神经营养因子衍生的肽序列
阅读：141发布：2020-07-07
专利汇可以提供神经营养因子衍生的肽序列专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及能够刺激神经元细胞分化、神经细胞存活、以及与记忆和学习有关的神经元可塑性的肽序列。本发明的肽序列衍生自属于神经营养因子的 蛋白质 ，诸如NGF、NT3、NT4/5和BDNF。本发明还涉及包含所述肽 片段 的药物组合物及其 治疗 如下 疾病 或疾患的用途，其中刺激神经元细胞分化、神经元细胞存活、以及与学习和记忆有关的神经可塑性的效应对治疗有益。，下面是神经营养因子衍生的肽序列专利的具体信息内容。
1.一种分离的肽序列，其包含5-25个连续氨基酸残基，所述序列包含氨基 酸基序xp1-D/E-T-xa1-C(基序I)，
其中
xp1为疏水性氨基酸残基，并且
xa1为K、R、S或A。
2.根据权利要求1的分离的肽序列，其中xp1是Y、F或I。
3.根据权利要求1或2的分离的肽序列，所述序列包含氨基酸基序 xp2-(xa)-(xa)-x+/--xa2-G(基序II)，
其中
xp2为疏水性或碱性氨基酸残基，
(xa)为任何氨基酸残基或键，
x+/-为带电荷的氨基酸残基，并且
xa2为任何氨基酸残基。
4.根据权利要求3的分离的肽序列，其中xp2是A、L、P或Y。
5.根据权利要求3的分离的肽序列，其中xp2是K。
6.根据权利要求3的分离的肽序列，其中(xa)是选自A、E、F、I、L、R、S、 T或V的氨基酸残基。
7.根据权利要求3的分离的肽序列，其中至少一个(xa)是键。
8.根据权利要求3的分离的肽序列，其中xa2是选自A、E、G、I、N、R、S 或T的氨基酸残基。
9.根据权利要求3的分离的肽序列，其中x+/-选自D、E、K、R或H。
10.根据前述权利要求任一项的分离的肽序列，所述肽序列包含下式的氨基 酸序列或其片段，
x1-xp1-D/E-T-xa1-C-(x)n-xp2-(xa)-(xa)-x+/--xa2-G-(x)n，
其中
x1为任何氨基酸残基，
(x)n为键或任何氨基酸残基序列，其中n为1到5的整数，并且
xp1、xp2、xa1、xa2、(xa)、x+/-如权利要求1-9中所定义的。
11.根据权利要求1-10任一项的分离的肽序列，所述序列包含氨基酸基序
R/K-A/G-L/V/I-T/D-xa3-x+/-(基序III)，
其中
xa3为任何氨基酸残基，并且
x+/-为带电荷的氨基酸残基。
12.根据权利要求11的分离的肽序列，其中xa3选自A、D、M、R或S。
13.根据权利要求11或12的分离的肽序列，其中x+/-选自D、E、K、R或H。
14.根据权利要求11-13任一项的分离的肽序列，所述肽序列包含下式的氨基 酸序列或其片段，
x1-xp1-D/E-T-xa1-C-(x)n-xp2-(xa)-(xa)-x+/--xa2-G-(x)n-R/K-A/G-L/V/I-T/D-xa3- x+/--(x)n，
其中
x1、xp1、xp2、xa1、xa2、xa3、(xa)、x+/-和(x)n如权利要求1-13中所定义的。
15.根据权利要求10或14的分离的肽序列，其中所述片段包含以下任何氨基 酸基序：
xp1-D/E-T-xa1-C(基序I)，
xp2-(xa)-(xa)-x+/--xa2-G(基序II)或
R/K-A/G-L/V/I-T/D-xa3-x+/-(基序III)，
其中xp1、xp2、xa1、xa2、xa3、(xa)、x+/-如权利要求1-14中所定义的。
16.根据前述权利要求任一项的分离的肽序列，其中所述肽序列能够刺激神 经突长出。
17.根据前述权利要求任一项的分离的肽序列，其中所述肽序列能够刺激神 经可塑性，诸如与学习和/或记忆有关的神经可塑性。
18.根据前述权利要求任一项的分离的肽序列，其中所述肽序列能够刺激细 胞分化，诸如神经干细胞分化或肿瘤细胞分化。
19.根据前述权利要求任一项的分离的肽序列，其中所述肽序列能够调控神 经营养因子受体的活性。
20.根据权利要求19的分离的肽序列，其中所述序列能够活化神经营养因子 受体。
21.根据权利要求19的分离的肽序列，其中所述序列能够抑制神经营养因子 受体。
22.根据权利要求19或20的分离的肽序列，其中所述神经营养因子受体是 Trk A、Trk B或Trk C。
23.根据权利要求19或21的分离的肽序列，其中所述神经营养因子受体是 p75Trk。
24.根据前述权利要求19-22任一项的分离的肽序列，其中所述肽序列能够 刺激细胞存活。
25.根据前述权利要求任一项的分离的肽序列，其中所述序列选自下述氨基 酸序列或其片段或变体：
YETKCRDPNPVDSG(SEQ ID NO：1)、
FETRCKEARPVKNG(SEQ ID NO：2)、
YETRCKADNAEEGGPGAG(SEQ ID NO：3)、
FETKCNPMGYTKEG(SEQ ID NO：4)、
RIDTACV(SEQ ID NO：5)、
RIDTSCV(SEQ ID NO：6)、
CVLSRKAVRRA(SEQ ID NO：7)、
CALSRKIGRT(SEQ ID NO：8)、
VCTLLSRTGRA(SEQ ID NO：9)、
VCTLTIKRGR(SEQ ID NO：10)、
SSHPIFHRGEFS(SEQ ID NO：11)、
YAEHKSHRGEYS(SEQ ID NO：12)、
SETAPASRRGELA(SEQ ID NO：13)、
HSDPARRGELS(SEQ ID NO：14)、
TFVKALTMDGKQAAWR(SEQ ID NO：15)、
TYVRALTSENNKLVGWR(SEQ ID NO：16)、
SYVRALTADAQGRVGWR(SEQ ID NO：17)、
SYVRALTMDSKKRIGWR(SEQ ID NO：18)、
RGIDSKHWNSY(SEQ ID NO：19)、
RGIDDKHWNSQCKTSQ(SEQ ID NO：20)、
RGVDRRHWVSE(SEQ ID NO：21)、
RGIDKRHWNSQ(SEQ ID NO：22)、
RIDTACVCVLSRKAVRRA(SEQ ID NO：23)、
RIDTSCVCALSRKIGRT(SEQ ID NO：24)、
RIDTACVCTLLSRTGRA(SEQ ID NO：25)或
RIDTSCVCTLTIKRGR(SEQ ID NO：26)。
26.根据权利要求25的分离的肽序列，其中所述片段是包含编号为SEQ ID NO：1-26的任一序列的至少5个氨基酸残基的氨基酸序列。
27.根据权利要求25的分离的肽序列，其中所述变体是与编号为SEQ ID NO： 1-26的任一序列具有至少60％同源性的氨基酸序列。
28.根据权利要求26或27的分离的肽序列，其中所述氨基酸序列具有选自权 利要求25中所述任一序列的肽序列的至少一种生物学活性。
29.根据权利要求28的分离的肽序列，其中所述生物学活性选自刺激细胞分 化、刺激与学习和记忆有关的神经可塑性、刺激细胞存活、调控神经营 养因子受体的活性的能力。
30.根据前述权利要求1-29任一项的分离的肽序列，所述序列衍生自神经生 长因子(NGF)。
31.根据权利要求30的分离的肽序列，其中所述序列选自编号为SEQ ID NO： 1、5、7、11、15、19、23的序列。
32.根据前述权利要求1-29任一项的分离的肽序列，所述序列衍生自神经营 养因子-3(NT-3)。
33.根据权利要求32的分离的肽序列，其中所述序列选自编号为SEQ ID NO： 2、6、8、12、16、20、24的序列。
34.根据前述权利要求1-29任一项的分离的肽序列，所述序列衍生自神经营 养因子-4/5(NT-4/5)。
35.根据权利要求34的分离的肽序列，其中所述序列选自编号为SEQ ID NO： 3、5、9、13、17、21、25的序列。
36.根据前述权利要求1-29任一项的分离的肽序列，所述序列衍生自脑衍生 神经营养因子(BDNF)。
37.根据权利要求36的分离的肽序列，其中所述序列选自编号为SEQ ID NO： 4、6、10、14、18、22、26的序列。
38.一种分离的肽序列，其为5-25个连续氨基酸残基，所述序列包含氨基酸 基序xp2-(xa)-(xa)-x+/--xa2-G(基序II)，
其中
xp2为疏水性或碱性氨基酸残基，
(xa)为任何氨基酸残基或键，
x+/-为带电荷的氨基酸残基，并且
xa2为任何氨基酸残基。
39.根据权利要求38的分离的肽序列，其中xp2是A、L、P或Y。
40.根据权利要求38的分离的肽序列，其中xp2是K。
41.根据权利要求38的分离的肽序列，其中(xa)是选自A、E、F、I、L、R、 S、T或V的氨基酸残基。
42.根据权利要求38的分离的肽序列，其中至少一个(xa)是键。
43.根据权利要求38的分离的肽序列，其中xa2是选自A、E、G、I、N、R、 S或T的氨基酸残基。
44.根据权利要求38的分离的肽序列，其中x+/-选自D、E、K、R或H。
45.根据前述权利要求38-43任一项的分离的肽序列，所述序列是选自编号 为SEQ ID NO：1-4、7-14或23-26的任一序列的序列。
46.根据权利要求45的分离的肽序列，其中所述序列是选自编号为SEQ ID NO：1-4的任一序列的序列。
47.根据权利要求45的分离的肽序列，其中所述序列是选自编号为SEQ ID NO：7-10的任一序列的序列。
48.根据权利要求45的分离的肽序列，其中所述序列是选自编号为SEQ ID NO：11-14的任一序列的序列。
49.根据权利要求45的分离的肽序列，其中所述序列是选自编号为SEQ ID NO：23-26的任一序列的序列。
50.根据权利要求45的分离的肽序列，其中所述序列是选自编号为SEQ ID NO：1、7、11或23的序列的序列。
51.根据权利要求45的分离的肽序列，其中所述序列选自编号为SEQ ID NO： 2、8、12或24的序列。
52.根据权利要求45的分离的肽序列，其中所述序列选自编号为SEQ ID NO： 3、9、13或25的序列。
53.根据权利要求45的分离的肽序列，其中所述序列选自编号为SEQ ID NO： 4、10、14或26的序列。
54.一种分离的肽序列，其为6-25个连续氨基酸残基，所述序列包含氨基酸 基序R/K-A/G-L/V/I-T/D-xa3-x+/-(基序III)，
其中
xa3为任何氨基酸残基，并且
x+/-为带电荷的氨基酸残基。
55.根据权利要求54的分离的肽序列，其中xa3选自A、D、M、R或S。
56.根据权利要求54或55的分离的肽序列，其中x+/-选自D、E、K、R或H。
57.根据前述权利要求54、55或56的分离的肽序列，所述序列选自编号为 SEQ ID NO：15-22的任一序列。
58.根据权利要求57的分离的肽序列，所述序列选自编号为SEQ ID NO： 15-18的任一序列。
59.根据权利要求57的分离的肽序列，所述序列选自编号为SEQ ID NO： 19-22的任一序列。
60.根据权利要求57的分离的肽序列，所述序列选自编号为SEQ ID NO：15 或19的序列。
61.根据权利要求57的分离的肽序列，所述序列选自编号为SEQ ID NO：16 或20的序列。
62.根据权利要求57的分离的肽序列，所述序列选自编号为SEQ ID NO：17 或21的序列。
63.根据权利要求57的分离的肽序列，所述序列选自编号为SEQ ID NO：18 或22的序列。
64.一种分离的肽序列，其为6-25个连续氨基酸残基，所述序列包含氨基酸 基序xp1-D/E-T-xa1-C(基序I)，
其中
xp1为疏水性氨基酸残基，并且
xa1为K、R、S或A。
65.根据权利要求64的分离的肽序列，其中xp1是Y、F或I。
66.根据权利要求65的分离的肽序列，其中所述序列选自编号为SEQ ID NO： 1-6、或23-26的任一序列。
67.根据权利要求66的分离的肽序列，其中所述序列选自编号为SEQ ID NO： 1-6的任一序列。
68.根据权利要求66的分离的肽序列，其中所述序列选自编号为SEQ ID NO： 23-26的任一序列。
69.根据权利要求65的分离的肽序列，其中所述序列选自编号为SEQ ID NO： 1-4的任一序列。
70.根据权利要求65的分离的肽序列，其中所述序列选自编号为SEQ ID NO： 5或SEQ ID NO：6的序列。
71.根据权利要求65的分离的肽序列，其中所述序列选自编号为SEQ ID NO： 1、5或23的序列。
72.根据权利要求65的分离的肽序列，其中所述序列选自编号为SEQ ID NO： 2、6或24的序列。
73.根据权利要求65的分离的肽序列，其中所述序列选自编号为SEQ ID NO： 3、5或25的序列。
74.根据权利要求65的分离的肽序列，其中所述序列选自编号为SEQ ID NO： 4、6或26的序列。
75.一种复合物，其包含前述权利要求1-74任一项的分离的肽序列。
76.根据权利要求75的复合物，其中所述肽序列被配制为由单一拷贝的个体 肽序列构成的单体。
77.根据权利要求75的复合物，其中所述肽序列被配制为由两个或多个拷贝 的个体肽序列构成的多聚体，诸如个体肽序列的二聚体或四聚体。
78.根据权利要求77的复合物，其中所述多聚体是树状聚体。
79.根据权利要求1-74任一项的个体肽序列或者根据权利要求73-77任一项 的复合物用于生产药剂的用途。
80.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-74任一项的个体肽序列和/或根 据权利要求75-78任一项的复合物。
81.刺激神经突长出、神经元细胞存活和/或抑制细胞运动性的方法，包括使 用根据权利要求1-74任一项的肽、根据权利要求75-78任一项的复合物、 或者根据权利要求80的药物组合物。
82.根据权利要求1-74任一项的个体肽序列、根据权利要求75-78任一项的复 合物、或者根据权利要求80的药物组合物用于刺激细胞分化、细胞存活、 神经细胞可塑性和/或诱导细胞凋亡的用途。
83.根据权利要求1-74任一项的个体肽序列、根据权利要求75-78任一项的复 合物、或者根据权利要求80的药物组合物用于治疗如下疾患或疾病的用 途，其中刺激细胞分化、细胞存活、神经细胞可塑性或诱导细胞凋亡对 治疗有益。
84.根据权利要求83的用途，其中所述疾患或疾病是中枢和周围神经系统的 疾患或疾病。
85.根据权利要求84的用途，其中所述疾患或疾病选自手术后神经损伤、外 伤性神经损伤、神经纤维髓鞘形成减弱、缺血后损伤诸如中风后的缺血 后损伤、与糖尿病有关的神经变性、影响生理节奏钟或神经-肌肉传递 的病症。
86.根据权利要求83的用途，其中所述疾患或疾病选自肌肉的疾患或疾病， 包括神经-肌肉连接功能减弱的疾患，诸如器官移植后的神经-肌肉连接 功能减弱的疾患，或者诸如遗传性或外伤性萎缩性肌肉病症。
87.根据权利要求86的用途，其中所述疾患或疾病是癌症。
88.根据权利要求87的用途，其中所述癌症是涉及血管新生的任何癌症。
89.根据权利要求87的用途，其中所述癌症是神经系统的癌症。
90.根据权利要求84的用途，其中所述疾患或疾病是学习能力减弱和/或记忆 减弱。
91.根据权利要求90的用途，其中所述疾患或疾病是帕金森氏病、阿耳茨海 默氏病、亨廷顿氏病或痴呆诸如多梗塞性痴呆。
92.根据权利要求84的用途，其中所述疾患或疾病是精神疾病，诸如思维和 /或心境障碍、神经精神病学障碍包括双相的(BPD)、遗传相关单相的情 感障碍、妄想性障碍、妄想痴呆、偏执性精神病、精神分裂症、分裂型 障碍、情感分裂性精神障碍、情感分裂性双相的和遗传相关单相的情感 障碍、心因性精神病、紧张症、周期性双相的和遗传相关单相的情感障 碍、环性精神病、分裂样人格障碍、偏执型人格障碍、双相的和遗传相 关单相的情感障碍相关的情感障碍及单相情感障碍各亚型。
93.根据权利要求83的用途，其中所述疾患或疾病是起因于酒精消耗的机体 损伤。
94.根据权利要求83的用途，其中所述疾患或疾病是朊病毒疾病。
95.根据权利要求1-74任一项的肽序列用于生产抗体的用途。
96.一种抗体，其能够识别并结合包含根据权利要求1、38、54或64的氨基 酸基序的表位。
97.根据权利要求96的抗体，所述抗体能够识别包含编号为SEQ ID NO：1-26 的任一序列的表位或者能够识别编号为SEQ ID NO：1-26的任一序列所 包含的表位。
98.治疗方法，包括为需要的个体施用有效量的根据权利要求1-74任一项的 肽序列、根据权利要求75-78任一项的复合物、根据权利要求80的药物 组合物、和/或根据权利要求96或97的抗体。
发明领域
本发明涉及能够刺激神经元细胞分化、神经细胞存活、以及与记忆和学 习有关的神经元可塑性的肽序列。本发明的肽序列衍生自属于神经营养因子 的蛋白质，诸如NGF、NT3、NT4/5和BDNF。本发明还涉及包含所述肽片段 的药物组合物及其治疗如下疾病或疾患的用途，其中刺激神经元细胞分化、 神经元细胞存活、以及与学习和记忆有关的神经可塑性的效应对治疗有益。
发明背景
神经元的生长、维持和再生至少部分受到称为神经营养因子 (neurotrophin，NT)的某些多肽生长因子的调节，所述神经营养因子结合并活 化Trk家族的细胞表面受体，所述Trk家族的细胞表面受体具有固有的酪氨酸 激酶活性。一旦神经营养因子结合，相信这些受体将在一个或多个氨基酸残 基上变成自我磷酸化的，并且随之与对信号转导来说重要的胞内分子相结合 (综述参见Ulrich和Schlessinger，Cell 1990，61：203-212；Chao，Neuron 1992， 9：583-593)。
神经营养因子是小的(约13kDa)强碱性的二聚体蛋白，其深刻地影响所 有脊椎动物物种中神经系统的发育。
神经生长因子(NGF)是最先且最好地被表征的神经营养因子家族成员。 它作为同二聚体存在于CNS中，其基因位于第1条染色体上(p21-p22.1区)。 已显示NGF促进基底前脑的胆碱能神经元和交感神经元、及初级感觉神经元 (primary sensory neurons)的存活。也已证明NGF是针对轴索显微外科术 (axotomy)诱导的神经变性和年龄相关的萎缩的保护因子。已经提出NGF在神 经变性病症诸如阿尔茨海默氏病的病理生理学和药物疗法中起作用。此外， 已显示其在暴露于毒性浓度谷氨酸的海马神经元中显著减弱神经变性并维 持细胞形态(综述见Salehi等，2004；Tuszynski MH等，Nat Med.2005Jun；11(6)： 551-5；Jakubowska-Dogru E，Gumusbas U Neurosci Lett.2005 Jul 1；382(1-2)： 45-50；Walz R等，Neurochem Res.2005 Feb；30(2)：185-90；Hu Z等，Neurobiol Dis.2005 Feb；18(1)：184-92)。
脑衍生神经营养因子(BDNF)是另一种很好表征的神经营养因子家族成 员。BDNF基因位于第11条染色体，p13条带。BDNF蛋白的结构与NGF的结 构类似。BDNF在CNS中比NGF分布更广。像NGF一样，BDNF富集于海马中， 海马是在成人脑中保持高度神经可塑性的脑区，其基本上与学习和记忆有 关。值得注意的是海马内NGF和BDNF表达的调节都至少部分受到胆碱能和 谷氨酸能系统的控制。已显示海马损伤导致BDNF表达的上调。此外，与NGF 类似，BDNF作为基底前脑初级感觉和胆碱能神经元的存活因子发挥作用。 另外，发现BDNF促进多种其它神经元细胞类型例如黑质(substania nigra)的 多巴胺能神经元、小脑颗粒神经元、运动神经元、蓝斑(locus ceruleus)神经 元和视网膜神经节细胞的存活，在这些神经元细胞类型中NGF看起来未扮演 重要角色。
神经营养因子-3(NT-3)具有与NGF和BDNF都高度相似的结构，然而该 生长因子在神经系统中的表达多少与NGF或BDNF有所不同。与NGF和 BDNF相反，NT-3在CNS中的水平在胎儿发育期间和新生儿脑中是高的，在 成人脑中降低。新生动物海马中NT-3的水平显著高于其它神经营养因子的水 平。根据这些发现，提出NT-3在早期神经元发育中扮演重要角色，脑发育期 间该神经营养因子的机能障碍可能导致海马病理学诸如精神分裂症。像NGF 和BDNF一样，NT-3延长初级感觉神经元特别是神经嵴细胞的存活，并且提 高多巴胺能神经元存活(综述参见Shoval和Weizman，2005)。
神经营养因子生长因子家族第四个有记载的成员是神经营养因子4/5 (NT-4/5)。同所有其它神经营养因子一样，NT-4/5是有效的神经元细胞存活 因子，特别是已显示它促进神经嵴和基板(placodes)的感觉神经元、运动神经 元、基底前脑和蓝斑的神经元的存活。它还充当基底前脑神经元和运动神经 元的分化因子。它与促进神经再生和海马神经元的突触活性有关(综述参见 Shoval和Weizman，2005)。
神经生长因子受体(NGFR)是所有神经营养因子的普遍存在的受体，根 据它的分子量也将其称为p75NTR。NGFR在被发现时被认为是独特的蛋白质类 型。然而，后来发现肿瘤坏死因子受体的大型超家族共享NGFR的整体结构 (4个胞外配体结合的、富含半胱氨酸的重复，或者称为CR，通过与胞质相互 作用物结合或者解离而发出信号)。对该超家族的鉴定帮助阐明了NGFR的一 些生物学功能，包括其在核因子κ-B和凋亡途径中的最终介入。NGFR/p75NTR 主要与细胞死亡有关。NGFR作为单体以低亲和力结合所有NT。NT的更高 亲和力结合通过该因子与原肌球蛋白受体激酶家族(TRK家族)的更高分子量 受体TRKA(NTRK1)、TRKB(NTRK2)和TRKC(NTRK3)的结合而获得。 TRKA、TRKB和TRKC分别特异于NGF、NT-4/5和BDNF、以及NT-3。NT-3 也结合TRKA和TRKB，但亲和力明显较低(有关NT及其受体的综述参见 Bothwell，Science 272：506-507，1996；Carter和Lewin，Neuron 18：187-190， 1997；Bibel和Barde，Genes Dev.14：2919-2937，2000)。
NT与其受体的结合以及对该结合的调节是非常复杂的，在发育期间和 成人中受到强烈调节。神经营养因子及其受体既涉及神经系统正常功能的调 节也涉及病理学。早已明了开发能够增强和/或抑制神经营养因子的功能和/ 或其受体的活性的新化合物对于开发用于治疗多种神经系统相关疾病的新 药来说将会是有益的。然而，尽管早已认识到该需求，但这样的化合物一直 是非常难以捉摸的。作为大分子，治疗性递送有效水平的神经营养因子本身 存在相当大的可能难以逾越的挑战。另外，天然神经营养因子可能与神经元 中的其它受体诸如p75受体相互作用，该受体与神经元凋亡和生长锥塌陷 (collapse)有关。然而，先前设计Trk受体的肽模拟物激动剂和/或拮抗剂的努 力也没有成功。例如，已报导衍生自神经营养因子NGF的第1个环的环肽适 度地模拟NGF的存活活性。然而，这些肽看起来以p75而非Trk受体依赖性的 方式起作用(Long等，J.Neurosci.Res.1997，48：1-17)。据说NGF第4个环的一 些环肽显示NGF样存活活性，该活性受到Trk拮抗剂的阻断。然而，据报导， 由那些肽诱导的最大存活应答仅仅为NGF神经营养因子自身引起的最大应 答的10-15％(Xie等，J.Biol.Chem.2000，275：29868-29874；Maliartchouk等，J. Biol.Chem.2000，275：9946-9956)。
已显示BDNF第2个环的肽的二环和三环二聚体型具有BDNF样活性。然 而，再次报导它们所诱导的最大存活应答仅仅为天然神经营养因子引起的最 大应答的30％(O′Leary等，J.Biol.Chem.2003，278：25738-25744)。因此，仍 然存在早已认知到的对能够调控(即增强或抑制)神经元生长和恢复的组合 物的需求。也存在对能够有效调控神经元生长和恢复的程序和方法(包括治 疗性方法)的需求。
发明概述
本发明涉及衍生自神经营养因子的短肽序列，其在刺激由神经营养因子 受体介导的神经元细胞分化、神经元细胞存活、以及与学习和记忆有关的神 经可塑性方面非常有效。根据本发明，所述肽序列包含一个或多个相同的氨 基酸基序，该相同氨基酸基序对于所述肽的生物学活性来说是重要的
如此，在第一个方面，本发明涉及包含5-25个连续氨基酸残基的分离的 肽序列，所述肽序列包含氨基酸基序xp1-D/E-T-xa1-C(基序I)，
其中
xp1为疏水性氨基酸残基，并且
xa1为K、R、S或A。
在本发明的另一个方面，包含基序(I)的肽序列可以进一步包含基序(II) xp2-(xa)1-(xa)2-x+/--xa2-G或/和基序(III)R/K-A/G-L/V/I-T/D-xa2-x+/-，
其中
xp2为疏水性或碱性氨基酸残基，
(xa)为任何氨基酸残基或键，
x+/-为带电荷的氨基酸残基，并且
xa2为任何氨基酸残基。
本发明公开了衍生自NGF、NT3、NT4/5和BDNF的特定肽序列，其包含 上述至少一种基序，并且能够刺激神经元细胞分化、神经元细胞存活、和/ 或与学习和记忆有关的神经可塑性。
进一步，本发明涉及含有包含上述至少一种基序的肽序列的复合物，特 别是包含衍生自NGF、NT3、NT4/5或BDNF的序列的复合物。
本发明还涉及所述肽序列和包含所述肽序列的复合物用于生产药剂和/ 或用于制备抗体的用途。本发明还涉及包含本发明的肽、复合物和/或抗体的 药物组合物。
利用本发明的肽、复合物、抗体和/或药物组合物刺激神经突细胞分化、 神经元细胞存活、和/或与学习和记忆有关的神经元可塑性的方法也在保护范 围内，以及包括为有需要的个体施用有效量的本发明的肽、复合物、抗体或 药物组合物的治疗方法。
附图简述
图1显示NGF衍生肽NGF-C2、NGF-D和NGF-E对小脑颗粒神经元(CGN) 的神经突长出的影响。
图2显示NGF衍生肽NGF-C1和NGF-EE对CGN的神经突长出的影响。
图3显示NGF衍生肽NGF-E、NGF-EE和NGF-N对CGN存活的影响。
图4显示BDNF衍生肽BDNF-E对CGN的神经突长出的影响。
图5显示BDNF衍生肽BDNF-EE对CGN的神经突长出的影响。
发明详述
I.肽序列
本发明的一个方面涉及包含5-25个连续氨基酸残基的肽序列，所述肽序 列包含氨基酸基序(基序I)xp1-D/E-T-xa1-C，
其中
xp1为疏水性氨基酸残基，并且
xa1为K、R、S或A。
根据本发明的基序(I)的xp1残基可以为任何疏水性残基，然而在优选实施 方案中xp1选自Y、F或I。如此，在一个优选实施方案中它可以是Y，在另一 优选实施方案中是F，在又一优选实施方案中它可以是I。
包含上述基序的本发明的肽序列可以进一步包含另一个氨基酸基序 xp2-(xa)1-(xa)2-x+/--xa2-G(基序II)，
其中
xp2为疏水性或碱性氨基酸残基，
(xa)为任何氨基酸残基或键，
x+/-为带电荷的氨基酸残基，并且
xa2为任何氨基酸残基。
如此，本发明的另一个方面涉及同时包含基序(I)和基序(II)的下式的肽 序列：x1-xp1-D/E-T-xa1-C-(x)n-xp2-(xa)-(xa)-x+/--xa2-G-(x)n，
其中
x1为任何氨基酸残基，
(x)n为键或任何氨基酸残基序列，其中n为1到5的整数，并且
xp1、xp2、xa1、xa2、(xa)、x+/-如权利要求1-9中所定义的。
根据本发明，基序(II)的xp2可以为任何疏水性氨基酸残基，然而优选xp2 选自A、L、P或Y。在另一个实施方案中xp2可以为带电荷的氨基酸残基，在 优选实施方案中为带正电荷的残基例如K、R或H。根据本发明最优选的带正 电荷的残基为K。
根据本发明，基序(II)中(xa)位点的残基为任何氨基酸残基，然而在该位 点一些氨基酸残基可能是优选的，这样的优选氨基酸残基可以选自A、E、F、 I、L、R、S、T或V。在一些实施方案中，(xa)位点的至少一个氨基酸残基可 以不存在，这样根据本发明的基序(II)可以包含5个或4个氨基酸残基。在这 样的实施方案中，本发明涉及一种包含基序xp2-(xa)-x+/--xa2-G的氨基酸序列， 即其中一个(xa)位点为肽键，或者本发明涉及一种包含基序xp2-x+/--xa2-G的氨 基酸序列，即其中两个(xa)位点均为肽键。在一些实施方案中，其中一个(xa) 残基不存在可能是优选的，在其他实施方案中，两个(xa)均为肽键取代可能 是优选的。
根据本发明，xa2可以选自氨基酸残基A、E、G、I、N、R、S或T，并且 x+/-可以选自D、E、K、R或H。
另外，根据本发明的上述氨基酸序列可以进一步包含氨基酸基序 R/K-A/G-L/V/I-T/D-xa3-x+/-(基序III)，
其中
xa3为任何氨基酸残基，并且
x+/-为带电荷的氨基酸残基。
在基序(III)中，xa3残基可以选自A、D、M、R或S，并且x+/-选自D、E、 K、R或H。
相应地，本发明的另一个方面涉及包含上述全部三种基序的至少15个连 续氨基酸残基的肽序列。根据本发明，这样的氨基酸序列可以由下式定义： x1-xp1-D/E-T-xa1-C-(x)n-xp2-(xa)1-(xa)2-x+/--xa2-G-(x)n-R/K-A/G-L/V/I-T/D-xa3-x+/- -(x)n，
其中
x1、xp1、xp2、xa1、xa2、xa3、(xa)、x+/-和(x)n如上文所讨论的，
或者为包含至少5个氨基酸残基的所述序列的片段，所述片段包含下述 基序之一：
xp1-D/E-T-xa1-C(基序I)，
xp2-(xa)1-(xa)2-x+/--xa2-G(基序II)或
R/K-A/G-L/V/I-T/D-xa3-x+/-(基序III)，
其中xp1、xp2、xa1、xa2、xa3、(xa)、x+/-如上文所讨论的。
上述肽序列可以例如包含选自以下序列的序列或其片段、变体或同源 物：
YETKCRDPNPVDSG(SEQ ID NO：1)、
FETRCKEARPVKNG(SEQ ID NO：2)、
YETRCKADNAEEGGPGAG(SEQ ID NO：3)、
FETKCNPMGYTKEG(SEQ ID NO：4)、
RIDTACV(SEQ ID NO：5)、
RIDTSCV(SEQ ID NO：6)、
CVLSRKAVRRA(SEQ ID NO：7)、
CALSRKIGRT(SEQ ID NO：8)、
VCTLLSRTGRA(SEQ ID NO：9)、
VCTLTIKRGR(SEQ ID NO：10)、
SSHPIFHRGEFS(SEQ ID NO：11)、
YAEHKSHRGEYS(SEQ ID NO：12)、
SETAPASRRGELA(SEQ ID NO：13)、
HSDPARRGELS(SEQ ID NO：14)、
TFVKALTMDGKQAAWR(SEQ ID NO：15)、
TYVRALTSENNKLVGWR(SEQ ID NO：16)、
SYVRALTADAQGRVGWR(SEQ ID NO：17)、
SYVRALTMDSKKRIGWR(SEQ ID NO：18)、
RGIDSKHWNSY(SEQ ID NO：19)、
RGIDDKHWNSQCKTSQ(SEQ ID NO：20)、
RGVDRRHWVSE(SEQ ID NO：21)、
RGIDKRHWNSQ(SEQ ID NO：22)、
RIDTACVCVLSRKAVRRA(SEQ ID NO：23)、
RIDTSCVCALSRKIGRT(SEQ ID NO：24)、
RIDTACVCTLLSRTGRA(SEQ ID NO：25)、
RIDTSCVCTLTIKRGR(SEQ ID NO：26)。
应当理解，上述序列SEQ ID NO：1-26都包含基序(I)、(II)或(III)中的至少 一种。
在一些实施方案中，本发明的肽序列可以包含选自序列SEQ ID NO：5-22 的序列，诸如SEQ ID NO：5或6，或者例如包含选自序列SEQ ID NO：7-10的 序列，或者包含选自序列SEQ ID NO：11-14或SEQ ID NO：15-22例如选自序 列SEQ ID NO：15-18或SEQ ID NO：19-22的序列。
所述肽序列也可以包含序列SEQ ID NO：5-22之外的序列。这种肽序列可 以是例如选自序列SEQ ID NO：1-4的序列，或者是选自序列SEQ ID NO： 23-26的序列。
根据本发明，所述肽序列优选包含5-25个氨基酸残基。如此，在一个实 施方案中，优选的肽序列可以具有5-10个氨基酸残基的长度，诸如6-9个氨基 酸残基，例如7个或8个氨基酸残基，或者所述肽序列的长度可以为11-15个氨 基酸残基，诸如例如12-14个氨基酸残基，例如13个氨基酸残基。在另一个 实施方案中，优选的肽序列的长度可以为16-25个氨基酸残基，例如17-24个 氨基酸残基，诸如18-23个，例如19-22个，它也可以为20个或21个氨基酸残 基。然而在一些实施方案中，本发明的肽序列的长度可以比上述长度更长， 例如它可以有26-50个氨基酸残基。
如以上所提到的，本发明涉及上述肽序列的片段、变体和同源物，其定 义如下：
1)片段指如下序列，该序列的序列长度的至少40％、更优选至少50％、 更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少 90％、更优选至少95％对应于包含本发明基序的序列，特别是选自 序列SEQ ID NO：1-26的序列。优选所述片段包含本发明的基序；
2)变体指如下氨基酸序列，该氨基酸序列与包含本发明基序的序列， 特别是与选自序列SEQ ID NO：1-26的序列具有至少60％、更优选至 少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、更优选95％的同源性， 或者指如下氨基酸序列，该氨基酸序列与包含本发明基序的序列， 特别是与序列SEQ ID NO：1-26相比有至少60％、更优选至少70％、 更优选至少80％、更优选至少90％、更优选95％的正的氨基酸匹配。 本文中正的氨基酸匹配定义为在两个进行比较的序列中具有相同 位置的氨基酸的物理和/或化学特性所限定的同一性或相似性。本发 明优选的正的氨基酸匹配为K与R、E与D、L与M、Q与E、I与V、I 与L、A与S、Y与W、K与Q、S与T、N与S及Q与R。一条氨基酸序 列与另一条氨基酸序列的同源性定义为两条进行对比的序列中相 同氨基酸的百分比。序列同源性可以利用公知的算法诸如BLOSUM 30、BLOSUM 40、BLOSUM 45、BLOSUM 50、BLOSUM 55、 BLOSUM 60、BLOSUM 62、BLOSUM 65、BLOSUM 70、BLOSUM 75、BLOSUM 80、BLOSUM 85、或BLOSUM 90来计算。优选所述 变体包含本发明的基序；
3)同源物指如下氨基酸序列，该氨基酸序列与包含本发明基序的序 列，特别是与序列SEQ ID NO：1-22具有小于60％但大于30％，诸如 50-59％，例如55％，诸如40-49％，例如45％，诸如30-39％，例如35％ 的同源性。优选所述同源物包含本发明的基序。
推测如上定义的片段、变体和同源物保持了原始序列的至少一些生物学 活性，诸如例如序列SEQ ID NO：1-26的生物学活性，例如刺激与与神经细胞 分化有关的和/或与记忆和学习有关的神经可塑性的能力、刺激细胞存活的能 力，例如抑制凋亡的能力或者活化Trk家族的受体的能力。
以上描述的所有序列均为根据本发明的分离的肽序列。
术语“分离的肽序列”指所述肽序列为个体化学实体。分离的肽序列可以 是天然的、合成的或者重组的肽序列或者是通过酶学/化学裂解更大的多肽/ 蛋白质而制备的序列。术语“天然的”指所述肽序列是机体代谢系统的一部分 并且在体内生成。术语“重组的”指所述肽序列是通过重组技术的方法生产 的。这种序列既可以在体内生产也可以在体外生产。术语“合成的”指所述肽 序列是以化学合成手段生产的。
根据本发明，分离的肽序列可以衍生自蛋白质序列。术语“衍生的”指所 述分离的肽序列具有与蛋白质氨基酸序列的内部片段相同的氨基酸序列，所 述蛋白质用作利用任何本领域已知的技术例如重组生产或者化学合成技术 生成所述分离的肽序列的原型。
如此，本发明的肽序列可以包含衍生自蛋白质序列的序列。在一个实施 方案中，所述序列可以衍生自神经生长因子(NGF)，例如衍生自编号为 SwissProt Acc.No：NP_02497的NGF多肽的序列；在另一个实施方案中，所 述序列可以衍生自神经营养因子-3(NT-3)，例如衍生自编号为SwissProtAcc. No：NP_002518的NT-3多肽的序列；在又一个实施方案中，所述序列可以衍 生自神经营养因子-4/5(NT-4/5)，例如衍生自编号为SwissProt Acc.No： AAAV38176的NT-4/5多肽的序列；或者所述序列可以衍生自脑衍生神经营养 因子(BDNF)，例如衍生自编号为SwissProt Acc.No：NP_733928的BDNF多肽 的序列。
在一个优选实施方案中，本发明涉及衍生自NGF的序列，其可以选自编 号为SEQ ID NO：1、5、7、11、15、19或23的序列。在另一个优选实施方案 中，本发明涉及衍生自NT3的序列，所述序列选自序列SEQ ID NO：2、6、8、 12、16、20或24。在又一个优选实施方案中，本发明涉及衍生自NT-4/5的序 列。这样的序列可以选自编号为SEQ ID NO：3、5、9、13、17、21或25的序 列。还有，在另一个优选实施方案中，本发明涉及衍生自BDNF序列的序列。 后者的序列可以选自编号为SEQ ID NO：4、6、10、14、18、22或26的序列。
在本申请中，既使用氨基酸残基的标准单字母代码也使用标准三字母代 码。氨基酸的缩写按照生物化学命名IUPAC-IUB联合委员会的建议(Eur.J. Biochem，1984，vol.184，pp 9-37)。整个说明书和权利要求书中对于天然氨基 酸使用三字母代码或者单字母代码。没有指定L或D构型时，所讨论的氨基 酸理解为具有天然L构型，参见Pure&Appl.Chem.Vol.(56(5)pp 595-624 (1984)或D构型，因而所形成的肽可以由氨基酸的L构型、D构型、或者L构 型和D构型的混合序列构成。
未指定时，本发明肽的C-末端氨基酸理解为以游离羧酸形态存在，这也 可以表示为“-OH”。然而，本发明复合物的C-末端氨基酸可以是酰胺化衍生 物，其表示为“-NH2”。未作其他陈述时，多肽的N-末端氨基酸包含游离氨基， 这也可以表示为“H-”。
未作其它指定时，氨基酸可以选自任何氨基酸，无论是天然发生的或非 天然发生的，诸如α氨基酸、β氨基酸、和/或γ氨基酸。相应地，该组包括但 不限于：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met、Gly、Ser、Thr、Cys、 Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Aib、Nal、Sar、Orn、赖氨酸 类似物、DAP、DAPA和4Hyp。
还有，根据本发明，可以对所述复合物/肽进行修饰，诸如例如氨基酸的 糖基化和/或乙酰化。
根据本发明，氨基酸残基Arg、Lys和His代表碱性氨基酸残基，氨基酸 残基Glu和Asp代表酸性氨基酸残基。碱性和酸性氨基酸残基构成带电荷氨基 酸残基组。氨基酸残基Leu、Ile、Val、Phe、Trp、Tyr和Met代表疏水性氨基 酸残基组。
在一个实施方案中，变体可以理解为随插入、删除和取代(包括保守性 取代)的数目和范围增加而显示出逐渐不同于优选的预定序列的氨基酸序 列。此差异以预定序列与所述变体之间同源性的减小来测量。
一个方面，术语“肽序列变体”指所述肽可以被修饰，例如取代一个或多 个氨基酸残基。L-氨基酸和D-氨基酸均可使用。其它修饰可以包括衍生物， 诸如酯、糖等等。例子为甲基和乙酰基酯。
另一方面，根据本发明的肽片段的变体可以在同一变体或其片段内或者 在不同变体或其片段之间包含至少一个取代，诸如彼此独立引入的许多取 代。如此，所述复合体的变体或其片段可以包含彼此独立的保守性取代，其 中所述变体或其片段的至少一个甘氨酸(Gly)被选自下组氨基酸的氨基酸所 取代：Ala、Val、Leu和Ile；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体 或其片段的至少一个丙氨酸(Ala)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Gly、 Val、Leu和Ile；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片段的至 少一个缬氨酸(Val)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Gly、Ala、Leu和Ile； 及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片段的至少一个亮氨酸 (Leu)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Gly、Ala、Val和Ile；及与此独立 的，变体或其片段，其中所述变体或其片段的至少一个异亮氨酸(Ile)被选自 下组氨基酸的氨基酸所取代：Gly、Ala、Val和Leu；及与此独立的，变体或 其片段，其中所述变体或其片段的至少一个天冬氨酸(Asp)被选自下组氨基酸 的氨基酸所取代：Glu、Asn和Gln；及与此独立的，变体或其片段，其中所 述变体或其片段的至少一个天冬酰胺(Asn)被选自下组氨基酸的氨基酸所取 代：Asp、Glu和Gln；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片 段的至少一个谷氨酰胺(Gln)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Asp、Glu 和Asn；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片段的至少一个 苯丙氨酸(Phe)被选自下组氨基酸：Tyr、Trp、His、Pro，优选选自下组氨基 酸：Tyr和Trp的氨基酸所取代；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变 体或其片段的至少一个酪氨酸(Tyr)被选自下组氨基酸的氨基酸：Phe、Trp、 His、Pro，优选选自下组氨基酸的氨基酸：Phe和Trp所取代；及与此独立的， 变体或其片段，其中所述变体或其片段的至少一个精氨酸(Arg)被选自下组氨 基酸的氨基酸所取代：Lys和His；及与此独立的，变体或其片段，其中所述 变体或其片段的至少一个赖氨酸(Lys)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代： Arg和His；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片段的至少一 个脯氨酸(Pro)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Phe、Tyr、Trp和His；及 与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片段的至少一个半胱氨酸 (Cys)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、 Gln、Ser、Thr和Tyr。
以上讨论了肽序列变体的其它标准。
如此，从上文得出肽片段的同一功能性等效物或者所述功能性等效物的 片段可以包含一个以上的保守性氨基酸取代，所述保守性氨基酸取代来自上 文限定的一个以上的保守性氨基酸组。本文所用术语“保守性氨基酸取代”与 术语“同源性氨基酸取代”同义。
保守性氨基酸组如下：
P、A、G(中性的、弱疏水性的)；
S、T(中性的、亲水性的)；
Q、N(亲水性的、酸胺(acid amine))；
E、D(亲水性的、酸性的)；
H、K、R(亲水性的、碱性的)；
A、L、I、V、M、F、Y、W(疏水性的、芳香族的)；
C(形成交联的)。
保守性取代可以在本发明优选的预定肽或其片段的任何位置引入。然 而，也可能需要引入非保守性取代，特别是但不限于在任何一个或多个位置 引入非保守性取代。
例如，导致形成本发明肽的功能上等同的片段的非保守性取代i)在极 性上有显著不同，例如具有非极性侧链的残基(Ala、Leu、Pro、Trp、Val、Ile、 Leu、Phe或Met)取代具有极性侧链的残基(诸如Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、 Asn或Gln)或带电荷的氨基酸(诸如Asp、Glu、Arg或Lys)，或者带电荷的或极 性的残基取代非极性的残基；和/或ii)在其对肽骨架取向的影响上显著不 同，诸如用Pro或Gly取代另一种残基或者Pro或Gly被另一种残基取代；和/ 或iii)在电荷上显著不同，例如带负电荷的残基(诸如Glu或Asp)取代带正 电荷的残基(诸如Lys、His或Arg)，反之亦然；和/或iv)在空间体积上显著 不同，例如大型残基(诸如His、Trp、Phe或Tyr)取代具有较小侧链的残基 (例如Ala、Gly或Ser)，反之亦然。
在一个实施方案中，可以基于氨基酸侧链取代基的疏水性和亲水性值以 及相对相似性包括电荷、大小等等来实施氨基酸取代。考虑前述各种特征的 示例性氨基酸取代是本领域技术人员熟知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨 酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨 酸和异亮氨酸。
根据本发明，可以将上述分离的肽序列配制为复合物(compound)。
复合物可以包含单一拷贝的选自上述任一种的个体(individual)氨基酸序 列，或者可以包含两个或多个拷贝的此种氨基酸序列。这意味着本发明的复 合物可以配制为肽序列单体，诸如包含单个个体肽序列，或者可以配制为肽 序列多聚体，即包含两个或多个个体肽序列，其中所述个体肽序列可以呈现 为两个或多个拷贝相同的序列或者呈现为两个或多个不同的个体肽序列。多 聚体也可以包含全长序列与所述序列的一种或多种片段的组合。在一个实施 方案中，复合物可以包含两条氨基酸序列，这样的复合物此处定义为二聚体， 在另一个实施方案中，复合物可以包含两条以上的氨基酸序列，例如三条、 四条或更多条序列。本发明优选涉及包含两条或四条本发明的肽序列的复合 物。然而，包含3、5、6、7、8或更多条序列的复合物也在本发明的范围内。
配制为二聚体或多聚体的肽片段可以具有相同的氨基酸序列，或者可以 具有不同的氨基酸序列。这种复合物的一个例子可以是包含SEQ ID NO：1和 SEQ ID NO：2的复合物。另一个例子可以是包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO： 4的复合物。也可以获得本发明序列的任意其它组合。复合物中的序列可以 借助于肽键相互连接，或者通过接头分子或基团(grouping)相互连接。
本发明的复合物可以包含相同序列的两个或多个相同拷贝，例如两个拷 贝的选自SEQ ID NO：1-26的序列，其中这些序列借助于接头分子或基团相连 接。优选其中所述序列借助于接头基团相连的复合物。这种连接基团的一个 例子可以是非手性的二、三或四羧酸。合适的非手性二、三或四羧酸和制备 这种复合物的方法(配体呈递装配法(a ligand presentation assembly method， LPA))描述于WO0018791和WO2005014623。另一种可能的接头的例子可以是 赖氨酸。个体肽序列可以附着于核心分子例如赖氨酸，从而形成个体肽序列 的树枝状多聚体(树状聚体)。树状聚体的生产也是本领域公知的 (PCT/US90/02039；Lu等(1991)Mol Immunol.28：623-630；Defoort等(1992) Int J Pept Prot Res.40：214-221；Drijfhout等(1991)Int J Pept Prot Res.37： 27-32)，目前树状聚体广泛用于研究和医学应用。本发明的优选实施方案是 提供包含四条附着于赖氨酸核心分子的个体氨基酸序列的树状聚体复合物。 也优选所述四个个体氨基酸序列中的至少一个包含上述通式的氨基酸序列。 甚至更加优选树状聚体复合物的所有四个个体氨基酸序列分别包含上述通 式的氨基酸序列。
本发明的多聚体复合物优选配制为LPA-二聚体或溶素-树状聚体。然而， 取决于实施方案，包含两个或多个本发明个体序列的其它类型的多聚体复合 物可能是优选的。
II.生物学活性
本发明的肽序列和包含本发明序列的复合物拥有生物学活性。本发明优 选涉及选自下述能力的生物学活性：
-刺激与神经细胞分化例如神经细胞前体的神经突长出或分化有关的神经 可塑性，
-刺激与记忆和学习有关的神经可塑性，例如形态学可塑性和/或突触功效，
-刺激细胞存活，例如抑制凋亡，和
-调控神经营养因子受体例如TRK受体或p75(NTR)的活性。
如此，在一个实施方案中，上述分离的肽序列能够结合神经营养因子受 体，所述神经营养因子受体是选自TRKA、TRKB和TRKC的TRK受体。在一 个优选实施方案中，所述受体可以是TRKA；在另一个优选实施方案中，所 述受体可以是TRKB；在又一个优选实施方案中，所述受体可以是TRKC。
本发明的作者已经鉴定了存在于所有神经营养因子(NGF、NT-3、NT-4/5、 BDNF)中的氨基酸基序，并且将本发明的肽片段的生物学活性与这些基序在 其序列中的存在关联起来。根据本发明的基序是本发明的肽序列结合TRK受 体即TRKA、B或C所必不可少的。TRK受体是神经系统中驱动神经细胞分化 的主要受体。TRK受体即TRK A、B或C对促进神经元存活来说也是很重要的， 其涉及与学习和记忆有关的神经可塑性。
如上文所讨论的，神经营养因子受体在神经系统的正常机能中扮演重要 角色，然而，这些受体也与病理学相关。如此，已经证明了TRKB的有力致 癌效应并揭示了特异性促存活(prosurvival)功能，TRKB抑制失巢凋亡(anoikis) (由细胞-基质相互作用丧失引起的凋亡)的能力可能对肿瘤细胞的转移能 力作出贡献，为过表达TRKB的人类肿瘤的攻击性本质提供了可能的解释 (Douma，S.；van Laar，T.；Zevenhoven，J.；Meuwissen，R.；van Garderen，E.； Peeper，D.S.：Suppression of anoikis and induction of metastasis by the neurotrophic receptor TrkB.Nature 430：1034-1040，2004)；已经将某些神经营 养因子(例如BDNF)水平的升高与医学疾患诸如癫痫关联起来(Binder等， Trends Neurosci.2001，24：47-53)。
如此，本发明的肽序列结合神经营养因子受体和调控这些受体的活性的 能力在正常状态和病理学中均用于调控依赖于这些受体活性的任何生物学 应答。相应地，本发明提供了调控神经营养因子受体诸如TRK家族的活性的 方法，包括使用本发明的分离的肽序列或包含所述序列的复合物。短语“调 节神经营养因子受体的活性”既涉及活化神经营养因子受体的活性也涉及抑 制其活性。在一个实施方案中，本发明涉及活化神经营养因子受体的方法， 在另一个实施方案中，本发明涉及抑制神经营养因子受体的方法。在一个实 施方案中所述神经营养因子受体可以是TRKA，在另一个实施方案中可以为 TRKB，在又一个实施方案中可以为TRKC，在一些实施方案中所述受体可 以是p75(NTR)。
本发明的分离的肽序列能够刺激神经元细胞分化。术语“神经元分化”既 理解为神经前体细胞或神经干细胞的分化，也理解为神经元的分化，诸如已 分化神经元的成熟。这种分化的例子可以是来自不成熟神经元的神经突长 出、神经突分支、神经元再生。在一个优选实施方案中，本发明可以涉及刺 激神经前体/干细胞或不成熟神经元的分化，在另一个优选实施方案中，本发 明可以涉及刺激来自成熟神经元的神经突长出，例如经历损伤但存活下来的 神经元。如此，本发明还涉及刺激神经元细胞分化的方法，包括使用本发明 的肽序列或包含所述序列的复合物。
在一些优选实施方案中，本发明涉及所述肽序列与学习和记忆有关的活 性。特别地，在一个优选实施方案中，本发明涉及所述肽序列刺激神经元的 形态学可塑性例如脊柱形成的能力，在另一个优选实施方案中，本发明涉及 所述序列促进突触功效的能力。如此，本发明进一步涉及刺激记忆和/或学习 的方法，包括使用本发明的肽序列和/或包含所述序列的复合物。本发明既涉 及短期记忆又涉及长期记忆。
本发明的肽序列还能够刺激神经元细胞存活。本发明涉及起因于外伤和 起因于变性疾病而刺激神经元细胞存活的能力。相应地，本发明进一步涉及 利用本发明的肽序列和/或包含所述序列的复合物刺激细胞存活，优选刺激神 经元细胞存活的方法。
本发明的肽序列和包含所述序列的复合物作为细胞生长培养基的可溶 性/流动性物质以及作为细胞生长底物的固定性物质来说都具有生物学活性。 在一些实施方案中，使用肽或包含该肽的复合物作为细胞底物可能是优选 的。然而，最优选可溶性肽序列或包含所述肽序列的复合物。
本申请中描述了本发明的肽序列和包含所述肽序列的复合物的生物学 活性的非限制性例子(参见下文的本发明的说明书和实施例)。
神经突长出的刺激
具有促进神经突长出以及刺激神经元细胞再生和/或分化潜力的物质诸 如某些内源营养因子是寻找促进例如神经元再生和其它形式神经可塑性的 复合物时的首要靶物。为了评估本发明复合物的潜力，可以调查其刺激神经 突长出相关信号传导、干扰细胞粘附、刺激神经突长出、神经再生的能力。 已表明本发明的复合物促进神经突长出，因此认为其为神经元连接再生以及 由此发生的损伤后机能恢复的优等促进剂，也是需要这种疗效的其它疾患中 神经元机能的促进剂。
上下文中“分化”与神经元的成熟和神经突的伸长过程有关，其发生于所 述神经元最后的细胞分裂之后。本发明的复合物可能能够终止神经细胞分裂 并启动所述细胞的成熟，诸如启动神经突的伸长。另外，“分化”与神经元祖 细胞、未成熟神经细胞或胚胎干细胞的遗传学、生物化学、形态学和生理学 转化进程的起始有关，所述进程导致具有正常神经元细胞的功能特征的细胞 的形成，所述特征在本领域中是明确的。本发明中将“未成熟神经细胞”定义 为具有神经细胞的至少一种如下特征的细胞，所述特征在本领域被公认为神 经细胞特征性的特征。
根据本发明，包含至少一种上述肽序列的复合物能够刺激神经突长出。 本发明涉及神经突长出的增强/刺激，诸如高于对照/未刺激细胞神经突长出 值的约50％或75％的增强/刺激或更强的刺激，诸如100％-150％之间，例如约 125％，诸如150％-200％之间，例如约175％，诸如250％-300％之间，例如约 275％，诸如300％-350％之间，例如约325％，诸如350％-400％之间，例如约 375％，诸如400％-450％之间，例如约425％，诸如450％-500％之间，500％-600％ 或超过600％。
可以通过采用评估神经突长出的任何已知的方法或测试来进行候选复 合物刺激神经突长出能力的评估，诸如例如本申请实施例1中所描述的方法 或测试。
根据本发明，复合物作为细胞生长底物的不溶性固定性组分和细胞生长 培养基的可溶性组分都具有神经突发生活性。本文中“固定性”指所述复合物 结合/附着于不溶于水或水溶液的物质，并因此变得在这种溶液中同样不能溶 解。对于医学应用来说，不溶性和可溶性复合物都可以考虑，但可溶性复合 物是优选的。“可溶性复合物”理解为可溶于水或水溶液的复合物。
神经元存活的刺激
具有因损伤增强神经元细胞存活以及抑制创伤和疾病中神经元细胞变 性和/或凋亡潜力的物质是寻找候选复合物的首要靶物，所述候选复合物用于 治疗神经变性疾病诸如例如阿尔茨海默氏病或帕金森氏病的新药。为了评估 本发明肽的潜力，可以调查其刺激存活相关信号传导、干扰细胞反应相关凋 亡、刺激神经再生的能力。已表明本发明的复合物促进神经细胞存活并减少 细胞损失，因此认为其为促进脑和/或周围神经系统中神经连接再生，以及由 此发生的因创伤或疾病而促进损伤后机能恢复的优等候选物，也是任何需要 此种效应的其它疾患中神经元功能的促进剂。
上下文中“存活”与涉及细胞损伤后细胞功能的维持和/或恢复的进程有 关。本发明的复合物可能能够终止或减弱致使细胞死亡的进程，诸如抑制由 起因于创伤或疾病的细胞损伤所启动的神经细胞凋亡。其它方面，“存活”与 抑制涉及导致细胞死亡的细胞损伤的进程有关，并且与启动细胞的遗传学、 生物化学、形态学和生理学转化或重建进程有关，特别是神经元细胞，诸如 祖细胞、不成熟神经细胞或胚胎干细胞或者具有本领域定义的正常功能特征 的成熟神经细胞。本发明中将“不成熟神经细胞”定义为具有神经细胞的至少 一种如下特征的细胞，所述特征在本领域被公认为神经细胞特征性的特征。
根据本发明，包含至少一种上述肽序列的复合物能够刺激神经细胞存 活。本发明涉及神经细胞存活刺激，诸如高于对照/未刺激细胞存活值的大约 75％的刺激，例如50％，诸如大约150％，例如100％，诸如大约250％，例如 200％，诸如大约350％，例如300％，诸如大约450％，例如400％，诸如大约 500％。
可以通过采用评估细胞存活的任何已知的方法或测试来进行候选复合 物刺激神经细胞存活能力的评估，诸如例如本申请实施例2中所描述的方法 或测试。
根据本发明，复合物作为不溶性和可溶性复合物均具有存活促进活性。 本文中“不溶性”指所述复合物结合/附着于不溶于水或水溶液的物质，并因此 所述复合物变得在这种溶液中同样不能溶解。对于医学应用来说，不溶性和 可溶性复合物都可以考虑，但可溶性复合物是优选的。“可溶性复合物”理解 为可溶于水或水溶液的复合物。
III.个体肽序列的生产
本发明的肽序列可以通过任何常规的合成方法、重组DNA技术、衍生所 述肽序列的全长蛋白质的酶学裂解、或上述方法的组合来制备。
重组制备
如此，在一个实施方案中，本发明的肽利用重组DNA技术来生产。
编码肽或衍生所述肽的相应全长蛋白质的DNA序列可以通过合成途径 来制备，其中使用已制定的标准方法，例如Beaucage和Caruthers，1981， Tetrahedron Lett.22：1859-1869描述的磷酰脒(phosphoamidine)法、或者Matthes 等，1984，EMBO J.3：801-805描述的方法。根据磷酰脒法，寡核苷酸例如在自 动DNA合成仪中合成、纯化、退火，在合适的载体中连接和克隆。
也可以根据标准方案，利用DNA酶I将编码衍生肽的相应全长蛋白质的 DNA序列片段化来制备编码肽的DNA序列(Sambrook等，Molecular cloning：A Laboratory manual.第二版，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。本发 明涉及选自以上鉴定的蛋白质的全长蛋白质。或者可以利用特异性限制性内 切核酸酶将编码本发明全长蛋白质的DNA片段化。利用Sambrook等， Molecular cloning：A Laboratory manual.第二版，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述的标准规程进一步纯化所述DNA片段。
编码全长蛋白质的DNA序列也可以是基因组或cDNA来源的，例如通过 制备基因组或cDNA文库并筛选编码全长蛋白质的全部或一部分的DNA序列 而获得，所述筛选依照标准技术利用合成寡核苷酸探针杂交进行(参考 Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，1989)。也可以利用特异性引物通过聚合酶链式反应来制备所述DNA 序列，例如US 4,683,202或Saiki等，1988，Science 239：487-491中所述。
然后将所述DNA序列插入到重组表达载体中，所述重组表达载体可以是 能够方便地实施重组DNA规程的任何载体。载体的选择通常取决于其所要导 入的宿主细胞。如此，所述载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体 存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒。或者，所述载体可以是 当导入到宿主细胞中时，整合到宿主细胞基因组中并与其已经整合到其中的 染色体一起复制的载体。
编码肽或全长蛋白质的DNA序列在载体中应当可操作地连接到合适的 启动子序列。所述启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何 DNA序列，可以衍生自编码与所述宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。指 导哺乳动物细胞中编码DNA序列转录的合适启动子的例子是SV 40启动子 (Subramani等，1981，Mol.Cell Biol.1：854-864)、MT-1(金属硫蛋白基因)启动 子(Palmiter等，1983，Science 222：809-814)或腺病毒2主要晚期启动子。用于昆 虫细胞的合适启动子是多角体蛋白启动子(Vasuvedan等，1992，FEBS Lett. 311：7-11)。用于酵母宿主细胞的合适启动子包括来自酵母糖酵解基因 (Hitzeman等，1980，J.Biol.Chem.255：12073-12080；Alber和Kawasaki，1982，J. Mol.Appl.Gen.1：419-434)或醇脱氢酶基因(Young等，1982，于Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals，Hollaender等编，Plenum Press， New York)的启动子，或者TPI1(US 4,599,311)或ADH2-4c(Russell等，1983， Nature 304：652-654)启动子。用于丝状真菌宿主细胞的合适启动子为例如 ADH3启动子(McKnight等，1985，EMBO J.4：2093-2099)或tpiA启动子。
所述编码DNA序列也可以可操作地连接到合适的终止子，诸如人生长激 素终止子(Palmiter等，前面引用的)或(用于真菌宿主)TPI1(Alber和Kawasaki， 前面引用的)或ADH3(McKnight等，前面引用的)启动子。所述载体可以进一 步包含其他成分，诸如多聚腺苷酸化信号(例如来自SV 40或腺病毒5Elb区)、 转录增强子序列(例如SV 40增强子)和翻译增强子序列(例如编码腺病毒VA RNA的那些)。
所述重组表达载体可以进一步包含能够使所述载体在所述宿主细胞中 复制的DNA序列。这种序列的例子(宿主细胞为哺乳动物细胞时)是SV 40复 制起点。所述载体还可以包含可选择标记，例如其产物弥补宿主细胞的缺陷 的基因，诸如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或赋予药物抗性例如新霉 素、潮霉素或甲氨蝶呤抗性的基因。
用于分别连接编码肽或全长蛋白质的DNA序列、启动子和终止子并将它 们插入到包含复制所必需的信息的适当载体中的方法是本领域技术人员熟 知的(参见例如Sambrook等，前面引用的)。
为了获得本发明的重组肽，有益地可以将编码DNA序列与第二个肽编码 序列和蛋白酶裂解位点编码序列融合在一起，提供编码融合蛋白的DNA构建 体，其中蛋白酶裂解位点编码序列位于HBP片段和第二个肽编码DNA之间， DNA构建体被插入到重组表达载体中，并在重组宿主细胞中表达。在一个实 施方案中，所述第二个肽选自但不限于包含谷胱甘肽-S-还原酶、小牛胸腺素、 细菌硫氧还蛋白或人泛素天然或合成变体、或其肽在内的组。在另一个实施 方案中，肽序列所包含的蛋白酶裂解位点可以是具有氨基酸序列IEGR的因子 Xa裂解位点、具有氨基酸序列DDDDK的肠激酶裂解位点、具有氨基酸序列 LVPR/GS的凝血酶裂解位点、或具有氨基酸序列XKX的水解无色杆菌 (Acharombacter lyticus)裂解位点。
表达载体导入到其中的宿主细胞可以是能够表达所述肽或全长蛋白质 的任何细胞，优选真核细胞，诸如无脊椎动物(昆虫)细胞或脊椎动物细胞， 例如爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞或哺乳动物细胞，特别是昆虫和哺乳动物 细胞。合适的哺乳动物细胞系的例子是HEK293(ATCC CRL-1573)、COS (ATCC CRL-1650)、BHK(ATCC CRL-1632、ATCC CCL-10)或CHO(ATCC CCL-61)细胞系。转染哺乳动物细胞并表达导入在所述细胞中的DNA序列的 方法描述于例如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.159，1982，pp.601-621； Southern和Berg，1982，J.Mol.Appl.Genet.1：327-341；Loyter等，1982，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 79：422-426；Wigler等，1978，Cell 14：725；Corsaro和 Pearson，1981，于Somatic Cell Genetics 7，p.603；Graham和van der Eb，1973， Virol.52：456；以及Neumann等，1982，EMBO J.1：841-845。
或者，真菌细胞(包括酵母细胞)可以用作宿主细胞。合适的酵母细胞的 例子包括糖酵母(Saccharomyces spp.)或裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces spp.) 细胞，特别是酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。其它真菌细胞的例 子是丝状真菌，例如曲霉(Aspergillus spp.)或脉孢霉(Neurospora spp.)，特别 是米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉(Aspergillus niger)的菌株。曲霉用于表 达蛋白质的用途描述于例如EP 238 023。
用于培养细胞的培养基可以是适合于培养哺乳动物细胞的任何常规培 养基，诸如含血清的或无血清的、含有合适添加物的培养基，或者用于培养 昆虫、酵母或真菌细胞的合适培养基。可从供应商那里获得合适的培养基， 或者也可以按照公开的配方(例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中的)制备合适的培养基。
然后，可以通过常规规程从培养液回收由细胞重组生产的肽或全长蛋白 质，所述常规规程包括通过离心或过滤从培养液分离宿主细胞，以盐例如硫 酸铵的手段沉淀上清液或滤出液的蛋白质组分，通过各种层析规程例如 HPLC、离子交换层析、亲和层析等等的纯化。
合成制备
合成生产肽的方法是本领域公知的。生产合成肽的详细说明和实践建议 可以在Synthetic Peptides：A User′s Guide(Advances in Molecular Biology)， Grant G.A.编，Oxford University Press，2002或者Pharmaceutical Formulation： Development of Peptides and Proteins，Frokjaer和Hovgaard编，Taylor和Francis， 1999中找到。
例如，可以利用Fmoc化学和Acm保护的半胱氨酸来合成肽。用反相HPLC 纯化后，可以进一步处理肽以获得例如环状或C-或N-末端修饰的同等型 (isoform)。环化和末端修饰的方法是本领域公知的，详细描述于上文引用的 手册中。
在一个优选实施方案中，本发明的肽序列以合成途径生产，特别是使用 序列辅助的肽合成(Sequence Assisted Peptide Synthesis，SAPS)法。
通过SAPS，肽可以在配备有过滤用的聚丙烯滤器的聚乙烯容器中分批 合成，或者使用用作N-α-氨基保护基团的9-芴甲氧羰基(Fmoc)或叔丁氧羰基 (Boc)和侧链官能基的合适公用保护基团在完全自动化的肽合成仪上以持续 流动型聚酰胺固相法(Dryland，A.和Sheppard，R.C.(1986)J.Chem.Soc.Perkin Trans.I，125-137)合成。
然后可以在合成后利用本领域公知的技术将个体肽序列配制为多聚体， 例如所述序列的二聚体可以通过WO 00/18791中描述的LPA法来获得，树枝 状聚合物可以通过PCT/US90/02039描述的MAP合成法来获得。
IV.抗体
本发明的一个目的是提供能够识别并选择性结合NGF、NT-3、NT-4/5、 BDNF上的表位的抗体、其抗原结合片段或重组蛋白，所述表位包含本发明 的基序或选自SEQ ID NO：1-26的序列或所述序列的片段。
术语“表位”指受到(抗原的)抗体识别(由此引起免疫应答)的(抗原分子上 的)特定原子群。术语“表位”与术语“抗原决定簇”等同。表位可以包含非常接 近的(诸如位于连续氨基酸序列中的，或者位于抗原氨基酸序列的远离部分 但由于蛋白质折叠已经相互靠近的)3个或更多个氨基酸残基，诸如例如4个、 5个、6个、7个、8个氨基酸残基。
抗体分子属于称为免疫球蛋白的血浆蛋白质家族，免疫球蛋白的基本构 件即免疫球蛋白折叠或结构域以多种形式用于免疫系统及其它生物识别系 统的许多分子中。典型的免疫球蛋白具有四条多肽链，包含称为可变区的抗 原结合区和称为恒定区的不变区。
天然抗体和免疫球蛋白通常为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两 条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。每条轻链由一个共价二硫键连 接于重链，然而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型重链之间有变化。每 条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链一端具有一个可变域 (VH)，接下来是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL)，在其另 一端具有一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一个恒定域排列在一起，轻 链可变域与重链可变域排列在一起。据信特定氨基酸残基形成轻链和重链可 变区之间的界面(Novotny J&Haber E.Proc Natl Acad Sci USA 82(14)：4592-6， 1985)。
依据其重链恒定域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类。 至少有五(5)大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可以进 一步分为亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。 对应于不同免疫球蛋白类的重链恒定域分别称为alpha(α)、delta(δ)、 epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列 指定为称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种截然不同的型之一。不同类免疫球蛋 白的亚基结构和三维构造是公知的。
在抗体可变域的上下文中术语“可变”指抗体当中可变域的某些部分在 序列上差异非常大的事实。可变域用于结合并决定每种特定抗体对其特定抗 原的特异性。然而，可变性在整个抗体可变域中不是均匀分布的。在轻链和 重链可变域中，可变性都集中于称为互补决定区(CDR)也称为高变区的三个 区段。
可变域更加高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域 各自包含四个大量采用β-片层构象的FR区，其通过三个CDR相连，这三个 CDR形成连接β-片层结构的环，在一些情况下构成β-片层结构的一部分。每 条链中的CDR通过FR非常紧密地保持在一起，与另一条链中的CDR一起对 抗体的抗原结合部位的形成作出贡献。恒定域不直接涉及抗体与抗原的结 合，但展现多种效应器功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
如此，设想用于本发明的抗体可以具有多种形式中的任何一种，包括完 整免疫球蛋白，抗体片段诸如Fv、Fab、以及类似片段，包括可变域互补决 定区(CDR)的单链抗体等等形式，所有这些都落在本文所用广义术语“抗体” 的范围内。本发明设想了具有任何特异性的抗体的应用，多克隆的或单克隆 的，不限于识别并与特定抗原发生反应的抗体。在优选实施方案中，在下述 治疗方法和筛选方法的上下文中均使用在免疫上特异于本发明抗原或表位 的抗体或其片段。
术语“抗体片段”指全长抗体的一部分，通常指抗原结合区或可变区。抗 体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段。抗体的木瓜蛋白酶消化产生 两个相同的抗原结合片段，称为Fab片段，每个都具有单一的抗原结合位点， 和剩余的“Fc”片段，由于其易于结晶的能力而称为“Fc”片段。胃蛋白酶处理 产生具有能够交联抗原的两个抗原结合位点的F(ab′)2片段，和剩余的其它片 段(称为pFc′)。其他片段可包括双抗体、线性抗体、单链抗体分子、以及由 抗体片段形成的多特异性抗体。本文所用抗体的“功能性片段”指Fv、F(ab) 和F(ab′)2片段。
本文术语“抗体片段”可与术语“抗原结合片段”互换使用。
抗体片段可以短至约4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、 9个氨基酸、约12个氨基酸、约15个氨基酸、约17个氨基酸、约18个氨基酸、 约20个氨基酸、约25个氨基酸、约30个氨基酸或更多个氨基酸。通常本发明 的抗体片段可以具有任何尺寸上限，只要其相对于特异性结合如下表位的抗 体来说具有类似的或免疫学的特性，所述表位包含选自本文编号为SEQ ID NO：1-22的任一序列或所述序列的片段的肽序列。如此，本发明的上下文中 术语“抗体片段”等同于术语“抗原结合片段”。
抗体片段保留了一些与其抗原或受体选择性结合的能力。一些抗体片段 类型如下定义：
(1)Fab指包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段。Fab片段可以用木 瓜蛋白酶消化完整抗体产生完整轻链和一条重链的一部分而制备。
(2)Fab’指可以用胃蛋白酶处理完整抗体，之后还原以产生完整轻链和重 链的一部分而获得的抗体分子的片段。每个抗体分子获得两个Fab’片段。
(3)Fab′片段与Fab片段的不同在于重链CH1结构域的羧基末端添加了几 个残基，包括一个或多个来自抗体绞链区的半胱氨酸。
(4)(Fab’)2指可以用胃蛋白酶处理完整抗体随后不经还原而获得的抗体 片段。F(ab’)2指通过两个二硫键保持在一起的两个Fab’片段的二聚体。
(5)Fv是包含完整抗原识别与结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、 非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体(VH-VL二聚体)构 成。正是在这种构象中，每个可变域的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体 表面上确定了抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然 而，即便是单一的可变域(或者是只包含三个抗原特异性CDR的半个Fv)也具 有识别并结合抗原的能力，虽然其亲和力低于完整的结合位点。
(6)单链抗体(“SCA”)定义为包含通过适当的多肽接头连接的轻链可变 区、重链可变区的遗传工程化分子，其为遗传工程手段融合的单链分子。这 样的单链抗体也称为“单链Fv”或“sFv”抗体片段。通常，Fv多肽在VH和VL 结构域之间进一步包含多肽接头，其使sFv能够形成所需的用于抗原结合的 结构。有关sFv的综述参见Pluckthun，于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113：269-315，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，NY，1994。
(7)术语“双抗体(diabodies)”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所 述片段包含同一多肽链中相连的重链可变域(VH)的轻链可变域(VL) (VH-VL)。通过使用太短而不允许同一条链上的两个结构域配对的接头，迫 使所述结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。例如 EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90： 6444-6448(1993)中更为详细地描述了双抗体。
本发明既设想了能够结合本发明表位的多克隆抗体和单克隆抗体，也设 想了其能够结合本发明表位的抗原结合片段和重组蛋白。
多克隆抗体的制备是本领域技术人员熟知的。参见例如Green等，1992， Production of Polyclonal Antisera，于Immunochemical Protocols(Manson编)， 1-5页(Humana Press)；Coligan等，Production of Polyclonal Antisera in Rabbits， Rats，Mice and Hamsters，于Current Protocols in Immunology，第2.4.1节，这些 文献加入本文作为参考文献。
单克隆抗体的制备同样是常规的。参见例如Kohler和Milstein，Nature， 256：495-7(1975)；Coligan等，第2.5.1-2.6.7节；以及Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，726页，Cold Spring Harbor Pub.(1988)。单克隆抗体可以通 过多种成熟的技术从杂交瘤培养物分离和纯化。这些分离技术包括使用蛋白 A-Sepharose的亲和层析、大小排阻层析、和离子交换层析。参见例如Coligan 等，第2.7.1-2.7.12节和第2.9.1-2.9.3节；Barnes等，Purification of Immunoglobulin G(IgG).于Methods in Molecular Biology，1992，10：79-104， Humana Press，NY。
体外和体内操作单克隆抗体的方法是本领域技术人员熟知的。例如，根 据本发明使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤法制备，所述杂交瘤法由Kohler 和Milstein，1975，Nature 256，495-7首次描述，或者可以通过重组法制备，其 描述于例如US 4,816,567。供本发明使用的单克隆抗体也可以利用Clackson 等，1991，Nature 352：624-628以及Marks等，1991，J Mol Biol 222：581-597中描 述的技术从噬菌体抗体文库分离。另一种方法涉及将单克隆抗体人源化，所 述人源化通过重组手段制备包含人特定的和可识别的序列的抗体而实施。综 述参见Holmes等，1997，J Immunol 158：2192-2201和Vaswani等，1998，Annals Allergy，Asthma & Immunol 81：105-115。
本文所用术语″单克隆抗体″指由基本上同质的抗体群体获得的抗体，即 除了可能少量存在的天然发生的突变之外，构成所述群体的个体抗体是相同 的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。另外，与典型地包括 针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规多克隆抗体制品相反，每种单克隆 抗体针对抗原上的单个决定簇。在其特异性之外，单克隆抗体由于是通过杂 交瘤培养物合成的，不受其它免疫球蛋白的污染而具有优势。所述修饰语“单 克隆”指从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，不能理解为需要以任 何特定方法生产所述抗体。
本文中单克隆抗体特别包括″嵌合″抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻 链的一部分与源于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列 相同或同源，而链的其余部分与源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗 体中的相应序列相同或同源，以及这些抗体的片段，只要它们显示所需的生 物学活性(US 4,816,567；和Morrison等，1984，Proc Natl Acad Sci，81： 6851-6855)。
制备抗体片段的方法也是本领域已知的(参见例如，Harlow和Lane， Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1988，加 入本文作为参考文献)。本发明的抗体片段可以通过抗体的蛋白水解或者通 过在大肠杆菌中表达编码所述片段的DNA而制备。抗体片段可以通过完整抗 体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化的常规方法获得。例如，可以用胃蛋白酶酶 学裂解抗体，提供称为F(ab’)2的5S片段而制备抗体片段。可以利用硫醇还原 剂进一步裂解该片段，以及任选用到由二硫键裂解而来的巯基的封闭基团， 以制备3.5S Fab’单价片段。或者用胃蛋白酶酶学裂解直接制备两个单价Fab’ 片段和一个Fc片段。这些方法描述于例如US 4,036,945和US 4,331,647以及包 含于其中的参考文献。此处将这些专利文献整体加入作为参考文献。
也可以使用其它裂解抗体的方法，诸如分离重链形成单价轻链-重链片 段，进一步裂解片段，或者其它酶学、化学、或遗传技术，只要所述片段结 合由所述完整抗体识别的抗原。例如，Fv片段包含VH与VL链的结合。这种 结合可以是非共价的，或者可变链可以由分子间二硫键连接或者由化学药品 诸如戊二醛交联。优选Fv片段包含由肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗 原结合蛋白(sFv)通过构建如下结构基因而制备，所述结构基因包含由寡核苷 酸连接的编码VH和VL结构域的DNA序列。将所述结构基因插入到表达载体 中，随后将表达载体导入到宿主细胞诸如大肠杆菌中。重组宿主细胞合成由 接头肽桥接两个V结构域的单个多肽链。例如，Whitlow等，1991，于Methods： A Companion to Methods in Enzymology，2：97；Bird等，1988，Science 242： 423-426；US 4,946,778；和Pack等，1993，BioTechnology 11：1271-77描述了制 备sFv的方法。
另一种形式的抗体片段是编码单一互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最 小识别单元”)通常涉及抗原识别和结合。CDR肽可以通过克隆或构建编码感 兴趣抗体的CDR的基因而获得。例如，利用聚合酶链式反应制备这些基因， 由生产抗体的细胞自RNA合成可变区。参见例如Larrick等，Methods：a Companion to Methods in Enzymology，Vol.2，p.106(1991)。
本发明设想了人和人源化形式的非人(例如鼠)抗体。这些人源化抗体是 包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列诸如表位识别序列的嵌合免疫球蛋 白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结 合子序列)。很大程度上，人源化抗体指其中来自受体互补决定区(CDR)的残 基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)CDR的残基所置 换的人免疫球蛋白(受体抗体)，所述非人物种为诸如小鼠、大鼠或兔。包含 本发明抗体最小序列诸如识别本文所述表位的序列的人源化抗体是本发明 的优选实施方案之一。
一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基由相应的非人残基所置换。此 外，人源化抗体可以包含在受体抗体和引入的CDR或框架序列中都未发现的 残基。构建了这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。总的来说，人源化抗 体基本上会包含至少一个、和典型地两个整个这样的可变区，其中所有的或 者基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且所有的或 者基本上所有的FR区均为人免疫球蛋白共有序列的FR区。最佳地，人源化 抗体还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)典型地人免疫球蛋白恒定区的至少一部 分。更多详情参见Jones等，1986，Nature 321，522-525；Reichmann等，1988， Nature 332，323-329；Presta，1992，Curr Op Struct Biol 2：593-596；Holmes等， 1997，J Immunol 158：2192-2201和Vaswani等，1998，Annals Allergy，Asthma & Immunol 81：105-115。
可以通过本领域用于制备多克隆和单克隆抗体的任何标准方法生产抗 体，利用人NGF、NT-3、NT-4/5、BDNF的天然或重组片段作为抗原，所述 片段包含选自SEQ ID NO：1-26的序列。也可以利用肽序列SEQ ID NO：1-26 的变体、同源物或片段制备这些抗体，所述变体、同源物和片段是满足下述 标准的免疫原性肽序列：
(i)为至少5个氨基酸的连续氨基酸序列；
(ii)包含本发明的基序。
也可以例如将根据本发明的免疫原性片段施用于个体，由待治疗的个体 在体内产生抗体。相应地，本发明进一步涉及包含上述免疫原性片段的疫苗。
本申请还涉及生产本发明的抗体的方法，所述方法包括提供上述免疫原 性片段的步骤。
本发明既涉及能够调控诸如增强或减弱NGF、NT-3、NT-4/5、BDNF的 生物学功能，特别是涉及神经细胞分化、存活和/或可塑性的功能的抗体，又 涉及能够识别和特异性结合后者所述蛋白质但不调控其生物学活性的抗体。
本发明涉及上述抗体用于1)调控人NGF、NT-3、NT-4/5、BDNF的活 性对治疗有益时的治疗性应用，2)诊断目的的体外和/或体内检测和/或监测 后者所述蛋白，3)研究目的的用途。
V.药物组合物
本发明还涉及包含如上定义的一种或多种复合物的药物组合物，其中所 述复合物能够刺激神经突长出和/或神经细胞分化、神经细胞存活和/或学习 和/或记忆。如此，本发明涉及能够刺激神经元细胞分化和/或刺激神经元细 胞再生、和/或刺激与学习和记忆有关的神经元可塑性、和/或刺激神经细胞 存活的药物组合物。
上下文中所用术语“药物组合物”与术语“药剂(medicament)”同义。
在组合物中，肽序列可以配制为包含上述分离的个体肽片段或其多聚体 或二聚体。
所述药物组合物在体外或体内可以具有针对细胞的上述效应，其中将所 述组合物施用于受试者。
本发明的药剂包含有效量的一种或多种上述定义的复合物，或者包含如 上定义的组合物与药学上可接受的添加剂的组合。可以适当地配制这种药剂 以用于口服、经皮、肌肉内、静脉内、颅内、鞘内、脑室内、鼻内或肺部给 药。
基于本发明复合物的药剂和组合物的剂型开发策略通常与基于任何其 它蛋白质的药物产品的剂型策略一致。几本教科书中讨论了潜在的问题以及 克服这些问题所需的教导，例如“Therapeutic Peptides and Protein Formulation. Processing and Delivery Systems”，A.K.Banga编，Technomic Publishing AG， Basel，1995。
可注射的制剂通常制备为液态溶液或悬浮液、适于在注射之前溶解于或 悬浮于液体中的固体形式。也可以乳化所述制品。通常将活性成分与药学上 可接受的且与所述活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为例如水、盐 水、右旋糖、甘油、乙醇等等及其组合。此外，需要的话，所述制品可以含 有少量辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、或提高制剂的效果或方 便其运输的辅助物质。
本发明复合物的制剂可以通过本领域技术人员已知的技术来制备。所述 制剂可以含有药学上可接受的载体和赋形剂，包括微球体、脂质体、微胶囊、 纳米颗粒等等。
可以适当地通过注射施用所述制品，任选在活性成分要发挥其效应的部 位注射。适合于其它给药方式的其他制剂包括栓剂、鼻腔的、肺部的以及一 些情况中口服的剂型。对于栓剂，传统的粘合剂和载体包括聚亚烷基二醇或 甘油三酯。这些栓剂可以由含有0.5％到10％，优选1-2％的活性成分的混合物 构成。口服制剂包括正常情况下使用的赋形剂，诸如例如药用级的甘露醇、 乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。这些组合物为溶液、 悬浮液、药片、药丸、胶囊、持续释放制剂或粉末的形式，通常含有10-95％ 的活性成分，优选25-70％。
其它制剂为适于鼻腔和肺部给药的制剂，诸如例如吸入剂和气雾剂。
活性复合物可以配制为中性或盐的形式。药学上可接受的盐包括酸加成 盐(与肽复合物的游离氨基一起形成)，其由无机酸诸如例如盐酸或磷酸或有 机酸诸如醋酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等等形成。由游离羧基形成的盐也 可以衍生自无机碱诸如例如氢氧化钠、钾、铵、钙、或铁，以及有机碱诸如 异丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇(ethylamino ethanol)、组氨酸、普鲁卡因等等。
所述制品以与剂量制剂相容的方式施用，这样的量将是治疗上有效的。 所要施用的量取决于所要治疗的受试者，包括例如受试者的体重和年龄、所 要治疗的疾病以及疾病的发展阶段。合适的剂量范围在正常情况下为每次给 药每公斤体重几百μg数量级的活性成分，优选范围为每公斤体重约0.1μg至 5000μg。使用单体形式的复合物时，合适的剂量通常为每公斤体重0.1μg至 5000μg的范围，诸如每公斤体重约0.1μg至3000μg的范围，尤其是每公斤体 重约0.1μg到1000μg的范围。使用多聚体形式的复合物时，合适的剂量通常 为每公斤体重0.1μg至1000μg的范围，诸如每公斤体重约0.1μg至750μg的范 围，尤其是每公斤体重约0.1μg到500μg的范围，诸如每公斤体重约0.1μg到 250μg的范围。特别是鼻腔给药时，使用比其它途径给药更小的剂量。可以 一次给药或者后续给药。剂量也将取决于给药途径，并且会随着所治疗的受 试者的年龄和体重而变化。多聚体形式的优选剂量介于每70kg体重1mg至 70mg。
对于一些适应征，优选局部或基本上局部用药。
本发明的一些复合物活性是足够的，但是对于其它一些复合物，如果所 述制品进一步包含药学上可接受的添加剂和/或载体则将增强其效力。这些添 加剂和载体将是本领域已知的。在一些例子中，包括促进活性物质向其目标 递送的化合物将是有益的。
许多情况下，多次施用所述制剂是必要的。可以连续输注给药，诸如心 室内输注，或者施用多剂，诸如一天多次、每天一次、一周多次、每周一次 等等。优选在个体已经遭受可能导致细胞死亡的因素之前或者之后不久开始 施用所述药剂。优选在所述因素出现8小时内施用所述药剂，诸如在所述因 素出现5小时内。许多复合物具有长期效应，由此可以以较长时间间隔施用 所述复合物，诸如1周或2周。
与神经导管(nerve guide)的应用有关，可以基于活性复合物的受控释放 连续或分为小份施用。此外，可以使用前体来控制释放速率和/或释放部位。 类似地，其他类型的植入物以及口服给药可以基于受控释放和/或前体的应 用。
如以上所讨论的，本发明涉及治疗个体以在体外或体内诱导神经细胞分 化、刺激其再生、可塑性和存活，所述治疗涉及施用有效量的上述一种或多 种复合物。
另一种给药策略是植入或注射能够表达和分泌所述复合物的细胞。由此 可以在其要发挥作用的部位产生所述复合物。
VI.治疗
又一方面，本发明涉及所述肽、或其片段、变体诱导神经细胞分化和/ 或刺激其再生、可塑性和/或存活的用途。所述用途是治疗、预防中枢和周围 神经系统、以及肌肉或多种器官的疾病和疾患。
在一个实施方案中，利用根据本发明的复合物/组合物进行治疗可用于诱 导植入或移植细胞的分化、调控其增殖、刺激其再生、神经元可塑性和存活。 这在使用具有长期效应的复合物时特别有用。
如此，所述治疗包括与中枢和周围神经系统疾病或疾患有关的细胞死亡 的治疗和/或预防，所述疾病或疾患为诸如手术后神经损伤(postoperative nerve damage)、外伤性神经损伤(traumatic nerve damage)例如由脊髓损伤 (spinal cord injury)引起的、神经纤维髓鞘形成减弱(impaired myelination of nerve fiber)、缺血后损伤(postischaemic damage)例如由中风(stroke)引起的、 多梗塞性痴呆(multiinfarct dementia)、多发性硬化(multiple sclerosis)、与糖尿 病有关的神经变性(nerve degeneration associated with diabetes mellitus)、神经- 肌肉变性(neuro-muscular degeneration)、精神分裂症(schizophrenia)、阿耳茨 海默氏病(Alzheimer’s disease)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、或亨廷顿氏 病(Huntington’s disease)。
同样，与肌肉有关的疾病或疾患，包括神经-肌肉连接机能减弱的疾患， 诸如遗传性或外伤性萎缩性肌肉病症(genetic or traumatic atrophic muscle disorder)；或者对于多种器官的疾病或疾患，诸如生殖腺、胰腺(诸如I型和 II型糖尿病)、肾脏(诸如肾病)的变性疾患(degenerative condition)的治疗来 说，根据本发明的复合物可用于诱导分化、调控增殖、刺激再生、神经元可 塑性和存活，即刺激存活。
在又一个实施方案中，所述复合物和/或药物组合物的用途是用于刺激学 习和/或短期和/或长期记忆的能力。
具体而言，本发明的复合物和/或药物组合物可用于治疗临床疾患，诸如 精神病(psychoses)，诸如老年性和早老性器质性精神疾患(senile and presenile organic psychotic conditions)、酒精中毒性精神病(alcoholic psychoses)、药物 性神经病(drug psychoses)、瞬时性器质性精神疾患(transient organic psychotic condition)、阿耳茨海默氏病、脑脂质沉积(cerebral lipidoses)、癫痫(epilepsy)、 全身性轻瘫(general paresis)[梅毒(syphilis)]、肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration)、亨廷顿氏舞蹈症(Huntington′s chorea)、雅-克二氏病 (Jakob-Creutzfeldt disease)、多发性硬化、脑的皮克氏病(Pick′s disease of the brain)、梅毒(syphilis)、精神分裂性障碍(Schizophrenic disorder)、情感性精神 病(affective psychoses)、神经症性障碍(neurotic disorder)、人格障碍(personality disorder)包括性格神经症(character neurosis)、与器质性脑病综合征(organic brain syndrome)有关的非精神病人格障碍(nonpsychotic personality disorder)、 偏执型人格障碍(paranoid personality disorder)、狂信型人格(fanatic personality)、类偏执性人格(障碍)(paranoid personality(disorder))、偏执狂 样特性(paranoid traits)、性偏离和紊乱(sexual deviations and disorders)、精神 发育迟缓(mental retardation)、神经系统和感觉器官的疾病、认知异常 (cognitive anomalies)、中枢神经系统的炎性疾病诸如脑膜炎(meningitis)、脑 炎(encephalitis)；脑变性(Cerebral degeneration)诸如阿耳茨海默氏病、皮克氏 病、脑的老年性变性(senile degeneration of brain)、交通性脑积水 (communicating hydrocephalus)、阻塞性脑积水(obstructive hydrocephalus)、帕 金森氏病包括其它锥体外束病(extra pyramidal disease)和异常运动障碍 (abnormal movement disorders)、脊髓小脑疾病(spinocerebellar disease)、小脑 性共济失调(cerebellar ataxia)、马里氏病(Marie′s)、桑格-布朗二氏病 (Sanger-Brown)、肌阵挛性小脑协同失调(Dyssynergia cerebellaris myoclonica)、原发性小脑变性(primary cerebellar degeneration)诸如脊髓性肌 萎缩(spinal muscular atrophy)、家族性(familial)、幼年型(juvenile)、成人型(adult) 脊髓性肌萎缩、运动神经元病(motor neuron disease)、肌萎缩性侧索硬化 (amyotrophic lateral sclerosis)、运动神经元病(motor neuron disease)、进行性 延髓性麻痹(progressive bulbar palsy)、假性延髓性麻痹(pseudobulbar palsy)、 原发性侧索硬化(primary lateral sclerosis)、其它前角细胞疾病(other anterior horn cell diseases)、未定性的(unspecified)前角细胞疾病、其它脊髓疾病、脊 髓空洞症(syringomyelia)和延髓空洞症(syringobulbia)、血管性脊髓病(vascular myelopathies)、急性脊髓梗塞(acute infarction of spinal cord)(栓塞性 (embolic))(非栓塞性(nonembolic))、脊髓动脉血栓形成(arterial thrombosis of spinal cord)、脊髓水肿(edema of spinal cord)、亚急性坏死性脊髓病(subacute necrotic myelopathy)、疾病分类中其它地方的亚急性脊髓混合变性(subacute combined degeneration of spinal cord)、脊髓病(myelopathy)、药物诱发的 (drug-induced)、辐射诱发的(radiation-induced)脊髓炎(myelitis)、自主神经系 统障碍(disorders of the autonomic nervous system)、外周自主(peripheral autonomic)、交感(sympathetic)、副交感(parasympathetic)或植物(vegetative) 系统障碍、家族性缺陷自主症(familial dysautonomia)[赖利-戴综合征 (Riley-Day syndrome)]、特发性周围自主神经病(idiopathic peripheral autonomic neuropathy)、颈动脉窦性晕厥或综合征(carotid sinus syncope or syndrome)、颈交感神经性营养不良或麻痹(cervical sympathetic dystrophy or paralysis)；疾病分类中其它地方的周围自主神经病(peripheral autonomic neuropathy)、淀粉样变(amyloidosis)、周围神经系统疾病、臂丛病损(brachial plexus lesions)、颈肋综合征(cervical rib syndrome)、肋锁综合征(costoclavicular syndrome)、前斜角肌综合征(scalenus anterior syndrome)、胸出口综合征 (thoracic outlet syndrome)、臂丛神经炎(brachial neuritis)或神经根炎(radiculitis) 包括新生儿的，炎性和毒性神经病(inflammatory and toxic neuropathy)包括急 性传染性多神经炎(acute infective polyneuritis)、吉兰-巴雷综合征 (Guillain-Barrésyndrome)、感染后多神经炎(Postinfectious polyneuritis)、胶原 血管病(collagen vascular disease)中的多神经病(polyneuropathy)、侵袭眼睛多 种结构的病症、化脓性眼内炎(purulent endophthalmitis)、耳和乳突疾病、新 生儿器官和软组织异常包括神经系统中的、分娩(labor and delivery)过程中施 用麻醉剂或其它镇静剂的并发症、皮肤病包括感染、循环不充分的问题、损 伤包括手术后的、压碎性损伤(crushing injury)、烧伤(burns)；对神经和脊髓 的损伤，包括神经分开(division ofnerve)、连续性病变(lesion in continuity)(有 或没有开放性伤口的)、创伤性神经瘤(traumatic neuroma)(有或没有开放性伤 口的)、外伤性瞬时麻痹(traumatic transient paralysis)(有或没有开放性伤口 的)、医疗过程中意外刺伤(puncture)或撕裂(laceration)、视神经和通道损伤、 视神经即第二脑神经损伤、视交叉损伤、视通道损伤、视皮层损伤、未定性 的失明、其它脑神经损伤、其它的和未定性的神经的损伤；药物、医学和生 物学物质中毒，遗传性或外伤性萎缩性肌肉病症；或者用于多种器官的疾病 或疾患的治疗，诸如生殖腺、胰腺(诸如I型和II型糖尿病)、肾脏(诸如肾 病)的变性疾患。
本发明的又一方面是生产药物组合物的方法，包括将有效量的一种或多 种本发明复合物、或者根据本发明的药物组合物与一种或多种药学上可接受 的添加剂或载体混合，为受试者施用有效量的至少一种所述复合物、或所述 药物组合物。
在上述方法的一个实施方案中，所述复合物与假体装置(prosthetic device) 组合使用，其中所述装置是修复性神经导管(prosthetic nerve guide)。如此， 另一方面，本发明涉及修复性神经导管，特征在于其包括一种或多种如上定 义的复合物或药物组合物。神经导管是本领域已知的。
本发明的另一方面涉及如上定义的复合物的用途。具体而言，根据本发 明的复合物的用途是用于生产药物组合物。所述药物组合物优选用于治疗或 预防以上提到的任一种疾病和疾患。
又一方面，本发明涉及通过施用本文定义的复合物以治疗上述疾病或疾 患的方法。
实施例
方法
培养物中原代神经元的神经突长出
解离的小脑神经元分离自7日龄的大鼠。在冰冷的改良Krebs Ringer溶液 中从脑中分离出小脑，去除血管，通过剁碎粗略地均质化，然后胰蛋白酶消 化。在DNA酶1和大豆胰蛋白酶抑制剂存在下清洗解离的细胞。出生后海马 神经元或小脑颗粒神经元(CGN)在添加有0.4％(w/v)牛血清清蛋白(BSA； Sigma-Aldrich)、2％(v/v)B27神经基质添加物(Neurobasal supplement)、1％ (v/v)glutamax、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2％1M HEPES(均来自 Gibco，BRL)的神经基质培养基(Neurobasal medium)中在未包被的8孔 permanox Lab-Tek腔式载玻片上以10,000细胞/cm2的密度铺板。24小时后，神 经元用4％(v/v)甲醛固定20分钟，此后用针对GAP-43的第一兔抗体和Alexa Fluor第二山羊抗兔Ig抗体免疫染色。对于每个个体实验中的每个组，通过之 前描述的计算机辅助的荧光显微术(等，2000)系统地获得至少200个神 经元的图像。简言之，用偶联到摄像机(Grundig Electronics，Germany)的带有 Nikon Plan 20x物镜的Nikon Diaphot倒置显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)记录。用 Protein Laboratory(Copenhagen，Denmark)开发的软件包Prima进行基于体视 学的神经突长度测定(等，2000)。
原代培养物中的神经元细胞存活
CGN原代培养物在添加有2％(v/v)B27、0.5％(v/v)glutamax、100U/ml 青霉素、100μg/ml链霉素和KCl的神经基质-A培养基(Gibco，BRL)中在聚-L- 赖氨酸包被的8孔permanox载玻片上以100,000细胞/cm2的密度铺板，其中KCl 在培养基中的终浓度为40mM。铺板后24小时，添加胞嘧啶-D-阿拉伯呋喃糖 苷(arabinofuranoside)(Ara-C；Sigma-Aldrich)至终浓度10μM，以避免神经胶质 细胞增殖，之后让神经元于37℃进一步分化6天。通过清洗两次并将培养基 改为添加有1％(v/v)谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素、3.5g d- 葡萄糖/L和1％(v/v)丙酮酸钠(Gibco BRL)以及不同浓度的肽的Eagle氏基本 培养基(BME；Gibco BRL)，来诱导凋亡性细胞死亡。由此，培养物中钾的浓 度降低到5mM KCl。诱导凋亡后两天，细胞用4％(v/v)甲醛固定并用Hoechst 33258染色(D’Merllo等，1993)。
外伤性脑损伤模型
通过将一块干冰(-78℃)直接敷用在小鼠头骨上30秒，敷用在大鼠头骨上 60秒而造成右侧顶额(fronto-parietal)皮层的病灶性脑损伤，如之前所详细描 述的(Penkowa等，2003)。
组织处理
在从取自固定的动物的器官切下的切片上实施组织化学和免疫组化。大 鼠和小鼠用Brietal深度麻醉，并用含肝素(heparine)的盐水(0.9％NaCl、3ml/L 5000IU肝素)心脏灌注冲洗2分钟，之后根据动物的大小用Zamboni氏固定剂 (pH 7.4)固定4-8分钟。对于免疫组化研究，解剖脑并在Zamboni氏固定剂中 后固定2-3小时，继分级醇(graded alcohol)之后在二甲苯中脱水，随后石蜡包 埋，然后贯穿整个冻伤部分切成3μm额切片(frontal section)。为了热诱导的表 位恢复，将所述切片置于柠檬酸盐缓冲液(pH 6或9)中在微波炉中煮沸10分 钟，之后于室温在含10％山羊血清(In Vitro，Fredensborg，DK)或驴血清(编号 BP 005.1；The Binding Site，Birmingham，UK)的tris缓冲盐水(TBS)/Nonidet P-40(0.01％)中温育30分钟。还将用于与单克隆小鼠衍生抗体一起温育的带 小鼠组织的切片与来自HistoMouse-SP试剂盒的封闭液A+B一起温育，以淬灭 内源性小鼠IgG(Zymed，CA，USA)。
免疫组化和组织化学
经过上述处理之后，于5℃将切片与下述第一抗体之一一起温育过夜： 在山羊血清中1∶100稀释的单克隆小鼠抗8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)(DNA氧 化的标志物；Chemicon，Temacula，CA，USA)；1∶250稀释的多克隆兔抗牛神 经胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)(星形细胞的标志 物；DakoCytomation)。用生物素化的第二抗体检测第一抗体，即与链霉亲合 素-生物素-过氧化物酶复合体一起温育30分钟。生物素化的番茄凝集素 (Sigma，，DK)用作小胶质细胞/巨噬细胞的标志物。凝集素染色如 制造商所述用链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合体(StreptABComplex/HRP； DakoCytomation，Glostrup，DK)进一步显影，于室温(RT)显影30分钟。以DAB 为色原体，用含0.015％H2O2的3，3’-二氨基联苯胺/TBS(DAB/TBS)使凝集素 反应产物显影。 NGF衍生肽
NGF-C2 CVLSRKAVRRA SEQ ID NO：7
NGF-D ETKCRDPNPVDSG SEQ ID NO：27
(N端截短一个aa的SEQ ID NO：1)
NGF-E RGIDSKHWNSY SEQ ID NO：19
NGF-C1 RIDTACV SEQ ID NO：5
NGF-EE TFVKALTMDGKQAAWR SEQ ID NO：15
NGF-N SSHPIFHRGEFS SEQ ID NO：11
BDNF衍生肽
BDNF-E RGIDKRHWNSQ SEQ ID NO：22
BDNF-EE SYVRALTMD SKKRIGWR SEQ ID NO：18
结果
实施例1：神经突长出的刺激
用不同浓度(3-81μg/ml)的肽NGF-C2、NGF-D、NGF-E、NGF-C1、 NGF-EE、BDNF-E或BDNF-EE处理如上制备的CGN。
从图1、2、4和5可以看到，包含指定结构基序的肽NGF-C2(基序II)、 NGF-E(基序III)、NGF-C1(基序I)、NGF-EE(基序III)、BDNF-E(基序III)或 BDNF-EE(基序III)均显著刺激来自培养物中的原代神经元的神经突长出。相 比之下，缺少基序I的必需疏水性残基的肽NGF-D不具有神经突发生活性(图 1)。
实施例2：神经元细胞存活的刺激
在体内和在体外都检验不同肽对神经元存活的影响。
对于体外试验，CGR神经元的培养物如上制备，并用不同浓度的NGF-E、 NGF-EE或NGF-N处理。
从图3可以看到，所有测试的肽都显著促进培养物中CGN的存活。
体内试验-通过将一块干冰(-78℃)直接敷用在小鼠头骨上30秒，敷用在 大鼠头骨上60秒而造成右侧顶额皮层的病灶性脑损伤，如之前所详细描述的 (Penkowa等，2003)。通过将一块干冰(-78℃)直接敷用在小鼠头骨上30秒，敷 用在大鼠头骨上60秒而造成右侧顶额(fronto-parietal)皮层的病灶性脑损伤， 如之前所详细描述的(Penkowa等，2003)。处理后，如下所述，于5℃将切片 与下述第一抗体之一一起温育过夜：在山羊血清中1∶100稀释的单克隆小鼠抗 8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)(DNA氧化的标志物；Chemicon，Temacula，CA， USA)；1∶250稀释的多克隆兔抗牛神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)(星形细 胞的标志物；DakoCytomation)。用生物素化的第二抗体检测第一抗体，即与 链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合体一起温育30分钟。生物素化的番茄凝 集素(Sigma，，DK)用作小胶质细胞/巨噬细胞的标志物。凝集素染 色如制造商所述用链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合体 (StreptABComplex/HRP；DakoCytomation，Glostrup，DK)进一步显影，于室温 (RT)显影30分钟。以DAB为色原体，用含0.015％H2O2的3，3’-二氨基联苯胺 /TBS(DAB/TBS)使凝集素反应产物显影。病变(lesion)之后的第(-1)天、第1 天和第3天通过皮下注射肽(10mg/kg/注射)处理动物。
用BDNF-EE肽处理病变大鼠导致氧化应激的抑制(表现为DNA氧化的 标志物8-羟基脱氧鸟苷的免疫染色)、小胶质细胞活化的抑制(表现为活化 的小胶质细胞的标志物番茄凝集素的结合)、和皮层星形细胞的活化(表现 为GFAP的免疫染色)。
实施例3：NGF和BDNF衍生肽与TrkA、TrkB、TrkC和P75的结合
表面等离振子共振(SPR)分析
于25℃，采用含有10mM Hepes，pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA和 0.005％P20的HBS-EP运行缓冲液，利用BIAlite仪器(Biacore AB，Uppsala，瑞 典)通过表面等离振子共振(SPR)分析NGF衍生肽NGF-C2、NGF-E、NGF-EE 和NGF以及BDNF衍生肽BDNF-C1、BDNF-C2、BDNF-E、BDNF-EE和BDNF 与Trk受体TrkA、TrkB、TrkC和P75受体的结合。在传感器芯片CM4上利用 胺偶联试剂盒如下固定TrkA、TrkB和TrkC受体以及p75NTR：用20μl活化液， N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N’-(3-二乙基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)活 化芯片，用30μl溶于50μl 10mM醋酸钠缓冲液(pH 4.0)中的4μl(0.5μg/ml)蛋白 质的混合物固定蛋白质；并用35μl封闭液(乙醇胺-HCl)封闭芯片。各配体注 射之间用15μl 2mM NaCl或10mM甘氨酸-HCl，pH 2.5使受体表面再生。本试 验中使用5μl/min的流速。
用相应于结合Trk受体或p75NTR受体和空白芯片之间的差异的曲线进行 分析。
计算得出的亲和常数(KD)列于表1。
表1
配体 TrkA/KD(M) TrkB/KD(M) TrkC/KD(M) P75/KD(M) NGF-C2 7.27x10-7 8.83x10-7 6.58x10-7 3.85x10-7 NGF-E (-) 2.54x10-7 1.06x10-6 2.60x10-6 NGF-EE (-) 1.03x10-8 5.19x10-8 2.26x10-7 NGF 4.63x10-9 9.94x10-9 3.56x10-8 1.65x10-8 BDNF-C1 (-) 1.04x10-6 3.50x10-6 1.20x10-6 BDNF-C2 (-) 4.08x10-8 1.11x10-7 3.31x10-7 BDNF-E (-) 1.73x10-7 6.97x10-7 5.56x10-7 BDNF-EE (-) 3.87x10-8 1.66x10-7 1.10x10-7 BDNF (-) 1.18x10-9 1.40x10-8 5.84x10-11
参考文献
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神经营养因子是小的(约13kDa)强碱性的二聚体蛋白，其深刻地影响所 有脊椎动物物种中神经系统的发育。
神经生长因子(NGF)是最先且最好地被表征的神经营养因子家族成员。 它作为同二聚体存在于CNS中，其基因位于第1条染色体上(p21-p22.1区)。 已显示NGF促进基底前脑的胆碱能神经元和交感神经元、及初级感觉神经元 (primary sensory neurons)的存活。也已证明NGF是针对轴索显微外科术 (axotomy)诱导的神经变性和年龄相关的萎缩的保护因子。已经提出NGF在神 经变性病症诸如阿尔茨海默氏病的病理生理学和药物疗法中起作用。此外， 已显示其在暴露于毒性浓度谷氨酸的海马神经元中显著减弱神经变性并维 持细胞形态(综述见Salehi等，2004；Tuszynski MH等，Nat Med.2005Jun；11(6)： 551-5；Jakubowska-Dogru E，Gumusbas U Neurosci Lett.2005 Jul 1；382(1-2)： 45-50；Walz R等，Neurochem Res.2005 Feb；30(2)：185-90；Hu Z等，Neurobiol Dis.2005 Feb；18(1)：184-92)。
脑衍生神经营养因子(BDNF)是另一种很好表征的神经营养因子家族成 员。BDNF基因位于第11条染色体，p13条带。BDNF蛋白的结构与NGF的结 构类似。BDNF在CNS中比NGF分布更广。像NGF一样，BDNF富集于海马中， 海马是在成人脑中保持高度神经可塑性的脑区，其基本上与学习和记忆有 关。值得注意的是海马内NGF和BDNF表达的调节都至少部分受到胆碱能和 谷氨酸能系统的控制。已显示海马损伤导致BDNF表达的上调。此外，与NGF 类似，BDNF作为基底前脑初级感觉和胆碱能神经元的存活因子发挥作用。 另外，发现BDNF促进多种其它神经元细胞类型例如黑质(substania nigra)的 多巴胺能神经元、小脑颗粒神经元、运动神经元、蓝斑(locus ceruleus)神经 元和视网膜神经节细胞的存活，在这些神经元细胞类型中NGF看起来未扮演 重要角色。
神经营养因子-3(NT-3)具有与NGF和BDNF都高度相似的结构，然而该 生长因子在神经系统中的表达多少与NGF或BDNF有所不同。与NGF和 BDNF相反，NT-3在CNS中的水平在胎儿发育期间和新生儿脑中是高的，在 成人脑中降低。新生动物海马中NT-3的水平显著高于其它神经营养因子的水 平。根据这些发现，提出NT-3在早期神经元发育中扮演重要角色，脑发育期 间该神经营养因子的机能障碍可能导致海马病理学诸如精神分裂症。像NGF 和BDNF一样，NT-3延长初级感觉神经元特别是神经嵴细胞的存活，并且提 高多巴胺能神经元存活(综述参见Shoval和Weizman，2005)。
神经营养因子生长因子家族第四个有记载的成员是神经营养因子4/5 (NT-4/5)。同所有其它神经营养因子一样，NT-4/5是有效的神经元细胞存活 因子，特别是已显示它促进神经嵴和基板(placodes)的感觉神经元、运动神经 元、基底前脑和蓝斑的神经元的存活。它还充当基底前脑神经元和运动神经 元的分化因子。它与促进神经再生和海马神经元的突触活性有关(综述参见 Shoval和Weizman，2005)。
神经生长因子受体(NGFR)是所有神经营养因子的普遍存在的受体，根 据它的分子量也将其称为p75NTR。NGFR在被发现时被认为是独特的蛋白质类 型。然而，后来发现肿瘤坏死因子受体的大型超家族共享NGFR的整体结构 (4个胞外配体结合的、富含半胱氨酸的重复，或者称为CR，通过与胞质相互 作用物结合或者解离而发出信号)。对该超家族的鉴定帮助阐明了NGFR的一 些生物学功能，包括其在核因子κ-B和凋亡途径中的最终介入。NGFR/p75NTR 主要与细胞死亡有关。NGFR作为单体以低亲和力结合所有NT。NT的更高 亲和力结合通过该因子与原肌球蛋白受体激酶家族(TRK家族)的更高分子量 受体TRKA(NTRK1)、TRKB(NTRK2)和TRKC(NTRK3)的结合而获得。 TRKA、TRKB和TRKC分别特异于NGF、NT-4/5和BDNF、以及NT-3。NT-3 也结合TRKA和TRKB，但亲和力明显较低(有关NT及其受体的综述参见 Bothwell，Science 272：506-507，1996；Carter和Lewin，Neuron 18：187-190， 1997；Bibel和Barde，Genes Dev.14：2919-2937，2000)。
NT与其受体的结合以及对该结合的调节是非常复杂的，在发育期间和 成人中受到强烈调节。神经营养因子及其受体既涉及神经系统正常功能的调 节也涉及病理学。早已明了开发能够增强和/或抑制神经营养因子的功能和/ 或其受体的活性的新化合物对于开发用于治疗多种神经系统相关疾病的新 药来说将会是有益的。然而，尽管早已认识到该需求，但这样的化合物一直 是非常难以捉摸的。作为大分子，治疗性递送有效水平的神经营养因子本身 存在相当大的可能难以逾越的挑战。另外，天然神经营养因子可能与神经元 中的其它受体诸如p75受体相互作用，该受体与神经元凋亡和生长锥塌陷 (collapse)有关。然而，先前设计Trk受体的肽模拟物激动剂和/或拮抗剂的努 力也没有成功。例如，已报导衍生自神经营养因子NGF的第1个环的环肽适 度地模拟NGF的存活活性。然而，这些肽看起来以p75而非Trk受体依赖性的 方式起作用(Long等，J.Neurosci.Res.1997，48：1-17)。据说NGF第4个环的一 些环肽显示NGF样存活活性，该活性受到Trk拮抗剂的阻断。然而，据报导， 由那些肽诱导的最大存活应答仅仅为NGF神经营养因子自身引起的最大应 答的10-15％(Xie等，J.Biol.Chem.2000，275：29868-29874；Maliartchouk等，J. Biol.Chem.2000，275：9946-9956)。
已显示BDNF第2个环的肽的二环和三环二聚体型具有BDNF样活性。然 而，再次报导它们所诱导的最大存活应答仅仅为天然神经营养因子引起的最 大应答的30％(O′Leary等，J.Biol.Chem.2003，278：25738-25744)。因此，仍 然存在早已认知到的对能够调控(即增强或抑制)神经元生长和恢复的组合 物的需求。也存在对能够有效调控神经元生长和恢复的程序和方法(包括治 疗性方法)的需求。
发明概述
本发明涉及衍生自神经营养因子的短肽序列，其在刺激由神经营养因子 受体介导的神经元细胞分化、神经元细胞存活、以及与学习和记忆有关的神 经可塑性方面非常有效。根据本发明，所述肽序列包含一个或多个相同的氨 基酸基序，该相同氨基酸基序对于所述肽的生物学活性来说是重要的
如此，在第一个方面，本发明涉及包含5-25个连续氨基酸残基的分离的 肽序列，所述肽序列包含氨基酸基序xp1-D/E-T-xa1-C(基序I)，
其中
xp1为疏水性氨基酸残基，并且
xa1为K、R、S或A。
在本发明的另一个方面，包含基序(I)的肽序列可以进一步包含基序(II) xp2-(xa)1-(xa)2-x+/--xa2-G或/和基序(III)R/K-A/G-L/V/I-T/D-xa2-x+/-，
其中
xp2为疏水性或碱性氨基酸残基，
(xa)为任何氨基酸残基或键，
x+/-为带电荷的氨基酸残基，并且
xa2为任何氨基酸残基。
本发明公开了衍生自NGF、NT3、NT4/5和BDNF的特定肽序列，其包含 上述至少一种基序，并且能够刺激神经元细胞分化、神经元细胞存活、和/ 或与学习和记忆有关的神经可塑性。
进一步，本发明涉及含有包含上述至少一种基序的肽序列的复合物，特 别是包含衍生自NGF、NT3、NT4/5或BDNF的序列的复合物。
本发明还涉及所述肽序列和包含所述肽序列的复合物用于生产药剂和/ 或用于制备抗体的用途。本发明还涉及包含本发明的肽、复合物和/或抗体的 药物组合物。
利用本发明的肽、复合物、抗体和/或药物组合物刺激神经突细胞分化、 神经元细胞存活、和/或与学习和记忆有关的神经元可塑性的方法也在保护范 围内，以及包括为有需要的个体施用有效量的本发明的肽、复合物、抗体或 药物组合物的治疗方法。
附图简述
图1显示NGF衍生肽NGF-C2、NGF-D和NGF-E对小脑颗粒神经元(CGN) 的神经突长出的影响。
图2显示NGF衍生肽NGF-C1和NGF-EE对CGN的神经突长出的影响。
图3显示NGF衍生肽NGF-E、NGF-EE和NGF-N对CGN存活的影响。
图4显示BDNF衍生肽BDNF-E对CGN的神经突长出的影响。
图5显示BDNF衍生肽BDNF-EE对CGN的神经突长出的影响。
发明详述
I.肽序列
本发明的一个方面涉及包含5-25个连续氨基酸残基的肽序列，所述肽序 列包含氨基酸基序(基序I)xp1-D/E-T-xa1-C，
其中
xp1为疏水性氨基酸残基，并且
xa1为K、R、S或A。
根据本发明的基序(I)的xp1残基可以为任何疏水性残基，然而在优选实施 方案中xp1选自Y、F或I。如此，在一个优选实施方案中它可以是Y，在另一 优选实施方案中是F，在又一优选实施方案中它可以是I。
包含上述基序的本发明的肽序列可以进一步包含另一个氨基酸基序 xp2-(xa)1-(xa)2-x+/--xa2-G(基序II)，
其中
xp2为疏水性或碱性氨基酸残基，
(xa)为任何氨基酸残基或键，
x+/-为带电荷的氨基酸残基，并且
xa2为任何氨基酸残基。
如此，本发明的另一个方面涉及同时包含基序(I)和基序(II)的下式的肽 序列：x1-xp1-D/E-T-xa1-C-(x)n-xp2-(xa)-(xa)-x+/--xa2-G-(x)n，
其中
x1为任何氨基酸残基，
(x)n为键或任何氨基酸残基序列，其中n为1到5的整数，并且
xp1、xp2、xa1、xa2、(xa)、x+/-如权利要求1-9中所定义的。
根据本发明，基序(II)的xp2可以为任何疏水性氨基酸残基，然而优选xp2 选自A、L、P或Y。在另一个实施方案中xp2可以为带电荷的氨基酸残基，在 优选实施方案中为带正电荷的残基例如K、R或H。根据本发明最优选的带正 电荷的残基为K。
根据本发明，基序(II)中(xa)位点的残基为任何氨基酸残基，然而在该位 点一些氨基酸残基可能是优选的，这样的优选氨基酸残基可以选自A、E、F、 I、L、R、S、T或V。在一些实施方案中，(xa)位点的至少一个氨基酸残基可 以不存在，这样根据本发明的基序(II)可以包含5个或4个氨基酸残基。在这 样的实施方案中，本发明涉及一种包含基序xp2-(xa)-x+/--xa2-G的氨基酸序列， 即其中一个(xa)位点为肽键，或者本发明涉及一种包含基序xp2-x+/--xa2-G的氨 基酸序列，即其中两个(xa)位点均为肽键。在一些实施方案中，其中一个(xa) 残基不存在可能是优选的，在其他实施方案中，两个(xa)均为肽键取代可能 是优选的。
根据本发明，xa2可以选自氨基酸残基A、E、G、I、N、R、S或T，并且 x+/-可以选自D、E、K、R或H。
另外，根据本发明的上述氨基酸序列可以进一步包含氨基酸基序 R/K-A/G-L/V/I-T/D-xa3-x+/-(基序III)，
其中
xa3为任何氨基酸残基，并且
x+/-为带电荷的氨基酸残基。
在基序(III)中，xa3残基可以选自A、D、M、R或S，并且x+/-选自D、E、 K、R或H。
相应地，本发明的另一个方面涉及包含上述全部三种基序的至少15个连 续氨基酸残基的肽序列。根据本发明，这样的氨基酸序列可以由下式定义： x1-xp1-D/E-T-xa1-C-(x)n-xp2-(xa)1-(xa)2-x+/--xa2-G-(x)n-R/K-A/G-L/V/I-T/D-xa3-x+/- -(x)n，
其中
x1、xp1、xp2、xa1、xa2、xa3、(xa)、x+/-和(x)n如上文所讨论的，
或者为包含至少5个氨基酸残基的所述序列的片段，所述片段包含下述 基序之一：
xp1-D/E-T-xa1-C(基序I)，
xp2-(xa)1-(xa)2-x+/--xa2-G(基序II)或
R/K-A/G-L/V/I-T/D-xa3-x+/-(基序III)，
其中xp1、xp2、xa1、xa2、xa3、(xa)、x+/-如上文所讨论的。
上述肽序列可以例如包含选自以下序列的序列或其片段、变体或同源 物：
YETKCRDPNPVDSG(SEQ ID NO：1)、
FETRCKEARPVKNG(SEQ ID NO：2)、
YETRCKADNAEEGGPGAG(SEQ ID NO：3)、
FETKCNPMGYTKEG(SEQ ID NO：4)、
RIDTACV(SEQ ID NO：5)、
RIDTSCV(SEQ ID NO：6)、
CVLSRKAVRRA(SEQ ID NO：7)、
CALSRKIGRT(SEQ ID NO：8)、
VCTLLSRTGRA(SEQ ID NO：9)、
VCTLTIKRGR(SEQ ID NO：10)、
SSHPIFHRGEFS(SEQ ID NO：11)、
YAEHKSHRGEYS(SEQ ID NO：12)、
SETAPASRRGELA(SEQ ID NO：13)、
HSDPARRGELS(SEQ ID NO：14)、
TFVKALTMDGKQAAWR(SEQ ID NO：15)、
TYVRALTSENNKLVGWR(SEQ ID NO：16)、
SYVRALTADAQGRVGWR(SEQ ID NO：17)、
SYVRALTMDSKKRIGWR(SEQ ID NO：18)、
RGIDSKHWNSY(SEQ ID NO：19)、
RGIDDKHWNSQCKTSQ(SEQ ID NO：20)、
RGVDRRHWVSE(SEQ ID NO：21)、
RGIDKRHWNSQ(SEQ ID NO：22)、
RIDTACVCVLSRKAVRRA(SEQ ID NO：23)、
RIDTSCVCALSRKIGRT(SEQ ID NO：24)、
RIDTACVCTLLSRTGRA(SEQ ID NO：25)、
RIDTSCVCTLTIKRGR(SEQ ID NO：26)。
应当理解，上述序列SEQ ID NO：1-26都包含基序(I)、(II)或(III)中的至少 一种。
在一些实施方案中，本发明的肽序列可以包含选自序列SEQ ID NO：5-22 的序列，诸如SEQ ID NO：5或6，或者例如包含选自序列SEQ ID NO：7-10的 序列，或者包含选自序列SEQ ID NO：11-14或SEQ ID NO：15-22例如选自序 列SEQ ID NO：15-18或SEQ ID NO：19-22的序列。
所述肽序列也可以包含序列SEQ ID NO：5-22之外的序列。这种肽序列可 以是例如选自序列SEQ ID NO：1-4的序列，或者是选自序列SEQ ID NO： 23-26的序列。
根据本发明，所述肽序列优选包含5-25个氨基酸残基。如此，在一个实 施方案中，优选的肽序列可以具有5-10个氨基酸残基的长度，诸如6-9个氨基 酸残基，例如7个或8个氨基酸残基，或者所述肽序列的长度可以为11-15个氨 基酸残基，诸如例如12-14个氨基酸残基，例如13个氨基酸残基。在另一个 实施方案中，优选的肽序列的长度可以为16-25个氨基酸残基，例如17-24个 氨基酸残基，诸如18-23个，例如19-22个，它也可以为20个或21个氨基酸残 基。然而在一些实施方案中，本发明的肽序列的长度可以比上述长度更长， 例如它可以有26-50个氨基酸残基。
如以上所提到的，本发明涉及上述肽序列的片段、变体和同源物，其定 义如下：
1)片段指如下序列，该序列的序列长度的至少40％、更优选至少50％、 更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少 90％、更优选至少95％对应于包含本发明基序的序列，特别是选自 序列SEQ ID NO：1-26的序列。优选所述片段包含本发明的基序；
2)变体指如下氨基酸序列，该氨基酸序列与包含本发明基序的序列， 特别是与选自序列SEQ ID NO：1-26的序列具有至少60％、更优选至 少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、更优选95％的同源性， 或者指如下氨基酸序列，该氨基酸序列与包含本发明基序的序列， 特别是与序列SEQ ID NO：1-26相比有至少60％、更优选至少70％、 更优选至少80％、更优选至少90％、更优选95％的正的氨基酸匹配。 本文中正的氨基酸匹配定义为在两个进行比较的序列中具有相同 位置的氨基酸的物理和/或化学特性所限定的同一性或相似性。本发 明优选的正的氨基酸匹配为K与R、E与D、L与M、Q与E、I与V、I 与L、A与S、Y与W、K与Q、S与T、N与S及Q与R。一条氨基酸序 列与另一条氨基酸序列的同源性定义为两条进行对比的序列中相 同氨基酸的百分比。序列同源性可以利用公知的算法诸如BLOSUM 30、BLOSUM 40、BLOSUM 45、BLOSUM 50、BLOSUM 55、 BLOSUM 60、BLOSUM 62、BLOSUM 65、BLOSUM 70、BLOSUM 75、BLOSUM 80、BLOSUM 85、或BLOSUM 90来计算。优选所述 变体包含本发明的基序；
3)同源物指如下氨基酸序列，该氨基酸序列与包含本发明基序的序 列，特别是与序列SEQ ID NO：1-22具有小于60％但大于30％，诸如 50-59％，例如55％，诸如40-49％，例如45％，诸如30-39％，例如35％ 的同源性。优选所述同源物包含本发明的基序。
推测如上定义的片段、变体和同源物保持了原始序列的至少一些生物学 活性，诸如例如序列SEQ ID NO：1-26的生物学活性，例如刺激与与神经细胞 分化有关的和/或与记忆和学习有关的神经可塑性的能力、刺激细胞存活的能 力，例如抑制凋亡的能力或者活化Trk家族的受体的能力。
以上描述的所有序列均为根据本发明的分离的肽序列。
术语“分离的肽序列”指所述肽序列为个体化学实体。分离的肽序列可以 是天然的、合成的或者重组的肽序列或者是通过酶学/化学裂解更大的多肽/ 蛋白质而制备的序列。术语“天然的”指所述肽序列是机体代谢系统的一部分 并且在体内生成。术语“重组的”指所述肽序列是通过重组技术的方法生产 的。这种序列既可以在体内生产也可以在体外生产。术语“合成的”指所述肽 序列是以化学合成手段生产的。
根据本发明，分离的肽序列可以衍生自蛋白质序列。术语“衍生的”指所 述分离的肽序列具有与蛋白质氨基酸序列的内部片段相同的氨基酸序列，所 述蛋白质用作利用任何本领域已知的技术例如重组生产或者化学合成技术 生成所述分离的肽序列的原型。
如此，本发明的肽序列可以包含衍生自蛋白质序列的序列。在一个实施 方案中，所述序列可以衍生自神经生长因子(NGF)，例如衍生自编号为 SwissProt Acc.No：NP_02497的NGF多肽的序列；在另一个实施方案中，所 述序列可以衍生自神经营养因子-3(NT-3)，例如衍生自编号为SwissProtAcc. No：NP_002518的NT-3多肽的序列；在又一个实施方案中，所述序列可以衍 生自神经营养因子-4/5(NT-4/5)，例如衍生自编号为SwissProt Acc.No： AAAV38176的NT-4/5多肽的序列；或者所述序列可以衍生自脑衍生神经营养 因子(BDNF)，例如衍生自编号为SwissProt Acc.No：NP_733928的BDNF多肽 的序列。
在一个优选实施方案中，本发明涉及衍生自NGF的序列，其可以选自编 号为SEQ ID NO：1、5、7、11、15、19或23的序列。在另一个优选实施方案 中，本发明涉及衍生自NT3的序列，所述序列选自序列SEQ ID NO：2、6、8、 12、16、20或24。在又一个优选实施方案中，本发明涉及衍生自NT-4/5的序 列。这样的序列可以选自编号为SEQ ID NO：3、5、9、13、17、21或25的序 列。还有，在另一个优选实施方案中，本发明涉及衍生自BDNF序列的序列。 后者的序列可以选自编号为SEQ ID NO：4、6、10、14、18、22或26的序列。
在本申请中，既使用氨基酸残基的标准单字母代码也使用标准三字母代 码。氨基酸的缩写按照生物化学命名IUPAC-IUB联合委员会的建议(Eur.J. Biochem，1984，vol.184，pp 9-37)。整个说明书和权利要求书中对于天然氨基 酸使用三字母代码或者单字母代码。没有指定L或D构型时，所讨论的氨基 酸理解为具有天然L构型，参见Pure&Appl.Chem.Vol.(56(5)pp 595-624 (1984)或D构型，因而所形成的肽可以由氨基酸的L构型、D构型、或者L构 型和D构型的混合序列构成。
未指定时，本发明肽的C-末端氨基酸理解为以游离羧酸形态存在，这也 可以表示为“-OH”。然而，本发明复合物的C-末端氨基酸可以是酰胺化衍生 物，其表示为“-NH2”。未作其他陈述时，多肽的N-末端氨基酸包含游离氨基， 这也可以表示为“H-”。
未作其它指定时，氨基酸可以选自任何氨基酸，无论是天然发生的或非 天然发生的，诸如α氨基酸、β氨基酸、和/或γ氨基酸。相应地，该组包括但 不限于：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met、Gly、Ser、Thr、Cys、 Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Aib、Nal、Sar、Orn、赖氨酸 类似物、DAP、DAPA和4Hyp。
还有，根据本发明，可以对所述复合物/肽进行修饰，诸如例如氨基酸的 糖基化和/或乙酰化。
根据本发明，氨基酸残基Arg、Lys和His代表碱性氨基酸残基，氨基酸 残基Glu和Asp代表酸性氨基酸残基。碱性和酸性氨基酸残基构成带电荷氨基 酸残基组。氨基酸残基Leu、Ile、Val、Phe、Trp、Tyr和Met代表疏水性氨基 酸残基组。
在一个实施方案中，变体可以理解为随插入、删除和取代(包括保守性 取代)的数目和范围增加而显示出逐渐不同于优选的预定序列的氨基酸序 列。此差异以预定序列与所述变体之间同源性的减小来测量。
一个方面，术语“肽序列变体”指所述肽可以被修饰，例如取代一个或多 个氨基酸残基。L-氨基酸和D-氨基酸均可使用。其它修饰可以包括衍生物， 诸如酯、糖等等。例子为甲基和乙酰基酯。
另一方面，根据本发明的肽片段的变体可以在同一变体或其片段内或者 在不同变体或其片段之间包含至少一个取代，诸如彼此独立引入的许多取 代。如此，所述复合体的变体或其片段可以包含彼此独立的保守性取代，其 中所述变体或其片段的至少一个甘氨酸(Gly)被选自下组氨基酸的氨基酸所 取代：Ala、Val、Leu和Ile；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体 或其片段的至少一个丙氨酸(Ala)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Gly、 Val、Leu和Ile；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片段的至 少一个缬氨酸(Val)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Gly、Ala、Leu和Ile； 及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片段的至少一个亮氨酸 (Leu)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Gly、Ala、Val和Ile；及与此独立 的，变体或其片段，其中所述变体或其片段的至少一个异亮氨酸(Ile)被选自 下组氨基酸的氨基酸所取代：Gly、Ala、Val和Leu；及与此独立的，变体或 其片段，其中所述变体或其片段的至少一个天冬氨酸(Asp)被选自下组氨基酸 的氨基酸所取代：Glu、Asn和Gln；及与此独立的，变体或其片段，其中所 述变体或其片段的至少一个天冬酰胺(Asn)被选自下组氨基酸的氨基酸所取 代：Asp、Glu和Gln；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片 段的至少一个谷氨酰胺(Gln)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Asp、Glu 和Asn；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片段的至少一个 苯丙氨酸(Phe)被选自下组氨基酸：Tyr、Trp、His、Pro，优选选自下组氨基 酸：Tyr和Trp的氨基酸所取代；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变 体或其片段的至少一个酪氨酸(Tyr)被选自下组氨基酸的氨基酸：Phe、Trp、 His、Pro，优选选自下组氨基酸的氨基酸：Phe和Trp所取代；及与此独立的， 变体或其片段，其中所述变体或其片段的至少一个精氨酸(Arg)被选自下组氨 基酸的氨基酸所取代：Lys和His；及与此独立的，变体或其片段，其中所述 变体或其片段的至少一个赖氨酸(Lys)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代： Arg和His；及与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片段的至少一 个脯氨酸(Pro)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Phe、Tyr、Trp和His；及 与此独立的，变体或其片段，其中所述变体或其片段的至少一个半胱氨酸 (Cys)被选自下组氨基酸的氨基酸所取代：Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、 Gln、Ser、Thr和Tyr。
以上讨论了肽序列变体的其它标准。
如此，从上文得出肽片段的同一功能性等效物或者所述功能性等效物的 片段可以包含一个以上的保守性氨基酸取代，所述保守性氨基酸取代来自上 文限定的一个以上的保守性氨基酸组。本文所用术语“保守性氨基酸取代”与 术语“同源性氨基酸取代”同义。
保守性氨基酸组如下：
P、A、G(中性的、弱疏水性的)；
S、T(中性的、亲水性的)；
Q、N(亲水性的、酸胺(acid amine))；
E、D(亲水性的、酸性的)；
H、K、R(亲水性的、碱性的)；
A、L、I、V、M、F、Y、W(疏水性的、芳香族的)；
C(形成交联的)。
保守性取代可以在本发明优选的预定肽或其片段的任何位置引入。然 而，也可能需要引入非保守性取代，特别是但不限于在任何一个或多个位置 引入非保守性取代。
例如，导致形成本发明肽的功能上等同的片段的非保守性取代i)在极 性上有显著不同，例如具有非极性侧链的残基(Ala、Leu、Pro、Trp、Val、Ile、 Leu、Phe或Met)取代具有极性侧链的残基(诸如Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、 Asn或Gln)或带电荷的氨基酸(诸如Asp、Glu、Arg或Lys)，或者带电荷的或极 性的残基取代非极性的残基；和/或ii)在其对肽骨架取向的影响上显著不 同，诸如用Pro或Gly取代另一种残基或者Pro或Gly被另一种残基取代；和/ 或iii)在电荷上显著不同，例如带负电荷的残基(诸如Glu或Asp)取代带正 电荷的残基(诸如Lys、His或Arg)，反之亦然；和/或iv)在空间体积上显著 不同，例如大型残基(诸如His、Trp、Phe或Tyr)取代具有较小侧链的残基 (例如Ala、Gly或Ser)，反之亦然。
在一个实施方案中，可以基于氨基酸侧链取代基的疏水性和亲水性值以 及相对相似性包括电荷、大小等等来实施氨基酸取代。考虑前述各种特征的 示例性氨基酸取代是本领域技术人员熟知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨 酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨 酸和异亮氨酸。
根据本发明，可以将上述分离的肽序列配制为复合物(compound)。
复合物可以包含单一拷贝的选自上述任一种的个体(individual)氨基酸序 列，或者可以包含两个或多个拷贝的此种氨基酸序列。这意味着本发明的复 合物可以配制为肽序列单体，诸如包含单个个体肽序列，或者可以配制为肽 序列多聚体，即包含两个或多个个体肽序列，其中所述个体肽序列可以呈现 为两个或多个拷贝相同的序列或者呈现为两个或多个不同的个体肽序列。多 聚体也可以包含全长序列与所述序列的一种或多种片段的组合。在一个实施 方案中，复合物可以包含两条氨基酸序列，这样的复合物此处定义为二聚体， 在另一个实施方案中，复合物可以包含两条以上的氨基酸序列，例如三条、 四条或更多条序列。本发明优选涉及包含两条或四条本发明的肽序列的复合 物。然而，包含3、5、6、7、8或更多条序列的复合物也在本发明的范围内。
配制为二聚体或多聚体的肽片段可以具有相同的氨基酸序列，或者可以 具有不同的氨基酸序列。这种复合物的一个例子可以是包含SEQ ID NO：1和 SEQ ID NO：2的复合物。另一个例子可以是包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO： 4的复合物。也可以获得本发明序列的任意其它组合。复合物中的序列可以 借助于肽键相互连接，或者通过接头分子或基团(grouping)相互连接。
本发明的复合物可以包含相同序列的两个或多个相同拷贝，例如两个拷 贝的选自SEQ ID NO：1-26的序列，其中这些序列借助于接头分子或基团相连 接。优选其中所述序列借助于接头基团相连的复合物。这种连接基团的一个 例子可以是非手性的二、三或四羧酸。合适的非手性二、三或四羧酸和制备 这种复合物的方法(配体呈递装配法(a ligand presentation assembly method， LPA))描述于WO0018791和WO2005014623。另一种可能的接头的例子可以是 赖氨酸。个体肽序列可以附着于核心分子例如赖氨酸，从而形成个体肽序列 的树枝状多聚体(树状聚体)。树状聚体的生产也是本领域公知的 (PCT/US90/02039；Lu等(1991)Mol Immunol.28：623-630；Defoort等(1992) Int J Pept Prot Res.40：214-221；Drijfhout等(1991)Int J Pept Prot Res.37： 27-32)，目前树状聚体广泛用于研究和医学应用。本发明的优选实施方案是 提供包含四条附着于赖氨酸核心分子的个体氨基酸序列的树状聚体复合物。 也优选所述四个个体氨基酸序列中的至少一个包含上述通式的氨基酸序列。 甚至更加优选树状聚体复合物的所有四个个体氨基酸序列分别包含上述通 式的氨基酸序列。
本发明的多聚体复合物优选配制为LPA-二聚体或溶素-树状聚体。然而， 取决于实施方案，包含两个或多个本发明个体序列的其它类型的多聚体复合 物可能是优选的。
II.生物学活性
本发明的肽序列和包含本发明序列的复合物拥有生物学活性。本发明优 选涉及选自下述能力的生物学活性：
-刺激与神经细胞分化例如神经细胞前体的神经突长出或分化有关的神经 可塑性，
-刺激与记忆和学习有关的神经可塑性，例如形态学可塑性和/或突触功效，
-刺激细胞存活，例如抑制凋亡，和
-调控神经营养因子受体例如TRK受体或p75(NTR)的活性。
如此，在一个实施方案中，上述分离的肽序列能够结合神经营养因子受 体，所述神经营养因子受体是选自TRKA、TRKB和TRKC的TRK受体。在一 个优选实施方案中，所述受体可以是TRKA；在另一个优选实施方案中，所 述受体可以是TRKB；在又一个优选实施方案中，所述受体可以是TRKC。
本发明的作者已经鉴定了存在于所有神经营养因子(NGF、NT-3、NT-4/5、 BDNF)中的氨基酸基序，并且将本发明的肽片段的生物学活性与这些基序在 其序列中的存在关联起来。根据本发明的基序是本发明的肽序列结合TRK受 体即TRKA、B或C所必不可少的。TRK受体是神经系统中驱动神经细胞分化 的主要受体。TRK受体即TRK A、B或C对促进神经元存活来说也是很重要的， 其涉及与学习和记忆有关的神经可塑性。
如上文所讨论的，神经营养因子受体在神经系统的正常机能中扮演重要 角色，然而，这些受体也与病理学相关。如此，已经证明了TRKB的有力致 癌效应并揭示了特异性促存活(prosurvival)功能，TRKB抑制失巢凋亡(anoikis) (由细胞-基质相互作用丧失引起的凋亡)的能力可能对肿瘤细胞的转移能 力作出贡献，为过表达TRKB的人类肿瘤的攻击性本质提供了可能的解释 (Douma，S.；van Laar，T.；Zevenhoven，J.；Meuwissen，R.；van Garderen，E.； Peeper，D.S.：Suppression of anoikis and induction of metastasis by the neurotrophic receptor TrkB.Nature 430：1034-1040，2004)；已经将某些神经营 养因子(例如BDNF)水平的升高与医学疾患诸如癫痫关联起来(Binder等， Trends Neurosci.2001，24：47-53)。
如此，本发明的肽序列结合神经营养因子受体和调控这些受体的活性的 能力在正常状态和病理学中均用于调控依赖于这些受体活性的任何生物学 应答。相应地，本发明提供了调控神经营养因子受体诸如TRK家族的活性的 方法，包括使用本发明的分离的肽序列或包含所述序列的复合物。短语“调 节神经营养因子受体的活性”既涉及活化神经营养因子受体的活性也涉及抑 制其活性。在一个实施方案中，本发明涉及活化神经营养因子受体的方法， 在另一个实施方案中，本发明涉及抑制神经营养因子受体的方法。在一个实 施方案中所述神经营养因子受体可以是TRKA，在另一个实施方案中可以为 TRKB，在又一个实施方案中可以为TRKC，在一些实施方案中所述受体可 以是p75(NTR)。
本发明的分离的肽序列能够刺激神经元细胞分化。术语“神经元分化”既 理解为神经前体细胞或神经干细胞的分化，也理解为神经元的分化，诸如已 分化神经元的成熟。这种分化的例子可以是来自不成熟神经元的神经突长 出、神经突分支、神经元再生。在一个优选实施方案中，本发明可以涉及刺 激神经前体/干细胞或不成熟神经元的分化，在另一个优选实施方案中，本发 明可以涉及刺激来自成熟神经元的神经突长出，例如经历损伤但存活下来的 神经元。如此，本发明还涉及刺激神经元细胞分化的方法，包括使用本发明 的肽序列或包含所述序列的复合物。
在一些优选实施方案中，本发明涉及所述肽序列与学习和记忆有关的活 性。特别地，在一个优选实施方案中，本发明涉及所述肽序列刺激神经元的 形态学可塑性例如脊柱形成的能力，在另一个优选实施方案中，本发明涉及 所述序列促进突触功效的能力。如此，本发明进一步涉及刺激记忆和/或学习 的方法，包括使用本发明的肽序列和/或包含所述序列的复合物。本发明既涉 及短期记忆又涉及长期记忆。
本发明的肽序列还能够刺激神经元细胞存活。本发明涉及起因于外伤和 起因于变性疾病而刺激神经元细胞存活的能力。相应地，本发明进一步涉及 利用本发明的肽序列和/或包含所述序列的复合物刺激细胞存活，优选刺激神 经元细胞存活的方法。
本发明的肽序列和包含所述序列的复合物作为细胞生长培养基的可溶 性/流动性物质以及作为细胞生长底物的固定性物质来说都具有生物学活性。 在一些实施方案中，使用肽或包含该肽的复合物作为细胞底物可能是优选 的。然而，最优选可溶性肽序列或包含所述肽序列的复合物。
本申请中描述了本发明的肽序列和包含所述肽序列的复合物的生物学 活性的非限制性例子(参见下文的本发明的说明书和实施例)。
神经突长出的刺激
具有促进神经突长出以及刺激神经元细胞再生和/或分化潜力的物质诸 如某些内源营养因子是寻找促进例如神经元再生和其它形式神经可塑性的 复合物时的首要靶物。为了评估本发明复合物的潜力，可以调查其刺激神经 突长出相关信号传导、干扰细胞粘附、刺激神经突长出、神经再生的能力。 已表明本发明的复合物促进神经突长出，因此认为其为神经元连接再生以及 由此发生的损伤后机能恢复的优等促进剂，也是需要这种疗效的其它疾患中 神经元机能的促进剂。
上下文中“分化”与神经元的成熟和神经突的伸长过程有关，其发生于所 述神经元最后的细胞分裂之后。本发明的复合物可能能够终止神经细胞分裂 并启动所述细胞的成熟，诸如启动神经突的伸长。另外，“分化”与神经元祖 细胞、未成熟神经细胞或胚胎干细胞的遗传学、生物化学、形态学和生理学 转化进程的起始有关，所述进程导致具有正常神经元细胞的功能特征的细胞 的形成，所述特征在本领域中是明确的。本发明中将“未成熟神经细胞”定义 为具有神经细胞的至少一种如下特征的细胞，所述特征在本领域被公认为神 经细胞特征性的特征。
根据本发明，包含至少一种上述肽序列的复合物能够刺激神经突长出。 本发明涉及神经突长出的增强/刺激，诸如高于对照/未刺激细胞神经突长出 值的约50％或75％的增强/刺激或更强的刺激，诸如100％-150％之间，例如约 125％，诸如150％-200％之间，例如约175％，诸如250％-300％之间，例如约 275％，诸如300％-350％之间，例如约325％，诸如350％-400％之间，例如约 375％，诸如400％-450％之间，例如约425％，诸如450％-500％之间，500％-600％ 或超过600％。
可以通过采用评估神经突长出的任何已知的方法或测试来进行候选复 合物刺激神经突长出能力的评估，诸如例如本申请实施例1中所描述的方法 或测试。
根据本发明，复合物作为细胞生长底物的不溶性固定性组分和细胞生长 培养基的可溶性组分都具有神经突发生活性。本文中“固定性”指所述复合物 结合/附着于不溶于水或水溶液的物质，并因此变得在这种溶液中同样不能溶 解。对于医学应用来说，不溶性和可溶性复合物都可以考虑，但可溶性复合 物是优选的。“可溶性复合物”理解为可溶于水或水溶液的复合物。
神经元存活的刺激
具有因损伤增强神经元细胞存活以及抑制创伤和疾病中神经元细胞变 性和/或凋亡潜力的物质是寻找候选复合物的首要靶物，所述候选复合物用于 治疗神经变性疾病诸如例如阿尔茨海默氏病或帕金森氏病的新药。为了评估 本发明肽的潜力，可以调查其刺激存活相关信号传导、干扰细胞反应相关凋 亡、刺激神经再生的能力。已表明本发明的复合物促进神经细胞存活并减少 细胞损失，因此认为其为促进脑和/或周围神经系统中神经连接再生，以及由 此发生的因创伤或疾病而促进损伤后机能恢复的优等候选物，也是任何需要 此种效应的其它疾患中神经元功能的促进剂。
上下文中“存活”与涉及细胞损伤后细胞功能的维持和/或恢复的进程有 关。本发明的复合物可能能够终止或减弱致使细胞死亡的进程，诸如抑制由 起因于创伤或疾病的细胞损伤所启动的神经细胞凋亡。其它方面，“存活”与 抑制涉及导致细胞死亡的细胞损伤的进程有关，并且与启动细胞的遗传学、 生物化学、形态学和生理学转化或重建进程有关，特别是神经元细胞，诸如 祖细胞、不成熟神经细胞或胚胎干细胞或者具有本领域定义的正常功能特征 的成熟神经细胞。本发明中将“不成熟神经细胞”定义为具有神经细胞的至少 一种如下特征的细胞，所述特征在本领域被公认为神经细胞特征性的特征。
根据本发明，包含至少一种上述肽序列的复合物能够刺激神经细胞存 活。本发明涉及神经细胞存活刺激，诸如高于对照/未刺激细胞存活值的大约 75％的刺激，例如50％，诸如大约150％，例如100％，诸如大约250％，例如 200％，诸如大约350％，例如300％，诸如大约450％，例如400％，诸如大约 500％。
可以通过采用评估细胞存活的任何已知的方法或测试来进行候选复合 物刺激神经细胞存活能力的评估，诸如例如本申请实施例2中所描述的方法 或测试。
根据本发明，复合物作为不溶性和可溶性复合物均具有存活促进活性。 本文中“不溶性”指所述复合物结合/附着于不溶于水或水溶液的物质，并因此 所述复合物变得在这种溶液中同样不能溶解。对于医学应用来说，不溶性和 可溶性复合物都可以考虑，但可溶性复合物是优选的。“可溶性复合物”理解 为可溶于水或水溶液的复合物。
III.个体肽序列的生产
本发明的肽序列可以通过任何常规的合成方法、重组DNA技术、衍生所 述肽序列的全长蛋白质的酶学裂解、或上述方法的组合来制备。
重组制备
如此，在一个实施方案中，本发明的肽利用重组DNA技术来生产。
编码肽或衍生所述肽的相应全长蛋白质的DNA序列可以通过合成途径 来制备，其中使用已制定的标准方法，例如Beaucage和Caruthers，1981， Tetrahedron Lett.22：1859-1869描述的磷酰脒(phosphoamidine)法、或者Matthes 等，1984，EMBO J.3：801-805描述的方法。根据磷酰脒法，寡核苷酸例如在自 动DNA合成仪中合成、纯化、退火，在合适的载体中连接和克隆。
也可以根据标准方案，利用DNA酶I将编码衍生肽的相应全长蛋白质的 DNA序列片段化来制备编码肽的DNA序列(Sambrook等，Molecular cloning：A Laboratory manual.第二版，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。本发 明涉及选自以上鉴定的蛋白质的全长蛋白质。或者可以利用特异性限制性内 切核酸酶将编码本发明全长蛋白质的DNA片段化。利用Sambrook等， Molecular cloning：A Laboratory manual.第二版，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述的标准规程进一步纯化所述DNA片段。
编码全长蛋白质的DNA序列也可以是基因组或cDNA来源的，例如通过 制备基因组或cDNA文库并筛选编码全长蛋白质的全部或一部分的DNA序列 而获得，所述筛选依照标准技术利用合成寡核苷酸探针杂交进行(参考 Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，1989)。也可以利用特异性引物通过聚合酶链式反应来制备所述DNA 序列，例如US 4,683,202或Saiki等，1988，Science 239：487-491中所述。
然后将所述DNA序列插入到重组表达载体中，所述重组表达载体可以是 能够方便地实施重组DNA规程的任何载体。载体的选择通常取决于其所要导 入的宿主细胞。如此，所述载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体 存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒。或者，所述载体可以是 当导入到宿主细胞中时，整合到宿主细胞基因组中并与其已经整合到其中的 染色体一起复制的载体。
编码肽或全长蛋白质的DNA序列在载体中应当可操作地连接到合适的 启动子序列。所述启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何 DNA序列，可以衍生自编码与所述宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。指 导哺乳动物细胞中编码DNA序列转录的合适启动子的例子是SV 40启动子 (Subramani等，1981，Mol.Cell Biol.1：854-864)、MT-1(金属硫蛋白基因)启动 子(Palmiter等，1983，Science 222：809-814)或腺病毒2主要晚期启动子。用于昆 虫细胞的合适启动子是多角体蛋白启动子(Vasuvedan等，1992，FEBS Lett. 311：7-11)。用于酵母宿主细胞的合适启动子包括来自酵母糖酵解基因 (Hitzeman等，1980，J.Biol.Chem.255：12073-12080；Alber和Kawasaki，1982，J. Mol.Appl.Gen.1：419-434)或醇脱氢酶基因(Young等，1982，于Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals，Hollaender等编，Plenum Press， New York)的启动子，或者TPI1(US 4,599,311)或ADH2-4c(Russell等，1983， Nature 304：652-654)启动子。用于丝状真菌宿主细胞的合适启动子为例如 ADH3启动子(McKnight等，1985，EMBO J.4：2093-2099)或tpiA启动子。
所述编码DNA序列也可以可操作地连接到合适的终止子，诸如人生长激 素终止子(Palmiter等，前面引用的)或(用于真菌宿主)TPI1(Alber和Kawasaki， 前面引用的)或ADH3(McKnight等，前面引用的)启动子。所述载体可以进一 步包含其他成分，诸如多聚腺苷酸化信号(例如来自SV 40或腺病毒5Elb区)、 转录增强子序列(例如SV 40增强子)和翻译增强子序列(例如编码腺病毒VA RNA的那些)。
所述重组表达载体可以进一步包含能够使所述载体在所述宿主细胞中 复制的DNA序列。这种序列的例子(宿主细胞为哺乳动物细胞时)是SV 40复 制起点。所述载体还可以包含可选择标记，例如其产物弥补宿主细胞的缺陷 的基因，诸如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或赋予药物抗性例如新霉 素、潮霉素或甲氨蝶呤抗性的基因。
用于分别连接编码肽或全长蛋白质的DNA序列、启动子和终止子并将它 们插入到包含复制所必需的信息的适当载体中的方法是本领域技术人员熟 知的(参见例如Sambrook等，前面引用的)。
为了获得本发明的重组肽，有益地可以将编码DNA序列与第二个肽编码 序列和蛋白酶裂解位点编码序列融合在一起，提供编码融合蛋白的DNA构建 体，其中蛋白酶裂解位点编码序列位于HBP片段和第二个肽编码DNA之间， DNA构建体被插入到重组表达载体中，并在重组宿主细胞中表达。在一个实 施方案中，所述第二个肽选自但不限于包含谷胱甘肽-S-还原酶、小牛胸腺素、 细菌硫氧还蛋白或人泛素天然或合成变体、或其肽在内的组。在另一个实施 方案中，肽序列所包含的蛋白酶裂解位点可以是具有氨基酸序列IEGR的因子 Xa裂解位点、具有氨基酸序列DDDDK的肠激酶裂解位点、具有氨基酸序列 LVPR/GS的凝血酶裂解位点、或具有氨基酸序列XKX的水解无色杆菌 (Acharombacter lyticus)裂解位点。
表达载体导入到其中的宿主细胞可以是能够表达所述肽或全长蛋白质 的任何细胞，优选真核细胞，诸如无脊椎动物(昆虫)细胞或脊椎动物细胞， 例如爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞或哺乳动物细胞，特别是昆虫和哺乳动物 细胞。合适的哺乳动物细胞系的例子是HEK293(ATCC CRL-1573)、COS (ATCC CRL-1650)、BHK(ATCC CRL-1632、ATCC CCL-10)或CHO(ATCC CCL-61)细胞系。转染哺乳动物细胞并表达导入在所述细胞中的DNA序列的 方法描述于例如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.159，1982，pp.601-621； Southern和Berg，1982，J.Mol.Appl.Genet.1：327-341；Loyter等，1982，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 79：422-426；Wigler等，1978，Cell 14：725；Corsaro和 Pearson，1981，于Somatic Cell Genetics 7，p.603；Graham和van der Eb，1973， Virol.52：456；以及Neumann等，1982，EMBO J.1：841-845。
或者，真菌细胞(包括酵母细胞)可以用作宿主细胞。合适的酵母细胞的 例子包括糖酵母(Saccharomyces spp.)或裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces spp.) 细胞，特别是酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。其它真菌细胞的例 子是丝状真菌，例如曲霉(Aspergillus spp.)或脉孢霉(Neurospora spp.)，特别 是米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉(Aspergillus niger)的菌株。曲霉用于表 达蛋白质的用途描述于例如EP 238 023。
用于培养细胞的培养基可以是适合于培养哺乳动物细胞的任何常规培 养基，诸如含血清的或无血清的、含有合适添加物的培养基，或者用于培养 昆虫、酵母或真菌细胞的合适培养基。可从供应商那里获得合适的培养基， 或者也可以按照公开的配方(例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中的)制备合适的培养基。
然后，可以通过常规规程从培养液回收由细胞重组生产的肽或全长蛋白 质，所述常规规程包括通过离心或过滤从培养液分离宿主细胞，以盐例如硫 酸铵的手段沉淀上清液或滤出液的蛋白质组分，通过各种层析规程例如 HPLC、离子交换层析、亲和层析等等的纯化。
合成制备
合成生产肽的方法是本领域公知的。生产合成肽的详细说明和实践建议 可以在Synthetic Peptides：A User′s Guide(Advances in Molecular Biology)， Grant G.A.编，Oxford University Press，2002或者Pharmaceutical Formulation： Development of Peptides and Proteins，Frokjaer和Hovgaard编，Taylor和Francis， 1999中找到。
例如，可以利用Fmoc化学和Acm保护的半胱氨酸来合成肽。用反相HPLC 纯化后，可以进一步处理肽以获得例如环状或C-或N-末端修饰的同等型 (isoform)。环化和末端修饰的方法是本领域公知的，详细描述于上文引用的 手册中。
在一个优选实施方案中，本发明的肽序列以合成途径生产，特别是使用 序列辅助的肽合成(Sequence Assisted Peptide Synthesis，SAPS)法。
通过SAPS，肽可以在配备有过滤用的聚丙烯滤器的聚乙烯容器中分批 合成，或者使用用作N-α-氨基保护基团的9-芴甲氧羰基(Fmoc)或叔丁氧羰基 (Boc)和侧链官能基的合适公用保护基团在完全自动化的肽合成仪上以持续 流动型聚酰胺固相法(Dryland，A.和Sheppard，R.C.(1986)J.Chem.Soc.Perkin Trans.I，125-137)合成。
然后可以在合成后利用本领域公知的技术将个体肽序列配制为多聚体， 例如所述序列的二聚体可以通过WO 00/18791中描述的LPA法来获得，树枝 状聚合物可以通过PCT/US90/02039描述的MAP合成法来获得。
IV.抗体
本发明的一个目的是提供能够识别并选择性结合NGF、NT-3、NT-4/5、 BDNF上的表位的抗体、其抗原结合片段或重组蛋白，所述表位包含本发明 的基序或选自SEQ ID NO：1-26的序列或所述序列的片段。
术语“表位”指受到(抗原的)抗体识别(由此引起免疫应答)的(抗原分子上 的)特定原子群。术语“表位”与术语“抗原决定簇”等同。表位可以包含非常接 近的(诸如位于连续氨基酸序列中的，或者位于抗原氨基酸序列的远离部分 但由于蛋白质折叠已经相互靠近的)3个或更多个氨基酸残基，诸如例如4个、 5个、6个、7个、8个氨基酸残基。
抗体分子属于称为免疫球蛋白的血浆蛋白质家族，免疫球蛋白的基本构 件即免疫球蛋白折叠或结构域以多种形式用于免疫系统及其它生物识别系 统的许多分子中。典型的免疫球蛋白具有四条多肽链，包含称为可变区的抗 原结合区和称为恒定区的不变区。
天然抗体和免疫球蛋白通常为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两 条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。每条轻链由一个共价二硫键连 接于重链，然而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型重链之间有变化。每 条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链一端具有一个可变域 (VH)，接下来是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL)，在其另 一端具有一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一个恒定域排列在一起，轻 链可变域与重链可变域排列在一起。据信特定氨基酸残基形成轻链和重链可 变区之间的界面(Novotny J&Haber E.Proc Natl Acad Sci USA 82(14)：4592-6， 1985)。
依据其重链恒定域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类。 至少有五(5)大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可以进 一步分为亚类(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。 对应于不同免疫球蛋白类的重链恒定域分别称为alpha(α)、delta(δ)、 epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列 指定为称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种截然不同的型之一。不同类免疫球蛋 白的亚基结构和三维构造是公知的。
在抗体可变域的上下文中术语“可变”指抗体当中可变域的某些部分在 序列上差异非常大的事实。可变域用于结合并决定每种特定抗体对其特定抗 原的特异性。然而，可变性在整个抗体可变域中不是均匀分布的。在轻链和 重链可变域中，可变性都集中于称为互补决定区(CDR)也称为高变区的三个 区段。
可变域更加高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域 各自包含四个大量采用β-片层构象的FR区，其通过三个CDR相连，这三个 CDR形成连接β-片层结构的环，在一些情况下构成β-片层结构的一部分。每 条链中的CDR通过FR非常紧密地保持在一起，与另一条链中的CDR一起对 抗体的抗原结合部位的形成作出贡献。恒定域不直接涉及抗体与抗原的结 合，但展现多种效应器功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
如此，设想用于本发明的抗体可以具有多种形式中的任何一种，包括完 整免疫球蛋白，抗体片段诸如Fv、Fab、以及类似片段，包括可变域互补决 定区(CDR)的单链抗体等等形式，所有这些都落在本文所用广义术语“抗体” 的范围内。本发明设想了具有任何特异性的抗体的应用，多克隆的或单克隆 的，不限于识别并与特定抗原发生反应的抗体。在优选实施方案中，在下述 治疗方法和筛选方法的上下文中均使用在免疫上特异于本发明抗原或表位 的抗体或其片段。
术语“抗体片段”指全长抗体的一部分，通常指抗原结合区或可变区。抗 体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段。抗体的木瓜蛋白酶消化产生 两个相同的抗原结合片段，称为Fab片段，每个都具有单一的抗原结合位点， 和剩余的“Fc”片段，由于其易于结晶的能力而称为“Fc”片段。胃蛋白酶处理 产生具有能够交联抗原的两个抗原结合位点的F(ab′)2片段，和剩余的其它片 段(称为pFc′)。其他片段可包括双抗体、线性抗体、单链抗体分子、以及由 抗体片段形成的多特异性抗体。本文所用抗体的“功能性片段”指Fv、F(ab) 和F(ab′)2片段。
本文术语“抗体片段”可与术语“抗原结合片段”互换使用。
抗体片段可以短至约4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、 9个氨基酸、约12个氨基酸、约15个氨基酸、约17个氨基酸、约18个氨基酸、 约20个氨基酸、约25个氨基酸、约30个氨基酸或更多个氨基酸。通常本发明 的抗体片段可以具有任何尺寸上限，只要其相对于特异性结合如下表位的抗 体来说具有类似的或免疫学的特性，所述表位包含选自本文编号为SEQ ID NO：1-22的任一序列或所述序列的片段的肽序列。如此，本发明的上下文中 术语“抗体片段”等同于术语“抗原结合片段”。
抗体片段保留了一些与其抗原或受体选择性结合的能力。一些抗体片段 类型如下定义：
(1)Fab指包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段。Fab片段可以用木 瓜蛋白酶消化完整抗体产生完整轻链和一条重链的一部分而制备。
(2)Fab’指可以用胃蛋白酶处理完整抗体，之后还原以产生完整轻链和重 链的一部分而获得的抗体分子的片段。每个抗体分子获得两个Fab’片段。
(3)Fab′片段与Fab片段的不同在于重链CH1结构域的羧基末端添加了几 个残基，包括一个或多个来自抗体绞链区的半胱氨酸。
(4)(Fab’)2指可以用胃蛋白酶处理完整抗体随后不经还原而获得的抗体 片段。F(ab’)2指通过两个二硫键保持在一起的两个Fab’片段的二聚体。
(5)Fv是包含完整抗原识别与结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、 非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体(VH-VL二聚体)构 成。正是在这种构象中，每个可变域的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体 表面上确定了抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然 而，即便是单一的可变域(或者是只包含三个抗原特异性CDR的半个Fv)也具 有识别并结合抗原的能力，虽然其亲和力低于完整的结合位点。
(6)单链抗体(“SCA”)定义为包含通过适当的多肽接头连接的轻链可变 区、重链可变区的遗传工程化分子，其为遗传工程手段融合的单链分子。这 样的单链抗体也称为“单链Fv”或“sFv”抗体片段。通常，Fv多肽在VH和VL 结构域之间进一步包含多肽接头，其使sFv能够形成所需的用于抗原结合的 结构。有关sFv的综述参见Pluckthun，于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113：269-315，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，NY，1994。
(7)术语“双抗体(diabodies)”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所 述片段包含同一多肽链中相连的重链可变域(VH)的轻链可变域(VL) (VH-VL)。通过使用太短而不允许同一条链上的两个结构域配对的接头，迫 使所述结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。例如 EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90： 6444-6448(1993)中更为详细地描述了双抗体。
本发明既设想了能够结合本发明表位的多克隆抗体和单克隆抗体，也设 想了其能够结合本发明表位的抗原结合片段和重组蛋白。
多克隆抗体的制备是本领域技术人员熟知的。参见例如Green等，1992， Production of Polyclonal Antisera，于Immunochemical Protocols(Manson编)， 1-5页(Humana Press)；Coligan等，Production of Polyclonal Antisera in Rabbits， Rats，Mice and Hamsters，于Current Protocols in Immunology，第2.4.1节，这些 文献加入本文作为参考文献。
单克隆抗体的制备同样是常规的。参见例如Kohler和Milstein，Nature， 256：495-7(1975)；Coligan等，第2.5.1-2.6.7节；以及Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，726页，Cold Spring Harbor Pub.(1988)。单克隆抗体可以通 过多种成熟的技术从杂交瘤培养物分离和纯化。这些分离技术包括使用蛋白 A-Sepharose的亲和层析、大小排阻层析、和离子交换层析。参见例如Coligan 等，第2.7.1-2.7.12节和第2.9.1-2.9.3节；Barnes等，Purification of Immunoglobulin G(IgG).于Methods in Molecular Biology，1992，10：79-104， Humana Press，NY。
体外和体内操作单克隆抗体的方法是本领域技术人员熟知的。例如，根 据本发明使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤法制备，所述杂交瘤法由Kohler 和Milstein，1975，Nature 256，495-7首次描述，或者可以通过重组法制备，其 描述于例如US 4,816,567。供本发明使用的单克隆抗体也可以利用Clackson 等，1991，Nature 352：624-628以及Marks等，1991，J Mol Biol 222：581-597中描 述的技术从噬菌体抗体文库分离。另一种方法涉及将单克隆抗体人源化，所 述人源化通过重组手段制备包含人特定的和可识别的序列的抗体而实施。综 述参见Holmes等，1997，J Immunol 158：2192-2201和Vaswani等，1998，Annals Allergy，Asthma & Immunol 81：105-115。
本文所用术语″单克隆抗体″指由基本上同质的抗体群体获得的抗体，即 除了可能少量存在的天然发生的突变之外，构成所述群体的个体抗体是相同 的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。另外，与典型地包括 针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规多克隆抗体制品相反，每种单克隆 抗体针对抗原上的单个决定簇。在其特异性之外，单克隆抗体由于是通过杂 交瘤培养物合成的，不受其它免疫球蛋白的污染而具有优势。所述修饰语“单 克隆”指从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，不能理解为需要以任 何特定方法生产所述抗体。
本文中单克隆抗体特别包括″嵌合″抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻 链的一部分与源于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列 相同或同源，而链的其余部分与源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗 体中的相应序列相同或同源，以及这些抗体的片段，只要它们显示所需的生 物学活性(US 4,816,567；和Morrison等，1984，Proc Natl Acad Sci，81： 6851-6855)。
制备抗体片段的方法也是本领域已知的(参见例如，Harlow和Lane， Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1988，加 入本文作为参考文献)。本发明的抗体片段可以通过抗体的蛋白水解或者通 过在大肠杆菌中表达编码所述片段的DNA而制备。抗体片段可以通过完整抗 体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化的常规方法获得。例如，可以用胃蛋白酶酶 学裂解抗体，提供称为F(ab’)2的5S片段而制备抗体片段。可以利用硫醇还原 剂进一步裂解该片段，以及任选用到由二硫键裂解而来的巯基的封闭基团， 以制备3.5S Fab’单价片段。或者用胃蛋白酶酶学裂解直接制备两个单价Fab’ 片段和一个Fc片段。这些方法描述于例如US 4,036,945和US 4,331,647以及包 含于其中的参考文献。此处将这些专利文献整体加入作为参考文献。
也可以使用其它裂解抗体的方法，诸如分离重链形成单价轻链-重链片 段，进一步裂解片段，或者其它酶学、化学、或遗传技术，只要所述片段结 合由所述完整抗体识别的抗原。例如，Fv片段包含VH与VL链的结合。这种 结合可以是非共价的，或者可变链可以由分子间二硫键连接或者由化学药品 诸如戊二醛交联。优选Fv片段包含由肽接头连接的VH和VL链。这些单链抗 原结合蛋白(sFv)通过构建如下结构基因而制备，所述结构基因包含由寡核苷 酸连接的编码VH和VL结构域的DNA序列。将所述结构基因插入到表达载体 中，随后将表达载体导入到宿主细胞诸如大肠杆菌中。重组宿主细胞合成由 接头肽桥接两个V结构域的单个多肽链。例如，Whitlow等，1991，于Methods： A Companion to Methods in Enzymology，2：97；Bird等，1988，Science 242： 423-426；US 4,946,778；和Pack等，1993，BioTechnology 11：1271-77描述了制 备sFv的方法。
另一种形式的抗体片段是编码单一互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最 小识别单元”)通常涉及抗原识别和结合。CDR肽可以通过克隆或构建编码感 兴趣抗体的CDR的基因而获得。例如，利用聚合酶链式反应制备这些基因， 由生产抗体的细胞自RNA合成可变区。参见例如Larrick等，Methods：a Companion to Methods in Enzymology，Vol.2，p.106(1991)。
本发明设想了人和人源化形式的非人(例如鼠)抗体。这些人源化抗体是 包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列诸如表位识别序列的嵌合免疫球蛋 白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结 合子序列)。很大程度上，人源化抗体指其中来自受体互补决定区(CDR)的残 基被具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)CDR的残基所置 换的人免疫球蛋白(受体抗体)，所述非人物种为诸如小鼠、大鼠或兔。包含 本发明抗体最小序列诸如识别本文所述表位的序列的人源化抗体是本发明 的优选实施方案之一。
一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基由相应的非人残基所置换。此 外，人源化抗体可以包含在受体抗体和引入的CDR或框架序列中都未发现的 残基。构建了这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。总的来说，人源化抗 体基本上会包含至少一个、和典型地两个整个这样的可变区，其中所有的或 者基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且所有的或 者基本上所有的FR区均为人免疫球蛋白共有序列的FR区。最佳地，人源化 抗体还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)典型地人免疫球蛋白恒定区的至少一部 分。更多详情参见Jones等，1986，Nature 321，522-525；Reichmann等，1988， Nature 332，323-329；Presta，1992，Curr Op Struct Biol 2：593-596；Holmes等， 1997，J Immunol 158：2192-2201和Vaswani等，1998，Annals Allergy，Asthma & Immunol 81：105-115。
可以通过本领域用于制备多克隆和单克隆抗体的任何标准方法生产抗 体，利用人NGF、NT-3、NT-4/5、BDNF的天然或重组片段作为抗原，所述 片段包含选自SEQ ID NO：1-26的序列。也可以利用肽序列SEQ ID NO：1-26 的变体、同源物或片段制备这些抗体，所述变体、同源物和片段是满足下述 标准的免疫原性肽序列：
(i)为至少5个氨基酸的连续氨基酸序列；
(ii)包含本发明的基序。
也可以例如将根据本发明的免疫原性片段施用于个体，由待治疗的个体 在体内产生抗体。相应地，本发明进一步涉及包含上述免疫原性片段的疫苗。
本申请还涉及生产本发明的抗体的方法，所述方法包括提供上述免疫原 性片段的步骤。
本发明既涉及能够调控诸如增强或减弱NGF、NT-3、NT-4/5、BDNF的 生物学功能，特别是涉及神经细胞分化、存活和/或可塑性的功能的抗体，又 涉及能够识别和特异性结合后者所述蛋白质但不调控其生物学活性的抗体。
本发明涉及上述抗体用于1)调控人NGF、NT-3、NT-4/5、BDNF的活 性对治疗有益时的治疗性应用，2)诊断目的的体外和/或体内检测和/或监测 后者所述蛋白，3)研究目的的用途。
V.药物组合物
本发明还涉及包含如上定义的一种或多种复合物的药物组合物，其中所 述复合物能够刺激神经突长出和/或神经细胞分化、神经细胞存活和/或学习 和/或记忆。如此，本发明涉及能够刺激神经元细胞分化和/或刺激神经元细 胞再生、和/或刺激与学习和记忆有关的神经元可塑性、和/或刺激神经细胞 存活的药物组合物。
上下文中所用术语“药物组合物”与术语“药剂(medicament)”同义。
在组合物中，肽序列可以配制为包含上述分离的个体肽片段或其多聚体 或二聚体。
所述药物组合物在体外或体内可以具有针对细胞的上述效应，其中将所 述组合物施用于受试者。
本发明的药剂包含有效量的一种或多种上述定义的复合物，或者包含如 上定义的组合物与药学上可接受的添加剂的组合。可以适当地配制这种药剂 以用于口服、经皮、肌肉内、静脉内、颅内、鞘内、脑室内、鼻内或肺部给 药。
基于本发明复合物的药剂和组合物的剂型开发策略通常与基于任何其 它蛋白质的药物产品的剂型策略一致。几本教科书中讨论了潜在的问题以及 克服这些问题所需的教导，例如“Therapeutic Peptides and Protein Formulation. Processing and Delivery Systems”，A.K.Banga编，Technomic Publishing AG， Basel，1995。
可注射的制剂通常制备为液态溶液或悬浮液、适于在注射之前溶解于或 悬浮于液体中的固体形式。也可以乳化所述制品。通常将活性成分与药学上 可接受的且与所述活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为例如水、盐 水、右旋糖、甘油、乙醇等等及其组合。此外，需要的话，所述制品可以含 有少量辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、或提高制剂的效果或方 便其运输的辅助物质。
本发明复合物的制剂可以通过本领域技术人员已知的技术来制备。所述 制剂可以含有药学上可接受的载体和赋形剂，包括微球体、脂质体、微胶囊、 纳米颗粒等等。
可以适当地通过注射施用所述制品，任选在活性成分要发挥其效应的部 位注射。适合于其它给药方式的其他制剂包括栓剂、鼻腔的、肺部的以及一 些情况中口服的剂型。对于栓剂，传统的粘合剂和载体包括聚亚烷基二醇或 甘油三酯。这些栓剂可以由含有0.5％到10％，优选1-2％的活性成分的混合物 构成。口服制剂包括正常情况下使用的赋形剂，诸如例如药用级的甘露醇、 乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。这些组合物为溶液、 悬浮液、药片、药丸、胶囊、持续释放制剂或粉末的形式，通常含有10-95％ 的活性成分，优选25-70％。
其它制剂为适于鼻腔和肺部给药的制剂，诸如例如吸入剂和气雾剂。
活性复合物可以配制为中性或盐的形式。药学上可接受的盐包括酸加成 盐(与肽复合物的游离氨基一起形成)，其由无机酸诸如例如盐酸或磷酸或有 机酸诸如醋酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等等形成。由游离羧基形成的盐也 可以衍生自无机碱诸如例如氢氧化钠、钾、铵、钙、或铁，以及有机碱诸如 异丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇(ethylamino ethanol)、组氨酸、普鲁卡因等等。
所述制品以与剂量制剂相容的方式施用，这样的量将是治疗上有效的。 所要施用的量取决于所要治疗的受试者，包括例如受试者的体重和年龄、所 要治疗的疾病以及疾病的发展阶段。合适的剂量范围在正常情况下为每次给 药每公斤体重几百μg数量级的活性成分，优选范围为每公斤体重约0.1μg至 5000μg。使用单体形式的复合物时，合适的剂量通常为每公斤体重0.1μg至 5000μg的范围，诸如每公斤体重约0.1μg至3000μg的范围，尤其是每公斤体 重约0.1μg到1000μg的范围。使用多聚体形式的复合物时，合适的剂量通常 为每公斤体重0.1μg至1000μg的范围，诸如每公斤体重约0.1μg至750μg的范 围，尤其是每公斤体重约0.1μg到500μg的范围，诸如每公斤体重约0.1μg到 250μg的范围。特别是鼻腔给药时，使用比其它途径给药更小的剂量。可以 一次给药或者后续给药。剂量也将取决于给药途径，并且会随着所治疗的受 试者的年龄和体重而变化。多聚体形式的优选剂量介于每70kg体重1mg至 70mg。
对于一些适应征，优选局部或基本上局部用药。
本发明的一些复合物活性是足够的，但是对于其它一些复合物，如果所 述制品进一步包含药学上可接受的添加剂和/或载体则将增强其效力。这些添 加剂和载体将是本领域已知的。在一些例子中，包括促进活性物质向其目标 递送的化合物将是有益的。
许多情况下，多次施用所述制剂是必要的。可以连续输注给药，诸如心 室内输注，或者施用多剂，诸如一天多次、每天一次、一周多次、每周一次 等等。优选在个体已经遭受可能导致细胞死亡的因素之前或者之后不久开始 施用所述药剂。优选在所述因素出现8小时内施用所述药剂，诸如在所述因 素出现5小时内。许多复合物具有长期效应，由此可以以较长时间间隔施用 所述复合物，诸如1周或2周。
与神经导管(nerve guide)的应用有关，可以基于活性复合物的受控释放 连续或分为小份施用。此外，可以使用前体来控制释放速率和/或释放部位。 类似地，其他类型的植入物以及口服给药可以基于受控释放和/或前体的应 用。
如以上所讨论的，本发明涉及治疗个体以在体外或体内诱导神经细胞分 化、刺激其再生、可塑性和存活，所述治疗涉及施用有效量的上述一种或多 种复合物。
另一种给药策略是植入或注射能够表达和分泌所述复合物的细胞。由此 可以在其要发挥作用的部位产生所述复合物。
VI.治疗
又一方面，本发明涉及所述肽、或其片段、变体诱导神经细胞分化和/ 或刺激其再生、可塑性和/或存活的用途。所述用途是治疗、预防中枢和周围 神经系统、以及肌肉或多种器官的疾病和疾患。
在一个实施方案中，利用根据本发明的复合物/组合物进行治疗可用于诱 导植入或移植细胞的分化、调控其增殖、刺激其再生、神经元可塑性和存活。 这在使用具有长期效应的复合物时特别有用。
如此，所述治疗包括与中枢和周围神经系统疾病或疾患有关的细胞死亡 的治疗和/或预防，所述疾病或疾患为诸如手术后神经损伤(postoperative nerve damage)、外伤性神经损伤(traumatic nerve damage)例如由脊髓损伤 (spinal cord injury)引起的、神经纤维髓鞘形成减弱(impaired myelination of nerve fiber)、缺血后损伤(postischaemic damage)例如由中风(stroke)引起的、 多梗塞性痴呆(multiinfarct dementia)、多发性硬化(multiple sclerosis)、与糖尿 病有关的神经变性(nerve degeneration associated with diabetes mellitus)、神经- 肌肉变性(neuro-muscular degeneration)、精神分裂症(schizophrenia)、阿耳茨 海默氏病(Alzheimer’s disease)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、或亨廷顿氏 病(Huntington’s disease)。
同样，与肌肉有关的疾病或疾患，包括神经-肌肉连接机能减弱的疾患， 诸如遗传性或外伤性萎缩性肌肉病症(genetic or traumatic atrophic muscle disorder)；或者对于多种器官的疾病或疾患，诸如生殖腺、胰腺(诸如I型和 II型糖尿病)、肾脏(诸如肾病)的变性疾患(degenerative condition)的治疗来 说，根据本发明的复合物可用于诱导分化、调控增殖、刺激再生、神经元可 塑性和存活，即刺激存活。
在又一个实施方案中，所述复合物和/或药物组合物的用途是用于刺激学 习和/或短期和/或长期记忆的能力。
具体而言，本发明的复合物和/或药物组合物可用于治疗临床疾患，诸如 精神病(psychoses)，诸如老年性和早老性器质性精神疾患(senile and presenile organic psychotic conditions)、酒精中毒性精神病(alcoholic psychoses)、药物 性神经病(drug psychoses)、瞬时性器质性精神疾患(transient organic psychotic condition)、阿耳茨海默氏病、脑脂质沉积(cerebral lipidoses)、癫痫(epilepsy)、 全身性轻瘫(general paresis)[梅毒(syphilis)]、肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration)、亨廷顿氏舞蹈症(Huntington′s chorea)、雅-克二氏病 (Jakob-Creutzfeldt disease)、多发性硬化、脑的皮克氏病(Pick′s disease of the brain)、梅毒(syphilis)、精神分裂性障碍(Schizophrenic disorder)、情感性精神 病(affective psychoses)、神经症性障碍(neurotic disorder)、人格障碍(personality disorder)包括性格神经症(character neurosis)、与器质性脑病综合征(organic brain syndrome)有关的非精神病人格障碍(nonpsychotic personality disorder)、 偏执型人格障碍(paranoid personality disorder)、狂信型人格(fanatic personality)、类偏执性人格(障碍)(paranoid personality(disorder))、偏执狂 样特性(paranoid traits)、性偏离和紊乱(sexual deviations and disorders)、精神 发育迟缓(mental retardation)、神经系统和感觉器官的疾病、认知异常 (cognitive anomalies)、中枢神经系统的炎性疾病诸如脑膜炎(meningitis)、脑 炎(encephalitis)；脑变性(Cerebral degeneration)诸如阿耳茨海默氏病、皮克氏 病、脑的老年性变性(senile degeneration of brain)、交通性脑积水 (communicating hydrocephalus)、阻塞性脑积水(obstructive hydrocephalus)、帕 金森氏病包括其它锥体外束病(extra pyramidal disease)和异常运动障碍 (abnormal movement disorders)、脊髓小脑疾病(spinocerebellar disease)、小脑 性共济失调(cerebellar ataxia)、马里氏病(Marie′s)、桑格-布朗二氏病 (Sanger-Brown)、肌阵挛性小脑协同失调(Dyssynergia cerebellaris myoclonica)、原发性小脑变性(primary cerebellar degeneration)诸如脊髓性肌 萎缩(spinal muscular atrophy)、家族性(familial)、幼年型(juvenile)、成人型(adult) 脊髓性肌萎缩、运动神经元病(motor neuron disease)、肌萎缩性侧索硬化 (amyotrophic lateral sclerosis)、运动神经元病(motor neuron disease)、进行性 延髓性麻痹(progressive bulbar palsy)、假性延髓性麻痹(pseudobulbar palsy)、 原发性侧索硬化(primary lateral sclerosis)、其它前角细胞疾病(other anterior horn cell diseases)、未定性的(unspecified)前角细胞疾病、其它脊髓疾病、脊 髓空洞症(syringomyelia)和延髓空洞症(syringobulbia)、血管性脊髓病(vascular myelopathies)、急性脊髓梗塞(acute infarction of spinal cord)(栓塞性 (embolic))(非栓塞性(nonembolic))、脊髓动脉血栓形成(arterial thrombosis of spinal cord)、脊髓水肿(edema of spinal cord)、亚急性坏死性脊髓病(subacute necrotic myelopathy)、疾病分类中其它地方的亚急性脊髓混合变性(subacute combined degeneration of spinal cord)、脊髓病(myelopathy)、药物诱发的 (drug-induced)、辐射诱发的(radiation-induced)脊髓炎(myelitis)、自主神经系 统障碍(disorders of the autonomic nervous system)、外周自主(peripheral autonomic)、交感(sympathetic)、副交感(parasympathetic)或植物(vegetative) 系统障碍、家族性缺陷自主症(familial dysautonomia)[赖利-戴综合征 (Riley-Day syndrome)]、特发性周围自主神经病(idiopathic peripheral autonomic neuropathy)、颈动脉窦性晕厥或综合征(carotid sinus syncope or syndrome)、颈交感神经性营养不良或麻痹(cervical sympathetic dystrophy or paralysis)；疾病分类中其它地方的周围自主神经病(peripheral autonomic neuropathy)、淀粉样变(amyloidosis)、周围神经系统疾病、臂丛病损(brachial plexus lesions)、颈肋综合征(cervical rib syndrome)、肋锁综合征(costoclavicular syndrome)、前斜角肌综合征(scalenus anterior syndrome)、胸出口综合征 (thoracic outlet syndrome)、臂丛神经炎(brachial neuritis)或神经根炎(radiculitis) 包括新生儿的，炎性和毒性神经病(inflammatory and toxic neuropathy)包括急 性传染性多神经炎(acute infective polyneuritis)、吉兰-巴雷综合征 (Guillain-Barrésyndrome)、感染后多神经炎(Postinfectious polyneuritis)、胶原 血管病(collagen vascular disease)中的多神经病(polyneuropathy)、侵袭眼睛多 种结构的病症、化脓性眼内炎(purulent endophthalmitis)、耳和乳突疾病、新 生儿器官和软组织异常包括神经系统中的、分娩(labor and delivery)过程中施 用麻醉剂或其它镇静剂的并发症、皮肤病包括感染、循环不充分的问题、损 伤包括手术后的、压碎性损伤(crushing injury)、烧伤(burns)；对神经和脊髓 的损伤，包括神经分开(division ofnerve)、连续性病变(lesion in continuity)(有 或没有开放性伤口的)、创伤性神经瘤(traumatic neuroma)(有或没有开放性伤 口的)、外伤性瞬时麻痹(traumatic transient paralysis)(有或没有开放性伤口 的)、医疗过程中意外刺伤(puncture)或撕裂(laceration)、视神经和通道损伤、 视神经即第二脑神经损伤、视交叉损伤、视通道损伤、视皮层损伤、未定性 的失明、其它脑神经损伤、其它的和未定性的神经的损伤；药物、医学和生 物学物质中毒，遗传性或外伤性萎缩性肌肉病症；或者用于多种器官的疾病 或疾患的治疗，诸如生殖腺、胰腺(诸如I型和II型糖尿病)、肾脏(诸如肾 病)的变性疾患。
本发明的又一方面是生产药物组合物的方法，包括将有效量的一种或多 种本发明复合物、或者根据本发明的药物组合物与一种或多种药学上可接受 的添加剂或载体混合，为受试者施用有效量的至少一种所述复合物、或所述 药物组合物。
在上述方法的一个实施方案中，所述复合物与假体装置(prosthetic device) 组合使用，其中所述装置是修复性神经导管(prosthetic nerve guide)。如此， 另一方面，本发明涉及修复性神经导管，特征在于其包括一种或多种如上定 义的复合物或药物组合物。神经导管是本领域已知的。
本发明的另一方面涉及如上定义的复合物的用途。具体而言，根据本发 明的复合物的用途是用于生产药物组合物。所述药物组合物优选用于治疗或 预防以上提到的任一种疾病和疾患。
又一方面，本发明涉及通过施用本文定义的复合物以治疗上述疾病或疾 患的方法。
实施例
方法
培养物中原代神经元的神经突长出
解离的小脑神经元分离自7日龄的大鼠。在冰冷的改良Krebs Ringer溶液 中从脑中分离出小脑，去除血管，通过剁碎粗略地均质化，然后胰蛋白酶消 化。在DNA酶1和大豆胰蛋白酶抑制剂存在下清洗解离的细胞。出生后海马 神经元或小脑颗粒神经元(CGN)在添加有0.4％(w/v)牛血清清蛋白(BSA； Sigma-Aldrich)、2％(v/v)B27神经基质添加物(Neurobasal supplement)、1％ (v/v)glutamax、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2％1M HEPES(均来自 Gibco，BRL)的神经基质培养基(Neurobasal medium)中在未包被的8孔 permanox Lab-Tek腔式载玻片上以10,000细胞/cm2的密度铺板。24小时后，神 经元用4％(v/v)甲醛固定20分钟，此后用针对GAP-43的第一兔抗体和Alexa Fluor第二山羊抗兔Ig抗体免疫染色。对于每个个体实验中的每个组，通过之 前描述的计算机辅助的荧光显微术(等，2000)系统地获得至少200个神 经元的图像。简言之，用偶联到摄像机(Grundig Electronics，Germany)的带有 Nikon Plan 20x物镜的Nikon Diaphot倒置显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)记录。用 Protein Laboratory(Copenhagen，Denmark)开发的软件包Prima进行基于体视 学的神经突长度测定(等，2000)。
原代培养物中的神经元细胞存活
CGN原代培养物在添加有2％(v/v)B27、0.5％(v/v)glutamax、100U/ml 青霉素、100μg/ml链霉素和KCl的神经基质-A培养基(Gibco，BRL)中在聚-L- 赖氨酸包被的8孔permanox载玻片上以100,000细胞/cm2的密度铺板，其中KCl 在培养基中的终浓度为40mM。铺板后24小时，添加胞嘧啶-D-阿拉伯呋喃糖 苷(arabinofuranoside)(Ara-C；Sigma-Aldrich)至终浓度10μM，以避免神经胶质 细胞增殖，之后让神经元于37℃进一步分化6天。通过清洗两次并将培养基 改为添加有1％(v/v)谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素、3.5g d- 葡萄糖/L和1％(v/v)丙酮酸钠(Gibco BRL)以及不同浓度的肽的Eagle氏基本 培养基(BME；Gibco BRL)，来诱导凋亡性细胞死亡。由此，培养物中钾的浓 度降低到5mM KCl。诱导凋亡后两天，细胞用4％(v/v)甲醛固定并用Hoechst 33258染色(D’Merllo等，1993)。
外伤性脑损伤模型
通过将一块干冰(-78℃)直接敷用在小鼠头骨上30秒，敷用在大鼠头骨上 60秒而造成右侧顶额(fronto-parietal)皮层的病灶性脑损伤，如之前所详细描 述的(Penkowa等，2003)。
组织处理
在从取自固定的动物的器官切下的切片上实施组织化学和免疫组化。大 鼠和小鼠用Brietal深度麻醉，并用含肝素(heparine)的盐水(0.9％NaCl、3ml/L 5000IU肝素)心脏灌注冲洗2分钟，之后根据动物的大小用Zamboni氏固定剂 (pH 7.4)固定4-8分钟。对于免疫组化研究，解剖脑并在Zamboni氏固定剂中 后固定2-3小时，继分级醇(graded alcohol)之后在二甲苯中脱水，随后石蜡包 埋，然后贯穿整个冻伤部分切成3μm额切片(frontal section)。为了热诱导的表 位恢复，将所述切片置于柠檬酸盐缓冲液(pH 6或9)中在微波炉中煮沸10分 钟，之后于室温在含10％山羊血清(In Vitro，Fredensborg，DK)或驴血清(编号 BP 005.1；The Binding Site，Birmingham，UK)的tris缓冲盐水(TBS)/Nonidet P-40(0.01％)中温育30分钟。还将用于与单克隆小鼠衍生抗体一起温育的带 小鼠组织的切片与来自HistoMouse-SP试剂盒的封闭液A+B一起温育，以淬灭 内源性小鼠IgG(Zymed，CA，USA)。
免疫组化和组织化学
经过上述处理之后，于5℃将切片与下述第一抗体之一一起温育过夜： 在山羊血清中1∶100稀释的单克隆小鼠抗8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)(DNA氧 化的标志物；Chemicon，Temacula，CA，USA)；1∶250稀释的多克隆兔抗牛神 经胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)(星形细胞的标志 物；DakoCytomation)。用生物素化的第二抗体检测第一抗体，即与链霉亲合 素-生物素-过氧化物酶复合体一起温育30分钟。生物素化的番茄凝集素 (Sigma，，DK)用作小胶质细胞/巨噬细胞的标志物。凝集素染色如 制造商所述用链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合体(StreptABComplex/HRP； DakoCytomation，Glostrup，DK)进一步显影，于室温(RT)显影30分钟。以DAB 为色原体，用含0.015％H2O2的3，3’-二氨基联苯胺/TBS(DAB/TBS)使凝集素 反应产物显影。 NGF衍生肽
NGF-C2 CVLSRKAVRRA SEQ ID NO：7
NGF-D ETKCRDPNPVDSG SEQ ID NO：27
(N端截短一个aa的SEQ ID NO：1)
NGF-E RGIDSKHWNSY SEQ ID NO：19
NGF-C1 RIDTACV SEQ ID NO：5
NGF-EE TFVKALTMDGKQAAWR SEQ ID NO：15
NGF-N SSHPIFHRGEFS SEQ ID NO：11
BDNF衍生肽
BDNF-E RGIDKRHWNSQ SEQ ID NO：22
BDNF-EE SYVRALTMD SKKRIGWR SEQ ID NO：18
结果
实施例1：神经突长出的刺激
用不同浓度(3-81μg/ml)的肽NGF-C2、NGF-D、NGF-E、NGF-C1、 NGF-EE、BDNF-E或BDNF-EE处理如上制备的CGN。
从图1、2、4和5可以看到，包含指定结构基序的肽NGF-C2(基序II)、 NGF-E(基序III)、NGF-C1(基序I)、NGF-EE(基序III)、BDNF-E(基序III)或 BDNF-EE(基序III)均显著刺激来自培养物中的原代神经元的神经突长出。相 比之下，缺少基序I的必需疏水性残基的肽NGF-D不具有神经突发生活性(图 1)。
实施例2：神经元细胞存活的刺激
在体内和在体外都检验不同肽对神经元存活的影响。
对于体外试验，CGR神经元的培养物如上制备，并用不同浓度的NGF-E、 NGF-EE或NGF-N处理。
从图3可以看到，所有测试的肽都显著促进培养物中CGN的存活。
体内试验-通过将一块干冰(-78℃)直接敷用在小鼠头骨上30秒，敷用在 大鼠头骨上60秒而造成右侧顶额皮层的病灶性脑损伤，如之前所详细描述的 (Penkowa等，2003)。通过将一块干冰(-78℃)直接敷用在小鼠头骨上30秒，敷 用在大鼠头骨上60秒而造成右侧顶额(fronto-parietal)皮层的病灶性脑损伤， 如之前所详细描述的(Penkowa等，2003)。处理后，如下所述，于5℃将切片 与下述第一抗体之一一起温育过夜：在山羊血清中1∶100稀释的单克隆小鼠抗 8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)(DNA氧化的标志物；Chemicon，Temacula，CA， USA)；1∶250稀释的多克隆兔抗牛神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)(星形细 胞的标志物；DakoCytomation)。用生物素化的第二抗体检测第一抗体，即与 链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合体一起温育30分钟。生物素化的番茄凝 集素(Sigma，，DK)用作小胶质细胞/巨噬细胞的标志物。凝集素染 色如制造商所述用链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合体 (StreptABComplex/HRP；DakoCytomation，Glostrup，DK)进一步显影，于室温 (RT)显影30分钟。以DAB为色原体，用含0.015％H2O2的3，3’-二氨基联苯胺 /TBS(DAB/TBS)使凝集素反应产物显影。病变(lesion)之后的第(-1)天、第1 天和第3天通过皮下注射肽(10mg/kg/注射)处理动物。
用BDNF-EE肽处理病变大鼠导致氧化应激的抑制(表现为DNA氧化的 标志物8-羟基脱氧鸟苷的免疫染色)、小胶质细胞活化的抑制(表现为活化 的小胶质细胞的标志物番茄凝集素的结合)、和皮层星形细胞的活化(表现 为GFAP的免疫染色)。
实施例3：NGF和BDNF衍生肽与TrkA、TrkB、TrkC和P75的结合
表面等离振子共振(SPR)分析
于25℃，采用含有10mM Hepes，pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA和 0.005％P20的HBS-EP运行缓冲液，利用BIAlite仪器(Biacore AB，Uppsala，瑞 典)通过表面等离振子共振(SPR)分析NGF衍生肽NGF-C2、NGF-E、NGF-EE 和NGF以及BDNF衍生肽BDNF-C1、BDNF-C2、BDNF-E、BDNF-EE和BDNF 与Trk受体TrkA、TrkB、TrkC和P75受体的结合。在传感器芯片CM4上利用 胺偶联试剂盒如下固定TrkA、TrkB和TrkC受体以及p75NTR：用20μl活化液， N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N’-(3-二乙基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)活 化芯片，用30μl溶于50μl 10mM醋酸钠缓冲液(pH 4.0)中的4μl(0.5μg/ml)蛋白 质的混合物固定蛋白质；并用35μl封闭液(乙醇胺-HCl)封闭芯片。各配体注 射之间用15μl 2mM NaCl或10mM甘氨酸-HCl，pH 2.5使受体表面再生。本试 验中使用5μl/min的流速。
用相应于结合Trk受体或p75NTR受体和空白芯片之间的差异的曲线进行 分析。
计算得出的亲和常数(KD)列于表1。
表1
配体 TrkA/KD(M) TrkB/KD(M) TrkC/KD(M) P75/KD(M) NGF-C2 7.27x10-7 8.83x10-7 6.58x10-7 3.85x10-7 NGF-E (-) 2.54x10-7 1.06x10-6 2.60x10-6 NGF-EE (-) 1.03x10-8 5.19x10-8 2.26x10-7 NGF 4.63x10-9 9.94x10-9 3.56x10-8 1.65x10-8 BDNF-C1 (-) 1.04x10-6 3.50x10-6 1.20x10-6 BDNF-C2 (-) 4.08x10-8 1.11x10-7 3.31x10-7 BDNF-E (-) 1.73x10-7 6.97x10-7 5.56x10-7 BDNF-EE (-) 3.87x10-8 1.66x10-7 1.10x10-7 BDNF (-) 1.18x10-9 1.40x10-8 5.84x10-11
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