天后，在OVA RNA-DC腹腔(IP)接种疫苗后静脉注射(IV)10*10个T细胞。
表明结合使用DC和T细胞的各组说明见右边标识。星号表示p<0.001。

[0048] B.OVA抗原特定CD8T细胞的强大扩增。来自WT小鼠和OT-1小鼠的1:1混合的脾脏T细胞在第0天使用CD8和OVA四聚体的标记物分析，并使用OVA RNA-DC在IL-2或细胞因子-cocktail存在下扩增6天。一部分CD8+Tetra+T细胞流式分析后标记在每个图片中。

[0049] C.OVA RNA-DC体外扩增后的CD8+OVA Tetra+T细胞的基因表达图谱。从分选的CD8+OVA Tetra+T细胞提取总RNA，并使用小鼠Affymetrix GeneChip(鼠430A 2.0阵列)分析基因表达图谱。上栏：基于由Partek Genomics Suit 6.6 软件分析的基因表达水平，代表601条基因、来自不同培养的T细胞的具有大于2倍变化的散点比标绘。下栏：一组代表性的基因被标绘在柱状图中。被选择的基因概括了它们在T细胞活性、细胞因子网络中的作用和细胞因子与受体间的相互作用(参见图7、8、9)。

[0050] 图7为变化的基因表达图谱与T细胞活性的相关性。如在图6中所述，在图表中用黄星表示反映大于2倍变化的一组基因，以概括它们在T细胞活性中的作用。本分析是基于网站分析(http://david.abcc.ncifcrf.gov)后的修改，T细胞活性路径信息由BIOCARTA软件产生。

[0051] 图8为变化的基因表达图谱细胞因子网络的相关分析。该图表由BIOCARTA软件产生，来自2倍截止列表的不同基因用箭头表示。

[0052] 图9为不同基因表达图谱与细胞因子-cocktail受体的相互作用。该图表由KEGG产生，来自2倍截止列表的不同基因用箭头表示。

具体实施方式

[0053] 本发明的第一个方面是提供一种抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述抗肿瘤T细胞是以肿瘤总RNA负载的树突状细胞DC特异性扩增和富集抗肿瘤T细胞。

[0054] 在上述抗肿瘤T细胞中，优选地，所述抗肿瘤T细胞中还包括细胞因子，所述细胞因子优选自但不限于IL-4、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF、CD40L中的任意一种或多种组合，更优选为IL-7、IL-12、IL-21的组合。

[0055] 在上述抗肿瘤T细胞中，优选地，所述树突细胞来自人类或鼠的髓细胞或淋巴细胞。

[0056] 本发明的第二个方面是提供如上述抗肿瘤T细胞的制备方法，包括如下步骤：

[0057] 步骤1、肿瘤总RNA的制备：来自经细胞培养的肿瘤细胞经体外合成为肿瘤总RNA；

[0058] 步骤2、成熟肿瘤总RNA-DC的制备：将步骤1得到的肿瘤总RNA与分离的树突细胞DC通过电转导的方式导入DC内，随后在培养基中培养过夜，得到成熟的肿瘤总RNA-DC；

[0059] 步骤3、将步骤2得到的成熟肿瘤总RNA-DC与T细胞共培养，得到如权利要求1所述的抗肿瘤T细胞。

[0060] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤1的肿瘤细胞系来自人类或鼠的肿瘤细胞，更优选自但不限于具有高度侵袭力的鼠的星形细胞瘤细胞系KR158和黑色素瘤细胞系B16F10OVA。

[0061] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤2的树突细胞来自人类或鼠的髓细胞或淋巴细胞。

[0062] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤2在培养基中加入CD40L或脂多糖LPS来实现DC的成熟。

[0063] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤3的共培养在细胞因子的存在下进行；更优选地，所述细胞因子选自IL-4、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF、CD40L中的任意一种或多种组合；最优选地，所述细胞因子选自IL-7、IL-12、IL-21的组合。

[0064] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤3的T细胞来自人类或鼠的脾脏，更优选地来自人类或鼠的脾脏。

[0065] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤3的T细胞为抗原应答细胞，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、效应T细胞、记忆T细胞。

[0066] 在上述制备方法中，优选地，所述步骤3的成熟ttRNA-DC与T细胞的数量比为1：(15-25)，例如1：20。

[0067] 本发明的第三个方面是提供一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物以权利要求1所述的抗肿瘤T细胞为活性成分。

[0068] 在上述抗肿瘤药物中，优选地，所述抗肿瘤药物为药剂或接种疫苗。

[0069] 在上述抗肿瘤药物中，优选地，所述肿瘤包括例如脑癌的肿瘤。

[0070] 下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

[0071] 实施例

[0072] 一、材料和方法：

[0073] 1、从小鼠肿瘤细胞系的细胞培养和ttRNA的制备：

[0074] 鼠细胞因子IL-4、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、GM-CSF和CD40L购自PEPROTECH公司(洛杉矶，新泽西)，以及IL-2(Aldesleukin)购自PROLEUKIN公司(圣地亚哥，加尼福尼亚)。将小鼠T细胞培养在RPMI中，其中包括补充有100U/ml的青霉素/链霉素的5％FBS、1mM的L-谷氨酰胺、55uMβ-ME、1mM丙酮酸钠、0.1mM NEAA、10mM HEPES(Invitrogen公司)。本实施例优选具有高度侵袭力的小鼠星形细胞瘤模型和黑素瘤IC肿瘤模型，即来自-/- -/-NF1 :p53 C57BL/6-鼠中的星形细胞瘤细胞系KR158，以及来自在含10％FBS的DMEM中培养的小鼠黑色素肿瘤细胞系B16F10OVA。所有的细胞在5％CO2加湿培养箱中在37℃下培养。脂多糖(LPS)购自Sigma公司(圣路易斯，密苏里州)。来自KR158、B16F10OVA细胞系的肿瘤总RNA(total tumor RNA,ttRNA)通过使用RNeasy Maxi试剂盒(Qiagen公司)按照产品手册制备。OVA RNA通过使用T7mMESSAGE mMACHINE RNA试剂盒(Ambion公司)在体外合成。ttRNA的完整性和质量通过使用1％琼脂糖凝胶电泳进行评价，并通过NanaDrop在260nm 波长处定量。

[0075] 2、鼠的树突状细胞DC的制备：

[0076] 产生小鼠树突状细胞DC的程序基于公开的实验流程并在杜克大学脑肿瘤免疫治疗中心进行了修改(Inaba K,Inaba M,Romani N,Aya H,Deguchi M,et al.(1992)Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.The Journal of experimental medicine 176:1693-1702)。本实施例优选来自两个后脚包括胫骨、股骨和胸骨的骨髓细胞按照标准无菌程序加工并提取。汇集这些骨髓细胞并通过70μm细胞过滤器(BD Biosciences公司)过滤后，将收获的每5只小鼠的细胞以500g在室温下离心5min，并再悬浮于3ml氯化铵中，接着在室温下孵育3-4分钟。对于红细胞(RBC)的细胞裂解通过加入包括10％FBS的预冷的30ml RPMI被停止。然后将这些细胞再次通过70μm细胞过滤器过滤、离心，并再悬浮在包含5％FBS、GM-CSF和IL-4(20ng/ml)(Peprotech公司)
5
的RPMI中，其它补充剂如上所述。将细胞铺放在以每孔3*10的6孔板中。在第3天，用吸管辅助器以循环的方式缓慢移去培养基，加入如上所述的新鲜的培养基。在第7天，用吸管
7
辅助器迅速地收获细胞。离心后，将这些细胞洗涤并以2.5*10/ml再悬浮于OptiMEM中，分
200μl小份转移到盛有25μg KR158ttRNA或10μg OVA RNA的比色杯中，并放入Electro Square Porator ECM 830(BTX Harvard Apparatus公司)中，然后在300V脉冲500微秒
6
(Mode,LV)。收集细胞并再次铺放在以每孔5*10的6孔板的如上所述的RPMI培养基以及额外的0.5μg/ml LPS中过夜。第二天收集成熟的ttRNA-DC用于免疫接种或与小鼠T细胞共培养。

[0077] 3、树突状细胞DC与T细胞的共培养：

[0078] 按照标准作业程序(SOPs)，将小鼠T细胞新鲜地从脾脏中取出，并与ttRNA-或OVA6
RNA-DC以10:1的比例(T细胞：DC细胞)共培养。共培养使用以每孔2*10T细胞的24孔板中进行。如每个附图说明中所示，加入细胞因子或它们的组合。在一些实验中，用0.5μM CFSE(Invitrogen公司)根据产品手册标记T细胞。

[0079] 4、流式细胞仪和分析：

[0080] 使用FACSCalibur(BD Biosciences公司)进行流式细胞分析。细胞的生存能力通过前向角散射和死亡细胞的7-AAD染色的结合来确定。使用荧光结合的抗体(BD Biosciences公司)检测CD3、CD4、CD8、CD40、CD44、CD70、CD80、CD86、CCR7、PD-L1、I-A、CD62L和CD45RO的细胞表面表达。使用FlowJo 8.1.1软件(FlowJo公司，亚什兰，俄勒冈州)分析所有FACS数据。对于用于微阵列分析的CD8+OVATetra+T细胞，经6天后的体外培养，通过在杜克大学流式细胞仪核心实验室(http://shared-resources.dhvi.duke.edu/research-flow-cytometry)的由FACSDiva软件操作的FACSAria II将CD8+OVATetra+T细胞分类挑选。

[0081] 5、细胞因子检测和微阵列分析：

[0082] 如上所述制备并培养小鼠树突状细胞DC，在第7天，收集DC并以不同浓度6
CD40L(最多1μg/ml)和LPS 0.5μg/ml重新铺放在每孔2*10个DC的24孔板中过夜。第二天，收集上清，并使用在杜克大学核心实验室(http://shared-resources.dhvi.duke.edu/home)由多倍Luminex微球阵列分析操作的Cytokine Mouse 10-Plex Panel(Invitrogen公司)检测细胞因子。一共进行了所有五次的独立实验，收集上清并储存在-20℃，细胞因子同时被检测。对于微阵列分析，来自WT小鼠和OT-1小鼠并以1:1混合的T细胞与OVA RNA-DC共培养6天。CD8+OVATetra+T细胞通过如上所述方法分类挑选。总RNA使用RNAeasy迷你试剂盒(Qiagen公司)从细胞中被纯化，并且基因表达谱图用小鼠Affymetrix公司的基因芯片(小鼠430A 2.0阵列)分析。基因表达谱图通过Partek Genomics Suit 6.6软件分析，选择来自不同培养的T细胞具有大于两倍变化的601个基因。被选择的基因进一步通过网站分析工具(http://david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp)分析，以概括它们在Biocarta子类下的T细胞活性、细胞因子网络以及细胞因子和受体之间相互作用中的作用。

[0083] 6、动物模型：

[0084] 雌性C57BL/6小鼠(6-8个星期大)被用于植入IC肿瘤。用含有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶收获KR158和B16F10OVA肿瘤细胞。将细胞与等体积的甲基纤维素在锌选项介质中混合，并用附加的25号针头装入250μl的注射器(Hamilton公司，里诺，内华达州)中。将30000个细胞(KR158)和5000个细胞(B16F10OVA)以5μl的体积使用Quitessential Stereotaxic Injector系统(Stoelting公司，Wood Dale，IL)植入大脑的右侧尾状核中。在IC肿瘤植入五天后，小鼠接受5Gy的全身放疗，在杜克大学医疗中心6
使用Shepherd辐照器进行。第二天，向小鼠皮内(ID)注射0.5-1*10个ttRNA-DC，并静脉
6 7
注射(IV)1*10个T细胞用于KR158模型，以及10*10 个T细胞用于 B16F10OVA模型。在
6
ACT后的第7天和第14天，小鼠腹腔(IP)接种疫苗两次0.5-1*10个ttRNA-DC用于KR158肿瘤模型。每天检查小鼠，并根据需要的人道终点处理小鼠，并根据实验需要保留标本。

[0085] 二、结果分析：

[0086] 1、成熟的DC的共刺激分子和细胞因子的高水平表达：

[0087] 发明人比较了LPS和CD40L对体外培养DC的影响，以确定在植入这个成熟步骤之后表型的和功能的变化。一般情况下，补充CD40L和LPS过夜显示出例如CD40、CD80和CD86的共刺激分子在小鼠DC表面上的增加趋势。然而，通过MFI检测，这些分子统计上显著性仅仅体现在LPS成熟DC的表面上(参见图1A)。当测量从过夜收集的上清液中释放的细胞因子时，发明人发现，CD40L和LPS两者的添加显著地提高了细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、IFNγ和TNFα的分泌(参见图1B)。IL-2和IL-5的水平保持不变，IL-10的水平处在背景值的误差范围内，仅少量的IL-10在LPS成熟的DC培养上清中检测到，这与先前的报道(Labeur MS,Roters B,Pers B,Mehling A,Luger TA,et al.(1999)Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.Journal of immunology 162:168-175)是一致的(参见图1B)。除此之外，IL-10的低水平也被证实是由于在DC体外培养过程中IL-4的存在，抑制了IL-10的产生(Jiang HR,Muckersie E,Robertson M,Xu H,Liversidge J,et al.(2002)Secretion of interleukin-10or interleukin-12by LPS-activated dendritic cells is critically dependent on time of stimulus relative to initiation of purified DC culture.J Leukoc Biol 72:978-985)。

[0088] 2、成熟DC促进CD8T细胞增殖以及在细胞因子-cocktail的协同下保持了CD8T细胞的低分化：

[0089] 为确定体内成熟DC的生物学功能，用不同体外制备的通过电穿孔导入ttRNA的DC对小鼠接种疫苗。接种一个星期后获取它的脾脏，并用CFSE标记T细胞。发明人发现，经CD40L和LPS成熟的DC显示出对T细胞体外增殖的深远影响(参见图1A)。与对照组和未成熟的DC组比较，在分类下可见大量的T细胞，并且CD4和CD8T细胞进入增殖阶段(参见图1)。有趣的是，IL-2的加入实际上加强了T细胞在对照组和未成熟的DC组的分化，并且显示出与T细胞在成熟DC组中的最小协同增强作用(参见图1A)。除了形象化这些用于接种疫苗的DC在体内的生物学功能，最终目的是利用这些体外制备的ttRNA-DC作为一个平台来富集并扩展用于ACT的抗肿瘤前体细胞。然而，在IL-2的存在下，这些ttRNA-DC当与脾脏的T细胞在体外共培养时产生了类似百分比的CD8T细胞、Tem和Tcm(参见图3A和图3B)。为直接调节体外培养的T细胞的表型，应用于肿瘤治疗的有效性和持久性，发明人优化了应用细胞因子-cocktail的培养条件。如图3C所示，在LPS成熟DC的基础上，相对于添加IL-2，补充细胞因子-cocktail显著地改变了体外培养的T细胞的表型，表现为低分化的表型，例如，显著增加了Tcm和Tn(CD44低，CD62高)子集的比例，而CD8T细胞的百分比保持不变。

[0090] 3、从成熟DC变化而来的抗肿瘤T细胞加上细胞因子-cocktail显示出引人注目的体内抗肿瘤活性：

[0091] 已有报道显示，低分化的体外培养的T细胞具有长期生长在异种移植小鼠模型中的优势(Yang S,Ji Y,Gattinoni L,Zhang L,Yu Z,et al.(2013)Modulating the differentiation status of ex vivo-cultured anti-tumor T cells using cytokine cocktails.Cancer Immunol Immunother 62:727-736；Yang S,Gattinoni L,Liu F,Ji Y,Yu Z,et al.(2011)In vitro generated anti-tumor T lymphocytes exhibit distinct subsets mimicking in vivo antigen-experienced cells.Cancer immunology,immunotherapy:CII 60:739-749)。并且这些类型的T细胞已经显示出在荷瘤模型中具有更强的抗肿瘤活性(Hinrichs CS,Borman ZA,Gattinoni L,Yu Z,Burns WR,et al.(2011)Human effector CD8+T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.Blood 117:808-814；Gattinoni L,Lugli E,Ji Y,Pos Z,Paulos CM,et al.(2011)A human memory T cell subset with stem cell-like properties.Nature medicine 17:1290-1297)。然而，这种低分化的T细胞是来自经CAR基因工程修饰或来自转基因小鼠；目前，对抗肿瘤T细胞和它们的抗肿瘤活性还没有系统的评价；因此，在本发明中，发明人系统地评估抗肿瘤活性与来自体外 ttRNA-DC平台的T细胞的分化状态之间的关系。与报道一致的是，人和小鼠经过ttRNA-DC扩增和富集的T细胞显示出肿瘤相关靶向的特异识别性。发明人发现，ttRNA-DC扩增的抗肿瘤T细胞可以特异性地识别肿瘤相关抗原和ttRNA制备所应用的肿瘤细胞(参见图4A)。

[0092] 由于在体内接种成熟的DC疫苗后对T细胞的显著促进作用，体内抗肿瘤效果亦发现，通过使用来自经过细胞因子-cocktail培养的不同的ttRNA-DC的T细胞表现出不同的抗肿瘤效果(参见图4B)。为评价体内抗肿瘤效果，颅内肿瘤被植入5天后，并在ACT前一天，小鼠接受5Gy的全身放疗；第二天，小鼠分别被体外静脉注射(IV)扩增的抗肿瘤T细胞，及腹腔(IP)接种ttRNA-DC疫苗。与未处理组和IL-4/GM-CSF DC组比较，CD40L和LPS-DC明显改善了荷瘤小鼠的生存中值，而LPS-DC组达到了统计学意义(参见图4B)。由于LPS-DC体内的可承受性和优越性(参见图1、图2、图4B)，接下来试图比较不同细胞因子的添加，并在LPS-DC的协同作用下，观察其在IC肿瘤模型中的抗肿瘤效果。与使用IL-2相比，细胞因子-cocktail培养的T细胞显著地改善了荷瘤小鼠的生存中值(参见图4C)。在本实施例中，细胞因子-cocktail是结合使用IL-7、IL-12、IL-21，而没有使用IL-2，发明人发现了在培养终点T细胞的低产量(未示出)；并比较了其它包括使用IL-15的细胞因子组合的抗肿瘤效果(参见图4D)。然而，基于LPS成熟DC的细胞因子-cocktail培养的T细胞持续延长了小鼠的生存中值，而其它组合未显示出显著的抗肿瘤效果(参见图4D)。
为证明ttRNA-DC对于体外产生抗肿瘤T细胞是一个必要步骤，增加了一组没有ttRNA-DC扩增的类似培养方式培养的T细胞组，如所期望的那样，这些T细胞不能延长荷瘤小鼠的生存中值(参见图4D)。

[0093] 4、细胞因子-cocktail或者其他组合的培养可以促进记忆T细胞的比例：

[0094] 基于LPS成熟DC，发明人发现，细胞因子-cocktail培养的T细胞能够延长荷瘤小鼠的生存中值。更重要的是，显示出其在体内外(参见图4)的抗肿瘤活性受到ttRNA-DC平台的影响，例如，抗原相关靶向的特异识别性和延长的生存中值，推断出生物学效果起因于抗肿瘤前体细胞的扩增和富集。虽然ttRNA负载的DC提供了一个创新的来源，但是ttRNA代表了包括肿瘤突变抗原在内的肿瘤抗原全体肿瘤相关抗原，从这一点上，大部分肿瘤相关抗原仍然需要进一步研究来确定。

[0095] 当ttRNA所包含的重量全息抗原还不是完全明了的情况下，发明人试图回答一个非常重要的问题：在ttRNA-DC-T系统中，添加细胞因子-cocktail是富集了T细胞的抗肿瘤前体细胞，还是改变了抗肿瘤T细胞的表型？为解决这个问题，选择了众所周知的来自OT-1小鼠的OVA抗原应答T细胞，即T细胞可识别OVA抗原。在图5中，使用来自OT-1小鼠的T细胞，并在体外利用OVA-DC进行扩增，发明人发现，与IL-2组相比，使用所有其它细胞因子的组合产生了类似百分比的CD8OVAtetra+T细胞，除了与IL7+IL21/IL12+IL15组显示出降低的CD8OVAtetra+T细胞(参见图5A和图5B，上栏)。在分析这一组CD8OVAtetra+CD62L+T细胞的百分比时，发明人发现，与IL-2组相比，所有其它细胞因子组合显著增加了这个类型的T细胞的比例(参见图5A和图5B，下栏)。似乎看起来，除了使用IL-2，细胞因子的组合使用能够转变体外培养的T细胞的表型。关于来自图4的体内数据，发明人发现，组合使用IL-7、IL-12和IL-21(一种细胞因子-cocktail)在共培养的头三天起到关键的作用。

[0096] 5、OVA-RNA DC体内富集抗肿瘤T细胞显著地延长了荷瘤小鼠的生存中值：

[0097] 在前面的实验中，已经显示出体外产生的来自ttRNA-DC-T平台的抗肿瘤T细胞显著地延长了荷瘤小鼠的生存中值(参加图4)。然而，细胞因子-cocktail培养的最佳治疗方案中的生存中值通常延长了两周，目前在这个系统中，通过一次注入过继转移T细胞并没有达到长期生存。想知道的是，通过ttRNA-DC体外富集和扩增，通过低水平的IFNγ感应表明，抗肿瘤前体细胞的百分比是低的(参加图4A)。为在培养终端富集抗肿瘤T细胞的频率和百分比，试图再次使用ttRNA-DC刺激T细胞；然而，体外培养的小鼠T细胞在第一轮ttRNA-DC共培养的7天后变得脆弱且易于细胞凋亡；而且，即使在细胞因子-cocktail培养环境下进行第二轮ttRNA-DC，低分化的CD62LHigh表型也不能被上调。

[0098] 为证明过继转移T细胞不仅能够显著地改善IC荷瘤小鼠的生存中值，而且也能够达到长期存活，发明人选择更具有侵袭性的黑素肿瘤系B16F10OVA，并被设计为表达OVA抗原以植入IC，该种荷瘤小鼠一般会在3周内死亡(参见图6A)。与OVA抗原一致，利用来自OT-1小鼠脾脏的T细胞以1:1比例与野生型 (WT)T细胞混合。在混合后的第0天，通过流式细胞仪检测CD8OVAtetra+T细胞的百分比通常为大约5％(参见图6B)。然而，在OVA RNA-DC体外扩增的6天后，最终产品主要由CD8OVAtetra+T细胞组成，其与IL-2或细胞因子-cocktail的使用无关(参见图6B)。虽然由细胞因子不同使用得到的体外培养的T细胞产生了类似水平的CD8OVAtetra+T细胞，并且两种类型的T细胞显著延长了IC肿瘤忍受小鼠的生存中值，然而来自细胞因子-cocktail组的T细胞导致了长期存活(51天的生存中值，相比之下，IL-2组为28天、未处理组为21天)(参加图6A)。

[0099] 为确定IL-2和cocktail培养的T细胞下的分子生物基础，挑选出体外扩增6天后的CD8OVAtetra+T细胞，其纯度由流式细胞仪分析确定(参见图6B)。基于经Partek Genomics Suit 6.6软件分析的基因表达，来自不同培养的T细胞具有大于2倍变化的代表601条基因的散点图被绘制(参见图6C，上栏)。而且，选择了一组基因，这组基因概括了它们在T细胞活性、细胞因子网络中的作用以及细胞因子和受体间的相互关系(参见图6C，下栏以及图7、8、9)。与表型分析保持一致的是，CD27、CD62L水平被上调，有趣的是，发现用于4-1BB的表达水平也被增加了(参见图6C，下栏)；然而明显增加的IFNγ水平与低分化的表型不一致(参见图5)。有趣的是，发明人发现，几种趋化因子在cocktail培养的T细胞中与IL-2相比被下调，包括CXCR3、CXCL10、CCL5、CCR9等(参见图6C，下栏)。

[0100] 6、分子标记物与体内抗肿瘤效果的相关性：

[0101] IL-2和cocktail体外扩增T细胞之间的不同的被定义为分子标记物。然而，发明人分析了一组具有2倍变化的601条基因，并集中几条候选基因以概括它们在T细胞活性中的作用(参见图7)。T细胞活性路径由BIOCARTA软件产生，反映2倍变化的关键分子由星号表示。发明人发现体外cocktail扩增的T细胞中，在T细胞表面上的4-1BB上调，这可能促进了DC和T细胞之间的相互作用；T细胞上的IL-2R也增加了，推断出这可能帮助了其与CD4T细胞亚类的相互作用；然而，降低水平的TCRζ链和IL-18的含义依然未知(参见图7)。

[0102] 为了明确ACT的疗效，一次注入荷瘤小鼠的T细胞与巨噬细胞、中性白细胞、嗜碱细胞、嗜伊红细胞、肥大细胞、B细胞之间的相互关系，准确找到一些关键的、通过微阵列分析得到的2倍变化的细胞因子，并用箭头标示以概括它们在细胞因子网络中的作用(参见图8和图9)。如上所述，IFNγ和IL-10被上调，而IL-18被下调。IL-10能够抑制促炎性细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-3、TNFα和GM-CSF的合成，这些促炎性细胞因子由巨噬细胞和调节性T细胞分泌。另外，IL-10也具有潜在的能够抑制抗原提呈细胞的抗原提呈能力，也可以刺激某些T细胞(Th2)和肥大细胞，并刺激B细胞成熟和抗体产生。虽然本实施例的主要目的是明确抗肿瘤T细胞的分子标记物，进而明确利用cocktail体外扩增的抗肿瘤T细胞的抗肿瘤基质，但本实施例所提供的数据不足以明确和抗肿瘤相关的分子标记物，需要进一步的研究来确定。

[0103] 三、讨论：

[0104] 在本发明中，发明人证明了成熟DC和组合细胞因子是如何支持体外ttRNA-DC扩增抗肿瘤T细胞的增殖和分化。发明人发现，成熟DC能够分泌一组细胞因子，并在体内接种疫苗后显著地延长了T细胞在体外培养过程中的活性状态。基于成熟DC，不使用IL-2的细胞因子cocktail产生了CD62L High表型，这成功地延长了具有高度侵袭力的小鼠星形细胞瘤模型和黑素瘤IC肿瘤模型的生存中值。发明人建议，在这些抗肿瘤T细胞上的高水平的CD62L可有助于优化体内抗肿瘤效果，或者能够被用作可靠的标记以重新定义最佳的抗肿瘤T细胞的表型并应用于临床。而且，发明人已经试图用微阵列分析识别基于优越的抗肿瘤效果的分子标记，并且准确找到一些对T细胞活性有主要作用的并与细胞因子网络相互作用的关键分子。然而，与治疗效果相关的不同表型需要被进一步阐明。

[0105] 大量证据表明，RNA转染是一种将抗原加载到DC上的良好方案。ttRNA代表以RNA为肿瘤抗原的全谱抗原，它们是应用细胞免疫疗法的理想靶标(Robbins PF,Lu YC,El-Gamil M,Li YF,Gross C,et al.(2013)Mining exomic sequencing data to identify mutated antigens recognized by adoptively transferred tumor-reactive T cells.Nat Med 19:747-752)。发明人证明了ttRNA-DC体外扩增的T细胞能够特异性识别相关靶标抗原，包括ttRNA被提取所应用的肿瘤细胞(参见图4)。然而，已经显示出，仅在IC肿瘤模型中作为接种疫苗的ttRNA-DC不能实施治疗效果，虽然它显示出了潜在的活化体内T细胞的作用。本实施例采用肿瘤模型和负载DC的肿瘤抗原。首先，不像皮下注射肿瘤并通过测量肿瘤体积评价肿瘤生长，在本发明中，发明人采用已经生长了5天的荷瘤小鼠为评价肿瘤治疗效果的模型；因此，发明人得出结论，ttRNA-DC作为体内接种疫苗有一定的治疗效果，该效果可能不足以延长动物的生存中值，并需要与ACT中的抗肿瘤T细胞协同作用。第二，发明人没有集中于研究什么是肿瘤抗原的最好来源，例如ttRNA或总肿瘤裂解产物；由于在脑部肿瘤中，被切除的肿瘤样本很小，因此不能获得足够的肿瘤细胞来制备总肿瘤裂解产物，相反可以体外扩增少量ttRNA至足够的量应用于临床应用。目前，已有积极的临床数据证实从肿瘤干细胞(以CD33为标记物)扩增的ttRNA应用于临床应用是可行的。

[0106] 与现有的基因工程方法(Morgan RA,Dudley ME,Wunderlich JR,Hughes MS,Yang JC,et al.(2006)Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes.Science 314:126-129；Kalos M,Levine BL,Porter DL,Katz S,Grupp SA,et al.(2011)T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.Science translational medicine 3:95ra73)不同，本发明提供了创新的ttRNA-DC-T平台，成功地延长了两种小鼠IC肿瘤模型的存活。发明人推断出，随后的接种疫苗提供了有利于体外过继转移T细胞持久在体内存活所需要的微环境，与图2中的结果一致，图2中成熟DC能够调节扩增后T细胞的体内增殖。在这种情况下，过继转移T细胞能够最终转移至肿瘤位置并杀死肿瘤细胞。与已报道的模型(Jiang HR,Muckersie E,Robertson M,Xu H,Liversidge J,et al.(2002)Secretion of interleukin-10or interleukin-12by LPS-activated dendritic cells is critically dependent on time of stimulus relative to initiation of purified DC culture.J Leukoc Biol72:978-985)保持一致，过继转移T细胞的体内抗肿瘤效果严重地依赖三个因素：淋巴清除(lymphodepletion)、随后的接种疫苗和IL-2的注入(Gattinoni L,Klebanoff CA,Palmer DC,Wrzesinski C,Kerstann K,et al.(2005)Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+T cells.The Journal of clinical investigation 115:
1616-1626)。ACT的最终目标是消除肿瘤细胞并建立持久抗肿瘤免疫记忆。或者，与使用ttRNA-DC作为疫苗比较，利用它的潜力直接产生多功能体外抗肿瘤T细胞，不需要依赖癌症患者中的受损免疫系统。实验证明，T细胞能够非常精确地消灭鼠和人类中大的、成熟的肿瘤(Brenner MK,Heslop HE(2010)Adoptive T cell therapy of cancer.Current opinion in immunology 22:251-257；Rosenberg SA(2011)Cell transfer immunotherapy for metastatic solid cancer-what clinicians need to know.Nature reviews Clinical oncology 8:577-585；Johnson LA,Morgan RA,Dudley ME,Cassard L,Yang JC,et al.(2009)Gene therapy with human and mouse T-cell receptors mediates cancer regression and targets normal tissues expressing cognate antigen.Blood
114:535-546；Robbins PF,Morgan RA,Feldman SA,Yang JC,Sherry RM,et al.(2011)Tumor regression in patients with metastatic synovial cell sarcoma and melanoma using genetically engineered lymphocytes reactive with NY-ESO-1.J Clin Oncol
29:917-924)，甚至是肿瘤处于“免疫豁免”大脑内(Hong JJ,Rosenberg SA,Dudley ME,Yang JC,White DE,et al.(2010)Successful treatment of melanoma brain metastases with adoptive cell therapy.Clinical cancer research:an official journal of the American Association for Cancer Research 16:4892-4898；Rosenberg SA,Yang JC,Sherry RM,Kammula US,Hughes MS,et al.(2011)Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy.Clinical cancer research:an official journal of the American Association for Cancer Research 17:4550-4557)。实际上，阻止体液免疫成分进入大脑的血脑屏障并不能阻碍T细胞介导的免疫疗法；作为活化的T细胞，研究证实可以通过血脑屏障(Hong JJ,Rosenberg SA,Dudley ME,Yang JC,White DE,et al.(2010)Successful treatment of melanoma brain metastases with adoptive cell therapy.Clinical cancer research:an official journal of the American Association for Cancer Research 16:4892-4898)。

[0107] 发明人建议使用可靠的CD62L作为分子标记物以预测体外培养的抗肿瘤T细胞的体内抗肿瘤效果，并重新定义用于癌症的ACT的最佳的体外培养的抗肿瘤T细胞的概念。

[0108] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

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