一种二芳基硫醚化合物、制备方法及其抗肿瘤应用
阅读：537发布：2023-03-04
专利汇可以提供一种二芳基硫醚化合物、制备方法及其抗肿瘤应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及新药研发领域，尤其涉及一种二芳基硫醚化合物、制备方法及其抗 肿瘤 应用，所述二芳基硫醚化合物，结构如通式I所示：A选自结构式II所示的4-硝基取代的取代苯基、结构式III所示的4-烷 氧 基取代的取代苯基、结构式IV所示的取代杂环或结构式V所示的取代杂环，其中R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R10，R11，R12，R13，R14,，R15，R16，R17，R18以及X，Y均如 说明书 中所述。该化合物抗异常新生血管、抑制微管蛋白聚合的作用机制，具有活性高和毒性低的优点。，下面是一种二芳基硫醚化合物、制备方法及其抗肿瘤应用专利的具体信息内容。
1.一种具有结构式I的化合物及其医药上可用的盐，
A为结构式III所示的4-烷氧基取代的取代苯基；
其中R5，R6，R7，R8分别独立选自氢、羟基，且R5，R6，R7，R8不同时为氢；R9选自1-3个碳原子的烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物及其医药上可用的盐，其特征在于，所述通式I化合物为3,4,5-三甲氧基-1-[(3-羟基-4-甲氧基苯基)硫代]苯。
3.根据权利要求1或2所述的化合物及其医药上可用的盐，其特征在于，所述羟基进一步取代成相应的磷酸酯、羧酸酯、及相应的有机盐或无机盐类衍生物。
4.权利要求1-3之一所述化合物及其医药上可用的盐，在制备微管蛋白聚合抑制剂方面的应用以及在制备治疗异常血管生长相关肿瘤的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述肿瘤选自肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、淋巴瘤、白血病、胰腺癌、骨细胞癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫颈癌、基底细胞癌、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、肾癌、松果体瘤、成血细胞癌、直肠癌、纤维肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、软骨肉瘤、精原细胞癌、恶性血管内皮细胞瘤或骨肉瘤。
一种二芳基硫醚化合物、制备方法及其抗肿瘤应用
技术领域
[0001] 本发明涉及新药研发领域，尤其涉及抗肿瘤药物新药研发领域。
背景技术
[0002] Combretum caffrum(Combretaceae)是南非风车子属植物，具有十分重要的医学应用价值，1988年Pettit等人从中分离出来一系列活性组Combretastatins。此系列化
合物能与秋水仙碱位点结合抑制微管蛋白聚合，其中以康普立停A4(Combretastatin A4，
CA4)的活性最好。CA4结构简单，与秋水仙碱的结构有一定的相似，它对细胞有丝分裂具有很高的抑制活性，同时对秋水仙碱促进的微管聚合有竞争性抑制作用，而且它能抑制肿瘤
细胞的有丝分裂，破坏分裂期纺锤体的形成，从而引起G2/M阻滞。同时，CA4能选择性地靶向生长中的肿瘤组织的新生血管。研究表明，它能在给药几分钟后使肿瘤相关的血管闭合，从而有效抑制血液进入和流出肿瘤细胞，几小时之内，新生血管关闭死亡。其作用机制初步认为：内皮细胞收缩、变圆、发泡以及内皮渗透性的升高，导致血流抗性增加，肿瘤血管的渗透性升高可能导致血管功能受损；血浆蛋白从血管内渗出，干扰了血管内外渗透压，引起组织液压力短暂升高，导致血管坏死，血管中液体损失继而引起血黏度升高，血流速度减慢，红细胞堆积，进一步升高血管抗性，使血流速度减慢。另外内皮细胞的损伤，可使基质膜和血流接触，引起凝血。除了这些作用，肿瘤血管本身具有很多交叉的微血管，这些结构使肿瘤血管中血液循环减慢，血流减少甚至停滞。但CA4对正常的血管没有毒副作用。导致这一选择性的原因可能是肿瘤组织的血管内皮细胞在形态和功能上的变化导致的渗透性增加，
细胞渗透性增加会使微管蛋白即细胞骨架破坏，而正常的内皮细胞受影响则小得多。
合物能与秋水仙碱位点结合抑制微管蛋白聚合，其中以康普立停A4(Combretastatin A4，
CA4)的活性最好。CA4结构简单，与秋水仙碱的结构有一定的相似，它对细胞有丝分裂具有很高的抑制活性，同时对秋水仙碱促进的微管聚合有竞争性抑制作用，而且它能抑制肿瘤
细胞的有丝分裂，破坏分裂期纺锤体的形成，从而引起G2/M阻滞。同时，CA4能选择性地靶向生长中的肿瘤组织的新生血管。研究表明，它能在给药几分钟后使肿瘤相关的血管闭合，从而有效抑制血液进入和流出肿瘤细胞，几小时之内，新生血管关闭死亡。其作用机制初步认为：内皮细胞收缩、变圆、发泡以及内皮渗透性的升高，导致血流抗性增加，肿瘤血管的渗透性升高可能导致血管功能受损；血浆蛋白从血管内渗出，干扰了血管内外渗透压，引起组织液压力短暂升高，导致血管坏死，血管中液体损失继而引起血黏度升高，血流速度减慢，红细胞堆积，进一步升高血管抗性，使血流速度减慢。另外内皮细胞的损伤，可使基质膜和血流接触，引起凝血。除了这些作用，肿瘤血管本身具有很多交叉的微血管，这些结构使肿瘤血管中血液循环减慢，血流减少甚至停滞。但CA4对正常的血管没有毒副作用。导致这一选择性的原因可能是肿瘤组织的血管内皮细胞在形态和功能上的变化导致的渗透性增加，
细胞渗透性增加会使微管蛋白即细胞骨架破坏，而正常的内皮细胞受影响则小得多。
[0003]
[0004] 但CA4也有其弱点——水溶性较差，故Pettit等人以它为先导化合物合成了其磷酸盐前药CA4P(US5561122)，大大改善其水溶性，目前已在进行临床Ⅲ期实
验。Ohsumi等人将3位羟基用电子等排体氨基替代合成了AVE-8063(EP0641767)，活
性有一定程度增强，再与氨基酸缩合得到水溶性较好的AC-7700(Ohsumi K.J Med Chem，
1998,41(16),3022-3032)。
验。Ohsumi等人将3位羟基用电子等排体氨基替代合成了AVE-8063(EP0641767)，活
性有一定程度增强，再与氨基酸缩合得到水溶性较好的AC-7700(Ohsumi K.J Med Chem，
1998,41(16),3022-3032)。
[0005]
[0006] 虽然CA4发现时间不长，但由于其良好的抗肿瘤活性、简单的结构及相对较低的毒副作用引起了广泛的兴趣，并已合成了许多新的有效地抗肿瘤化合物，对其构效关系也
有了一定研究，发现其中A环是保持活性的重要基团，B环的4位甲氧基也很重要但并非
不可替换的，3位羟基是一个重要的修饰位点，而双键桥部分以顺式为活性结构，反式无活性，双键可用其他结构如杂环或其他1～3个原子长度的链状结构替代。如Welsh W.J.合
成了一系列1,2,4-三唑环替代双键的CA4衍生物(WO2006047631)，Tracey等人用呋喃环
替代双键合成了一列化合物(Pirali Tracey etc.J.Med.Chem.2006,49(17),5372-5376.)，Wang Le等人则合成了一列含咪唑环桥链的CA4衍生物(Wang Le etc.J.Med.
Chem.2002,45(8),1697-1711.)，均有着不错的抗微管活性和细胞毒作用。Pettit
G.R.于1999年按生物电子等排原理用羰基替代双键得到了一系列化合物(WO9934788)，
Lawrence等人用氧原子替代双键得到了一系列化合物(Lawrence N.J.Bioorg.Med.Chem.
Lett.2001,11(1),51-54.)，都有着不错的抗肿瘤活性。
有了一定研究，发现其中A环是保持活性的重要基团，B环的4位甲氧基也很重要但并非
不可替换的，3位羟基是一个重要的修饰位点，而双键桥部分以顺式为活性结构，反式无活性，双键可用其他结构如杂环或其他1～3个原子长度的链状结构替代。如Welsh W.J.合
成了一系列1,2,4-三唑环替代双键的CA4衍生物(WO2006047631)，Tracey等人用呋喃环
替代双键合成了一列化合物(Pirali Tracey etc.J.Med.Chem.2006,49(17),5372-5376.)，Wang Le等人则合成了一列含咪唑环桥链的CA4衍生物(Wang Le etc.J.Med.
Chem.2002,45(8),1697-1711.)，均有着不错的抗微管活性和细胞毒作用。Pettit
G.R.于1999年按生物电子等排原理用羰基替代双键得到了一系列化合物(WO9934788)，
Lawrence等人用氧原子替代双键得到了一系列化合物(Lawrence N.J.Bioorg.Med.Chem.
Lett.2001,11(1),51-54.)，都有着不错的抗肿瘤活性。
[0007]
[0008] 早期的一些研究发现，一些简单的二芳基硫醚类化合物具有抗疟疾、抗菌等 生 物 活 性 (Chan,J.H.etc J.Med.Chem.1995,38,3608-3616；Singh,T.etc J.Med.
Chem.1970,326-327)。在对CA4的结构改造过程中,Chen等发现在分子中引入硫醚桥
链得到的二芳炔芳基硫醚类化合物9保留了一定的抗肿瘤活性(Chen,Z.etc J.Org.
Chem2000,65,8811-8815.)最近,Barbosa,E.G等同样发现硫醚类化合物10具有较强的抑
制微管蛋白活性和较强的抑制乳腺癌细胞株MCF-7的活性(Barbosa,E.G.etc Eur.J.Med.
Chem.2009,44,2685-2688)另外，2008年Serenex INC公开的一份专利中也涉及到几个具有
一定的抗增值活性的该类化合物(WO2008024963)。
Chem.1970,326-327)。在对CA4的结构改造过程中,Chen等发现在分子中引入硫醚桥
链得到的二芳炔芳基硫醚类化合物9保留了一定的抗肿瘤活性(Chen,Z.etc J.Org.
Chem2000,65,8811-8815.)最近,Barbosa,E.G等同样发现硫醚类化合物10具有较强的抑
制微管蛋白活性和较强的抑制乳腺癌细胞株MCF-7的活性(Barbosa,E.G.etc Eur.J.Med.
Chem.2009,44,2685-2688)另外，2008年Serenex INC公开的一份专利中也涉及到几个具有
一定的抗增值活性的该类化合物(WO2008024963)。
[0009]
[0010] 鉴于二芳基硫醚类CA4类似物较好的抗肿瘤活性，本发明对该类化合物进行了较深入的研究，合成了一系列新的二芳基硫醚类CA4类似物，测试结果显示其中多个化合物
具有更强的抗肿瘤活性。
具有更强的抗肿瘤活性。
发明内容
[0011] 本发明旨在提供一种二芳基硫醚类CA4衍生物，化合物的结构如通式I。
[0012] 本发明的另一个目的是提供通式I化合物的制备方法。
[0013] 本发明的另一个目的是提供通式I化合物的医药用途。
[0014] 本发明的技术方案之一是：
[0015] 一种具有结构式I的化合物及其医药上可用的盐，
[0016]
[0017] A选自结构式II所示的4-硝基取代的取代苯基、结构式III所示的4-烷氧基取代的取代苯基、结构式IV所示的取代杂环或结构式V所示的取代杂环；
[0018]
[0019] 其中R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R10，R11，R12，R13，R14,，R15，R16，R17，R18分别独立选自氢、卤素、羟基、胺基、取代胺基、氰基、烷基、烷氧基、硝基、酰胺基、卤代烷基、酰基、醛基、羧基、烷氧羰基或酰氧基，且R5，R6，R7，R8不同时为氢；
[0021] X，Y分别独立选自氮、氧或硫；
[0022] 其中所述烷基为1-6个碳原子烷基；所述烷氧基为1-6个碳原子的烷基氧基或氧基烷基；所述卤代烷基为被F、Cl或Br取代的1-6个碳原子的烷基；烷氧羰基为1-6个碳
原子的烷氧羰基。
原子的烷氧羰基。
[0023] 所述A为取代苯基II时，其中R1，R2，R3，R4分别独立地指氢、卤素、羟基、胺基、甲基、乙基。所述R1，R2，R3和R4中优选至少有一个为羟基或胺基，所述羟基或胺基进一步取代成其相应的磷酸酯、羧酸酯、磺酸酯、酰胺、肽类及相应的有机盐或无机盐类衍生物。
[0024] 所述A为取代苯基III时，其中R5，R6，R7，R8分别独立地指氢、卤素、羟基、胺基、甲基、乙基、苄基、烷氧基、硝基、酰氧基或酰胺基，且R5，R6，R7，R8不同时为氢。所述R5，R6，R7和R8中优选至少有一个为羟基或胺基，所述羟基或胺基进一步取代成其相应的磷酸酯、羧酸酯、磺酸酯、酰胺、肽类及相应的有机盐或无机盐类衍生物。
[0025] 所述A为取代杂环IV或取代杂环V时，R10，R11，R12，R13，R14,R15，R16，R17，R18分别独立选自氢、卤素、羟基、胺基、取代胺基、氰基、烷基、烷氧基。
[0026] 所述通式I化合物选自如下化合物：
[0027] 3,4,5-三甲氧基-1-[(3-氨基-4-硝基苯基)硫代]苯，
[0028] 3,4,5-三甲氧基-1-[(3-乙酰胺基-4-硝基苯基)硫代]苯，
[0029] 3,4,5-三甲氧基-1-[(3-硝基-4-甲氧基苯基)硫代]苯，
[0030] 3,4,5-三甲氧基-1-[(3-氨基-4-甲氧基苯基)硫代]苯，
[0031] 3,4,5-三甲氧基-1-[(3-氟-4-甲氧基苯基)硫代]苯，
[0032] 3,4,5-三甲氧基-1-[(4-乙氧基苯基)硫代]苯，
[0033] 3,4,5-三甲氧基-1-[(3-苄氧基-4-甲氧基苯基)硫代]苯，
[0034] 5-三氟甲基-2-[(3,4,5-三甲氧基苯基)硫代]吡啶，
[0035] 3-[(3,4,5-三甲氧基苯基)硫代]苯并噻吩-2-甲酸甲酯，
[0036] 2-芴甲氧酰胺基-3-乙酰氧基-N-[2-甲氧基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)硫代]丙酰胺，
[0037] 2-氨基-3-羟基-N-[2-甲氧基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)硫代]丙酰胺,
[0038] 3,4,5-三甲氧基-1-[(3-羟基-4-甲氧基苯基)硫代]苯。
[0039] 本发明的技术方案之二：
[0040] 通式I所述化合物及其医药上可用的盐的制备方法，具体步骤为：
[0041] 以苯硫酚化合物7为原料，与芳香氯代化合物8或芳香碘代化合物6溶在碱性催化剂作用下得到通式I化合物中的二芳基硫醚类衍生物；其中芳香碘代化合物6为
苯硫酚化合物7为 芳香氯代化合物8为 其中，A的
结构如上所述。
苯硫酚化合物7为 芳香氯代化合物8为 其中，A的
结构如上所述。
[0042] 下面对合成方法做进一步的解释和说明：
[0043] 上述合成方法中苯硫酚化合物7为已知化合物，可以通过现有方法合成或者通过购买得到。
[0044] 本发明的具体合成路线如下：
[0045]
[0046] 其中：THF表示四氢呋喃，DMF表示N,N-二甲基甲酰胺，i-PrOH表示异丙醇，EG表示乙二醇，t-BuOK表示叔丁醇钾，HAc表示醋酸。con.HNO3表示浓硝酸，con.HCl表示浓盐
酸。
酸。
[0047] 具体步骤包括：
[0048] a.化合物1脱羧硝化得化合物2，再还原成化合物3，然后再重氮化，与乙基黄原酸钾反应生成化合物4；
[0049]
[0050] b.将芳香胺5重氮化，再与碘化钠反应合成芳香碘代产物6；
[0051]
[0052] c.先将化合物4还原成苯硫酚7，然后与芳香氯代化合物8或芳香碘代化合物6溶在碱性催化剂作用下得到通式I化合物中的二芳基硫醚类衍生物；
[0053]
[0054] 其中所述化合物1为： 化合物2为 化合物3为化合物4为 芳香胺5为 芳香碘代化合物
6为 苯硫酚7为 芳香氯代化合物8为
6为 苯硫酚7为 芳香氯代化合物8为
[0055]
[0056] 其中，A的结构如上所述。
[0057] 为了制备通式I化合物中的含硫醚桥链的CA4衍生物，具体条件如下：
[0058] a步骤中的脱羧硝化的反应温度为0-100℃；还原反应所用还原剂可以是锌粉、铁粉、镁粉，酸可以是醋酸、盐酸，还原剂也可以是钯碳/水合肼，镁粉/水合肼，铁粉/水合肼，钯碳/氢气等，反应温度为0-100℃；重氮化步骤中试剂可以是亚硝酸钠、亚硝酸钾、硝基丁烷，酸可以是盐酸、硫酸、磷酸和醋酸，反应温度为-20-10℃；二硫代碳酸盐化试剂可以是各种烷基黄原酸盐，反应温度为0-120℃；
[0059] b步骤中的重氮化步骤可以用四氢锂铝/四氢呋喃还原，也可以用氢氧化钠水溶液水解，反应温度为0-100℃；而碘代反应的反应溶剂可以是乙醇，甲醇，异丙醇，乙二醇等醇，苯，甲苯，丙酮，四氢呋喃，二氧六环，N,N-二甲基甲酰胺，吡啶，二甲亚砜，二氯甲烷，三氯甲烷，二氯乙烷等。
[0060] c步骤中所用碱性催化剂为选自无机碱性化合物，如碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠等，反应温度为0-200℃。
[0061] 在另一优选例中，它包含步骤：
[0062] (1)化合物1在浓硝酸和醋酸作用下脱羧硝化得化合物2，再用锌粉/醋酸或钯碳/水合肼还原成化合物3，然后用亚硝酸钠和盐酸制成重氮盐溶液，再与乙基黄原酸钾反应
生成化合物4；
生成化合物4；
[0063] (2)将芳香胺5用亚硝酸钠和盐酸制成重氮盐溶液，再与碘化钠反应合成芳香碘代产物6；
[0064]
[0066] 为了制备通式I化合物中的二芳基硫醚类化合物，a步骤中的脱羧硝化步骤反应温度为0-100℃，还原反应所用还原剂可以是锌粉、铁粉、镁粉，酸可以是醋酸、盐酸，还原剂也可以是钯碳/水合肼，镁粉/水合肼，铁粉/水合肼，钯碳/氢气等，反应温度为
0-100℃，重氮化试剂可以是亚硝酸钠、亚硝酸钾、硝基丁烷，所用酸可以是盐酸、硫酸、磷酸和醋酸，反应温度为-20-10℃，二硫代碳酸盐化试剂可以是各种烷基黄原酸盐，反应温度为
0-120℃；
0-100℃，重氮化试剂可以是亚硝酸钠、亚硝酸钾、硝基丁烷，所用酸可以是盐酸、硫酸、磷酸和醋酸，反应温度为-20-10℃，二硫代碳酸盐化试剂可以是各种烷基黄原酸盐，反应温度为
0-120℃；
[0067] b步骤中的重氮化所用重氮化试剂可以是亚硝酸钠、亚硝酸钾、硝基丁烷，所用酸可以是盐酸、硫酸、磷酸和醋酸，反应温度为-20-10℃；碘代反应所以碘代试剂可以是碘化钠、碘化钾、碘单质、氯化碘，反应温度为0-100℃；
[0068] c步骤中的还原步骤可以用四氢锂铝/四氢呋喃还原，也可以用氢氧化钠水溶液水解，反应温度为0-100℃，而碘代反应的反应溶剂可以是乙醇，甲醇，异丙醇，乙二醇等醇，苯，甲苯，丙酮，四氢呋喃，二氧六环，N,N-二甲基甲酰胺，吡啶，二甲亚砜，二氯甲烷，三氯甲烷，二氯乙烷或混合溶剂等，所用碱性催化剂为碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠、各种醇钾或醇钠等，催化剂为碘化亚铜、碘化铜，反应温度为0-200℃。
[0069] 本发明的技术方案之三是：
[0070] 通式I所述化合物及其医药上可用的盐的应用，具体为，在制备微管蛋白聚合抑制剂方面的应用和在制备治疗异常血管生长相关肿瘤的药物中的应用。
[0071] 所述肿瘤选自肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、淋巴瘤、白血病、胰腺癌、骨细胞癌、前列腺癌、睾丸癌、膀胱癌、子宫颈癌、基底细胞癌、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、肾癌、松果体瘤、成血细胞癌、直肠癌、纤维肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤、软骨肉瘤、精原细胞癌、恶性血管内皮细胞瘤或骨肉瘤。
[0072] 据此，本发明提供了一类新二芳基硫醚类CA4衍生物，因其抗异常新生血管、抑制微管蛋白聚合的作用机制，该类化合物具有活性高和毒性低的优点。
具体实施方式
[0074] 实施例1
[0075] 制备O-乙基-S-(3,4,5-三甲氧基苯基)二硫代碳酸盐(ZLM-1)
[0076]
[0077] 将3,4,5-三甲氧基苯胺(22.3g)溶于30.5mL浓盐酸和250mL水中，冰浴冷至0℃左右，搅拌下缓慢滴加NaNO2水溶液(9.2g)，控温不超过5℃，滴毕继续反应15min，再加入AcONa(20.0g)。将此重氮盐溶液缓慢滴加至80℃左右的KS2COEt水溶液中(48.7g溶于
120mL水中)，于70-80℃反应1h。反应结束，冷至室温，EA萃取100mL×3，合并有机相。再
加无水硫酸钠干燥。抽滤，得滤液，旋去溶剂，得30.4g红褐色油状物，硅胶柱分离，得11.8g
1
淡黄白色粘稠固体，产率34％.H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.34(t,J＝7.2Hz,3H),3.84(s,3
H),3.85(s,6H),3.88(s,3H),4.61(dd,J＝7.2,7.2Hz,1H),6.73(s,1H)。
120mL水中)，于70-80℃反应1h。反应结束，冷至室温，EA萃取100mL×3，合并有机相。再
加无水硫酸钠干燥。抽滤，得滤液，旋去溶剂，得30.4g红褐色油状物，硅胶柱分离，得11.8g
1
淡黄白色粘稠固体，产率34％.H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.34(t,J＝7.2Hz,3H),3.84(s,3
H),3.85(s,6H),3.88(s,3H),4.61(dd,J＝7.2,7.2Hz,1H),6.73(s,1H)。
[0078] 实施例2
[0079] 制备3,4,5-三甲氧基-1-[(3-氨基-4-硝基苯基)硫代]苯(ZLM-2)
[0080]
[0081] 将O-乙基-S-(3,4,5-三甲氧基苯基)二硫代碳酸盐ZLM-1(4.0g)溶于THF(66mL)中，缓慢分次加入LiAlH4(2.11g)，回流1h，冷至室温，用10％HCl调至pH＝5，再用EA萃取
100mL×3，合并有机相，加无水硫酸钠干燥1h，然后抽滤，得滤液，旋去溶剂即得3,4,5-三甲氧基苯硫酚。氮气保护下，先将K2CO3(5.8g)与5-氯-2-硝基苯胺(1.2g)加至50mL二
颈瓶中，再将上步所得3,4,5-三甲氧基苯硫酚溶于DMF(23.7mL)加入反应瓶中，于120℃
回流，TLC监测(展开剂：PE:EA＝4:1)。原料消失，停止反应，冷至室温，加200mL水稀释，用EA萃取200mL×4，合并有机相，加无水硫酸钠干燥1h。抽滤，得滤液，旋去溶剂，硅胶柱
1
分离，得1.2g黄色固体，产率51％，mp168.1-170.2℃.H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.86(s,6H),3.91(s,3H),6.09(br,2H),6.33(d,J＝1.6Hz,1H),6.43(dd,J＝7.2,2.0Hz,1H),6.79(s
13
,2H),7.99(d,J＝9.6Hz,1H). C NMR(400MHz,CDCl3):δ56.3,61.0,112.2,113.5,114.9,1
+
24.1,126.6,129.7,139.3,144.9,149.8,153.9.MS(EI)m/z:336(M)。
100mL×3，合并有机相，加无水硫酸钠干燥1h，然后抽滤，得滤液，旋去溶剂即得3,4,5-三甲氧基苯硫酚。氮气保护下，先将K2CO3(5.8g)与5-氯-2-硝基苯胺(1.2g)加至50mL二
颈瓶中，再将上步所得3,4,5-三甲氧基苯硫酚溶于DMF(23.7mL)加入反应瓶中，于120℃
回流，TLC监测(展开剂：PE:EA＝4:1)。原料消失，停止反应，冷至室温，加200mL水稀释，用EA萃取200mL×4，合并有机相，加无水硫酸钠干燥1h。抽滤，得滤液，旋去溶剂，硅胶柱
1
分离，得1.2g黄色固体，产率51％，mp168.1-170.2℃.H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.86(s,6H),3.91(s,3H),6.09(br,2H),6.33(d,J＝1.6Hz,1H),6.43(dd,J＝7.2,2.0Hz,1H),6.79(s
13
,2H),7.99(d,J＝9.6Hz,1H). C NMR(400MHz,CDCl3):δ56.3,61.0,112.2,113.5,114.9,1
+
24.1,126.6,129.7,139.3,144.9,149.8,153.9.MS(EI)m/z:336(M)。
[0082] 实施例3
[0083] 制备3,4,5-三甲氧基-1-[(3-乙酰胺基-4-硝基苯基)硫代]苯(ZLM-3)
[0084]
[0085] 将3,4,5-三甲氧基-1-[(3-氨基-4-硝基苯基)硫代]苯ZLM-2(50mg)加至醋酐(17μL)和醋酸(9μL)的混合溶剂中，于85-90℃回流2h。减压蒸去低沸点物质，得61mg
1
黄色固体，产率93％，mp168.1-170.2℃.H NMR(400MHz,CDCl3):δ2.26(s,3H),3.87(s,6H),3.92(s,3H),6.73(dd,J＝7.2,1.8Hz,1H),6.81(s,2H),8.07(d,J＝8.8Hz,1H),8.61(d,J
13
＝6.0Hz,1H),10.48(s,1H). CNMR(400MHz,CDCl3):δ25.7,56.3,61.0,112.2,117.6,119.
+
8,123.7,126.2,132.9,135.2,139.6,151.4,154.0,168.9.MS(EI)m/z:378(M)。
1
黄色固体，产率93％，mp168.1-170.2℃.H NMR(400MHz,CDCl3):δ2.26(s,3H),3.87(s,6H),3.92(s,3H),6.73(dd,J＝7.2,1.8Hz,1H),6.81(s,2H),8.07(d,J＝8.8Hz,1H),8.61(d,J
13
＝6.0Hz,1H),10.48(s,1H). CNMR(400MHz,CDCl3):δ25.7,56.3,61.0,112.2,117.6,119.
+
8,123.7,126.2,132.9,135.2,139.6,151.4,154.0,168.9.MS(EI)m/z:378(M)。
[0086] 实施例4
[0087] 制备3-硝基-4-甲氧基碘苯(ZLM-4)
[0088]
[0089] 将3-硝基-4-甲氧基苯胺(860mg)溶于稀盐酸(0.5mL浓盐酸加9mL水稀释)中，冷至0℃，开始滴加NaNO2水溶液(424mg，)，再于此温度下反应20min，即得重氮盐溶液。然后将此重氮盐溶液于0℃缓慢滴加至NaI水溶液(921mg)中，滴毕，升至室温搅拌12h。EA
萃取50mL×3，合并有机相，加无水硫酸钠干燥1h，然后抽滤，得滤液，旋去溶剂，硅胶柱分离，得573mg黄色固体，产率40％，mp95.8-97.3℃(文献值：97-99℃)。
萃取50mL×3，合并有机相，加无水硫酸钠干燥1h，然后抽滤，得滤液，旋去溶剂，硅胶柱分离，得573mg黄色固体，产率40％，mp95.8-97.3℃(文献值：97-99℃)。
[0090] 实施例5
[0091] 制备3-氟-4-甲氧基碘苯(ZLM-5)
[0092]
[0093] 按实施例4，用3-氟-4-甲氧基苯胺(600mg)代替3-硝基-4-甲氧基苯胺，得549mg淡黄色固体，产率56％，mp32.8-34.1℃(文献值：34℃)。
[0094] 实施例6
[0095] 制备3,4,5-三甲氧基-1-[(3-硝基-4-甲氧基苯基)硫代]苯(ZLM-6)
[0096]
[0097] 将O-乙基-S-(3,4,5-三甲氧基苯基)二硫代碳酸盐ZLM-1(2.42g)溶于THF(32mL)中，缓慢分次加入LiAlH4(1.3g)，回流1h，冷至室温，用10％HCl调至pH＝
5，再用EA萃取20mL×4，合并有机相，加无水硫酸钠干燥1h，然后抽滤，得滤液，旋去
溶剂，得黄色油状物。氮气保护下，先将碳酸钾(1.16g，8.40mmol，2.0eq)、CuI(400mg，
2.10mmol，0.5eq)及乙二醇(0.49mL，8.40mmol，2.0eq)加至25mL二颈瓶中，再将上步所
得黄色油状物溶于异丙醇(4.0mL)，然后将其加入反应瓶中，于80℃回流20h，冷至室温，
抽滤，滤渣用EA洗涤数次，得滤液，旋去溶剂，硅胶柱分离，得597mg黄色固体，产率40％，mp168.1-170.2℃.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.81(s,6H),3.85(s,3H),3.95(s,3H),6.61(s
,2H),7.03(d,J＝8.8Hz,1H),7.48(dd,J＝6.4,2.2Hz,1H),7.81(d,J＝6.4Hz,1H).13C NM
R(400MHz,CDCl3):δ56.3,61.0,112.2,113.5,114.9,124.1,126.6,129.7,139.3,144.9,1
49.8,153.9.MS(EI)m/z:351(M+)。
5，再用EA萃取20mL×4，合并有机相，加无水硫酸钠干燥1h，然后抽滤，得滤液，旋去
溶剂，得黄色油状物。氮气保护下，先将碳酸钾(1.16g，8.40mmol，2.0eq)、CuI(400mg，
2.10mmol，0.5eq)及乙二醇(0.49mL，8.40mmol，2.0eq)加至25mL二颈瓶中，再将上步所
得黄色油状物溶于异丙醇(4.0mL)，然后将其加入反应瓶中，于80℃回流20h，冷至室温，
抽滤，滤渣用EA洗涤数次，得滤液，旋去溶剂，硅胶柱分离，得597mg黄色固体，产率40％，mp168.1-170.2℃.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.81(s,6H),3.85(s,3H),3.95(s,3H),6.61(s
,2H),7.03(d,J＝8.8Hz,1H),7.48(dd,J＝6.4,2.2Hz,1H),7.81(d,J＝6.4Hz,1H).13C NM
R(400MHz,CDCl3):δ56.3,61.0,112.2,113.5,114.9,124.1,126.6,129.7,139.3,144.9,1
49.8,153.9.MS(EI)m/z:351(M+)。
[0098] 实施例7
[0099] 制备3,4,5-三甲氧基-1-[(3-氨基-4-甲氧基苯基)硫代]苯(ZLM-7)
[0100]
[0101] 按实施例X，用3,4,5-三甲氧基-1-[(3-硝基-4-甲氧基苯基)硫代]苯ZLM-6(300mg)代替1-(3’-硝基-4’-甲氧基苯基)-2-甲基-5-(3’,4’,5’-三甲氧基苯
基)吡咯ZLM-12，得181mg白色固体，产率66％，mp168.1-170.2℃.1H NMR(400MHz,CDCl3):
δ3.77(s,6H),3.81(s,3H),3.86(s,3H),6.50(s,2H),6.75(d,J＝8.4Hz,1H),6.78(d,J＝
2.4Hz,1H),6.83(dd,J＝6.4,2.0Hz,1H).13C NMR(400MHz,CDCl3):δ55.5,56.0,60.9,106.
4,110.7,118.6,122.9,125.3,132.6,136.4,136.8,147.2,153.3.MS(EI)m/z:321(M+)。
基)吡咯ZLM-12，得181mg白色固体，产率66％，mp168.1-170.2℃.1H NMR(400MHz,CDCl3):
δ3.77(s,6H),3.81(s,3H),3.86(s,3H),6.50(s,2H),6.75(d,J＝8.4Hz,1H),6.78(d,J＝
2.4Hz,1H),6.83(dd,J＝6.4,2.0Hz,1H).13C NMR(400MHz,CDCl3):δ55.5,56.0,60.9,106.
4,110.7,118.6,122.9,125.3,132.6,136.4,136.8,147.2,153.3.MS(EI)m/z:321(M+)。
[0102] 实施例8
[0103] 制备3,4,5-三甲氧基-1-[(4-硝基苯基)硫代]苯(ZLM-8)
[0104]
[0105] 按实施例6，用对硝基碘苯(200mg)代替3-硝基-4-甲氧基碘苯，得194mg淡黄色固体，产率76％，mp168.1-170.2℃.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.85(s,6H),3.91(s,3H),6.7
9(s,2H),7.17(d,J＝8.8Hz,2H),8.09(d,J＝8.8Hz,2H).13C NMR(400MHz,CDCl3):δ56.3,
61.0,112.0,124.1,124.2,125.9,138.4,145.1,149.1,154.1.MS(EI)m/z:321(M+)。
9(s,2H),7.17(d,J＝8.8Hz,2H),8.09(d,J＝8.8Hz,2H).13C NMR(400MHz,CDCl3):δ56.3,
61.0,112.0,124.1,124.2,125.9,138.4,145.1,149.1,154.1.MS(EI)m/z:321(M+)。
[0106] 实施例9
[0107] 制备3,4,5-三甲氧基-1-[(3-氟-4-甲氧基苯基)硫代]苯(ZLM-9)
[0108]
[0109] 按实施例6，用3-氟-4-甲氧基碘苯(282mg)代替3-硝基-4-甲氧基碘苯，得1
222mg白色固体，产率69％，mp168.1-170.2℃.H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.80(s,6H),3.84
13
(s,3H),3.90(s,3H),6.55(s,2H),6.91-6.95(m,1H),7.10-7.14(m,2H). C NMR(400MHz,CD
Cl3):δ56.1,56.2,60.9,107.8,113.6,119.1,119.2,126.9,127.0,127.6,130.6,137.2,1
+
47.2,147.3,151.0,153.5.MS(EI)m/z:324(M)。
222mg白色固体，产率69％，mp168.1-170.2℃.H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.80(s,6H),3.84
13
(s,3H),3.90(s,3H),6.55(s,2H),6.91-6.95(m,1H),7.10-7.14(m,2H). C NMR(400MHz,CD
Cl3):δ56.1,56.2,60.9,107.8,113.6,119.1,119.2,126.9,127.0,127.6,130.6,137.2,1
+
47.2,147.3,151.0,153.5.MS(EI)m/z:324(M)。
[0110] 实施例10
[0111] 制备3,4,5-三甲氧基-1-[(4-乙氧基苯基)硫代]苯(ZLM-11)
[0112]
[0113] 按实施例6，用4-乙氧基碘苯(248mg)代替对甲氧基碘苯，得89mg淡黄白色固体，产率27.8％，mp91.4-93.3℃.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.43(t,J＝7.0Hz,3H),3.76(s,6
H),3.81(s,3H),4.04(q,J＝7.2Hz,3H),6.45(s,2H),6.88(d,J＝8.8Hz,2H),7.38(d,J＝
8.8Hz,2H).13C NMR(400MHz,CDCl3):δ14.7,56.0,60.9,63.5,106.1,115.3,124.7,132.8,1
34.5,136.5,153.4,159.0.MS(EI)m/z:320(M+)。
H),3.81(s,3H),4.04(q,J＝7.2Hz,3H),6.45(s,2H),6.88(d,J＝8.8Hz,2H),7.38(d,J＝
8.8Hz,2H).13C NMR(400MHz,CDCl3):δ14.7,56.0,60.9,63.5,106.1,115.3,124.7,132.8,1
34.5,136.5,153.4,159.0.MS(EI)m/z:320(M+)。
[0114] 实施例11
[0115] 制备3,4,5-三甲氧基-1-[(3-苄氧基-4-甲氧基苯基)硫代]苯(ZLM-12)
[0116]
[0117] 按实施例6，用3-苄氧基-4-甲氧基碘苯(1.02g)代替对甲氧基碘苯，得728mg1
白色固体，产率58.9％，mp100.6-101.1℃.H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.73(s,6H),3.8
3(s,3H),3.90(s,3H),5.10(s,2H),6.43(s,2H),6.86(d,J ＝ 8.8Hz,1H),6.95(d,J ＝
13
2.0Hz,1H),7.02(dd,J＝6.8,2.0Hz,1H),7.28-7.38(m,5H). CNMR(400MHz,CDCl3):56.1,
60.9,70.9,106.7,112.1,117.8,125.5,125.6,127.2,127.9,128.5,132.0,136.5,136.7,1
+
48.4,149.6,153.4.MS(EI)m/z:412(M)。
白色固体，产率58.9％，mp100.6-101.1℃.H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.73(s,6H),3.8
3(s,3H),3.90(s,3H),5.10(s,2H),6.43(s,2H),6.86(d,J ＝ 8.8Hz,1H),6.95(d,J ＝
13
2.0Hz,1H),7.02(dd,J＝6.8,2.0Hz,1H),7.28-7.38(m,5H). CNMR(400MHz,CDCl3):56.1,
60.9,70.9,106.7,112.1,117.8,125.5,125.6,127.2,127.9,128.5,132.0,136.5,136.7,1
+
48.4,149.6,153.4.MS(EI)m/z:412(M)。
[0118] 实施例12
[0119] 制备5-三氟甲基-2-[(3,4,5-三甲氧基苯基)硫代]吡啶((ZLM-13)
[0120]
[0121] 参照ZLM-2的合成，用2-氯-5-三氟甲基吡啶(127mg)替代5-氯-2-硝基苯胺，并降低反应温度至80℃，得到206mg白色固体，产率59.7％，mp83.8-84.5℃。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.86(s,6H),3.91(s,3H),6.85(s,2H),6.94(d,J ＝8.8Hz,1H),7.66(dd,J ＝
6.4,2.0Hz,1H),8.67(s,1H).13CNMR(400MHz,CDCl3):δ56.6,61.3,112.8,120.1,122.7,123.0,123.7,125.3,133.8,133.9,139.9,146.6,146.7,154.3,167.6.MS(EI)m/z:345(M+)。
6.4,2.0Hz,1H),8.67(s,1H).13CNMR(400MHz,CDCl3):δ56.6,61.3,112.8,120.1,122.7,123.0,123.7,125.3,133.8,133.9,139.9,146.6,146.7,154.3,167.6.MS(EI)m/z:345(M+)。
[0122] 实施例13
[0123] 制备3-[(3,4,5-三甲氧基苯基)硫代]苯并噻吩-2-甲酸甲酯(ZLM-14)
[0124]
[0125] 参照ZLM-2的合成，用3-氯苯并噻吩-2-羧酸(100mg)替代5-氯-2-硝基苯1
胺，并降低反应温度至80℃，得到45mg黄色固体，产率25.7％。H NMR(400MHz,CDCl3):δ
3.69(s,6H),3.79(s,3H),3.95(s,3H),6.47(s,2H),7.35(t,J ＝ 7.8Hz,1H),7.47(t,J ＝
13
7.6Hz,1H),7.81(d,J＝8.4Hz,1H),7.86(d,J＝8.0Hz,1H). C NMR(400MHz,CDCl3):δ52.6
,56.1,60.9,106.1,122.7,125.1,125.4,127.5,130.6,131.6,139.7,139.8,153.4,162.2.
+
MS(EI)m/z:390(M)。
胺，并降低反应温度至80℃，得到45mg黄色固体，产率25.7％。H NMR(400MHz,CDCl3):δ
3.69(s,6H),3.79(s,3H),3.95(s,3H),6.47(s,2H),7.35(t,J ＝ 7.8Hz,1H),7.47(t,J ＝
13
7.6Hz,1H),7.81(d,J＝8.4Hz,1H),7.86(d,J＝8.0Hz,1H). C NMR(400MHz,CDCl3):δ52.6
,56.1,60.9,106.1,122.7,125.1,125.4,127.5,130.6,131.6,139.7,139.8,153.4,162.2.
+
MS(EI)m/z:390(M)。
[0126] 实施例14
[0127] 制备2-芴甲氧酰胺基-3-乙酰氧基-N-[2-甲氧基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)硫代]丙酰胺(ZLM-15)
[0128]
[0129] 氮气保护下，将3,4,5-三甲氧基-1-[(3-氨基-4-甲氧基苯基)硫代]苯ZLM-7(140mg)和O-乙酰基-N-Fmoc-L-丝氨酸(148mg)溶于5mL无水二氯甲烷中，再加
入DCC(82mg)和HOBt(56mg)，室温搅拌24h，旋去溶剂，再加20mL乙酸乙酯溶解，抽滤，滤渣用乙酸乙酯洗涤数次，合并有机相，用水洗反应液数次，无水硫酸钠干燥有机相，抽滤，得滤液，旋去溶剂得到365mg黄棕色油状物。硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，得到277mg
1
白色固体，产率80.6％。H NMR(400MHz,CDCl3):δ2.09(s,3H),3.78(s,6H),3.82(s,3H),
3.83(s,3H),4.24(t,J ＝6.8Hz,1H),4.33(t,J ＝5.2Hz,1H),4.41-4.53(m,3H),4.64(d,J
＝4.0Hz,1H),5.73(d,J＝6.8Hz,1H),6.57(s,2H),6.83(d,J＝8.4Hz,1H),7.13(dd,J＝
2.2,6.4Hz,1H),7.31-7.33(m,2H),7.39-7.42(m,2H),7.60(d,J＝6.8Hz,2H),7.71(d,J＝
7.6Hz,2H),8.44(s,1H),8.49(d,J＝2.4Hz,1H)。
入DCC(82mg)和HOBt(56mg)，室温搅拌24h，旋去溶剂，再加20mL乙酸乙酯溶解，抽滤，滤渣用乙酸乙酯洗涤数次，合并有机相，用水洗反应液数次，无水硫酸钠干燥有机相，抽滤，得滤液，旋去溶剂得到365mg黄棕色油状物。硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，得到277mg
1
白色固体，产率80.6％。H NMR(400MHz,CDCl3):δ2.09(s,3H),3.78(s,6H),3.82(s,3H),
3.83(s,3H),4.24(t,J ＝6.8Hz,1H),4.33(t,J ＝5.2Hz,1H),4.41-4.53(m,3H),4.64(d,J
＝4.0Hz,1H),5.73(d,J＝6.8Hz,1H),6.57(s,2H),6.83(d,J＝8.4Hz,1H),7.13(dd,J＝
2.2,6.4Hz,1H),7.31-7.33(m,2H),7.39-7.42(m,2H),7.60(d,J＝6.8Hz,2H),7.71(d,J＝
7.6Hz,2H),8.44(s,1H),8.49(d,J＝2.4Hz,1H)。
[0130] 实施例15
[0131] 制备2-氨基-3-羟基-N-[2-甲氧基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)硫代]丙酰胺(ZLM-16)
[0132]
[0133] 将2-芴甲氧酰胺基-3-乙酰氧基-N-[2-甲氧基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)硫代]丙酰胺ZLM-15(232mg)溶于适量的二氯甲烷：甲醇＝1:1的混合溶剂中，再加入0.36mL2N
氢氧化钠水溶液，室温搅拌2h，旋去溶剂，得到256mg黄棕色油状物。硅胶柱分离(二氯
甲烷：甲醇＝10:1)，得到56mg白色固体，产率41.6％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ2.16(br,3H),3.62(t,J ＝2.6Hz,1H),3.78(s,6H),3.81(s,3H),3.90(s,3H),3.99(dd,J ＝4.8,6.
0Hz,1H),6.55(s,2H),6.84(d,J ＝ 8.4Hz,1H),7.11(dd,J ＝6.4,2.2Hz,1H),8.55(d,J ＝
2.0Hz,1H),9.91(s,1H).13C NMR(400MHz,CDCl3):δ55.9,56.2,56.5,60.9,65.1,107.4,110.7,123.6,126.5,127.6,128.2,132.0,137.0,148.3,153.4,171.5.MS(EI)m/z:408(M+)。
氢氧化钠水溶液，室温搅拌2h，旋去溶剂，得到256mg黄棕色油状物。硅胶柱分离(二氯
甲烷：甲醇＝10:1)，得到56mg白色固体，产率41.6％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ2.16(br,3H),3.62(t,J ＝2.6Hz,1H),3.78(s,6H),3.81(s,3H),3.90(s,3H),3.99(dd,J ＝4.8,6.
0Hz,1H),6.55(s,2H),6.84(d,J ＝ 8.4Hz,1H),7.11(dd,J ＝6.4,2.2Hz,1H),8.55(d,J ＝
2.0Hz,1H),9.91(s,1H).13C NMR(400MHz,CDCl3):δ55.9,56.2,56.5,60.9,65.1,107.4,110.7,123.6,126.5,127.6,128.2,132.0,137.0,148.3,153.4,171.5.MS(EI)m/z:408(M+)。
[0134] 实施例16
[0135] 制备3,4,5-三甲氧基-1-[(3-羟基-4-甲氧基苯基)硫代]苯(ZLM-17)
[0136]
[0137] 将3,4,5-三甲氧基-1-[(3-苄氧基-4-甲氧基苯基)硫代]苯ZLM-12(200mg)溶于二氯甲烷：三氟乙酸＝1:1的混合溶剂4.8mL中，室温搅拌15h，除去溶剂，得到红褐
色油状物，硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)，得到32mg淡黄色油状物，产率20.7％。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.78(s,6H),3.82(s,3H),3.88(s,3H),5.70(br,1H),6.55(s,2H)
,6.82(d,J＝8.4Hz,2H),6.93(dd,J＝1.8,6.8Hz,1H),6.98(d,J＝2.0Hz,1H).MS(EI)m/
z:322(M+)。
色油状物，硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝4:1)，得到32mg淡黄色油状物，产率20.7％。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.78(s,6H),3.82(s,3H),3.88(s,3H),5.70(br,1H),6.55(s,2H)
,6.82(d,J＝8.4Hz,2H),6.93(dd,J＝1.8,6.8Hz,1H),6.98(d,J＝2.0Hz,1H).MS(EI)m/
z:322(M+)。
[0138] 实施例17
[0139] 化合物抗肿瘤活性测试
[0140] 实验方法
[0141] 1.收集对数期乳腺癌MCF-7细胞和肝癌HepG2细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞调密度至4000个每孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。
[0142] 2.于5％二氧化碳，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度，每孔100μL，设3-5个复孔。
[0143] 3.于5％二氧化碳，37℃孵育16-48h，倒置显微镜下观察细胞生长情况。
[0144] 4.每孔加入20μL MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑)溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
[0145] 5.终止培养，小心吸去孔内培养液。
[0146] 6.每孔加入100μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
[0147] 7.同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。
[0148] 8.将各复孔OD值取平均值，计算细胞成活率和抑制率
[0149] 成活率＝药物组OD值取平均值/对照组OD值取平均值×100％
[0150] 抑制率＝100％－成活率
[0151] 以抑制率纵坐标，药物浓度为横坐标绘制折线图，可从图上直观的看出IC50大致对应的药物浓度。
[0152] 测试结果见表1，抗人类乳腺癌MCF增值活性测试结果，显示ZLM-17，ZLM-9，ZLM-7等显示了很强的活性。抗肝癌HepG2增值活性测试结果见表2，ZLM-11，ZLM-16，ZLM-7等显示了很好的活性。
[0153] 表1本发明通式I所示化合物结构和对人类乳腺癌MCF-7细胞株的IC50值
[0154]
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