自闭症模型犬的建立方法
阅读：981发布：2020-05-12
专利汇可以提供自闭症模型犬的建立方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及通过基因编辑技术制备 自闭症 模型犬的方法，以及获得的自闭症模型犬，自闭症模型犬的细胞和组织。所述方法包括如下步骤：(1)利用基因编辑技术获得Shank3基因敲除型自闭症模型犬受精卵；以及(2)将Shank3基因敲除型自闭症模型犬受精卵移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬的一侧输卵管内，从而制备Shank3基因敲除型自闭症模型犬。，下面是自闭症模型犬的建立方法专利的具体信息内容。
1.用于建立Shank3基因敲除型自闭症模型犬的方法，所述方法包括如下步骤：(1)利用基因编辑技术获得Shank3基因敲除型自闭症模型犬受精卵；以及(2)将Shank3基因敲除型自闭症模型犬受精卵移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬的一侧输卵管内，从而制备Shank3基因敲除型自闭症模型犬。
2.根据权利要求1的方法，所述步骤(1)中的基因编辑技术包括：CRISPR，TALEN和ZFN。
3.用于建立Shank3基因敲除型自闭症模型犬的方法，所述方法包括如下步骤：(1)根据犬Shank3基因序列，针对外显子的序列确定打靶位点；(2)根据步骤(1)确定的打靶位点合成sgRNA序列，然后将合成的序列与骨架载体连接构建sgRNA打靶载体；(3)将sgRNA打靶载体体外转录获得sgRNA的mRNA，将CRISPR/Cas9体外转录为mRNA；(4)将步骤(3)获得的sgRNA的mRNA和CRISPR/Cas9的mRNA混合后胞质内注射到犬受精卵中；以及(5)将犬受精卵移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬出血较少一侧输卵管内，从而制备Shank3基因敲除型自闭症模型犬。
4.根据权利要求3的方法，针对犬Shank3基因外显子19的序列确定打靶位点，对外显子
19中的序列进行插入、删除、置换和/或添加修饰。
5.根据权利要求4的方法，根据Shank3基因设计2个打靶位点，其sgRNA合成序列分别为：
S2位点CCGGCGGGCTCGACTACGGCCCC(SEQ ID NO：1)；和
S3位点GGCCCGCGACTCCGAGCGAGGGG(SEQ ID NO：2)。
6.用于建立Shank3基因敲除型自闭症模型犬的方法，所述方法包括如下步骤：(1)根据犬Shank3基因序列，针对外显子的序列确定打靶位点；(2)根据步骤(1)确定的打靶位点合成sgRNA序列，然后将合成的序列与骨架载体连接构建sgRNA打靶载体；(3)将sgRNA打靶载体体外转录获得sgRNA的mRNA，将CRISPR/Cas9体外转录为mRNA；(4)将步骤(3)获得的sgRNA的mRNA和CRISPR/Cas9的mRNA混合后胞质内注射到犬体细胞中，然后将犬体细胞核移植到犬去核卵母细胞中；以及在步骤(5)中将犬去核卵母细胞移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬的一侧输卵管内，从而制备Shank3基因敲除型自闭症模型犬。
7.犬Shank3基因敲除打靶载体，所述犬Shank3基因敲除打靶载体由sgRNA序列以及骨架载体构成，所述sgRNA序列是针对犬Shank3基因外显子中打靶位点的序列设计的。
8.根据权利要求7的犬Shank3基因敲除打靶载体，所述sgRNA序列为：
S2位点CCGGCGGGCTCGACTACGGCCCC(SEQ ID NO：1)；和
S3位点GGCCCGCGACTCCGAGCGAGGGG(SEQ ID NO：2)。
9.由权利要求1-6任一项的方法获得的Shank3基因敲除型自闭症模型犬的体细胞、组织和器官。
10.根据权利要求9的体细胞、组织和器官，其特征在于包含SEQ IDNO：3所示的如下序列：
11.根据权利要求9的体细胞、组织和器官，其特征在于包含SEQ IDNO：10所示的如下序列：
12.根据权利要求10或11的体细胞，其特征在于为分类命名为突触后密集区支架蛋白(Shank3)基因敲除比格犬耳成纤维细胞：Shk3-KO-ASD，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(邮政编码
100101)，保藏号为CGMCC No.15599，保藏日期为2018年4月26日。
13.根据权利要求9的体细胞、组织和器官，其特征在于包含SEQ ID NO：11所示的如下序列：
14.根据权利要求9的体细胞、组织和器官，其特征在于包含SEQ ID NO：12所示的如下序列：
15.根据权利要求9的体细胞、组织和器官，其特征在于包含SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的序列。
16.根据权利要求9的体细胞、组织和器官，其特征在于包含SEQ ID NO：13所示的如下序列：
17.根据权利要求9的体细胞、组织和器官，其特征在于包含SEQ ID NO：14所示的如下序列：
18.根据权利要求9的体细胞、组织和器官，其特征在于包含SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的序列。
19.用于检测包含SEQ ID NO：3所示序列的Shank3基因敲除型自闭症模型犬的引物对，所述引物对针对如下SEQ ID NO：4所示序列进行设计：
20.根据权利要求19的引物对，所述引物对的序列如下：
P1：5’CCTTCAGCGCCAGCATCTTC3(SEQ ID NO：5)；
P2：5’TGCAGAGACGTGTCCAGGACG3’(SEQ ID NO：6)。
21.用于检测包含SEQ ID NO：11所示序列的Shank3基因敲除型自闭症模型犬的引物对，所述引物对针对如下SEQ ID NO：13所示序列进行设计：
22.用于检测包含SEQ ID NO：12所示序列的Shank3基因敲除型自闭症模型犬的引物对，所述引物对针对如下SEQ ID NO：14所示序列进行设计：
23.根据权利要求21的引物对，所述引物对的序列如下：
P3：CGAGCCCTCCCCAGCCTTC(SEQ ID NO：15)；
P4：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：16)。
24.根据权利要求22的引物对，所述引物对的序列如下：
P5：GCGGCCCTCGGCCTCCCCAG(SEQ ID NO：17)；
P6：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：18)。
25.用于检测包含SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示序列的Shank3基因敲除型自闭症模型犬的两对引物对，所述引物对分别针对SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示序列进行设计。
26.根据权利要求25的引物对，所述引物对的序列如下：
第一引物对：
P3：CGAGCCCTCCCCAGCCTTC(SEQ ID NO：15)；
P4：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：16)；
第二引物对：
P5：GCGGCCCTCGGCCTCCCCAG(SEQ ID NO：17)；
P6：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：18)。
27.用于检测包含SEQ ID NO：3所示序列的Shank3基因敲除型自闭症模型犬的试剂盒，所述试剂盒包含针对SEQ ID NO：4所示序列设计的引物对。
28.根据权利要求27的试剂盒，所述引物对的序列如下：
P1：5’CCTTCAGCGCCAGCATCTTC3’(SEQ ID NO：5)；
P2：5’TGCAGAGACGTGTCCAGGACG3’(SEQ ID NO：6)。
29.用于检测包含SEQ ID NO：11所示序列的Shank3基因敲除型自闭症模型犬的试剂盒，所述试剂盒包含针对SEQ ID NO：13所示序列设计的引物对。
30.根据权利要求29的试剂盒，所述引物对的序列如下：
P3：CGAGCCCTCCCCAGCCTTC(SEQ ID NO：15)；
P4：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：16)。
31.用于检测包含SEQ ID NO：12所示序列的Shank3基因敲除型自闭症模型犬的试剂盒，所述试剂盒包含针对SEQ ID NO：14所示序列设计的引物对。
32.根据权利要求31的试剂盒，所述引物对的序列如下：
P5：GCGGCCCTCGGCCTCCCCAG(SEQ ID NO：17)；
P6：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：18)。
33.用于检测包含SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示序列的Shank3基因敲除型自闭症模型犬的试剂盒，所述试剂盒包含分别针对SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示序列设计的两对引物对。
34.根据权利要求33的引物对，所述引物对的序列如下：
第一引物对：
P3：CGAGCCCTCCCCAGCCTTC(SEQ ID NO：15)；
P4：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：16)；
第二引物对：
P5：GCGGCCCTCGGCCTCCCCAG(SEQ ID NO：17)；
P6：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：18)。
35.由权利要求1-6任一项的方法获得的Shank3基因敲除型自闭症模型犬。
自闭症模型犬的建立方法
技术领域
背景技术
[0002] 犬是目前基础医学研究和教学中最常用的实验动物之一，尤其在生理、药理和病理生理学等实验研究中起着重要作用。通过对犬进行全基因组测序分析，共计确定约1.93万个基因，其中约1.8万个基因与人类已知基因相同，其基因组与人类的相似度高于小鼠等其他实验动物。犬在遗传性疾病方面与人类也极为相似，约有癌症、心脏病、聋哑、失明和免疫性神经系统疾病等360多种遗传疾病与人类相同，适于作为人类疾病研究的模式动物。而且，犬的遗传性疾病少，实验重复性好，血液循环和神经系统发达，消化系统及内脏与人相似，在毒理方面的反应与人类比较接近，尤其适合药理、循环生理、眼科、毒理、外科学等研究。另外犬性格温顺容易调教，经短期训练能很好地配合实验，被国际医学、生物学界公认为较理想的实验用犬。
[0003] 目前常用的制备犬疾病模型的方法主要包括：饲喂法、机械损伤法及免疫学方法等。但是，因为饲喂法、机械损伤法和免疫学法均是在健康动物基础上，采用特殊的方法诱导其出现疾病表型，因此存在无法出现疾病表型、表型持续时间较短或无法模拟人类疾病症状等问题。而采用基因工程的方法对犬基因组进行基因敲除或转基因修饰，其疾病症状为原发症状，表型持续时间长，并且具有可遗传性。
[0004] 孤独症谱系障碍(autism spectrum disorders，ASD)是一类常见的神经发育障碍性疾病，是根据典型孤独症的核心症状进行扩展定义的广泛意义上的孤独症。孤独症也称作自闭症，主要表现为不同程度的交往、交流障碍、狭隘的兴趣和重复刻板行为、感知觉异常，严重影响患者及其家庭的生活质量。不同病人之间的症状存在很大的异质性，目前并没有明确的病理水平的检测标准及统一的生物学标记(marker)，只能通过行为学检测来诊断此疾病。美国精神病学协会的诊断手册(DSM-IV)和世界健康卫生组织的诊断手册(ICD-10)要求在三个具体的核心行为学方面进行检测：第一，异常的社会互动，其中包括减少对同龄人的兴趣和很难进行社交互动；第二，不使用眼睛凝视和面部表情进行有效沟通；以及第三，狭隘的兴趣和重复刻板行为。最近的美国精神病学协会的诊断手册(DSM-V)将前两条标准融为一条，建立了新的行为学诊断标准，即异常的社会互动和交流，狭隘的兴趣和重复刻板行为。
[0005] ASD的患病率在不同地区间有差异，并且呈逐年增加趋势。美国疾病控制和预防中心报道的患病率为1.47％，韩国大约为2.64％，中国还没有官方的ASD患病率数据，但综合已发表的研究数据估算患病率约为0.25％。ASD男性患者更多见，男女比例约4∶1，但在重度患者中比例约为1∶1。目前ASD的致病原因仍有很多未知，除了遗传因素之外，也受环境因素影响，但环境与遗传因素如何相互作用影响ASD的发病仍有待研究。目前对自闭症患者的研究发现，25％与基因遗传有关，其余75％仍然不知道具体的致病原因。近年来，采用候选基因及全基因组关联研究，发现多个与ASD有关的突触结构及功能相关的致病候选基因，如SHANK3、NLGN3、NLGN4、CNTNAP2、NRXN1、NRXN2、PCD9等等。另外，DNA拷贝数变异(CNV)可改变基因剂量，导致不同程度的基因表达差异，对表型改变及疾病的发生发展具有一定作用。研究发现，ASD患者较正常人更常携带CNV。
[0006] 2007年，研究人员对来自3个家庭的5名ASD儿童进行检测，发现与ASD有关的新基因SHANK3(突触后密集区支架蛋白基因)。到目前为止，已经在超过1000例ASD患者中鉴定出SHANK3基因的6类分子缺陷：1.细胞遗传学检测可见的22q13.3缺失(5-10Mb)或环状22号染色体；2.微缺失(0.1-4Mb)；3.微小扩增；4.基因内断点易位；5.微小基因内缺失(＜100kb)；以及6.点突变等。近来发现SHANK3基因CpG丰富的序列(又称“CpG”岛，CG1)的高度甲基化能够改变其蛋白的组织特异性表达。人类基因组中共有3个SHANK基因(SHANK1，SHANK2和SHANK3)，在脑中及身体其它位置具有不同的表达摸模式。随后又利用全基因组测序，发现
1％的自闭症病人存在SHANK基因家族的突变，其中主要突变在SHANK3基因，SHANK1和SHANK2基因突变占少数。全长SHANK3蛋白由1731个氨基酸组成，含有ANK(Ankyrin repeat)、SH3(Srchomology-3)、PDZ、Pro(Proline-rich)和SAM(Sterile alpha motif)五个结构域，蛋白免疫印迹实验中SHANK蛋白分子量在75-250kDa间。PDZ结构域与NMDA和AMPA受体直接或间接互作。Pro和SAM结构域对SHANK的多聚化以及与Homer、cortactin的结合很重要。
1％的自闭症病人存在SHANK基因家族的突变，其中主要突变在SHANK3基因，SHANK1和SHANK2基因突变占少数。全长SHANK3蛋白由1731个氨基酸组成，含有ANK(Ankyrin repeat)、SH3(Srchomology-3)、PDZ、Pro(Proline-rich)和SAM(Sterile alpha motif)五个结构域，蛋白免疫印迹实验中SHANK蛋白分子量在75-250kDa间。PDZ结构域与NMDA和AMPA受体直接或间接互作。Pro和SAM结构域对SHANK的多聚化以及与Homer、cortactin的结合很重要。
[0007] 虽然自闭症病人中发现很多类型的SHANK3基因突变，但具体机制还不清楚，为了解决这个问题。研究者开发了不同动物模型包括小鼠，大鼠和猴子。基因突变小鼠模型是研究人类SHANK3突变相关的疾病发病机理的主流途径，目前已开发出15种不同突变类型的自闭症小鼠品系，但是表型差异很大，有的表现出社会互动异常，交流异常及重复的刻板行为，但有的症状表型不明显。同时，值得注意的是从小鼠研究的结果看，大多都是纯合突变时有表型，杂合子趋于正常，这与人差异明显。最近也有关于大鼠和猴子SHANK3基因敲出模型的报道，但是，由于猴的繁殖周期长，成本贵，表型检测相对困难，因此难以广泛用于疾病模型研究。综上所述，有必要开发新的高效自闭症动物模型。犬与人类长期生活在一起，很多遗传疾病与人类似，特别是神经性疾病，因此利用最新的基因组编辑技术制备SHANK3敲除犬意义重大。
发明内容
[0008] 本发明提供了一种经基因编辑技术建立Shank3(突触后密集区支架蛋白)基因敲除自闭症模型犬的方法，所述方法包括针对犬Shank3基因序列选择打靶位点，构建CRISPR/Cas9表达载体，载体经验证有效后，体外转录为mRNA，然后采用胞质注射的方式将mRNA注射入犬受精卵中，再胚胎移植入冲卵母犬体内，从而制备Shanks3基因敲除型自闭症疾病模型犬。本发明还涉及所建立的Shanks3基因敲除型自闭症犬模型，其细胞和组织。
[0009] 第一方面，本发明提供了用于建立Shanks3基因敲除型自闭症模型犬的方法，所述方法包括如下步骤：(1)利用基因编辑技术获得Shanks3基因敲除型自闭症模型犬受精卵；以及(2)将Shanks3基因敲除型自闭症模型犬受精卵移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬的一侧输卵管内制备Shanks3基因敲除型自闭症模型犬。
[0010] 所述步骤(1)中的基因编辑技术包括：CRISPR，TALEN和ZFN。
[0011] 第二方面，本发明提供了用于建立Shanks3基因敲除型自闭症模型犬的方法，所述方法包括如下步骤：(1)根据犬Shank3基因序列，针对外显子的序列确定打靶位点；(2)根据步骤(1)确定的打靶位点合成sgRNA序列，然后将合成的序列与骨架载体连接构建sgRNA打靶载体；(3)将sgRNA打靶载体体外转录获得sgRNA的mRNA，将CRISPR/Cas9体外转录为mRNA；(4)将步骤(3)获得的sgRNA的mRNA和CRISPR/Cas9的mRNA混合后胞质内注射到犬受精卵中；
以及(5)将犬受精卵移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬一侧输卵管内，从而制备Shanks3基因敲除型自闭症模型犬。
以及(5)将犬受精卵移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬一侧输卵管内，从而制备Shanks3基因敲除型自闭症模型犬。
[0012] 优选地，针对Shanks3基因外显子19的序列确定打靶位点。
[0013] 优选地，对外显子19中的序列进行插入、删除、置换和/或添加等修饰。
[0014] 优选地，设计2个打靶位点，将2个打靶位点之间的序列删除。
[0015] 优选地，根据Shank3基因序列设计2个打靶位点，其sgRNA合成序列分别为：
[0016] S2位点CCGGCGGGCTCGACTACGGCCCC(SEQ ID NO：1)；和
[0017] S3位点GGCCCGCGACTCCGAGCGAGGGG(SEQ ID NO：2)。
[0018] 优选地，所述骨架载体为购自Addgene的T7-gRNA。
[0019] 优选地，所述步骤(5)中将犬受精卵移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬出血较少的一侧输卵管内。
[0020] 第三方面，在第二方面的步骤(4)中将步骤(3)获得的sgRNA的mRNA和CRISPR/Cas9的mRNA混合后胞质内注射到犬体细胞中，然后将犬体细胞核移植到犬去核卵母细胞中；以及在步骤(5)中将犬去核卵母细胞移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬的一侧输卵管内，从而制备Shanks3基因敲除型自闭症模型犬。
[0021] 第四方面，本发明提供了犬Shank3基因敲除打靶载体，所述犬Shank3基因敲除打靶载体由针对犬Shank3基因的外显子中的打靶位点序列设计的sgRNA序列以及骨架载体构成。
[0022] 优选地，所述外显子为犬Shank3基因外显子19。优选地，所述骨架载体为购自Addgene的T7-gRNA。
[0023] 优选地，所述sgRNA序列为：
[0024] S2位点CCGGCGGGCTCGACTACGGCCCC(SEQ ID NO：1)；和
[0025] S3位点GGCCCGCGACTCCGAGCGAGGGG(SEQ ID NO：2)。
[0026] 第五方面，本发明提供了由第一方面至第三方面任一项的方法获得的Shanks3基因敲除型自闭症模型犬的体细胞、组织和器官。
[0027] 优选地，所述体细胞、组织和器官包含SEQ ID NO：3所示的如下序列：CGCGGCCCTCGGCTCCCCAAGAGGGGCCCTGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGG(SEQ ID NO：3)。
[0028] 优选地，所述体细胞、组织和器官包含SEQ ID NO：10所示的如下序列：
[0029] GCCCGAAGTGGGCGACGTCCCGCGGCCACCTCCGGCTGTCACCCCGCCTGAGCGGCCTAAGCGGAGGCCACGGCCGCCAGGCCCCGACAGCCCGTACGCCAACCTGGGCGCCTTCAGCGCCAGCATCTTCGCACCCTCCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAGCCCCCTGGTGAAGCAGCTGCAGGTGGAGGACGCCCAGGAGCGTGCTGCCCTGGCCGTCGGCAGCCCTGGCCCGGGTGGTGGCAGCTTTGCCCGCGAGCCCTCCCCGACGCACCGCGGCCCTCGGCTCCCCAAGAGGGGCCCTGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCAGCGGCCGGCTGGTCTCATCGTCGTGCATGCCACCAGCAA(SEQ ID NO：10)。
[0030] 优选地，所述体细胞为分类命名为突触后密集区支架蛋白(Shank3)基因敲除比格犬耳成纤维细胞：Shk3-KO-ASD，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(邮政编码100101)，保藏号为CGMCC No.15599，保藏日期为2018年4月26日。
[0031] 第六方面，本发明提供了用于检测包含SEQ ID NO：3(CGCGGCCCTCGGCTCCCCAAGAGGGGCCCTGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGG)所示序列片段的基因组序列的Shanks3基因敲除型自闭症模型犬的引物对，所述引物对针对如下所示的序列进行设计：
[0032] CCCTCGGCTCCCCAAGAGGGGCCCTGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：4)。
[0033] 优选地，所述引物对的序列如下：
[0034] P1：5’CCTTCAGCGCCAGCATCTTC3’(SEQ ID NO：5)；
[0035] P2：5’TGCAGAGACGTGTCCAGGACG3’(SEQ ID NO：6)。
[0036] 第七方面，本发明提供了用于检测包含SEQ ID NO：3(CGCGGCCCTCGGCTCCCCAAGAGGGGCCCTGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGG)所示序列的基因组序列的Shanks3基因敲除型自闭症模型犬的试剂盒，所述试剂盒包含针对SEQ ID NO；4(CCCTCGGCTCCCCAAGAGGGGCCCTGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA)所示序列设计的引物对。
[0037] 优选地，所述引物对的序列如下：
[0038] P1：5’CCTTCAGCGCCAGCATCTTC3’(SEQ ID NO：5)；
[0039] P2：5’TGCAGAGACGTGTCCAGGACG3’(SEQ ID NO：6)。
[0040] 第八方面，本发明提供了由第一方面至第三方面任一项的方法获得的Shanks3基因敲除型自闭症模型犬的体细胞、组织和器官。
[0041] 优选地，所述体细胞、组织和器官包含SEQ ID NO：11所示的如下序列：
[0042] CGAGCCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：11)。
[0043] 优选地，所述体细胞、组织和器官包含SEQ ID NO：12所示的如下序列：
[0044] GCGGCCCTCGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：12)。
[0045] 优选地，所述体细胞、组织和器官包含SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的如下序列：
[0046] CGAGCCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：11)；
[0047] GCGGCCCTCGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：12)。
[0048] 优选地，所述体细胞、组织和器官包含SEQ ID NO：13所示的如下序列：
[0049] CCTTCAGCGCCAGCATCTTCGCACCCTCCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAGCCCCCTGGTGAAGCAGCTGCAGGTGGAGGACGCCCAGGAGCGTGCCGCCCTGGCCGTCGGCAGCCCTGGCCCGGGTGGTGGCAGCTTTGCCCGCGAGCCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：13)。
[0050] 优选地，所述体细胞、组织和器官包含SEQ ID NO：14所示的如下序列：
[0051] CCTTCAGCGCCAGCATCTTCGCACCCTCCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAGCCCCCTGGTGAAGCAGCTGCAGGTGGAGGACGCCCAGGAGCGTGCCGCCCTGGCCGTCGGCAGCCCTGGCCCGGGTGGTGGCAGCTTTGCCCGCGAGCCCTCCCCGACGCACCGCGGCCCTCGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：14)。
[0052] 优选地，所述体细胞、组织和器官包含SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的如下序列：
[0053] CCTTCAGCGCCAGCATCTTCGCACCCTCCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAGCCCCCTGGTGAAGCAGCTGCAGGTGGAGGACGCCCAGGAGCGTGCCGCCCTGGCCGTCGGCAGCCCTGGCCCGGGTGGTGGCAGCTTTGCCCGCGAGCCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：13)；
[0054] CCTTCAGCGCCAGCATCTTCGCACCCTCCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAGCCCCCTGGTGAAGCAGCTGCAGGTGGAGGACGCCCAGGAGCGTGCCGCCCTGGCCGTCGGCAGCCCTGGCCCGGGTGGTGGCAGCTTTGCCCGCGAGCCCTCCCCGACGCACCGCGGCCCTCGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：14)。
[0055] 第九方面，本发明提供了用于检测包含SEQ ID NO：11(CGAGCCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA)所示序列片段的基因组序列的Shanks3基因敲除型自闭症模型犬的引物对，所述引物对针对如下所示的序列进行设计：
[0056] CCTTCAGCGCCAGCATCTTCGCACCCTCCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAGCCCCCTGGTGAAGCAGCTGCAGGTGGAGGACGCCCAGGAGCGTGCCGCCCTGGCCGTCGGCAGCCCTGGCCCGGGTGGTGGCAGCTTTGCCCGCGAGCCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：13)。
[0057] 优选地，所述引物对的序列如下：
[0058] P3：CGAGCCCTCCCCAGCCTTC(SEQ ID NO：15)；
[0059] P4：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：16)。
[0060] 本发明提供了用于检测包含SEQ ID NO：12GCGGCCCTCGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：12)所示序列片段的基因组序列的Shanks3基因敲除型自闭症模型犬的引物对，所述引物对针对如下所示的序列进行设计：
[0061] CCTTCAGCGCCAGCATCTTCGCACCCTCCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAGCCCCCTGGTGAAGCAGCTGCAGGTGGAGGACGCCCAGGAGCGTGCCGCCCTGGCCGTCGGCAGCCCTGGCCCGGGTGGTGGCAGCTTTGCCCGCGAGCCCTCCCCGACGCACCGCGGCCCTCGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：14)。
[0062] 优选地，所述引物对的序列如下：
[0063] P5：GCGGCCCTCGGCCTCCCCAG(SEQ ID NO：17)；
[0064] P6：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：18)
[0065] 本发明提供了用于检测包含SEQ ID NO：11(CGAGCCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA)和SEQ ID NO：12(GCGGCCCTCGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA)所示序列片段的基因组序列的Shanks3基因敲除型自闭症模型犬的两对引物对，所述引物对分别针对如下SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的序列进行设计：
[0066] CCTTCAGCGCCAGCATCTTCGCACCCTCCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAGCCCCCTGGTGAAGCAGCTGCAGGTGGAGGACGCCCAGGAGCGTGCCGCCCTGGCCGTCGGCAGCCCTGGCCCGGGTGGTGGCAGCTTTGCCCGCGAGCCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：13)；
[0067] CCTTCAGCGCCAGCATCTTCGCACCCTCCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAGCCCCCTGGTGAAGCAGCTGCAGGTGGAGGACGCCCAGGAGCGTGCCGCCCTGGCCGTCGGCAGCCCTGGCCCGGGTGGTGGCAGCTTTGCCCGCGAGCCCTCCCCGACGCACCGCGGCCCTCGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：14)。
[0068] 优选地，所述引物对的序列如下：
[0069] 第一引物对：
[0070] P3：CGAGCCCTCCCCAGCCTTC(SEQ ID NO：15)；
[0071] P4：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：16)；
[0072] 第二引物对：
[0073] P5：GCGGCCCTCGGCCTCCCCAG(SEQ ID NO：17)；
[0074] P6：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：18)
[0075] 第十方面，本发明提供了用于检测包含SEQ ID NO：11(CGAGCCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA)所示序列片段的基因组序列的Shanks3基因敲除型自闭症模型犬的试剂盒，所述试剂盒包含针对如下所示的序列进行设计的引物对：
[0076] CCTTCAGCGCCAGCATCTTCGCACCCTCCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAGCCCCCTGGTGAAGCAGCTGCAGGTGGAGGACGCCCAGGAGCGTGCCGCCCTGGCCGTCGGCAGCCCTGGCCCGGGTGGTGGCAGCTTTGCCCGCGAGCCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：13)。
[0077] 优选地，所述引物对的序列如下：
[0078] P3：CGAGCCCTCCCCAGCCTTC(SEQ ID NO：15)；
[0079] P4：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：16)。
[0080] 本发明提供了用于检测包含SEQ ID NO：12GCGGCCCTCGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA所示序列片段的基因组序列的Shanks3基因敲除型自闭症模型犬的试剂盒，所述试剂盒包含针对如下所示的序列进行设计的引物对：CCTTCAGCGCCAGCATCTTCGCACCCTCCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAGCCCCCTGGTGAAGCAGCTGCAGGTGGAGGACGCCCAGGAGCGTGCCGCCCTGGCCGTCGGCAGCCCTGGCCCGGGTGGTGGCAGCTTTGCCCGCGAGCCCTCCCCGACGCACCGCGGCCCTCGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：14)。
[0081] 本发明提供了用于检测包含SEQ ID NO：11(CGAGCCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA)和SEQ ID NO：12(GCGGCCCTCGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA)所示序列片段的基因组序列的Shanks3基因敲除型自闭症模型犬的试剂盒，所述试剂盒包含分别针对如下所示的序列进行设计的两对引物对：
[0082] TTCAGCGCCAGCATCTTCGCACCCTCCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAGCCCCCTGGTGAAGCAGCTGCAGGTGGAGGACGCCCAGGAGCGTGCCGCCCTGGCCGTCGGCAGCCCTGGCCCGGGTGGTGGCAGCTTTGCCCGCGAGCCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：13)；
[0083] CCTTCAGCGCCAGCATCTTCGCACCCTCCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAGCCCCCTGGTGAAGCAGCTGCAGGTGGAGGACGCCCAGGAGCGTGCCGCCCTGGCCGTCGGCAGCCCTGGCCCGGGTGGTGGCAGCTTTGCCCGCGAGCCCTCCCCGACGCACCGCGGCCCTCGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：14)。
[0084] 优选地，所述引物对的序列如下：
[0085] 第一引物对：
[0086] P3：CGAGCCCTCCCCAGCCTTC(SEQ ID NO：15)；
[0087] P4：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：16)；
[0088] 第二引物对：
[0089] P5：GCGGCCCTCGGCCTCCCCAG(SEQ ID NO：17)；
[0090] P6：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：18)。
[0091] 第十一方面，本发明提供了由第一方面至第三方面任一项的方法获得的Shanks3基因敲除型自闭症模型犬。
[0092] 犬Shank3基因共包含20个外显子。本发明在其第19外显子处进行基因打靶。
[0093] 第一种情况下，导致基因组序列删除了483bp的片段，并且插入了7bp的片段：
[0094] Shank3基因第19外显子部分野生型序列：
[0095](加粗并且加下划线的两端序列分别为S2和
S3位点的序列)。
S3位点的序列)。
[0096] 打靶后，删除S2和S3之间483bp的如下片段：
[0097] CCGGCGGGCTCGACTACGGCCCCGCTGACAGCCCTGGCCTGGCTTTCGGCGGCCCGGGGCCGGCCAAGGACCGGCGGCTGGAGGAGCGGCGCCGCTCCACCGTGTTCCTGTCGGTGGGAGCCATCGAGGGCAGCCCCCCCAGCGCCGAGCTGCCCTCCCTGCAGCCCTCCCGCTCCATCGACGAGCGCCTTCTGGGCGCCGGCGCCGCCCCCACCACCGGCCGCGACCTGCTCCTGCCCTCCCCCGTCTCTGCTCTGAAGCCATTGGTGAGCGGCCCGAGCCTTGGGCCTTCAGGCTCCACCTTCATCCACCCGCTCACCGGCAAGCCCCTGGACCCCAGCTCGCCCCTGGCCCTGGCCCTGGCCGCGCGGGAGCGGGCTCTGGCCTCCCAGGCGCCCTCCCGGTCCCCCACGCCTGTGCACAGCCCCGACGCTGACCGTCCCGGGCCTCTATTTGTGGATGTGCAGGCCCGCGACTCCGAGC(SEQ ID NO：8)；
[0098] 并且插入了7bp的如下片段：
[0099] TCCCCAA(SEQ ID NO：9)。
[0100] 突变后的序列为：
[0101]
[0102] 第二种情况下，导致基因组序列删除522bp的片段和496bp的片段：
[0103] 野生型序列(黑体且加下划线部分显示了要删除的522bp序列)
[0104]
[0105]
[0106] 野生型序列(黑体且加下划线部分显示了要删除的496bp)
[0107]
[0108] 522bp删除后序列
[0109] CCTTCAGCGCCAGCATCTTCGCACCCTCCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAGCCCCCTGGTGAAGCAGCTGCAGGTGGAGGACGCCCAGGAGCGTGCCGCCCTGGCCGTCGGCAGCCCTGGCCCGGGTGGTGGCAGCTTTGCCCGCGAGCCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：13)。
[0110] 147bp的特征序列：
[0111] CGAGCCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：11)
[0112] 496bp删除后序列
[0113] CCTTCAGCGCCAGCATCTTCGCACCCTCCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAGCCCCCTGGTGAAGCAGCTGCAGGTGGAGGACGCCCAGGAGCGTGCCGCCCTGGCCGTCGGCAGCCCTGGCCCGGGTGGTGGCAGCTTTGCCCGCGAGCCCTCCCCGACGCACCGCGGCCCTCGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：14)。
[0114] 153bp的特征序列：
[0115] GCGGCCCTCGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：12)
[0116] 除第19外显子外，在犬Shank3基因的其他外显子的任意序列处进行基因打靶，也可达到诱发犬发生自闭症疾病表型，从而制备Shanks3基因敲除型自闭症模型犬的目的。
[0117] 母犬阴道有血性分泌物流出时即判断为处于发情前期，然后采集血液检测血清中孕酮浓度，当孕酮浓度达到4-7ng/mL时可以确定为排卵期，排卵后48-72h卵母细胞发育至第二次减数分裂中期。为获得处于1细胞期的原核胚胎，需在排卵后48h进行自然交配，经过18h的体内受精，冲取受精胚胎。
[0118] 冲胚时，首先暴露卵巢及子宫的宫管结合部，将带有圆形前端的金属注射针从卵巢囊的裂口处插入输卵管伞部，然后将针管与输卵管伞部结扎固定；然后在位于宫管结合部的输卵管处，将采血针穿刺入输卵管中，用10mL含有10％胎牛血清HEPES缓冲的TCM199培养基(HM，GIBCO，11150)冲洗输卵管，冲卵液有输卵管伞部结扎的注射针处流出并收集到10mL离心管中。双侧输卵管均采用该方法进行冲卵。
[0119] 本发明利用基因编辑技术，根据犬Shank3基因序列的外显子选择打靶位点序列，并且根据打靶位点序列构建了sgRNA打靶载体和CRISPR/Cas9表达载体，载体经验证有效后，体外转录为mRNA，然后采用胞质注射的方式将mRNA注射入犬受精卵中，然后将犬受精卵移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬的一侧输卵管内，从而制备Shanks3基因敲除型自闭症模型犬。这是世界上首次成功获得了Shanks3基因敲除型自闭症模型犬。
[0120] 犬丰富多样的社交行为和高度发达的情感认知功能，是神经退行性疾病的良好模式动物。本研究通过删除犬Shank3基因第19外显子的约500bp序列，模拟人类自闭症疾病的遗传缺陷，制备了人类自闭症疾病模型犬。利用该方法制备的自闭症疾病模型犬是世界上第一例自闭症疾病模型犬，能够有效弥补小鼠及灵长类自闭症模型动物的缺陷，同时在基因缺陷模式上与人类具有较高的相似性，可用于人类自闭症治疗新技术的研究，新药研发及其发病机制的研究。为推动孤独症谱系障碍(ASD)的研究和孤独症谱系障碍，尤其是自闭症药物的筛选奠定基础。
[0121] 缩略语和关键术语定义：
[0123] 图1图示了犬Shank3基因的打靶位点。
[0124] 图2为本发明制备的Shanks3基因敲除型自闭症模型犬180306的照片。
具体实施方式
[0126] 实施例：
[0127] (1)Shanks3基因敲除型自闭症模型犬的制备
[0128] Shanks3基因敲除型自闭症模型犬的制备包括如下步骤：
[0129] 1)根据犬Shank3基因敲序列，针对外显子的序列确定打靶位点序列；
[0130] 2)根据步骤(1)确定的打靶位点序列合成sgRNA序列，然后将合成的序列与骨架载体连接构建sgRNA打靶载体；
[0131] 3)将sgRNA打靶载体体外转录，从而获得sgRNA的mRNA，以及将CRISPR/Cas9体外转录为mRNA；
[0132] 4)采用现有的比格犬皮肤成纤维细胞进行细胞转染及筛选，将筛选获得的细胞克隆提取基因组DNA，采用靶位点特异引物进行PCR，将PCR产物进行测序，根据测序的基因突变结果，计算该载体的打靶效率；
[0133] 5)将步骤(3)获得的sgRNA的mRNA和CRISPR/Cas9的mRNA混合后胞质内注射到犬受精卵中；以及
[0134] 6)将犬受精卵移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬出血较少的一侧输卵管内。
[0135] 根据测序获得的犬Shank3基因序列信息，设计针对犬Shank3基因Exon19的CRISPR/Cas9的表达载体，共设计2个打靶位点，实现对2个打靶位点之间483bp序列的大片段删除和7bp片段的插入。在本实施例中的打靶位点序列为：
[0136] S2位点CCGGCGGGCTCGACTACGGCCCC(SEQ ID NO：1)；和
[0137] S3位点GGCCCGCGACTCCGAGCGAGGGG(SEQ ID NO：2)。
[0138] 在本实施例中步骤2)中合成的sgRNA序列及其互补序列为：
[0139] sgRNA序列：
[0140] S2位点CCGGCGGGCTCGACTACGGCCCC(SEQ ID NO：1)；和
[0141] S3位点GGCCCGCGACTCCGAGCGAGGGG(SEQ ID NO：2)。
[0142] 构建载体时，将骨架载体T7-gRNA(Addgene)用BbsI进行酶切，用于后续实验；根据GGN18NGG原则设计打靶位点；根据Shank3基因设计2个打靶位点，其sgRNA合成序列分别为：S2位点CCGGCGGGCTCGACTACGGCCCC(SEQ ID NO：1)和S3位点GGCCCGCGACTCCGAGCGAGGGG(SEQ ID NO：2)；合成的用于识别Shank3基因打靶位点的sgRNA序列进行退火连接，之后再与酶切好的T7-gRNA质粒连接、转化扩增并提取质粒。PCR扩增T7-gRNA质粒的打靶位点并回收PCR产物，利用体外转录试剂盒对T7-gRNA的PCR产物进行体外转录；根据所需的注射浓度稀释分装mRNA，置于-80℃保存；受精卵注射时分装好的Cas9与2个位点的gRNA的mRNA按2∶1∶1体积混合即可用于受精卵胞质注射。
[0143] 具体来说，首先对CRISPR/Cas9的质粒进行线性化，反应体系为：30μg质粒，5μL限制性内切酶Afl||，10μL的10×Buffer及ddH2O，总体积为100μL。然后加入100μL酚∶仿∶异戊醇(25∶24∶1)纯化线性化质粒DNA，12,000g离心5min；吸取50μl上清至无Rnase的1.5ml离心管内，加入1/10体积醋酸钠和3倍体积无水乙醇沉淀质粒DNA，12,000g离心5min；弃上清，尽量吸弃残留的上清，加150μL 70％乙醇洗涤质粒，12,000g离心5min；空气中干燥3-5min，用15μL无RNase的ddH2O溶解DNA，测定浓度。
[0144] 体外转录mRNA试剂盒法(Ambion)：体外转录体系为：1μg线性化质粒DNA，10μL的2×NTP/CAP，2μL的10×Buffer，2μL的RNA合成酶及ddH2O，总体积为20μL。混匀后37℃孵育1小时；加入1μL TURBO DNA酶，消化质粒模板，37℃孵育30min。然后将体外转录产物20μL，20μL的10×Reaction Buffer，10μL的ATP(10mM)，2.5μL的RNA酶抑制剂，2μL的Poly(A)聚合酶及无核酸酶ddH2O混合，配制总体积为100μL的体外转录mRNA加polyA体系，37℃孵育1hr。孵育后，向反应体系中加入350μL结合缓冲液(binding buffer)，吹吸混匀；然后加入250μL无水乙醇，混合均匀；再将样品转移到mRNA纯化柱中，10,000g室温离心1min；弃掉滤液，重新装好柱子，500μL洗脱液漂洗柱子，10,000g室温离心1min；重复漂洗一次，弃掉滤液，空柱离心1min将蛋白质等杂质洗脱掉；然后将柱子放入一个新的离心管中，加入50μL RNA洗脱液到柱子中央位置，盖好盖子65℃孵育10min，10,000g室温离心1min；检测RNA质量及浓度。将CRISPR的sgRNA及Cas9的mRNA进行混合，使sgRNA的终浓度为20ng/μL、Cas9的终浓度为200ng/μL，进行胞质注射。
[0145] 将构建完成的gRNA与Cas9质粒共转至犬皮肤成纤维细胞，然后采用G418进行筛选。筛选获得的细胞克隆提取DNA作为模板，采用引物P1：5’CCTTCAGCGCCAGCATCTTC3’(SEQ ID NO：5)；P2：5’TGCAGAGACGTGTCCAGGACG3’(SEQ ID NO：6)进行PCR，扩.增sgRNA识别切割靶点上下游共计811bp的DNA片段。将PCR扩增得到的目的片段进行DNA测序，判断载体的打靶效率。经过转染、筛选及PCR产物测序，结果显示S2位点的突变效率为73.3％，S3位点的突变效率为81.3％，证明载体构建准确打靶效率较高，可用于Shank3基因敲除犬的制备。
[0146] 共计11只自然发情的比格母犬，作为受精卵供体同时作为胚胎移植受体进行实验。所有母犬均采集血液检测血清中孕酮浓度，当孕酮浓度达到4-7ng/mL时可以确定为排卵期，排卵后48h进行自然交配，然后采用手术法冲取受精胚胎，13只母犬累计获得受精卵64枚。受精卵收集后，采用含有0.1％透明质酸酶的TCM199培养基脱去卵丘颗粒细胞，然后放入HM微滴中，放到装有显微操作仪的倒置显微镜上。利用显微注射针吸取含有sgRNA和Cas9的混合液，然后注射入受精卵的胞质中。胞质注射完成后，将胚胎装入胚胎移植管中，选择冲胚出血较少一侧的输卵管，将胚胎移植管中的胚胎从伞部注射入输卵管内。
[0147] 幼犬出生后，采集耳组织及尾组织用于鉴定。组织块在离心管内剪碎后，再加入蛋白酶K水浴56℃裂解1～3h。然后用移液枪吸取Genomic Lysis Buffer 700μL，加入裂解体系，上下颠倒混合均匀，10000g，离心1min。用移液器吸取上清液至纯化柱，10,000g，室温静置1min，离心1min。换取新的收集管，向离心柱内加入200μL的DNA Pre-Wash Buffer，10,000g，室温静置1min，离心1min，弃废液。向离心柱中加入400μL的g-DNA清洗缓冲液，10,
000g，室温静置1min，离心1min，弃废液。将纯化柱和收集管重新离心，10,000g，离心2min。
将纯化柱更换至新的1.5mL离心管内，加入50μL的洗脱缓冲液洗脱DNA，室温放置2min。12,
000rpm，离心1min，得到的溶液为犬基因组DNA。
000g，室温静置1min，离心1min，弃废液。将纯化柱和收集管重新离心，10,000g，离心2min。
将纯化柱更换至新的1.5mL离心管内，加入50μL的洗脱缓冲液洗脱DNA，室温放置2min。12,
000rpm，离心1min，得到的溶液为犬基因组DNA。
[0148] 以犬基因组DNA作为模板进行PCR，引物为P1：5’CCTTCAGCGCCAGCATCTTC3’(SEQ ID NO：5)；P2：5’TGCAGAGACGTGTCCAGGACG3’(SEQ ID NO：6)进行PCR，扩增sgRNA识别切割靶点上下游共计811bp的DNA片段。将PCR扩增得到的目的片段进行DNA测序，与测序获得的犬Shank3基因序列进行比对，判断Shank3基因的突变类型。
[0149] 经过测序及序列信息比对，22只幼犬中有3只公犬在Shank3基因外显子(Exon)19靶位点处发生突变，其中编号180203的公犬突变类型为删除20bp的Shank3基因敲除嵌合体；编号180216的犬为删除522bp序列和496bp序列的杂合突变嵌合体犬；编号180306为删除483bp序列同时插入7bp序列的纯合突变犬。
[0150] 表1：胚胎移植汇总表
[0151]
[0152]
[0153] 表2：Shank3基因编辑犬突变类型汇总
[0154]
[0155] (a)180306号犬：
[0156] 犬编号为180306的体细胞为分类命名为突触后密集区支架蛋白(Shank3)基因敲除比格犬耳成纤维细胞：Shk3-KO-ASD，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(邮政编码100101)，保藏号为CGMCC No.15599，保藏日期为2018年4月26日。
[0157] 具体而言：
[0158] 犬Shank3基因第19外显子部分野生型序列：
[0159]
[0160](加粗并且加下划线的两端序列分别为S2和
S3位点的序列)。
S3位点的序列)。
[0161] 打靶后，删除S2和S3之间483bp的如下片段：
[0162] CCGGCGGGCTCGACTACGGCCCCGCTGACAGCCCTGGCCTGGCTTTCGGCGGCCCGGGGCCGGCCAAGGACCGGCGGCTGGAGGAGCGGCGCCGCTCCACCGTGTTCCTGTCGGTGGGAGCCATCGAGGGCAGCCCCCCCAGCGCCGAGCTGCCCTCCCTGCAGCCCTCCCGCTCCATCGACGAGCGCCTTCTGGGCGCCGGCGCCGCCCCCACCACCGGCCGCGACCTGCTCCTGCCCTCCCCCGTCTCTGCTCTGAAGCCATTGGTGAGCGGCCCGAGCCTTGGGCCTTCAGGCTCCACCTTCATCCACCCGCTCACCGGCAAGCCCCTGGACCCCAGCTCGCCCCTGGCCCTGGCCCTGGCCGCGCGGGAGCGGGCTCTGGCCTCCCAGGCGCCCTCCCGGTCCCCCACGCCTGTGCACAGCCCCGACGCTGACCGTCCCGGGCCTCTATTTGTGGATGTGCAGGCCCGCGACTCCGAGC(SEQ ID NO：8)；
[0163] 并且插入了7bp的如下片段：
[0164] TCCCCAA(SEQ ID NO：9)。
[0165] 突变后的序列为：
[0166]
[0167] (b)180216号犬：
[0168] 野生型序列(黑体且加下划线部分显示了要删除的522bp序列)
[0169]
[0170]
[0171] 野生型序列(黑体且加下划线部分显示了要删除的496bp)
[0172]
[0173] P1：CCTTCAGCGCCAGCATCTTC：
[0174] P2：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA
[0175] (P1和P2作为鉴定引物，用于PCR产物回收测序，从而确定具体突变的序列)[0176] 522bp删除后序列
[0177] CCTTCAGCGCCAGCATCTTCGCACCCTCCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAGCCCCCTGGTGAAGCAGCTGCAGGTGGAGGACGCCCAGGAGCGTGCCGCCCTGGCCGTCGGCAGCCCTGGCCCGGGTGGTGGCAGCTTTGCCCGCGAGC------------------------------------------------------------------------CCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：13)。
[0178] P3：CGAGCCCTCCCCAGCCTTC
[0179] P4：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA
[0180] (适用于522bp删除后序列的PCR特异鉴定用引物)
[0181] 147bp的特征序列：
[0182] CGAGCCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：11)
[0183] 496bp删除后序列
[0184] CCTTCAGCGCCAGCATCTTCGCACCCTCCAAGCCCCAGCGCCGCAAGAGCCCCCTGGTGAAGCAGCTGCAGGTGGAGGACGCCCAGGAGCGTGCCGCCCTGGCCGTCGGCAGCCCTGGCCCGGGTGGTGGCAGCTTTGCCCGCGAGCCCTCCCCGACGCACCGCGGCCCTC---------------------------------------------------------GGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：14)。
[0185] 496bp鉴定引物及序列
[0186] P5：GCGGCCCTCGGCCTCCCCAG
[0187] P6：CGTCCTGGACACGTCTCTGCA
[0188] (适用于496bp删除后序列的PCR特异鉴定用引物)
[0189] 153bp的特征序列：
[0190] GCGGCCCTCGGCCTCCCCAGCCTTCTCCCCAAGAAGTCCAGCCTGGGTCCCTGTGCCTGCTCGCAGGGAGCCGGAGAAAGCACCCCGGGAGGAGCGGAAGTCGCCGGAGGACAAGAAGTCCATGATCCTCAGCGTCCTGGACACGTCTCTGCA(SEQ ID NO：12)
[0191] (2)自闭症犬的行为学验证：
[0192] 美国的精神病学诊断手册(DSM-IV)和世界卫生组织会(ICD-10)最新规定，自闭症患者两个核心临床症状包括：社会活动及交流异常和刻板重复性行为，同时还伴有运动能力异常，身体发育迟缓的并发症。
[0193] 本发明制备的自闭症犬180306和自闭症犬180216进行了经典的三箱子，单箱子及相关运动能力检测，这些实验可以对自闭症动物模型进行检测。通过单箱子实验发现上述这两只自闭症犬具有类似小鼠的刻板重复行为，过度的自我梳毛，同时跑步机检测实验发现，与其它野生型犬相比，这两只自闭症犬运动能力异常。而且，最重要的是这两只自闭症犬发育迟缓，体重明显轻于同月龄的野生型犬，这些都证明本发明制备的Shank3基因敲除犬满足作为自闭症犬的临床症状，具有自闭症表型，是一个新的自闭症动物模型，可以作为人类自闭症机理及治疗药物的筛选和药物治疗的模型犬，可以用于自闭症机理的研究及治疗药物的开发。
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