在医疗技术进步、老龄化更新的现在，癌依然作为重大疾病 存在。当然，癌的治疗技术也有很大的进步，开发了合成医药、 中药和以从天然物的提取物等作为基础的很多医药。对于合成医 药，来自天然物的提取物在副作用这一点上优秀，例如从西洋紫 杉发现了紫杉酚，被用作抗癌剂的有效成分(日本专利特开昭63 -30478号公报、日本专利特开平7-233064号公报等)，但其副 作用依然很大。

本发明的目的在于提供一种抗肿瘤剂，其为植物成分，抗肿 瘤活性高，副作用少。
本发明的目的还在于提供含有植物成分的食品。
在探索植物成分中的抗癌物质的过程中，发现夹竹桃科植物 和百合科植物成分在体外(in vitro)和体内(in vivo)强烈杀伤 癌细胞，特别是杀伤人的大肠癌、胃癌和肺癌细胞，而且即使这 些植物的提取物高度稀释后也杀伤癌细胞，本发明是基于该见解 进行的。
即，本发明提供抗肿瘤剂，其特征在于，含有夹竹桃科植物、 百合科植物或它们的提取物。
本发明还提供用于制备抗肿瘤剂的夹竹桃科植物、百合科植 物或它们的提取物的使用。
本发明还提供含有夹竹桃科植物、百合科植物或它们的提取 物的食品。
附图说明
[图1]表示夹竹桃提取物(分子量100,000以下的级分)对小 鼠胃癌的治疗效果。
[图2]表示夹竹桃提取物(分子量100,000以下的级分)对小 鼠大肠癌的治疗效果。
[图3]表示夹竹桃提取物(分子量100,000以下的级分)对小 鼠肺癌的治疗效果。
[图4]表示将夹竹桃的分子量10,000至3,000的部分纯化样品 运用于各种癌细胞时的抗癌谱。

本发明中使用的夹竹桃科植物(Apocynaceae)是属于龙胆 目(Gentianales，Apocynales)的植物，可举出夹竹桃(Nerium Oleander L.)、黄蝉(Allamanda Oenotheraefolia Pohl)、墨 西哥鸡蛋花(Plumeria Mexicana)、长春花(Lochnera)、欧 洲夹竹桃(Nerium ole nder L.c.v.Variegatum)、乌头、海芒果 (Cerbera manghas L.)、黄花夹竹桃(Thevetia peruviana L.)、 红蝉花(Mandevilla splendens Woodson hybrid)、水甘草 (Amsonia)、罗布麻(Apocynum)等。其中，优选为夹竹桃 (Nerium Oleander L.)。另外，欧洲夹竹桃、乌头、海芒果、 黄花夹竹桃表现出50％细胞致死率在log104.5以上的活性，因此它 们也为优选。
另外，百合科植物(Liliaceae)是属于百合目(Liliales)的 植物，可举出凤尾兰(Yucca Gloriosa L.)、白丝草 (Chionoqraphis)、铃兰(Convallaria)等，其中优选为凤尾 兰(Yucca Gloriosa L.)。
在本发明中，可以使用这些植物的叶、花、种子、茎和(球) 根。其中，优选使用茎或叶。对于将植物本身作为抗肿瘤剂的有 效成分使用时，优选将植物干燥后，粉碎至微细后使用。
在本发明中，可以使用将夹竹桃科植物和百合科植物的叶、 花、种子、茎和(球)根在例如干燥、粉碎后、或在未干燥的鲜 的状态下，用水，例如蒸馏水或离子交换水，或用亲水性或疏水 性有机溶剂提取的溶液本身或其干燥物。其中所使用的有机溶剂 可举出乙酸乙酯、四氯化碳、氯仿、二氯甲烷、甲醇、乙醇、(异) 丙醇、丁醇、丙酮或DMSO。其中亲水性溶剂也可以以含水状态 使用。所使用的水或溶剂的量可以是任意的，但是优选使用5分之 1～5倍量，特别优选使用约等量。另外，提取可在60℃以下进行， 进一步优选在室温下进行，特别优选边用搅拌器等搅拌边提取的 方式。
提取物中的有效成分的分子量优选小于30万，更优选分子量 在10万以下，最优选为1万以下。
水或溶剂提取物既可以以原有的液体状态直接使用，也可以 进行干燥以粉末、颗粒等固体形状使用。
另外，做成含有夹竹桃科植物、百合科植物或它们的提取物 的抗肿瘤剂时，还可以含有医药上容许的各种制剂用物质，例如 赋形剂、稀释剂、崩解剂、粘合剂、包衣剂、润滑剂、助流剂、 湿润剂、风味剂、甜味剂、增溶剂等作为辅助剂。具体来说，可 举出碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇以及其它的糖类、滑石、 奶蛋白、明胶、淀粉、纤维素及其衍生物、动物和植物油、聚乙 二醇、甘油等。
本发明的抗肿瘤剂优选经口给予，但并不限定于此种方式。 本发明的抗肿瘤剂每1kg体重可使用0.25～2g左右的量。
另外，做成含有夹竹桃科植物、百合科植物或它们的提取物 的食品时，可作为健康食品或具有抗肿瘤活性的功能食品。对食 品中的夹竹桃科植物、百合科植物或它们的提取物没有特别限定， 优选含有0.01～5质量％左右。
根据本发明，通过含有夹竹桃科植物、百合科植物或它们的 提取物作为有效成分，可提供抗肿瘤活性高、副作用少的抗肿瘤 剂。特别是使用夹竹桃科植物的提取物作为有效成分时，对人的 大肠癌、胃癌和肺癌细胞表现出大致同等高的癌细胞杀伤活性， 推定其有效成分是由分子量低的物质构成。另外，癌细胞致死效 果表现出比用于阳性对照的丝裂霉素C还高10倍以上。另一方面， 凤尾兰中所合成分的癌细胞杀伤效果尤其对大肠癌表现出特别高 的癌细胞杀伤活性。
如上所述，根据本发明可提供对各种肿瘤，特别是对大肠癌、 胃癌和肺癌良好的抗肿瘤剂。
下面，通过实施例对本发明进行详细说明。
实施例
实施例1
植物成分的提取
将自然生长于冲绳县北部地区的夹竹桃科的夹竹桃、黄蝉、 墨西哥鸡蛋花以及百合科的凤尾兰的叶和茎，在没有干燥的鲜的 状态进行秤量，用菜刀切细成大致数毫米左右宽。向其中加入等 重量的蒸馏水后，用市售的大型搅拌器以每分钟10,000转处理10 分钟。将该混合物分注到15～50ml容量的塑料离心管中，使用 Beckman离心机(GS-15R)以每分钟5,000转离心60分钟。以 此作为上述植物成分的粗级分总成分，再用Sartorius的Minisart (0.45μm)过滤灭菌后供于试验。除了用蒸馏水进行成分提取之 外，在提取实验中还使用了氯仿、异丙醇、乙酸乙酯、乙醇、甲 醇、二氯甲烷溶剂等。
比较对照
将作为抗癌剂已经广泛使用的市售丝裂霉素C(协和发酵)按 照每1ml溶解1mg的量溶解于-PBS后的溶液作为比较对照供检 测。
细胞和培养
人的大肠癌细胞(HT-29)、胃癌细胞(MKN1)以及肺癌 细胞(A549)由(财)癌研究会癌化学疗法中心分子药理部的矢 守隆夫博士提供，使用含有5％胎牛血清的市售RPMI-1640 (GIBCO)的培养基，在25cm2烧瓶(IWAKI)中对各个细胞进 行传代维持。
评价用细胞的培养
在直径100mm塑料培养皿(IWAKI)中，用含有5％胎牛血 清的RPMI-1640培养基培养上述的HT-29、MKN1以及A549 细胞，2天后用负磷酸缓冲食盐水(-PBS)洗涤细胞，向其中添 加胰蛋白酶-EDTA(GIBCO)，使细胞分散，接着，在含有5％ 胎牛血清的RPMI-1640中悬浮并计算出细胞数。上述3种细胞浓 度定为105/ml，96孔(well)的细胞培养用塑料板(IWAKI)的 每1孔分注0.1ml。例如，各板的A列和H列、编号板1列和2列只加 培养基，2号至11号、B列至G列分注各试验用细胞，在37℃下培 养24小时。
评价方法
以未加入血清的GIBCO的极限必需培养基(MEM)将提取的 各个植物成分和比较对照的丝裂霉素C稀释至10-1～10-8、或 10-1～10-4，向各个孔分注各100μl。就各个检体准备2列孔，在B、 C列的第11号至第8号孔中加入被检体的10-1、10-2、10-3、10-4 稀释液，进而在第2、3、4、5号孔中添加10-5、10-6、10-7、10-8 稀释液，在第6号和7号孔中只分注培养基作为各个被检体的对照。 按照同样的步骤，在D和E列、F和G列中配被检体的系列稀释液。 分注被检体培养2天后，向各孔添加50％的三氯乙酸(TCA)50μl， 在4℃下静置1小时。然后加200μl自来水洗涤5次，干燥板，向各 孔加50μl硫代若丹明染色液，静置10分钟，然后每次加入100μl 的1％乙酸，洗涤5次，将板干燥。最后，向各板加10mM的TRIS (Tris[hydroxymethyl]aminomethane，三羟甲基氨基甲烷)液 体150μl，以每分钟750转振荡5分钟，在525nm的波长下测定吸光 度。细胞的存活率如下计算。
细胞的存活率＝100×(各稀释点的被检体的平均吸光度-对 应于各稀释点的培养基对照的平均吸光度)/(细胞对照的平均吸 光度-对应于各稀释点的培养基对照的平均吸光度)
分子量的予测定
首先使用离心浓缩器(vivaspin20)的0.2μm的膜以每分钟 5,000转离心50分钟(Beckman GS-15R离心机)，得到本实验 中采用的各植物种类的粗级分总成分，对此进行过滤浓缩，然后 在vivaspinVS206(分子量1,000,000)、vivaspinVS205(分子 量300,000)、vivaspin6：VS064(分子量100,000)、vivaspin2： VS013(分子量50,000)、vivaspin2：VS012(分子量30,000)、 vivaspin2：VS010(分子量10,000)、vivaspin2：VS021(分 子量5,000)以及vivaspin20：VS2091(分子量3,000)中使用 Beckman GS-15R离心机，以每分钟5,000转离心分离浓缩60分 钟后供试验使用。
植物提取成分对大肠癌(HT-29)、胃癌(MKN1)以及肺 癌(A549)细胞的杀伤效果的结果归纳示于表-1中。
表1.夹竹桃科和百合科植物成分的抗癌细胞活性   植物种   类     来源       癌细胞                                       细胞存活率                                      被检体稀释10-n   50％细胞   致死率     (log10)       2     3     4     5     6     7     8     9     夹竹桃     叶和茎     大肠癌   胃癌   肺癌   2.02   8.04   11.12   18.17   7.66   8.65   33.14   18.60   20.09   72.95   88.69   64.51   79.60   99.30   86.38   5.68   5.70   5.84     凤尾兰     叶和茎     大肠癌   胃癌   肺癌   5.50   43.44   32.20   21.86   66.51   43.30   23.81   80.26   62.16   17.75   91.38   71.16   31.96       24.06       52.37       8.96   3.55   4.62     乌头     叶和茎     大肠癌   胃癌   肺癌   1.83   14.20   24.87   3.19   13.68   18.47   17.77   19.43   20.02   82.33   82.91   64.61   4.74   4.72   4.85     海芒果     叶、茎、   种子     大肠癌   胃癌     肺癌   6.42   21.03     12.39   13.30   18.55     17.58   32.63   44.07     27.65   89.85   89.60     78.12   4.57   4.33     4.69     黄花夹   竹桃     叶和茎       大肠癌   胃癌     肺癌   13.42   21.48     22.57   27.80   16.52     24.24   44.10   41.65     22.96   98.07   96.42     72.20   4.29   4.37     4.77     欧洲夹   竹桃     叶和茎       大肠癌   胃癌     肺癌   1.61   17.38     21.64   1.46   8.39     15.58   3.07   6.71     17.04   21.91   18.56     18.45   ＞5.0   ＞5.0     ＞5.0   丝裂霉     素C     大肠癌   胃癌     肺癌   16.14   50.20     15.55   56.48   77.79     35.97   84.07   89.99     63.35   70.34   99.98     70.66   3.93   2.99     4.74
夹竹桃科植物杀伤癌细胞的效果
表-1表明夹竹桃对大肠癌的50％细胞致死率在log10-3的稀 释点杀伤97％以上的细胞，在log10-4的稀释点杀伤80％以上的细 胞，进一步在log10-5的稀释点杀伤70％以上的细胞，在该植物成 分中含有相当高的细胞致死性的物质。结果可以计算出夹竹桃成 分的50％大肠癌细胞致死率为log105.68。
利用同样的方法评价的夹竹桃成分对胃癌和肺癌细胞也表现 出高的致死效果，计算出的50％细胞致死率分别为log105.70和 log105.84。
接下来，由于已确认对3种癌细胞的抗癌作用，为了预测该分 子大小，利用离心机的重力使分子通过规定的分子筛膜，研究抗 癌活性，其结果在表-2中示出。
表2.夹竹桃科和百合科植物中含有的抗癌细胞成分的分子大 小的预测定     植物种类     癌细胞                 50％细胞致死率(log10)                    分子过滤膜大小  ＞1,000,000  100,000   10,000   3,000     夹竹桃     大肠癌   胃癌   肺癌  5.97  6.02  7.97  5.73  4.73  8.40   4.83   4.89   8.37   4.66   4.69   4.83     凤尾兰     大肠癌   胃癌   肺癌  6.92  3.63  3.47   3.84   3.81   2.91   2.74   3.59   ＜2   2.67   3.67   ＜2   阳性对照     丝裂霉素C     大肠癌   胃癌     肺癌   3.72   2.96     3.72
表-2的结果表明，就分子量100万以上的样品来看，夹竹桃 成分对大肠癌细胞表现出105.97、对胃癌细胞表现出106.02以及对肺 癌细胞表现出107.97的极高的细胞致死效果。另外能够通过分子量 10万的分子筛膜的成分对大肠癌、胃癌和肺癌细胞的细胞致死活 性也分别表现出105.73、104.73和108.40的活性。特别引人注目的是 对于肺癌细胞的活性，已明确了在利用分子膜进行部分纯化的过 程中活性增强约1000倍的现象。作为其原因，推测可能是特定的 抗癌物质被浓缩的缘故。这样的倾向在能够通过分子量1万大小的 成分中也可看到。另外在分子量3千以下的成分中依然可确认高的 抗癌活性，因此表明夹竹桃成分中含有的抗癌物质是由分子量1万 至3千左右大小的比较小的分子构成。
为了研究夹竹桃科的其它植物种类是否也存在夹竹桃成分显 示出的高抗癌活性，作为参考，对于黄蝉和墨西哥鸡蛋花植物也 进行评价。结果表明黄蝉对大肠癌、胃癌和肺癌细胞分别表现出 102.82、102.99和102.78的50％细胞致死率。另外，墨西哥鸡蛋花也 对大肠癌、胃癌和肺癌细胞分别表现出102.76、102.86和102.72的值。 由以上的比较调查可以认为高抗癌活性是特征性地分布于夹竹桃 植物的，其可用性更凸现出来。
百合科植物凤尾兰杀伤癌细胞的效果
在抗癌活性中特别引人注目的是对大肠癌的非常高的细胞杀 伤效果，由表-1的结果看到该值为108.96，同一样品对胃癌和肺 癌细胞的50％细胞致死率分别为103.55和104.62。这表明凤尾兰植物 中含有的抗癌成分是特征性地强烈作用于大肠癌细胞的物质。
另外，如果对利用过滤膜的分子大小的预测的结果进行比较 调查，特别是如表-2中了解的那样，分子量10万以下的样品中抗 癌活性显著减少，达到103.84的细胞致死率，表明该成分中含有的 物质是相对高分子的抗癌物质。另一方面，由于在分子量1万以下 或分子量3千以下的级分中依然残留着低的抗癌活性，所以也表明 在该成分中同时存在着高分子和低分子的抗癌物质。总之，在凤 尾兰中显然含有更强烈作用于大肠癌的抗癌成分，其利用价值引 人注目。
在上述2种植物成分中被确认的抗癌活性在以有机溶剂(异丙 醇、乙酸乙酯、乙醇以及二氯甲烷)提取的成分中也被确认。
实施例2(夹竹桃中有用抗癌成分的纯化法和在制品中的应 用)
对于与实施例1同样操作得到的夹竹桃植物的粗提取液(用蒸 馏水提取)，利用离心浓缩器实施成分纯化法。即，首先将用水 提取的粗成分用孔径0.4μm的注射器用Minisart进行加压过滤，然 后使用孔径0.22μm、分子量(MW)分别为1,000,000、300,000、 100,000、50,000、10,000、5,000以及3,000的一系列vivaspin离 心浓缩器离心过滤60分钟。结果，夹竹桃的抗癌成分在分子量 100,000、50,000、10,000、5,000以及3,000的膜中都可高效通过， 其癌细胞杀伤效果表现出106.0以上的50％癌细胞致死率。将由离 心浓缩器得到的一系列级分定名为a(通过0.22μm孔径的成分)、 b(孔径1,000,000MW)、c(孔径300,000MW)、d(孔径 100,000MW)、e(孔径50,000MW)以及f(孔径10,000MW)、 g(孔径5,000MW)、h(孔径3,000MW)，如以下给出的那样， 可知在所有使用的分子筛膜中分级成分都表现出高的抗癌活性。
急性毒性试验结果
有关上述那样得到的各级分的急性毒性的试验结果在表-3 中示出。
表3   植物成分   来源     级分           急性毒性(小鼠死亡率)   抗癌活性评价   50％细胞致死率     (log10)     腹腔内注射       经口给予     夹竹桃             a(0.22μm)   c(300,000MW)   d(100,000MW)   f(10,000MW)   g(5,000MW)   h(3,000MW)   +    (100％)   +    (100％)   -    (0％)   -    (0％)   -    (0％)   -    (0％)   -    (0％)   -    (0％)   -    (0％)   -    (0％)   -    (0％)   -    (0％)   ++++   +++   +++   +++   +++   +++
如表-3给出的结果表明的那样，可知在夹竹桃植物的粗提取 液的级分a(通过0.22μm孔径的成分)、级分b(孔径 1,000,000MW)、级分c(孔径300,000MW)中含有当注射到小 鼠腹腔内时大约1小时表现出100％死亡率的强度的急性毒性物 质。
另一方面，经口给予时，所有小鼠都存活，表明急性毒性成 分不被肠道吸收，可以在任一种形式的健康·功能性食品或医药 品的制品开发中利用。
部分纯化抗癌成分在体外的再评价
有关夹竹桃的体外抗癌活性在实施例1中已经说明，现就分子 量10,000以下的成分对于39种人癌细胞的杀伤效果进行进一步评 价。结果表明夹竹桃的分子量10,000至3,000的部分纯化样品可以 有效杀伤5种乳癌(HBC-4、BSY-1、HBC-5、MCF-7、MDA -MB-231)、7种肺癌(NCI-H23、NCI-H226、NCI-H522、 NCI-H460、A549、DMS-273、DMS-114)、1种肾癌(ACHN)、 6种脑肿瘤(U251、SF-268、SF-295、SF-539、SNB-75、 SNB-78)、1种黑素瘤(LOX-IMVI)、6种胃癌(St-4、MKN1、 MKN7、MKN28、MKN45、MKN74)、5种大肠癌(HCC2998、 KM-12、HT-29、HCT-15、HCT-116)、4种卵巢癌(OVCAR -3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3)以 及2种前列腺癌(DV-145、PC-3)(图4(1)～(3))。当计算出 其50％癌细胞致死率时，即使低的致死率也表现出log104.0的值， 高的致死率计算为log106.4。
体内的夹竹桃抗癌活性
为了研究在体内的抗癌效果，按照1只100万细胞数的比例向5 周龄雌性小鼠BALB/cS Lc-nu/cn的背部接种大肠癌、胃癌和肺癌 细胞，当各个癌用肉眼可充分确认时开始治疗。治疗按照每隔4天 经口给予部分纯化的分子量100,000或10,000以下的级分，对于所 形成的肿瘤部位的变化计算出2只小鼠的癌体积增殖率的平均值， 评价治疗效果。图1～3归纳了治疗的结果，观察到经口给予PBS 组的胃癌(MKN1)相对于横轴时间(天)呈直线成长，与此相 反，给予夹竹桃成分的小鼠的癌的成长被显著抑制(图1)。治疗 期间虽然只有2周，但在实验结束时，治疗组的癌体积已经降低到 大约20％。如此，到目前为止还没有夹竹桃的部分纯化样品通过 经口给予表现出这样程度的肿瘤治疗效果的报告，在本研究中首 次明确了本成分作为健康·功能性食品、或医药品外的药品可以 在制品开发中利用。同样，图2给出了夹竹桃对大肠癌的治疗效果。 从曲线的走向可清楚看到非治疗组的癌显著增加，相反，给予分 子量10,000以下的成分的癌的成长被显著抑制。预期该治疗组的 癌的治疗效果可使癌的增殖率下降到大约14％，通过延长治疗期 间，其效果会变得更好。另外，也研究了夹竹桃成分对肺癌的效 果，表明本成分对该癌的缩小效果也有贡献(图3)。
可以说，以上事实表明通过开发利用夹竹桃和凤尾兰等成分 的各种各样形态的健康食品、功能性食品、或健康和功能性饮料 制品，可以在癌的预防和治疗中利用。同时通过这些具有抗癌活 性的物质的结构决定和抗癌活性的再确认，预期可开发可在医院 等活用的各种各样形态的抗癌剂。另外作为具体的食品，可举出 果汁等各种饮料制品、茶类、各种点心、片剂型食品、粉末状食 品、健康功能食品等。
专利文献1：日本专利特开昭63-30478号公报
专利文献2：日本专利特开平7-233064号公报