一种针对循环肿瘤细胞的lncRNA和AR3联合检测试剂盒及其应用
阅读：594发布：2023-02-24
专利汇可以提供一种针对循环肿瘤细胞的lncRNA和AR3联合检测试剂盒及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种针对循环 肿瘤 细胞的联合 诊断 试剂 盒 及其应用，所述联合诊断试剂盒通过实时定量PCR技术联合检测长链非编码RNA(lncRNA)PCGEM1及雄 激素 受体异构体AR-V7(AR3)；所述长链非编码RNA为循环肿瘤细胞中的特异性lncRNA PCGEM1。本发明的试剂盒具有高特异性、高灵敏性、高准确度及高效性的优点，与目前通用的常规方法相比，lncRNA PCGEM1及AR-V7(AR3)联合检测，解决了临床常见病的有效 预后 评估及检测的问题，具有显著的临床经济和社会价值。，下面是一种针对循环肿瘤细胞的lncRNA和AR3联合检测试剂盒及其应用专利的具体信息内容。
1.长链非编码RNA在调控pre-mRNA剪切的转录后修饰控制雄激素受体异构体AR3的产生中的应用，其特征在于，所述的长链非编码RNA为lncRNAPCGEM1。
2.用于检测长链非编码RNA及检测雄激素受体异构体AR3的核酸引物，其特征在于，所述长链非编码RNA为循环肿瘤细胞中的特异性长链非编码lncRNAPCGEM1；所述检测长链非编码RNA的核酸引物序列为
PCGEM1-5.1(SEQ ID NO.1)：TTTTTGCCCTATGCCGTAAC，
PCGEM1-3.1(SEQ ID NO.2)：GGAGACTCCCAACCTGATGA；或为
PCGEM1-5.2(SEQ ID NO.3)：GGTAGGCACGTGGAGGACTA，
PCGEM1-3.2(SEQ ID NO.4)：TGCTTTTGTGGGTTTGTTCA；
所述检测雄激素受体异构体AR3的核酸引物序列为
AR3-5.1(SEQ ID NO.5)：GCAATTGCAAGCATCTCAAA，
AR3-3.1(SEQ ID NO.6)：GGAGGGAGTCAGCAATCAAG。
3.一种针对循环肿瘤细胞的lncRNA和AR3联合诊断试剂盒，其特征在于，所述联合诊断试剂盒通过实时定量PCR技术联合检测长链非编码RNA及雄激素受体异构体AR3；所述长链非编码RNA为循环肿瘤细胞中的特异性lncRNAPCGEM1。
4.根据权利要求3所述的联合诊断试剂盒，其特征在于，所述检测长链非编码lncRNAPCGEM1的核酸引物序列为：
PCGEM1-5.1(SEQ ID NO.1)：TTTTTGCCCTATGCCGTAAC，
PCGEM1-3.1(SEQ ID NO.2)：GGAGACTCCCAACCTGATGA；或为
PCGEM1-5.2(SEQ ID NO.3)：GGTAGGCACGTGGAGGACTA，
PCGEM1-3.2(SEQ ID NO.4)：TGCTTTTGTGGGTTTGTTCA。
5.据权利要求3所述的联合诊断试剂盒，其特征在于，所述检测雄激素受体异构体AR3的两条核酸引物序列为：
AR3-5.1(SEQ ID NO.5)：GCAATTGCAAGCATCTCAAA；
AR3-3.1(SEQ ID NO.6)：GGAGGGAGTCAGCAATCAAG。
6.权利要求3-5任一所述的联合诊断试剂盒在制备诊断AR相关肿瘤的去势抵抗及复发的试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的AR相关肿瘤为前列腺癌、肺癌、乳腺癌、睾丸癌、子宫颈癌或结肠癌。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的AR相关肿瘤为前列腺癌。
一种针对循环肿瘤细胞的lncRNA和AR3联合检测试剂盒及
其应用
技术领域
背景技术
[0002] 癌症占人类死亡病因的近1/4。在过去的几十年里肿瘤复发和转移仍是改善整体存活率的主要障碍，这可能主要归因于人们对于癌症生物学仍然缺乏全面的了解。例如，功能基因组学研究的最新进展表明，参与人类基因转录的绝大多数是非编码RNA。然而，对于lncRNAs在调控癌症基因表达及机制等方面人类仍然所知甚少[1]。
[0003] 近期我们通过对肿瘤表观遗传机制的研究发现lncRNAs可以通过多种机制调控肿瘤的进展。新近有研究表明lncRNA PCGEM1可以与雄激素受体AR结合作用[2]。PCGEM1在前列腺癌上调[3]，可 促进细胞增殖[4]，而我们则通过临床标本研究发现，PCGEM1的基因表达与前列腺癌恶性程度及转移复发呈高度相关性，PCGEM1不但可以通过与AR直接作用，更重要的是PCGEM1与AR异构体(如AR3)的表达呈高度正相关，我们进一步证明了PCGEM1通过选择性转录修饰调控了AR的异构体如AR3的表达。由此发现lncRNAs如PCGEM1可能通过调控AR基因转录的表观遗传机制参与AR相关肿瘤的增殖、恶性侵袭复发及转移驱动。因为在一定程度上是由于AR的异构体如AR-V7(AR3)介导了该类肿瘤的激素去势抵抗，而并非野生型全长AR。而研究已表明AR-V7在很大程度上诱导形成了相关肿瘤如前列腺癌的激素去势抵抗[5]。
[0004] 针对上述AR相关肿瘤的特异性调节lncRNAs如PCGEM1和该类肿瘤的激素去势抵抗的高度相关AR异构体(如AR3)的表达呈高度相关性，通过荧光原位杂交及免疫组织化学技术联合检测临床组织标本的上述指标，可以高度有效的评估和预测诊断AR相关肿瘤的激素去势抵抗和复发转移，并在激素去势抵抗和复发转移的早期做出诊断。该项申请的技术及试剂盒是基于当前最新的研究结果而建立。这是一种目前其他方法都无法替代的检测方法，迄今为止尚未见相关报道。
[0005] 一方面，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)，即从实体肿瘤中脱落并进入血液循环，形成随血液循环的肿瘤细胞。这些细胞被认为和肿瘤的远端转移等问题有重大关系，目前较成熟的检测技术多采用免疫标记方法进行分离检测分析，目前已经有成熟的技术手段用于循环肿瘤细胞的分离和鉴定，如美国强生公司旗下Veridex公司研发的CellSearch系统，该系统具有很好的特异性、灵敏度、准确性和可重复性，是目前唯一获得FDA、SFDA认证的技术，在美国已经被广泛应用到临床诊断。
[0006] 另一方面，直观快捷地检测基因；此外，能够高效、准确的检测该特异性目标检测基因，并放大该信号，较常规的染色检测更为灵敏和精确。本发明是基于最新的长链非编码RNA(lncRNA)参与的肿瘤表观遗传调控机制。最重要的是联合检测PCGEM1及雄激素受体异构体AR-V7(AR3)，是建立在lncRNAs PCGEM1通过本发明证明的表观遗传调控机制的基础上。即lncRNA PCGEM1通过调控AR-V7(AR3)pre-mRNA的转录后修饰及共定位，直接决定了表达雄激素受体的肿瘤如前列腺癌、肺癌及乳腺癌等的激素去势治疗后去势抵抗或复发转移。尤其本发明基于研究所发现的lncRNA PCGEM1通过调控pre-mRNA剪切的转录后修饰控制雄激素受体(AR)异构体(AR-V7(AR3))的产生的新理论。该lncRNA PCGEM1--AR-V7(AR3)调节机制的新理论所介导的雄激素受体(AR)的激素去势治疗后去势抵抗或复发转移。联合检测循环肿瘤细胞的PCGEM1及雄激素受体异构体AR-V7(AR3)的表达可以有效的预测和评价雄激素受体(AR)的激素去势治疗后去势抵抗或复发转移情况。
[0007] 参 考 文 献 ：1.Xie C,Yuan J,Li H,Li M,Zhao G,Bu D,etal.NONCODEv4:exploring the world of long non-coding RNA genes.Nucleic acids research.2013；doi:10.1093/nar/gkt1222.
[0008] 2.Yang L,Lin C,Jin C,Yang JC,Tanasa B,Li W,et al.lncRNA-dependent mechanisms of androgen-receptor-regulated gene activation programs.Nature.2013；29:598-602.
[0009] 3.Srikantan V,Zou Z,Petrovics G,Xu L,Augustus M,Davis L,et al.PCGEM1,a prostate-specific gene,is overexpressed in prostate cancer.Proceedings of the NationalAcademy ofSciences ofthe United States ofAmerica.2000；97:12216-21.[0010] 4.Petrovics G,Zhang W,Makarem M,Street JP,Connelly R,Sun L,et al.Elevated expression of PCGEM1,a prostate-specific gene with cell growth-promoting function,is associated with high-risk prostate cancer patients.Oncogene.2004；23:605-11.
[0011] 5.Antonarakis ES,et al.AR-V7and resistance to enzalutamide and abiraterone in prostate cancer.The New Englandjournal ofmedicine.2014；371,1028-1038.
发明内容
[0012] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供长链非编码RNA(lncRNA)的用途。
[0013] 本发明的再一的目的是，提供用于检测lncRNA及检测雄激素受体异构体AR-V7(AR3)的核酸引物。
[0014] 本发明的另一的目的是，提供一种针对循环肿瘤细胞的lncRNA和AR3联合诊断试剂盒。
[0015] 本发明的第四个目的是，提供上述试剂盒的用途
[0016] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0017] 长链非编码RNA在调控pre-mRNA剪切的转录后修饰控制雄激素受体异构体AR-V7(AR3)的产生中的应用，所述的长链非编码RNA为lncRNA PCGEM1。
[0018] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0019] 用于检测长链非编码RNA及检测雄激素受体异构体AR-V7(AR3)的核酸引物，所述lncRNA为循环肿瘤细胞中的特异性lncRNA PCGEM1；所述检测长链非编码RNA的核酸引物序列为
[0020] PCGEM1-5.1(SEQ ID NO.1)：TTTTTGCCCTATGCCGTAAC，
[0021] PCGEM1-3.1(SEQ ID NO.2)：GGAGACTCCCAACCTGATGA；或为
[0022] PCGEM1-5.2(SEQ ID NO.3)：GGTAGGCACGTGGAGGACTA，
[0023] PCGEM1-3.2(SEQ ID NO.4)：TGCTTTTGTGGGTTTGTTCA；
[0024] 所述检测雄激素受体异构体AR-V7(AR3)的核酸引物序列为
[0025] AR3-5.1(SEQ ID NO.5)：GCAATTGCAAGCATCTCAAA，
[0026] AR3-3.1(SEQ ID NO.6)：GGAGGGAGTCAGCAATCAAG。
[0027] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0028] 一种针对循环肿瘤细胞的lncRNA和AR3联合诊断试剂盒，所述联合诊断试剂盒通过实时定量PCR技术联合检测lncRNA及雄激素受体异构体AR-V7(AR3)；所述长链非编码RNA为循环肿瘤细胞中的特异性lncRNA PCGEM1。
[0029] 所述检测lncRNA PCGEM1的核酸引物序列为：
[0030] PCGEM1-5.1(SEQ ID NO.1)：TTTTTGCCCTATGCCGTAAC，
[0031] PCGEM1-3.1(SEQ ID NO.2)：GGAGACTCCCAACCTGATGA；或为
[0032] PCGEM1-5.2(SEQ ID NO.3)：GGTAGGCACGTGGAGGACTA，
[0033] PCGEM1-3.2(SEQ ID NO.4)：TGCTTTTGTGGGTTTGTTCA。
[0034] 所述检测雄激素受体异构体AR-V7(AR3)的两条核酸引物序列为：
[0035] AR3-5.1(SEQ ID NO.5)：GCAATTGCAAGCATCTCAAA；
[0036] AR3-3.1(SEQ ID NO.6)：GGAGGGAGTCAGCAATCAAG。
[0037] 本发明目的是在于提供一种高效、高度特异性、灵敏性及高可信度，同时又非常直观并具有临床实用性和应用价值的用于雄激素受体相关肿瘤激素去势抵抗及复发的诊断试剂盒。
[0038] 基于lncRNA参与的肿瘤表观遗传调控机制，尤其是lncRNA PCGEM1通过调控pre-mRNA剪切的转录后修饰控制雄激素受体(AR)异构体(AR-V7(AR3))的产生。本发明基于前期工作所阐明的lncRNA PCGEM1调控AR-V7(AR3)表达的新理论，以及该方面新理论所介导的雄激素受体(AR)的激素去势治疗后去势抵抗或复发转移。
[0039] 联合检测PCGEM1及雄激素受体异构体AR-V7(AR3)可以有效的预测和评价雄激素受体(AR)的激素去势治疗后去势抵抗或复发转移情况。
[0040] 针对循环肿瘤细胞，目前已经有成熟的技术手段用于循环肿瘤细胞的分离和鉴定。而采用实时定量PCR检测目标基因表达具有很好的特异性、灵敏度、准确性和可重复性，适用于在临床得到广泛应用。
[0041] 本发明能够通过明确循环肿瘤细胞中PCGEM1及雄激素受体异构体AR-V7(AR3)的表达水平，评价肿瘤的良恶性程度，了解并评估其肿瘤激素去势抵抗及复发的潜在性及可能程度。
[0042] 联合上述方法具有直观、准确、高效及灵敏和特异性强，具有切实的临床使用价值。故lncRNAs PCGEM1及AR-V7(AR3)实时定量PCR联合检测用于雄激素受体相关肿瘤激素去势抵抗及复发的联合诊断试剂盒。
[0043] 本发明提供了一种通过实时定量PCR联合检测lncRNA PCGEM1及AR-V7(AR3)用于雄激素受体相关肿瘤激素去势抵抗及复发的诊断技术及试剂盒，其技术方案包括如下步骤：
[0044] a.lncRNA PCGEM1引物合成，引物序列如SEQ ID NO.1-4所示。
[0045] b.AR-V7(AR3)引物合成，引物序列如SEQ ID NO.5-6所示。
[0046] c.循环肿瘤细胞分离(循环肿瘤细胞(CTCs)无标记分选检测方法)[0047] 法国ScreenCell公司采用滤膜技术(循环肿瘤细胞(CTCs)无标记分选检测方法)根据肿瘤细胞在形态、大小及其它物理性质与正常细胞的不同，对其进行快速、高效、高灵敏度、无损伤地分离。或采用免疫标记方法进行分离检测分析，如美国强生公司旗下Veridex公司研发的CellSearch系统，该系统具有很好的特异性、灵敏度、准确性和可重复性，是目前唯一获得FDA、SFDA认证的技术，在美国已经被广泛应用到临床诊断。
[0048] d.应用上述引物与循环肿瘤细胞进行实时定量PCR检测:
[0049] 循环肿瘤细胞进行实时定量PCR检测样本需要分离准备、mRNA提取，逆转录等常规处理。本发明联合lncRNA PCGEM1及AR-V7(AR3)两个目标基因检测。
[0050] 本发明提供了一种通过联合lncRNA PCGEM1及AR-V7(AR3)两个目标基因检测方法，用于雄激素受体相关肿瘤激素去势抵抗及复发的诊断技术及试剂盒，该试剂盒包括了上述特异性引物和实时定量PCR试剂。
[0051] 本发明优点在于：
[0052] 1、本发明目的是在于提供一种高效、高度特异性、灵敏性及高可信度，同时又非常直观并具有临床实用性和应用价值的用于雄激素受体相关肿瘤激素去势抵抗及复发的诊断试剂盒。
[0053] 2、本发明具有显著的特异性，目的是明确该病变或组织的良恶性程度，并评估其肿瘤激素去势抵抗及复发的潜在性及可能性。
[0054] 3、联合上述方法具有准确性、高效性。
[0055] 4、本发明具有特异性强，具有切实的临床使用价值。lncRNA PCGEM1及AR-V7(AR3)双重联合检测增加了临床应用的可行性和可信度，能够直接应用于临床，这是目前其他分子生物学检测方法不能比拟的特点。
[0056] 5、由于所设计的核酸引物对于目标基因的检测是特异的，且信号经过放大，所以较常规的染色方法检测更为灵敏，具有更高的区分度和准确性。
[0057] 6、lncRNA PCGEM1及AR-V7(AR3)双重联合检测有效的解决了临床常见病的有效预后评估及检测，具有显著的临床经济和社会价值。
[0058] 7、在病人血液标本中通过RT-PCR方法扩增，对于阳性结果的认定更为准确，也更为快速方便，但需联合其他标志物共同检测，才能达到较高的检测效率。作为早期诊断的肿瘤标志物，与目前通用的常规方法相比，具有更高的灵敏度和特异性，同时将会极大提前诊断时间，真正做到早发现、早诊断。附图说明
[0059] 附图1是定量PCR检测结果。表明循环肿瘤细胞中AR-V7(AR3)的高表达与肿瘤患者的生存期成显著负相关。(Antonarakis ES,et al.AR-V7and resistance to enzalutamide and abiraterone in prostate cancer.The New England journal of medicine.2014；371,1028-1038.)
[0060] 附图2是免疫组织化学实验结果。表明PCGEM1在肿瘤，尤其是高度恶性及转移性前列腺癌中表达显著上调。
[0061] 附图3是循环肿瘤细胞分离，荧光原位杂交(PCGEM1)及荧光免疫细胞化学检测AR-V7(AR3)。
[0062] 附图4是实时定量PCR检测PCGEM1及AR-V7(AR3)的表达，并且PCGEM1及AR-V7(AR3)表达具有高度相关性。和低度恶性肿瘤比较，在高度恶性的肿瘤中，PCGEM1及AR-V7(AR3)被诱导显著上调。
[0063] 附图5是实时定量PCR检测PCGEM1及AR-V7(AR3)的表达，并且PCGEM1及AR-V7(AR3)表达具有高度正相关性。
具体实施方式
[0064] 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
[0065] 实施例1 特异性引物的合成
[0066] 本发明所述的两条lncRNA PCGEM1的两对核酸引物，其序列如下：
[0067] PCGEM1-5.1(SEQ ID NO.1)：TTTTTGCCCTATGCCGTAAC；
[0068] PCGEM1-3.1(SEQ ID NO.2)：GGAGACTCCCAACCTGATGA；或为
[0069] PCGEM1-5.2(SEQ ID NO.3)：GGTAGGCACGTGGAGGACTA；
[0070] PCGEM1-3.2(SEQ ID NO.4)：TGCTTTTGTGGGTTTGTTCA。
[0071] 本发明所述的AR-V7(AR3)两条核酸引物，其序列如下：
[0072] AR3-5.1(SEQ ID NO.5)：GCAATTGCAAGCATCTCAAA；
[0073] AR3-3.1(SEQ ID NO.6)：GGAGGGAGTCAGCAATCAAG。
[0074] 实施例2
[0075] 定量PCR检测显示(图1)，循环肿瘤细胞中AR-V7(AR3)的高表达与肿瘤患者的生存期成显著负相关。(Antonarakis ES,et al.AR-V7 and resistance to enzalutamide and abiraterone in prostate cancer.The New England journal of medicine.2014；371,1028-1038.)
[0076] 实施例3 lncRNA PCGEM1及AR-V7表达检测
[0077] 实验结果如图2、图3所示。免疫组织化学显示(图2)组织中lncRNA PCGEM1的高表达与肿瘤恶性程度成显著正相关。免疫荧光化学及原位杂交检测循环肿瘤细胞中AR-V7和lncRNA PCGEM1的表达(图3)。
[0078] 实验过程如下：
[0079] 一、免疫组织化学
[0080] (1)标本处理。
[0081] (2)滴加适当稀释的特异性抗体于标本上，置湿盒中，37℃30～60分钟或4℃过夜。
[0082] (3)滴加适当稀释的间接抗体，置湿盒中，37℃30～60分钟。
[0083] (5)PBS洗2次，双蒸水洗1次。
[0084] (6)甘油缓冲液封片，显微镜下观察。
[0085] (7)对照染色：可用空白对照和阴性对照等。
[0086] 二、荧光原位杂交
[0087] 1、细胞固定等预处理。
[0088] 2、杂交：
[0089] 1)准备探针(PCGEM1探针序列：
[0091] 2)细胞预处理；
[0092] 3)滴10μl探针在玻片的细胞上，加盖玻片；
[0093] 4)盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。
[0094] 杂交后的水洗：
[0095] 5)镊子小心去除盖玻片；
[0096] 6)43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗玻片15min；
[0097] 7)2×SSC(37℃)洗两次，每次10min；
[0098] 8)切片放入染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
[0099] 检测：
[0100] 9)从1×PBS中取出玻片，除去过多的水分，避免标本干燥。把玻片放入湿盒内，同时处理4张玻片。
[0101] 10)每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min。
[0102] 11)去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。
[0103] 扩增：
[0104] 12)从1×PBS中取出玻片，斜置玻片使液体排出；
[0105] 13)每张玻片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
[0106] 14)去掉塑料盖膜，把玻片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；
[0107] 15)从1×PBS中取出玻片，斜置切片使液体排出；
[0108] 16)每张玻片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；
[0109] 17)1×PBS室温下洗3次，每次2min。
[0110] 3、细胞核染色：
[0111] 1)每张玻片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；
[0113] 三、荧光原位免疫细胞化学
[0114] (1)标本处理。
[0115] (2)滴加适当稀释的特异性抗体于标本上，置湿盒中，37℃30～60分钟或4℃过夜。
[0116] (3)滴加适当稀释的间接荧光抗体，置湿盒中，37℃30～60分钟。
[0117] (5)PBS洗2次，双蒸水洗1次。
[0118] (6)甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察。
[0119] (7)对照染色：可用空白对照和阴性对照等。
[0120] 实施例4 循环肿瘤细胞的分离、实时定量PCR检测
[0121] 本发明提供了一种通过实时定量PCR联合检测lncRNAs PCGEM1及AR-V7(AR3)用于雄激素受体相关肿瘤激素去势抵抗及复发的诊断技术及试剂盒，其技术方案包括如下步骤：
[0122] a.lncRNA PCGEM1引物合成，引物序列如SEQ ID NO.1-4所示；
[0123] b.AR-V7(AR3)引物合成，引物序列如SEQ ID NO.5-6。
[0124] c.循环肿瘤细胞分离(循环肿瘤细胞无标记分选检测方法)。
[0125] 法国ScreenCell公司采用滤膜技术(循环肿瘤细胞(CTCs)无标记分选检测方法)根据肿瘤细胞在形态、大小及其它物理性质与正常细胞的不同，对其进行快速、高效、高灵敏度、无损伤地分离。或采用免疫标记方法进行分离检测分析，如美国强生公司旗下Veridex公司研发的CellSearch系统，该系统具有很好的特异性、灵敏度、准确性和可重复性，是目前唯一获得FDA、SFDA认证的技术，在美国已经被广泛应用到临床诊断。循环肿瘤细胞进行实时定量PCR检测样本需要分离准备、mRNA提取，逆转录等常规处理。本发明联合lncRNAs PCGEM1及AR-V7(AR3)两个目标基因检测。
[0126] d.应用上述引物与循环肿瘤细胞进行实时定量PCR检测。
[0127] e.本发明提供了一种通过联合lncRNA PCGEM1及AR-V7(AR3)两个目标基因检测方法，用于雄激素受体相关肿瘤激素去势抵抗及复发的诊断技术及试剂盒，该试剂盒包括了上述特异性引物和实时定量PCR试剂。
[0128] f.实时定量PCR检测。
[0129] 一、样品RNA的抽提
[0130] (1)取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
[0131] (2)两相分离：每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60％。
[0132] (3)RNA沉淀：将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
[0133] (4)RNA清洗：移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75％乙醇(75％乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
[0134] (5)RNA干燥：小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
[0135] (6)溶解RNA沉淀：溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
[0136] 二、样品cDNA合成
[0137] (1)收集细胞及样本。
[0139] (3)取100ng的总RNA，进行逆转录。
[0140] 三、待测样品的待测基因实时定量PCR
[0141] (1)所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。
[0142] 体系配置如下：
[0143] 表1
[0144]反应物 计量
SYBR Green 1染料 10μl
上游引物 1μl
下游引物 1μl
dNTP 1μl
Taq聚合酶 2μl
待测样品cDNA 5μl
ddH2O 30μl
总体积 50μl
SYBR Green 1染料 10μl
上游引物 1μl
下游引物 1μl
dNTP 1μl
Taq聚合酶 2μl
待测样品cDNA 5μl
ddH2O 30μl
总体积 50μl
[0145] 上面表中引物：
[0146] lncRNA PCGEM1的两对核酸引物，其序列如下：
[0147] PCGEM1-5.1(SEQ ID NO.1)：TTTTTGCCCTATGCCGTAAC；
[0148] PCGEM1-3.1(SEQ ID NO.2)：GGAGACTCCCAACCTGATGA；
[0149] 或为
[0150] PCGEM1-5.2(SEQ ID NO.3)：GGTAGGCACGTGGAGGACTA；
[0151] PCGEM1-3.2(SEQ ID NO.4)：TGCTTTTGTGGGTTTGTTCA。
[0152] AR-V7(AR3)两条核酸引物，其序列如下：
[0153] AR3-5.1(SEQ ID NO.5)：GCAATTGCAAGCATCTCAAA；
[0154] AR3-3.1(SEQ ID NO.6)：GGAGGGAGTCAGCAATCAAG。
[0155] 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
[0156] (2)将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃延伸7分钟。
[0157] 4数据分析
[0158] 实验结果如图4、图5所示，从图中可以看出PCGEM1及AR-V7(AR3)表达具有高度相关性，和低度恶性肿瘤比较，在高度恶性的肿瘤中，尤其是前列腺肿瘤中，PCGEM1及AR-V7(AR3)被诱导显著上调。PCGEM1及AR-V7(AR3)表达具有高度正相关性。
[0159] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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