一种木蹄复方提取物及其制备方法与用途
阅读：709发布：2023-03-05
专利汇可以提供一种木蹄复方提取物及其制备方法与用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 医药技术领域。具体的说，本发明涉及一种木 蹄 复方提取物及其制备方法和用途。木蹄复方按重量比组成为：木蹄层孔菌(1～10)∶松针层孔菌(1～9)∶赤芝(1)，复方提取物的提取方法为：配制好的术蹄复方，混合之后 粉碎 ，加纯 水 ，水提醇沉后取上清液，减压浓缩，浓缩液 真空 干燥，即得。本发明中木蹄复方提取物中三萜和三萜皂苷的含量不低于5.5％。该提取物具不仅具有有显著的体外和体内抗 肿瘤 功效，而且没有明显急性毒性，小鼠的最大耐受量为0.2g(折合生药量为4.58g)，为人口服用量的327倍。该提取物与药学上可接受的载体混合，可制成复方制剂，其中复方制剂包括口服液、注射液、混悬剂、丸剂、片剂、胶囊、散剂、颗粒剂或滴丸剂。，下面是一种木蹄复方提取物及其制备方法与用途专利的具体信息内容。
1.木蹄复方提取物，其特征在于三萜类和三萜皂苷的含量不低于5.5％。
2.权利要求1所述木蹄复方提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，步骤一：将木蹄复方粉碎；
步骤二：粉碎之后的木蹄复方加水，加热回流提取，低温静置后，离心，上清液减压浓缩。之后，浓缩液再加乙醇，使乙醇终浓度为80％，在低温静置后，离心，取上清液，再次减压浓缩，浓缩液真空干燥，即得。
3.权利要求1中所述木蹄复方提取物的用途，其特征为：((1)该提取物在体外对人肺腺癌细胞(A549)、人宫颈癌细胞(Hela)、人肝癌细胞(QGY)、人前列腺癌细胞(DU145)、人结肠癌细胞(HCT116)、人食管癌细胞(Eca109)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-435S)、人胃癌细胞(SGC-7901)、人成骨肉瘤细胞(Saos-2)、人骨肉瘤细胞(U2Os)等肿瘤细胞株有显著杀伤作用。(2)该提取物能有效诱导包括A549在内的肿瘤细胞凋亡。(3)该提取物在体内对小鼠肉瘤S180和Lewis肺癌移植瘤模型肿瘤有显著的抑制作用。(4)该提取物能有效提高荷瘤小鼠免疫功能，能使荷瘤小鼠的胸腺指数和外周血TNF-a含量提高。
4.根据权利要求2所述木蹄复方，其特征在于：木蹄层孔菌∶松针层孔菌∶赤芝的重量比为1～10∶1～9∶1。
5.权利要求2中所述木蹄复方提取物与药学上可接受的载体混合，可制成复方制剂。
6.权利要求5中所述复方制剂包括口服液、注射液、混悬剂、丸剂、片剂、胶囊、散剂、颗粒剂或滴丸剂。
一种木蹄复方提取物及其制备方法与用途
1技术领域
[0002] 近年来，我国肿瘤发病率处于快速上升期，每年癌症发病人数约260万，死亡180万，已成为中国城市和农村居民第一死因。由于肿瘤手术切除、化疗和放疗都存在固有缺陷，天然药物或中药抗肿瘤研究被日益重视。药用真菌是天然药物中的一个重要组成部分，而抗肿瘤作用是药用真菌重要的功效之一。
[0003] 其中，木蹄层孔菌Fomes fomentarius(L.:Fr)Kick.又名桦菌芝，是多孔菌科、层孔菌属的药用真菌。《中华本草》中记载：木蹄层孔菌子实体无柄。菌盖马蹄形，长径3-40cm，短径2-27cm，厚2-18cm。表面有厚角质皮壳，灰色、浅褐色或黑色，光滑，有明显的同心环棱纹。管口面浅褐色或灰色，管口圆形，每1mm间3-4个。纵剖面可见菌管多层，每层厚5-25mm。木栓质。气微，味淡。其药理作用主要是：显着提高实验小鼠减压缺氧的耐受能力，延长其存活时间，具有抗疲劳、抗高温的作用。并且能影响缺氧机体肠系膜微循环的流速、流态，对微循环具有改善作用。主治：消积；化瘀；抗癌(食管癌；胃癌和子宫癌)。通过小鼠实验已证明：木蹄层孔菌中分离出的单宁类酚性物对小鼠移植性肿瘤S180有明显杀灭作用，而张丽萍等深入研究发现木蹄层孔菌多糖对S180肿瘤细胞并无直接杀伤作用，而是通过激活动物机体的免疫功能，激活巨噬细胞、自然杀伤细胞、杀伤性T细胞的活性，从而增强对肿瘤免疫功能。
[0004] 松针层孔菌Phellinus pini.又名松针灵芝、松木层孔菌，为多孔菌科、层孔菌属药用真菌。《中国大型真菌原色图鉴》记载：其子实体多年生，木栓质，无辆，菌盖扁米球形至马蹄形，4-14厘米7×24厘米，罕达23厘米×40厘米，厚2.5-18.5厘米或更大。盖面初期有红褐色胶状皮壳，渐角质化而成灰色至黑色，并有宽的棱带，边缘往钝，初期近白色，后渐变淡黄色至赤粟色，下侧无子实层。菌肉近白色至淡黄褐色，有环纹，木栓质至木质。厚0.5-2厘米，味苦。菌管多层，每层厚3-5毫米，淡黄色，管口白色至乳白色。孢子卵圆形或椭圆形，无色。生于松、云杉、冷杉、铁杉及落叶松等针叶树的树干或朽木上。偶尔也生于阔叶树的枯腐木上。王稳航、刘安军等对松针层孔菌的药理作用进行了比较系统的研究，结果显示：松针灵芝的三种多糖均不同程度地提高了小鼠血清、心、肝、脑、脾中SOD、GSH-Px活力，降低了MDA生成量，而对TOAC值影响较小；同时，三利多糖均显著提高了小鼠体内血清NO生成量。同时，他们提出三种多糖的抗氧化机制可能与其它抗氧化剂不同，其对小鼠体内氧 化压力和抗氧水平呈双重增加效果，可能是由于多糖作为免疫物质引起机体的免疫反应造成的。松针层孔菌是针叶林里红野生松、落叶松、云杉最主要的、危害最大的火立木腐朽菌，对于针叶林无疑是一种癌，但是对于人类却是抑制肿瘤、治疗癌症的一剂良药。《中国大型真菌原色图鉴》73页中记载：松针子实体含齿孔酸等活性物质，是所有真菌中治疗癌症效果最好的品种，子实体提取物对小白鼠肉瘤180及艾氏腹水癌的抑制率均达100％。然而，松针具有毒性，为达到中医理论中扶正祛邪的目的，所以松针必须要与其他中药配合才可解除毒性，安全使用。目前采用松针层孔菌为主要成份治疗各类癌症的有效配方的机构，国内外仅有两家，一家是美国的CELG，另一家用国内的汉草荟。
[0005] 赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr)Karst为多孔菌科、灵芝属药用真菌。据《中国药典》记载：赤芝外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形，直径10～18cm，厚1～2cm。皮壳坚硬，黄褐色至红褐色，有光泽，具环状棱纹和辐射状皱纹，边缘薄而平截，常稍内卷。菌肉白色至淡棕色。菌柄圆柱形，侧生，少偏生，长7～15cm，直径1～3.5cm，红褐色至紫褐色，光亮。孢子细小，黄褐色。气微香，味苦涩。其主要功效为：补气安神，止咳平喘。
用于眩晕不眠，心悸气短，虚劳咳喘。此外，赤芝抗肿瘤功效已被广泛报道，其抗肿瘤机制也已被深入研究，主要包括：1.促凋亡：通过促进Bax表达，同时抑制Bcl-2和Bcl-xl等基因表达，从而抑制淋巴瘤、炎性乳腺癌等生长，促使其凋亡；2.生长抑制：通过抑制周期蛋白cyclinD1，抑制卵巢癌细胞生长；3.提高免疫：灵芝多糖和三萜类物质能广泛调节免疫细胞和免疫相关细胞的功能，包括B细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞等，同时它们还时以促进TNF-α表达，降低IL-10，TGF-β1和VEGF表达，增强免疫应答强度。
用于眩晕不眠，心悸气短，虚劳咳喘。此外，赤芝抗肿瘤功效已被广泛报道，其抗肿瘤机制也已被深入研究，主要包括：1.促凋亡：通过促进Bax表达，同时抑制Bcl-2和Bcl-xl等基因表达，从而抑制淋巴瘤、炎性乳腺癌等生长，促使其凋亡；2.生长抑制：通过抑制周期蛋白cyclinD1，抑制卵巢癌细胞生长；3.提高免疫：灵芝多糖和三萜类物质能广泛调节免疫细胞和免疫相关细胞的功能，包括B细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞等，同时它们还时以促进TNF-α表达，降低IL-10，TGF-β1和VEGF表达，增强免疫应答强度。
[0006] 目前，中药、天然药物复方已经成为治病用药的最主要形式之一，把不同药理机制的真菌组成复方更有利于抗肿瘤治疗。本研究首次提出木蹄层孔菌、松针层孔菌和赤芝三者结合，以达到扶正气，提高肿瘤免疫、肿瘤杀伤的作用。3发明内容
[0007] 本发明目的在于提供一种高效低毒的木蹄复方提取物及制备方法。
[0008] 本发明的另一目的在于提供该提取物在体内和体外抗肿瘤中的用途。该提取物能在体外显著杀伤肿瘤细胞，并有效抑制小鼠体内肿瘤生长；并且小鼠口服和腹腔注射均没有发现明显毒性，最大耐受剂量为10g/kg。
[0009] 本发明涉及一利有显著抗肿瘤功效的、低毒性的木蹄复方提取物及制备方法。
[0010] 本发明木蹄复方中，木蹄层孔菌：松针层孔菌：赤芝的重量比为1～10∶1～9∶1。
[0011] 优选地，本发明木蹄复方中，木蹄层孔菌：松针层孔菌：赤芝的重量比为2～7∶1～6∶1。
[0012] 更优选地，本发明木蹄复方中，木蹄层孔菌：松针层孔菌：赤芝的重量比为4～5∶1～3∶ 1。
[0013] 本发明制备木蹄复方提取物方法步骤如下：
[0014] 步骤一：木蹄层孔菌、松针层孔菌和赤芝按照重量比要求配成木蹄复方，混合之后粉碎；
[0015] 步骤二：粉碎之后的木蹄复方加纯水，100℃加热回流提取3次，每次2小时，料液-1比分别为1∶20、1∶15和1∶10，4℃静置24小时后，9000r·min 离心30分钟，上清液减压浓缩20倍体积。之后，浓缩液再加95％乙醇，使乙醇终浓度为80％，在4℃静置24小-1
时后，9000r·min 离心30分钟，取上清液，减压浓缩20倍体积，浓缩液真空干燥，即得。
时后，9000r·min 离心30分钟，取上清液，减压浓缩20倍体积，浓缩液真空干燥，即得。
[0016] 本发明制备的木蹄复方提取物，其成分分析结果显示其含有机酸，氨基酸、多肽和蛋白质，糖、多糖和苷类，皂苷，内酯、香豆素及其苷类，植物甾醇和三萜成分以及挥发油和油脂等多种成分，其中三萜类和三萜皂苷的含量不低于5.5％。
[0017] 本发明制备的木蹄复方提取物，其用途在于：(1)该提取物在体外对人肺腺癌细胞(A549)、人宫颈癌细胞(Hela)、人肝癌细胞(QGY)、人前列腺癌细胞(DU145)、人结肠癌细胞(HCT116)、人食管癌细胞(Eca109)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-435S)、人胃癌细胞(SGC-7901)、人成骨肉瘤细胞(Saos-2)、人骨肉瘤细胞(U2Os)等肿瘤细胞株有显著杀伤作用。(2)该提取物能有效诱导细胞凋亡，终浓度为100μg/ml作用24h后，A549的凋亡率为14.8％。(3)该提取物在体内对小鼠肉瘤S180和Lewis肺癌移植瘤模型肿瘤有显著的抑制作用，在给药剂量为150mg/kg时对S180肉瘤的抑瘤率为57.7％；在给药剂量为100mg/kg时对Lewis肺癌的抑瘤率为56.5％。(4)该提取物能有效提高荷瘤小鼠免疫功能，能使荷瘤小鼠的胸腺指数和外周血TNF-a含量提高。
[0018] 本发明制备的木蹄复方提取物与药学上可接受的载体混合，可制成复方制剂，其中复方制剂包括口服液、注射液、混悬剂、丸剂、片剂、胶囊、散剂、颗粒剂或滴丸剂。
[0019] 本发明与已有技术相比，具有如下显著特征：
[0020] (1)提供一种新的抗肿瘤的木蹄复方：木蹄层孔菌抗肿瘤的作用机理在于其毒性作用，作为复方中君药，而松针层孔菌也有显著抗肿瘤作用，作为臣药，而赤芝有提高机体免疫力的功效，与前两者配伍使用，有很好扶正祛邪的作用。
[0021] (2)提供一种新的抗肿瘤木蹄复方提取物，该提取物的提取方法为：水提醇沉，然后离心取上清液，浓缩，干燥，即得。
[0022] (3)该提取物成分分析结果显示其含有机酸，氨基酸、多肽和蛋白质，糖、多糖和苷类，皂苷，内酯、香豆素及其苷类，植物甾醇和三萜成分以及挥发油和油脂等多种成分，其中三萜类和三萜皂苷的含量不低于5.5％。
[0023] (4)该提取物具有明显体内、体外抑制肿瘤细胞生长的作用；能提高荷瘤小鼠免疫功能， 能使荷瘤小鼠的胸腺指数和外周血TNF-a含量提高；且该提取物小鼠口服和腹腔注射没有明显毒性，最大耐受剂量为10g/kg。
[0024] (5)该提取物易溶于水，水溶液颜色为棕色。
[0026] 图1木蹄复方提取物对A549细胞凋亡的影响5具体实施方式
[0027] 以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
[0028] 实施例1木蹄复方提取物的制备
[0029] 木蹄层孔菌60g、松针层孔菌30g和赤芝15g，粉碎，加水，100℃加热回流提取3次，每次2h，料液比分别为1∶20、1∶15和1∶10，过滤，合并滤液，4℃静置24h，9000r/min离心30min，上消液减压浓缩20倍体积，浓缩液加95％乙醇，使乙醇终浓度为80％，4℃静置24h，9000r/min离心30min，上清液减压浓缩20倍体积，浓缩液真空干燥，即得。
[0030] 实施例2木蹄复方提取物的制备
[0031] 木蹄层孔菌70g、松针层孔菌20g和赤芝15g，粉碎，加水，100℃加热回流提取3次，每次2h，料液比分别为1∶20、1∶15和1∶10，过滤，合并滤液，4℃静置24h，9000r/min离心30min，上清液减压浓缩20倍体积，浓缩液加95％乙醇，使乙醇终浓度为80％，4℃静置24h，9000r/min离心30min，上清液减压浓缩20倍体积，浓缩液真空干燥，即得。
[0032] 实施例3木蹄复方提取物成分分析
[0033] (1)组分分析
[0034] 把木蹄复方提取物溶于80％乙醇溶液，即得供试液，然后采用系统预试法对其进行鉴别。①试管预试法向盛有供试液的试管中加入相关试剂，根据颜色、沉淀、荧光等反应现象判断某化学成分的存在。②圆形滤纸层法用毛细点样管吸取供试液在圆形滤纸上点样，待干后使乙醇从中心展开，喷以不同显色剂，根据出现的颜色、斑点或产生的荧光等现象判断某化学成分的存在。结果如表1所示，可知其含有有机酸，糖、多糖和苷类，皂苷，内酯、香豆素及其苷类，植物甾醇、三萜成分以及挥发油和油脂。可能含有生物碱，氨基酸、多肽和蛋白质，黄铜及其苷类以及蒽醌及其苷类。
[0035] 表1木蹄复方提取物化学成分
[0036]
[0037]
[0038] Note：“+”means positive reaction；“-”means negative reaction[0039] (2)总三萜和三萜皂苷含量测定
[0040] ①对照品溶液的制备
[0041] 精密称取熊果酸对照品10.7mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇使之溶解并稀释到刻度，摇匀，即得。
[0042] ②供试品溶液的制备
[0043] 精密称取复方提取物200mg，置于200mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，即得。
[0044] ③标准曲线的制备
[0045] 精密吸取熊果酸溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mL分别置于具塞试管中，加入挥去溶剂，加入新配制的5％香草醛-冰醋酸溶液0.2mL及高氯酸1.2mL，在70℃恒温水浴中加热15min，流水冷至室温，加入乙酸乙酯使总量为5mL.摇匀，15min后在550nm处测吸光度值。以试剂空白为参比液，绘制标准曲线。得回归方程y＝4.4209x-0.0051R＝0.99785。
[0046] ④测定取0.5mL供试品溶液，按标准曲线制备项下的方法，依法测定吸光度。计算，三批样品总三萜和三萜皂苷含量分别为6.09％，5.80％，5.50％，可知总三萜和三萜皂苷含量在5.50％以上。
[0047] 实施例4木蹄复方提取物体外抗肿瘤功效
[0048] 取对数生长期细胞A549、Hela、QGY、DU145、HCT116、Eca109、MDA-MB-435S、SGC-7901、Saos-2和U2os，细胞用胰酶消化，调细胞浓度，然后把细胞悬液接种到96孔培养板中，每孔190μL，约5000个细胞。37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养24h，然后每孔加入10μL不同浓度的药液，继续培养48h。倒掉培养基，每孔加100μLPBS洗版一次，然后每孔加100μL0.5mg/mL的MTT溶液(用无血清的培养基配制)，继续培养4h后弃上清，然后每孔加入150μLDMSO，轻轻振荡10min，约1h左右用酶标仪在570nm波长处测吸光度值(A)， 计算IC50。木蹄复方提取物对A549、Hela、QGY、DU145、HCT116、Eca109、MDA-MB-435S、SGC-7901、Saos-2和U2os的IC50分别为0.542、0.365、0.252、0.521、0.326、0.593、0.870、0.562、0.396和0.627mg/ml。
[0049] 实施例5木蹄复方提取物急性毒性实验
[0050] 最大耐受量试验：取体重18～22g的健康KM小鼠60只(雌雄各半)，随即分为3组，每组20只(雌雄各半)，每组灌服不同浓度的药物两次(上午和下午各一次，时间间隔＞6h)，每次0.5mL，观察7天内动物的中毒反应或有无死亡。以死亡为主要观察指标，如有死亡，则以刚不出现死亡组为准，此时的用药量即为小鼠的最大耐受量。然后按公式计算出耐受倍数，以耐受人用量口服100倍以上为安全，计算公式如下：
[0051]
[0052] 结果，每只小鼠的最大耐受最为0.2g，折合生药量为4.58g，小鼠的最大耐受倍数为327倍＞100倍，说明其安全。
[0053] 实施例6木蹄复方提取物抑制小鼠肿瘤生长
[0054] (1)S180移植瘤试验：取生长良好的S180腹水瘤KM种鼠，无菌条件下取腹水，用生理盐水1∶8稀释，缓慢混匀，接种在同种异体小鼠右前肢腋下皮下，每只0.2mL，接种24h后按体重随机分为5组，每组10只，分别为模剂组、低剂量组(50mg/kg)、中剂量组(100mg/kg)、高剂量组(150mg/kg)和阳性对照组(CTX，30mg/kg)。模型组每天腹腔注射0.2mL生理盐水，给药组每天腹腔注射0.2mL不同浓度的药液，阳性对照组每天腹腔注射
0.2mL环磷酰胺溶液(CTX)。给药8天后剥取瘤块，称重，计算抑瘤率。抑瘤率(％)＝(模型组平均瘤重-给药组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100％。结果如表2所示。
0.2mL环磷酰胺溶液(CTX)。给药8天后剥取瘤块，称重，计算抑瘤率。抑瘤率(％)＝(模型组平均瘤重-给药组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100％。结果如表2所示。
[0055] 表2木蹄复方提取物对S180荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用
[0056]* **
[0057] Note：P＜0.05and P＜0.01vs blank control
[0058] (2)Lewis肺癌移植瘤模型：取肿瘤生长良好的Lewis肺癌C57BL/6小鼠，无菌条件下取瘤块，剔除包膜和坏死部分，加生理盐水(1∶4)匀浆。接种在同种异体小鼠右前肢腋下皮下，每只0.2mL，接种接种24h后按体重随机分为5组，每组10只，分别为模型组、低剂量组 (50mg/kg)、中剂量组(100mg/kg)、高剂量组(150mg/kg)和阳性对照组(CTX，30mg/kg)。模型组每天腹腔注射0.2mL生理盐水，给药组每天腹腔注射0.2mL不同浓度的药液，阳性对照组每天腹腔注射0.2mL环磷酰胺溶液(CTX)。给药15天后剥取瘤块，称重，计算抑瘤率。抑瘤率(％)＝(模型组平均瘤重-给药组平均瘤重)/模型组平均瘤重×100％。结果如表3所示。
[0059] 表3水蹄复方提取物对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用
[0060]
[0061] Note：*P＜0.05and **P＜0.01vs blank control
[0062] 实施例7木蹄复方提取物诱导肿瘤细胞凋亡
[0063] 取对数生长期细胞A549，将消化计数的单细胞悬液1.9mL接种于6孔板中，每孔约1.5×105个细胞。待细胞贴壁后加入100μL不同浓度的提取物，对照组加等量的提取物溶解介质(无血清的培养基)，培养24h后收集上清液，细胞用预冷的PBS洗两次，胰酶消化打匀后收集细胞，预冷的PBS洗两次，细胞用含2％小牛血清的PBS悬浮，加PI染料，冰上作用
5min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果如图1所示。
5min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果如图1所示。
[0064] 实施例8木蹄复方提取物刺激效应免疫增强
[0065] 动物接种、分组及给药等力法同实施例5，给药结束，各组动物摘眼球取血，分离血清；剥取胸腺和脾脏，称重，计算胸腺(脾)指数。胸腺(脾)指数＝胸腺(脾)重量(mg)/体重(g)。血清TNF-a含量测定：用ELISA试剂盒，采用双夹心酶联免疫检测法，λ＝450nm，根据标准A值绘制曲线，从标准曲线上读出待检测样本的TNF-a含量。结果如表4所示。
[0066] 表4-1木蹄复方提取物对S180荷瘤小鼠胸腺指数、脾指数以及
[0067] 外周血中TNF-α生成的影响
[0068]
[0069] 表4-2木蹄复方提取物对Lewis肺癌荷瘤小鼠胸腺指数、脾指数以及外周血中TNF-α生成的影响
[0070]
[0071]
[0072] Note：*P＜0.05and **P＜0.01 vs blank control
[0073] 本发明提出的一利有显著抗肿瘤功效且毒性低的木蹄复方提取物及其制备方法，本领域技术人员可通过借鉴本文，明显能不脱离本发明内容、精神和范围内，适当改变原料、工艺等来实现本产品。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动，都被视为在本发明精神、范围和内容中。
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