瑞格替尼和拉帕替尼在制备抗肿瘤联合用药物中的应用
阅读：340发布：2023-01-24
专利汇可以提供瑞格替尼和拉帕替尼在制备抗肿瘤联合用药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于抗 肿瘤 药物制备技术领域，具体涉及瑞格替尼和拉帕替尼在制备抗肿瘤联合用药物中的应用。所述的瑞格替尼和拉帕替尼的联合用药可显著的引起肿瘤细胞周期阻滞作用，使肿瘤细胞阻滞在G0/G1期，从而抑制结肠癌的进展；可有效地提高对肿瘤细胞的杀伤能 力 ，能极大促进肿瘤细胞凋亡的发生。两者具有明显的协同作用，有效提高疗效，相对于单一组分或两组分简单疗效 叠加 更显著，提高了对肿瘤细胞的杀伤性；有效降低彼此的用药量，从而减少毒 副作用 。两者联合使用也可节约成本，减轻病人的经济负担，为肿瘤的防治提供了一条新途径，在医药学领域的应用前景广阔。，下面是瑞格替尼和拉帕替尼在制备抗肿瘤联合用药物中的应用专利的具体信息内容。
1.瑞格替尼和拉帕替尼在制备抗肿瘤联合用药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的瑞格替尼和拉帕替尼在制备抗肿瘤联合用药物中的应用，其特征在于：
所述的瑞格替尼和拉帕替尼的用量摩尔比为(0.001:1)～(1:1)。
3.根据权利要求1所述的瑞格替尼和拉帕替尼在制备抗肿瘤联合用药物中的应用，其特征在于：
所述的瑞格替尼的有效剂量为50mg/kg，拉帕替尼的有效剂量为100mg/kg。
4.根据权利要求1所述的瑞格替尼和拉帕替尼在制备抗肿瘤联合用药物中的应用，其特征在于：
所述的肿瘤为结直肠癌肿瘤。
5.一种抗肿瘤联合用药物，其特征在于：包含瑞格替尼和拉帕替尼或其药学上可接受的盐，以及瑞格替尼和拉帕替尼或其药学上可接受的盐的溶剂化合物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体或其任意比例的混合物，包括外消旋混合物。
6.根据权利要求5所述的抗肿瘤联合用药物，其特征在于：所述的抗肿瘤联合用药物还含有一种或者是至少两种药学上可以接受的载体。
7.根据权利要求5所述的抗肿瘤联合用药物，其特征在于：所述的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。
8.根据权利要求5所述的抗肿瘤联合用药物，其特征在于：所述的抗肿瘤联合用药物进一步制成注射剂、片剂、粒剂或胶囊。
瑞格替尼和拉帕替尼在制备抗肿瘤联合用药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于抗肿瘤药物制备技术领域，具体涉及瑞格替尼和拉帕替尼在制备抗肿瘤联合用药物中的应用。
背景技术
[0002] 随着肿瘤分子生物学的发展，肿瘤的化疗进入分子靶向治疗时代，针对分子靶点的新一代抗肿瘤药物将凭借其特异性和靶向性，成为肿瘤治疗的另一主要方向。多靶点抑制剂在治疗方面优于单靶点抑制剂，多靶点联合阻断信号传导是肿瘤治疗和药物开发新的发展方向。
[0003] 联合用药是近年来肿瘤化疗领域的热点之一，大量的临床和实验研究证明，联合药物疗法在肿瘤的防治和康复方面有特效。其与传统的单药治疗相比具有多种优点，如可以同时靶向多种重要信号通路、克服肿瘤耐药、降低毒副作用等。
[0004] 酪氨酸激酶受体家族是肿瘤治疗较理想的特异性靶点，赋予了酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的关键作用。TKIs可通过下调肿瘤细胞的血管生成因子以及抑制EGFR对肿瘤血管内皮细胞的信号传导，EGFR和血管内皮生长因子受体(VEGFR)两种信号传导通路的“交叉对话”，为临床同时抑制这两种传导通路提供了合理的依据。
[0005] 瑞格替尼(Regorafenib)可广泛抑制与血管生成和肿瘤发生相关的靶激酶，如VEGFR、TIE-2和Ret、PDGFR-β、c-Kit、c-Raf、bFGFR-1以及p38等，从而发挥抗肿瘤作用。除此之外，Regorafenib对酪氨酸蛋白激酶DDR2、Trk2A、Eph2A、RAF-1、BRAFV600E、SAPK2、PTK5、Abl等多个激酶都有很强的抑制作用，由于其广谱的激酶抑制活性，对该药在除了转移性直肠癌及胃肠道间质瘤以外的适应症的研究也在广泛开展。拉帕替尼是一种口服的小分子表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂，是一种可逆性EGFR和HER-2双受体阻断剂，2007年
5月通过了美国FDA的审批，临床适应症是已接受过蒽环类、紫杉类和transtuzumab治疗转移或侵袭性的HER-2过表达的乳癌患者。
5月通过了美国FDA的审批，临床适应症是已接受过蒽环类、紫杉类和transtuzumab治疗转移或侵袭性的HER-2过表达的乳癌患者。
[0006] 目前，尚没有瑞格替尼和拉帕替尼联合使用的相关文献报道。
发明内容
[0007] 为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供瑞格替尼和拉帕替尼在制备抗肿瘤联合用药物中的应用。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种抗肿瘤联合用药物。
[0009] 本发明的目的通过下述方案实现：
[0010] 瑞格替尼和拉帕替尼在制备抗肿瘤联合用药物中的应用；
[0011] 所述的瑞格替尼和拉帕替尼的用量摩尔比优选为(0.001:1)～(1:1)；
[0012] 所述的瑞格替尼的有效剂量优选为50mg/kg，拉帕替尼的有效剂量优选为100mg/kg；
[0013] 所述的肿瘤优选为结直肠癌肿瘤；
[0014] 一种抗肿瘤联合用药物，包含瑞格替尼和拉帕替尼或其药学上可接受的盐，以及瑞格替尼和拉帕替尼或其药学上可接受的盐的溶剂化合物、对映异构体、非对映异构体、互变异构体或其任意比例的混合物，包括外消旋混合物；
[0015] 所述的抗肿瘤联合用药物还可以含有一种或者是至少两种药学上可以接受的载体；
[0017] 所述的抗肿瘤联合用药物可以进一步制成注射剂、片剂、粒剂或胶囊等多种形式，各种剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备；
[0018] 本发明所述的瑞格替尼和拉帕替尼的联合用药可显著的引起肿瘤细胞周期阻滞作用，使肿瘤细胞阻滞在G0/G1期，从而抑制结直肠癌的进展。
[0019] 本发明所述的瑞格替尼和拉帕替尼的联合用药可有效地提高对肿瘤细胞的杀伤能力，能极大促进肿瘤细胞凋亡的发生。
[0020] 本发明所述的瑞格替尼和拉帕替尼在制备抗肿瘤联合用药物中的应用，指可通过抑制HCT116、HT29、SW620和HCT8等不同的结直肠癌肿瘤细胞的生长以达到治疗肿瘤的作用；可以引起HCT116和SW620细胞周期阻滞，使细胞阻滞在G0/G1期，从而抑制肿瘤细胞增殖；可以引起HCT116和SW620细胞发生凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖；本发明所述瑞格替尼和拉帕替尼联合用药可以抑制裸鼠移植瘤生长，裸鼠血清中药物浓度测定显示瑞格替尼和拉帕替尼代谢无拮抗相互影响作用。
[0021] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
[0022] (1)瑞格替尼和拉帕替尼联合用药，在本发明的用量比例范围内，两者具有明显的协同作用，有效提高疗效，相对于单一组分或两组分简单疗效叠加更显著，提高了对肿瘤细胞的杀伤性。
[0023] (2)在保证同样治疗效果的情况下，瑞格替尼和拉帕替尼的联合使用可以降低彼此的用药量，从而减少毒副作用。
[0025] 图1是MTT方法检测不同肿瘤细胞在瑞格替尼或拉帕替尼单独处理后的存活率结果分析图；其中，A：瑞格替尼处理后结果分析；B：拉帕替尼处理后结果分析。
[0026] 图2是MTT方法检测结直肠癌细胞HCT116和SW620经瑞格替尼和拉帕替尼单独处理及联合处理后细胞的存活率结果分析图；其中，A：细胞HCT116结果分析；B：细胞SW620结果分析。
[0027] 图3是利用流式细胞术检测经瑞格替尼和拉帕替尼分别单独处理及联合处理后结直肠癌细胞HCT116的细胞周期分布结果分析图。
[0028] 图4是利用流式细胞术检测经瑞格替尼和拉帕替尼分别单独处理及联合处理后结直肠癌细胞SW620的细胞周期分布结果分析图。
[0029] 图5是利用流式细胞术检测经瑞格替尼和拉帕替尼分别单独处理及联合处理后结直肠癌细胞HCT116的细胞凋亡检测结果分析图。
[0030] 图6是利用流式细胞术检测经瑞格替尼和拉帕替尼分别单独处理及联合处理后结直肠癌细胞SW620的细胞凋亡检测结果分析图。
[0031] 图7是利用Western Blot法评价经瑞格替尼和拉帕替尼分别单独处理及联合处理后结直肠癌细胞HCT116和SW620细胞内细胞周期相关蛋白和凋亡蛋白的影响结果分析图；其中，A：细胞HCT116结果分析；B：细胞SW620结果分析。
[0032] 图8是在裸鼠动物中，瑞格替尼和拉帕替尼单独给药及联合给药后小鼠移植瘤体积的生长曲线及瘤重结果分析图。
[0033] 图9是在裸鼠动物中，瑞格替尼和拉帕替尼单独给药及联合给药后小鼠血清中血药的浓度曲线结果分析图。
具体实施方式
[0034] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0035] 本发明实施例使用的所有细胞株均来源于ATCC，本发明使用的瑞格替尼和拉帕替尼购于ApexBio公司。
[0036] 实施例1MTT法检测不同肿瘤细胞对瑞格替尼或拉帕替尼的敏感性
[0037] 将人结直肠癌细胞HCT116、SW620、HT29和HCT8细胞以每孔5000～9000个细胞的数量接种到96孔板，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的瑞格替尼或拉帕替尼的PBS溶液。培养72h后，每孔加入10μL浓度为5mg/mL的MTT再培养4h，然后弃培养液每孔加入100μL的DMSO，用酶标仪在490nm读取每孔的吸光值。用Bliss法计算半数抑制浓度值(IC50)。具体结果见图1。
[0038] 从图1可以看出，瑞格替尼和拉帕替尼对不同的肿瘤细胞的IC50值都处在一个比较小的范围内，其中瑞格替尼对不同的肿瘤细胞的IC50值在15～25μM范围内，而拉帕替尼对不同的肿瘤细胞的IC50值在10～70μM范围内。表明瑞格替尼和拉帕替尼对不同的肿瘤细胞都具有较好的抑制增殖作用。
[0039] 实施例2瑞格替尼或拉帕替尼单独使用以及联合使用后对不同肿瘤细胞存活率的影响
[0040] 将人结直肠癌细胞HCT116和SW620细胞以每孔5000～9000个细胞的数量接种到96孔板，待细胞贴壁后，加入不同的瑞格替尼和拉帕替尼的配比的PBS溶液。培养72h后，每孔加入10μL浓度为5mg/mL的MTT再培养4h，然后弃培养液每孔加入100μL的DMSO，用酶标仪在490nm读取每孔的吸光值。用CompuSyn软件进行协同作用综合因子(Combination index，CI)分析。结果见图2和表1，图2表明经不同药物浓度联合处理后HCT116和SW620的细胞存活率。
[0041] CI值表示药物联合作用时的一个复合指数，CI值小于、等于和大于1分别表示药物具有协同作用、增效作用和拮抗作用。从表1可以看出，瑞格替尼和拉帕替尼对不同的肿瘤细胞联合使用时，其CI值基本都在小于1的范围内，表示瑞格替尼和拉帕替尼在本发明的用量范围内联合使用具有很好的协同作用。
[0042] 表1瑞格替尼和拉帕替尼联合作用HCT116和SW620的CI值
[0043]
[0044] 实施例3瑞格替尼和拉帕替尼单独及联合使用后对HCT116和SW620细胞的细胞周期的影响
[0045] 用流式细胞术检测瑞格替尼和拉帕替尼单独使用及它们联合使用后引起结直肠癌细胞HCT116和SW620的细胞周期阻滞情况。先将HCT116和SW620细胞分别以每孔5
3×10个细胞的密度接种到6孔板上，待细胞贴壁后，再将HCT116和SW620细胞各分为四个实验组，分别加入下列溶液：第一组为对照组不处理；第二组为瑞格替尼单独处理组(浓度为3μM，10μM，30μM三个梯度)；第三组为拉帕替尼单独处理组(浓度为3μM，10μM，
30μM三个梯度)；第四组为瑞格替尼和拉帕替尼联合处理组(联合用药浓度为瑞格替尼
10μM+拉帕替尼10μM)。共同处理48h后，用胰酶消化的办法收获这些细胞，1000转离心
5min，去掉上清，后分别用带血清的培养基和磷酸盐缓冲液(PBS)清洗一次。加入体积分数为70％的乙醇冰上固定2h，1000转离心5min，去掉上清，PBS清洗一次后加入200μL碘化丙锭(PI)染色液室温避光反应30min，样品随后用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。
3×10个细胞的密度接种到6孔板上，待细胞贴壁后，再将HCT116和SW620细胞各分为四个实验组，分别加入下列溶液：第一组为对照组不处理；第二组为瑞格替尼单独处理组(浓度为3μM，10μM，30μM三个梯度)；第三组为拉帕替尼单独处理组(浓度为3μM，10μM，
30μM三个梯度)；第四组为瑞格替尼和拉帕替尼联合处理组(联合用药浓度为瑞格替尼
10μM+拉帕替尼10μM)。共同处理48h后，用胰酶消化的办法收获这些细胞，1000转离心
5min，去掉上清，后分别用带血清的培养基和磷酸盐缓冲液(PBS)清洗一次。加入体积分数为70％的乙醇冰上固定2h，1000转离心5min，去掉上清，PBS清洗一次后加入200μL碘化丙锭(PI)染色液室温避光反应30min，样品随后用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。
[0046] 结果如图3和图4所示，瑞格替尼(10μM)和拉帕替尼(10μM)单独处理HCT116和SW620细胞时，其G0/G1期细胞较对照组相比有一定的增加。而用瑞格替尼(10μM)和拉帕替尼(10μM)联合处理HCT116和SW620细胞后，HCT116细胞其G0/G1期的细胞比率分别上升到77.87％，与对照组相比具有显著性变化，SW620细胞周期没有明显的变化。这表明瑞格替尼和拉帕替尼的联合使用可显著引起HCT116细胞阻滞在G0/G1期，从而抑制细胞增殖。
[0047] 实施例4瑞格替尼和拉帕替尼单独使用及联合使用后诱导HCT116和SW620的细胞凋亡的影响
[0048] 用流式细胞术检测瑞格替尼和拉帕替尼单独使用及它们联合使用后诱导HCT1165
和SW620的细胞凋亡情况。先将HCT116和SW620细胞分别以每孔3×10个细胞的密度接种到6孔板上，待细胞贴壁后，按实施例3分组给药。共同处理48h后，用胰酶消化的办法收获这些细胞，1000转离心5min，去掉上清，后PBS清洗一次。用200μL 1×Binding buffer重悬后，加入10μL FITC染色液室温避光反应10min，后再加入5μL PI染色液室温避光反应10min，样品随后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
和SW620的细胞凋亡情况。先将HCT116和SW620细胞分别以每孔3×10个细胞的密度接种到6孔板上，待细胞贴壁后，按实施例3分组给药。共同处理48h后，用胰酶消化的办法收获这些细胞，1000转离心5min，去掉上清，后PBS清洗一次。用200μL 1×Binding buffer重悬后，加入10μL FITC染色液室温避光反应10min，后再加入5μL PI染色液室温避光反应10min，样品随后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
[0049] 结果如图5和图6所示，HCT116和SW620细胞经瑞格替尼(10μM)单独处理后的细胞凋亡率分别仅为26.01％和10.10％；HCT116和SW620细胞经拉帕替尼(10μM)单独处理后的细胞凋亡率分别仅为22.98％和11.24％；而用上述用量的瑞格替尼和拉帕替尼联合处理HCT116和SW620细胞后，细胞的凋亡率分别上升到48.55％和18.08％。这些结果表明，瑞格替尼和拉帕替尼的联合使用可显著引起肿瘤细胞发生凋亡。
[0050] 实施例5瑞格替尼和拉帕替尼单独处理及联合处理后HCT116和SW620细胞内相关蛋白的表达情况
[0051] 利用Western blot方法检测对经瑞格替尼和拉帕替尼分别单独处理及联合处理后结直肠癌细胞HCT116和SW620细胞内周期表达相关蛋白的表达情况。先将HCT116和5
SW620细胞分别以每孔3×10个细胞的密度接种到6孔板上，待细胞贴壁后，按实施例3分组给药。共同处理48h后，分别收取各组细胞全蛋白。先经SDS电泳后，将蛋白转移至PVDF膜上，用质量体积比为5％的BSA室温封闭2h，敷上所需检测的蛋白相对应的一抗(其中Anti-Cyclin B(610219)、Anti-CDK1(610037)、Anti-Cyclin E(551159)、Anti-CCND1(554181)均购于BD生物公司；
Anti-Cyclin A(SC-596)购于SANTA公司；Anti-CDK6(3524-1)购于Abcam公司；Anti-panAKT(4691)、Anti-p-AKT(4060)、Anti-Bax(2772)均购于Cell Signaling Technology公司，)，4℃孵育过夜。第二天回收一抗，用TBST清洗3次，每次10min，后孵上二抗(Goat anti-rabbit IgG-HRP SC2004，Goat anti-mouse IgG-HRP SC2003购于SANTA公司)，室温孵育1h。后用TBST清洗3次，每次
10min。之后均匀涂上发光液，于凝胶成像系统上观察。
SW620细胞分别以每孔3×10个细胞的密度接种到6孔板上，待细胞贴壁后，按实施例3分组给药。共同处理48h后，分别收取各组细胞全蛋白。先经SDS电泳后，将蛋白转移至PVDF膜上，用质量体积比为5％的BSA室温封闭2h，敷上所需检测的蛋白相对应的一抗(其中Anti-Cyclin B(610219)、Anti-CDK1(610037)、Anti-Cyclin E(551159)、Anti-CCND1(554181)均购于BD生物公司；
Anti-Cyclin A(SC-596)购于SANTA公司；Anti-CDK6(3524-1)购于Abcam公司；Anti-panAKT(4691)、Anti-p-AKT(4060)、Anti-Bax(2772)均购于Cell Signaling Technology公司，)，4℃孵育过夜。第二天回收一抗，用TBST清洗3次，每次10min，后孵上二抗(Goat anti-rabbit IgG-HRP SC2004，Goat anti-mouse IgG-HRP SC2003购于SANTA公司)，室温孵育1h。后用TBST清洗3次，每次
10min。之后均匀涂上发光液，于凝胶成像系统上观察。
[0052] 结果如图7所示，在HCT116细胞中，当用瑞格替尼和拉帕替尼单独及联合用药处理时，周期相关蛋白CCND1、CCNB、CCNE、CCNA、CDK1和CDK6的表达都呈下调的趋势，并且联合组与各个单药组相比表达具有明显的差异；在SW620细胞中，单药瑞格替尼处理后，同样引起上述周期相关蛋白的下调表达变化；而用拉帕替尼单药处理时，只有CCNA、CDK1和CDK6的表达呈下调的趋势；联合用药组与单药组相比并没有明显的统计学差异。这些周期相关蛋白的表达变化，与流式结果是相一致的，说明瑞格替尼药物作用使HCT116和SW620细胞阻滞在G1期，拉帕替尼药物作用使HCT116细胞也阻滞在G1期。虽然拉帕替尼对SW620细胞的周期阻滞没有明显的检测到某个时期的分布比例变化，但是很有可能是因为随着浓度的增加，拉帕替尼对SW620是全周期阻滞，进而引起细胞凋亡。
[0053] 不管是单独处理还是联合用药，凋亡相关蛋白Bax的表达显著升高，说明细胞凋亡的发生。而通路相关蛋白AKT磷酸化水平的变化，当用瑞格替尼和拉帕替尼分别单独处理及联合处理后，总体都呈下调的趋势，说明AKT蛋白是药物发挥作用的主要通路之一。
[0054] 综上所述，通过分子水平检测相关蛋白的表达变化，说明了药物作用引起细胞周期的G0/G1期阻滞以及引起细胞凋亡的现象，并且药物是有通过AKT信号通路发挥作用的。
[0055] 实施例6瑞格替尼和拉帕替尼单独给药及联合给药后对裸鼠移植瘤生长的抑制情况
[0056] 以裸鼠(雌性，4～5周龄，14～17g/只，购于广东省医学实验动物中心)为实7
验动物。取对数生长期的结肠癌HCT116细胞悬液，调整到每100微升5×10个细胞，取
7 2
100μL(5×10个细胞)左前肢腋窝皮下注射接种于裸鼠。待移植瘤长到接近2×2cm 大小
2
时，将抑制瘤取出来，平均切成0.3×0.3cm大小，移植到28只裸鼠左前肢腋窝皮下。待移
2
植3～4天左右，肿瘤组织生长至约0.5×0.5cm大小时，裸鼠被随机分成4组，每组7只。
分别以灌胃给药的方式给予质量分数为0.5％的羟丙基甲基纤维素和质量分数为0.1％的吐温-80(对照组)，瑞格替尼50mg/kg，拉帕替尼100mg/kg及联合给予瑞格替尼50mg/kg和拉帕替尼100mg/kg。每天给一次药，每天用电子称取裸鼠体重，用电子游标卡尺测量肿瘤大小。肿瘤体积计算公式为V＝π/6(A+B)3/2，A代表肿瘤长度，B代表肿瘤宽度。给药
21天后，处死裸鼠，取全血，取出肿瘤并称重。
验动物。取对数生长期的结肠癌HCT116细胞悬液，调整到每100微升5×10个细胞，取
7 2
100μL(5×10个细胞)左前肢腋窝皮下注射接种于裸鼠。待移植瘤长到接近2×2cm 大小
2
时，将抑制瘤取出来，平均切成0.3×0.3cm大小，移植到28只裸鼠左前肢腋窝皮下。待移
2
植3～4天左右，肿瘤组织生长至约0.5×0.5cm大小时，裸鼠被随机分成4组，每组7只。
分别以灌胃给药的方式给予质量分数为0.5％的羟丙基甲基纤维素和质量分数为0.1％的吐温-80(对照组)，瑞格替尼50mg/kg，拉帕替尼100mg/kg及联合给予瑞格替尼50mg/kg和拉帕替尼100mg/kg。每天给一次药，每天用电子称取裸鼠体重，用电子游标卡尺测量肿瘤大小。肿瘤体积计算公式为V＝π/6(A+B)3/2，A代表肿瘤长度，B代表肿瘤宽度。给药
21天后，处死裸鼠，取全血，取出肿瘤并称重。
[0057] 结果如图8和表2所示，在上述单独给药的情况下，瑞格替尼和拉帕替尼都能在一定程度上抑制移植瘤的生长，其抑制率分别为28.68％和22.46％，当瑞格替尼和拉帕替尼联合给药时，其抑制率达到72.10％，具有显著效果。而且联合给药组裸鼠的体重与对照组相比没有显著下降，表明其对裸鼠的安全性比较高。这些结果都表明，瑞格替尼和拉帕替尼这两个药物的联合使用对肿瘤的生长具有更强的抑制效果。
[0058] 表2瑞格替尼和拉帕替尼单独给药及联合给药后小鼠体重、肿瘤重量及抑瘤率结果
[0059]
[0060] 实施例7瑞格替尼和拉帕替尼单独给药及联合给药后小鼠血清中血药的浓度曲线
[0061] 利用高效液相色谱(HPLC)的方法检测血清中药物的浓度。通过眼球取裸鼠(实施例6中给药21天后处死的小鼠)全血，在4℃静止过夜，低速离心，吸取上层血清。将血清用二倍乙腈沉淀处理后高速离心，上清即为HPLC上样样品。所用的柱子Athena C18(8.462571.0001)，色谱级试剂乙腈(75-05-8)，三氟乙酸(76-05-8)均购买自上海安谱生物公司。吸收峰设置为262nm，梯度洗脱条件如表3所示。其中A液为含体积分数为0.1％TFA的乙腈，B液为含体积分数为0.1％TFA的超纯水。在48.8～50000ng/mL浓度范围内，按照三倍梯度配置标准品，构建log后的标准曲线，瑞格替尼对应的标准曲线是y＝0.927x+5.216，拉帕替尼对应的标准曲线是y＝1.033x+4.699。将测试样品得到的吸收峰值带入标准曲线，还原处理过程中的稀释倍数，得到血清中药物的浓度。
[0062] 表3HPLC梯度洗脱条件
[0063]
[0064] 结果如图9所示：可以看到联合组中和瑞格替尼单药组中瑞格替尼的药物浓度分别为1.969±0.912μg/mL和1.461±0.314μg/mL。在联合组和拉帕替尼单药组中拉帕替尼的药物浓度分别为0.693±0.298μg/mL和0.573±0.510μg/mL。联合组和单药组中同一药物的浓度并没有显著性差异，这说明瑞格替尼和拉帕替尼联合给药，并不影响每个单药的代谢，两个药物之间不会产生负面的相互干扰。也在另一方面支持了瑞格替尼和拉帕替尼联合用药的可行性。
[0065] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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