GPR1靶点及其拮抗剂与抗肿瘤相关的应用
阅读：559发布：2022-12-29
专利汇可以提供GPR1靶点及其拮抗剂与抗肿瘤相关的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了GPR1靶点及其拮抗剂与抗 肿瘤 相关的应用。本发明公开了一种GPR1基因或GPR1蛋白的拮抗剂在制备 预防 或 治疗 肿瘤或其增殖和迁移的药物中的用途。还公开了一种GPR1基因或GPR1蛋白作为预防和/或治疗肿瘤治疗靶点、或者作为肿瘤诊断靶点、或者用于治疗或预防肿瘤的药物靶点的用途。，下面是GPR1靶点及其拮抗剂与抗肿瘤相关的应用专利的具体信息内容。
1.一种GPR1基因或GPR1蛋白在筛选用于治疗或预防肿瘤的药物靶点的用途。
2.一种GPR1基因或GPR1蛋白作为预防和/或治疗肿瘤治疗靶点、或者作为肿瘤诊断靶点的用途。
3.一种GPR1基因的拮抗剂或GPR1蛋白的拮抗剂在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
4.一种GPR1基因的拮抗剂或GPR1蛋白的拮抗剂在制备预防或治疗肿瘤增殖和迁移的药物中的用途。
5.一种GPR1基因的拮抗剂或GPR1蛋白的拮抗剂预防或治疗肿瘤的用途。
6.一种GPR1基因的拮抗剂或GPR1蛋白的拮抗剂预防或治疗肿瘤增殖和迁移的用途。
7.根据权利要求3-6的用途，GPR1基因的拮抗剂或GPR1蛋白的拮抗剂选自GPR1抗体、GPR1受体抗体、修饰的GPR1、GPR1的部分肽、靶向GPR1基因序列的siRNAs、shRNAs、反义分子和DNA酶，或者包含siRNAs、shRNAs、反义分子的表达载体。
8.根据权利要求3-6的用途，GPR1基因的拮抗剂或GPR1蛋白的拮抗剂是一种表达载体，表达载体包括启动子和可操作连接到上述启动子的核酸插入物，所述核酸插入物，所述插入物为shRNA。
9.根据权利要求1-7任一项所述的用途，肿瘤优选为绒毛膜癌、胎盘绒毛癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、头颈癌、肉瘤、胆管癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、睾丸癌、肺癌、胃癌。
10.一种预防和治疗肿瘤或者预防或治疗肿瘤增殖和迁移的方法，其包括敲除或敲弱GPR1基因，或者调低GPR1的表达水平的步骤；优选地，该步骤通过GPR1拮抗剂实现。
GPR1靶点及其拮抗剂与抗肿瘤相关的应用
技术领域
背景技术
[0002] Chemerin一方面作为趋化因子，趋化树突状细胞和巨噬细胞，在免疫和适应性免疫之间起桥梁作用；另一方面作为新的脂肪因子，由脂肪组织分泌产生，调节脂肪细胞的分化、脂解，可促进脂肪细胞内胰岛素信号传导途径等生物学效应。越来越多的研究表明Chemerin及其受体的信号异常与癌症发生和发展之间有着密切关联，Chemerin在大多数肿瘤内部的表达水平很低，有的甚至检测不到，但是在癌旁组织，及远端的正常组织中，Chemerin的表达水平较高。
[0003] GPR1作为Chemerin的三个受体之一，属于G蛋白偶联受体(GPCRs)超家族一员，具有7个跨膜螺旋(7TM)结构，在脂肪和性腺组织均有表达。GPCRs在胞外信号向胞内转导过程中起到重要的作用，调控着细胞运动、生长和基因转录—这三个癌症生物学中至关重要的因素。过去的十几年中，介导的信号通路已经被证明是原癌基因信号的关键调控者，并且是很好的药物靶点，目前市面上出售的药物60％都是针对该受体设计的。但是目前，仍然没有任何药物是直接针对GPR1来治疗临床癌症的。因此，以GPR1为靶标，筛选抗癌的新型多肽药物和人源化抗体具有重要的社会意义和广阔的经济市场。
[0004] 绒毛膜癌(Choriocarcinoma)
[0005] 绒毛膜癌是发生于胎盘外层的绒毛膜上皮细胞(即滋养叶细胞)的一种高度恶性的肿瘤。继发于葡萄胎、流产或足月分娩以后。其发病率为0.0001％～0.36％，少数可发生于异位妊娠后。绒毛膜癌损害卵巢正常功能，严重危害育龄妇女的生殖健康。绒毛膜癌的感染途径有多种，可以通过临近器官的症波及而来，如阑尾等。也可经过淋巴道、血行播散等，性接触，不注意卫生也会引起绒症，如未及时治疗，可演变成慢性绒毛膜癌，阻塞输卵管，导致宫外孕或不孕症。
[0006] 绒毛膜癌的治疗以化疗为主，手术为辅。化学药物治疗居多，在一般早期病例，可单用一种药物，以5-Fu为首选。如病情急或已到晚期、则需二种或二种以上药物合用。常用的为5—氟脲嘧啶(5－Fu)加更生霉素(ksm)。5－Fu、ksm疗效最好，副作用小、对肺、消化道、泌尿道及生殖道的转移均有效。可用作静脉给药，动脉灌注，腔内或瘤内注射，也可口服。
[0007] 在病灶大，估计化疗不能完全治疗或治疗过程中HCG下降缓慢者，子宫穿孔肝内转移灶出血等，为挽救病人生命，手术仍然是治疗绒毛膜癌的重要方法。一般行次广泛子宫切除及双侧附件大网膜及宫旁静脉丛及卵巢静脉丛切除。
[0008] 乳腺癌(Breast Cancer)
[0009] 乳腺癌是仅次于肺癌的全球第二高死亡率的致命性癌症，中国女性乳腺癌年龄标化发病率为21.6/10万，居女性癌症发病的第1位；死亡率为5.7/10万，居女性癌症死亡的第6位。4％～6％乳腺癌诊断时即为转移性乳腺癌，而接受辅助治疗的早期患者30％～40％可发展为转移性乳腺癌，患者5年生存率约20％。
[0010] 肥胖与乳腺癌的相关性研究最早见于20世纪60年代，Dewaard等的病例对照研究最早提出乳腺癌的发病倾向于绝经后肥胖及高血压病的女性。在动物实验研究中也发现，与对照组相比，肥胖的小鼠肿瘤生长速度明显增加。Meta分析显示，患乳腺癌的危险性随BMI增加而增加，BMI＞30kg/m2的患者患乳腺癌的风险是正常人的1.3～2倍，肥胖可显著增加女性患乳腺癌的风险。
发明内容
[0011] 本发明的主要目的在于寻找抗肿瘤的新靶点，以更好地预防和/或治疗肿瘤，控制肿瘤的增殖和迁移。发明人在研究中发现，利用基因敲除技术或shRNA方式干扰GPR1的基因表达，或者，利用特异性抗体。干扰GPR1受体的作用，可以有效抑制人绒毛膜癌细胞和乳腺癌细胞体外体内的增殖和迁移。
[0012] 本发明一个方面提供了一种GPR1基因或GPR1蛋白在筛选用于治疗或预防肿瘤的药物靶点的用途。
[0013] 本发明另一个方面提供了一种GPR1基因或GPR1蛋白作为预防和/或治疗肿瘤治疗靶点、或者作为肿瘤诊断靶点的用途。
[0014] 本发明另一个方面提供了一种GPR1基因或GPR1蛋白的拮抗剂在制备预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
[0015] 在本发明的具体技术方案中，公开了GPR1基因或GPR1蛋白的拮抗剂在制备预防或治疗肿瘤增殖和迁移的药物中的用途。
[0016] 本发明另一个方面提供了一种GPR1基因或GPR1蛋白的拮抗剂预防或治疗肿瘤的用途。
[0017] GPR1基因或蛋白的拮抗剂选自GPR1抗体、GPR1受体抗体、修饰的GPR1、GPR1的部分肽、靶向GPR1基因序列的siRNAs、shRNAs、反义分子和DNA酶，或者包含siRNAs、shRNAs、反义分子的表达载体；例如，所述的shRNA如SEQ ID No.1所示。
[0018] 在本发明的另一具体实验中，利用特异性干扰GPR1基因表达的shRNA序列，建立了利用shRNA干扰敲弱GPR1基因的人绒毛膜癌细胞JEG-3，体外细胞群落增殖实验显示，与对照组相比，敲弱GPR1基因的人绒毛膜癌细胞的增殖显著受到抑制。进一步，通过划痕实验发现，与对照组相比，敲弱GPR1基因的人绒毛膜癌细胞的迁移能力受到显著抑制。
[0019] 本发明再一个方面提供了一种GPR1基因或GPR1蛋白的拮抗剂，其是一种表达载体，表达载体包括启动子和可操作连接到上述启动子的核酸插入物，所述核酸插入物，所述插入物为shRNA，例如，如SEQ ID No.1的shRNA。
[0020] 在本发明的一个具体实验中，利用特异性干扰GPR1基因表达的shRNA序列，建立了利用shRNA干扰敲弱GPR1基因的人乳腺癌细胞HCC1937和MDA-MAB-231，体外细胞群落增殖实验显示，与对照组相比，敲弱GPR1基因的人乳腺癌细胞的增殖显著受到抑制。进一步，通过划痕实验发现，与对照组相比，敲弱GPR1基因的人乳腺癌细胞的迁移能力受到显著抑制。
[0021] 从而，本发明提供了一种预防和/或治肿瘤的方法，该方法包括：以GPR1为靶点，降低GPR1的表达水平和/或拮抗GPR1的作用，以预防和/或治疗肿瘤。具体地，可以是利用针对GPR1的拮抗剂降低GPR1的表达水平(敲除GPR1基因或敲弱GPR1基因的表达水平)和/或拮抗GPR1的作用。
[0022] 在本发明中，所述GPR1(G Protein-Coupled Receptor 1，G蛋白偶联受体-1)是趋化因子/脂肪因子chemerin的受体之一，属于G蛋白偶联受体家族。
[0023] 本发明所述的GPR1基因为现有技术中已知基因且是唯一的序列，在NCBI的GeneID:NM_146250。具体序列如下SEQ ID No.4所示:
[0024]atggaagtctcaaaggaaatgttatttgaggagttggacaactattcctatgccttagattattactcccaggagtctgacccggaggagaaggtgtacctgggactcgttcactggatctccctgttcttatatgccctagcatttgttctgggcatcccaggaaatgccatcgtcatttggctcatgggattcaagtggaagaagacagtcaccactctttggttcctcaatctggccatcgcagacttcatctttgttctcttcctgcccctgtacatttcctacgtggccttgagtttccactggccctttggcctgtggctctgcaaggttaattccttcattgcccaactgaacatgttttccagtgttttcttcttgacagtgatcagcctggaccgctacatccacttgctccatcctggcttgtctcatcggcaccggactctaaagagctcactggttgttgttatacttgtctggctgttggcttctctgcttggaggtcctaccttatacttccgggacaccatggaggtcaacaaccacatcatttgttataataatttccaggagcatgaactcaccttgatgagacaccatgttctgacctgggtgaagttcctctttggctacctcttccctttgctaaccatgagctcctgctacttgtgcctcatcttcaagatgaaaaagcggaacatcctgatatctagaaagcatctctggatgatcctgtctgtggtcattgccttcttggtttgctggaccccttatcacctgtttagcatctgggagctcagcattcatcacaacagctctttccagaatgtgctgcagggtggaatccccctctcaactggcttagccttcctcaatagctgcttgaatcccatcctttacgtcctaataagcaagacgttccaagcccgcttcagggcctctgttgctgaggtactaaagcgttcgctgtgggaagccagctgctctggtacagtcagtgaacaactcaggagtgctgaaaccaagagcctgtctctcctagaaactgcccagtga SEQ ID No.4。
[0025] 在本发明中，所用术语“肿瘤”和“癌症”代表相同的含义，其均为组织中细胞不正常的分裂繁殖。肿瘤一般呈现局部或完全缺少结构组织性以及与正常组织的功能协调性，且通常形成与区别的组织团块，其可为良性的或恶性的。本文所用术语可恶性肿瘤或恶性瘤，也可为良性肿瘤。通常情况下除非给予足够治疗，否则这些恶性肿瘤可以侵入组织周围，可以转移至各不相同的位置，且可能在试图移除后再复发并引起病患的死亡。
[0026] 在本发明中，所述的肿瘤优选为绒毛膜癌、胎盘绒毛癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、头颈癌、肉瘤、胆管癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、睾丸癌、肺癌、胃癌。
[0027] 在本发明中，所述治疗和预防肿瘤是指预防或治疗肿瘤的增殖和迁移。
[0028] 在本发明中，所用术语“拮抗剂”和“抑制剂”具有相同含义，指所述针对GPR1的为任何可降低GPR1的表达水平、拮抗GPR1的作用、抑制GPR1与配体结合的任何试剂。这种拮抗剂通过多种方式来实现这一作用。一类拮抗剂会以足够的亲和力和特异性结合GPR1蛋白，以中和GPR1蛋白的生物效应。这类分子包括抗体和抗体片断。另一类拮抗剂包含蛋白质的片断、突变蛋白质或有机小分子，即模拟肽，它们将结合GPR1或GPR1结合配偶体，例如具有阻断趋化素与GPR1结合的化合物或者小分子多肽，从而抑制GPR1的生物活性。GPR1拮抗剂可为任何这些类别，只要它是抑制GPR1生物活性的物质。GPR1拮抗剂包括GPR1抗体、GPR1受体抗体、修饰的GPR1和GPR1的部分肽。另一类GPR1拮抗剂包括本文公开的本领域所公知的靶向GPR1基因序列的siRNAs、shRNAs、反义分子和DNA酶。这样的试剂对于本领域技术人员而言可根据现有技术获得，可以是现有技术中已知的任何可降低GPR1的表达水平和/或拮抗GPR1的作用的拮抗剂本身，也可是基于该分子式进行修饰、改构后仍具有降低GPR1的表达水平和/或拮抗GPR1作用的功能的试剂。
[0029] 在本发明的一优选具体实施方案，所述针对GPR1的拮抗剂为小分子拮抗剂，例如shRNA等。更优选地，所述shRNA具有如SEQ ID No.1所示序列。
[0030] 有益效果
[0031] 本发明证实了GPR1基因与多种肿瘤之间的联系，其可以作为预防和治疗绒毛膜癌和乳腺癌的靶点，利用任何技术干扰GPR1基因表达或干预GPR1的作用，可以有效的抑制绒毛膜癌、乳腺癌细胞增殖和迁移；为疾病的预防、诊断和治疗提供了依据。附图说明
[0032] 图1：shRNA GPR1敲低GPR1蛋白表达水平后抑制JEG3绒毛膜癌细胞增殖能力。
[0033] 图2：shRNA GPR1敲低GPR1蛋白表达水平后抑制JEG3绒毛膜癌细胞迁移能力。
[0034] 图3：shRNA GPR1敲低GPR1蛋白表达水平后抑制乳腺癌细胞增殖能力。
[0035] 图4：shRNA GPR1敲低GPR1蛋白表达水平后抑制乳腺癌细胞迁移能力。
具体实施方式
[0036] 为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
[0037] 实施例1：干扰GPR1的基因表达，或拮抗GPR1的作用，可有效抑制人绒毛膜癌细胞的增殖和迁移。
[0038] 本实施例验证了干扰GPR1的基因表达，或拮抗GPR1的作用，可有效抑制人绒毛膜癌细胞的增殖和迁移。其中，设计特异性干扰GPR1基因表达的shRNA序列，利用shRNA干扰敲弱GPR1基因的人绒毛膜癌细胞系。
[0039] 体外细胞群落增殖实验显示，与对照组相比，敲弱GPR1基因的人绒毛膜癌细胞的增殖显著受到抑制。进一步，通过划痕实验发现，与对照组相比，敲弱GPR1基因的人绒毛膜癌细胞的迁移能力受到显著抑制。
[0040] 具体如下：
[0041] 1、建立敲弱了GPR1基因的人绒毛膜癌细胞系。
[0042] 本实验中所用人GPR1基因shRNA为pSM2c-Hu-shGPR1(购自Open Biosystems)，small Hairpin序列：
[0043] 5’-TGCTGTTGACAGTGAGCGCACTCTCTGATTGTCATTATATTAGTGAAGCCACAGATGTAATATAATGACAATCAGAGAGTTTGCCTACTGCCTCGGA-3’(SEQ ID No.1)。对照组为pSM2c-Hu-scramble shRNA。
[0044] ①选取生长旺盛的绒毛膜癌细胞：JEG3，在转染前一天以5×105个/孔，接种于6孔板中，培养至第二日后，细胞融合度为60％；
[0045] ②第二日进行转染，以6孔板的一个培养孔为单位，用200μL的opti-MEM培养基稀释3μg质粒，另以200μL的opti-MEM培养基稀释6μL脂质体Lipofectamine 2000，分别轻轻混匀后，室温放置5分钟；
[0046] ③将两管稀释液轻轻混合，室温静置20分钟；
[0048] ⑤培养4～6小时后弃尽转染所用培养基，向孔中加入3mL完全培养基；
[0049] ⑥48小时后选用含有1μg/mL嘌呤霉素(puromycin)的培养基进行筛选；待细胞不再出现死亡后即得到稳定表达GPR1shRNA的绒毛膜癌细胞系。
[0050] ⑦用TRIzol提取总RNA，定量2μg RNA进行逆转录(逆转录试剂盒，购于Promega公司)，并用特异引物序列进行qPCR。
[0051] 所用特异引物序列为Hu-GPR1引物序列：
[0052] Fw 5’-AATGCCATCGTCATTTGGTT-3’(SEQ ID No.2)
[0053] Rv 5’-CAACTGGGCAGTGAAGGAAT-3’(SEQ ID No.3)
[0054] ⑧与转染了pSM2c-Hu-scramble shRNA的绒毛膜癌细胞(即转染了空载体的绒毛膜癌细胞系,JEG3)做比较，GPR1基因表达水平仅为其38％±2.57％，作为敲弱了GPR1基因的人绒毛膜癌细胞系，并命名为：JEG3-shGPR1/LRH；即可用后续实验。
[0055] 2、敲弱了GPR1基因的人绒毛膜癌细胞系的体外增殖和迁移实验。
[0056] (1)MTT增殖实验：
[0057] 1)将绒毛膜癌细胞JEG3-shGPR1/LRH以10000个/孔密度接种于96孔细胞培养板中，每孔培养基体积为200μL，分别培养0小时、12小时、24小时、48小时、72小时；同时以转染了空载体的绒毛膜癌细胞系设立阴性对照。
[0058] 2)分别于不同检测时间点将20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续放入二氧化碳培养箱中培养4小时；
[0059] 3)弃上清，加入150μL DMSO(二甲基亚砜)，震荡10分钟，在酶标仪上选择490nm波长进行检测，计算细胞增殖率。在培养的不同时间在酶标仪上测出的OD值不同，不同时间点OD值与0小时时的OD值的比值即细胞增殖率。
[0060] 试验结果参见附图1，试验结果显示，相比于转染了空载体的绒毛膜癌细胞系，敲弱了GPR1基因的人绒毛膜癌细胞系JEG3-shGPR1/LRH的细胞增殖率显著下降，在24小时，48小时以及72小时时二者的细胞增殖率均有显著性差异，且随着时间的增长，二者差距逐渐增加：在24小时时，对照组增殖了1.69倍，GPR1敲弱组增值了1.4倍；48小时时，对照组增殖了3.3倍，GPR1敲弱组增值了2.98倍；72小时时，对照组增殖了5.6倍，GPR1敲弱组增值了4.57倍。试验结果证明，当GPR1基因的被抑制，则相应的绒毛膜癌细胞增殖率也会下降，即通过抑制GPR1基因或其表达，可以有效地抑制绒毛膜癌细胞增殖。
[0061] (2)划痕实验
[0062] 1)先用marker笔在6孔板背后，均匀划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线；
[0063] 2)分别在孔中加入约2×106个JEG3细胞：JEG3-shGPR1/LRH和未处理过的绒毛膜癌细胞，过夜铺满；
[0064] 3)次日，用枪头垂直于背后横线划痕；
[0065] 4)用PBS洗细胞3次，去掉划下细胞，加入无血清或低血清培养基；
[0066] 5)放入37℃培养箱中培养，分别于培养0小时，12小时，24小时后取样拍照。
[0067] 试验结果见附图2。其中pSM2C shGPR1为JEG3-shGPR1/LRH组，pSM2C empty vector为转染了空载体的绒毛膜癌细胞系。在12小时和24小时的迁移距离做归一化统计，可以看出(右图)GPR1被抑制的绒毛膜癌细胞的迁移距离要明显低于转染了空载体的绒毛膜癌细胞系，且在12小时时和24小时时均有显著性差异：12小时时，对照组为1，GPR1敲弱组为0.709；24小时时，对照组为1，GPR1敲弱组为0.762。试验结果说明抑制绒毛膜癌细胞的GRP1可以有效地抑制细胞的迁移。
[0068] 实施例2、干扰GPR1的基因表达，或拮抗GPR1的作用，可有效抑制抑制人乳腺癌细胞的增殖和迁移。
[0069] 本实施例验证了干扰GPR1的基因表达，或拮抗GPR1的作用，可有效抑制抑制人乳腺癌细胞的增殖和迁移。其中，设计特异性干扰GPR1基因表达的shRNA序列，利用shRNA干扰敲弱GPR1基因的人乳腺癌细胞系。
[0070] 体外细胞群落增殖实验显示，与对照组相比，敲弱GPR1基因的人乳腺癌细胞的增殖显著受到抑制，如图4所示HCC1937细胞24小时时，对照组增殖2.08倍，敲弱GPR1基因组增殖1.3倍；48小时时，对照组增殖2.85倍，敲弱GPR1基因组增殖1.98倍；72小时时，对照组增殖4.78倍，敲弱GPR1基因组增殖3.51倍。MDA-MB-231细胞24小时时，对照组增殖3.01倍，敲弱GPR1基因组增殖1.97倍；48小时时，对照组增殖4.2倍，敲弱GPR1基因组增殖2.94倍；72小时时，对照组增殖6.77倍，敲弱GPR1基因组增殖5.23倍。进一步，通过划痕实验发现，与对照组相比，敲弱GPR1基因的人乳腺癌细胞的迁移能力受到显著抑制：HCC1937细胞24小时时，对照组迁移距离为0.26cm，敲弱GPR1基因组迁移距离为0.08cm；48小时时，对照组迁移距离为0.46cm，敲弱GPR1基因组迁移距离为0.21cm。MDA-MB-231细胞24小时时，对照组迁移距离为0.36cm，敲弱GPR1基因组迁移距离为0.29cm；48小时时，对照组迁移距离增加了0.33cm，而敲弱GPR1基因组迁移距离仅增加0.16cm。
[0071] 具体试验方法如下：
[0072] 1、建立敲弱了GPR1基因的人乳腺癌细胞系。
[0073] 本实验中所用人GPR1基因shRNA为pSM2c-Hu-shGPR1(购自Open Biosystems)，Hairpin序列：5’-TGCTGTTGACAGTGAGCGCACTCTCTGATTGTCATTATATTAGTGAAGCCACAGATGTAATATAATGACAATCAGAGAGTTTGCCTACTGCCTCGGA-3’(SEQ ID No.1)。对照组为未进行处理的野生组细胞。
[0074] ①选取生长旺盛的乳腺癌细胞：HCC1937和MDA-MAB-231，在转染前一天以5×105个/孔，接种于6孔板中，培养至第二日后，细胞融合度为60％；
[0075] ②第二日进行转染，以6孔板的一个培养孔为单位，用200μL的opti-MEM培养基稀释3μg质粒，另以200μL的opti-MEM培养基稀释6μL脂质体Lipofectamine 2000，分别轻轻混匀后，室温放置5分钟；
[0076] ③将两管稀释液轻轻混合，室温静置20分钟；
[0077] ④将待转染的细胞用PBS轻轻漂洗一次，加入600μLopti-MEM培养基，然后将混合好的稀释液轻轻加入培养孔中，置于二氧化碳培养箱中培养；
[0078] ⑤培养4～6小时后弃尽转染所用培养基，向孔中加入3mL完全培养基；
[0079] ⑥48小时后选用含有1μg/mL嘌呤霉素(puromycin)的培养基进行筛选；待细胞不再出现死亡后即得到稳定表达GPR1shRNA的绒毛膜癌细胞系。
[0080] ⑦用TRIzol提取总RNA，定量2μg RNA进行逆转录(逆转录试剂盒，购于Promega公司)，并用特异引物序列进行qPCR。
[0081] 所用特异引物序列为Hu-GPR1引物序列：
[0082] Fw 5’-AATGCCATCGTCATTTGGTT-3’(SEQ ID No.2)
[0083] Rv 5’-CAACTGGGCAGTGAAGGAAT-3’(SEQ ID No.3)
[0084] ⑧与转染了pSM2c-Hu-scramble shRNA的做比较，GPR1基因表达水平仅为其(野生组HCC1937)37％±2.97％，作为敲弱了GPR1基因的人乳腺癌细胞系，并命名为：HCC1937-shGPR1/LRH和MDA-MAB-231-shGPR1/LRH；即可用后续实验。
[0085] 2、敲弱了GPR1基因的人乳腺癌细胞系的体外增殖和迁移实验。
[0086] (1)MTT增殖实验：
[0087] 1)将乳腺癌细胞以2000个/孔密度接种于96孔细胞培养板中，每孔培养基体积为200μL，分别培养12小时、24小时、48小时、72小时；同时设立阴性对照。
[0088] 2)分别于不同检测时间点将20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续放入二氧化碳培养箱中培养4小时；
[0089] 3)弃上清，加入150μL DMSO(二甲基亚砜)，震荡10分钟，在酶标仪上选择490nm波长进行检测，计算细胞增殖率。试验结果见图3。从图3可以看出对于两种乳腺癌细胞而言，通过shRNA的干扰作用，细胞增值率相对于对照组而言显著降低。且这种增值率的降低能够持续进行。
[0090] (2)划痕实验
[0091] 1)先用marker笔在6孔板背后，均匀划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线；
[0092] 2)分别在孔中加入约5×105个乳腺癌细胞：过夜铺满；
[0093] 3)次日，用枪头垂直于背后横线划痕；
[0094] 4)用PBS洗细胞3次，去掉划下细胞，加入无血清或低血清培养基；
[0095] 5)放入37℃培养箱中培养，24h和48h后取样拍照。
[0096] 试验结果见附图4。其中对于HCC1937和MDA-MB-231两种乳腺癌而言，在24小时和24-48小时的迁移距离的统计中，可以看出GPR1被抑制的乳腺癌细胞的迁移距离要明显低于未处理的乳腺癌细胞，且在24小时时和48小时时均有显著性差异。24-48小时的迁移距离低于24小时的迁移距离，说明随着时间的增长，细胞的迁移能力减弱。试验结果说明抑制乳腺癌细胞的GRP1可以有效地抑制细胞的迁移，并随着时间效果越来越明显。
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈