技术领域
[0001] 本
发明属于医学材料技术和药物领域 ,具体地本发明涉及一种环状RNAs核苷酸,尤其是涉及人环状RNAs核苷酸。该核苷酸可与circ_0001017互补,从而抑制人circ_0001017的表达,与其他抗
肿瘤药物其起到抗肿瘤的作用。
背景技术
[0002] CircRNAs是一种普遍的其分子呈封闭环状结构的RNA,可由外显子或内含子、非编码RNA等环化形成。ADAR1、QKI、 FUS、 HNRNPL和DHX9等参与了circRNAs形成过程的调控。CircRNAs通过多种方式发挥作用,研究表明circRNAs含有miRNA应答元件可以竞争性结合miRNA,通过影响miRNA方式调节基因表达的;有的circRNAs可与小核糖核蛋白相互作用,调控基因的转录; 部分circRNAs可以调节pre-mRNA的剪接,改变mRNA含量,从而影响
蛋白质的产量。在细胞的生长、增值、分化、周期调控和应激等多个过程中circRNAs均起重要作用,其表达变化与神经系统
疾病、糖尿病、冠心病以及多种癌症的发生、发展、和
预后密切相关。
[0003] RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源RNA从而沉默靶基因,从而实现干扰靶基因的功能。
[0004] 近年,尽管临床上肿瘤的联合疗法得到普及,但是联合疗法对肿瘤患者的5年生存率提高不大,中晚期患者生存率更低,约为20%。部分
化疗药物副作用大限制了药物的运用。因此,寻找更安全有效的靶向性联合疗法是提高肿瘤患者生存的途径。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种能够特异高效地抑制circ_0001017表达的siRNA及其应用。
[0006] 本 发 明 的 目 的 是 这 样 实 现 的 ,包 括 合 成 核 苷 酸 的 序 列 由AUAGAUUACUUCGCACUGGUUCC(SEQ ID NO.1)序列中的18-23个连续核苷酸序列组成或者互补序列中的18-23个连续核苷酸序列组成。特别是其包含序列:AUAGAUUACUUCGCACUGG (SEQ ID NO.2)和AGAUUACUUCGCACUGGUUCC(SEQ ID NO.3)。核苷酸为核糖核苷酸、脱
氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的嵌合体。核苷酸进一步被核糖修饰、
碱基修饰和
磷酸骨架修饰中的一种或几种修饰。修饰选自氟代修饰、硫代修饰、2-甲氧基修饰、胆固醇修饰、LNA修饰中的一种或几种。核苷酸和其他抗肿瘤
治疗药物特别是三价无机砷。制备治疗癌症药物中的应用。癌症包括 :肝癌、
肺癌、胰腺癌、
乳腺癌、
宫颈癌、大肠癌、胃癌、、鼻咽癌、卵巢癌、
前列腺癌症、慢性或急性白血病、脑瘤、食道 癌、
口腔癌、贲
门癌、结肠癌、胆囊癌、喉癌、
牙龈癌、尿道癌、
皮肤癌、直肠癌、中
耳癌、骨癌、 睾丸癌、内分泌系统的癌症、淋巴细胞性淋巴瘤。本研究受国家自然科学基金的支持(81860572)。
[0007] 本发明(优点):发明的核苷酸具有很好的circ_0001017抑制效果,作用于特异性的靶位点,特异性强、毒性低、副作用小和修饰
半衰期长,可以与多种抗肿瘤药物合用。
[0008]
具体实施方式
[0009] 下面对本发明作进一步的说明,但不以任何方式对本发明加以限制,基于本发明教 导所作的任何变换或替换,均属于本发明的保护范围。
[0010] 具体实施方式:
实施例1
本实施例中的沉默RNA序列为AUAGAUUACUUCGCACUGGdTdT(SEQ ID NO.2) ,以及互补序列CCAGUGCGAAGUAAUCUAUdTdT(SEQ ID NO.4)。所有的序列都是从5端到3端,其中dTdT是不足19核苷酸加上去了TT尾巴,circ_0001017的RNA序列信息存在于UCSC
数据库中。本研究受国家自然科学基金的支持(81860572)。
[0011] 对照合成:首先,由上海吉玛制药技术有限公司合成核苷酸,合成包含其互补序列的双链RNA序列,对照组使用吉玛制药技术有限公司的A06001序列为UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT(SEQ ID NO.5)以及互补的ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT(SEQ ID NO.6)作为阴性对照。
[0012] 细胞培养:将A549或者MBA-MD-231细胞在含有10%胎
牛血清的1640培养基中培养,胎牛血清购自cellmax公司,1640培养基来自于Hyclone,于37℃,5%CO2条件下培养。收集生长状态良好的细胞,离心计数,以5000个每孔铺于96孔板内200000个接种于六孔板内,37℃,5%CO2培养。
[0013] RNA
转染:采用碧
云天公司Lipo8000™转染
试剂,按照操作说明进行操作,A549使用六孔板转染时候,六孔板中SIRNA量为每孔20ul,转染试剂为15ul,培养基为2ml,MBA-MD-231使用六孔板转染时候,六孔板中SIRNA量为每孔10ul,转染试剂为7.5ul,培养基为2ml,96小时检测沉默效果,其结果见表1。
[0014] 表1.circ_0001017沉默效果沉默效果 对照组 沉默组1 沉默组1
A549 1.02±0.07 0.21±0.02 0.24±0.08
MBA-MD-231 1.04±0.09 0.18±0.04 0.16±0.03
表1为本发明SIRNA沉默的效果表1,对照组使用的是阴性对照
片段,沉默组1为实施例1沉默核苷酸片段的结果;沉默组2为实施例2沉默核苷酸片段的的结果,数据使用2^-ΔΔCt表示。
[0015] A549使用96孔板转染时候96孔板SIRNA量为每孔0.5ul,转染试剂为0.5ul培养基为0.1ml, MBA-MD-231使用96孔板转染时候96孔板SIRNA量为每孔0.25ul,转染试剂为0.25ul培养基为0.1ml,二者转染后24小时加入亚砷酸钠A549加入30uM(微摩尔每升), MBA-MD-231 5uM,其中一排不加入亚砷酸钠,再培养48小时后MTS检测细胞活
力,其结果见表2。
[0016] 表2.circ_0001017沉默后加入砷后活力(%)活力% 未加砷组 对照组 实验组1 实验组2
A549 100±4.53 83±3.52 67±2.31 65±5.38
MBA-MD-231 101±5.62 84±3.77 57±4.01 53±3.40
表2为本发明MTT的结果表2;未加入砷组:不加入亚砷酸钠,对照组:为使用阴性对照片段后加入亚砷酸钠的结果,定为100%,实验组1实施例1沉默核苷酸片段沉默后加入亚砷酸钠的结果,实验组2实施例2沉默核苷酸片段沉默后加入亚砷酸钠的结果。
[0017] MTS检测采用Promega公司CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay,an
说明书的方法进行操作计算。
[0018] 检测沉默效果采用
荧光定量PCR,PCR的条件是1、95度2-10分,2、95度10秒,3、60度10秒,4、72度15秒,PCR试剂采用罗氏或者康为世纪的,引物序列如下:
CAAGGAACCAGTGCGAAGTAATC(SEQ ID NO.7)和TTCCAAAATTGTGTCGACTCTTGT(SEQ ID NO.8).采用2^ΔΔCt表示表达量。
[0019] 实施例2本实施例中的RNA序列为:AGAUUACUUCGCACUGGUUCC(SEQ ID NO.3),互补序列:
GGAACCAGUGCGAAGUAAUCU(SEQ ID NO.9),细胞培养和转染等试验方法同实施例1,仅使用的沉默RNA序列不同。沉默效果,其结果见表1,MTT其结果见表2。