聚乙二醇缀合的糖皮质激素前体药物及其组合物和方法
阅读：769发布：2020-09-02
专利汇可以提供聚乙二醇缀合的糖皮质激素前体药物及其组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 申请 公开了基于聚乙二醇(PEG)的糖皮质 激素 前药的制备方法和可用于 治疗 的 疾病 和病症。具体而言，本发明申请披露了PEG缀合的地塞米松化合物及其用于治疗炎性和 自身免疫性疾病 (包括，但不限于红斑狼疮)的方法。，下面是聚乙二醇缀合的糖皮质激素前体药物及其组合物和方法专利的具体信息内容。
1.如式(I)所示的化合物：
或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前体药物，其中：
n是3至500的整数；
m是1至5的整数；
w是1至5的整数；
A无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，含六到十个碳的亚芳基；
B无基团，或为NR4，O，C(O)；
D无基团，或为NR4，O，C(O)，CR5R5；
E无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，能够连接两个或更多个R2基团的分支结构的连接基团，该连接基团可包含一个，两个或更多个含O，S和N的杂原子；
G无基团，或为NR4或O；
P无基团，或为C(O)；
Q无基团，或为含含六到十个碳的亚芳基，一到六个碳的亚烷基；
T无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，含六到十个碳的亚芳基，C(O)；
X无基团，或为O，S,NR4；
Y无基团，或为C(O)，含六到十个碳的亚芳基，含一到六个碳的亚烷基；
Z无基团，或为NR4，O，含一到六个碳的亚烷基，能够连接一个或多个地塞米松可包含一个或杂原子O，S和N的分枝结构；
R1为H，或为含一到六个碳的烷基，含二到六个碳的烯基，含二到六个碳的炔基，含六到十个碳的芳基，五到十元杂芳基或五到十元杂环基，除H以外的每个基团均可被1至5个取代基取代，如含一到四个碳的烷基，含一到四个碳的卤代烷基，卤素，氧代(＝O),-NRaRb,-
3 3 1 2
NO2,-CN,-OR ,和SR；或者R可和另一端的-CH2-A-B-D-E-(R)m相同；
R3可为H，或含一到四个碳的烷基或卤代烷基；
R4可为H，或含一到四个碳的烷基；
R5可为H，含一到四个碳的烷基或卤代烷基；
a b
R和R可为H或含一到四个碳的烷基；
当A，B，D，E，G，P，Q，T，X，Y和Z基团中的任何一个不存在时，其两个可用的相邻基团彼此直接单键连接。
2.根据权利要求1中所述的化合物，其中E是能够连接两个或更多个R2基团的分支结构的连接基团，该连接基团可包含一个，两个或更多个含O，S和N的杂原子；
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中Z是包含能够共价键合至两个或更多个地塞米松的具有分支结构的连接基团，所述连接基团任选地包含一个或多个独立地选自O，S和N的杂原子。
4.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中E和Z可为无基团，或含一到四个碳的亚烷基，基于氨基酸、柠檬酸、甘油、三(2-氨基乙基)胺、季戊四醇、戊酸等及其衍生的具有分枝的结构，分别如下所示：
其中i和j可为0或1至5的整数。
5.如权利要求4所述的化合物，其中：
w是1；
Z无基团，或为含一到四个碳亚烷基；
E为包含如下所示的分枝结构：
6.权利要求1的化合物，其中m是1；w是1；并且A，B，D，E和Z基团均不存在，则其结构为(II)：
7.如权利要求6所述的化合物，其中R1是CH3；Y是C(O)；X是NH；并且T，Q，P和G基团均不存在，则其结构为：
8.权利要求5的化合物，其中A是C(O)；B和D无基团；E是基于氨基酸的连接结构；m是2；w是1；Z和Y基团，且X为NH，其结构如下图(III)所示：
或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前药，其中：
i＝0或1至5的整数；
j＝0或1至5的整数；
G无基团，或为NR4或O；
P无基团，或为C(O)；
Q无基团，或为含六到十个碳的亚芳基，含一到六个碳的亚烷基；
T无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，含六到十个碳的亚芳基，C(O)；
X无基团，或为O，S,NR4；
Y无基团，或为含一到六个碳的亚烷基；
R1为H，或为含一到六个碳的烷基，含二到六个碳的烯基，含二到六个碳的炔基，含六到十个碳的芳基，五到十元杂芳基或五到十元杂环基，除H以外的每个基团均可被1至5个取代基取代，如含一到四个碳的烷基，含一到四个碳的卤代烷基，卤素，氧代(＝O),-NRaRb,-NO2,-CN,-OR3,和SR3；
R3可为H，含一到四个碳的烷基或卤代烷基；
R4可为H或含一到四个碳的烷基；
a b
R和R可为H或含一到四个碳的烷基；
当G，P，Q，T，X，和Y基团中的任何一个不存在时，其两个相邻基团彼此直接单键连接。
9.权利要求8的化合物，其中i是0；j是2；E是基于谷氨酸的分枝结构：
10.权利要求8的化合物，其中i是0，j是2，X是NH；Q是亚甲基，P是C(O)，G是NH，则其分子结构为：
11.权利要求5的化合物，其中A是亚甲基，B是NH，m是1，w是2，E是基于柠檬酸的分枝结构，Z是NH，则其分子结构为(IV)：
或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前药，其中：
i＝0或1至5的整数；
j＝0或1至5的整数；
G无基团，或为NR4或O；
P无基团，或为C(O)；
Q无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，含六到十个碳的亚芳基；
T无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，含六到十个碳的亚芳基，C(O)；
X无基团，或为O，S,NR4；
Y无基团，或为含一到六个碳的亚烷基；
1
R为H，或为含一到六个碳的烷基，含二到六个碳的烯基，含二到六个碳的炔基，含六到十个碳的芳基，五到十元杂芳基或五到十元杂环基，除H以外的每个基团均可被1至5个取代基取代，如含一到四个碳的烷基，含一到四个碳的卤代烷基，卤素，氧代(＝O),-NRaRb,-NO2,-CN,-OR3,和SR3；
3
R可为H，含一到四个碳的烷基或卤代烷基；
R4可为H或含一到四个碳的烷基；
Ra和Rb可为H或含一到四个碳的烷基；
当G，P，Q，T，X，和Y基团中的任何一个不存在时，其两个可用的相邻基团彼此直接单键连接。
12.权利要求11的化合物，其中G，P，Q，T，X和Y基团均不存在时，其分子结构为：
13.权利要求5的化合物，其中m为3，w为1，A为亚甲基，B为NH，D为C(O)且E基于季戊四醇的分枝结构，则其分子结构为(V)：
14.权利要求13的化合物，其中Y是C(O)；X是NH；并且G，P，Q和T基团均不存在，则其分子结构为：
15.权利要求1的化合物，其具有式(VI)－(XI)中所示任何一个的结构：
其中R为包含以下结构的基团：
和
其中k均可为1至10的整数。
16.权利要求15的化合物，其中E是具有基于谷氨酸的分枝结构：
17.结构式如(XII)所示的化合物：
或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前药，其中：
n是3至500的整数；
m是1至5的整数；
w是1至5的整数；
GC是糖皮质激素药物分子部分
A无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，含六到十个碳的亚芳基；
B无基团，或为NR4，O，C(O)；
D无基团，或为NR4，O，C(O)，CR5R5；
E无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，能够连接两个或更多个R2基团的分枝结构的连接基团，该连接基团可包含一个，两个或更多个含O，S和N的杂原子；
4
G无基团，或为NR或O；
P无基团，或为C(O)；
Q无基团，或含六到十个碳的亚芳基，为含一到六个碳的亚烷基；
T无基团，或为C(O)，含一到六个碳的亚烷基，含六到十个碳的亚芳基；
4
X无基团，或为O，S,NR；
Y无基团，或为C(O)，含六到十个碳的亚芳基，含一到六个碳的亚烷基；
Z无基团，或为NR4，O，含一到六个碳的亚烷基，能够连接一个或多个地塞米松部分可包含一个或杂原子O，S和N的分枝结构；
1
R为H，或为含一到六个碳的烷基，含二到六个碳的烯基，含二到六个碳的炔基，含六到十个碳的芳基，五到十元杂芳基或五到十元杂环基，除H以外的每个基团均可被1至5个取代基取代，如含一到四个碳的烷基，含一到四个碳的卤代烷基，卤素，氧代(＝O),-NRaRb,-NO2,-CN,-OR3,和SR3；或者R1可和另一端的-CH2-A-B-D-E-(R2)m相同；
R3可为H，含一到四个碳的烷基或卤代烷基；
R4可为H或含一到四个碳的烷基；
R5可为H，含一到四个碳的烷基或卤代烷基；
Ra和Rb可为H或含一到四个碳的烷基；
当A，B，D，E，G，P，Q，T，X，Y和Z基团中的任何一个不存在时，其两个相邻基团彼此直接单键连接。
18.权利要求17的化合物或其药学上可接受的盐，溶剂合物或前药，其具有如下结构(XIII)至(XVIII)：
其中R为包含糖皮质激素药物分子的基团。
19.如权利要求17或18所述的化合物或其药学上可接受的盐，溶剂合物或前药，其中所述糖皮质激素药分子为如下图所示的分子：
20.如权利要求1至19中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前药，其中n为40至50。
21.如权利要求1至19中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，溶剂合物或前药，其中n为42。
22.包含根据权利要求1至19中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前药的组合物，以及药学上可接受的载体，辅剂，稀释剂或媒介物。
23.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述组合物为口服，鼻腔，局部，口腔，舌下，直肠，阴道，静脉内或其他注射给药形式。
24.根据权利要求22或23所述的药物组合物，所述药物组合物被用于汽化，喷雾，纳米颗粒或脂质体等制剂中。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的组合物，还可进一步包含第二个治疗药物，该药物可以选自NSAIDs(非甾体抗炎药物，例如阿司匹林，萘普生，塞来昔布)，糖皮质激素(例如地塞米松，泼尼松，倍他米松)，DMARDs(可缓解疾病的抗风湿药物，如甲氨蝶呤，来氟米特，柳氮磺胺吡啶，羟基氯喹)以及生物药物。
26.一种治疗自身免疫性疾病和/或炎症性疾病的方法，包括向需要治疗的患者施用有效剂量的药物。该药物可以是权利要求1至19中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，溶剂合物或前药。
27.权利要求26的方法，其中所述疾病或病症是系统性红斑狼疮，狼疮肾炎，最小变化疾病，局灶节段性肾小球硬化症，IgA肾病，移植排斥，类风湿性关节炎，骨关节炎，牛皮癣，强直性脊柱炎，血管炎，多发性硬化症，系统性硬化症，痛风，葡萄膜炎，哮喘，囊性纤维化，慢性阻塞性肺病，特应性皮炎(湿疹)，败血症，炎性肠病，创伤性脑损伤，脊髓损伤，缺血再灌注损伤，异位骨化，肉芽肿等。
28.权利要求26或27所述的方法，还包括向所述患者施用第二治疗剂。
29.一种治疗与狼疮有关的疾病或病症的方法，其包括向需要治疗的患者施用有效剂量的药物。该药物可以是权利要求22至25中任一项的药物组合物。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述患者是哺乳动物。
31.如权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述患者是人。
32.使用权利要求1至19中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前药用于制备治疗与狼疮相关的疾病或病症的药物。
33.关于权利要求32的用途，其中所述疾病或病症可以是系统性红斑狼疮，皮肤红斑狼疮，光敏感，皮肤血管疾病，非秃头症，口腔溃疡，指甲和毛细血管改变，丘疹结节性粘液病，大疱性红斑狼疮，甜综合征，脓皮病坏疽，皮状嗜中性粒细胞肉芽肿性皮炎，无菌性脑膜炎，脑血管病，脱髓鞘综合征，头痛，运动障碍，脊髓病，惊厥失常，急性混淆状态，焦虑症，认知功能障碍，情绪障碍，精神病，吉兰-巴雷(Guilain-Barré)综合征，自主神经病，单神经病，重症肌无力，颅神经病，多发性神经病，狼疮肾炎，心包炎，冠状动脉血管炎，冠状动脉粥样硬化，血管炎，胸膜炎，胸腔积液，急性狼疮肺炎，弥漫性肺泡出血，慢性间质性肺病萎缩肺综合征，肺动脉高压，血栓栓塞，环杓关节炎和狼疮性肝炎，干燥综合征，食管炎，西瓜胃，嗜酸性胃肠炎，腹痛，肠血栓形成，炎性肠病，蛋白质丢失性肠病，脂肪吸收不良，腹腔疾病，慢性肠假性梗阻，淀粉样变性，腹膜炎症，胰腺炎，脾肿大，自身免疫性溶血性贫血，免疫性血小板减少性紫癜，白细胞减少症，关节痛，关节炎，肌腱断裂，肌炎，骨坏死，骨质疏松症等。
聚乙二醇缀合的糖皮质激素前体药物及其组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
技术领域
背景技术
[0004] 红斑狼疮是一种临床上具有挑战性的自身免疫性风湿病，目前的疗法在病情缓解和毒性控制方面都不令人满意。红斑狼疮的病理特征在于B细胞和T细胞的超活化，自身抗体的过度生成以及免疫复合物在各种组织/器官中的沉积。红斑狼疮的症状非常多样复杂，包括皮疹，关节炎，心包炎，神经精神障碍和肾炎。据估计，150万美国人受狼疮影响，患者人数不断增加。狼疮性肾炎是红斑狼疮最具破坏性的并发症之一，也是造成患者发病和死亡的主要原因。狼疮性肾炎直接造成30-60％的狼疮患者的免疫抑制和死亡。在美国，大约35％的成年狼疮患者在诊断时有肾炎的临床证据。另外15-25％将在诊断后的10年内发展为肾炎。狼疮性肾炎由肾脏的肾小球和肾小管内的免疫复合物沉积以及随后激活导致肾组织损伤的免疫效应细胞(如巨噬细胞和嗜中性粒细胞)引发。如果控制不当，狼疮性肾炎可以迅速发展，损伤肾功能并最终导致肾功能衰竭。
[0005] 虽然临床医生已经使用多种药物来治疗狼疮，但只有少数已被美国食品药物管理局批准用于该疾病。它们包括阿司匹林，贝利单抗(抑制B细胞活化因子的人单克隆抗体)，抗疟药(例如氯喹)和糖皮质激素(GC，例如泼尼松，地塞米松)。在这些治疗选项中，糖皮质激素是治疗狼疮最有效和最广泛使用的药物之一。在美国风湿病学会(ACR)关于狼疮性肾炎临床管理的新指南中，推荐的治疗方案包括高剂量脉冲糖皮质激素，然后是低/高剂量每日糖皮质激素联合免疫抑制药物。与先前的指南相比，新的免疫抑制剂(例如麦考酚酸吗乙酯)已被添加作为环磷酰胺的替代物。目前还没有任何药物能替代糖皮质激素。不同于糖皮质激素已作为治疗缓解大多数狼疮症状的治疗手段，贝利单抗在治疗狼疮性肾炎中的临床益处尚未确定。另一方面，非甾体抗炎药物由于其肾毒性而禁用于狼疮性肾炎。
[0006] 由于其强效的抗炎功效和相关替代疗法的缺乏，糖皮质激素仍然是红斑狼疮临床治疗的主要手段。短期激素治疗可以有效控制一些狼疮病症，如关节炎和皮疹。更严重的狼疮并发症，如进行性肾炎，则需要长期激素治疗。这种治疗通常会引发严重副作用，主要涉及内分泌，心血管，造血和肌肉骨骼系统。这些副作用严重影响狼疮患者的病情。
[0007] 糖皮质激素的行为被认为是通过两种不同的途径介导的：反式激活和反式抑制。据推测，反式抑制主要介导糖皮质激素的抗炎作用，而反式激活导致糖皮质激素相关的副作用。目前已经开发了可以优先激活反式阻抑的化合物。尽管如此，这些化合物并不具有严格的途径选择性，因而仍然引发糖皮质激素相关的副作用。
[0008] 发明简介
[0009] 为解决前述各种问题，本申请公开了糖皮质激素(GC)前药和使用它们治疗红斑狼疮和红斑狼疮肾炎的方法。这些包含地塞米松(Dex)并基于聚乙二醇(PEG)的大分子前药(PEG-DiDex)，可自组装成胶束。
[0010] 一方面，本发明提供了式(I)或(XII)的化合物：
[0011]
[0012] 或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前药，其中：
[0013] n是3至500的整数；
[0014] m是1至5的整数；
[0015] w是1至5的整数；
[0016] GC是糖皮质激素药物分子部分
[0018] B无基团，或为NR4，O，C(O)；
[0019] D无基团，或为NR4，O，C(O)，CR5R5；
[0020] E无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，能够连接两个或更多个R2基团的分支结构的连接基团，该连接基团可包含一个，两个或更多个含O，S和N的杂原子；
[0021] G无基团，或为NR4或O；
[0022] P无基团，或为C(O)；
[0023] Q无基团，或为含六到十个碳的亚芳基，含一到六个碳的亚烷基；
[0024] T无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，含六到十个碳的亚芳基，C(O)；
[0025] X无基团，或为O，S,NR4；
[0026] Y无基团，或为C(O)，含六到十个碳的亚芳基，含一到六个碳的亚烷基；
[0027] Z无基团，或为NR4，O，含一到六个碳的亚烷基，能够连接一个或多个地塞米松的可包含一个或杂原子O，S和N的分枝结构；
[0028] R1为H，或为含一到六个碳的烷基，含二到六个碳的烯基，含二到六个碳的炔基，含六到十个碳的芳基，五到十元杂芳基或五到十元杂环基，除H以外的每个基团均可被1至5个a b取代基取代，如含一到四个碳的烷基，含一到四个碳的卤代烷基，卤素，氧代(＝O),-NRR ,-NO2,-CN,-OR3,和SR3；或者R1可和另一端的-CH2-A-B-D-E-(R2)m相同；
[0029] R3可为H，含一到四个碳的烷基或卤代烷基；
[0030] R4可为H，或含一到四个碳的烷基；
[0031] R5可为H，含一到四个碳的烷基或卤代烷基；
[0032] Ra和Rb可为H或含一到四个碳的烷基；
[0033] 当A，B，D，E，G，P，Q，T，X，Y和Z基团中的任何一个不存在时，其两个相邻基团彼此直接单键连接。
[0034] 另一方面，本发明提供药物组合物，其包含根据本文所述的任何一个实施方案的化合物或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前药以及药学上可接受的载体，助剂，稀释剂或媒介物。
[0036] 另一方面，本发明提供了治疗与狼疮有关的疾病或病症的方法，其包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的本文公开的任何实施方案的药物组合物。
[0037] 另一方面，本发明提供了根据本文公开的任何实施方案或任何实施方案组合的化合物或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前药在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途，特别是用于治疗红斑狼疮。
[0038] 通过对糖皮质激素纳米化前体药物的开发，基于PEG的地塞米松(Dex)大分子前体药物能够克服毒糖皮质激素在临床应用上所面临的各种挑战包括严重的毒副作用，从而全面发挥糖皮质激素在临床上治疗红斑狼疮肾炎的潜力。不受理论束缚，本发明部分基于纳米药物可渗漏通过炎症部位血管系统并随后被炎症细胞内吞的ELVIS机理。根据该机理，纳米药物会显着改变原药的药代动力学/生物分布(PK/BD)状况，从而有利于药物在发炎组织/器官中的特异性积聚。有鉴于PEG链的非免疫原性，该前药设计将有可能延长原药血液循环时间并增强其在肾中的滞留。具体而言，该前药为两亲分子，可自组装为胶束。在患有严重肾炎的红斑狼疮的小鼠模型(NZB/W F1)中进行测试时，每月一针的前药治疗在改善肾功能方面表现出优于等剂量每日Dex治疗的疗效，并且没有观察到与糖皮质激素相关的副作用。
[0040] 附图简要说明
[0041] 图1为基于聚乙二醇(PEG)的两亲性地塞米松大分子前药PEG-DiDex的结构设计图，其可以自组装成胶束。
[0043] 图3为PEG-DiDex在37℃的乙酸盐缓冲液(pH＝5.0)中释放Dex的曲线图。为保证释放过程始终在处于漏槽状态的介质进行，缓冲液中加有氟化F127。
[0044] 图4证实PEG-DiDex(每月给药一次)对患有严重肾炎的28周龄NZB/WF1雌性小鼠的疗效明显优于同等总剂量的Dex(每日给药一次)。(A)PEG-DiDex组中60％的NZB/W F1小鼠的尿蛋白恢复正常水平。，而在2个月治疗结束时，Dex组仅18％的小鼠的尿蛋白正常化。PT为治疗前。(B)显示PEG-DiDex，Dex和盐水处理组小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。如图所示，只有PEG-DiDex治疗组的小鼠在2个月的试验终点达到100％的存活。
[0045] 图5为各治疗组小鼠经2个月试验后肾脏的组织学评估。肾组织经福尔马林固定后切片(3μm)并以高碘酸希夫(PAS)染色，由病理学家采用盲法4级量化评估。(A)-(D)分别为生理盐水对照组，Dex治疗组，PEG-DiDex治疗组以及NZW健康小鼠对照组PAS染色的肾切片，标尺均为20μm。；(E)显示为经组织学评估各组患有中轻度，中度和重度肾病的小鼠所占比例；(F)显示为经组织学评估各组呈现有异常肾小球的小鼠所占百分比。
[0046] 图6说明经PEG-DiDex治疗的小鼠血清炎性细胞因子水平降低。
[0047] 图7说明经两个月PEG-DiDex胶束治疗后的NZB/W F1小鼠没有显示典型的糖皮质激素毒性症状。(A)PEG-DiDex胶束治疗法维持骨密度(BMD)的效力显示优于Dex治疗法；(B)PEG-DiDex胶束组小鼠的骨量/组织体积(BV/TV)呈现出高于Dex组和生理盐水组小鼠的骨量/组织体积(BV/TV)的趋势；(C)PEG-DiDex胶束组的骨小梁厚度(Tb.Th.)值显著高于Dex和盐水组；(D)PEG-DiDex胶束组的小鼠白细胞水平显著高于Dex组；(E)不同于Dex组，PEG-DiDex组小鼠没有出现可能由Dex免疫抑制作用所引起的相总血清IgG水平的显着降低；(F)与Dex治疗组不同，PEG-DiDex治疗没有导致肾上腺萎缩。星号(*)表示统计学显着性差异(P<0.05)。
[0048] 图8说明了以IRDye标记的PEG-DiDex在NZW健康小鼠体内组织分布作为对照，IRDye标记的PEG-DiDex具有对NZB/W F1小鼠炎性肾组织的被动靶向作用，。IRDye标记的PEG-DiDex通过尾静脉被注射入小鼠体内。小鼠在给药后1天和4天被处死，心脏(he)，肺(lu)，肾脏(kd)，肝脏(lv)，脾脏(sp)和肾上腺(ad)被分离并进行近红外成像。彩色编码显示不同的信号强度从而反应各器官内PEG-DiDex的分布水平。
[0049] 图9说明了不同治疗方案对血清抗dsDNA IgG水平的影响。Dex显着降低小鼠血清中dsDNA抗体的水平，但PEG-DiDex却没有此作用。
[0050] 图10说明PEG-DiDex改善白蛋白尿，延长存活期并减轻重度肾炎的发展。(A)显示生理盐水组(n＝12)，Dex治疗组(n＝11)和PEG-DiDex治疗组(n＝11)在治疗前(PT)和治疗第8周时的尿蛋白数据。各小组的右上方显示该小组在第8周时间点的尿蛋白阳性的发生率(％)。(B)显示了每个治疗组的Kaplan-Meier存活曲线。
具体实施方式
[0051] 与母体药物Dex相比，基于聚乙二醇的糖皮质激素前体药物具有优异的治疗效果以及显著降低的毒副作用。
[0052] 具体而言，近红外成像，免疫组织化学和流式细胞术研究表明，近红外染料(IRDye)标记的PEG-DiDex胶束在全身系统给药后主要分布于炎性肾脏，通过被肾小球系膜细胞和近端小管上皮细胞的吞噬作用。前药胶束的疗效及安全性评价则通过对NZB/W F1雌性小鼠(28周龄)尾静脉注射给药(每月一次)进行进行了评价。对照组包括同等剂量当量的地塞米松磷酸钠经每日一次尾静注射给药和生理盐水经每月一次尾静脉注射。与Dex组相比，PEG-DiDex显著提高了NZB/W F1小鼠的存活率，显示出更有效的恢复尿蛋白水平的作用，且未呈现明显的糖皮质激素的相关的系统毒性(即WBC减少，总IgG降低，肾上腺萎缩和骨质减少)。PEG-DiDex处理的动物在治疗2个月后也表现出较低的促炎细胞因子(例如MCP-1，IFN-β，IFN-γ等)的血清水平和肾炎减轻的组织学指征。但它对血清抗dsDNA抗体水平没有影响。总的来说，这些证据表明PEG-DiDex的新型前药胶束设计可以通过被动地将药物靶向至炎性肾脏从而显着改变Dex的生物分布特性，具体表现为在炎性肾脏的靶向分布模式从而增强并延长Dex在肾脏局部抗炎作用。其杰出的安全性可能归因于显著降低的Dex在全身的分布水平。
[0053] 一方面，本发明提供了式(I)的化合物：
[0054]
[0055] 或其药学上可接受的盐，溶剂合物或前药，其中：
[0056] n是3至500的整数；
[0057] m是1至5的整数；
[0058] w是1至5的整数；
[0059] A无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，含六到十个碳的亚芳基；
[0060] B无基团，或为NR4，O，C(O)；
[0061] D无基团，或为NR4，O，C(O)，CR5R5；
[0062] E无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，能够连接两个或更多个R 2基团的分枝结构的连接基团，所述连接基团可包含一个，两个或更多个含O，S和N的杂原子；
[0063] G无基团，或为NR4或O；
[0064] P无基团，或为C(O)；
[0065] Q无基团，或为含六到十个碳的亚芳基，含一到六个碳的亚烷基；
[0066] T无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，含六到十个碳的亚芳基，C(O)；
[0067] X无基团，或为O，S,NR4；
[0068] Y无基团，或为C(O)，含六到十个碳的亚芳基，含一到六个碳的亚烷基；
[0069] Z无基团，或为NR4，O，含一到六个碳的亚烷基，能够连接一个或多个地塞米松部分可包含一个或杂原子O，S和N的分枝结构；
[0070] R1为H，或为含一到六个碳的烷基，含二到六个碳的烯基，含二到六个碳的炔基，含六到十个碳的芳基，五到十元杂芳基或五到十元杂环基，除H以外的每个基团均可被1至5个取代基如含一到四个碳的烷基，含一到四个碳的卤代烷基，卤素，氧代(＝O),-NRaRb,-NO2,-3 3 1 2
CN,-OR ,SR；或者R和另一端的-CH2-A-B-D-E-(R)m相同；
CN,-OR ,SR；或者R和另一端的-CH2-A-B-D-E-(R)m相同；
[0071] R3可为H，含一到四个碳的烷基或卤代烷基；
[0072] R4可为H或含一到四个碳的烷基；
[0073] R5可为H，含一到四个碳的烷基或卤代烷基；
[0074] Ra和Rb可为H或含一到四个碳的烷基；
[0075] 并且其中当基团A，B，D，E，G，P，Q，T，X，Y和Z基团中的任何一个不存在时，其两个相邻基团彼此直接单键连接。
[0076] 具体来说，E是包含能够共价键连接两个或更多个R2基团具有分枝的结构，该分枝结构可包含一个或多个O，S和N等杂原子。
[0077] 具体来说，Z是包含能够共价结合两个或多个地塞米松单元的具有分枝的结构，该分枝结构可包含一个或多个O，S和N等杂原子。
[0079]
[0080] i和j可为0或1至5的整数。
[0081] 具体来说，
[0082] w是1；
[0083] Z无基团或为含一到四个碳的烷基；
[0084] E为包含下列分枝结构的基团：
[0085]
[0086] 具体来说，m是1；w是1；并且A，B，D，E和Z无基团，则其分子结构如式(II)所示：
[0087]
[0088] 又如，R1是CH3；Y是C(O)；X是NH；并且T，Q，P和G无基团，则其分子结构如下式所示：
[0089]
[0090] 又如，A是C(O)；B和D不存在；E是基于氨基酸分枝基团；m是2；w是1；Z和Y无基团，且X为NH，则其分子结构如式(III)所示：
[0091]
[0092] 或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前药，其中：
[0093] i＝0或1至5的整数；
[0094] j＝0或1至5的整数；
[0095] G无基团，或为NR4，O；
[0096] P无基团，或为C(O)；
[0097] Q无基团，或为含六到十个碳的亚芳基，含一到六个碳的亚烷基，；
[0098] T无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，含六到十个碳的亚芳基，C(O)；
[0099] X无基团，或为O，S,NR4；
[0100] Y无基团，或为含一到六个碳的亚烷基；
[0101] R1为H，或为含一到六个碳的烷基，含二到六个碳的烯基，含二到六个碳的炔基，含六到十个碳的芳基，五到十元杂芳基或五到十元杂环基，除H以外的每个基团均可被1至3个取代基取代，如含一到四个碳的烷基，含一到四个碳的卤代烷基，卤素，氧代(＝O),-NRaRb,-NO2,-CN,-OR3,和SR3；
[0102] R3可为H，含一到四个碳的烷基或卤代烷基；
[0103] R4可为H或含一到四个碳的烷基；
[0104] Ra和Rb可为H或含一到四个碳的烷基；并且其中当基团G，P，Q，T，X，和Y基团中的任何一个不存在时，其两个相邻基团彼此直接单键连接。
[0105] 具体来说，i是0；j是2时；E是如下图所示的基于谷氨酸的分枝结构：
[0106]
[0107] 又如，i是0，j是2，X是NH时；并且Q是亚甲基，P是C(O)，G是NH，所述化合物结构为：
[0108]
[0109] 又如，A是亚甲基，B是NH，m是1，w是2时，E是基于柠檬酸的分枝结构，Z是NH，结构式如(IV)所示：
[0110]
[0111] 或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前药，其中：
[0112] i＝0或1至5的整数；
[0113] j＝0或1至5的整数；
[0114] G无基团，或为NR4，O；
[0115] P无基团，或为C(O)；
[0116] Q无基团，或为含六到十个碳的亚芳基，含一到六个碳的亚烷基；
[0117] T无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，含六到十个碳的亚芳基，C(O)；
[0118] X无基团，或为O，S,NR4；
[0119] Y无基团，或为含一到六个碳的亚烷基；
[0120] R1为H，或为含一到六个碳的烷基，含二到六个碳的烯基，含二到六个碳的炔基，含六到十个碳的芳基，五到十元杂芳基或五到十元杂环基，除H以外的每个基团均可被1至3个取代基取代，如含一到四个碳的烷基，含一到四个碳的卤代烷基，卤素，氧代(＝O),-NRaRb,-NO2,-CN,-OR3,和SR3；
[0121] R3可为H，含一到四个碳的烷基或卤代烷基；
[0122] R4可为H或含一到四个碳的烷基；
[0123] Ra和Rb可为H或含一到四个碳的烷基；并且其中当基团G，P，Q，T，X，和Y基团中的任何一个不存在时，其两个相邻基团彼此直接单键连接。
[0124] 具体来说，如果G，P，Q，T，X和Y均无基团，所述化合物结构为：
[0125]
[0126] 又如，m为3，w为1，A为亚甲基，B为NH，D为C(O)且E为基于季戊四醇的分枝结构，则其分子结构如(V)所示：
[0127]
[0128] 具体来说，Y是C(O)；X是NH；并且G，P，Q和T均无基团时，则其分子结构为：
[0129]
[0130] 具体来说，所述化合物结构可为式(VI)-(XI)中任一结构：
[0131]
[0132]
[0133] 其中R可为包含下述结构的基团:
[0134]
[0135] 其中上述结构中k均可是1至10的整数。具体来说，k为1至8、1至6、1至4的整数甚至为1至2的整数。
[0136] 如E可为具有基于谷氨酸的分枝结构：
[0137]
[0138] 另一方面，本发明提出了如(XII)所示结构：
[0139]
[0140] 或其药学上可接受的盐，溶剂合物或前药，其中：
[0141] n是3至500的整数；
[0142] m是1至5的整数；
[0143] w是1至5的整数；
[0144] GC是糖皮质激素药物分子部分；
[0145] A无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，含六到十个碳的亚芳基；
[0146] B无基团，或为NR4，O，C(O)；
[0147] D无基团，或为NR4，O，C(O)，CR5R5；
[0148] E无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，能够连接两个或更多个R2基团的分枝结构的连接基团，该连接基团可包含一个，两个或更多个含O，S和N的杂原子；
[0149] G无基团，或为NR4或O；
[0150] P无基团，或为C(O)；
[0151] Q无基团，或为含六到十个碳的亚芳基，含一到六个碳的亚烷基；
[0152] T无基团，或为含一到六个碳的亚烷基，含六到十个碳的亚芳基，C(O)；
[0153] X无基团，或为O，S,NR4；
[0154] Y无基团，或为C(O)，含六到十个碳的亚芳基，含一到六个碳的亚烷基；
[0155] Z无基团，或为NR4，O，含一到六个碳的亚烷基，能够连接一个或多个地塞米松可包含一个或杂原子O，S和N的分枝结构；
[0156] R1为H，或为含一到六个碳的烷基，含二到六个碳的烯基，含二到六个碳的炔基，含六到十个碳的芳基，五到十元杂芳基或五到十元杂环基，除H以外的每个基团均可被1至5个取代基取代，如含一到四个碳的烷基，含一到四个碳的卤代烷基，卤素，氧代(＝O),-NRaRb,-NO2,-CN,-OR3,和SR3；或者R1可和另一端的-CH2-A-B-D-E-(R2)m相同；
[0157] R3可为H，或含一到四个碳的烷基，卤代烷基；
[0158] R4可为H，或含一到四个碳的烷基；
[0159] R5可为H，含一到四个碳的烷基或卤代烷基；
[0160] Ra和Rb可为H或含一到四个碳的烷基；
[0161] 当A，B，D，E，G，P，Q，T，X，Y和Z基团中的任何一个不存在时，其两个相邻基团彼此直接单键连接。
[0162] “糖皮质激素药物分子部分”是指使用C＝N双键通过各种连接结构与PEG连接的前药的药物部分。具体而言，糖皮质激素药物分子部分包括但不限于以下分子结构：
[0163]
[0164] 或类似分子
[0165] 具体来说，可为下述分子结构为(XIII)至(XVIII)：
[0166]
[0167]
[0168] 其中R是包含糖皮质激素药物分子的基团。
[0169] 糖皮质激素药物分子包括：
[0170]
[0171] 本发明中所述前药化合物的PEG的大小可以在一定范围内变化，以达到本文公开的发明目的。典型的尺寸可以在分子量为100至20,000Da的范围内。n可以在大约3至500的范围内。具体来说n可在10至300的范围内。或者n可为20至200、n可为10至100。
[0172] 在优化方案中，n可为40-45；特别是n为42。
[0173] 本领域普通技术人员可以理解，本发明所述及具体实例化合物中，任何两个相邻的原子或键必须符合成键基本原则。在符合成键基本原则条件下，任何在此阐明的两个或多个具体结构的潜在组合都包含在本发明中。
[0174] 另一方面，本发明提供药物组合物，其包含根据本文所述的任何一个实施方案的化合物或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前药，以及药学上可接受的载体，助剂，稀释剂或媒介物。
[0176] 在该方面的一些实施方案中，药物组合物处于易汽化，异雾化，纳米粒子制剂或脂质体制剂。在该方面的一些实施方案中，所述组合物还包含第二治疗剂，包括但不限于NSAIDs(非甾体抗炎药物,例如阿司匹林，萘普生，塞来昔布)，糖皮质激素(例如地塞米松，泼尼松，倍他米松)，DMARDs(可缓解疾病的抗风湿药物,例如甲氨蝶呤，来氟米特，柳氮磺吡啶，羟基氯喹)或类似物。
[0177] 另一方面，本发明提供了治疗自身免疫性疾病和/或炎性病症的方法，其包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的根据本文公开的任何实施方案的化合物或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前药。
[0178] 在该方面的一些实施方案中，疾病或病症是全身性狼疮
[0179] IgA肾病，移植排斥，类风湿性关节炎，骨关节炎，牛皮癣，强直性脊柱炎，血管炎，多发性硬化症，系统性硬化症，痛风，葡萄膜炎，哮喘，囊性纤维化，慢性阻塞性肺病，特应性皮炎(湿疹)，败血症，炎性肠病，创伤性脑损伤，脊髓损伤，缺血再灌注损伤，异位骨化或肉芽肿等。
[0180] 在该方面的一些实施方案中，治疗疾病或病症的方法进一步包括向患者施用第二治疗剂，例如NSAIDs(非甾体抗炎药物,例如阿司匹林，萘普生，西乐葆)，糖皮质激素(例如地塞米松，泼尼松，倍他米松)，DMARDs(可缓解疾病的抗风湿药物,例如甲氨蝶呤，来氟米特，柳氮磺吡啶，羟基氯喹)，生物制剂(例如贝利莫单抗，依那西普，阿那卡因，英利昔单抗，利妥昔单抗等)等。
[0181] 在另一方面，本发明提供了治疗与狼疮有关的疾病或病症的方法，其包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的本文公开的任何实施方案的药物组合物。
[0183] 另一方面，本发明提供了根据本文公开的任何实施方案或任何实施方案组合的化合物或其药学上可接受的盐，溶剂化物或前药在制备用于治疗疾病或病症的药物中的用途，尤其是那些与狼疮有关。
[0184] 可使用本发明治疗的疾病或病症包括但不限于系统性红斑狼疮，皮肤红斑狼疮，光敏性，皮肤血管疾病，非秃头症，口腔溃疡，指甲和毛细血管改变，结核性结肠粘液病，大疱性结肠炎红斑狼疮，甜综合征，脓皮病，皮肤嗜中性粒细胞肉芽肿性皮炎，无菌性脑膜炎，脑血管病，脱髓鞘综合征，头痛，运动障碍，脊髓病，癫痫发作，急性混淆状态，焦虑症，认知功能障碍，情绪障碍，格林-巴利综合征，自主神经病，单神经病，重症肌无力，颅神经病，神经丛病，多发性神经病，狼疮性肾炎，心包炎，冠状动脉血管炎，冠状动脉粥样硬化，血管炎，胸膜炎，胸腔积液，急性狼疮肺炎，弥漫性肺泡出血，慢性间质性肺病，综合征，脉搏高血压，高血压，血栓栓塞，环杓关节炎，小气道疾病，慢性活动性和狼疮性肝炎，舍伦综合征，食管炎，西瓜胃，嗜酸性胃肠炎，腹痛，肠血栓形成，炎性肠病，蛋白丢失性肠病，脂肪吸收不良，乳糜泻，慢性小肠假性梗阻，淀粉样变性，腹膜炎症，胰腺炎，脾肿大，自身免疫性溶血性贫血，免疫性血小板减少性紫癜，白细胞减少症，关节痛，关节炎，肌腱断裂，肌炎，骨坏死，骨质疏松症等。不受限制地，在一些实施方案中，本发明中使用的PEG的分子量在约200至约10,000Da的范围内。糖皮质激素(GC)药物分子可以缀合至PEG的链末端或两个链末端。除了线性PEG之外，分支PEG，像PEG一样的刷子或甚至树枝状PEG也可以用作与分子如Dex缀合的前药载体。药物分子如地塞米松(Dex)的数量在每个PEG前药缀合物分子中可以为1至10。为了增加胶束稳定性，疏水末端可以用弱化学键交联。根据本文公开的原理和方法，除了地塞米松之外，可以使用其他糖皮质激素(例如泼尼松，泼尼松龙，甲基泼尼松龙，倍他米松，曲安西龙，倍氯米松)，抗炎剂和低分子量免疫抑制剂与PEG偶联。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
[0185] 除非另外指明，否则对特定化合物的提及包括其所有异构形式。例如，当化合物具有C＝NX部分(X＝NHR，OR或R，其中R为任何合适的基团，例如H，烷基，芳基或酰基等)时，例如腙(X＝NHR)，亚胺(X＝R)或肟(X＝OR)衍生物时，X基团可以相对于分子的其他部分以顺、反或称(Z-)、(E-)构型存在，正如本领域的普通技术人员所理解的，C＝N键两侧的基团。当化合物具有多个这样的C＝N-X部分时，多种异构体将是可能的。在本公开中，如所属领域的普通技术人员将理解的那样，所有这些异构体，无论以纯的，混合物形式或其任何组合，即使没有被明确述及，均包含在这些化合物的名字和结构中。除非另外指明，对特定化合物的提及还包括如本文所讨论的离子，盐，溶剂化物(例如水合物)，连接保护基团的形式及其其他立体异构体。
[0186] 在本文公开的化合物中，原子可使用天然同位素丰度的原子，或者一个或多个原子可采用人工富集具有相同原子序数的特定同位素，但其原子质量或质量数不同于自然界中丰度占主导地位的同位素。例如，用较重的同位素取代，如用氘代替氢(H)(即2H或D)可以提供某些由更高的代谢稳定性(例如增加在体内的半衰期或降低的剂量需求)从而在某些情况下优先使用。另外，某些同位素标记的化合物(例如3H和14C)可用于化合物和/或底物组织分布测定。同位素标记的化合物通常可以通过和以下图示和/或例子中所式方法，用合适的同位素标记的试剂取代非同位素标记的试剂制备。本发明意在包括所有含同位素变化的化合物。
[0187] 制备，纯化和/或处理活性化合物的相应盐，例如药学上可接受的盐可能是方便的或期望的。1977年，Berge等人讨论了药学上可接受的盐的实例，发表在“Pharmaceutically Acceptable Salts”，J.Pharm.Sci.Vol.66,pp1-19。
[0188] 当“大约”用于描述数字或参数时，其值可相差±10％，包括10％。如本领域技术人员将理解的，当参数非关键参数时，通常仅给出的数字仅用于说明目的，而非严格限定。
[0189] 本文在治疗疾病或病症的情况中使用的术语“治疗”，“治疗”或“治疗”等通常涉及动物患者，优选人类的治疗和治疗，其中一些达到期望的治疗效果。例如，治疗可以包括抑制病情进展，降低进展速度，停止进展速度，改善病症，绝对或部分预防迟发性并发症，以及治愈病症。治疗还包括对本领域建立的标准治疗方案的预防措施以及辅助治疗。
[0190] 如本文所用，术语“治疗有效量”涉及有效产生某种所需治疗效果的活性化合物或包含活性化合物的材料，组合物或剂型的量，其与合理的益处/风险比。
[0191] 制备，纯化和/或处理前药形式的活性化合物可能是方便的或期望的。如本文所用，术语“前药”涉及当代谢时产生期望的活性化合物或其本身为活性化合物的化合物。通常，前药是无活性的，或比活性化合物活性低，但可提供有利的处理，给药或代谢性质。例如，一些前药是活性化合物的醚或酯；在代谢期间，醚基团被切割以产生活性药物。而且，一些前药通过酶促活化产生活性化合物，或者在进一步化学反应后产生活性化合物的化合物。因此，在本文公开的本发明的治疗方法中，术语“给药”应包括治疗具体公开的化合物所描述的各种病症或可能没有具体公开的化合物，但转化为指定的化合物给予患者后体内化合物。这些化合物的代谢物包括将本发明化合物引入哺乳动物患者后产生的活性物质。
[0192] 可考虑本发明的任何化合物以药物，前体药物或甚至活性代谢物的形式施用于人患者。
[0193] 特别地，尽管本文公开的化合物本身是相对于母体药物化合物(例如糖皮质激素(例如地塞米松，泼尼松等))的前药，但是这些化合物本身可以以其前药形式存在。例如，分子上的任何羟基或氨基可以被酰基(例如乙酰基)或其它在生理条件下易于水解成为母体聚乙二醇-糖皮质激素(PEG-GC)药物的基团保护复合。在某些情况下，这种额外水平的前药甚至可能是优选的，以进一步控制患者中母体药物化合物的释放模式和速率。
[0194] 如本文所述，本发明化合物的盐指无毒的“药学上可接受的盐”。然而，其它盐可用于制备本发明化合物或其药学上可接受的盐。当本发明化合物含有碱性基团时，在术语“药学上可接受的盐”内涵盖的盐是指通常通过使游离碱与合适的有机或无机酸反应制备的无毒盐。代表性的盐包括本领域已知的任何此类盐。当本发明化合物带有酸性部分时，其合适的药学上可接受的盐可以包括碱金属盐，例如钠盐或钾盐；碱土金属盐，例如钙盐或镁盐；和与合适的有机配体形成的盐，例如季铵盐。
[0195] 为了治疗人类患者，将有效量的一种或多种本发明化合物或其药学上可接受的盐给予有需要的人类患者以促进暴露于或接触处于危险中的组织或身体或神经的靶向区域，突触或神经肌肉接头，或器官系统，包括但不限于自主神经系统和中枢神经系统。有效剂型，给药方式和剂量可凭经验确定，并且做出这样的确定在本领域的技术范围内。
[0196] 如本文所述，本文公开的PEG-GC药物化合物可以以片剂，胶囊剂(每种包括缓释剂或定时释放剂)，丸剂，粉剂(例如可重构的冻干粉剂)，微粉化组合物，酏剂，酊剂，混悬剂，软膏剂，蒸气，脂质体颗粒，纳米颗粒，糖浆剂和乳剂。同样地，它们也可以静脉内(推注或输注)，腹膜内，局部(例如皮肤，表皮，透皮，眼科如眼部滴眼剂)，鼻内，皮下，吸入，肌内或透皮(例如贴剂，微针)形式，全部使用制药领域普通技术人员熟知的形式。同样，普通熟练的医生，兽医或临床医师或临床药剂师可以容易地确定和开出预防，抵抗或阻止病症进展所需的有效量的药物。
[0197] 如本文所述，本发明的化合物可以与具有与本文公开的化合物类似或互补作用的其他药物或疗法组合使用。这种组合的单独组分可以在治疗过程中的不同时间分开给药，或者以分开或单一组合形式同时给予需要这种治疗的患者或区域。因此，本发明应被理解为包括所有这些同时或交替治疗的方案，并且术语“给药”应被相应地解释。
[0198] 如本文所用，术语“组合物”，“药物组合物”等意图涵盖包含特定量的特定成分的产品，以及任何直接或间接由指定量的特定成分。
[0199] 将与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据待治疗的宿主，特定的施用模式和上述所有其他因素而变化。将与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是有效产生治疗效果的最低剂量的活性成分的量。
[0200] 本发明的药物制剂包括适用于口服，鼻腔，局部(包括口腔和舌下)，直肠，阴道和/或胃肠外给药的那些。适用于口服给药的本发明制剂可以是胶囊剂，扁囊剂，丸剂，片剂，锭剂(使用调味基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)，粉剂(例如可重构冻干粉剂)，颗粒剂或在含水或非含水液体中的溶液或悬浮液，或者作为水包油或油包水液体乳液，或作为酏剂或糖浆或酊剂，或作为软锭剂(使用惰性基质如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)等，每种都含有预定量的活性成分。活性成分也可以作为推注剂，药糖剂或糊剂施用。
[0201] 所述制剂可以以单位剂量或多剂量密封的容器(例如安瓿和小瓶)存在，或者存在于用于蒸气或雾化给药的专用胶囊中，并且可以以仅需要添加无菌液体载体的冻干条件存储，例如注射用的水或油，在使用之前立即进行。临时注射溶液和悬浮液可以由上述类型的无菌粉末，颗粒和片剂制备。
[0202] PEG-DiDex是具有Dex二聚体的两亲性大分子前药构成疏水部分。采用mPEG 1900作为亲水部分。这种短PEG作为载体的应用不仅会减少WBC内化，而且会显着降低前药的血清半衰期，这可能大大限制前药分配到单核吞噬细胞系统(MPS)。由于使用PEG作为药物载体，PEG-DiDex活化缓慢(图3)，这可能有助于维持低血清游离Dex浓度。两亲性设计将允许前药自组装成胶束(图1和图2)，使得其不会通过肾清除得太快并压倒肾细胞隔离能力。PEG-DiDex的合成在每个步骤中都很直接，产率很高。由于使用腙连接体作为前体药物激活触发因子，PEG-DiDex将具有多个顺式/反式腙异构体，这使得NMR光谱的解释变得困难。为了最小化多种异构体的形成，在一些实施方案中，可以使用对称分支结构如柠檬酸代替谷氨酸。此外，为了最小化由于使用常规PEG导致的具有多分散分子量的前药的形成，在一些实施方案中，可能优选使用已变得可商购的单分子量离散PEG(dPEG)。与传统的聚合物前药设计不同，在PEG-DiDex的合成中使用dPEG将产生具有单一分子量的产物，这将消除产品开发过程中潜在的监管障碍。
[0203] 每月用PEG-DiDex治疗患有严重肾炎的NZB/W F1小鼠有效地减轻白蛋白尿并且在整个实验期间维持100％动物存活。另一方面，剂量当量每日Dex治疗仅表现出中等效力和80％存活率(图4)。这些观察进一步得到肾组织学发现的支持，其中PEG-DiDex处理的小鼠主要发现轻微/中度肾炎和比Dex和盐水组更多的正常肾小球(图5)。在组织学评估期间值得注意一点是在NZW对照小鼠的肾切片中发现了严重肾炎的迹象。NZB/W F1是NZB/BlNJ(购自杰克逊实验室)雌性和NZW/LacJ(购自杰克逊实验室)雄性的后代。近交亲本品系在F1中观察到某些自身免疫异常，但不一定具有相似的发病或严重程度。NZW/LacJ小鼠具有正常的寿命，但确实在晚年开发出抗dsDNA抗体，高水平的逆转录病毒gp70抗原和肾炎。因此，我们将这个孤立的发现归因于动物的高龄(38周)。
[0204] PEG-DiDex治疗的其他治疗益处还包括其能够比Dex治疗更有效地减弱系统性炎性细胞因子/趋化因子水平(图6)。
[0205] 系统性炎性细胞因子/趋化因子的这种有效调节还可以解释PEG-DiDex组的小鼠(图7)所表现出比Dex和盐水组更好的骨质量，因为严重的全身炎症会损害骨骼质量。与剂量相当的每日一次的Dex治疗相比，每月一次的PEG-DiDex治疗不诱导免疫抑制，表现为该组小鼠具有与生理盐水组相当的白细胞及总血清IgG水平。此外，PEG-DiDex治疗组小鼠的肾上腺质量显著高于等剂量当量Dex组小鼠。总的来说，这些数据提供了PEG-DiDex具有优于Dex的安全性的可靠证据。
[0206] PEG-DiDex也与以前公开的基于N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物的Dex前药(“P-Dex”)(参见例如WO 2005/097073A1，CN 101518654A和CN 103059220A)对不良影响。首先，PEG-DiDex是一种前药两亲物，可以与药物缀合到链末端自组装成胶束。胶束在循环中稀释后分解成单体；而在P-Dex中，药物与聚合物侧链缀合。P-Dex不形成胶束，不能分解。其次，由于使用相对较短的PEG(约2000Da)，PEG-DiDex预计具有显著低于P-Dex的血清半衰期，导致其肾靶向能力和经数据证实的非常低的全身毒性。第三，成像结果显示PEG-DiDex靶向至炎性肾脏，而P-Dex除了肾脏外，在肝脏和脾脏中也有较高的积聚量。此外，当使用dPEG(具有单分子量的PEG可从供应商处购买)时，PEG-DiDex应该像具有单分子量的小分子或生物药物一样行为，而没有聚合物药物缀合物通常具有的多分子量分散性。另外，当Dex通过腙键与多功能PEG载体缀合时，前体药物活化速率比P-Dex慢。因此，PEG-Dex的设计通过降低白细胞对前药的吞噬以及前药在肝脏和脾脏中的沉积显著降低了Dex分子在血清中的水平。同时，PEG-Dex相较于P-Dex更低的分子量和较短的血清半衰期则减少了前药在肝脏和脾脏的分布。
[0207] 基于光学成像的体内生物分布数据(图8)表明NZB/W F1小鼠中PEG-DiDex的优先并持续和持续分布于炎性肾脏，而在其他器官的分布则非常有限。这与用P-Dex在小鼠体内(具有高的肝脏和脾脏沉积，数据未显示)的观察结果形成鲜明对比。PEG-DiDex无法降低全身性dsDNA抗体水平(图9)及缓解脾肿大(数据未显示)的证据进一步支持了上述结论。这些发现共同表明，PEG-DiDex的杰出安全性可能归因于其肾炎靶向分布模式。在NZW对照小鼠中，重复了PEG-DiDex的肾性分布模式，但组织前药浓度处于显著性较低的水平。这表明PEG-DiDex的肾脏滞留是具有炎症选择性的。
[0208] 免疫组织化学和流式细胞术分析显示NZF的肾脏中Alexa Fluor 488标记的PEG-DiDex主要被CD11-b+(单核细胞)，F4/80+(巨噬细胞)，CD146+(内皮细胞)和CD326+(上皮细胞)/W F1小鼠。治疗8周后，PEG-DiDex处理的NZB/W F1小鼠的肾比剂量相当于Dex处理的动物显示出显着更低的单核细胞/巨噬细胞群和局部炎性细胞因子水平，表明非常有效且持续的局部抗炎作用PEG-DiDex。前体药物的被细胞内吞，亚细胞活化和炎症减轻作用进一步通过用体外细胞试验所验证。
[0209] 总之，本发明提供了具有优异和持续抗狼疮性肾炎功效但不具有典型糖皮质激素副作用的新型形成胶束的基于PEG的地塞米松前药(PEG-DiDex)。虽然从PEG-DiDex释放的Dex几乎不可能通过不同的分子机制减弱炎症，但这种新开发的前药实际上通过改变Dex分布靶向至发炎的肾并通过在内体/溶酶体区室内逐渐激活PEG-DiDex释放Dex维持其在炎性肾脏的维持局部浓度，从而在生理学水平上改变了Dex的药理机制。鉴于其卓越的治疗效果和安全性，PEG-DiDex可以提供更好的狼疮性肾炎临床治疗。此外，由于糖皮质激素通常也用于治疗其他肾脏疾病，新型糖皮质激素前药也可以更广泛的应用这些疾病，例如IgA肾病，局灶节段性肾小球硬化和肾移植。
[0210] 以下非限制性实施例进一步说明了本发明的某些方面。
[0211] PEG-DiDex的合成与表征
[0212]
[0213] 试剂
[0214] 聚乙二醇单甲醚1900(mPEG，1.9kDa)和N-Fmoc-L-谷氨酸购自Alfa Aesar(MA，USA)。地塞米松(Dex)获自天津药业集团有限公司(中国天津)。地塞米松磷酸盐购自Hawkins，Inc。(Minneapolis，MN，USA)。地塞米松磷酸二钠购自BUFA(荷兰)。哌啶购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。Dess-Martin periodinane得自Oakwood Products，Inc。(Estill，SC，USA)。IRDye 800CW NHS酯购自LI-COR Biosciences(Lincoln，NE，USA)。Alexa Fluor 488NHS酯得自Life Technologies(Carlsbad，CA，USA)。交联葡聚糖LH-20树脂购自GE HealthCare(Piscataway，NJ，USA)。所有溶剂和其他试剂(如果未特别指出的话)均购自Fisher Scientific或ACROS，并且无需进一步纯化即可使用。
[0215] 仪器
[0216] 在500MHz NMR光谱仪(Varian，Palo Alto，CA，USA)上记录1H和13C NMR谱。电喷雾电离质谱法在LCQ经典质谱仪(Finnigan MAT，San Jose，CA，USA)上进行。使用反相C18柱(Agilent，ZORBAX 300SB-C18,4.6×250mm，5μm)在Agilent 1100HPLC系统(Agilent Technologies，Inc.，Santa Clara，CA，USA)上进行HPLC分析。在LI-COR PearlTM Impulse Small Animal Imaging System(Lincoln，NE，USA)上完成基于体内近红外荧光(NIRF)的光学成像。使用高分辨率微CT系统(Skyscan 1172，Skyscan，Aartselaar，Belgium)分析骨质量。使用Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments，Worcestershire，UK)通过动态光散射(DLS)实验确定胶束的平均流体动力学直径，多分散指数(PDI)和ζ电位。使用Tecnai G2Spirit透射电子显微镜(TEM)(FEI，Hillsboro，OR，USA)以80kV的加速电压观察胶束形态。使用KeenView高分辨率相机采集数字图像，并使用Soft Imaging Solutions AnalySIS ITEM数字软件进行分析。使用Spectramax M2分光荧光计(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)测量IRDye 800CW，Alexa Fluor488和芘的荧光信号强度的量化。使用FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)进行流式细胞术分析。配备Waters 2489吸收检测器和Waters Qtof Micro电喷雾电离质谱仪的Waters e2695系统用于执行高效液相色谱/质谱分析。
[0217] 两亲性大分子地塞米松前药(PEG-DiDex)
[0218] 基于聚乙二醇(PEG)的两亲性地塞米松前药PEG-DiDex根据图1中所示的合成路线合成。使用LC-MS/MS证实聚合物前药的同一性和不存在游离Dex。多步合成是线性的，每个步骤都有高产率。由于腙键作为将Dex连接在谷氨酸上形成二聚体及释放Dex的活性连接方式，因此可形成至少4个顺式/反式腙构型异构体。Dex二聚体(化合物6)的这些异构体使用LC-MS/MS色谱法分离，色谱条件在仪器部分中述及。这些异构体的质谱(正离子ESI)显示分子离子[M+H+]在1066.7，这证实了它们的单同位素质量为1065.7。PEG-DiDex中的理论Dex重量含量计算为26.7％。在前药完全水解后，HPLC分析显示26.4wt％的前药以完整地塞米松的形式释放，表明所合成的PEG-DiDex前药具有约99％的纯度。
[0219]
[0220] 方案1
[0221] 如方案1所示，前药的合成是将通过谷氨酸/甘氨酸/腙键连接的Dex二聚体缀合至聚乙二醇(PEG)2000链末端来实现的。
[0222] 化合物1的合成：
[0223]
[0224] 将地塞米松(7.84g，20mmol)和咪唑(2.72g，40mmol)溶于无水DMF(40mL)中并将溶液冷却至0℃。加入叔丁基二甲基甲氯硅烷基(TBSCl，3.3g，22mmol)。该溶液在0℃下搅拌3小时，然后在室温下继续搅拌2小时。加入乙酸乙酯(100mL)并用盐水(80mL×4)洗涤。有机相用MgSO4干燥后除去溶剂。柱色谱(乙酸乙酯/己烷＝1/2)分离纯化，得到9.98g化合物1(产率98.5％)。
[0225] 1H NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm)＝7.26(d,J＝10.0,1H),6.32(d,J＝10.0,6.10(s,1H),4.63(d,J＝18.0,1H),4.38(d,J＝18.0,1H),4.37(m,1H),3.23(s,1H),3.05(m,1H),
2.62(td,J＝13.5,6.0,1H),2.51(s,1H),2.38(m,3H),2.22(m,1H),1.82(m,1H),1.75(m,J＝7.0,1H),1.56(m,1H),1.55(s,3H),1.45(d,J＝13.5,1H),1.24(m,1H),1.06(s,3H),0.92(s,9H),0.91(d,J＝7.0,3H),0.103(s,3H),0.098(s,3H).
2.62(td,J＝13.5,6.0,1H),2.51(s,1H),2.38(m,3H),2.22(m,1H),1.82(m,1H),1.75(m,J＝7.0,1H),1.56(m,1H),1.55(s,3H),1.45(d,J＝13.5,1H),1.24(m,1H),1.06(s,3H),0.92(s,9H),0.91(d,J＝7.0,3H),0.103(s,3H),0.098(s,3H).
[0226] 13C NMR(125MHz,CDCl3):δ(ppm)＝209.474,186.768,166.725,152.226,129.617,124.904,91.147,72.159,71.853,69.462,48.503,43.635,37.164,36.146,34.240,
34.084,32.289,31.045,27.296,25.814,22.931,22.886,18.442,17.168,14.810,-
5.328,-5.4662.
34.084,32.289,31.045,27.296,25.814,22.931,22.886,18.442,17.168,14.810,-
5.328,-5.4662.
[0227] 化合物2的合成：
[0228]
[0229] 将原料1(2.53g，5mmol)和一水合肼(750mg，15mmol)溶于甲醇(25mL)中。然后加入乙酸(60mg，1mmol)并在室温下搅拌5小时。加入乙酸乙酯(100mL)并用盐水(80mL×4)洗涤。有机相用MgSO4干燥后除去溶剂。柱色谱法(乙酸乙酯/己烷＝1/1)纯化，得到1.14g化合物
2.回收总计1.24g原料。基于原料转化产率为85.8％。由于形成腙键，产物是两种腙键为顺式和反式构型异构体的混合物，很难用柱色谱法分离。NMR分析表明两种异构体的摩尔比是
1.75:1。
2.回收总计1.24g原料。基于原料转化产率为85.8％。由于形成腙键，产物是两种腙键为顺式和反式构型异构体的混合物，很难用柱色谱法分离。NMR分析表明两种异构体的摩尔比是
1.75:1。
[0230] 1H NMR(500MHz,d6-DMSO):δ(ppm)＝6.66(dd,J＝10.2Hz,1.5Hz,),6.34(s,J＝10.2Hz,6.28(dd,J＝10.2Hz,1.9Hz),6.14(d,J＝10.2Hz),5.99(s),5.24(br,s),4.61(d,J＝18.0Hz),4.59(d,J＝18.0Hz),4.38(d,J＝18.0Hz),4.36(m),3.05(m,1H),3.03(s),2.97(t,J＝4.8Hz),2.62(td,J＝13.5,5.8Hz),2.51(td,J＝13.5,5.8Hz),2.40-2.20(m),1.70-
1.60(m),1.55-1.50(m),1.476(s),1.472(s),1.40(s),1.37(s),1.24-1.20(m),1.04(s),
0.92(s),0.90(d,J＝7.3Hz),0.103(s).MS(ESI):m/z＝521.5(M+H+),计算值：520.3.[0231] 化合物3的合成：
1.60(m),1.55-1.50(m),1.476(s),1.472(s),1.40(s),1.37(s),1.24-1.20(m),1.04(s),
0.92(s),0.90(d,J＝7.3Hz),0.103(s).MS(ESI):m/z＝521.5(M+H+),计算值：520.3.[0231] 化合物3的合成：
[0232]
[0233] 将化合物2(2.86g，5.5mmol)，二甲基氨基吡啶(DMAP，201mg，1.65mmol)溶于无水DMF(15mL)中并将溶液冷却至0℃。然后将Fmoc-甘氨酸(2.12g，7.15mmol)，二环己基碳二亚胺(DCC，1.70g，8.25mmol)加入到溶液中。将该溶液在0℃下搅拌3小时。加入乙酸乙酯(100mL)并用盐水(80mL×4)洗涤。有机相用MgSO4干燥，然后除去溶剂。柱色谱法(乙酸乙酯/己烷＝1：1)纯化，得到3.72g化合物3(84.5％产率)。
[0234] 化合物4的合成:
[0235]
[0236] 将化合物3(3.0g，3.75mmol)溶于二氯甲烷(DCM，10mL)中。将溶液用冰水浴冷却至0℃。加入哌啶(1mL)。将该溶液在0℃下搅拌1小时。加入乙酸乙酯(100mL)并用盐水(80mL×
3)洗涤。有机相用MgSO4干燥，然后除去溶剂。加入甲苯(50mL)，然后蒸干以除去残留哌啶。
柱色谱法(乙酸乙酯，然后乙酸乙酯/甲醇＝2.5/1)纯化，得到1.96g化合物4(90.6％收率)。
3)洗涤。有机相用MgSO4干燥，然后除去溶剂。加入甲苯(50mL)，然后蒸干以除去残留哌啶。
柱色谱法(乙酸乙酯，然后乙酸乙酯/甲醇＝2.5/1)纯化，得到1.96g化合物4(90.6％收率)。
[0237] 1H NMR(500MHz,d6-DMSO):δ(ppm)＝7.01(d,J＝10.2Hz),6.83(d,J＝10.2Hz),6.77(s),6.66(d,J＝10.2Hz),6.57(d,J＝10.2Hz),6.56(s),6.43(d,J＝10.2Hz),6.38(d,J＝9.8Hz),6.27(d,J＝10.2Hz),6.18(d,J＝9.8Hz),6.00(s),5.92(s),5.15(s),5.13(s),
4.94(s),4.76(d,J＝9.0Hz),4.27(d,J＝9.0Hz),4.11(br),2.88(br),2.70-2.50(m),2.49(s),2.40-2.20(m),2.15-2.05(m),1.73-1.63(m),1.63-1.53(m),1.41(s),1.40(s),1.37(s),1.35-1.25(m),1.10-1.00(m),0.87(s),0.84(s),0.76(d,J＝6.8Hz),0.03(s),0.02(s).MS(ESI):m/z＝578.3(M+H+),计算值:577.3.
4.94(s),4.76(d,J＝9.0Hz),4.27(d,J＝9.0Hz),4.11(br),2.88(br),2.70-2.50(m),2.49(s),2.40-2.20(m),2.15-2.05(m),1.73-1.63(m),1.63-1.53(m),1.41(s),1.40(s),1.37(s),1.35-1.25(m),1.10-1.00(m),0.87(s),0.84(s),0.76(d,J＝6.8Hz),0.03(s),0.02(s).MS(ESI):m/z＝578.3(M+H+),计算值:577.3.
[0238] 化合物5的合成:
[0239]
[0240]
[0241] 将化合物4(444mg，0.768mmol)溶于无水DMF(3mL)中，加入Fmoc-谷氨酸(135mg，0.366mmol)，DCC(226mg，1.098mmol)和羟基苯并三唑(HOBt，148mg，1.098mmol)。该溶液在室温下搅拌4小时。加入乙酸乙酯(100mL)并用盐水(80mL×3)洗涤。有机相用MgSO4干燥，然后除去溶剂。柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇＝10/1)纯化，得到471mg化合物5(86.5％收率)。由于Dex二聚体中存在多个顺式/反式腙基团，因此化合物5的1H NMR谱图中峰的分配是复杂的，因此使用LC-MS/MS来确认化合物5。
[0242] 化合物6的合成:
[0243]
[0244] 将化合物5(450mg，0.3mmol)溶于DCM(4.5mL)中。用冰水浴将溶液冷却至0℃。加入哌啶(1.5mL)。将该溶液在0℃下搅拌1小时。加入乙酸乙酯(100mL)并用盐水(80mL×3)洗涤。有机相用MgSO4干燥，然后除去溶剂。柱色谱法(乙酸乙酯然后乙酸乙酯/甲醇＝3/1)纯化，得到330mg化合物6(86.4％收率)。MS(ESI)：m/z＝1266.7(M+H+)，计算值：1265.7。
[0245] 化合物7的合成(PEG-DiDex):
[0246]
[0247] 将mPEG-COOH(100mg，0.052mmol)，HOBt(70.2mg，0.52mmol)和DCC(107mg，0.52mmol)溶于DMF(3mL)中，并将溶液在室温下搅拌1小时。加入化合物6(428mg，0.34mmol)后继续在室温下搅拌24小时，用LH-20柱分离得到大分子部分。溶剂蒸发后，将残余物溶于四正丁基氟化铵溶液(TBAF，1M，2mL)中。将该溶液搅拌2小时。将所得溶液用LH-20柱分离，得到118.7mg化合物7(PEG-DiDex，77.8％收率)。
[0248] MS(ESI)：在质谱中观察到两个簇的峰：一个出现在m/z 1550处，代表PEG-DiDex的双离子峰；另一个在m/z 1100处，代表PEG-DiDex的三离子峰。在每簇m/z值处出现多个峰值是缘于所使用的mPEG的多分散性。例如，在1546.7处的峰表示在mPEG中具有44个重复乙二醇单元的PEG-DiDex的双离子峰；在1068.5处的峰表示在mPEG中具有46个重复乙二醇单元PEG-DiDex的三离子峰
[0249] 对称mPEG-(地塞米松二聚体)化合物9的合成
[0250]
[0251] 化合物8的合成:
[0252]
[0253] 将柠檬酸单甲酯(0.206g，1mmol)溶于无水DMF(15mL)中并将溶液冷却至0℃。加入DCC(0.494g，2.4mmol)，化合物2(1.144g，2.2mmol)和DMAP(48.8mg，0.4mmol)。将该溶液在0℃下搅拌3小时。加入乙酸乙酯(100mL)并用盐水(80mL×4)洗涤。有机相用MgSO4干燥，然后除去溶剂。柱色谱(乙酸乙酯/己烷＝1/1)纯化，得到化合物8。
[0254] 化合物9的合成:
[0255]
[0256] 将化合物3(0.9g，0.75mmol)和mPEG-NH2(0.285g，0.15mmol)溶于无水DMF(5mL)中，并在Ar保护下将溶液加热至80℃达6小时。然后将溶液置于室温，加入TBAF(3mL，1M的THF溶液)。将该溶液在室温下搅拌1小时。然后浓缩溶液，然后通过LH-20色谱法纯化，得到化合物9。
[0257] 对称mPEG-(Dex-三聚体)化合物11的合成
[0258]
[0259] 化合物10的合成:
[0260] 将季戊四醇衍生物(0.41g，1mmol)溶于无水DMF(5mL)中。加入DCC(0.82g，4mmol)，HOBt(0.405g，3mmol)和Et3N(0.30g，3mmol)并将溶液搅拌30分钟，加入mPEG-NH2(0.38g，0.2mmol)。该溶液在室温下搅拌20小时。然后通过LH-20纯化得到化合物10。
[0261] 化合物11的合成:
[0262]
[0263] 将化合物10(0.23g，0.1mmol)和氢氧化钠(12mg，0.3mmol)溶于甲醇和水的混合溶液(1：1,5mL)中。该溶液在室温下搅拌5小时。然后加入HCl(3mL，1M)。然后除去溶剂，残余物用LH-20纯化，得到脱保护的中间体。然后将其溶于无水二氯甲烷(5mL)中。加入DCC(0.30g，1.5mmol)，HOBt(0.20g，1.5mmol)和Et3N(0.15g，1.5mmol)并将溶液搅拌30分钟，然后加入化合物2(0.62g，1.2mmol)。该溶液在室温下搅拌20小时。然后将溶液上样到硅胶柱上，用乙酸乙酯/己烷＝1:1作为洗脱液回收未反应的化合物2.然后用甲醇作为洗脱液得到粗产物。
除去溶剂后溶于THF(5mL)中并加入TBAF(1.5mL，1M的THF溶液)。该溶液在室温下搅拌1小时。然后将溶液浓缩并通过LH-20纯化，得到最终产物化合物11。
除去溶剂后溶于THF(5mL)中并加入TBAF(1.5mL，1M的THF溶液)。该溶液在室温下搅拌1小时。然后将溶液浓缩并通过LH-20纯化，得到最终产物化合物11。
[0264] mPEG-Dex，化合物12的合成
[0265]
[0266] 化合物12的合成:
[0267] 将mPEG-CH2COOH(0.19g，0.1mmol)溶于无水DMF(5mL)中。加入DCC(0.21g，1mmol)，HOBt(0.135g，1mmol)和Et3N(0.1g，1mmol)并将溶液搅拌30分钟，然后将化合物2(0.26g，0.5mmol)添加。该溶液在室温下搅拌20小时。加入TBAF(0.5mL，1M的THF溶液)并将该溶液搅拌1小时，然后进行LH-20纯化，得到化合物12。
[0268] 对称Dex-PEG-Dex化合物的合成13
[0269]
[0270] 化合物13的合成：
[0271] 将HOOCCH2-PEG-CH2COOH(0.14g，0.07mmol)溶于无水DMF(5mL)中。加入DCC(0.142g，0.7mmol)，HOBt(0.093g，0.7mmol)并将溶液搅拌30分钟，然后加入化合物2(0.398g，0.7mmol)。该溶液在室温下搅拌15小时。加入TBAF(1mL，1M的THF溶液)并将该溶液搅拌1小时，然后通过LH-20纯化，得到化合物13。
[0272] 不对称mPEG-(Dex-四聚体)化合物15的合成
[0273]
[0274] 化合物14的合成：
[0275]
[0276] 将Fmoc-L-谷氨酸(93mg，0.25mmol)溶于无水DMF(5mL)中。加入DCC(0.62g，3mmol)，HOBt(0.41g，3mmol)并将该溶液搅拌30分钟，然后加入化合物6(0.79g，
0.625mmol)。该溶液在室温下搅拌15小时。加入乙酸乙酯(100mL)并用盐水(80mL×4)洗涤。
有机相用MgSO4干燥，然后除去溶剂。柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇＝5/1)纯化，得到产物，将其溶于二氯甲烷(3mL)中，然后加入哌啶(1mL)，将溶液搅拌1小时，然后经柱层析(乙酸乙酯/甲醇＝2.5/1)纯化，得到化合物14。
0.625mmol)。该溶液在室温下搅拌15小时。加入乙酸乙酯(100mL)并用盐水(80mL×4)洗涤。
有机相用MgSO4干燥，然后除去溶剂。柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇＝5/1)纯化，得到产物，将其溶于二氯甲烷(3mL)中，然后加入哌啶(1mL)，将溶液搅拌1小时，然后经柱层析(乙酸乙酯/甲醇＝2.5/1)纯化，得到化合物14。
[0277] 化合物15的合成：
[0278]
[0279] 将mPEG-CH2COOH(50mg，0.025mmol)溶于无水DMF(3mL)中。加入DCC(0.10g，0.5mmol)，HOBt(68mg，0.5mmol)并将该溶液搅拌30分钟，然后加入化合物14(0.43g，
0.15mmol)。该溶液在室温下搅拌15小时。加入TBAF(0.5mL，1M的THF溶液)并将溶液搅拌1小时，然后将溶液通过LH-20纯化，得到化合物15。
0.15mmol)。该溶液在室温下搅拌15小时。加入TBAF(0.5mL，1M的THF溶液)并将溶液搅拌1小时，然后将溶液通过LH-20纯化，得到化合物15。
[0280] PEG-Dex二聚体前药(PEG-DiDex)的表征和测试
[0281] PEG-DiDex胶束的形成
[0282] 通过两亲结构设计，PEG-DiDex可以通过自组装形成胶束。将PEG-DiDex(26.5毫克)溶于蒸馏水(1毫升)并在37摄氏度平衡4小时以形成胶束。然后通过加入双蒸水将胶束-3溶液稀释至3毫克/毫升(1.02×10 摩尔)，然后用于以下表征。
[0283] 胶束表征
[0284] 使用Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments，Worcestershire，UK)通过动态光散射(DLS)测定胶束的平均流体动力学直径，多分散系数(PDI)和ZETA电位。散射光的强度在173度散射角处测量。为了理解胶束形态，使用透射电子显微镜(TEM)观察沉积在formvar/一氧化硅涂覆的200目铜网格表面上的胶束。
[0285] 基于芘的荧光偏振方法用于确定PEG-DiDex的临界胶束浓度(CMC)。为了制备样品，将已知量的芘在丙酮中的储备液加入到96孔板的空孔中。向孔中加入不同浓度的PEG-DiDex水溶液并在室温下蒸发2小时。最终溶液中的芘浓度为0.6微摩尔，该浓度在室温下略低于其在水中的溶解度。在测量之前，将来自每个孔的样品转移至石英96-孔板，并且使用荧光微板荧光分光光度计(Fluorescent microplate spectrofluorometer)测量激发波长334nm和发射波长373nm(I1)和384nm(I3)(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)。绘制荧光强度I1/I3与前药浓度的比率以获得CMC值。
[0286] 为了理解pH值和血清蛋白质的存在对PEG-DiDex释放Dex的影响，将前药(3毫克/毫升)溶于醋酸盐缓冲液(pH＝5.0，6.5和7.4)和小鼠血清(加入0.2wt％叠氮化钠作为抑菌剂)。加入普朗尼克F127以便形成漏槽状态。将胶束溶液置于37摄氏度的振荡培养箱(60转/分钟)中。在选定的时间点，取出释放溶液(0.5毫升)，用NaOH(0.1摩尔)中和并用高效液相色谱(HPLC)分析以测定游离Dex浓度。每个样品的分析重复三次。根据以下公式计算PEG-DiDex胶束中Dex的累积释放率，其中Ci指时间i时的地塞米松浓度。
[0287]
[0288] 为了量化PEG-DiDex中的地塞米松含量，将前药(1毫克)溶于盐酸HCl(0.5毫升，0.1当量)过夜。取出样品(50微升)并通过加入NaOH(50微升，0.1当量)中和，然后用乙腈(0.9mL)稀释。使用配备有反相C18柱(Agilent，ZORBAX 300SB-C18,4.6×250毫米，5微米)的Agilent 1100HPLC系统分析样品(每个样品的分析重复三次)。流动相：乙腈/水＝30/70；
检测波长，240nm；流速，1毫升/分钟；注射体积，10微升。然后基于HPLC分析结果计算PEG-DiDex中的Dex含量。
检测波长，240nm；流速，1毫升/分钟；注射体积，10微升。然后基于HPLC分析结果计算PEG-DiDex中的Dex含量。
[0289] 测试结果
[0290] 动态光散射(DLS)测量表明PEG-DiDex确实可以形成具有约11nm的平均胶束直径，多分散性指数(PDI)为0.345和ZETA电位为-54.61毫伏的胶束。如TEM图像(图2)所示，沉积在基底上的胶束显示出平均约30纳米的直径。DLS测量的尺寸差异可能归因于样品制备过程中胶束的塌陷。使用基于芘的荧光偏振方法，确定PEG-DiDex的临界胶束浓度(CMC)值为-42.5×10 摩尔.
[0291] 作为Dex激活触发器，PEG-DiDex设计中的腙键只能在酸性环境裂解。这已经被体外药物释放实验证实。如图3所示，在pH＝5.0的醋酸盐缓冲液中，2％的Dex在头两天内释放出来。然后在接下来的26天内以大约0.27％/天的速度持续释放。
[0292] 用PEG-DiDex治疗狼疮性肾炎
[0293] 从20周龄开始，将NZB/W F1雌性小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)随机分为三个测试组(生理盐水对照，Dex和PEG-DiDex)。每周使用Albustix试剂条(Siemens Healthineers)监测其尿蛋白水平。只有证明持续2周以上的持续蛋白尿(≥100毫克/分公升)形成肾炎的小鼠被纳入研究。PEG-DiDex(106毫克/千克，含有28毫克/千克地塞米松，n＝10)和生理盐水(n＝12)通过每月静脉注射给予治疗。Dex(地塞米松21-磷酸二钠，1.32毫克/千克，含1.00毫克/千克地塞米松，n＝11)通过每日静脉注射给予治疗。所有治疗持续8周。每周监测动物的体重和尿蛋白水平。每4周从隐静脉收集外周血用于血清分析。对产生严重蛋白尿(≥2000毫克/分公升)或出现窘迫迹象(例如活动度降低，体重减轻>20％，水肿，蓬乱外观)的小鼠立即处死。在最后一次治疗后再监测存活的小鼠两周。然后通过二氧化碳窒息使小鼠安乐死，取出所有主要组织和器官，称重并在尸检时处理。所有动物程序均由内布拉斯加大学医学中心(UNMC)的实验动物使用与管理委员会(IACUC)批准。
[0294] 骨质分析
[0295] 使用Skyscan 1172微CT系统分析股骨质量。微型计算机断层扫描(micro-CT)参数设置如下：电压48千伏，电流187微安，曝光时间620毫秒，分辨率6.07微米，铝滤光片0.5毫米。用NRecon和DataViewer软件(SkyScan)进行三维重建。在股骨中心内选取感兴趣的多边形区域的骨小梁进行分析，起始于生长板近端20个切片(0.25mm)，并向近端延伸80个切片(0.99mm)。用CTAn软件(SkyScan)量化小梁骨容积(BV/TV)，平均骨矿物质密度(BMD)，小梁数量和厚度。
[0296] 近红外成像研究
[0297] 在蛋白尿形成后，通过给NZB/W F1小鼠(n＝6)尾静脉注射IRDye 800CW-标记的PEG-DiDex(含148纳摩尔/千克的IRDye 800CW，28毫克/千克等剂量的地塞米松)。还向NZW小鼠(n＝6，健康对照)静脉内给予相同剂量的IRDye 800CW-标记的PEG-DiDex。在选定的时间点(给药后1和4天)，使小鼠安乐死用生理盐水灌注。取出所有主要器官(即心脏，肺，肝，脾，肾和肾上腺)并使用LI-COR PearlTM Impulse小动物成像系统成像以评估PEG-DiDex的分布和储留。
[0298] 流式细胞术分析
[0299] 在形成蛋白尿后，将NZB/W F1小鼠(n＝6)和NZW小鼠(健康对照)给予Alexa Fluor 488标记的PEG-DiDex(含300纳摩尔/千克Alexa Fluor 488，28毫克/千克等剂量的地塞米松)通过尾静脉注射。在选定的时间点(给药后1和4天)，使动物安乐死并灌注。从外周血分离白细胞。取出骨髓，肾脏，脾脏和肝脏，浸泡并用70-μm细胞过滤网过滤以制备单细胞悬液。用以下抗体标记细胞：PE标记的抗小鼠CD3e(17A2)，CD11b，F4/80，NK1.1，CD146，prominin(Miltenyi Biotec)和CD19(eBioscience Inc.)；APC标记的抗小鼠CD11c，Ly-6G，CD326，CD117；抗小鼠GL7-eFluor660。使用FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)分析细胞。
[0300] 统计
[0301] 大多数统计分析使用SPSS软件(版本19.0)进行。使用Kruskal-Wallis检验比较未假设遵循正态分布的数据，该检验是替代单因素方差分析的非参数检验。为了评估实验组之间的具体差异，分别使用Tukey事后比较检验和Mann-Whitney U检验比较正态分布和非正态分布数据。双侧P值≤0.05被认为是有显著差异的。
[0302] 对于炎性细胞因子/趋化因子分析，获得的数据进行log2转换以使它们更符合正态分布。在相同动物随时间的重复测量之间具有AR(1)相关性的混合效应模型用于分别拟合每种细胞因子的对数转换的细胞因子表达值。三种不同的比较被用来进行评估(1)在每个观察时间处理组之间的差异；(2)每个治疗组内不同时间之间的差异；和(3)不同治疗组中细胞因子表达相对于基线的变化的差异。Benjamini-Hochberg方法用于控制多重比较的错误发现率。报告了在对数比例数据，标准误差，没有调整错误发现率的原始p值和用于BH错误发现率控制的调整p值方面的差异的结果。
[0303] PEG-DiDex有效改善了蛋白尿并改善了患有严重肾炎的NZB/W F1小鼠的存活率[0304] 为了评估PEG-DiDex的潜在疗效，给完全形成蛋白尿(持续观测到蛋白尿)的NZB/W F1雌性小鼠(约28周)每月注射PEG-DiDex。治疗持续8周。每日等效剂量的Dex治疗组和每月注射生理盐水组被用作对照。如图4A所示，2个月的PEG-DiDex治疗导致60％的受试小鼠中白蛋白尿消退。对于每日Dex治疗组，在实验结束时仅达到了18％的治愈率。在整个实验时间过程中，100％生理盐水组的小鼠持续存在蛋白尿。根据IACUC的规定，生理盐水组中42％的小鼠由于严重肾炎而被处以安乐死(图4B)。这一观察结果与其他人对NZB/W F1小鼠的中位生存期的发现约为36周一致。尽管每日Dex治疗将小鼠存活率提高至约82％，但是PEG-DiDex治疗组在实验结束时所有动物都存活，表明比每日Dex治疗组具有更好的疗效。
[0305] 为了收集PEG-DiDex卓越疗效的更多证据，将受试动物的肾脏切片并用过碘酸希夫(PAS)染色。然后送给病理学家(KWF)检查，该病理学家不了解实验组设计。PAS染色的肾脏切片通过具有4点量表的组织病理学评分系统进行分级。如图5所示，来自Dex和生理盐水组的40％以上的小鼠显示出严重肾小球肾炎(评分3分和4分)的组织学证据，所述严重肾小球肾炎(丝圈样损害，急性肾小管坏死(ATN)，肾小球瘢痕形成，细胞新月体和透明血栓形成。PEG-DiDex治疗组仅有11％的小鼠出现严重肾小球肾炎，明显低于生理盐水和Dex组。在PEG-DiDex组中26％的肾小球中观察到组织学异常，这接近于在NZW小鼠中发现的频率(21.6％)。与此观察相比，地塞米松组和生理盐水组分别有40％和52％的肾小球出现异常，这进一步支持了PEG-DiDex治疗狼疮性肾炎的优越疗效。
[0306] PEG-DiDex治疗减弱组织破坏性促炎性细胞因子/趋化因子分泌。
[0307] 如图6所示，只有PEG-DiDex治疗的动物在2个月治疗结束时引起MCP-1，IFN-γ和IFN-γ值在统计学意义上显著性降低。另一方面，Dex治疗并未引起改善。
[0308] PEG-DiDex治疗不会导致典型的糖皮质激素毒性
[0309] 为了解PEG-DiDex治疗对骨骼的影响，使用高分辨率微型计算机断层扫描(Skyscan1172)评估股骨平均骨矿化密度(BMD)和微观结构。PEG-DiDex治疗的小鼠的股骨骨小梁中的BMD值和小梁厚度显着高于生理盐水和Dex组中观察到的BMD值和小梁厚度(图7A，C；P<0.05)。同时观察到小梁骨容积(BV/TV)值增加的趋势，尽管这种增加不具有统计学意义(图7B，P>0.05)。与NZW小鼠(作为健康对照)相比，即使生理盐水组也表现出显著降低的BMD，BV/TV和小梁厚度值(数据未显示)，这表明NZB/W F1小鼠的全身炎症状态对骨骼质量的损害。PEG-DiDex治疗不仅避免了糖皮质激素对骨骼的负面影响，而且通过有效改善肾炎进一步阻止了与炎症相关的骨骼恶化。
[0310] 现已知长期接受糖皮质激素治疗会伴随全身性免疫抑制反应。为了解PEG-DiDex作为糖皮质激素前药是否会具有相似的免疫抑制性，我们在实验过程中评估了治疗结束时总血清IgG水平和外周血白细胞(WBC)计数水平。如图7D所示，经PEG-DiDex治疗的小鼠表现出与生理盐水组类似的WBC计数，但显着高于Dex处理组(P<0.05)。如图7E所示，每月PEG-DiDex治疗组在治疗过程中血清IgG水平不变，而用每日地塞米松治疗的动物在治疗1个月后血清IgG值具有显著下降(P<0.05)。这些数据总体表明在用PEG-DiDex治疗的动物中没有免疫抑制迹象。
[0311] 接受糖皮质激素治疗即使在短期内也可能抑制下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴，导致肾上腺的临床萎缩。为了解PEG-DiDex治疗是否会引起肾上腺萎缩，我们分析了治疗结束后肾上腺对质量。Dex组的平均肾上腺质量显著低于PEG-DiDex组(图7F；P<0.05)。PEG-DiDex和生理盐水组之间的肾上腺质量没有显着差异(图7F；P>0.05)。这些数据表明PEG-DiDex治疗不会引起肾上腺萎缩。
[0312] PEG-DiDex被动靶向NZB/W F1小鼠的肾炎肾脏
[0313] 为了解PEG-DiDex(糖皮质激素前体药物)加强的治疗效果并大大降低糖皮质激素相关毒性(的机理)，我们使用近红外光学成像分析了PEG-DiDex的体内生物分布。NZB/W F1小鼠和NZW小鼠都接受静脉注射IRDye 800CW-标记的PEG-DiDex。注射后第1天和第4天处死动物，取出所有重要器官(即心脏，肺，肝，脾，肾和肾上腺)用于光学成像。如图8所示，在NZB/W F1小鼠中，IRDye标记的PEG-DiDex主要积聚在肾脏中并且可以在肾脏储留至少4天。虽然PEG-DiDex也被发现在NZW小鼠肾脏中累积，但储存前药的信号强度处于非常低的水平，特别是在给药后4天，这表明肾脏的炎症状况可能尤其促进前药在肾炎时的被动靶向和储留效应。
[0314] PEG-DiDex治疗不会改变血清抗双链DNA抗体水平
[0315] 现已知糖皮质激素通过下调抗双链DNA抗体水平发挥其对狼疮的治疗作用。因此，根据类似的药理学现象研究是否诸如PEG-DiDex的Dex前药治疗可以改善狼疮症状是非常有意义的。如图9所示，发现每日Dex治疗在治疗开始后4周和8周均显著降低了血清抗双链DNA抗体水平。然而，生理盐水和PEG-DiDex治疗组在任一时间点均未观察到对抗双链DNA抗体水平的显著影响。
[0316] PEG-DiDex的表征和载药效率
[0317] 使用Zetasizer Nano ZS90(Malvern Instruments，Worcestershire，UK)通过动态光散射(DLS)测量PEG-DiDex二聚体的有效流体动力学直径(Deff)和多分散系数(PDI)。将PEG-DiDex二聚体以2毫克/毫升的浓度溶解于PBS(pH 7.4)中。DLS分析显示PEG-DiDex二聚体的流体动力学尺寸为273.5纳米，PDI值为0.464。
[0318] 为了定量PEG-DiDex中的地塞米松载药量，将1毫克前药溶于0.5毫升缓冲液(盐酸，0.1当量)中过夜。取50微升样品用50微升氢氧化钠(0.1当量)中和，然后用0.9毫升乙腈稀释。使用具有四元泵(配有排气阀)，自动取样器和基于二极管阵列的紫外检测器的Agilent 1100HPLC系统分析1毫升样品(每个样品的分析重复三次)。流动相，乙腈/水＝30/70；检测，UV 240纳米；流速，1毫升/分钟；进样量10微升。使用Microsoft Excel获得平均值和标准偏差。HPLC分析显示26.38％的前体药物以地塞米松的形式释放。由于PEG-DiDex的理论药物含量为26.75％，所以98.6％理论含量的Dex共价结合至前药。
[0319] PEG-DiDex二聚体治疗狼疮性肾炎
[0320] 实验动物和药物治疗
[0321] 从28周龄开始，将(NZB×NZW)F1雌性小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)小鼠组随机分为生理盐水，Dex和PEG-DiDex组，并使用Albustix试剂条(西门子公司，华盛顿特区)每周监测白蛋白尿。只有证明持续2周以上的持续蛋白尿(≥100毫克/分公升)形成肾炎的小鼠被纳入研究。PEG-DiDex(106毫克/千克，含有28毫克/千克地塞米松，n＝10)和生理盐水(n＝12)通过每月静脉注射给予治疗。地塞米松21-磷酸二钠(n＝11，，Dex，1.32毫克/千克，含1.00毫克/千克地塞米松，霍金斯公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州)通过每日静脉注射给予治疗。治疗持续8周。在停止治疗后再监测小鼠两周。之后安乐死处死小鼠，并且取出脾脏，肾脏，肾上腺和左侧股骨。
[0322] PEG-DiDex可逆转已形成的蛋白尿，延长生存率并减少严重肾炎的发生率[0323] 为了确定PEG-DiDex是否可以改善已形成的肾炎，从约28周龄开始，在持续监测到蛋白尿证明已经发展为肾炎之后，每月给予(NZB×NZW)F1雌性小鼠PEG-DiDex治疗。治疗持续8周。两个对照组也治疗8周，一个每日接受等效剂量的Dex治疗，另一个接受每月剂量的盐水。在停止治疗后再监测小鼠两周。在整个实验时间过程中，蛋白尿不仅持续存在100％生理盐水组的小鼠，而且在大多数生理盐水组小鼠(75％)中严重程度增加(图10A)。然而，在Dex组中，在82％的小鼠中检测到蛋白尿，但仅有36％Dex治疗的小鼠蛋白尿加重，表明Dex治疗可以预防肾功能障碍的进展。
[0324] 相比之下，在PEG-DiDex组中的60％的小鼠中蛋白尿消退(图10A)，并且20％的PEG-DiDex治疗的小鼠甚至显示蛋白尿阴性并完全恢复。PEG-DiDex组中显示已治愈蛋白尿的小鼠比例显著高于Dex治疗组，表明PEG-DiDex在治疗与狼疮肾炎有关的蛋白尿方面比等效剂量的Dex更有效。
[0325] 在实验结束之前，约42％的生理盐水组和约18％Dex治疗的小鼠因严重肾炎而被处以安乐死(图10B)。PEG-DiDex组中的所有小鼠在整个治疗期间存活，表明在治疗期结束时，PEG-DiDex治疗增加了存活小鼠的比例。这些数据表明PEG-DiDex可以延长(NZB×NZW)F1小鼠的寿命。
[0326] 评估治疗引起的副作用
[0327] PEG-DiDex治疗不影响骨质量
[0328] 外周双X射线吸收测定法以20毫米/秒的扫描速度和0.2×0.2毫米的分辨率进行。微型计算机断层扫描参数如下：电压48千伏，电流187微安，曝光时间620毫秒，分辨率6.07微米，铝滤光片0.5毫米。用NRecon和DataViewer软件(SkyScan)进行三维重建。在股骨中心内选取感兴趣的多边形区域的骨小梁进行分析，起始于生长板近端20个切片(0.25mm)，并向近端延伸80个切片(0.99mm)。用CTAn软件(SkyScan)量化小梁骨容积(BV/TV)，平均骨矿化密度(BMD)，小梁数量和厚度。
[0329] 骨质疏松症是长期使用糖皮质激素的主要不良副作用。为了研究PEG-DiDex对骨骼的影响，对股骨骨矿化密度和微观结构进行了评估。PEG-DiDex组骨小梁骨容积(BV/TV)和骨小梁厚度与生理盐水组的平均值没有显著性差异(图7B，C；P>0.05)，表明PEG-DiDex不会对骨容积或骨的小梁厚度造成负面影响。PEG-DiDex治疗的小鼠的平均骨矿化密度(BMD)和骨小梁数目显着高于生理盐水组和Dex组(图7A，D；P<0.05)。与NZW小鼠(作为健康对照)相比，即使生理盐水组也表现出显著降低的BMD，BV/TV和小梁厚度值(数据未显示)。因此，PEG-DiDex治疗不仅可以避免长期糖皮质激素治疗引起的骨质疏松症，而且可以改善由SLE，类风湿性关节炎的其它并发症引起的骨损伤。
[0330] PEG-DiDex治疗不会导致外周血白细胞减少
[0331] 糖皮质激素治疗与免疫抑制有关。因此，我们监测了实验时间过程中的外周血白细胞(WBC)计数水平。与健康对照小鼠相比，其他三组的外周血白细胞(WBC)计数显著降低(数据未显示)。但与Dex组相比，PEG-DiDex组表现出显著更高的WBC计数(图7D；P<0.05)。Dex组白细胞计数低于生理盐水组，即使没有显著性差异。PEG-DiDex和生理盐水组之间的WBC计数没有显著差异。因此，PEG-DiDex治疗改善了由糖皮质激素治疗引起的外周WBC减少。
[0332] PEG-DiDex治疗没有诱导肾上腺萎缩
[0333] 糖皮质激素治疗可以抑制下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴从而导致肾上腺萎缩。因此，在尸检时，我们称量了每只小鼠肾上腺的质量。Dex组的平均肾上腺质量显著低于PEG-DiDex组(图7F；P<0.05)。PEG-DiDex和生理盐水组之间的肾上腺质量没有显着差异(图7F；P>0.05)。这些数据表明PEG-DiDex治疗不会引起肾上腺萎缩。
[0334] 总之，PEG-DiDex治疗将延长寿命，减少严重肾炎的发生率，降低全身毒性和副作用的风险，从而促进狼疮型肾炎的治愈。
[0335] 虽然已经参考特定实施例描述了本发明，但应该理解的是，这些实施例仅仅是对本发明的原理和应用的说明。因此应该理解，可以对说明性实施例作出许多修改，并且可以设计出其它布置而不脱离如所附权利要求中所要求保护的本发明的精神和范围。
[0336] 本申请中引用的所有出版物，专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物，专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入本文。
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