2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮用作抗肿瘤增效剂
阅读：997发布：2023-01-06
专利汇可以提供2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮用作抗肿瘤增效剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4- 酮 在制备抗 肿瘤 药物中的应用。本发明还公开了2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮在制备抗肿瘤药物增效剂中的应用。本发明 实施例 2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮用作抗肿瘤增效剂及药物，可联合 抗体 对肿瘤进行 治疗 ，具有增强免疫治疗肿瘤的效果。，下面是2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮用作抗肿瘤增效剂专利的具体信息内容。
1.2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮在制备抗肿瘤药物中的应用。
2.2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮在制备抗肿瘤药物增效剂中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，
所述2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮针对肿瘤细胞免疫治疗过程中，通过增强PD-1抗体和PD-L抗体作用，提高T细胞杀伤肿瘤细胞的能力。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，
所述2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮通过诱导肿瘤细胞MSH2或MSH6基因表达下降。
5.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述抗肿瘤药物组合物的有效成分包括PD-1抗体、PD-L抗体和2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮。
6.如权利要求5所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，
所述肿瘤为胶质母细胞瘤、肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、大肠癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、白血病、淋巴瘤、甲状腺癌、黑色素瘤。
7.如权利要求5所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，
还包括药学上可接受的载体和/或助剂。
8.如权利要求7所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，
所述载体和/或助剂为聚乙二醇、硬脂酸、丙三醇、淀粉、羟丙基甲基纤维素或纳米材料。
9.如权利要求5所述的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，
所述PD-1抗体和PD-L抗体与2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮的质量比为(2-3)：(10-50)。
2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮用作抗肿瘤增
效剂
技术领域
[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮用作抗肿瘤增效剂，抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
[0002] 正常情况下，程序性细胞死亡蛋白-1(programmed death-1，PD-1)主要在T淋巴细胞和B淋巴细胞中表达，其功能是抑制淋巴细胞的激活，这是免疫系统的一种正常的自稳机制，防止过度的免疫反应导致自身免疫性损伤。然而，在恶性肿瘤中，肿瘤微环境会诱导浸润的T细胞高表达PD-1分子，肿瘤细胞会高表达PD-1的配体PD-L1，通过PD-1/PD-L1的结合，导致PD-1通路持续激活，使T细胞功能被抑制，无法杀伤肿瘤细胞，导致免疫逃逸。PD-1抗体和PD-L抗体可以阻断这一通路，部分恢复T细胞的功能，使这些细胞能够继续杀伤肿瘤细胞。这是PD-1、PD-L1免疫治疗的原理。
[0003] 然而PD-1、PD-L1免疫治疗只对一部分恶性肿瘤有效，近年研究(附件1-6)已证实，当肿瘤出现MSH2或MSH6表达下降或突变时，就会导致错配修复缺陷(Mismatch Repair Difficiency)，肿瘤就会对PD-1、PD-L1免疫治疗敏感；特别是附件1的研究表明：无论肿瘤的组织来源，只要出现错配修复缺陷，就会对PD-1、PD-L1免疫治疗有效。其机制是因为肿瘤无法修复基因错配，导致肿瘤基因组中出现大量的基因突变，进而表达出大量的肿瘤抗原，从而更好地激活T淋巴细胞。
[0004] 其中，错配修复缺陷这一状态可以用微卫星不稳定(Microsatellite instability，MSI)这一方法进行检测，简言之，如果检测到MSI阳性，就代表肿瘤处于错配修复缺陷状态。所以，MSI阳性可以视为错配修复缺陷的同义词。
[0005] 2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮是一种人工合成的小分子化合物，迄今为止的文献报道中，它是作为一种PtdIns 3-kinase的抑制剂，但没有发现2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮抑制MSH2、MSH6表达的作用，也没有2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮导致错配修复缺陷的报道。
[0006] 综上所述，亟待研发一种新型的抗肿瘤药物药物，使得肿瘤出现MSH2或MSH6表达下降，将可以提高肿瘤对PD-1、PD-L1免疫治疗敏感性，达到增强PD-1、PD-L1免疫治疗的效果，提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤力。
发明内容
[0007] 本发明实施例的目的在于提供2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮用作抗肿瘤增效剂及抗肿瘤药物，用以解决现有免疫治疗肿瘤效果差的缺陷。
[0008] 为实现上述目的，本发明实施例提供2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0009] 本发明实施例还提供2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮在制备抗肿瘤药物增效剂中的应用。
[0010] 优选的，所述2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮针对肿瘤细胞免疫治疗过程中，通过增强PD-1抗体和PD-L抗体作用，增强T细胞杀伤肿瘤细胞的能力。
[0011] 优选的，所述2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮通过诱导肿瘤细胞MSH2或MSH6基因表达下降。
[0012] 本发明实施例提供一种抗肿瘤药物组合物，所述抗肿瘤药物组合物的有效成分包括PD-1抗体、PD-L抗体和2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮。
[0013] 优选的，所述肿瘤为胶质母细胞瘤。
[0014] 优选的，还包括药学上可接受的载体和/或助剂。
[0016] 优选的，所述PD-1抗体和PD-L抗体与2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮的质量比为(2-3)：(10-50)。
[0017] 本发明实施例具有如下优点：
[0018] 本发明实施例2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮用作抗肿瘤增效剂及药物，体外实验证明，本发明实施例的2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮可以诱导胶质母细胞瘤细胞出现MSH2和MSH6表达下降，进而出现MSI阳性，从而起到对PD-1、PD-L1免疫治疗增效的作用，可联合抗体对肿瘤进行治疗，增强免疫治疗效果。附图说明
[0019] 图1为本发明实施例1提供的通过Western Blot检测肿瘤细胞的MSH2、MSH6表达情况的示意图，其中，A为对照组，B为10uM 2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮处理组，C为20uM 2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮处理组，D为30uM 2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮处理组。
[0020] 图2为本发明实施例1的MSl检测图1，其中，A为对照组，B为2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮处理组，C为MSH2shRNA基因沉默组，D为MSH6shRNA基因沉默组。
[0021] 图3为本发明实施例1的MSl检测图2，其中，A为对照组，B为2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮处理组，C为MSH2shRNA基因沉默组，D为MSH6shRNA基因沉默组。
[0022] 图4为本发明实施例1的MSl检测图3，其中，A为对照组，B为2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮处理组，C为MSH2shRNA基因沉默组，D为MSH6shRNA基因沉默组。
具体实施方式
[0023] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0024] 本发明的实施例的2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮具有抑制胶质瘤细胞MSH2、MSH6表达的作用。其化学结构为：2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-l-benzopyran-4-One，2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮。英文名称：LY 294002；MF：C19H18ClNO3；MW：343.8；化学式如下式Ⅰ所示：
[0025]
[0026] 一般情况下，肿瘤是否存在MSH2或MSH6表达下降或突变，是否存在错配修复缺陷，是肿瘤在起源和演进过程中随机出现的，本发明实施例发现小分子化合物2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮可以诱导胶质母细胞瘤细胞出现MSH2和MSH6表达下降，进而出现MSI阳性，本发明实施例的2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮通过增强T细胞的杀伤肿瘤细胞的能力，可进一步开发成PD-1、PD-L1免疫治疗增效药物。
[0027] 实施例1
[0028] 培养胶质母细胞瘤U87MG细胞，分成四组，其中A组为对照组，未加入2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮的阴性对照，B、C、D组中，分别在DMEM/5％FBS培养基中加入2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮，剂量为10uM，20uM，30uM，作用3天后，收集细胞，提取蛋白质，如图1所示，通过Western Blot(MSH2一抗为ABCAM ab52266，MSH6一抗为ABCAM ab137457)检测肿瘤细胞的MSH2、MSH6表达，发现MSH2和MSH6均明显下降，2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮10uM即有显著抑制MSH2和MSH6蛋白表达作用，剂量越大，抑制效果越明显。
[0029] 培养胶质母细胞瘤U87MG细胞，在DMEM/5％FBS培养基中加入2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮，剂量为10uM，作用15天后，收集肿瘤细胞，检测MSI，发现细胞出现了MSI阳性。使用shRNA对MSH2、MSH6基因敲减作为阳性对照组，使用未经任何处理的U87MG细胞作为阴性对照组。如图2所示，阴性对照组BAT-26微卫星片段是122.72bp，而2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮处理组、MSH2-shRNA阳性对照组、MSH6-shRNA阳性对照组的BAT-26微卫星片段为117bp左右，相差大于2bp，表明BAT-26位点出现了新等位基因(new alleles)。
[0030] 如图3所示，阴性对照组NR-21微卫星片段是106.75bp，而2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮处理组、MSH2-shRNA阳性对照组、MSH6-shRNA阳性对照组的NR-21微卫星片段为105.5bp左右，相差小于2bp，表明NR-21位点没有变化。
[0031] 阴性对照组BAT-25微卫星片段是131.83bp，而2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮处理组、MSH2-shRNA阳性对照组、MSH6-shRNA阳性对照组的BAT-25微卫星片段为128bp左右，相差大于2bp，表明BAT-25位点出现了新等位基因(new alleles)。
[0032] 阴性对照组MONO-27微卫星片段是154.97bp，而2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮处理组、MSH2-shRNA阳性对照组、MSH6-shRNA阳性对照组的MONO-27微卫星片段为155bp左右，相差小于2bp，表明MONO-27位点没有变化。
[0033] 如图4所示，阴性对照组NR-24微卫星片段是139.33bp，而2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮处理组、MSH2-shRNA阳性对照组、MSH6-shRNA阳性对照组的NR-24微卫星片段为135bp左右，相差大于2bp，表明NR-24位点出现了新等位基因(new alleles)。
[0034] MSI结果判断，在基因组中，存在5个微卫星片段(Micro-Satellite,MS)：BAT-26，BAT-25，NR-24，NR-21，MONO-27。正常情况下，这5个微卫星片段的长度是恒定的，称为微卫星稳定(Micro-Satellite Stable,MSS)。当存在错配修复缺陷时(MMR-deficiency)，某些微卫星片段的长度就会变化，如果长度变化超过2bp，就称为新等位基因(new alleles)。如果5个微卫星片段，其中两个或两个以上出现了新等位基因(new alleles)，就认为这个肿瘤基因组微卫星不稳定(Micro-Satellite Instability,MSI)阳性。其中，本发明实施例中，MSI检测是使用Promega MSI Analysis System，Version 1.2试剂盒进行检测。
[0035] 本实施例中，胶质母细胞瘤细胞经过2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮处理后，在5个微卫星片段中，BAT-26,BAT-25和NR-24三个片段出现了新等位基因(new alleles)，而NR-21，MONO-27两个片段未出现，所以判断为MSI阳性。胶质瘤如果被抑制了MSH2和MSH6的表达，就会发生错配修复缺陷(MMR-deficiency)，肿瘤基因组会产生大量的突变负荷，从而对免疫治疗敏感。
[0037] 本实施例的2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮可联合PD-1抗体和PD-L抗体，对肿瘤进行治疗，增强肿瘤对PD-1、PD-L1免疫治疗敏感性，提高免疫治疗的效果，本实施例的2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮可以用作免疫治疗的增效药，其通过在免疫治疗前使用2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮，提高肿瘤的突变负荷和免疫原性，达到增强免疫治疗效果的目的。
[0038] 具体的，抗肿瘤的组合药物还包括药学上可接受的载体和/或助剂，该载体和/或助剂为聚乙二醇、硬脂酸、丙三醇、淀粉、羟丙基甲基纤维素或纳米材料。其中，抗肿瘤药物组合物中，PD-1抗体和PD-L抗体与2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-L-苯并吡喃-4-酮的质量比为(2-3)：(10-50)。
[0039] 附件1-6如下：
[0040] 1.Le DT,Durham JN,Smith KN,Wang H,Bartlett BR,et al.:Mismatch repair deficiency predicts response of solid tumors to PD-1 blockade.Science 357(6349),409-413,2017.
[0041] 2.Dudley JC,Lin MT,Le DT,Eshleman JR:Microsatellite Instability as a Biomarker for PD-1 Blockade.Clin Cancer Res 22(4),813-820,2016.
[0042] 3.Lee V,Le DT:Efficacy of PD-1 blockade in tumors with MMR deficiency.Immunotherapy 8(1),1-3,2016.
[0043] 4.Kelderman S,Schumacher TN,Kvistborg P:Mismatch Repair-Deficient Cancers Are Targets for Anti-PD-1 Therapy.Cancer Cell 28(1),11-13,2015.[0044] 5.Le DT,Uram JN,Wang H,Bartlett BR,Kemberling H,et al.:PD-1 Blockade in Tumors with Mismatch-Repair Deficiency.N Engl J Med 372(26),2509-2520,2015.
[0045] 6.Killock D:Immunotherapy:PD-1 blockade exploiting MMR deficiency.Nat Rev Clin Oncol 14(8),459,2017.
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