技术领域
[0001] 本
发明属于
有机化学技术领域，尤其涉及一种能抑制人
宫颈癌细胞增殖的药物及检测方法。
背景技术
[0002] 目前，业内常用的
现有技术是这样的：湘西是五步蛇原产地。自古以来蛇毒是宝，五步蛇蛇毒居首，素有“软黄金”之称，但比黄金珍贵。湘西人用蛇毒救人，可追溯到远古时期。湘西人招蛇术，就是最早使用蛇毒的见证。《本草纲目》载：“蛇，春出冬藏，善于收藏阳气、修身养性，全身是宝。”《神农本草经》载：“内达脏腑，外彻肌肤，活血祛
风，清除百毒，补精气、补中气”。中国是最早使用蛇疗治病的国家之一。蛇类入药我国历代传统中医名著都有详尽的记载，并得到广泛的应用，如西汉的《神农本草》、梁的《本草经集注》、宋的《开宝本草》、明的《本草纲目》、《本草图经》、《本草拾遗》和《中国毒蛇学文献》、《贵州药用动物药典》、《中华人民共和国药典》、《中药大词典》、《中国动物药》等。中国
专利申请号：2016102149912，
发明名称：一种玉液琼浆乳状酒及其制备方法，发明公开了一种玉液琼浆乳状酒，包括调制酒及食用胶，所述调制酒及食用胶的重量比为99.1-99.7；所述调制酒包括以下重量份的原料：公丁香8-12份、桂花4-6份、糯米788-1182份、
冰糖39.4-118.2份。其制备方法为将食用胶加入到热
水中密闭搅拌至所述食用胶完全融化，得食用胶溶液；将调制酒与食用胶溶液混合均匀后灌装、冷藏得乳状酒。上述发明虽然公开了乳状酒的制作，但是却无法实现蛇毒乳状酒制备，不能使新鲜蛇毒稳定悬浮于白酒酒液中并且保持蛇毒酶活性。
[0003] 综上所述，现有技术存在的问题是：乳状酒的制作方法无法实现蛇毒乳状酒制备，不能使新鲜蛇毒稳定悬浮于白酒酒液中并且保持蛇毒酶活性。如果单纯的将蛇毒原液混入白酒酒液中，那白酒中的
乙醇成分会使蛇毒酶中活性成分变性且使蛇毒缩水聚体程絮凝状态无法真正溶于酒液中，这样的话在使用药剂时就无法真正发挥蛇毒中活性酶成分对体内癌细泡的抑制作用甚至很可能会出现使用者蛇毒中毒的情况。
[0004] 解决上述技术问题的难度和意义：难度在于要使蛇毒均匀且充分的融于白酒酒液当中的同时还要保持蛇毒酶的活性成分不能变性，这样就必须添加其它合适的成分以达到配成能有效抑制癌细胞的蝮蛇蛇毒药剂。
发明内容
[0005] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种能抑制人宫颈癌细胞增殖的药物及检测方法。
[0006] 本发明是这样实现的，一种能抑制人宫颈癌细胞增殖的药物，所述能抑制人宫颈癌细胞增殖的药物为尖吻蝮蛇蛇毒。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种能抑制人宫颈癌细胞增殖的药物的检测方法包括：
[0008] 步骤一，将白酒与稳定剂溶液以体积比19：1混合，搅拌；
[0009] 步骤二，将新鲜蛇毒加入制备的含有白酒和稳定剂溶液的
混合液中，搅拌；
[0010] 步骤三，将混合液，以MTT法检测对人子宫颈癌细胞生长的作用。
[0011] MTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜(Formazan)颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经
盐酸-异丙醇溶解后为蓝色溶液，通过酶联免疫检测仪在490nm处测定各孔的吸光值。根据OD值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。
[0012] (1)取贴壁的Hela细胞，按传代的操作方法对细胞进行消化，制成细胞悬液，细胞浓度为2.5×103～5×104个/ml(预先算好需要的板数以及每孔加的量，以便控制细胞悬液的量)。
[0013] (2)取96孔板，将细胞悬液接种当中，按10个组接种(1个对照组及9个药物组浓度)，每组8个复孔，每孔200ul放入二
氧化
碳培养箱中继续培养。
[0014] (3)待细胞贴壁且铺满板底后，吸去悬液，以上浓度梯度的药物处理细胞，每孔200ul，对照组加入等量的完全培养液，放入二氧化碳培养箱继续培养72h。
[0015] (4)取出96孔板，吸去上清液，每孔加入100ulMTT液，继续培养4h，吸去上清液，每孔加入DMSO150ul。
[0016] (5)将96孔板置于酶标仪中，震荡15min，
波长调为490nm检测每孔OD值，再计算出各组的抑制率。抑制率＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。
[0017] (6)将HFL1细胞如上述方法步骤做MTT毒性实验，检测。
[0018] 所述能抑制人宫颈癌细胞增殖的药物的检测方法进一步包括：HE
染色，在
显微镜下观察，对照组的Hela细胞，细胞核被苏木素染成深紫色；经尖吻蝮蛇蛇毒处理24h后的Hela细胞，随着浓度升高，细胞体积缩小，胞质致密，形成致密质
块，核染色质致密深染。
[0019] 进一步，所述能抑制人宫颈癌细胞增殖的药物的检测方法随着蛇毒浓度升高，Hela细胞的抑制率表现为上升的趋势，呈浓度依赖性，各实验组与对照组比有统计学意义。
[0020] 进一步，所述能抑制人宫颈癌细胞增殖的药物的检测方法的尖吻蝮蛇蛇毒对Hela细胞及HFL1细胞的生长均有抑制效应，Hela细胞随着蛇毒浓度升高抑制越明显，细胞逐渐死亡，说明具有剂量依赖性，且尖吻蝮蛇蛇毒对Hela细胞的增殖抑制效应比对HFL1细胞的增殖抑制效应要强。
[0021] 综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明通过科学的配伍，利用稳定剂，解决了新鲜蛇毒于酒液中不能保持抑制人宫颈癌细胞活性的问题。本发明中制备的蛇毒乳状酒具有抑制人子宫颈癌细胞生长的作用，抑制率达到20％。
附图说明
[0022] 图1是本发明
实施例提供的能抑制人宫颈癌细胞增殖的药物的检测方法
流程图。
[0023] 图2是本发明实施例提供的对照组与蛇毒酒组示意图；
[0024] 图中：(a)对照组；(b)蛇毒酒组。
具体实施方式
[0025] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0026] 本发明的目的在于克服现有技术中不能使新鲜蛇毒在酒液中保持蛇毒抑制人宫颈癌细胞生长的活性问题，提供一种蛇毒酒制备方法，通过本发明实现新鲜蛇毒酒液保持抑制人宫颈癌细胞生长活性的制备方法。
[0027] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0028] 本发明实施例提供的能抑制人宫颈癌细胞增殖的药物尖吻蝮蛇蛇毒。
[0029] 如图1所示，本发明实施例提供的能抑制人宫颈癌细胞增殖的检测方法包括以下步骤：
[0030] S101：将白酒与稳定剂溶液以体积比19：1混合，搅拌；
[0031] S102：将新鲜蛇毒加入制备的含有白酒和稳定剂溶液的混合液中，搅拌；
[0032] S103：将混合液，以MTT法检测对人子宫颈癌细胞生长的作用。
[0033] MTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜(Formazan)颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经盐酸-异丙醇溶解后为蓝色溶液，通过酶联免疫检测仪在490nm处测定各孔的吸光值。根据OD值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。
[0034] (1)取贴壁的Hela细胞，按传代的操作方法对细胞进行消化，制成细胞悬液，细胞浓度为2.5×103～5×104个/ml(预先算好需要的板数以及每孔加的量，以便控制细胞悬液的量)。
[0035] (2)取96孔板，将细胞悬液接种当中，按10个组接种(1个对照组及9个药物组浓度)，每组8个复孔，每孔200ul放入二氧化碳培养箱中继续培养。
[0036] (3)待细胞贴壁且铺满板底后，吸去悬液，以上浓度梯度的药物处理细胞，每孔200ul，对照组加入等量的完全培养液，放入二氧化碳培养箱继续培养72h。
[0037] (4)取出96孔板，吸去上清液，每孔加入100ulMTT液，继续培养4h，吸去上清液，每孔加入DMSO150ul。
[0038] (5)将96孔板置于酶标仪中，震荡15min，波长调为490nm检测每孔OD值，再计算出各组的抑制率。抑制率＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。
[0039] (6)将HFL1细胞如上述方法步骤做MTT毒性实验，检测。
[0040] 下面结合附图对本发明的应用原理作进一步的描述。
[0041] 为尖吻蝮蛇蛇毒对Hela细胞生长增值的抑制率，随着浓度的增加而增加，有浓度依赖性。稳定剂是从上海山浦化工有限公司购买的叫做CMC
纤维素钠盐的悬浮剂，添加以后能让新鲜蛇毒毒液稳定悬浮于白酒酒液中并且保持蛇毒酶活性。
[0042] 根据表1结果显示，随着蛇毒浓度升高，Hela细胞的抑制率表现为上升的趋势，呈浓度依赖性，各实验组与对照组比有统计学意义(p<0.05)。
[0043] HE染色后，在显微镜下观察，对照组的Hela细胞，细胞核被苏木素染成深紫色，细胞结构清晰，边界清楚。而经尖吻蝮蛇蛇毒处理24h后的Hela细胞，随着浓度升高，细胞体积缩小，胞质致密，形成致密质块，核染色质致密深染。
[0044] 尖吻蝮蛇蛇毒对Hela细胞及HFL1细胞的生长均有抑制效应，Hela细胞随着蛇毒浓度升高抑制越明显，细胞逐渐死亡，说明具有剂量依赖性，且尖吻蝮蛇蛇毒对Hela细胞的增殖抑制效应比对HFL1细胞的增殖抑制效应要强。
[0045] 表1蛇毒酒对人宫颈癌细胞增殖抑制作用
[0046]
[0047] 注：各实验组与对照组的比较，*：P<0.05。
[0048] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
