结晶抗体的组合物和方法

阅读:790发布:2020-10-27

专利汇可以提供结晶抗体的组合物和方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及结晶抗人类TNFα(hTNFα) 抗体 和抗体 片段 的批量结晶方法,其容许在工业规模上生产所述抗体;控制抗体晶体例如,抗-hTNFα抗体片段的晶体的大小的方法,包含所述晶体的组合物以及利用所述晶体和组合物的方法。,下面是结晶抗体的组合物和方法专利的具体信息内容。

1.一种制备期望的基本上一致的大小的抗体晶体的方法,所述方法包括以下步骤:
a)在能够使抗体晶体形成的条件下提供性结晶混合物,其包含抗体和至少一种结晶试剂;和
a)在控制的条件下搅拌所述结晶混合物,从而形成处于期望的平均大小范围内的抗体晶体。
2.权利要求1的方法,其中所述控制的条件相当于以约1到约200rpm范围内的速度在滚筒容器中搅拌所述结晶混合物。
3.权利要求2的方法,其中所述控制的条件相当于在具有约2到约100cm范围内直径的滚筒容器中搅拌所述结晶混合物。
4.权利要求2的方法,其中所述控制的条件相当于在滚筒容器中搅拌所述结晶混合物,其中所述滚筒容器的总内体积的约1%到约100%填充了所述结晶混合物。
5.权利要求3的方法,其中所述控制的条件相当于在滚筒容器中搅拌所述结晶混合物,其中所述滚筒容器的总内体积的约1%到约100%填充了所述结晶混合物。
6.权利要求1到5的任一项的方法,其中所述控制的条件相当于在滚筒容器中搅拌所述结晶混合物约30分钟到约20天。
7.权利要求1到5的任一项的方法,其中所述控制的条件相当于在约-15℃到约+50℃的范围的温度下在滚筒容器中搅拌所述结晶混合物。
8.权利要求1到5的任一项的方法,其中所述搅拌包括滚转、搅动、摇动和/或翻滚所述结晶混合物。
9.权利要求1到5的任一项的方法,其中所述结晶试剂是聚亚烷基多元醇。
10.权利要求9的方法,其中所述结晶试剂是聚亚烷基二醇。
11.权利要求10的方法,其中所述结晶试剂是聚乙二醇。
12.权利要求1到5的任一项的方法,其中所述晶体包含在约1到约1000μm范围内的一致的晶体颗粒直径和/或长度。
13.权利要求1到5的任一项的方法,其中所述抗体是抗体片段
14.权利要求13的方法,其中所述抗体片段是抗-hTNFα抗体结合片段。
15.权利要求13的方法,其中所述抗体片段是Fab或F(ab’)2片段。
16.权利要求15的方法,其中所述抗体片段是MAK195F,其是由具有保藏编号ECACC
87050801的杂交瘤细胞系产生的MAK195的F(ab’)2片段。
17.权利要求16的方法,其中所述MAK195F以约0.5到约280mg/ml范围内的起始蛋白质浓度存在,在约15到约25℃范围内的温度下、以约5到约100rpm范围内的速度、在滚筒容器中搅拌约1到约60天。
18.权利要求17的方法,其中所述晶体包含处于约1到约200μm范围内的控制的平均晶体颗粒长度。
19.可通过权利要求1到5的任一项的方法获得的抗体晶体。
20.一种结晶抗-hTNFα抗体结合片段的批量结晶方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供水性结晶混合物,其包含抗体和至少一种聚亚烷基二醇作为结晶试剂;和b)孵育所述水性结晶混合物直到所述抗体的晶体形成;
其中所述至少一种聚亚烷基二醇(a)在一个步骤中,或(b)在超过一个步骤中提供,其中在步骤中形成的所述抗体晶体在随后的步骤中不被移除。
21.权利要求20的方法,其中所述抗体是抗体片段。
22.权利要求20的方法,其中所述水性结晶混合物的pH值处在约pH4到约6.5的范围内。
23.权利要求20的方法,其中所述水性结晶混合物包含缓冲液。
24.权利要求23的方法,其中所述缓冲液包含乙酸盐缓冲液和/或柠檬酸盐缓冲液。
25.权利要求23的方法,其中所述缓冲液包含乙酸钠和/或柠檬酸钠。
26.权利要求23的方法,其中所述缓冲液以最高达约0.5M的浓度存在于所述水性结晶混合物中。
27.权利要求20-22的任一项的方法,其中所述聚亚烷基二醇具有约400到约
10,000g/mol的范围内的平均分子量。
28.权利要求27的方法,其中所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇。
29.权利要求20-22的任一项的方法,其中所述聚亚烷基二醇以总体积的约5到约
30%(w/v)的范围内的终浓度存在于所述结晶混合物中。
30.权利要求29的方法,其中所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇。
31.权利要求1-5和20-22的任一项的方法,其中满足以下另外结晶条件中的至少一种:
a)孵育进行约1小时到约250天;
b)孵育在约-15℃和约+50℃之间的温度下进行;和
c)所述结晶混合物包含约0.5到约280mg/ml范围内的浓度的抗体片段。
32.权利要求1-5和20-22的任一项的方法,进一步包括干燥所述晶体的步骤。
33.权利要求31的方法,进一步包括干燥所述晶体的步骤。
34.权利要求31的方法,其中所述结晶混合物包含晶体和天然母液,并且其中所述方法进一步包括用人工的母液交换天然的母液的步骤。
35.权利要求1-5和20-22的任一项的方法,其中所述结晶混合物包含约1mL到约
20,000升范围内的批量体积。
36.权利要求20的方法,其中所述结晶在晶体大小控制的条件下进行。
37.权利要求36的方法,其中所述控制的条件包括以约1到约200rpm范围内的速度在滚筒容器中搅拌所述结晶混合物。
38.权利要求36的方法,其中所述控制的条件包括在具有约2到约100cm范围内直径的滚筒容器中搅拌所述结晶混合物。
39.权利要求36的方法,其中所述控制的条件包括在滚筒容器中搅拌所述结晶混合物,其中所述滚筒容器的总内体积的约1%到约100%填充了所述结晶混合物。
40.权利要求37的方法,其中所述控制的条件包括在滚筒容器中搅拌所述结晶混合物,其中所述滚筒容器的总内体积的约1%到约100%填充了所述结晶混合物。
41.权利要求36到40的任一项的方法,其中所述控制的条件包括在滚筒容器中搅拌所述结晶混合物约30分钟到约20天。
42.权利要求36到40的任一项的方法,其中所述控制的条件包括在约-15℃到约+50℃的范围内的温度下在滚筒容器搅拌所述结晶混合物。
43.权利要求36到40的任一项的方法,其中所述搅拌包括滚转、搅动、摇动和/或翻滚所述结晶混合物。
44.一种抗-hTNFα抗体片段的晶体。
45.一种抗-hTNFα抗体片段的晶体,所述晶体可通过权利要求1-5、20-22和36-40任一项的方法获得。
46.权利要求44的晶体,其中所述晶体包含针状的形态。
47.权利要求45的晶体,其中所述晶体包含针状的形态。
48.可通过权利要求36的方法获得的晶体,其中所述抗体片段是多克隆抗体片段或单克隆抗体片段。
49.可通过权利要求36的方法获得的晶体,其中所述抗体片段选自由嵌合抗体、人源化抗体、非糖基化抗体、人类抗体和小鼠抗体的片段构成的组。
50.可通过权利要求36的方法获得的晶体,其中所述抗体片段是IgG抗体的片段。
51.权利要求50的晶体,其中所述抗体选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体构成的组。
52.权利要求48-51的任一项的晶体,其中所述抗体片段是Fab或F(ab’)2片段。
53.权利要求52的晶体,其中所述抗体片段是MAK195F,其是由具有保藏编号ECACC
87050801的杂交瘤细胞系产生的抗体MAK195的F(ab’)2片段。
54.药物组合物,所述组合物包含:(a)根据权利要求1到5、20到22和36到40的任一项的方法制备的抗体的晶体,和(b)至少一种药物赋形剂;其中所述组合物作为固体、半固体或液体制剂提供。
55.药物组合物,所述组合物包含:(a)根据权利要求1到5、20到22和36到40的任一项的方法制备的抗体的晶体,和(b)至少一种药物赋形剂,其中所述赋形剂包埋或密封所述晶体。
56.权利要求54的药物组合物,其中所述抗体以大于约1mg/ml的浓度存在。
57.权利要求54的药物组合物,其中所述抗体以大于约200mg/ml的浓度存在。
58.权利要求55的药物组合物,其中所述抗体以大于约1mg/ml的浓度存在。
59.权利要求55的药物组合物,其中所述抗体以大于约200mg/ml的浓度存在。
60.权利要求54或55的药物组合物,其中所述组合物是包含0.1到99.9%(w/w)的抗体晶体的固体。
61.权利要求54或55的药物组合物,其中所述赋形剂包含至少一种聚合的生物可降解的或非生物可降解的载体和/或至少一种油或脂质载体。
62.根据权利要求61的药物组合物,其中所述聚合载体包含选自以下构成的组的至少一种聚合物:聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(基酸)、聚(酸酐)、聚(缩酚酸肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共聚-羟基乙酸)或PLGA、聚(β-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚(二杂环己)、聚(乙二醇)、聚(羟基丙基)甲基丙烯酰胺、聚(有机)磷腈、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、来酸酐烷基乙烯基醚共聚物、复合多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原蛋白、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡聚糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、其共混物和共聚物。
63.可注射的液体组合物,其包含可通过权利要求1到5、20到22和36到40的任一项的方法获得的抗体晶体,其中所述抗体以约10到约400mg/ml的范围内的浓度存在。
64.晶体浆液组合物,其包含可通过权利要求1到5、20到22和36到40的任一项的方法获得的抗体晶体,其中所述抗体以大于约100mg/ml的浓度存在。
65.一种治疗哺乳动物的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的、可通过权利要求1到5、20到22和36到40的任一项的方法获得的抗体晶体的步骤。
66.一种治疗哺乳动物的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求
54的组合物的步骤。
67.一种治疗哺乳动物的方法,所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求
55的组合物的步骤。
68.权利要求66或67的方法,其中所述组合物通过胃肠外途径、口服途径或通过注射来施用。
69.一种在个体中治疗hTNFα相关的病症的方法,其中所述方法包括施用治疗有效量的权利要求19和46-51的抗体晶体的步骤。
70.权利要求69的方法,其中所述hTNFα相关的病症选自以下构成的组:自体免疫疾病,特别是类湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎和痛风性关节炎、过敏症、多发性硬化、自体免疫性糖尿病、自体免疫性葡萄膜炎和肾病综合征;传染性疾病、移植排斥或移植体-抗-宿主疾病、恶性肿瘤部病症、肠病症、心脏病症、炎性骨骼病症、骨吸收疾病、酒精性肝炎、病毒性肝炎、暴发型肝炎、凝血紊乱、灼伤、再灌注损伤、瘢痕瘤形成、瘢痕组织形成、发热、牙周病、肥胖和放射毒性;脊柱关节病、肺部病症、冠状动脉的病症、代谢病症、贫血、疼痛、肝脏的病症、皮肤病症、指甲病症,或脉管炎、Behcet′s病、关节强硬性脊椎炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、再狭窄、糖尿病、贫血、疼痛、克罗恩氏病-相关的病症、青少年类风湿性关节炎(JRA)、丙型肝炎病毒感染屑病、银屑病性关节炎和慢性斑银屑病、年龄-相关的恶病体质、阿尔茨海默氏病、脑水肿、炎性脑损伤、慢性疲劳综合征、皮肌炎、药物反应、脊髓中和/或周围的水肿、家族性周期性发热、Felty’s综合征、纤维化、血管球性肾炎(例如链球菌感染后的血管球性肾炎或IgA肾病)、假肢的松动、显微镜的多脉管炎、混合的结缔组织病症、多发性骨髓瘤、癌和恶病体质、多器官病症、髓发育不良综合征、睾丸炎、骨质溶解、胰腺炎、包括急性的、慢性的和胰脓肿、牙周病多肌炎、渐进性肾衰竭、假性痛风、坏疽性脓皮病、复发性多软骨炎、风湿性心脏病、结节病、硬化性胆管炎、中风、胸腹的主动脉瘤修复(TAAA)、TNF受体相关的周期性综合征(TRAPS)、与黄热病疫苗接种相关的症状、与相关的炎症性疾病、慢性耳炎症、或儿科的耳炎症、葡萄膜炎、坐骨神经痛、前列腺炎、子宫内膜异位、脉络膜新血管形成、狼疮、Sjogren’s综合征和湿润黄斑变性。
71.权利要求69的方法,其中所述hTNFα相关的病症选自以下构成的组:获得性免疫缺陷疾病综合征、获得性免疫缺陷相关的疾病、获得恶性贫血、急性冠状动脉综合征、急性的和慢性疼痛、急性自发性多发性神经炎、与器官移植相关的急性免疫疾病、与器官移植相关的急性或慢性免疫疾病、急性炎性的脱髓鞘多神经根神经病、急性缺血、急性肝病、急性风湿热、急性横贯性脊髓炎、阿狄森氏病、成年人(急性)呼吸窘迫综合征、成年人Still′s病、酒精性肝硬变、醇类-诱导肝脏损伤、过敏性疾病、过敏症、脱发、斑形脱发、阿尔茨海默氏病、过敏性反应、关节强硬性脊椎炎、关节强硬性脊椎炎相关肺病、抗磷脂抗体综合征、再生障碍性贫血、动脉硬化、关节病、哮喘、动脉粥样化疾病/动脉硬化、动脉粥样硬化、特异反应性过敏、特异反应性湿疹、特异反应性皮炎、萎缩性自体免疫甲状腺机能减退、自体免疫大疱疾病、自体免疫性皮炎、自体免疫性糖尿病、与链球菌属感染相关的自体免疫性病症、自体免疫性肠病、自体免疫性溶血性贫血症、自体免疫性肝炎、自体免疫性听丧失、自体免疫性淋巴组织增生的综合征(ALPS)、自体免疫性介导低血糖、自体免疫性心肌炎、自体免疫性中性白细胞减少、自体免疫性卵巢功能早期衰退、自体免疫性血小板减少(AITP)、自体免疫性甲状腺病、自体免疫性葡萄膜炎、闭塞性细支气管炎、白塞氏病、睑炎、支气管扩张、大疱性天疱疮、恶病体质、心血管疾病、灾难性抗磷脂综合征、乳糜泻、颈脊椎病、衣原体、胆汁郁积、慢性活动性肝炎、慢性嗜酸细胞性肺炎、慢性疲劳综合征、慢性免疫疾病相关用器官移植、慢性缺血、慢性肝脏疾病、慢性皮肤粘膜念珠菌病、瘢痕天疱疮、具有多发性硬化风险的临床上分离的综合征(CIS)、常见的可变的免疫缺陷、常见可变的低丙种球蛋白血症、结缔组织疾病相关的间质肺病、结膜炎、库姆阳性溶血性贫血症、儿童期发作的精神错乱、慢性阻塞性肺病(COPD)、克罗恩氏病、起因不明的自体免疫性肝炎、起因不明的纤维性肺泡炎、泪囊炎、抑郁症、皮炎硬皮症、皮肌炎、皮肌炎/多肌炎相关肺病、糖尿病性视网膜病、糖尿病、扩张型心肌炎、盘状红斑狼疮、盘形疝形成、腰椎间盘突出、弥漫性血管内凝血、药物-诱导的肝炎、药物-诱导的间质肺病、药物诱发的免疫性溶血性贫血、心内膜炎、子宫内膜异位、内眼炎、肠病滑膜炎、巩膜表层炎、多形性红斑、主要多形性红斑、雌性不育、纤维化、纤维化的肺病、妊娠期的天疱疮、巨细胞性动脉炎(GCA)、肾小球肾炎、甲状腺肿的自体免疫性甲状腺机能减退(Hashimoto’s病)、古德帕斯彻氏综合征、痛风性关节炎、移植物抗宿主疾病(GVHD)、Grave′s病、B组链球菌(GBS)感染、急性感染性多发性神经根神经炎(GBS)、含血黄素沉着病相关的肺疾病、枯草热、心力衰竭、溶血性贫血、过敏性紫癜、乙型肝炎、丙型肝炎、Hughes综合征、亨廷顿氏舞蹈病、甲状腺机能亢进、甲状旁腺机能减退、自发性白细胞减少症、自发性的血小板减少、自发性帕金森氏病、自发性的间质性肺炎、特应性的肝脏疾病、IgE-介导的过敏症、免疫性溶血性贫血、包涵体肌炎、传染性疾病、传染性眼睛炎性疾病、炎症性肠病、炎性髓鞘脱失病、炎性心脏病、炎性肾病、胰岛素依赖型糖尿病、间质肺炎、IPF/UIP、虹膜炎、青少年的慢性关节炎、青少年的恶性贫血、青少年类风湿性关节炎、Kawasaki′s病、膜炎、keratojuntivitis sicca、Kussmaul疾病或Kussmaul-Meier疾病、兰德里麻痹、Langerhan′s细胞组织细胞增多病、线性IgA疾病、网状青斑、Lyme关节炎、淋巴细胞的渗透性肺病、黄斑变性、男性不育症自发性的或NOS、恶性肿瘤、肾的显微脉管炎、显微镜的多血管炎、混合结缔组织病相关的肺病、Morbus Bechterev、运动神经元病症、粘膜天疱疮、多发性硬化(全部亚型:基本的渐进性的、继发性的渐进性的、复发减轻的,等等)、多器官衰竭、肌痛性脑炎/Royal Free病、重症肌无力、脊髓发育不良综合征、心肌梗死、心肌炎、肾病综合征、神经根病症、神经病、非酒精性脂肪肝、非甲非乙型肝炎、视神经炎、器官移植排斥、骨关节炎、骨质溶解、卵巢癌、卵巢衰竭、胰腺炎、寄生虫的疾病、帕金森氏病、少关节的JRA、天疱疮、落叶状天疱疮、寻常天疱疮、外周动脉闭塞疾病(PAOD)、周围性血管疾病(PVD)、外周动脉疾病(PAD)、晶状体源性葡萄膜炎、静脉炎、多发性结节性动脉炎(或结节性动脉周围炎)、多软骨炎、风湿性多肌痛、灰发症、多关节的JRA、多内分泌腺的缺陷综合症、多肌炎、多腺体缺陷I型和多腺体缺陷II型、风湿性多肌痛(PMR)、传染后的间质的肺病、炎症后的间质的肺病、Post-Pump综合征、卵巢功能早期衰退、夏科氏肝硬变、原发的黏液腺瘤病、原发性帕金森氏综合征、原发性硬化性胆管炎、原发性硬化性肝炎、原发性脉管炎、前列腺和直肠癌和造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、银屑病、1型银屑病、2型银屑病、银屑病性关节炎、银屑病性关节病、继发于结缔组织疾病的肺动脉高血压、多发性结节性动脉炎的肺部表现、纯红血球发育不全、原发性肾上腺机能不全、放射后肺纤维化、反应性关节炎、莱特尔氏病、复发性的德维克氏病、肾病NOS、再狭窄、类风湿性关节炎、类风湿性关节炎相关的间质肺病、风湿性心脏病、SAPHO(滑膜炎、粉刺、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、结节病、精神分裂症、Schmidt′s综合征、硬皮症、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不全、败血症综合征、脓毒性关节炎、脓毒性休克、血清反应阴性的关节痛、酮相关的结缔组织疾病、病相关的肺病、 综合征、Sneddon-Wilkinson皮肤病、精子自体免
疫、脊柱关节病、强直性脊柱炎、多形糜烂性红斑(SJS)、Still′s病、中风、交感性眼炎、全身性炎性反应综合征、全身性红斑狼疮、全身性红斑狼疮相关的肺病、全身性硬化、全身性硬化相关的间质肺病、Takayasu’s病/动脉炎、颞动脉炎、Th2型和Th1型介导疾病、甲状腺炎、中毒性休克综合征、弓形虫视网膜炎、中毒性表皮坏死溶解、横贯性脊髓炎、TRAPS(肿瘤坏死因子受体、伴有黑棘皮病的B型胰岛素抗性、1型过敏性反应、1型自体免疫性肝炎(标准的自体免疫或狼疮样肝炎)、2型自体免疫肝炎(抗LKM抗体肝炎)、II型糖尿病、肠溃疡性关节病、溃疡性结肠炎、荨麻疹、普通的间质性肺炎(UIP)、葡萄膜炎、脉管炎弥散性肺病、脉管炎、春季结膜炎、病毒视网膜炎、白斑病、Vogt-Koyanagi-Harada综合征(VKH综合征)、眶坏死性肉芽肿病、湿润黄斑变性、伤口愈合、耶尔森氏菌和沙氏菌相关关节病。
72.权利要求19的抗体晶体用于制备治疗hTNFα相关疾病的药物组合物的用途。
73.一种包含hTNF抑制剂的晶体的药物组合物,其中所述晶体的生物利用率和安全性相对于所述hTNF抑制剂的液体组合物不降低。

说明书全文

结晶抗体的组合物和方法

[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请是2007年8月8日提交的美国临时申请系列号NO.60/963,964的部分延续,并要求它的优先权,通过引用将其完全合并在此。发明领域
[0003] 本发明涉及用于结晶抗体,包括抗体片段的组合物和方法,以及其用途。在一个实施方式中,本发明涉及在工业规模上结晶抗体片段,例如抗人类肿瘤坏死因子α(hTNFα)抗体片段的方法,以及控制抗体和抗体片段晶体的大小的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 有超过100种单克隆抗体当前在2或3期临床研究中被评估,单克隆抗体(mAb)市场被认为是最有前景的生物药市场之一。由于这些药物将要以通常超过100mg的单次剂量递送给患者,急需找到满足稳定性和安全性需求以及患者顺应性的适合的制剂。
[0006] 高度浓缩的液体mAb制剂具有比更低浓缩的制剂更高的粘度,其可能阻碍它们通过更为亲近患者的高规格针头的可注射性。此外,mAb分子聚集的倾向随着提高的浓度指数性地提高,妨碍了关于安全性和稳定性需求的顺应性。高mAb剂量的递送因而限于大的体积,其一般必需通过输注来递送。然而,这种给药方式是花费密集的,显著地降低了患者顺应性。
[0007] 为此,晶体形式的mAb对于药物物质的用途是期望的。然而,由于与结晶条件相关的公知的不可预测性,进行了很少的尝试来评估这种策略。虽然蛋白质胰岛素已经被成功地结晶,大多数其他蛋白质倾向于形成无序的沉淀而不是晶体。确定特定蛋白质的结晶条件因而不是轻而易举的任务。迄今为止,没有一般规则来容许人们可靠地预测所选蛋白质的成功结晶条件。
[0008] 几种筛选系统是商业上可获得的(例如,Hampton 1和2和WizardI和II),其容许在微升级别上筛选特定蛋白质的潜在适合的结晶条件。然而,使用这样的筛选系统获得的阳性结果不必然能转变为在更大的、工业可应用的批量规模上成功的结晶(参见Jen,A.等人(2001)Pharm.Res.18(11):1483)。
[0009] Baldock等人((1996)J.Crystal Growth,168(1-4):170-174)报道了用于结晶条件的初步筛选的微批量和蒸气扩散的比较。使用一组结晶溶液筛选了六种商业上可获得的蛋白质。使用常见的蒸气扩散方法和微批量结晶方法的三种变体进行了筛选。在所鉴定的58种结晶条件中,43种(74%)由微批量鉴定出,而41种(71%)由蒸气扩散鉴定出。通过两种方法鉴定出26种条件,如果根本不使用微批量,将错过17种(29%)。这些数据显示了在起始结晶筛中最常使用的蒸气扩散技术不能保证阳性结果。
[0010] 因而,各种蛋白质的结晶不能使用预定的方法或算法成功地进行。当然,过去20-30年来技术发展了。例如,A.McPherson提供了关于大分子结晶的趋性、策略、试剂和设备的广泛的详细描述。然而,他没有提供一种方法,来确保本领域技术人员以合理的成功期望实际地结晶任何给定大分子。McPherson声称,例如:“为了鼓舞或促进分子之间的特异性结合相互作用和在一旦它们形成时稳定它们,无论过程如何,在精炼和优化系统、溶剂和溶质的参数方面无法免除努。难题的后一方面一般取决于要结晶的特定蛋白质或核酸的具体的化学和物理性质。”(McPherson,A.(1999)Crystallization of BiologicalMacromolecules.Cold Spring Harbor,New York,Cold Spring HarborLaboratory Press,p.159)。蛋白质结晶领域的技术人员广泛接受的是,对于处理新的目标蛋白质、应用具体的过程步骤和从而获得期望的晶体,没有一种算法是可靠的。
[0011] 由于分子的柔性,抗体特别难以结晶。然而,免疫球蛋白晶体的实例确实存在,例如Bence Jones蛋白,其是异常的Ig轻链二聚体的晶体(Jones,H.B.(1848).Philosophical Transactions of the RoyalSociety.London.138:55-62)。此外,Ig重链寡聚体的晶体(von Bonsdorf,B.,H.Groth,等人(1938).Folia Haematoloaia 59:184-208)和正常结构的人免疫球蛋白(与两个轻链连接的两个重链)的晶体也已经被描述(Putnam,F.W.(1955)Science 122:275-7:Terry,W.D.,等人(1968)Nature 220(164):
239-41;Huber,R.,等人(1976).Nature 264(5585):415-20;Ra-jan,S.S.,等人(1983)Mol.Immunol.20(7):787-99;Harris,L J., 等 人 (1992)Nature)360(6402):369-72,Nisonoff,A.,等人(1968)Cold Spring Harbor Symposia on Quant.Biol.32:89-93;
Connell.G.E.,等人(1973)Canad.J.Biochem.51(8):1137-41;Mills,L E.,等人(1983)Annals of Int.Med.99(5):601-4;and Jentoft,J.E.,等 人 (1982)Biochem.21(2):
289-294。例如,Margolin和同事报道了,治疗性单克隆抗体trastuzumab(Herceptin )可以被结晶(Shenoy,Govardhan等人2002),晶体trastuzumab悬浮液在小鼠肿瘤模型中是治疗有效的,因而展现了晶体trastuzumab的生物学活性的保留(Yang,M.X.,等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.100(12):6934-6939)。然而,没有描述形成同质性抗体晶体制品的可预测的和可靠的方法。
[0012] WO-A-02/072636公开了完全整体的抗体Rituxi-mab、Infliximab和Trastuzumab的结晶。大多数结晶实验使用具有不清楚的毒性的化学物质进行,例如,咪唑、2-环己基-乙烷磺酸盐(CHES)、甲基戊二醇、硫酸和2-吗啉-乙烷磺酸盐(MES)。该申请的许多实施例中使用了晶种来启动结晶。
[0013] 人类TNFα(hTNFα)被认为是许多疾病的致病因素。因而,对于治疗hTNFα相关的病症的适合的方法存在很大的需求。一种有前途的治疗方法是施用药学上有效剂量的抗TM人类TNFα抗体。近来,称为D2E7、或一般称为Adalimumab 的一种这样的抗体正在以商品名HUMIRA (Abbott Laboratories)出售。
[0014] WO-A-2004/009776公开了使用直滴蒸气扩散(sitting drop vapordiffusion)技术在微升级别上的结晶实验,其涉及混合等分体积(1μL)的不同结晶缓冲液和D2E7 F(ab)’2或Fab片段。没有公开D2E7抗体或其片段的大小控制的结晶的方法。
[0015] EP-A-0 260 610公开了鼠抗-hTNFα单克隆抗体的s系列,即,中和抗体AM-195,也称为MAK195,由保藏为ECACC 87050801的杂交瘤细胞系产生。MAK195(例如,MAK195F)TM的F(ab’)2片段也称为Afelimomab 。没有公开MAK195的晶体和MAK195F的晶体。这些抗体的批量接近迄今为止没有成功。
[0016] 目前,没有提供抗-hTNFα抗体片段晶体的生产的可获得的技术教导。此外,没有教导提供抗体分子、包括抗体片段,例如抗-hTNFα抗体的片段的大小控制的结晶。
[0017] 因而,对于抗体和抗体片段,例如抗-hTNFα抗体和抗体片段的适合的结晶条件,特别是批量结晶条件,以及建立用于产生适合于工业生产的晶体体积的结晶过程条件存在着需求。对于不使用可能不利地影响这些抗体的药物可用性的毒性试剂的结晶方法也存在着需求。对于容许晶体大小的选择和控制的、抗体或抗体片段,例如Fab或F(ab’)2片段的结晶方法,仍然存在着另外的需求。
[0018] 发明概述
[0019] 令人惊讶地,通过本发明解决了上述难题,本发明提供了结晶方法和由此产生的晶体以及它们的用途。
[0020] 在一个方面,本发明提供了用于期望的平均均匀粒度范围的抗体或抗体片段晶体的大小控制制备的方法,通过在允许抗体或抗体片段晶体的形成的条件下提供包含抗体或抗体片段和至少一种结晶试剂的性结晶混合物、在控制的条件下搅拌所述结晶混合物,从而形成处于期望的平均大小范围内、优选的基本上一致的抗体或抗体片段晶体。
[0021] 所述控制的条件有几种实施方式,其可以单独地或以任何组合或顺序一起地使用。在一个实施方式中,所述控制的条件包括以约1到约200rpm范围内的速度在滚筒容器(roller container)中搅拌结晶混合物或相当于结晶混合物的搅拌。在另一个实施方式中,所述控制的条件包括在具有约2到约100cm直径的滚筒容器中搅拌结晶混合物或相当于结晶混合物的搅拌。在另一个实施方式中,所述控制的条件相当于在滚筒容器中结晶混合物的搅拌,或包含搅拌结晶混合物,其中所述滚筒容器的总内体积的约1到约100%填充了所述结晶混合物。在又一个实施方式中,所述控制的条件相当于在滚筒容器中结晶混合物的搅拌或包含搅拌结晶混合物约30分钟到约20天。在又一个实施方式中,所述控制的条件相当于在约-15到约+50℃范围的温度下在滚筒容器中结晶混合物的搅拌或包含搅拌结晶混合物。本发明的方法的搅拌步骤可以包括在相当于滚动的条件下滚动、搅拌、摇动和/或翻滚结晶混合物。任何数量的上述条件可以以任何顺序组合。
[0022] 在另一个方面,本发明的方法提供了抗体或抗体片段晶体的小规模和大规模生产,所述晶体包含直径和/或长度在约1到约1000μm范围内的均匀晶体颗粒。在另一个实施方式中,所述晶体包括在约1到约200μm范围内的控制的平均晶体颗粒长度。根据进一步的实施方式,本发明是上述结晶方法还可以这样进行,从而在步骤a)中获得的结晶混合物可以补充合适数量的预先存在的抗体或抗体片段晶体作为晶种以启动或强化结晶。
[0023] 在一个实施方式中,被结晶的抗体是任何类型或种类的完整抗体,或其抗体片段。在一个实施方式中,所述抗体片段是IgG抗体,例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的片段。
所述抗体片段可以是例如,嵌合或非嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体、双可变域免疫TM
球蛋白(DVD-Ig )、非糖基化的抗体、人类抗体和非人类抗体如小鼠抗体的多克隆抗体片段或单克隆抗体片段。在特定的实施方式中,要结晶的抗体是非嵌合的人类抗体,任选地被进一步加工以改善抗原结合,或其片段。
[0024] 在一个实施方式中,所述抗体片段是抗-hTNFα抗体结合片段。在特定的实施方式中,所述抗体片段是Fab或F(ab’)2片段,例如,MAK195F、具有保藏编号ECACC 87050801的杂交瘤细胞系产生的抗体MAK195的F(ab’)2片段。
[0025] 在另一个方面,本发明提供了结晶抗-hTNFα抗体或抗体结合片段的批量结晶方法,通过提供包含抗体或抗体片段(例如,溶解的形式)和至少一种聚亚烷基多元醇,例如聚亚烷基二醇作为结晶试剂的水性结晶混合物,并孵育所述水性结晶混合物直到形成所述抗体或抗体片段的晶体,其中所述聚亚烷基二醇在(a)一个步骤或(b)超过一个步骤中提供,其中在步骤中形成的抗体晶体在下一个步骤之前不被移除。
[0026] 在另一个实施方式中,所述水性结晶混合物的pH值在约pH 4到约6.5、特别是约4.5到约6.0、或约4.8到约5.6、或约5.0到约5.4的范围内,例如约5.1、约5.2或约5.3。
上文所列的结晶混合物通常通过向蛋白质溶液中添加溶液中的或作为固体的结晶试剂来获得。两种溶液可以是,但不必须是,缓冲的。初始结晶溶液中的结晶试剂浓度和缓冲液摩尔浓度通常高于结晶混合物中的,因为当添加蛋白质溶液时它被稀释。在一个实施方式中,是水性结晶混合物可以含有至少一种缓冲液。所述缓冲液可以包含,例如,乙酸盐和/或柠檬酸盐成分,或其金属盐,例如,钠或盐,例如乙酸钠和/或柠檬酸钠。所述盐通过添加酸,例如乙酸或柠檬酸调节至所需的pH值。
[0027] 在结晶方法的实施方式中,在水性结晶混合物中所述缓冲液浓度(总乙酸盐或总柠檬酸盐)是约0到约0.5M,或约0.02到约0.5M,例如约0.05到约0.3M,约0.07到约0.2M或约0.09到约0.16M。
[0028] 在一个实施方式中,所述聚亚烷基二醇具有约400到约10,000g/mol的平均分子量。例如,所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇(PEG),以总体积约5到约30%(w/v)范围的终浓度存在于所述结晶混合物中。
[0029] 在另一个实施方式中,满足至少一种以下的另外的结晶条件:(1)孵育进行约1小时到约250天,或约1天到约250天、或约13天到约250天,例如,约1天到约30天,或约2天到约10天;(2)孵育在约-15℃到约+50℃,例如约4℃到约37℃或约15℃到约25℃之间的温度下进行;和(3)所述结晶混合物包含在约0.5到约280mg/ml,或约1到200mg/ml或约1到约100mg/ml,例如约1.5到约20mg/ml的范围内,特别是约2到约15mg/ml、或约2到约7mg/ml的的范围内的浓度的抗体或抗体片段。所述蛋白质浓度可以根据用于蛋白质测定的标准方法,例如,通过在适合的波长下,例如280nm下的光密度的测量来测定。
[0030] 在另一个实施方式中,本发明的方法包含干燥所产生的晶体的步骤。适合的干燥方法包括蒸发干燥、喷雾干燥、冻干、真空干燥、流化床干燥、喷雾冷冻干燥、近临界干燥、超临界干燥和氮气干燥。
[0031] 在进一步的实施方式中,本发明的结晶方法进一步包括交换所述结晶母液与不同的液体或缓冲液,例如,含有至少一种不同于用于结晶的聚亚烷基多元醇、具有约300到约8,000道尔顿范围内的摩尔质量的聚亚烷基多元醇的液体或缓冲液,或在此列出的其他(聚合的)载体、脂质载体、或油性载体,例如,通过离心、渗滤、超滤或其他通常使用的缓冲液交换技术。不同的液体或缓冲液可以称为“人工母液”,其不同于晶体的“天然的”结晶母液,并且防止形成的晶体的溶解。mAb晶体制剂中的某些赋形剂具有阻碍晶体溶解的主要功能。这样,聚乙二醇可以在最终组合物中被替代。
[0032] 在优选的实施方式中,进行所述批量结晶方法,例如,使用PEG作为结晶试剂的,从而孵育在约3到约10mg/ml的抗体浓度下在约20℃的温度下进行约3天到约60天。
[0033] 在本发明的特定的实施方式中,在两个或更多个步骤中分步地添加聚亚烷基二醇,例如,在2、3、4、5、6、7、8、9或10个步骤中。令人惊讶地,通过这种分步添加的方法,抗体或抗体片段晶体的总回收率可以被进一步提高,而基本上没有非期望的无定形蛋白质聚集物或沉淀的并发形成。
[0034] 根据另一个实施方式,批量结晶在以下结晶混合物条件下进行:(1)聚亚烷基二醇:PEG 4000,约8到约12%(w/v)(2)缓冲液:乙酸钠或柠檬酸钠,约0到约0.3M(总乙酸盐或柠檬酸盐);(3)pH值(终):约5.0到约5.4;(4)抗-hTNFα片段浓度:约3到约10mg/ml;(5)温度:约18到约24℃;(6)批量体积:约1到约100l;(7)搅拌:无;或约1到约100rpm;(8)持续时间:约1到约60天。
[0035] 在一个实施方式中,本发明提供了结晶抗-hTNFα抗体或抗体结合片段的批量结晶方法,通过提供包含抗体或抗体片段和至少一种聚亚烷基二醇作为结晶试剂的水性结晶混合物;孵育所述水性结晶混合物直到形成所述抗体或抗体片段的晶体;其中所述至少一种聚亚烷基二醇在(a)一个步骤或(b)超过一个步骤中提供,其中在步骤中形成的抗体晶体在后续步骤之前或期间不被移除,和其中所述结晶在晶体大小控制的条件下进行。
[0036] 所述控制的条件可以包含任何组合的一种或更多种控制的条件。在一个实施方式中,所述控制的条件以约1到约200rpm范围内的速度在滚筒容器中相当于结晶混合物的搅拌包包括搅拌结晶混合物。在另一个实施方式中,所述控制的条件在具有约2到约100cm直径的滚筒容器中相当于或包含搅拌结晶混合物。在又一个实施方式中,所述控制的条件相当于或包括在滚筒容器中搅拌结晶混合物,其中所述滚筒容器的总内体积的约1到约100%填充了所述结晶混合物。在又一个实施方式中中,所述控制的条件相当于或包括在滚筒容器中搅拌结晶混合物,其中所述滚筒容器的总内体积的约1到约100%填充了所述结晶混合物。在再另一个实施方式中,所述控制的条件相当于或包括在滚筒容器中搅拌结晶混合物约30分钟到约20天,或在约-15℃到约+50℃范围内的温度下在滚筒容器中。搅拌步骤可以相当于或包括结晶混合物的滚动、搅拌、摇动和/或翻滚。
[0037] 在另一个方面,本发明提供了抗-hTNFα抗体或抗体片段的晶体,如通过在此定义的任何方法所制备的。
[0038] 在一个实施方式中,所述晶体具有针的形状。例如,本发明的晶体可以以针状的形态为特征,最大长度(l)约2到约500μm或约100到约300μm,长度/直径(l/d)为约1到约100。这样的针状晶体的高大致地在直径的尺度上。
[0039] 在另一个方面,本发明提供了药物组合物,包含:(a)根据在此定义的方法制备的抗体或抗体片段的晶体;和(b)稳定地维持所述抗体晶体的至少一种药物赋形剂;其中所述组合物作为固体、半固体或液体制剂提供。在另一个实施方式中,本发明提供了药物组合物,包含:(a)根据本发明的方法制备的抗体的晶体,和(b)至少一种药物赋形剂,其中所述赋形剂包埋或密封所述晶体。
[0040] 在另一个实施方式中,所述抗体以大于约1mg/ml的浓度存在。在特定的实施方式中,所述抗体以大于约200mg/ml,例如约200到约600mg/ml,或约300到约500mg/ml的浓度存在。在另一个实施方式中,所述药物组合物是包含约0.1到约9.9%(w/w)的抗体晶体的固体。
[0041] 在一个实施方式中,所述赋形剂包含至少一种聚合的生物可降解的或非生物可降解的载体和/或至少一种油或脂质载体,包括其组合物或共混物以及其聚合物
[0042] 示范性的聚合载体包含选自以下构成的组的至少一种聚合物:聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(基酸)、聚(酸酐)、聚(缩酚酸肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共聚-羟基乙酸)或PLGA、聚(β-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚(二杂环己)、聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(羟基丙基)甲基丙烯酰胺、聚(有机)磷腈、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、来酸酐烷基乙烯基醚共聚物、复合多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原蛋白、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖和多糖、羟乙基淀粉、糖胺聚糖、硫酸化多糖、其共混物和共聚物,以及SAIB。
[0043] 脂质载体包括脂肪酸和脂肪酸盐、脂肪醇、脂肪族胺、脂肪酸的甘油单酯、二酯和三酯、磷脂、糖脂、固醇和蜡以及相关的类似物质。蜡被进一步分类为天然的和合成的产物。天然的材料包括从植物、动物或矿物质来源获得的蜡,例如蜂蜡、棕榈蜡或蜡。氯化的和乙烯聚合物是合成蜡产物的实例。
[0044] 油(或油状液体)载体包括油(或油状液体)例如,油质的杏仁油、玉米油、花子油、油酸乙酯、十四烷酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油、轻质矿物油、十二醇、橄榄油花生油、杏仁油、芝麻油、豆油、鲨烷、液体甘油三酯、多聚羟乙基化的蓖麻油、液体蜡和高级醇。赋形剂仍然主要连接到载体(封装/包埋):
[0045] 脂质载体包括脂肪酸和脂肪酸盐、脂肪醇、脂肪族胺、脂肪酸的甘油单酯、二酯和三酯、磷脂、糖脂、固醇和蜡以及相关的类似物质。蜡被进一步分类为天然的和合成的产物。天然的材料包括从植物、动物或矿物质来源获得的蜡,例如蜂蜡、棕榈蜡或褐煤蜡。氯化的萘和乙烯聚合物是合成蜡产物的实例。
[0046] 油(或油状液体)载体包括油(或油状液体)例如,油质的杏仁油、玉米油、棉花子油、油酸乙酯、十四烷酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油、轻质矿物油、十二醇、橄榄油、花生油、杏仁油、芝麻油、豆油、鲨烷、液体甘油三酯、液体蜡和高级醇。
[0047] 在另一个方面,本发明提供了可注射的液体组合物,其包含可通过本发明的方法获得的抗体或抗体片段晶体,其中所述抗体或抗体片段以约10到约400mg/ml、或约50到约300mg/ml的范围内,例如约200mg/ml的浓度存在。
[0048] 在另一个方面,本发明提供了晶体浆液组合物,其包含可通过本发明的方法获得的抗体或抗体片段晶体,其中所述抗体或抗体片段以大于约100mg/ml,例如约150到约600mg/ml、或约200到约400mg/ml的浓度存在。
[0049] 在另一个方面,本发明提供了治疗哺乳动物的方法,包括向所述哺乳动物施用有效量的可通过本发明的方法获得的抗体晶体或组合物的步骤。施用晶体和其组合物的方法可以包括,但不限于,通过胃肠外的途径、通过口服途径、通过吸入、通过注射或它们的组合来施用。
[0050] 在特定的实施方式中,本发明提供了在个体中治疗hTNFα相关的病症的方法,包括向所述个体施用治疗有效量的抗体晶体。
[0051] 在另一个方面,本发明提供了本发明的抗-hTNFα抗体晶体用于制备治疗hTNFα相关疾病的药物组合物的用途。
[0052] 本发明还提供了用于药物的上文定义的hTNFα抗体片段晶体。
[0053] 附图的简要描述
[0054] 本发明的上述和其他目的、特征和优点以及本发明本身,根据以下优选的实施方式的描述,与相伴的附图一起阅读时,将被更完全地理解,在附图中:
[0055] 附图1显示了在不同的滚转速度下作为时间的函数的MAK195F晶体的产率。
[0056] 附图2显示了在不同的滚转速度下获得的MAK195F晶体的显微镜图像。
[0057] 附图3显示了滚转速度对MAK195F晶体的晶体长度的影响。对五种不同速度的每一种描述了不同滚转速度的平均颗粒长度。
[0058] 附图4显示了MAK195F样品的二阶导数IR光谱。A晶体悬浮液;B重新溶解的晶体。实线代表来自晶体MAK195F的样品,短划线是液体标准物。分别地,A是用BioATR细胞记录的,B用AquaSpec细胞记录。样品和标准物之间的补偿被分别插入以更好地说明。
[0059] 附图5显示了在25℃保存6个月的MAK195F样品(在18%PEG4,000缓冲液中200mg/mL晶体蛋白质)的二阶导数IR光谱。A晶体悬浮液;B重新溶解的晶体。分别地,A是用BioATR细胞记录的,B用AquaSpec细胞记录。样品和标准物之间的补偿被分别插入以更好地说明。
[0060] 附图6显示了MAK195F晶体悬浮液、液体制剂(都是200mg/mL)和含有PEG 4,000的安慰剂悬浮缓冲液的DSC热象图。
[0061] 附图7显示了SEM获得的MAK195F晶体的代表性的图片。
[0062] 附图8显示了依赖于晶体浓度和针头直径的MAK195F晶体悬浮液的可注射性。
[0063] 发明的详细说明
[0064] A.定义
[0065] “允许抗体晶体形成的条件”是指溶液的任何条件,其在非搅拌条件下引起晶体形成。这意味着提供一种溶液,其含有抗体分子和足够浓度的至少一种结晶试剂以在给定条件下随着时间的过去启动晶体形成,所述条件例如混合物的pH值、温度。
[0066] “相当于”在本发明的意义上意味着以下的:
[0067] 一种特定的结晶技术,其包括在特定几何结构的滚筒容器中以特定速度和/或特定填充体积向结晶混合物施加搅拌,构成了大小控制结晶的“参考系统”。在所述参考系统的描述的指导下,熟练技术人员将能够在不同的条件下进行大小控制的抗体结晶。“不同的条件”包括,例如,滚筒容器中结晶过程的增大或降低规模,或包括施加不同的搅拌条件,例如,通过摇动、搅拌或翻滚的搅拌,或包括搅拌速度的变化,或其组合。“结晶的批量方法”意思是结晶方法包括向含有抗体的结晶混合物添加要结晶的、优选以溶解形式的至少一种结晶试剂的步骤。
[0068] “微尺度结晶方法”是指任何结晶方法,其中结晶混合物的体积在0.1μL和10μL之间,特别是允许在结晶期间蒸气扩散起作用的任何方法。例如,基于蒸气扩散的方法包括步骤,添加小体积的抗体溶液到含有结晶试剂的储备缓冲液的微升范围内,将混合物的液滴置于密封容器中邻近储备缓冲液的等份试样;容许液滴和储备液之间溶剂通过蒸气扩散交换,在这期间液滴中的溶剂成分改变,如果达到适合的结晶条件可以观察到结晶。
[0069] “结晶试剂”是帮助、增强或促进要结晶的抗体的晶体形成的试剂。
[0070] “结晶溶液”含有溶解形式的结晶试剂。优选的,所述溶液是水性系统,即,其液体组成部分主要由水组成。例如,80到100wt.-%,或95到100wt.%,或98到100wt.-%可以是水。术语“贮备溶液”还指“结晶溶液”,如通过蒸气扩散技术的微尺度结晶所使用的。
[0071] “结晶混合物”含有抗体或其片段的水溶液以及结晶溶液。
[0072] “晶体”是物质例如蛋白质的固态的一种形式,其不同于第二固态,即,无定形态,无定形态基本上作为未组织的、非均质的固体存在。晶体具有规则的三维结,一般称为晶格。抗体晶体包含抗体分子的规则的三维阵列(参见,Giege,R-等人,Crystallization of NucleicAcids and Proteins,a Practical Approach,2nd ed.,pp.1-16,OxfordUniversity Press,New York(1999))。
[0073] “整个”或“完整”抗体是在能够体外和/或体内识别和结合它的抗原,例如hTNFα的功能性抗体。抗体可以启动与抗体对其抗原的结合相关的的患者的随后的免疫系统反应,特别是直接细胞毒性、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。抗体分子一般具有由共价地相互结合的两条相同的重链(MW各为约50kDa)、各自与重链之一共价结合的两条相同的轻链(MW各为约25kDa)组成的结构。四条链按照典型的“Y”图形布置。每个重链包括重链可变区(在此缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域,CH1、CH2和CH3。每个轻链包括轻链可变区(在此缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区定区包括一个结构域CL。VH和VL区域可以进一步分成高可变性的区域,称为互补决定区(CDR),与更为保守的称为框架区域(FR)的区域间隔。每个VH和VL一般由三个CDR和四个FR组成,从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。完整抗体分子具有两个抗原结合位点,即,是“二价的”。两个抗原结合位点特异于一个hTNFα抗原,即,所述抗体是“单特异性的”。上述结构在不同物种之间可以变化。
[0074] “单克隆抗体”是来自B淋巴细胞(B细胞)的单个克隆、识别同一抗原决定簇的抗体。完整的单克隆抗体是具有上述典型分子结构、包括两个完整的重链和两个完整的轻链的抗体。单克隆抗体通过将抗体生产B细胞与永生的骨髓瘤细胞融合来产生持续在细胞培养物中生产单克隆抗体的B细胞杂交瘤来产生。其他生产方法是可用的,例如,利用例噬菌体-展示技术、酵母展示技术或RNA展示技术,在细菌、酵母、昆虫、真核或哺乳动物细胞培养物中单克隆抗体的表达;或在遗传修饰的动物,例如、山羊、猪、兔、鸡中,或在已经被修饰以含有和表达全部人类B细胞基因组的转基因小鼠中体内生产;或在遗传修饰的植物,例如烟草和玉米中生产。来自所有这些来源的抗体或片段可以根据本发明来结晶。
[0075] 根据本发明结晶的单克隆抗体包括“嵌合”抗体,其中重链和/或轻链的一部分相同于或同源于来自特定物种的抗体中的相应序列、或属于特定抗体种类或子类,而链的其余部分相同于或同源于来自另一个物种的抗体中的相应序列,或属于另一个抗体种类或子类。小鼠/人类嵌合体的实例含有鼠抗体的可变抗原结合部分和来自人类抗体的恒定部分。
[0076] 非人类(例如,鼠)抗体的“人源化”形式也被本发明涵盖。这些是含有来自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在很大程度上,人源化抗体是人类免疫球蛋白,其中来自人免疫球蛋白的互补决定区(CDR)或超变环(HVL)的残基被来自非人类物种如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的、具有期望的功能的CDR或HVL的残基替代。人免疫球蛋白的框架区域(FR)残基可以被相应的非人类残基替代来改善抗原结合亲和力。此外,人源化抗体可以包含既不在相应的人类抗体部分、也不在非人类抗体部分中存在的残基。这些修饰可能是进一步改善抗体效力必需的。
[0077] “人类抗体”或“完全人类抗体”是具有相应于人类产生的抗体、或重组产生的抗体的序列的氨基酸序列的抗体。如在此使用的,术语“人类抗体”意图包括具有来自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人类抗体可以包括不被人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外的随机或定点诱变或通过体内的体细胞突变而引入的突变),例如,在CDR中和在特定的CDR3中。然而,如在此使用的,术语“人类抗体”不意图包括其中来自另一个哺乳动物物种的种系,例如小鼠的CDR序列被移植到人类框架序列上的抗体。
[0078] 如在此使用的,术语“重组人类抗体”意图包括通过重组方法制备、表达、创造或分离的所有人类抗体,例如,利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体,从重组的组合人类抗体文库分离的抗体、从人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如,小鼠)分离的抗体(参见,例如Taylor,L.D.,等人(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295),或通过涉及人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的剪接的任何其他方式制备、表达、创造或分离的抗体。这样的重组人类抗体具有来自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而,在某些实施方式中,这样的重组人类抗体经历了体外诱变(或,当使用人类Ig序列的转基因的动物时,体内的体细胞诱变的),因而重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是,虽然来自于或相关于人类种系VH和VL序列,可能在体内不天然地存在于人类抗体种系全集中。
[0079] 在此使用的,“中和抗体”(或“中和hTNFα活性的抗体”)意图指其结合hTNFα引起hTNFα的生物学活性的抑制作用的抗体。
[0080] “亲和成熟的”抗体是在一个或更多个高变区中具有一个或更多个改变的抗体,其引起抗体对抗原的亲和力相比亲本抗体的改善。亲合成熟的抗体可以具有对于目标抗原的纳摩尔乃至皮摩尔的亲和力值。亲和成熟的抗体通过本领域已知的过程产生。Marks等人(1992)Bio/Technology 10:779-783描述了通过VH和VL结构域混洗(shuffling)的亲和成熟。在Barbas等人(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91:3809-3813;Scier等人(1995)Gene 169:147-155;Yelton等人(1995)J.Immunol.155:1994-2004;Jackson等人(1995)J.Immunol.154(7):3310-9;和Hawkins等人(1992)J.Mol Biol.226:889-896中描述了CDR和/或框架残基的随机诱变。
[0081] 如在此使用的,“分离的抗体”意图指一种抗体,其基本上没有其他具有不同抗原性特征的抗体(例如,特异性结合hTNFα的分离的抗体基本上没有特异性结合hTNFα以外的抗原的抗体)。然而,特异性结合hTNFα的分离的抗体可以具有与其他抗原的交叉反应性,例如来自其他物种的hTNFα分子。此外,分离的抗体可以基本上没有其他细胞材料和/或化学物质。
[0082] 根据本发明的结晶的特定“亲本”抗体的“功能等效物”是显示了相同的抗原特异性、但是在氨基酸水平或糖基化水平上与“亲本”抗体的分子组成不同的分子。然而,所述差异可以仅仅是这样,从而结晶条件不偏离在此公开的参数范围。
[0083] 抗体晶体的“封装”是指一种制剂,其中所述晶体被至少一层包被材料独立地包被。在优选的实施方式中,这样包被的晶体可以具有维持的溶解速率。
[0084] 抗体晶体的“包埋”是指一种制剂,其中可能被密封或未被密封的晶体以分散的方式掺入到固体、液体或半固体载体中。这样包埋的结晶的抗体分子可以以控制的、持续的方式从载体中释放或溶解。
[0085] “聚亚烷基多元醇型的结晶试剂”在下文更详细地定义。
[0086] 根据本发明使用的“聚亚烷基多元醇”是直链或支链的,特别是直链的,聚-C2-C6-亚烷基多元醇。聚醚是从至少一种类型的多功能脂肪醇形成的,所述多功能脂肪醇带有2到6、2到4和特别是2或3个,优选的邻近的羟基基团,并具有2到6、特别是2、3或4个原子,优选的形成线性的碳骨架。非限制性实例是乙-1,2-二醇(乙二醇)、丙-1,2-二醇、丙-1,3-二醇和正丁-1,3-二醇和正丁-1,4-二醇。特别优选的二醇是乙二醇。
[0087] 术语“聚亚烷基多元醇”还包括它们的衍生物。非限制性实例是烷基酯和醚,特别是单烷基醚和二烷基醚。“烷基”被特别地定义为直链或支链的C1-C8-烷基,特别是,甲基、乙基、正丙基或异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基、正戊基或异戊基;和正己基。
[0088] 聚亚烷基多元醇,特别是聚亚烷基二醇,如根据本发明使用的,进一步的特征在于分子量的广泛范围。表示为数字或重量平均分子量的分子量范围一般在约400到约10,000g/mol的范围内,例如约1,000到约8,000g/mol、或约2,000到约6,000g/mol、约
3,000到约6,000g/mol或约3,200到约6,000g/mol,例如约3,350到约6,000g/mol、约
3,350到约5000g/mol、或约3,800到约4,200g/mol,特别是约4,000g/mol。
[0089] 特别优选的聚亚烷基多元醇是聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)和相应的随机或共聚物。适合的多元醇的具体实例是PEG 2,000;PEG 3,000;PEG 3,350;PEG 4,000;PEG5,000;和PEG 6,000。
[0090] 在结晶混合物中的聚亚烷基多元醇浓度,特别是PEG浓度处在约5到约30%(w/v)的范围内,例如约7到约15%(w/v)或约9到约16%(w/v)或约9到约14%(w/v)或约9到约12%(w/v)。优选的,具有约4,000的平均分子量的PEG以结晶混合物中在单步骤过程中约9到约12%(w/v)、或在多步骤过程中约10到约16%(w/v)的浓度使用。
[0091] 本发明的聚亚烷基多元醇可以由一个单一种类的多元醇、或至少两种不同的多元醇组成,其可以无规地聚合或作为嵌段共聚物存在。
[0092] 在本发明的优选的实施方式中,抗体蛋白质溶液和结晶溶液以约1∶1的比例组合。因而,在原始结晶溶液中缓冲试剂/结晶试剂的摩尔浓度是结晶混合物中的约两倍。
[0093] 在特定的实施方式中,结晶混合物包含范围约1mL到约20,000升、或约1ml到约15,000升、或约1ml到约12,000升、或约1ml到约10,000升、或约1ml到约6,000升、或约
1ml到约3,000升、或约1ml到约1,000升、或约1ml到约100升,例如约50ml到约8升、或约100ml到约5升、或约1升到约3升;或约1升到约1,000升;或约10升到约500升的批量体积。在一个实施方式中,在本文描述的晶体大小控制的条件下进行结晶。
[0094] B.结晶的方法
[0095] 本发明的结晶方法,除非另有陈述,适合于任何抗体或抗体片段。抗体可以是多克隆抗体,或优选的,是单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、非人类抗体,例如,小鼠抗体,每个处于糖基化或非糖基化的形式。抗体可以是例如双特异性抗体(dsAb)或双可变域抗体(DVDAb)。
[0096] 除非另有说明,本发明的结晶方法利用了本领域公知的技术、设备、化学物质和方法。然而,如上文解释的,本发明是基于令人惊讶的发现,特定结晶条件的选择,特别是特定结晶试剂的选择,任选地进一步与特定的pH值条件和/或相应试剂(缓冲液、抗体、结晶试剂)的浓度范围组合,第一次容许了可再现地和在大小控制条件下和/或大规模地制备稳定的抗体或抗体片段的晶体,其可以被进一步加工来形成优越的、高度有益的药物组合物的活性成分。
[0097] 进行结晶方法的起始材料通常包含要结晶的抗体的浓缩的溶液。蛋白质浓度可以是,例如,在约5到约75mg/ml的范围内。所述溶液可以含有稳定所溶解的抗体的添加剂。在一个实施方式中,建议是预先除去添加剂。这可以通过进行本文描述的缓冲液交换步骤来实现。
[0098] 优选的,用于进行本发明的结晶方法的起始材料含有水溶液中的抗体,具有被调节至约3.2到约8.2、或约4.0到约8.0、特别是约4.5到约5、优选的约5.0到约5.5的范围内的pH值。所述pH值可以通过以约1到约500mM、特别是约1到约100mM或约1到约10mM的终浓度存在的适合的缓冲液来调整。所述溶液可以含有添加剂,例如,以根据溶液的总重量约0.01到约15、或约0.1到约5、或约0.1到约2wt.-%的比例,例如,盐、糖、糖醇和表面活性剂,以进一步稳定所述溶液。赋形剂优选地选自在药物制品中常规地应用的、生理学可接受的化合物。作为非限制性实例,可以提及的是盐,例如NaCl;表面活性剂,例如聚山梨醇酯80(吐温80)和聚山梨醇酯20(吐温20);糖类、例如蔗糖和海藻糖;糖醇,例如甘露醇和山梨醇;和缓冲剂,例如基于磷酸盐的缓冲系统,例如如上所定义的磷酸氢钠和磷酸氢钾缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、马来酸盐缓冲液或琥珀酸盐缓冲液,以及组氨酸缓冲液;和氨基酸,例如组氨酸、精氨酸和甘氨酸,举例来说。
[0099] 可以通过常规方法,例如,通过透析、渗滤或超滤进行缓冲液交换。
[0100] 用作起始材料的水溶液的起始蛋白质浓度应当在约0.5到约280mg/ml或约1到约50mg/ml的范围内。
[0101] 取决于预期的最终批量大小(其可以在约1ml到约20,000升的范围内),水性抗体溶液的初始体积被置于由惰性物料,例如玻璃、聚合物或金属制成的合适容器中(例如,器皿、瓶子或罐)。水溶液的初始体积可以相当于最终批量大小的约30%到约80%,通常约50%。
[0102] 如有必要,所述溶液在填充到容器中之后,将被调节到标准化的条件。特别是,温度将被调节到约4℃到约37℃的范围内。如果希望或有益的,温度不必保持恒定,例如,温度可以是变化的,提供了期望形状的晶体的温度分布可以在结晶过程期间添加。
[0103] 含有合适浓度的结晶试剂,任选地按照与抗体溶液一样的方式预先条件化的结晶溶液然后被添加到抗体溶液中来形成结晶混合物。
[0104] 在第一个步骤中,结晶试剂的部分被添加到抗体溶液中达到约9到11wt.-%的第一终浓度,其足以启动结晶而在通常具有相对高的起始抗体蛋白质浓度的起始结晶混合物中基本上不形成聚集物/沉淀。在孵育足够的时间以达到晶体形成的第一最大值时,添加结晶试剂的进一步的等份试样,任选地在除去至此形成的抗体晶体之后。结晶试剂的浓度因而进一步提高到第二终浓度,增加约0.5到约3wt.-%。在随后孵育足够的时间期间,例如约1小时到约5天,形成另外的抗体晶体而基本上不形成聚集物/沉淀,并可以从上清液或“母液”中分离。结晶试剂的补充可以按照相同方式重复一次或多次,只要另外的抗体晶体形成被诱导而基本上不形成聚集物/沉淀。结晶试剂的终浓度因而可以达到约12到约20wt.-%的值。
[0105] 根据进一步的实施方式,本发明的结晶方法还可以这样进行,从而在步骤a)中获得的结晶混合物可以补充合适数量的预先存在的抗体晶体,例如抗-hTNFα抗体结合片段晶体,作为种子晶体以启动或强化结晶。
[0106] 结晶溶液的添加在柔和搅拌下连续地或不连续地进行以促进两种液体的混合。优选的,添加在一定条件下进行,在所述条件中蛋白质溶液在搅拌下提供,结晶溶液(或它的固体形式的试剂)以受控的方式添加。
[0107] 在本发明的优选的实施方式,结晶在控制的条件下进行,其相当于在一定条件下在滚筒容器中结晶混合物的搅拌,在选择至少一种关键参数,例如滚转速度时,容许控制在结晶过程的进程期间形成的抗体晶体的平均颗粒大小。例如,所述过程持续直到达到晶体形成的平台期或晶体产量的最大值,或在结晶过程期间的预定的时间段期间,例如,在晶体形成的主要阶段期间,例如,所述主要阶段特征可以是每个时间间隔(例如,每天)超过5%、或超过10%或超过15%的结晶速率的提高。
[0108] 当在此使用时,“相当于”是指以特定的速度在特定几何结构的滚筒容器中施加搅拌的特定结晶技术必需被理解为大小控制结晶的“参考系统”。在这样的参考系统的描述的指导下,熟练的技术人员将能够在不同的条件下进行大小控制的抗体结晶,例如,滚筒容器中的结晶过程中增加或降低规模、或应用不同的搅拌条件,例如,通过摇动、搅拌或翻滚或其组合的搅拌。
[0109] 通过进行有限数量的常规实验,熟练的技术人员将能够将在此提供的一般教导转移到本发明的参考滚筒容器系统来得到降低或提高规模的滚筒容器结晶方法、或基于在适合的条件下摇动、搅拌或翻滚结晶混合物的大小控制的结晶方法,例如,通过选择适合的容器或器皿中摇动、搅拌或翻滚的适合的速度、选择适合的蛋白质和结晶试剂浓度、温度、持续时间、液体结晶混合物对容器的装载水平和/或混合物的pH值。
[0110] 根据本发明的参考系统,搅拌的关键参数通过滚转速度来表示。特别地,滚转速度被设置为约1到约200rpm范围内的值。所述滚转速度可以在所述范围内变化,或在所述范围内区间内,例如,所述范围的约±1到约±5、或约±2到约±4rpm。然而,优选的,所述速度被设置为一个特定的值,其在结晶过程的进程期间保持恒定。例如,滚转速度可以被设置为约2到约150rpm、或约5到约120rpm或约8到约100rpm的范围内的值,例如,10、20、30、40、50、60、70、80或90rpm。相应适合的速度值可以由熟练的技术人员选择,用于增加或降低在滚筒容器中结晶的规模,或用于通过摇动、搅拌或翻滚的大小控制的结晶。
[0111] 根据所述参考系统的另一个实施方式,结晶在控制的条件下进行,其相当于在具有约2到约100cm、例如约5到约80或约10到约50cm的范围内的直径的滚筒容器中结晶混合物的搅拌。要理解的是,在参考滚筒容器系统中为大小控制的结晶获得的实验设置可以通过减少或优选的增加规模转移到更小或优选的更大的大小或内体积的器皿(滚筒容器)。它们还可以转移到具有更小或优选的更大体积的、适合于通过搅拌、摇动或翻滚来搅拌的其他类型的器皿中。适合的器皿几何结构是熟练的技术人员公知的。
[0112] 根据所述参考系统的另一个实施方式,在控制的条件下进行大小控制的结晶,所述条件相当于在滚筒容器中结晶混合物的搅拌,其中所述滚筒容器的总内体积的约1到约100vol.-%,例如约4到约99、约10到约80、约20到约70、约30到约60、或约40到约50vol.-%填充了所述结晶混合物。当然,这些参数范围可以转移到不同大小的容器和用于通过搅拌、摇动或翻滚来搅拌的容器。
[0113] 根据所述参考系统的另一个实施方式,所述大小控制的结晶在控制的调节下进行,其相当于在滚筒容器中搅拌结晶混合物约30分钟到约60天的时间,例如,约1到约40、约2到约20、或约3到约10天。当然,这些参数可以转移到通过搅拌、摇动或翻滚来搅拌的大小控制的结晶。
[0114] 根据所述参考系统的另一个实施方式,所述大小控制的结晶在控制的条件下进行,其相当于在约-15到约+50℃的范围内的温度,例如约0到约40、约5到约30、约10到约25或约15到约20℃的温度下在滚筒容器中结晶混合物的搅拌。当然,这些参数可以转移到通过搅拌、摇动或翻滚来搅拌的大小控制的结晶。
[0115] 用于在滚筒容器中大小控制的结晶的优选的参考系统应用了一种或更多种以下的关键参数,特别是其组合:
[0116] 滚筒容器体积:约450到约550ml、优选的约500ml
[0117] 滚筒容器直径:约6到约10cm,优选的约8cm
[0118] 滚转速度: 设置到约1到约100rpm之间的值
[0119] 填充: 约5到约15、优选的约10vol.-%
[0120] 温度: 约15到约25、优选的约20℃
[0121] 持续时间: 约2到约20、优选的约5到约10天
[0122] 通过遵照本发明的教导,有可能调整平均晶体颗粒大小(即,平均直径或平均长度)到约1到约1000μm,例如约5到约400、约10到约00、约15到约150、约15到约100、约15到约50或约18到约40μm的范围内。在一个实施方式中,所述抗体片段是抗-hTNFa抗体结合片段。在特定的实施方式中,所述抗体片段是Fab或F(ab’)2片段,例如,MAK195F、具有保藏编号ECACC 87050801的杂交瘤细胞系产生的抗体MAK195的F(ab’)2片段。
[0123] 在特定的实施方式中,MAK195F以约0.5到约280mg/ml范围内的起始蛋白质浓度存在,在约15到约25℃范围内的温度下、在滚筒容器中以约5到约100rpm范围内的速度搅拌约1到约60天。
[0124] 在MAK195F晶体的大小控制的制备的优选的实施方式中,具有约0.5到约280mg/ml、特别是约1到约15mg/ml、优选的约5mg/ml的起始MAK195F蛋白质浓度的含MAK195F的结晶混合物,在具有约100ml到约1000升内体积、约5到约50cm范围内的直径、填充约5到约80vol.%的结晶混合物的滚筒容器中,以约1到约100rpm范围内的速度,在约15到约25℃的范围内的温度下搅拌约1到约60天的时间。
[0125] 在中等规模的结晶的实施方式中,MAK195F蛋白质浓度是约1到约15、优选的约5mg/ml;所述滚筒容器具有约100到约1000ml的体积和约5到约10cm范围内的直径,填充约5到约20vol.%的结晶混合物;在约1到约100rpm的范围内的滚转速度下;持续时间约
1到约10天;在约15到约25℃的温度下。
[0126] 在大规模结晶的实施方式中,MAK195F蛋白质浓度是约1到约15mg/ml,优选的约5mg/ml,在具有约10到约20,000升的体积和约10到约100cm范围内的直径、填充约20到约90vol.%的结晶混合物的滚筒容器中,在约1到约10rpm范围内的滚转速度下,在约15到约25℃的温度下搅拌约1到约10天的持续时间。
[0127] 抗体晶体的形成通过施加上文定义的聚亚烷基多元醇、特别是聚亚烷基二醇、优选的聚乙二醇(PEG)、或上文定义的至少两种不同聚亚烷基多元醇的混合物作为结晶试剂来启动。结晶混合物含有一定浓度的试剂,所述浓度足够提供结晶混合物中所述聚亚烷基多元醇的终浓度在约5到约30%(w/v)的范围内。如上文已经描述的聚亚烷基多元醇的浓度梯度也是可应用的。
[0128] 优选的,结晶溶液另外含有酸性缓冲液,即,不同于抗体溶液的缓冲液,浓度适合于容许将结晶混合物的pH值调节至约4到约6的范围内。
[0129] 在结束了向结晶溶液添加结晶试剂之后,所述混合物可以进一步孵育约1小时到约250天以获得抗体晶体的最大产量。如果合适,例如,所述混合物可以搅拌、轻轻地搅拌、滚动或以本领域已知的方式运动。如果希望另外控制晶体大小,基于在控制的条件下的搅拌的大小控制的结晶方法(如上文已经解释的)可以实现到本发明的批量结晶方法中。
[0130] 获得的晶体可以通过已知的方法分离,例如,过滤或离心,例如,通过在约4℃的室温下在约200到约20,000rpm、优选的约500到约2,000rpm离心。残余的母液可以丢弃或进一步加工,例如,通过添加另外的结晶试剂。
[0131] 如有必要,分离的晶体可以洗涤和随后干燥,或者母液可以用适合于贮存或适合于悬浮在其中的抗体的最终用途的不同溶剂系统替代。
[0132] 根据本发明形成的抗体晶体可以在它们的形状上不同,如上文已经描述的。对于治疗性施用,晶体的大小将取决于给药途径而变化,例如,对于皮下施用,晶体的大小可以大于用于静脉内施用的。晶体的形状可以通过向结晶混合物添加特定的其他添加剂来改变,这是早先对蛋白质晶体和低分子量有机和无机分子的晶体已经描述的。
[0133] 如有必要,可以验证所述晶体实际上是抗体的晶体。抗体的晶体可以显微镜下分析双折射。一般地,除非是立方内部对称的,晶体将旋转偏振光的偏振平面。在又一个方法中,晶体可以被分离、洗涤、重新溶解和通过SDS-PAGE分析,任选地,用检测抗体染色。任选地,重新溶解的抗体也可以利用标准分析测试与其抗原的结合。
[0134] 根据本发明的获得的晶体还可以是相互交联的。这样的交联可以增强晶体的稳定性。交联晶体的方法已经描述了,例如在美国专利No.5,849,296中,通过引用将其合并在此。晶体可以利用双功能试剂例如戊二来交联。一旦被交联,晶体可以被冻干和保存,用于例如诊断或治疗应用。
[0135] 在某些情况下,可能希望的是干燥晶体。晶体可以通过惰性气体如氮气、真空炉干燥、冻干、蒸发、盘式干燥、流化床干燥、喷雾干燥、真空干燥或滚筒干燥的方式来干燥。适合的方法是本领域公知的。
[0136] 根据本发明的形成的晶体可以维持在原始的结晶混合物中,或它们可以被洗涤并与其他物质组合,例如,惰性载体或成分,来形成包含本发明的晶体的组合物或制剂。这样的组合物或制剂可以用于,例如,治疗和诊断应用。
[0137] 在优选的实施方式中,适合的载体或成分与本发明的晶体组合,从而制剂的晶体被赋形剂包埋或密封。适合的载体或结晶试剂可以来自以下的非限制性的组:聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(缩酚酸肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚(乳酸-共聚-羟基乙酸)或PLGA、聚(β-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)、聚二甲基氧烷/甲基乙烯基硅氧烷共聚物、乙烯乙烯基乙酸酯共聚物、聚[二(p-羧基苯氧基)丙烷酸酐]癸二酸、polyglactin、聚硅氧烷、聚(二氧杂环己酮);聚(乙二醇)、聚(羟基丙基)甲基丙烯酰胺、聚(有机)磷腈、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、马来酸酐烷基乙烯基醚共聚物、复合多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原蛋白、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡聚糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、羟乙基-淀粉、共混物和共聚物其、二乙酰蔗糖六异丁酸酯、脂肪酸和脂肪酸盐、脂肪醇、脂肪族胺、脂肪酸的甘油单、二-、三酯、磷脂、糖脂、固醇和蜡以及相关的类似物质。蜡被进一步分类为天然的和合成的产物。天然的材料包括从植物、动物或矿物质来源获得的蜡,例如蜂蜡、棕榈蜡或褐煤蜡。氯化用于萘和乙烯聚合物是合成蜡产物的实例。
[0138] C.组合物
[0139] 在另一个方面,本发明提供了包含与至少一种载体和/或赋形剂组合的抗体晶体的组合物和制剂。所述制剂可以是固体、半固体或液体。
[0140] 本发明的制剂通过以悬浮液的形式混合具有必需的纯度的抗体与生理学可接受的添加剂,例如载体、赋形剂和/或稳定剂(参见,例如Remington′s Pharmaceutical Sciences,16th Edn.,Osol,A.Ed.(1980))来制备为适合于贮存和/或使用的形式,或以其他方式被冻干或干燥。任选地,进一步的活性成分,例如不同的抗体、生物分子、或化学或酶学合成的低分子量分子也可以掺入。
[0141] 可接受的添加剂是在采用的剂量和浓度下对接受者无毒的。其非限制性实例包括:
[0142] -酸化试剂,例如,乙酸、柠檬酸、延胡索酸、盐酸、苹果酸、硝酸、磷酸、稀释的磷酸、硫酸和酒石酸
[0143] -气溶胶喷射剂,例如,丁烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟甲烷、异丁烷、丙烷和三氯氟代甲烷;
[0144] -空气置换物,例如二氧化碳和氮气;
[0145] -醇类变性剂,例如甲基异丁基酮和蔗糖辛醋酸酯;
[0146] -碱化试剂,例如,氨溶液、碳酸铵、二乙醇胺、二异丙胺、氢氧化钾、碳酸氢钠酸钠、碳酸钠、氢氧化钠和三乙醇胺;
[0147] -消泡沫剂,例如二甲聚硅氧烷和二甲硅油;
[0148] -抗微生物防腐剂,例如,苯扎氯铵、苯扎氯铵溶液、benzelthoniumchloride、苯甲酸、苯甲醇、对羟基苯甲酸丁酯、西吡氯铵、三氯叔丁醇、氯甲酚、甲酚、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯钠、苯酚、苯基乙醇、醋酸苯汞、硝酸苯汞、苯甲酸钾、山梨酸钾、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯钠、苯甲酸钠、脱氢醋酸钠、丙酸钠、山梨酸、硫柳汞、和麝香草酚;
[0149] -抗氧化剂,例如,抗坏血酸抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚、丁羟甲苯、次磷酸、硫代甘油、醅酸丙酯、甲醛合次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、二氧化硫、生育酚和生育酚赋形剂;
[0150] -缓冲剂,例如乙酸、碳酸铵、磷酸铵、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、柠檬酸钾、偏磷酸钾、磷酸二氢钾、乙酸钠、柠檬酸钠、乳酸钠溶液、磷酸二钠、磷酸单钠、组氨酸;
[0151] -螯合剂,例如,依地酸二钠、乙二胺四乙酸和盐和依地酸;
[0152] -包被试剂,例如羧甲基纤维素钠、醋酸纤维素、苯二甲酸醋酸纤维素、乙基纤维素、明胶、药学的釉料、羟基丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸盐、甲基丙烯酸共聚物、甲基纤维素、聚乙二醇、聚醋酸乙烯酯邻苯二甲酸盐、虫胶、蔗糖、二氧化、巴西棕榈蜡、微晶蜡、玉米蛋白、聚氨基酸、其他聚合物例如PLGA,等等,以及SAIB;
[0153] -着色试剂,例如三氧化二
[0154] -复合试剂,例如乙二胺四乙酸和盐(EDTA)、依地酸、龙胆酸乙醇胺和羟基喹啉盐。
[0155] -干燥剂,例如氯化、硫酸钙和二氧化硅
[0156] -乳化剂和/或增溶剂,例如,阿拉伯胶、胆固醇、二乙醇胺(添加剂)、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂醇、卵磷脂、单和二-甘油酯、单乙醇胺(添加剂)、油酸(添加剂)、油醇(稳定剂)、泊洛沙姆、聚氧50硬脂酸盐、聚烃氧35蓖麻油、聚烃氧40氢化蓖麻油、聚烃氧10油烯基醚、聚烃氧20十八烷基醚、聚烃氧40硬脂酸盐、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、丙二醇双醋酸酯、单硬脂酸丙二醇酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸钠、单月桂酸山梨醇酐酯、山梨糖醇酐一油酸酯、山梨聚糖甘油一棕榈酸酯、单硬脂酸山梨糖醇酐酯、硬脂酸、三乙醇胺和乳化蜡;
[0157] -助滤剂,例如,粉末的纤维素和纯化的硅藻土
[0158] -气味和芳香剂,例如,茴香脑、苯甲醛、3-乙氧基-4-羟基苯甲醛、薄荷醇、水杨酸甲酯、谷氨酸单钠、橙花油、薄荷、薄荷油、薄荷精、玫瑰油、浓玫瑰水、麝香草酚、叶鲁香脂酊剂、香草兰、香草兰酊,并且香草醛;
[0159] -助流剂和/或防结块剂,例如,硅酸钙、硅酸镁、胶体二氧化硅和滑石粉;
[0160] -湿润剂,例如甘油、已二醇、丙二醇和山梨醇;
[0161] -软膏基质,例如羊毛脂、无水羊毛脂、亲水性软膏、白色软膏剂、黄色软膏剂、聚乙二醇软膏剂、矿脂、亲水性的矿脂、白凡士林、玫瑰水软膏剂和鲨烷;
[0162] -成形剂,例如,蓖麻油、羊毛脂、矿物油、矿脂、苯甲基苯基甲酸盐、三氯叔丁醇、邻苯二甲酸二乙酯、山梨醇、二乙酰化单酸甘油酯、邻苯二甲酸二乙酯、甘油、甘油、单-和二-乙酰化单甘油脂肪酸酯、聚乙二醇、丙二醇、三醋汀、柠檬酸三乙酯和乙醇;
[0163] -多肽,例如,低分子量的(低于约10个残基);
[0164] -蛋白质,例如,血清白蛋白、明胶和免疫球蛋白;
[0165] -聚合物膜,例如,醋酸纤维薄膜
[0166] -溶剂,例如,丙酮、醇类、稀释的醇、水合戊烯、苯甲酸苄酯、丁醇、四氯化碳、氯仿、玉米油、棉花子油、乙酸乙酯、甘油、已二醇、异丙醇、甲醇、二氯甲烷、甲基异丁基酮、矿物油、花生油、聚乙二醇、丙烯碳酸酯、丙二醇、芝麻油、注射用水、灭菌注射水、冲洗用无菌水、纯水、液体甘油三酯、液体蜡和高级醇;
[0167] -吸附剂,例如,粉剂纤维素、活性炭、纯化的硅藻土、二氧化碳吸附剂、氢氧化钡、石灰和碱石灰;
[0168] -硬化剂,例如,氢化蓖麻油、十八烷基醇、十六醇、十六烷基酯蜡、硬脂、石蜡、聚乙烯赋形剂、硬脂醇、乳化蜡、白蜡和黄蜡;
[0169] -栓剂基质,例如,可可脂、硬脂和聚乙二醇;
[0170] -悬浮和/或粘度-提高试剂,例如,阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、单硬脂酸、斑脱土、纯化的斑脱土、岩浆斑脱土、卡波姆934p、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钠12、叉菜胶、微晶的和羧甲基纤维素钠纤维素、糊精、明胶、瓜豆胶、羟乙基纤维素、羟基丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸镁铝、甲基纤维素、果胶、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、聚烯吡酮、海藻酸丙二醇酯、二氧化硅、胶体二氧化硅、海藻酸钠和黄芪胶、黄原胶;
[0171] -甜味剂,例如,阿斯巴甜、葡萄糖结合剂、葡萄糖、赋形剂葡萄糖、果糖、甘露醇、糖精、糖精钙、糖精钠、山梨醇、溶液山梨醇、蔗糖、可压缩的糖类、糖果糖类和糖浆;
[0172] -片剂粘合剂,例如,阿拉伯胶、海藻酸、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、糊精、乙基纤维素、明胶、液状葡萄糖、瓜耳豆胶、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、聚环氧乙烷、聚烯吡酮、预胶化淀粉和糖浆;
[0173] -片剂和/或胶囊稀释剂,例如,碳酸钙、二碱的磷酸钙、三碱的磷酸钙、硫酸钙、微晶纤维素、粉剂纤维素、葡萄糖结合剂、糊精、葡萄糖赋形剂、果糖、白陶土、乳糖、甘露醇、山梨醇、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、可压缩的糖类和糖果糖类;
[0174] -片剂崩解剂,例如,海藻酸、微晶纤维素、交联羧甲纤维素钠、交聚维酮、离子交换树脂钾、淀粉羟基乙酸钠、淀粉和预胶化淀粉。
[0175] -片剂和/或胶囊剂润滑剂,例如,硬脂酸钙、甘油基山嵛酸酯、硬脂酸镁、轻质矿物油、聚乙二醇、硬脂酰延胡索酸钠、硬脂酸、纯化的硬脂酸、滑石粉、氢化植物油和硬脂酸锌;
[0176] -渗涨度试剂,例如,葡萄糖、甘油、甘露醇、氯化钾氯化钠
[0177] -运载体,例如,调味和/或加甜芳香酏剂、化合物苯甲醛酏剂、异醇的酏剂、薄荷水、山梨醇溶液、糖浆和叶鲁香脂糖浆;
[0178] -运载体,例如,油质的杏仁油、玉米油、棉花子油、油酸乙酯、十四烷酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油、轻质矿物油、肉豆寇醇、十二醇、橄榄油、花生油、杏仁油、芝麻油、豆油、鲨烷;固体载体糖类球体;无菌的抑菌注射用水、抑菌的氯化钠注射液、液体甘油三酯、液体蜡和高级醇;
[0179] -水排斥试剂,例如,环甲聚硅氧烷、二甲聚硅氧烷和二甲硅油;和
[0180] -湿润和/或增溶剂,例如,苯扎氯铵、苄索氯铵、西吡氯铵、多库酯钠、壬苯醇醚9、壬苯醇醚10、辛苯聚醇9、泊洛沙姆、聚烃氧35蓖麻油、聚烃氧40、氢化蓖麻油、聚烃氧50硬脂酸酯、聚烃氧10油烯基醚、聚烃氧20、十八烷基醚、聚烃氧40硬脂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、十二烷基硫酸钠、单月桂酸山梨醇酐酯、单油酸山梨醇酐酯、山梨聚糖甘油一棕榈酸酯、单硬脂酸山梨糖醇酐酯和泰洛沙泊。
[0181] 所述晶体可以与聚合的载体组合来提供稳定性和/或持续释放。这样的聚合物包括生物相容的和可生物降解的聚合物。聚合的载体可以是单一聚合物类型的,或可以由聚合物类型的混合物组成。聚合的载体的非限制性实例已经在上文提供了。
[0182] 优选的成分或赋形剂的实例包括:
[0183] -氨基酸例如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸和组氨酸的盐;
[0184] -单糖,例如,葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖和核糖;
[0185] -二糖,例如,乳糖、海藻糖、麦芽糖和蔗糖;
[0186] -多糖,例如,麦芽糊精、葡聚糖、淀粉和糖原;
[0187] -糖醇,例如,甘露醇、木糖醇、拉克替醇和山梨醇;
[0188] -葡糖醛酸和半乳糖醛酸;
[0189] -环糊精,例如,甲基环糊精、羟基丙基-(3-环糊精);
[0190] -无机盐,例如,氯化钠、氯化钾、氯化镁、钠和钾的磷酸盐、硼酸碳酸铵和磷酸铵;
[0191] -有机盐,例如,乙酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐和乳酸盐;
[0192] -乳化或增溶剂比如阿拉伯胶、二乙醇胺、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、单乙醇胺、油酸、油醇、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸、单月桂酸山梨醇酐酯、单硬脂酸山梨糖醇酐酯和其他山梨糖醇酐衍生物、聚烃氧衍生物、蜡、聚氧乙烯衍生物、山梨糖醇酐衍生物;和
[0193] -粘度提高试剂,例如,琼脂、海藻酸和它的盐、瓜耳豆胶、果胶、聚乙烯醇、聚环氧乙烷、纤维素和它的衍生物、丙烯碳酸酯、聚乙二醇、已二醇和泰洛沙泊。
[0194] 本文描述的制剂还包含有效量的晶体抗体。特别地,本发明的制剂可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的抗体晶体。“治疗有效量”是指在必需的剂量和时间段下实现期望的治疗结果的有效数量。抗体晶体的“治疗有效量”可以根据一些因素而改变,例如,个体的疾病状况、年龄、性别和体重,抗体在个体中引发期望的响应的能力。治疗有效量也是一种量,其中治疗有益的效果胜过抗体的任何毒性或不利影响。“预防有效量”是指在必需的剂量和时间段下实现期望的预防结果的有效数量。一般地,由于在疾病之前或较早阶段在个体中使用预防剂量,预防有效量将低于治疗有效量。
[0195] 适合的剂量可以使用标准方法容易地测定。一次性或在医治的系列过程中将抗体适当地施用给病人。取决于上述因素,约1μg/kg到约50mg/kg,例如约0.1到约20mg/kg的抗体是向患者施用的初始候选剂量,无论是通过例如一次或更多次独立的施用还是通过连续的输注。典型的每日或每周剂量可以从约1μg/kg到约20mg/kg或更多,取决于条件,重复治疗直到发生疾病症状的期望的抑制。然而,其他给药方案也是有用的。在某些情况下,当重新溶解时,制剂包含至少约1g/L或更高的抗体浓度。在其他实施方式中,当重新溶解时,抗体浓度是至少约1g/L到约100g/L。
[0196] 抗体的晶体、或包含这样的晶体的制剂可以单独地或作为药物制品的部分来施用。本发明的晶体可以通过,例如,口服的、胃肠外的、部的、鼻部、耳的、肛的、真皮的、眼睛的、静脉内的、肌肉内的、动脉内的、腹膜内的、粘膜的、舌下的、皮下的、穿表皮的、表面的或颅内的途径施用,或施用到口腔中。施用技术的具体实例包括肺部吸入、病灶内应用、针头注射、干粉吸入、皮肤电穿孔、气雾剂递送和无针头的注射技术,包括无针头的皮下施用。
[0197] hTNFα相关的病症可以选自以下疾病列表:
[0198]获得性免疫缺陷疾病综合
获得性免疫缺陷相关疾病
获得性恶性贫血
急性冠状动脉综合征
急性和慢性疼痛(各种形式的疼痛)
急性自发性的多发性神经炎
与器官移植相关的急性免疫疾病
与器官移植相关的急性或慢性免疫疾病
急性炎性脱髓鞘多神经根神经病
急性缺血
急性的肝脏疾病
急性湿热
急性的横贯性脊髓炎
阿狄森氏病
成年人(急性)呼吸窘迫综合征
成年人Still′s疾病
酒精性肝硬变
酒精诱导的肝脏损伤
过敏性疾病
过敏症
脱发
斑形脱发
阿尔茨海默氏病
过敏性反应
关节强硬性脊椎炎
关节强硬性脊椎炎相关的肺部疾病
抗磷脂抗体综合征
再生障碍性贫血
动脉硬化
关节病
哮喘
动脉粥样化疾病/动脉硬化
动脉粥样硬化
特异反应性过敏
特异反应性湿疹
特异反应性皮炎
萎缩性自体免疫甲状腺机能减退
自体免疫性大疱疾病
自体免疫性皮炎
自体免疫性糖尿病
与链球菌感染相关的自体免疫病症
自体免疫性肠病
自体免疫溶血性贫血症
自体免疫性肝炎
自体免疫性听力丧失
自体免疫性淋巴组织增生综合征(ALPS)
自体免疫介导的低血糖
自体免疫性心肌炎
自体免疫性中性白细胞减少
自体免疫性卵巢功能早期衰退
自体免疫性血小板减少(AITP)
自体免疫性甲状腺病
自体免疫性葡萄膜炎
闭塞性细支气管炎
白塞氏病
睑炎
支气管扩张
大疱性天疱疮
恶病体质
血管疾病
灾难性抗磷脂综合征
乳糜泻
颈脊椎病
衣原体
胆汁阻塞
慢性活动性肝炎
慢性嗜酸细胞性肺炎
慢性疲劳综合征
与器官移植相关的慢性免疫疾病
慢性缺血
慢性肝脏疾病
慢性皮肤粘膜念珠菌病
瘢痕性天疱疮
具有多发性硬化风险的临床上分离的综合征(CIS)
常见的可变的免疫缺陷(常见的可变的低丙种球蛋白血症)
与间质肺部疾病相关的结缔组织疾病
结膜炎
Coombs阳性溶血性贫血症
儿童期发作的精神错乱
慢性阻塞性肺病(COPD)
克罗恩氏病
起因不明的自体免疫肝炎
起因不明的纤维性肺泡炎
泪囊炎
抑郁症
皮炎性硬皮症
皮肌炎
皮肌炎/多肌炎相关性肺病
糖尿病性视网膜
糖尿病
扩张型心肌炎
盘状红斑狼疮
盘状疝形成
椎间盘突出
弥漫性血管内凝血
药物诱导的肝炎
药物诱导的间质的肺病
药物诱发的免疫性溶血性贫血
心内膜炎
子宫内膜异位
内眼炎
肠病性滑膜炎
巩膜表层炎
多形性红斑
主要多形性红斑
雌性不育
纤维化
纤维化肺病
妊娠期天疱疮
巨细胞性动脉炎(GCA)
肾小球肾炎
甲状腺肿自体免疫甲状腺机能减退(桥本氏病)
古德帕斯彻氏综合征
痛风性关节炎
移植物抗宿主疾病(GVHD)
Grave′s病
B组链球菌(GBS)感染
急性感染性多发性神经根神经炎(GBS)
含铁血黄素沉着病相关的肺疾病
枯草热
心力衰竭
溶血性贫血
过敏性紫癜
乙型肝炎
丙型肝炎
Hughes综合征
亨廷顿氏舞蹈病
甲状腺机能亢进
甲状旁腺机能减退
自发性白细胞减少症
自发性的血小板减少
自发性帕金森氏病
自发性的间质性肺炎
特应性的肝脏疾病
IgE-介导的过敏症
免疫性溶血性贫血
包涵体肌炎
传染性疾病
传染性眼睛炎性疾病
炎症性肠病
炎性髓鞘脱失病
炎性心脏病
炎性肾病
胰岛素依赖型糖尿病
间质肺炎
IPF/UIP
虹膜炎
青少年的慢性关节炎
青少年的恶性贫血
青少年类风湿性关节炎
Kawasaki′s病
角膜
keratojuntivitis sicca
Kussmaul疾病或Kussmaul-Meier疾病
兰德里麻痹
Langerhan′s细胞组织细胞增多病
线性IgA疾病
网状青斑
Lyme关节炎
淋巴细胞的渗透性肺病
黄斑变性
男性不育症自发性的或NOS
恶性肿瘤
肾的显微脉管炎
显微镜的多血管炎
混合结缔组织病相关的肺病
Morbus Bechterev
运动神经元病症
粘膜天疱疮
多发性硬化(全部亚型:基本的渐进性的、继发性的渐进性的、复
发减轻的,等等)
多器官衰竭
肌痛性脑炎/Royal Free病
重症肌无力
脊髓发育不良综合征
心肌梗死
心肌炎
肾病综合征
神经根病症
神经病
非酒精性脂肪肝
非甲非乙型肝炎
视神经炎
器官移植排斥
骨关节炎
骨质溶解
卵巢癌
卵巢衰竭
胰腺炎
寄生虫的疾病
帕金森氏病
少关节的JRA
天疱疮
落叶状天疱疮
寻常天疱疮
外周动脉闭塞疾病(PAOD)
周围性血管疾病(PVD)
外周动脉疾病(PAD)
晶状体源性葡萄膜炎
静脉炎
多发性结节性动脉炎(或结节性动脉周围炎)
多软骨炎
风湿性多肌痛
灰发症
多关节的JRA
多内分泌腺的缺陷综合症
多肌炎
多腺体缺陷I型和多腺体缺陷II型
风湿性多肌痛(PMR)
传染后的间质的肺病
炎症后的间质的肺病
Post-Pump综合征
卵巢功能早期衰退
夏科氏肝硬变
原发的黏液腺瘤病
原发性帕金森氏综合征
原发性硬化性胆管炎
原发性硬化性肝炎
原发性脉管炎
前列腺和直肠癌和造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)
前列腺炎
屑病
1型银屑病
2型银屑病
银屑病性关节炎
银屑病性关节病
继发于结缔组织疾病的肺动脉高血压
多发性结节性动脉炎的肺部表现
纯红血球发育不全
原发性肾上腺机能不全
放射后肺纤维化
反应性关节炎
莱特尔氏病
复发性的德维克氏病
肾病NOS
[0199]
[0200]
[0201]
[0202]
[0203]
[0204]
[0205]
[0206]
[0207]全身性红斑狼疮相关的肺病
全身性硬化
全身性硬化相关的间质肺病
Takayasu’s病/动脉炎
颞动脉炎
Th2型和Th1型介导疾病
甲状腺炎
中毒性休克综合征
弓形虫视网膜炎
中毒性表皮坏死溶解
横贯性脊髓炎
TRAPS(肿瘤坏死因子受体
伴有黑棘皮病的B型胰岛素抗性
1型过敏性反应
1型自体免疫性肝炎(标准的自体免疫或狼疮样肝炎)
2型自体免疫肝炎(抗LKM抗体肝炎)
II型糖尿病
肠溃疡性关节病
溃疡性结肠炎
荨麻疹
普通的间质性肺炎(UIP)
葡萄膜炎
脉管炎弥散性肺病
脉管炎
春季结膜炎
病毒视网膜炎
白斑病
Vogt-Koyanagi-Harada综合征(VKH综合征)
眶坏死性肉芽肿病
湿润黄斑变性
伤口愈合
耶尔森氏菌和沙门氏菌相关关节病
[0208]
[0209] hTNFα相关病症还可以选自以下的疾病列表:类风湿性脊椎炎、肺部病症、肠病症、心脏病症、炎性骨骼病症、骨吸收病、病毒性肝炎、暴发型肝炎、凝血紊乱、灼伤、再灌注损伤、瘢痕瘤形成、瘢痕组织形成、发热、牙周病、肥胖和放射毒性;脊柱关节病、代谢病症、贫血、疼痛、肝脏病症、皮肤病症、指甲病症、特发性肺纤维化(IPF)、贫血、疼痛、罗恩氏病相关的病症、慢性斑块银屑病、年龄相关的恶病体质、脑水肿、炎性脑损伤、药物反应、脊髓中和/或周围的水肿、家族性的周期性发热、费尔蒂综合征、链球菌后血管球性肾炎或IgA肾病、假肢的松动、多发性骨髓瘤、癌、多器官病症、睾丸炎、骨质溶解、包括急性的、慢性的,和胰脓肿、牙周病、渐进性肾衰竭、假性痛风、坏疽性脓皮病、复发性多软骨炎、硬化性胆管炎、中风、胸腹主动脉瘤修复(TAAA)、与黄热病疫苗接种相关的症状、与耳朵相关的炎症性疾病,例如,慢性耳炎或儿科的耳炎症,和脉络膜的新血管形成或狼疮。
[0210] D.MAK195F
[0211] MAK195F,也称为AfelimomabTM,是具有100kDa的近似分子量、对肿瘤坏死因子α(TNFα)特异的鼠lgG3单克隆抗体的F(ab’)2片段。F(ab’)2片段通过IgG3单克隆抗体的胃蛋白酶消化产生,由两个异二聚体组成。异二聚体由IgG3抗体的轻链多肽和重链多肽的Fd′部分组成。抗体分子的四条链通过二硫键内部地连接在一起。轻链和重链的Fd′部分的所有半胱氨酸残基被包括在二硫键中。以下半胱氨酸残基对预计通过二硫键连接:轻链内的连键:L23-L88和L134-L194,Fd′片段内的连键:H22-H95和H144-H198,轻链和Fd′片段之间的连键:L214-H132,Fd′片段之间的连键:H229-H229。预计的二硫化物模TM
式是基于Afelimomab 多肽的氨基酸序列与具有已知的二硫化物结构的IgG抗体的高度同源的氨基酸序列的比较。二硫键的形成对于所有的二硫键是一定程度上不完全的,每个F(ab’)2分子大约0.3个半胱氨酸残基被发现以游离半胱氨酸形式存在。
[0212] 轻链各自包含214个氨基酸。轻链的氨基酸序列在下文说明。除了单个天冬酰胺残基(ASnL157)的脱酰胺作用之外,没有检测到轻链的共价结构的改变。完整IgG3抗体的重链的氨基酸序列各自包含447个氨基酸。氨基酸序列显示如下。来自cDNA序列的重链的N-末端以氨基酸谷氨酰胺开始。这个氨基酸被完全地转化为焦谷氨酸。
[0213] AfelimomabTM分子的轻链的氨基酸序列
[0214] DIVMTQSHKF MSTTVGDRVS ITCKASQAVS SAVAWYQQKP GQSPKLLIYW 50
[0215] ASTRHTGVPD RFTGSGSVTD FTLTIHNLQA EDLALYYCQQ HYSTPFTFGS 100
[0216] GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI 150
[0217] DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEATHKT 200
[0218] STSPIVKSFN RNEC 214
[0219] (SEQ ID NO:1)
[0220] AfelimomabTM分子的重链的氨基酸序列
[0221] QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLT DYGVNWVRQP PGKGLEWLGM 50
[0222] IWGDGSTDYD STLKSRLSIS KDNSKSQIFL KMNSLQTDDT ARYYCAREWH 100
[0223] HGPVAYWGQG TLVTVSAATT TAPSVYPLVP GCSDTSGSSV TLGCLVKGYF 150
[0224] PEPVTVKWNY GALSSGVRTV SSVLQSGFYS LSSLVTVPSS TWPSQTVICN 200
[0225] VAHPASKTEL IKRIEPRIPK PSTPPGSSCP PGNILGGPSVFIFPPKPKDA 250
[0226] Hinge region
[0227] LMISLTPKVT CVVVDVSEDD PDVHVSWFVD NKEVHTAWTQ PREAQYNSTF 300
[0228] RVVSALPIQH QDWMRGKEFK CKVNNKALPA PIERTISKPK GRAQTPQVYT 350
[0229] IPPPREQMSK KKVSLTCLVT NFFSEAISVE WERNGELEQD YKNTPPILDS 400
[0230] DGTYFLYSKL TVDTDSWLQG EIFTCSVVHE ALHNHHTQKN LSRSPGK 447
[0231] (SEQ ID NO:2)
[0232] 对N-末端Fd′片段的形成负责的蛋白水解裂解在绞链区中发生,导致在位置H233(产 生Fd ′ 片 段 的C-末 端...PPGN(SEQ ID NO:3))、H235(...PPGNIL(SEQ ID NO:4))、H236(...PPGNILG(SEQ ID NO:5))、H239(...NILGGPS(SEQ ID NO:6))、H240(...NILGGPSV(SEQ ID NO:7))和H241(...NILGGPSVF(SEQ ID NO:8))处的氨基酸的C-末端侧的裂解。除了在位置H236处裂解之外,裂解位置是对胃蛋白酶特异性的,胃蛋白TM酶是用于Afelimomab API的生产的蛋白水解试剂。位置H236处的裂解显示了是由于组织蛋白酶D。组织蛋白酶D存在于无细胞上清液中,是酸性蛋白酶,例如胃蛋白酶。这种内源蛋白酶的含量可以通过层析步骤来降低。由于胃蛋白酶的有限特异性,F(ab’)2分子的重链多肽的C-末端展现了一定程度的异质性。
[0233] 在SerH222处的部分O-糖基化构成了AfelimomabTM分子的异质性的另一个来源。大约70%的Fd′片段是非糖基化的。在糖基化的片段中,结合于SerH222的优势寡聚糖结构被鉴定为GalNAc-Gal-NGNA(GalNAc:N-乙酰半乳糖胺;Gal:半乳糖,NGNA:N-乙酰神经氨酸)。此外,发现了没有或有两个NGNA部分的更小程度的寡聚糖(参见下文)。
[0234] 表1:AfelimomabTM分子的Fd′部分的共价结构的变化
[0235]
[0236] 根据以下实施例,本发明的实践将被更完全地理解,实施例在此呈现仅用于说明,无论如何不应看作限制本发明。根据说明书的一般部分和在技术人员的一般知识的基础上,熟练的技术人员将能够提供
[0237] 本发明的进一步的实施方式而不需过度的实验。实施例
[0238] A.材料
[0239] a)蛋白质
[0240] 所有实验使用MAK195F lot G008.01E/PZ0105P025进行,其原始的mAb浓度是12.39mg/mL。
[0241] b)精制化学药品
[0242] 乙酸钠获自Grossing GmbH,Filsum。聚乙二醇4,000获自ClariantGmbH,Sulzbach。此外,商售的结晶筛和试剂(Hampton Research,Emerald BioStructures,Jena Bioscience)用于某些微尺度实验。所有其他化学物质来自Sigma-Aldrich,Steinheim或Merck,Darmstadt。
[0243] B.一般方法
[0244] a)AfelimomabTM(MAK195F)药物物质的解冻
[0245] MAK195F在搅拌的水浴中在25℃解冻。
[0246] b1)缓冲液交换——方法A
[0247] MAK195F溶液的等份试样交换到SLIDE-A-LYZER透析盒(Pierce Biotechnology Inc.)中。透析盒置于和含有所选缓冲液的烧杯中,在4℃在搅拌下进行缓冲液交换过夜。在调整蛋白质浓度之后,溶液通过0.2μm注射器驱动的过滤装置无菌过滤。
[0248] b2)缓冲液交换——方法B
[0249] MAK195F溶液的等份试样移液到30KDa MWCO Vivaspin 4浓缩器(Vivascience)中。蛋白质样品用新缓冲液以1∶4的比例稀释,通过在10,000×g在4℃离心(Sigma 4K15实验室离心机),将样品体积回复到原始样品体积。稀释/离心步骤重复两次,产生原始样品缓冲液的1∶64稀释物。在调整蛋白质浓度之后,溶液通过0.2μm注射器驱动过滤装置无菌过滤。
[0250] b3)缓冲液交换——方法C
[0251] MAK195F溶液的等份试样移液到30KDa MWCO Vivaspin 20浓缩器(Vivascience)中。蛋白质样品用新缓冲液以1∶10的比例稀释,通过在5,000×g在4℃离心(Sigma 4K15实验室离心机),将样品体积回复到原始样品体积。稀释/离心步骤重复一次,产生原始样品缓冲液的1∶100稀释物。在调整蛋白质浓度之后,溶液通过0.2μm注射器驱动过滤装置无菌过滤。
[0252] b4)缓冲液交换——方法D
[0253] MAK195F溶液的等份试样移液到30KDa MWCO Vivaspin 20浓缩器(Vivascience)中。蛋白质样品通过在5,000×g在4℃离心(Sigma4K 15实验室离心机)浓缩到原始体积的1∶10。随后,浓缩的样品用新缓冲液稀释到原始样品体积。离心/稀释步骤重复一次,产生原始样品缓冲液的1∶100稀释物。在调整蛋白质浓度之后,溶液通过0.2μm注射器驱动过滤装置无菌过滤。
[0254] b5)缓冲液交换——方法E
[0255] MAK195F溶液的等份试样添加到烧杯中。30KDa MWCOVivaspin 50浓缩器(Vivascience)用超纯水清洗,使用Master-flexEasyLoad II,原始样品体积变为1∶4。蛋白质样品随后稀释到原始体积。浓缩/稀释步骤重复三次,产生原始缓冲液的1∶256的总体稀释物。在蛋白质浓度的调整之后,溶液通过0.2μm注射器驱动过滤装置无菌过滤。
[0256] c)OD280蛋白质浓度测量
[0257] ThermoSpectronics UV1设备被用于在280nm处评估蛋白质浓度,施加2 -1
1.37cmmg 的消光系数。为此,结晶浆液的等份试样在14,000rpm离心,测定上清液中残余的蛋白质浓度。
[0258] d)pH值测量
[0259] pH值测量使用Mettler Toledo MP220pH计进行。使用Inlab 413电极和Inlab423微电极。
[0260] e1)微尺度结晶-直滴蒸气扩散Hydra II
[0261] 起始的结晶筛选使用Hydra II结晶机器人和Greiner 96孔平板(三个滴孔,Research Hampton)进行。在安装平板之后,孔用Clearseal膜(Hampton Research)密封。
[0262] e2)微尺度结晶-悬滴蒸气扩散
[0263] 悬滴蒸气扩散实验分别使用VDX平板(具有密封剂,HamptonResearch)和OptiClear塑料盖片(正方形,Hampton Research)或硅化的玻璃盖玻片(圆形的,Hampton Research)进行。在制备储备溶液之后,一滴贮备溶液与一滴蛋白质溶液在盖玻片上混合,用翻转的盖玻片密封反应孔,从而液滴悬在储备液上方。
[0264] f1)批量结晶-方法A(96/24孔平板)
[0265] 通过在反应孔中混合蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行批量结晶。反应孔随后用胶带密封来防止水蒸发。
[0266] f2)批量结晶-方法B(Eppendorff反应管)
[0267] 通过在1.5mL或2mL Eppendorff反应管中混合蛋白质溶液与等量的结晶溶液来进行批量结晶。
[0268] f3)批量结晶-方法C(Falcon试管、无搅拌)
[0269] 通过在50mL Falcon试管中混合蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行批量结晶。
[0270] f4)批量结晶-方法D(Falcon试管、搅拌)
[0271] 通过在50mL Falcon试管中混合蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行批量结晶。在密闭之后立刻,试管置于实验室摇动器(GFL 3013或GFL 3015)上,或做为选择通过滚转来搅拌。通过所应用的方法,可以避免向样品中引入搅拌器。
[0272] f5)批量结晶-方法E(1升聚丙烯容器,搅拌或无搅拌)
[0273] 通过在灭菌的1升聚丙烯瓶子中混合蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行批量结晶。在密闭之后立刻,通过滚转来搅拌容器,或不搅拌。通过所应用的方法,可以避免向样品中引入搅拌器。
[0274] g)SDS-PAGE
[0275] 通过将蛋白质浓度调节至8μg/20μL来制备样品。样品用含有溴酚蓝的SDS/Tris/甘油缓冲液稀释。
[0276] 使用Invitrogen NuPage 10%Bis-Tris凝胶、NuPage MES SDS运行缓冲液和Mark12宽量程蛋白质标准物进行定性SDS PAGE分析。20μL样品移液到凝胶孔穴中。在跑凝胶和用乙酸/甲醇试剂固定之后,使用Novex Colloidal Blue染色工具进行染色。使用Invitrogen Gel-Dry干燥溶液来干燥凝胶。
[0277] h)光学显微术
[0278] 利用Zeiss Axiovert 25或Nikon Labophot显微镜观察晶体。后者装备有偏光滤镜组和JVC TK C1380彩色摄像机。
[0279] i)近似晶体大小的评定
[0280] 使用Nikon Labophot显微镜和JVC Digital Screen MeasurementComet软件版本3.52a,测定近似的晶体大小。
[0281] k)SE-HPLC
[0282] MAK195F样品的聚集水平通过SE-HPLC评估。Dionex P680泵、ASI-100自动取样器和UVD170U检测设备。通过两个连续的Amersham Bioscience Agarose 1210/300GL凝胶TM过滤柱,应用批准的Abbott标准方案(Afelimomab -药物物质)从单体分离聚集的物质。
[0283] 除非另有陈述,上述鉴定一般程序可以通过本领域技术水平之内的任何其他等价操作来替代。
[0284] C.蒸气扩散结晶实验
[0285] 以下实施例中给出的浓度值是在混合两种溶液之前关于抗体溶液和储备溶液的初始值。
[0286] 如果没有另外描述,所有pH值是指在与其他物质例如结晶试剂组合之前缓冲液贮备液(乙酸盐或柠檬酸盐缓冲液)的pH值。
[0287] 如果没有另外描述,所有缓冲液摩尔浓度是指在一般用醋酸或柠檬酸进行pH值调整之前,贮备溶液中的乙酸钠/柠檬酸钠浓度。
[0288] 实施例1-蒸气扩散方式中的条件的初步筛选
[0289] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/ml。使用Hydra II结晶机器人,96孔Greiner平板利用商业上可获得的结晶筛在环境温度下建立。蛋白质溶液和结晶试剂以1∶1的比例混合。使用以下的筛:Hampton CrystalScreen 1&2(Hampton Research)、Wizard Screen I&II(EmeraldBioStructures)、Hampton Index Screen(Hampton Research)、JenaScreens 1-8(Jena Bioscience)。在将蛋白质添加到本领域公知的结晶试剂之后(每个条件一滴),平板用Clearseal膜密封,在环境温度保存。在以后7天期间,液滴的显微镜检查进行多次。状况分为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴、含有沉淀物质和晶体的混合物的液滴。
[0290] 结果:从测试的480种条件中,在11种中观察到晶体。条件包含厂家声明的以下结晶试剂。
[0291] -0.1M二甲胂酸钠pH 6.5,0.2M乙酸钙,18%w/v PEG 8,000(Hampton Crystal Screen,D10)
[0292] -0.1M MES pH 6.5,12%w/v PEG 20,000(Hampton Crystal Screen,F10)[0293] -0.1M柠檬酸盐,pH 5.5,20%w/v PEG 3,000(Wizard Screen I&II,A6)[0294] -0.1M乙酸盐,pH 4.5,20%w/v PEG 3,000(Wizard Screen I&II,D9)[0295] -0.1M Bis-Tris pH 6.5,45%v/v聚丙二醇P 400(Hampton Index,E10)[0296] -0.1M HEPES pH 7.5,0.02M氯化镁,22%w/v聚丙烯酸5,100钠盐
[0297] (Hampton Index,E11)
[0298] -0.1M Tris pH 8.5,0.2M三甲胺N-氧化物二水合物,20%w/vPEG MME 2000[0299] (Hampton Index,F2)
[0300] -0.2M柠檬酸钠二水合物,20%w/v PEG 3,350(Hampton Index,H10)
[0301] -10%PEG 4,000,0.1M HEPES钠pH 7.5,20%异丙醇(JENA 1-4,E5)
[0302] -15%PEG 4,000,0.1M柠檬酸钠pH 5.6,0.2M硫酸铵(JENA 1-4,F2)
[0303] -20%PEG 4,000,0.1M柠檬酸钠pH 5.6,0.2M硫酸铵(JENA 1-4,G6)
[0304] 晶体显示了具有约10到约150μm长度的针状的形态。
[0305] 实施例2-利用Hampton PEG/离子筛选的悬滴蒸气扩散
[0306] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/ml。使用油脂化的VDX平板和圆形硅化玻璃盖玻片。48种缓冲制剂的每种1mL移液到反应孔中。约1μL蛋白质样品移液到盖玻片上,随后与特定反应孔的约1μL贮备溶液混合。反应孔用翻转的盖玻片密封,产生悬滴实验。平板在环境温度下保存。在以后7天期间,液滴的显微镜检查进行多次。状况分为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质和晶体的混合物的液滴。
[0307] 结果:从测试的48种条件中,在一种中观察到晶体。该条件包含厂家声明的以下结晶试剂:
[0308] -0.2M柠檬酸三钾一水合物,20%w/v PEG 3,350pH 8.3晶体显示了具有约10到约50μm尺度的针簇样形态。
[0309] 实施例3-利用Hampton低离子强度筛选的悬滴蒸气扩散
[0310] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/ml。使用油脂化的VDX平板和圆形硅化玻璃盖玻片。1mL的24%w/v PEG 3,350脱水溶液吸移到108个反应孔中。约2μL的蛋白质样品吸移到盖玻片上,随后与约1μL的18种特定缓冲试剂之一混合。此后,六种不同浓度的约2.5μL PEG 3,350添加到液滴中。
反应孔用翻转的盖玻片密封,产生108种不同的悬滴实验。平板在环境温度下保存。在以后7天期间,液滴的显微镜检查进行多次。状况分为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀物质和晶体的混合物的液滴。
[0311] 结果:在测试的108种条件的任一个中没有观察到晶体。
[0312] 实施例4-悬滴蒸气扩散方式的PEG 4,000/柠檬酸钠网格筛选
[0313] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/ml。使用油脂化的VDX平板和圆形硅化玻璃盖玻片。1mL特定贮备溶液通过在每个反应孔中混合柠檬酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水(完全脱盐的和任选地预蒸馏的)来制备。在这个实施例中,柠檬酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,PEG 4,000浓度保持恒定在约20%w/v。pH值以0.1的梯级从约4.2到约6.5变化,产生24种不同的条件。约1μL蛋白质溶液与约1μL特定贮备溶液在圆形硅化玻璃盖玻片上混合,反应孔用翻转的玻片密封,产生悬滴实验。平板在环境温度下保存。在保存过夜之后进行液滴的显微镜检查。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0314] 结果:在保存过夜后在测试的24种条件的任一个中没有观察到晶体。
[0315] 实施例5-以悬滴蒸气扩散方式的PEG 4,000/柠檬酸钠网格筛选,不同的设置[0316] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。使用油脂化的VDX平板和圆形硅化玻璃盖玻片。1mL的特定贮备溶液通过在每个反应孔中混合柠檬酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,柠檬酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,PEG 4,000在约10%w/v、15%w/v、20%w/v和25%w/v的浓度下施加。pH值以0.3的梯级从约5.0到约6.5变化,产生24种不同的条件。约1μL蛋白质溶液与约1μL特定贮备溶液在圆形硅化玻璃盖玻片上混合,反应孔用翻转的玻片密封,产生悬滴实验。平板在环境温度下保存。在保存过夜之后进行液滴的显微镜检查。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0317] 结果:在保存过夜后在测试的24种条件的任一个中没有观察到晶体。
[0318] 实施例6-以悬滴蒸气扩散方式的PEG4,000/乙酸钠网格筛选
[0319] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。使用油脂化的VDX平板和圆形硅化玻璃盖玻片。1mL的特定贮备溶液通过在每个反应孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,PEG 4,000浓度保持恒定在约20%w/v。pH值以0.1的梯级从约3.6到约5.6变化,产生21种不同的条件。约1μL蛋白质溶液与约1μL特定贮备溶液在圆形硅化玻璃盖玻片上混合,反应孔用翻转的玻片密封,产生悬滴实验。平板在环境温度下保存。液滴的显微镜检查在后来的七天期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0320] 结果:从测试的21种条件中,分别在pH值约4.9、5.0、5.3和5.6观察到晶体。晶体显示了约30到约300μm尺寸的针状或针簇样形态。
[0321] 实施例7-以悬滴蒸气扩散方式的PEG 4,000/乙酸钠网格筛选,不同的设置[0322] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。使用油脂化的VDX平板和圆形硅化玻璃盖玻片。1mL的特定贮备溶液通过在每个反应孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,PEG 4,000在约10%w/v、15%w/v、25%w/v、30%w/v、35%w/v和40%w/v的浓度下施加。pH值约3.9、4.2、4.8和5.1,产生24种不同的条件。约1μL蛋白质溶液与约1μL特定贮备溶液在圆形硅化玻璃盖玻片上混合,反应孔用翻转的玻片密封,产生悬滴实验。平板在环境温度下保存。液滴的显微镜检查在后来的七天期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0323] 结果:从测试的24种条件中,在pH值约5.1和PEG 4,000浓度约15%w/v下观察到晶体。晶体显示了约50到约150μm长度的针状形态。
[0324] 实施例8-以悬滴蒸气扩散方式的PEG 4,000/乙酸钠网格筛选,不同的设置[0325] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。使用了油脂化的VDX平板和方形OptiClear塑料盖玻片。500μL的特定贮备溶液通过在每个反应孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,PEG 4,000浓度保持恒定在约20%w/v。pH值以0.1的梯级从约4.2到约6.5变化,产生24种不同的条件。约1μL蛋白质溶液与约1μL特定贮备溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合,反应孔用翻转的玻片密封,产生悬滴实验。平板在环境温度下保存。液滴的显微镜检查在后来的二十一天期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0326] 结果:从测试的24种条件中,在pH值约4.6、4.84.9、5.1、5.2、5.5和5.7下观察到晶体。晶体显示了针状或针簇样形态。
[0327] 实施例9-以悬滴蒸气扩散方式的PEG 4,000/乙酸钠网格筛选,不同的设置[0328] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。使用了油脂化的VDX平板和方形OptiClear塑料盖玻片。500μL的特定贮备溶液通过在每个反应孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,PEG 4,000在约16%w/v、18%w/v、22%w/v和24%w/v的浓度下施加。pH值约4.2、4.7、5.2、5.7、6.2和6.5,产生24种不同的条件。约1μL蛋白质溶液与约1μL特定贮备溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合,反应孔用翻转的玻片密封,产生悬滴实验。平板在环境温度下保存。液滴的显微镜检查在后来的二十一天期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0329] 结果:从测试的24种条件中,在pH值约6.2和PEG 4,000浓度约18%、22%和24%w/v下观察到晶体。晶体显示了针状或针簇样形态。
[0330] 实施例10-以悬滴蒸气扩散方式的PEG 4,000/乙酸钠网格筛选,不同的设置[0331] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。使用了油脂化的VDX平板和方形OptiClear塑料盖玻片。500μL的特定贮备溶液通过在每个反应孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,缓冲液pH值保持恒定在约5.7。PEG 4,000在约10%w/v、12%w/v、14%w/v、16%w/v、18%w/v和20%w/v的浓度下施加。在此,一式四份地评估了六种不同的条件。约1μL蛋白质溶液与约1μL特定贮备溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合,反应孔用翻转的玻片密封,产生悬滴实验。平板在环境温度下保存。液滴的显微镜检查在后来的二十一天期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0332] 结果:从测试的6种条件中,在所有PEG 4,000浓度下观察到晶体。在四份的实验中一到四个反应孔中观察到晶体。晶体显示了针状或针簇样形态。
[0333] 实施例11-以悬滴蒸气扩散方式的PEG 4,000/乙酸钠网格筛选,不同的设置[0334] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。使用了油脂化的VDX平板和方形OptiClear塑料盖玻片。500μL的特定贮备溶液通过在每个反应孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,PEG 4,000在约8%w/v、10%w/v、12%w/v和14%w/v的浓度下施加。pH值约4.2、4.7、5.2、5.7、6.2和6.5,产生
24种不同的条件。约1μL蛋白质溶液与约1μL特定贮备溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合,反应孔用翻转的玻片密封,产生悬滴实验。平板在环境温度下保存。液滴的显微镜检查在后来的二十一天期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0335] 结果:从测试的24种条件中,在pH值约4.7和PEG 4,000浓度约8%w/v、10%w/v和12%w/v下观察到晶体。此外,在pH值约5.2和PEG 4,000浓度约12%和14%w/v下观察到晶体。此外,在pH值约5.7和PEG 4,000浓度约10%、12%w/v和14%w/v下观察到晶体。此外,在pH值约6.2和PEG 4,000浓度约10%和14%w/v下观察到晶体。此外,在pH值约6.5和PEG 4,000浓度约8%w/v和12%w/v下观察到晶体。晶体显示了针状或针簇样形态。
[0336] 实施例12-以悬滴蒸气扩散方式的PEG 4,000/柠檬酸钠网格筛选,不同的设置[0337] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。使用了油脂化的VDX平板和方形OptiClear塑料盖玻片。500μL的特定贮备溶液通过在每个反应孔中混合柠檬酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,柠檬酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,PEG4,000浓度保持恒定在约20%w/v。pH值以0.1的pH值单位梯级从约4.2到约6.5变化,产生24种不同的条件。约1μL蛋白质溶液与约1μL特定贮备溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合,反应孔用翻转的玻片密封,产生悬滴实验。平板在环境温度下保存。液滴的显微镜检查在后来的九天期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0338] 结果:从测试的24种条件中,在pH值约5.1到6.5观察到晶体。晶体显示了针状或针簇样形态。
[0339] 实施例13-以悬滴蒸气扩散方式的PEG 4,000/柠檬酸钠网格筛选,不同的设置[0340] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。使用了油脂化的VDX平板和方形OptiClear塑料盖玻片。500μL的特定贮备溶液通过在每个反应孔中混合柠檬酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,柠檬酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,PEG4,000在约16%w/v、18%w/v、22%w/v和24%w/v的浓度下施加。pH值以0.5的pH值单位梯级从约4.2到约6.5变化,产生24种不同的条件。约1μL蛋白质溶液与约1μL特定贮备溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合,反应孔用翻转的玻片密封,产生悬滴实验。平板在环境温度下保存。液滴的显微镜检查在后来的九天期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0341] 结果:从测试的24种条件中,在pH值约4.7和PEG 4,000浓度约16%w/v下观察到晶体。此外,在pH值约5.2和PEG 4,000浓度约16%和18%w/v下观察到晶体。此外,在pH值约5.7和PEG 4,000浓度约16%w/v、18%w/v、22%w/v和24%w/v下观察到晶体。此外,在pH值约6.2和PEG 4,000浓度约10%和14%w/v下观察到晶体。此外,在pH值约6.5和PEG 4,000浓度约16%w/v下观察到晶体。晶体显示了针状或针簇样形态。
[0342] 实施例14-以悬滴蒸气扩散方式的PEG 4,000/柠檬酸钠网格筛选,不同的蛋白质缓冲液
[0343] MAK195F在它的标准药物物质缓冲液(12.39mg/mL MAK195F在10mM磷酸钠、150mM氯化钠、0.01%Pluronic F 68、pH 7.2中)中使用。Abbott所声明的缓冲液组合物是12.4mg/mL MAK195F在10mM磷酸钠、150mM氯化钠、0.01%Pluronic F 68、pH 7.2中。使用了油脂化的VDX平板和方形OptiClear塑料盖玻片。500μL的特定贮备溶液通过在每个反应孔中混合柠檬酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,柠檬酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,PEG 4,000保持恒定在约20%w/v的浓度下。pH值以0.1的pH值单位梯级从约4.2到约6.5变化,产生24种不同的条件。
约1μL蛋白质溶液与约1μL特定贮备溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合,反应孔用翻转的玻片密封,产生悬滴实验。平板在环境温度下保存。液滴的显微镜检查在后来的六天期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0344] 结果:从测试的24种条件中,在约5.3到约5.9的pH值范围下观察到晶体。晶体显示了针状或针簇样形态。
[0345] 实施例15-以悬滴蒸气扩散方式的PEG 4,000/柠檬酸钠网格筛选,不同的蛋白质缓冲液
[0346] MAK195F在它的标准药物物质缓冲液(12.39mg/mL MAK195F在10mM磷酸钠、150mM氯化钠、0.01%Pluronic F 68、pH 7.2中)中使用。使用了油脂化的VDX平板和方形OptiClear塑料盖玻片。500μL的特定贮备溶液通过在每个反应孔中混合柠檬酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,柠檬酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,PEG 4,000在约16%w/v、18%w/v、22%w/v和24%w/v的浓度下施加。pH值以0.5的pH值单位梯级从约4.2到约6.5变化,产生24种不同的条件。约1μL蛋白质溶液与约1μL特定贮备溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合,反应孔用翻转的玻片密封,产生悬滴实验。平板在环境温度下保存。液滴的显微镜检查在后来的六天期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0347] 结果:从测试的24种条件中,在pH值约5.7和PEG 4,000浓度约16%和18%w/v下观察到晶体。此外,在PEG 4,000浓度约16%w/v和pH值分别约6.2和6.5下观察到晶体。晶体显示了针状或针簇样形态。
[0348] 实施例16-以悬滴蒸气扩散方式的醋酸锌/柠檬酸钠网格筛选
[0349] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。使用了油脂化的VDX平板和方形OptiClear塑料盖玻片。500μL的特定贮备溶液通过在每个反应孔中混合柠檬酸盐缓冲液、醋酸锌和Milli Q水来制备。在这个实施例中,柠檬酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,醋酸锌在约0.05M、0.1M、0.5M和0.9M的浓度下使用。pH值以0.5的pH值单位梯级从约4.2到约6.5变化,产生24种不同的条件。约1μL蛋白质溶液与约1μL特定贮备溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合,反应孔用翻转的玻片密封,产生悬滴实验。平板在环境温度下保存。液滴的显微镜检查在后来的二十一天期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0350] 结果:在测试的24种条件的任一种下没有观察到晶体。
[0351] 实施例17-以悬滴蒸气扩散方式的甘露醇/柠檬酸钠网格筛选
[0352] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。使用了油脂化的VDX平板和方形OptiClear塑料盖玻片。500μL的特定贮备溶液通过在每个反应孔中混合柠檬酸盐缓冲液、甘露醇和Milli Q水来制备。在这个实施例中,柠檬酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,甘露醇在约0.05M、0.1M、0.5M和0.9M的浓度下使用。pH值以0.5的pH值单位梯级从约4.2到约6.5变化,产生24种不同的条件。约1μL蛋白质溶液与约1μL特定贮备溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合,反应孔用翻转的玻片密封,产生悬滴实验。平板在环境温度下保存。液滴的显微镜检查在后来的六天期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0353] 结果:在测试的24种条件的任一种下没有观察到晶体。
[0354] 实施例18-以悬滴蒸气扩散方式的PEG 4,000/乙酸钠网格筛选,不同的温度[0355] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。使用了油脂化的VDX平板和方形OptiClear塑料盖玻片。500μL的特定贮备溶液通过在每个反应孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,PEG 4,000在约10%w/v,12%w/v,18%w/v和20%w/v的浓度下施加。pH值自始至终是约5.6。约1μL蛋白质溶液与约1μL特定贮备溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合,反应孔用翻转的玻片密封,产生悬滴实验。平板在4℃下保存。在保存过夜之后进行液滴的显微镜检查。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。作为阳性对照,用等同的条件设置第二平板,保存在环境温度下。
[0356] 结果:在4℃保存过夜后在测试的24种条件的任一个中没有观察到晶体。阳性对照在PEG 4,000浓度10%w/v、12%w/v和18%w/v下含有晶体。
[0357] 实施例19-以悬滴蒸气扩散方式的PEG 4,000/乙酸钠网格筛选,不同的蛋白质缓冲液
[0358] MAK195F交换到含有约0.1M乙酸钠、pH值约5.5的缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。使用了油脂化的VDX平板和方形OptiClear塑料盖玻片。500μL的特定贮备溶液通过在每个反应孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。
在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度不同于约0.1M,PEG 4,000浓度以2%的梯级从约
12%w/v到约26%w/v变化。pH值自始至终是约5.5。每个条件一式三份评估。约1μL蛋白质溶液与约1μL特定贮备溶液在方形OptiClear塑料盖玻片上混合,反应孔用翻转的玻片密封,产生悬滴实验。平板在环境温度下保存。液滴的显微镜检查在后来的十四天期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0359] 结果:从评估的24个反应孔中,在所有测试的PEG 4,000浓度下观察到晶体。晶体显示了针状或针簇样形态。
[0360] D1.体积最高达1mL的批量实验
[0361] 以下实施例给出的浓度值是两种溶液混合之前抗体溶液和结晶溶液的初始值。
[0362] 如果没有另外描述,所有的pH值是指在与其他物质如结晶试剂组合之前,缓冲液贮备液(乙酸盐或柠檬酸盐缓冲液)的pH值。
[0363] 如果没有另外描述,所有缓冲液摩尔浓度是指在一般使用冰醋酸或柠檬酸进行的pH值调整之前、在贮备溶液中的乙酸钠或柠檬酸钠浓度。
[0364] 实施例20-以50μL批量模式的PEG 4,000/乙酸钠栅屏
[0365] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在反应孔中混合约25μL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。反应孔平板随后用胶带密封来防止水蒸发。25μL的特定结晶溶液通过在每个反应孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.05M,乙酸盐缓冲液pH值自始至终约5.7。PEG 4,000浓度以1%的梯级从约12%w/v到约4%w/v变化。每个条件一式两份地评估。平板在环境温度下保存。在三天后进行反应孔的显微镜检查。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0366] 结果:在3天后在测试的18种条件的任一种中没有观察到晶体。
[0367] 实施例21-以50μL体积批量模式的PEG 4,000/乙酸钠网格筛选,不同的设置[0368] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在反应孔中混合约25μL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。反应孔平板随后用胶带密封来防止水蒸发。25μL的特定结晶溶液通过在每个反应孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值自始至终约5.7。PEG 4,000浓度以2%的梯级从约14%w/v到约36%w/v变化。每个条件一式两份地评估。平板在环境温度下保存。反应孔的显微镜检查在后来的七天期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0369] 结果:从观察的18个反应孔中,在用22%w/v和16%w/v PEG4,000设立的条件下观察到晶体。
[0370] 实施例22-300μL体积批量模式的PEG 4,000/乙酸钠网格筛选
[0371] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在反应孔中混合约150μL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。反应孔平板随后用胶带密封来防止水蒸发。150μL的特定结晶溶液通过在每个反应孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值自始至终约5.7。PEG 4,000浓度以2%的梯级从约18%w/v到约24%w/v变化。每个条件一式两份地评估。平板在环境温度下保存。液滴的显微镜检查在后来的十四天期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0372] 结果:从观察的8个反应孔中,在所有测试的条件下观察到晶体。在20%w/v PEG4,000批次中,除了结晶物质外没有观察到沉淀。
[0373] 实施例23-300μL体积批量模式的PEG 4,000/乙酸钠网格筛选,不同的蛋白质缓冲液
[0374] MAK195F在它的标准药物物质缓冲液(12.39mg/mL MAK195F在10mM磷酸钠、150mM氯化钠、0.01%Pluronic F 68、pH 7.2中)中使用。批量结晶通过在反应孔中混合约150μL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。反应孔平板随后用胶带密封来防止水蒸发。150μL的特定结晶溶液通过在每个反应孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/vPEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值自始至终约5.7。PEG 4,000浓度以2%的梯级从约18%w/v到约24%w/v变化。每种条件评估一次。平板在环境温度下保存。液滴的显微镜检查在后来的十四天期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0375] 结果:观察的4个反应孔中,在所有测试的条件下观察到晶体。实施例24-150μL体积批量模式中PEG 4,000/乙酸钠和柠檬酸钠网格筛选,寻找导致扩大规模超过1mL的条件
[0376] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在反应孔中混合约75μL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。反应孔平板随后用胶带密封来防止水蒸发。75μL的特定结晶溶液通过在每个反应孔中混合乙酸盐或柠檬酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,缓冲液pH值约4.2、4.7、5.2、5.7和6.2。PEG4,000浓度以2%的梯级从约6%w/v到约28%w/v变化。每个条件一式三份评估。平板在环境温度下保存。液滴的显微镜检查分别在1、2、3和7天后进行。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。并且,通过OD280测定一种条件的三个反应孔中的两个的颗粒物质产量。100μL等份试样在
14,000×g离心,评定上清液中的蛋白质浓度。
[0377] 结果:通过从约6%w/v到约28%w/v改变PEG 4,000浓度,晶体化合物的外观从清澈(低PEG浓度)到针状或针簇样晶体(中度PEG浓度)到沉淀(高PEG浓度水平)。结晶窗口的出现还取决于缓冲液组成(pH值、离子强度、盐)。使用乙酸盐缓冲液和6.2的pH值没有观察到晶体,pH值4.2和6.2的柠檬酸盐缓冲液也没有。所有其他缓冲液系统显示了在特征性的PEG 4,000浓度下的结晶窗口。这些结果表明,可能的结晶条件散布在通过使用添加的化学物质产生的基质中,有可能选择产生晶体而没有伴随的沉淀的缓冲液组合物。
[0378] 实施例25-1mL体积批量模式中的PEG 4,000/乙酸钠网格筛选
[0379] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在1.5mL Eppendorf反应管中混合约500μL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。500μL的特定结晶溶液通过在试管中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值是约4.7或5.2。PEG4,000在两种浓度16%w/v和18%w/v下添加。每个条件一式两份地评估。试管在环境温度下保存。每个试管的1μL等份试样的显微镜检查在后来一个月期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0380] 结果:在14天后,在所有测试的条件下观察到针状物。
[0381] 实施例26-150μL体积批量模式中PEG 4,000/乙酸钠网格筛选,不同的蛋白质缓冲液
[0382] MAK195F交换到含有约0.1M乙酸钠、pH值约5.5的缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在反应孔中混合约75μL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。反应孔平板随后用胶带密封来防止水蒸发。75μL的特定结晶溶液通过在每个反应孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值自始至终约5.5。PEG 4,000在18%w/v和20%w/v的浓度下使用。每个条件一式两份地评估。平板在环境温度下保存。反应孔的显微镜检查在后来的十二天期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0383] 结果:在两种条件下都观察到处于针状或针簇样形态的晶体。实施例27-1mL体积批量模式中的PEG 4,000/乙酸钠网格筛选,不同的蛋白质缓冲液
[0384] MAK195F交换到含有约0.1M乙酸钠、pH值约5.0或5.5的缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在反应孔中混合约500μL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。反应孔平板随后用胶带密封来防止水蒸发。500μL的特定结晶溶液通过在每个反应孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度保持恒定在约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值自始至终约5.0或5.5。缓冲到pH值5.5的蛋白质与pH 5.5的结晶溶液混合,用缓冲到pH 5.0的蛋白质缓冲液进行同样的。PEG4,000在以2%的梯级变化的约16%w/v到24%w/v的浓度下使用。每个条件一式三份评估。平板在环境温度下保存。反应孔的显微镜检查在后来的一个月期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0385] 结果:在所有测试的条件下观察到处于针状或针样簇的形状的晶体。
[0386] 实施例28-1mL体积批量模式中的PEG 4,000/乙酸钠网格筛选,不同的设置[0387] MAK195F交换到含有约0.1M乙酸钠、pH值约5.0或5.5的缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在反应孔中混合约500μL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。反应孔平板随后用胶带密封来防止水蒸发。500μL的特定结晶溶液通过在每个反应孔中混合蒸馏水和50%w/v PEG 4,000溶液来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度是0M,即,实验中仅有的乙酸盐缓冲液是在原始MAK195F溶液中的。PEG 4,000在以2%的梯级变化的约22%w/v到26%w/v的浓度下使用。平板在环境温度下保存。反应孔的显微镜检查在后来的一个月期间进行多次。状态分类为清澈的液滴、含有随机沉淀的液滴、含有晶体的液滴和含有沉淀的物质和晶体的混合物的液滴。
[0388] 结果:在含有22%w/v PEG 4,000和pH 5.5缓冲液中的蛋白质的反应孔中观察到针状或针样簇形式的晶体。
[0389] 实施例29-1mL批量体积下PEG 4,000/乙酸钠结晶条件,聚山梨醇酯80添加的影响
[0390] MAK195F交换到含有约0.1M乙酸钠、pH值约5.5的缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。聚山梨醇酯80以约1%、0.1%、0.01%和0.001%的浓度添加到蛋白质溶液中。
设置无聚山梨醇酯80的溶液作为对照。在设置结晶实验之前溶液孵育过夜。批量结晶通过在1.5mL Eppendorf反应管中混合约500μL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。
500μL的结晶溶液通过在试管中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度在约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值约5.5。
PEG 4,000在20%w/v的浓度下使用。一式两份地评估每种聚山梨醇酯80浓度。试管在环境温度下保存。在之后一个月期间溶液的1μL等份试样的显微镜检查进行多次。
[0391] 结果:在所有容器中,针状的晶体在五天后出现。在晶体形态上、晶体产量上没有观察到差异。
[0392] 实施例30-在100μL批量体积下PEG 4,000/乙酸钠结晶条件,不同的矿物质如结晶成核剂的影响
[0393] MAK195F交换到含有约0.1M乙酸钠、pH值约5.2的缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。一组49种不同的矿物质(“Mineralogische Staatssammlung Munchen”的所有权)作为结晶成核剂来评估。这个实验的思想是研究使用这些矿物质作为表面用于不同于标准的针状或针簇样形态的多形晶体形式的生长的可行性。每种矿物质新近地分割,50到
250μm的颗粒放入反应孔中。每种矿物质一式两份地研究,设置许多无矿物质的反应孔作为对照。批量结晶通过在反应孔中混合约50μL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。
50μL的结晶溶液通过在反应孔中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度在约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值约5.2。
PEG 4,000在约16%w/v的浓度下使用。在接下来的两周期间进行反应孔平板的显微镜检查。
[0394] 结果:发现孔雀石产生了蛋白质的油样沉淀。
[0395] D2.超过1mL体积的批量实验
[0396] 以下实施例给出的浓度值是两种溶液混合之前抗体溶液和结晶溶液的初始值。
[0397] 如果没有另外描述,所有的pH值是指在与其他物质如结晶试剂组合之前,缓冲液贮备液(乙酸盐或柠檬酸盐缓冲液)的pH值。
[0398] 如果没有另外描述,所有缓冲液摩尔浓度是指在一般使用冰醋酸或柠檬酸进行的pH值调整之前、在贮备溶液中的乙酸钠或柠檬酸钠浓度。
[0399] 实施例31-在10mL批量体积下的PEG 4,000/乙酸钠结晶条件
[0400] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在50mL Falcon试管中混合约5mL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。5mL的结晶溶液通过在试管中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度在约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值约5.2。PEG 4,000在18%w/v的浓度下使用。试管在环境温度下保存。在之后一个月期间溶液的1μL等份试样的显微镜检查进行多次。此外,通过OD280测定晶体产率。悬浮液的等份试样在14,000rpm离心,评定上清液中的蛋白质浓度。
[0401] 结果:在保存过夜后出现约100到约300μm长度的针状晶体。在以后一个月的保存期间没有观察到沉淀物质。通过上清液中残余蛋白质浓度OD280测定的,晶体产率在十天后在60%到80%之间。
[0402] 实施例32-在10mL批量体积下PEG 4,000/乙酸钠结晶条件,引入搅拌
[0403] MAK195F缓冲到pH 7.4的20mM HEPES/150mM氯化钠缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在50mL Falcon试管中混合约5mL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。5mL的结晶溶液通过在试管中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度在约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值约5.2。PEG 4,000在18%w/v的浓度下使用。试管保存在环境温度下,在实验室摇动器上搅拌该批量。在之后一个月期间溶液的1μL等份试样的显微镜检查进行多次。此外,通过OD280测定晶体产量。悬浮液的等份试样在14,000rpm离心,评定上清液中的蛋白质浓度。
[0404] 结果:在一天后出现长度约10到30μm的细针状晶体。在实验期间没有观察到沉淀物质。通过上清液中残余蛋白质浓度OD280测定的,晶体产率在十天后在60%到80%之间。
[0405] 实施例33-在10mL批量体积下PEG 4,000/乙酸钠结晶条件,不同的蛋白质缓冲液
[0406] MAK195F交换到含有约0.1M乙酸钠、pH值约5.5的缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在50mL Falcon试管中混合约5mL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。5mL的结晶溶液通过在试管中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和MilliQ水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度在约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值约5.5。PEG 4,000在20%w/v和22%w/v的浓度下使用。试管在环境温度下保存。在之后一个月期间溶液的1μL等份试样的显微镜检查进行多次。此外,通过OD280测定晶体产量。悬浮液的等份试样在14,000rpm离心,评定上清液中的蛋白质浓度。
[0407] 结果:在两天后在两种PEG浓度水平下都出现了长度100到300μm的针状晶体。在以后一个月的保存期间没有观察到沉淀物质。通过上清液中残余蛋白质浓度OD280测定的,晶体产率在十天后在60%到80%之间。
[0408] 实施例34-10mL批量体积下PEG 4,000/乙酸钠结晶条件,不同的蛋白质缓冲液以及比较非搅拌和搅拌的批量
[0409] MAK195F交换到含有约0.1M乙酸钠、pH值约5.2的缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在50mL Falcon试管中混合约5mL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。5mL的结晶溶液通过在试管中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和MilliQ水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度在约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值约5.2。PEG 4,000在20%w/v的浓度下使用。试管保存在环境温度下,一个没有搅拌,一个置于实验室摇动器上。在之后二十一天期间溶液的1μL等份试样的显微镜检查进行多次。此外,通过OD280测定晶体产量。悬浮液的等份试样在14,000rpm离心,评定上清液中的蛋白质浓度。
[0410] 结果:在两个容器中在七天后都出现针状晶体。搅拌批量的针晶是非搅拌批量的针晶长度的约十分之一。对于非搅拌的批量,针晶长度是约100到300μm,而在搅拌的批量中,针晶是约10到30μm长。在两个容器中,通过上清液中残余蛋白质浓度OD280测定的,晶体产率在十天后在50%到80%之间。
[0411] 实施例35-10mL批量体积下PEG 4,000/乙酸钠结晶条件,不同的蛋白质缓冲液以及比较非搅拌和搅拌的批量
[0412] MAK195F交换到含有约0.1M乙酸钠、pH值约5.5的缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在50mL Falcon试管中混合约5mL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。5mL的结晶溶液通过在试管中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和MilliQ水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度在约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值约5.5。PEG 4,000在20%w/v的浓度下使用。试管保存在环境温度下,一个没有搅拌,一个置于实验室摇动器上。在之后二十一天期间溶液的1μL等份试样的显微镜检查进行多次。此外,通过OD280测定晶体产量。悬浮液的等份试样在14,000rpm离心,评定上清液中的蛋白质浓度。
[0413] 结果:在两个容器中在七天后都出现针状晶体。搅拌批量的针晶是非搅拌批量的针晶长度的约十分之一。对于非搅拌的批量,针晶长度是约100到300μm,而在搅拌的批量中,针晶是约10到30μm长。在两个容器中,通过上清液中残余蛋白质浓度OD280测定的,晶体产率在十天后在50%到80%之间。
[0414] 实施例36-在250mL批量体积下的PEG 4,000/乙酸钠结晶条件
[0415] MAK195F交换到含有约0.1M乙酸钠、pH值约5.2的缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在1L聚丙烯容器中混合约125mL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。125mL的结晶溶液通过在试管中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和MilliQ水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度在约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值约5.2。PEG 4,000在20%w/v的浓度下使用。容器在环境温度下保存。通过在约60rpm滚筒容器来进行搅拌。在之后一个月期间溶液的1μL等份试样的显微镜检查进行多次。此外,通过OD280测定晶体产量。悬浮液的等份试样在14,000rpm离心,评定上清液中的蛋白质浓度。
[0416] 结果:在三天后出现约10到30μm长度的针状晶体。在以后一个月的保存期间没有观察到沉淀物质。通过上清液中残余蛋白质浓度OD280测定的,晶体产率在七天后在60%到70%之间。
[0417] 实施例37-在10mL批量体积下PEG 4,000/乙酸钠结晶条件,不同的容器材料[0418] MAK195F交换到含有约0.1M乙酸钠、pH值约5.2的缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在50mL glass(一级)小瓶中混合约5mL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。5mL的结晶溶液通过在试管中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和Milli Q水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值约5.2。PEG 4,000在20%w/v的浓度下使用。小瓶用特氟龙化的塞子密封,在环境温度下保存,在实验室摇动器上搅拌。在之后二十一天期间溶液的1μL等份试样的显微镜检查进行多次。
[0419] 结果:三天后出现针状晶体。
[0420] 实施例38-在10mL批量体积下PEG 4,000/乙酸钠结晶条件,不同的温度[0421] MAK195F交换到含有约0.1M乙酸钠、pH值约5.2的缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在50mL Falcon试管中混合约5mL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。5mL的结晶溶液通过在试管中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和MilliQ水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度在约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值约5.2。PEG 4,000在20%w/v的浓度下使用。试管保存在4℃下,在实验室摇动器上搅拌该批量。在之后十天期间溶液的1μL等份试样的显微镜检查进行多次。在4℃保存十天后,该批量转移到环境温度。
[0422] 结果:在4℃保存期间没有出现晶体。当批量转移到环境温度时,在过夜时出现晶体。
[0423] 实施例39-在1L批量体积下的PEG 4,000/乙酸钠结晶条件
[0424] MAK195F交换到含有约0.1M乙酸钠、pH值约5.2的缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在1L聚丙烯容器中混合约500mL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。500mL的结晶溶液通过在试管中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和MilliQ水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度在约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值约5.2。PEG 4,000在20%w/v的浓度下使用。容器在环境温度下保存。通过在约60rpm滚筒容器来进行搅拌。在之后一个周期间溶液的1μL等份试样的显微镜检查进行多次。此外,通过OD280测定晶体产量。悬浮液的等份试样在14,000rpm离心,评定上清液中的蛋白质浓度。
[0425] 结果:在两天后出现针状晶体。在以后一个月的保存期间没有观察到沉淀物质。通过上清液中残余蛋白质浓度OD280测定的,晶体产率在七天后在60%到70%之间。
[0426] 实施例40-在400mL批量体积下PEG 4,000/乙酸钠结晶条件,没有搅拌
[0427] MAK195F交换到含有约0.1M乙酸钠、pH值约5.2的缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。批量结晶通过在1L聚丙烯容器中混合约200mL的蛋白质溶液和等量的结晶溶液来进行。200mL的结晶溶液通过在试管中混合乙酸盐缓冲液、50%w/v PEG 4,000溶液和MilliQ水来制备。在这个实施例中,乙酸盐缓冲液摩尔浓度约0.1M,乙酸盐缓冲液pH值约
5.2。PEG 4,000在20%w/v的浓度下使用。容器在环境温度下保存。在之后一个周期间溶液的1μL等份试样的显微镜检查进行多次。此外,通过OD280测定晶体产量。悬浮液的等份试样在14,000rpm离心,评定上清液中的蛋白质浓度。
[0428] 结果:在14天后观察到针状晶体。晶体具有约100-300μm的长度。通过上清液中残余蛋白质浓度OD280测定的,晶体产率在31天后在40%到50%之间。
[0429] E.晶体加工和分析的方法
[0430] 实施例41-晶体的洗涤
[0431] 在晶体形成之后,没有晶体的再溶解的洗涤步骤是有利的。因此,在实施例36中描述的结晶过程完成之后,晶体浆液被转移到离心试管中,在500到1000×g离心二十分钟。在4℃或在环境温度下进行离心。在离心之后,丢弃上清液,晶体颗粒容易地重悬浮在含有约20%w/v PEG 4,000的约0.1M乙酸钠pH约5.2的缓冲液中。通过OD280分析的,在洗涤缓冲液中没有发生可测量的MAK195F晶体的溶解。离心/重悬浮步骤随后重复一到三次,在这个洗涤过程之后,颗粒重悬浮并保存。
[0432] 实施例42-结晶过程的产率扩大
[0433] 结晶过程的终点可以定义为当结晶浆液的上清液的等份试样的OD280测量保存恒定,例如随后三天的时点。通过添加一定量的另外的PEG 4,000(在pH约5.2的约0.1M乙酸钠缓冲液中的50%w/v溶液)到结晶浆液的上清液中,发现产率扩大是可能的。在以后数天形成了与初次收获相同形状的晶体。进行这种操作,容易地驱使总回收率超过90%,而不引入沉淀。
[0434] 例如,在实施例39的上清液的等份试样中,PEG 4,000浓度从约10%w/v提高到约20%w/v、18%w/v、16%w/v、14%w/v和12%w/v。在环境温度下保存过夜中,在约20%w/v、18%w/v和16%w/v PEG4,000下观察到沉淀的物质。在约14%w/v和12%w/v PEG4,000下发现没有伴随的沉淀的晶体。通过向结晶浆液的残余上清液中添加PEG4,000到约
14%w/v的总浓度,在两天中,总体晶体产率从约60%到70%推动到超过90%。
[0435] 实施例43-通过SDS-PAGE的晶体分析
[0436] 为了确认晶体的蛋白质性质,来自实施例36的晶体根据实施例41的方案洗涤。在几个洗涤步骤之后,通过OD280测定的是,在洗涤缓冲液上清液中不存在可测量数量的溶解蛋白质。弃去上清液,晶体随后溶于蒸馏水中。这个溶液的OD280测量显示了,现在存在溶解的是,因为UV吸收是显著的。当与MAK195F标准物相比较时,这个溶液的SDS-PAGE分析显示了相同的模式。
[0437] 实施例44-SE-HPLC的晶体分析
[0438] 为了评估MAK195F晶体的聚集的物质的含量,来自实施例36的洗涤的晶体的等份试样被离心,根据标准方法重溶解在SE-HPLC运行缓冲液中。在结晶过程的完成时,在这个实施例中在环境温度下七天,聚合物含量从约0.9%稍微提高到约1.3-1.4%。不清楚的是,这样的聚合物是否是MAK195F晶体的固有的特征,或是否是,例如,在晶体表面的未结晶的可溶的MAK195F单体聚合物。
[0439] 产生MAK195F晶体的上述批量实验的实验条件在表2中概括。
[0440] 表2-产生MAK195F的晶体的选定的批量实验
[0441]
[0442]
[0443] 结晶溶液:用蛋白质样品1∶1稀释的
[0444] 蛋白质缓冲液 1∶20mM HEPES/150NaCl/pH7.4
[0445] 2∶10mM NaPhos,150mM NaCI,0.01%Pluronic F68,pH 7.2
[0446] 3∶0.1M NaAc,pH 5.5
[0447] 4∶0.1M NaAc,pH 5.0
[0448] 5∶0.1M NaAc,pH 5.5,0,0.001,0.01,0.1,1%聚山梨醇酯80
[0449] 60.1M NaAc,pH 5.2
[0450] F.研究搅拌对结晶结果的影响的实验
[0451] 这些实验的目的是研究搅拌速度对已经对抗体例如MAK 195F实施的批量结晶方法的影响。通过保持所有其他参数恒定,搅拌的程度在五个连续的批次中不同(10、20、40、60和80rpm)。探索了对结晶动力学、总产量和颗粒形状和大小分布的影响。
[0452] 实施例45-在控制的条件下MAK195F的结晶
[0453] 材料
[0454] -MAK195F,lot G008.01E/PZ0105P025(Abbott Laboratories)
[0455] -无水乙酸钠(Gruessing)
[0456] -冰醋酸(Merck)
[0457] -聚乙二醇4,000(Clariant)
[0458] -聚丙烯瓶子,直径8cm,高度10cm
[0459] 方法
[0460] 冷冻的MAK195F(在500mL聚丙烯瓶子中在-80℃保存)在环境温度下在2小时内解冻。在解冻时,药物物质溶液是清澈的,肉眼没有观察到污染物颗粒。蛋白质缓冲液如下制备:500mL乙酸盐缓冲液通过在纯水中溶解41.02g乙酸钠来制备。体积调节到500.0mL,pH值用冰醋酸调节到5.2。400mL的这种缓冲液用纯水稀释到4.0L的总容积。这种缓冲液在五个批量结晶的每一个之前新鲜制备。
[0461] 对于每个批量结晶,25mL的MAK195F通过使用Slide-A-Lyzer透析盒(12-30mL填充体积,10kDa MWCO)交换到蛋白质缓冲液中。蛋白质浓度然后用蛋白质缓冲液调节到10mg/ml,溶液使用0.22μm滤片(PVDF)无菌过滤。
[0462] 结晶溶液如下制备:500mL乙酸盐缓冲液通过在纯水中溶解41.02g乙酸钠来制备。体积调节到500.0mL,pH值用冰醋酸调节到5.2。200g的PEG 4,000溶于100mL乙酸盐缓冲液和纯水中,随后体积调节至1,000mL。这种结晶溶液用于所有的批量结晶,在2-8℃保存。
[0463] 结晶通过在聚丙烯瓶子中混合25mL蛋白质溶液和25mL结晶溶液来启动。瓶子随后通过在20℃滚转来搅拌9天。建立5个结晶批次,分别在10rpm、20rpm、40rpm、60rpm和80rpm(每分钟转速)下搅拌。每天,200μL的等份试样从任何样品中取出,通过在晶体离心后上清液的蛋白质浓度测定来确定晶体产率。
[0464] 晶体产率[/o]=C蛋白质,总量-C蛋白质,上清液/C蛋白质,总量×100%[0465] 晶体的光学显微图片如下取得:在搅拌8天后,10μL的等份试样吸移到物镜夹持器上,随后用玻璃盖玻片覆盖。使用装备有E-PI 10×目镜和40×物镜的Zeiss Axiovert25反相光学显微镜评估制品。图片使用数字照相机(Sony Cybershot DSC S75)拍摄。
[0466] 晶体的颗粒大小测量如下进行:
[0467] I)人工评估
[0468] 在搅拌8天后,10μL的等份试样吸移到物镜夹持器上,随后用玻璃盖玻片覆盖。使用装备有CFW 10×目镜和20×物镜的NikonLabophot显微镜。通过JVC TK C1380彩色摄像机将显微照片转移到计算机屏幕上,通过JVC Digital Screen Measurement Comet软件版本3.52a测量100个晶体的长度,来评估晶体大小9最大长度)。对于这100个测量,指明了颗粒大小分布和最大长度的平均值。
[0469] II)自动评估
[0470] 为了在更为统计学上显著的基础上洞察样品的颗粒大小分布,还用PS Prozesstechnik XPT-C Optical Particle Analysis System(PSProzesstechnik GmbH,Basel,Switzerland)分析了悬浮液记录了Feretmax(所有颗粒方向上最大距离)值。每个样品的颗粒数量分别超过了5,000。
[0471] SE-HPLC数据如下评估:任何结晶批次的两个300μL等份试样在12天后取出。等份试样被离心,随后弃去上清液。晶体颗粒用MAK195F药物物质缓冲液重溶解,使得蛋白质浓度是1mg/ml。等份试样在-80℃保存直到SE-HPLC分析时。根据标准方法进行SE-HPLC分析。
[0472] 搅拌速度(聚丙烯瓶子,直径8cm,高度10cm,每分钟转速=rpm)对结晶动力学和总产率的作用在附图1中描绘。
[0473] 结果表明,通过施加不同的转速,结晶动力学(曲线的形状)和总产量(ymax)都不受影响。虽然总产率在8天的结晶之后总是约55%,结晶曲线的形状显示了所有实验可以分成三个相似的部分:
[0474] -停滞阶段(第1和2天),没有产量;
[0475] -主要结晶期(第3-5天),结晶率>10%(与达到的产量相比)。
[0476] -次要结晶期和平台期(第6-8天),结晶率<10%,通过SE-HPLC分析的最大MAK195F纯度
[0477] 对每个结晶批次进行SE-HPLC分析来检查转速是否影响降解产物和/或聚合物的形成。在表3中描绘的结果展现了MAK195F纯度不受影响。
[0478] 表3:搅拌速度对MAK195F纯度的影响
[0479]样品 聚集物(%) 单体(%) 片段(%)
结晶之前的批量材料 0.8 98.4 0.8
10rpm 2.2 97.6 0.2
20rpm 2.1 97.7 0.2
40rpm 1.9 97.9 0.2
60rpm 2.4 97.3 0.3
80rpm 2.1 97.7 0.2
[0480] 颗粒形状和大小分布
[0481] 搅拌速度对颗粒形状的影响在附图2中示出。所有的批量结晶产生了针形的晶体物质。
[0482] -图A:MAK195F晶体,10rpm
[0483] -图B:MAK195F晶体,20rpm
[0484] -图C:MAK195F晶体,40rpm
[0485] -图D:MAK195F晶体,60rpm
[0486] -图F:MAK195F晶体,80rpm
[0487] 搅拌速度对颗粒大小分布的影响在附图3中描绘(人工评估)。平均颗粒大小是不同的,10rpm批次为39.6μm,80rpm批次为19.9μm。
[0488] 通过应用XPT-C Optical Particle Analysis System的自动化方法,获得了以下的值:10rpm,x(1,2)26.4μm;20rpm,x(1,2)25.9μm;40rpm,x(1,2)20.4μm;60rpm,x(1,2)23.6μm;80rpm,x(1,2)18.7μm。
[0489] 该数据在统计学上显著的基础上展现了,更高的搅拌水平产生更小的针晶长度。从自动评估和人工评估获得的绝对值之间的偏离可以解释为,颗粒不总是按照装备有CCD摄像机的测量格的方向完美排列的(即,完全Feretmax可见的)。
[0490] 启动这项研究来研究批量转速和几种批量参数之间是否存在关系。虽然一些因素如mAb纯度、结晶动力学、产率和基本晶体形态不受影响,呈现的数据展现了晶体大小随着搅拌程度的提高而降低。
[0491] G.混杂的实施例
[0492] 实施例46-固体结晶试剂
[0493] MAK195F交换到含有约0.1M乙酸钠、pH值约5.2的缓冲液中。蛋白质浓度调节到10mg/mL。
[0494] 通过在2mL Eppendorf反应管中混合约500μL的蛋白质溶液和约400μL的乙酸盐缓冲液(0.1M,pH 5.2)来进行批量结晶。随后,固体聚乙二醇添加到10%m/v(100mg/ml)的终浓度。随后闭合试管,搅拌,直到获得结晶试剂的完全溶解。试管在环境温度下保存,没有搅拌。结晶混合物的等份试样的显微镜检查在接下来数周期间随着结晶进展进行多次。
[0495] 实施例47-不同的缓冲液制备方案和晶体的制备
[0496] 在这个实施例中,乙酸盐缓冲液如下文描述的制备:60g冰醋酸用约840mL纯水稀释。pH值用氢氧化钠溶液调整,体积调节到1,000mL。在这种情况下,总乙酸盐固定在1M(蛋白质溶液、结晶溶液和结晶化合物中100mM)。
[0497] 根据实施例36进行结晶。
[0498] 实施例48-密封的晶体的制备
[0499] 通过利用Malvern仪器Zetasizer nano的zeta电势测量所测定的,实施例36中获得的晶体是带正电的。
[0500] 晶体在含有保持结晶性的赋形剂的、并且具有保持晶体电荷的pH值的缓冲液中洗涤和悬浮。随后,合适的密封试剂添加到晶体悬浮液中。在这种情境下,合适的密封试剂是具有低毒性、生物降解能力和反离子性质的(聚合)物质。由于这种反离子性质,物质被吸移到晶体上并容许包被。通过这种技术,晶体在不含任何其他维持结晶性的赋形剂的介质中的溶解优选地被维持了。
[0501] 实施例49-密封/包埋的晶体的制备
[0502] 如实施例36中描述的获得晶体。
[0503] 晶体在含有保持结晶性的赋形剂的缓冲液中洗涤和悬浮。
[0504] 使用本领域已知的方法,所述晶体可以
[0505] -通过干燥所述晶体和将这些干燥的晶体与载体组合,例如通过压缩、熔化分散,等等,来包埋。
[0506] -通过组合晶体悬浮液和与水不可混融的载体溶液来密封/包埋。所述载体在除去载体的溶剂之后沉淀。随后,所述材料被干燥。
[0507] -通过组合晶体悬浮液与水溶性的载体溶液来密封/包埋。当在混合物中载体的溶解度极限超出时,载体沉淀。
[0508] -通过组合干燥的晶体或晶体悬浮液与水溶性载体溶液来包埋。
[0509] -通过组合干燥晶体和水不溶性的载体溶液来包埋。
[0510] H.晶体表征
[0511] H1.生物活性测试
[0512] 实施例50:晶体MAK195F的生物活性的保留
[0513] a)一般方法
[0514] AfelimomabTM溶液对rHuTNF的细胞毒性作用的中和效果通过在96孔微量滴定板TM中、在37℃在存在各种Afelimomab 浓度的情况下与预定数量的rHuTNF孵育小鼠L-929细胞作为指示物48小时来测定。存活的细胞用结晶紫染色。颜色强度通过在微量滴定板的单个反应孔中的分光光度测定来测量并评估。测量IC50,即,降低rHuTNF对L-929细胞的TM
的细胞毒性作用从而50%的细胞存活的Afelimomab 的浓度。
[0515] 在独立的稀释盒中,从1μg蛋白质/ml稀释度开始,在稀释试管中单独地制备9份额滴定曲线测试点(曲线稀释物)用于样品和参考标准。
[0516] L-929细胞悬浮液用培养基稀释来提供60,000细胞/mL的浓度。随后,相应细胞浓度下每个反应孔100μL吸移到测试平板的第1-11列中。第12列的反应孔仅含有100μL的每种培养基。在测试平板中在37℃和5%(v/v)CO2进行孵育24小时。
[0517] 在24小时的孵育之后,9种滴定曲线稀释度的每一种的50μL从稀释盒转移的测试平板用于参考标准或样品,即,用于参考标准的到1-9列的A-D行的反应孔中,用于样品的到1-9列的E-H行的反应孔中。
[0518] 50μL的培养基吸移到第10列;100μL的每种系第一到第11和12列。50μL的TNF参考标准物(12.5ng蛋白质/mL培养基)吸移到1-10列、A-H行的反应孔中,从而第10列相应于100%裂解值(TNF对照)。第11列是100%生长对照,第12列不含细胞材料因此作为空白起作用。每个反应孔的最终体积是200μL。测试平板的孵育在37℃、5%CO2下进行48小时。
[0519] 在孵育2天后,来自测试平板反应孔的液体通过快速翻转并给予一次强有力的向下摇动来除去。50μL的结晶紫溶液吸移到每个反应孔中。溶液保持在反应孔中15分钟,然后如上所述地弃去。洗涤平板,在室温下干燥约30分钟。随后,100μL的试剂溶液吸移到每个反应孔中。平板的搅拌(约300rpm 15分钟)产生了每个反应孔中均匀着色的溶液。测试平板反应孔中染料的吸光度在620nm处在平板光度计中测量。单独的值在图形上标绘,相对于各自的稀释度或抗体浓度ng/ml(x轴)来标绘吸光度(y轴)。
[0520] 四个参数用于生物活性测定:1)描述剂量对比抑制效果的曲线的最小平台期;2)描述剂量对比抑制效果的曲线的最大平台期;3)IC50值;和4)曲线拐点的斜率。对于4-参数曲线,在一半细胞存活和一半细胞死亡处读取浓度(IC50值)。该浓度通过曲线数据的4-参数函数的参数3来计算。计算参考标准物浓度的平均值。样品的相对生物学活性通过参考标准物的平均IC50值除以样品的单独IC50值并乘以100%来计算。然后将相对活性平均。
[0521] b)结果
[0522] 进行测试来比较样品(洗涤的晶体;洗涤方案如实施例41中描述的,晶体来自实TM施例39中描述的批次)的生物学活性与参考标物的生物学活性。相对于Afelimomab 的浓度标绘的、通过4-参数非线性回归评估的吸收值揭示了抗体对TNF作用的抑制作用的IC50TM
值。由于两种样品在一个微量培养板上四个重复地运行,这对Afelimomab 参考标准物和样品分别产生了四个的IC50值。随后,计算参考标准物的IC50值的平均值,样品的每个副本的相对活性通过参考标准物的平均IC50值除以样品的相关IC50值并乘以100%来评定。
[0523] 样品(晶体悬浮液1.87mg/mL)的测试显示了102%的相对生物学活性,因而是完全生物学活性的。
[0524] H2.显微镜的表征
[0525] 实施例51:MAK195F晶体的显微镜表征
[0526] a)mAb晶体批量样品的光学分析
[0527] 在均质化之后,1到10μL样品体积的等份试样吸移到目镜夹持板上,用玻璃盖玻片覆盖。利用分别装备有E-PI 10×目镜和10×、20×和40×物镜的Zeiss Axiovert 25反相光学显微镜评定晶体制品。图片使用数字照相机(Sony Cybershot DSC S75)拍摄。
[0528] H3.双折射
[0529] 对于双折射行为的检测,使用装备有CFW 10x目镜和4x、10x、20x和40x物镜的Nikon Labophot显微镜。此外,显微镜装备有滤镜组(分解和偏振单元)。
[0530] 从所有批量实验产生的晶体展现了双折射。
[0531] H4.可注射性
[0532] 在晶体中掺入的、在洗涤缓冲液中配制的150mg/mL蛋白质的MAK195F晶体悬浮液通过27G针头是可注射的。
[0533] 在以下小节中,列出了所进行的实验,来测试使用不同的针头,单克隆抗体片段MAK195F(10-200mg/ml)的晶体悬浮液(在PEG中)的可注射性。
[0534] PEG缓冲液:
[0535] 18%PEG 4,000m/v
[0536] 0.01%泊洛沙姆188
[0537] 10mM磷酸钠缓冲液
[0538] pH值用氢氧化钠溶液调节到7.2
[0539] 进行注射器排空(1mL装填体积),这将由患者在施用的过程中手动地进行。评估了20-27.5G针头大小。
[0540] 注射器:
[0541] 20/23/26G:
[0542] Henke Sass Wolf GmbH 1mL Norm-Ject注射器,装备有
[0543] -Henke Sass Wolf GmbH Fine-Ject 20G针头
[0544] - 23G针头
[0545] - 26G针头
[0546] 27.5G:
[0547] BD HyPak SCFTM 1mL长注射器,装备有27.5G RNS针头38800Le Pontdu Claix[0548] 结果(附图8)表明,27.5G针头提供了在高浓度下更慢的晶体递送。
[0549] I.二级结构
[0550] 实施例52:在晶体的结晶/重新溶解时天然二级结构的保留
[0551] 使用Bruker Optics Tensor 27上的Confocheck系统记录IR光谱。使用TMMicroBiolytics AquaSpec cell分析液体样品。用Harrick BioATRIIcell 进行蛋白质悬浮液的测量。在25℃评估每种样品,进行120到500次扫描的至少两次测量。空白缓冲液光谱分别从蛋白质光谱中减去。蛋白质二阶导数光谱通过傅里叶变换产生,矢量根据-1
1580-1720cm 正常化用于相对比较。
[0552] 晶体的重新溶解如下进行:晶体悬浮液进行离心,弃去上清液,团粒溶于0.1M乙酸钠缓冲液pH 5.2中到10mg/mL蛋白质浓度。附图4描绘了晶体MAK195F悬浮液(根据实施例39中描述的过程结晶的,根据实施例41中介绍的操作洗涤的)以及在这种预处理的晶体的重新溶解之后的FT-IR二阶导数光谱。光谱展现了,在结晶固体状况和在重新溶解之后,没有观察到二级结构的显著改变。
[0553] J.稳定性数据
[0554] 实施例53:在PEG/磷酸盐缓冲液中12个月稳定性数据(Se Hplc,Ft-lr,形态学)[0555] 应用实施例39中描述的结晶过程结晶MAK 195F。如实施例41描述的洗涤晶体,在这种情况下,使用含有18%(w/v)PEG 4,000、0.01%泊洛沙姆188和10mM磷酸钠pH 7.2的缓冲液。随后,晶体通过离心分别浓缩到5mg/mL和200mg/mL蛋白质含量,在2-8℃保存。5/200mg/mL晶体MAK195F在2-8℃在12个月的保存期的稳定性数据,清楚地表明了超过
90%单体的保留。
[0556] 材料:
[0557] 分散缓冲液:
[0558] 18%PEG 4,000m/v
[0559] 0.01%泊洛沙姆188
[0560] 10mM磷酸钠缓冲液
[0561] pH值用氢氧化钠溶液调节到7.2
[0562] SE-HPLC
[0563] 表4:在重溶解后5mg/mL晶体MAK195F
[0564]时点 聚集物(%) 单体(%) 片段(%)
T0 1.6 97.9 0.5
1个月 1.8 97.8 0.4
3个月 2.2 97.6 0.2
6个月 2.6 97.0 0.4
9个月 2.5 96.5 1.0
12个月 2.6 96.7 0.7
[0565] 表5:在重溶解后200mg/mL晶体MAK19200F
[0566]时点 聚集物(%) 单体(%) 片段(%)
T0 1.8 97.7 0.5
1个月 1.8 97.9 0.3
3个月 2.1 97.5 0.4
6个月 2.1 97.3 0.6
9个月 2.3 96.9 0.8
12个月 2.2 97.1 0.7
[0567] 使用Dionex HPLC系统(P680泵,ASI 100自动采样器,UVD170U)MAK195F样品在两个连续连接的GE Superose 12柱上进行,应用0.5mL/分钟的流动速度。检测在280nm的波长下进行。运行缓冲液由0.1M磷酸钾缓冲液pH 6.9中的0.5M氯化钠组成。
[0568] FT-IR
[0569] 使用Bruker Optics Tensor 27上的Confocheck系统记录IR光谱。使用TMMicroBiolytics AquaSpec cell分析液体样品。用Harrick BioATRIIcell 进行蛋白质悬浮液的测量。在25℃评估每种样品,进行120到500次扫描的至少两次测量。空白缓冲液光谱分别从蛋白质光谱中减去。蛋白质二阶导数光谱通过傅里叶变换产生,矢量根据-1
1580-1720cm 正常化用于相对比较。
[0570] 晶体的重溶解如下进行:晶体悬浮液进行离心,弃去上清液,团粒溶于0.1M乙酸钠缓冲液pH 5.2中到10mg/mL蛋白质浓度。
[0571] 附图5描绘了晶体MAK195F悬浮液(200mg/mL搁置稳定性样品,如上文描述制备的,在25℃保存了6个月)和这样的预处理的晶体的重溶解后的FT-IR二阶导数光谱光谱展现了,在结晶固体状况或在重新溶解后,在25℃保存6个月时都没有观察到二级结构的显著改变。
[0572] 形态学
[0573] 1到10μL样品体积的等份试样吸移到模具夹持板上,用制剂缓冲液(20%PEG)稀释,用玻璃盖玻片覆盖。利用分别装备有E-PI 10×目镜和10×、20×和40×物镜的Zeiss Axiovert 25反相光学显微镜评定晶体制品。在2-8℃保存12个月后,在晶体的光学显微镜分析中没有观察到显著的形态改变。
[0574] K.DSC分析
[0575] 实施例54:DSC分析
[0576] 使用200mg/mL无应力的样品进行差示扫描量热术(DSC)。比较了如段落3)中制备的晶体悬浮液、液体制剂(在含有0.01%泊洛沙姆188、150mM氯化钠和10mM磷酸钠缓冲液的缓冲液、pH7.2中)和安慰剂18%PEG 4,000晶体悬浮液缓冲液。
[0577] 使用装备有CC 200L控制器、CC 200供应系统和TASC 414/3A控制器的Netzsch DSC 204 Cell。20μL的液体样品或悬浮液转移到铝坩埚中,在封闭坩埚之后,通过以5K/分钟的加热速度从0-100℃加热来进行样品分析。附图6描绘了从样品获得的典型的热图像。
[0578] 液体溶液展现了66到78℃之间的相当广阔的吸热线,而相反地,晶体悬浮液的特征在于在约77℃的显著更尖的吸热峰。没有热事件与安慰剂悬浮液缓冲液的加热相关联(附图6)。
[0579] 结果表明,由于与液体制剂相比更高的吸热峰温度,MAK195F在结晶状态具有更高的构象稳定性,由于更尖的吸热峰,MAK195F在结晶状态比在溶液中具有更高程度的纯度和构象同质性(Elkordy,A.等人(2002)Int.J.Pharmaceutics 247:79-90)。
[0580] L.MAK195F晶体的扫描电子显微镜(SEM)特征
[0581] 实施例55:MAK195F晶体的扫描电子显微镜(SEM)特征
[0582] 如实施例39制备的MAK195F晶体悬浮液的等份试样被离心。在倒出上清液之后,团粒重悬浮在完全乙醇中。在乙醇中进行几个连续的离心/重悬浮步骤之后,一滴悬浮液转移到SEM样品夹上,在室温下干燥。样品进行碳溅射,在装备有Oxford Instruments7418检测器的JEOL JSM 6500F扫描电子显微镜上采集数据。附图7描绘了MAK195F晶体的典型实例。
[0583] L.使用连续过程的产率扩大(与现有实施例42中不同的设置)
[0584] 实施例56:结晶过程的产量扩大,产生连续过程的不同的设置
[0585] 结晶过程的终点可以定义为当结晶浆液的上清液的等份试样的OD280测量保存恒定,例如随后三天的时点。通过添加一定量的另外的PEG 4,000(在pH约5.2的约0.1M乙酸钠缓冲液中的50%w/v溶液)到结晶浆液的上清液中,发现产率扩大是可能的。在以后数天形成了与初次收获相同晶形的晶体。进行这种操作,容易地驱使总回收率超过90%,而不引入沉淀。
[0586] 在这个实施例中,另外的沉淀剂和/或蛋白质以预定的速率被“滴加”到结晶批量(任选地含有一定量的结晶试剂作为基础水平)中。从而诱导随着时间的过去的连续结晶,最后产生超过90%的晶体产率。
[0587] M.结晶批量的加晶种
[0588] 实施例57:MAK195F结晶批量的加晶种
[0589] 如实施例39描述的制备MAK 195F结晶批量。在混合蛋白质溶液和结晶缓冲液之后,通过例如用先有的MAK195F晶体均匀加晶种来对混合物进行加晶种。例如,如实施例39描述的制备的晶体悬浮液的等份试样,展现了约60到70%的晶体产率,可以以例如1/20的比例(v/v)添加到结晶批量中(在这个实施例中,50mL添加到1,000mL中)。应用这种策略,总晶体产率和加工持续时间向着更短处理时间中的更高的产率被进一步优化。
[0590] P.PK/TOX研究
[0591] 实施例58:用于在大鼠中PK/毒性研究的样品的制备(见下文)
[0592] 制备了4种不同的制剂:
[0593] -MAK195F液体制剂,50mg/mL
[0594] -MAK195F晶体悬浮液,50mg/mL,用搅拌加工(产生更小的针晶)
[0595] -MAK195F晶体悬浮液,200mg/mL,用搅拌加工
[0596] -MAK195F晶体悬浮液,200mg/mL,没有搅拌加工(产生更大的针晶)
[0597] a)MAK195F液体制剂
[0598] MAK195F溶液的解冻
[0599] 20mL MAK195F的溶液(LOT G008.01E/PZ0105P025,c=12.4mg/mL)在25℃在2小时内在搅拌的水浴中解冻。
[0600] 50mg/ml批量的制备
[0601] 20mL MAK195F溶液通过使用容易地制备的Vivaspin 20试管(30kDa PES MWCO)并在5,000×g在4℃离心直到体积降低到5mL,来浓缩到5mL。溶液无菌过滤。
[0602] 浓度的测定(OD280)
[0603] 产生的MAK195F溶液的浓度通过OD280测定,相对于蒸馏水,测量用1990mL蒸馏水稀释的10μL的蛋白质溶液。
[0604] A=0.353/0.359/0.354,c=51.9mg/mL
[0605] 溶液填充了到无菌的2mL Eppendorf反应管中。
[0606] 组成
[0607] MAK195F 51.9mg/mL
[0608] Pluronic F 68 0.1mg/mL
[0609] 磷酸二氢钠二水合物 1.56mg/mL
[0610] 氯化钠 8.77mg/mL
[0611] 氢氧化钠 pH调节至7.2
[0612] b)MAK195F晶体悬浮液
[0613] 1.批量结晶:
[0614] MAK195F溶液的解冻
[0615] 400mL MAK195F的溶液(LOT G008.01E/PZ0105P025,c=12.4mg/mL)在25℃搅拌的水浴中在2小时内解冻。溶液转移到1000μL烧杯中。
[0616] 缓冲液交换设备的制备
[0617] Vivaflow 50(30000MWCO,PES)柱体用500mL蒸馏水清洗直到400mL的水进入到过滤器皿中。
[0618] 缓冲液的制备
[0619] 缓冲液A(1M乙酸钠缓冲液,pH5.2)
[0620] 41.02g乙酸钠在500mL量杯中溶于约450mL蒸馏水中。通过添加另外的蒸馏水调节至500mL的体积。缓冲液的pH值通过添加浓缩物的乙酸调节到5.2。
[0621] 缓冲液B(0.1M乙酸钠,pH5.2)
[0622] 250mL的缓冲液A在5000mL烧杯中用蒸馏水稀释到2500mL的总体积。
[0623] 缓冲液C(20%PEG 4000在0.1M乙酸钠pH 5.2中)
[0624] 150mL的缓冲液A和300g的PEG 4000转移到1500mL量杯中,用蒸馏水填充到1500mL的总体积。然后缓冲液放入层流工作台中,无菌过滤(2个0.22μm孔径大小的过滤盘)。
[0625] MAK195F的缓冲液交换
[0626] 通过使用容易地制备的Vivaflow 50柱体,400mL MAK 195F溶液浓缩到50mL。这种浓缩的溶液(c=约100mg/mL)用450mL的缓冲液B在1000mL烧杯中稀释。使用容易地制备的Vivaflow 50柱体,将体积变为50mL。这个操作重复一次。在最后的步骤中,50mL用450mL的缓冲液B稀释,但是体积不减少,从而蛋白质浓度应当是约10mg/ml。原始的MAK195F缓冲液的总稀释度是1比1000。mAb浓度的测定和调节至10mg/ml(OD280)[0627] 产生的MAK195F溶液在缓冲液B中的浓度通过OD280测定,相对于蒸馏水,测量用1960μL蒸馏水稀释的40μL蛋白质溶液。
[0628] A=0.258 c=9.4mg/mL
[0629] 批量制备
[0630] 470mL的mAb溶液放在层流工作台上,无菌过滤(两个孔径大小0.22μm的过滤盘)。260mL溶液转移到1000mL刻度量筒中,与260mL的缓冲液C混合。混合物转移到1000mL聚丙烯容器瓶子中。瓶子用帕拉胶膜密封,在20℃保存。瓶子在约60rpm搅拌。(“搅拌的过程”)。210mL溶液转移到1000mL刻度量筒中,与210mL缓冲液C混合。混合物转移到1000mL聚丙烯容器瓶子中。瓶子用帕拉胶膜密封,在20℃保存。瓶子不搅拌(“没有搅拌的过程”)。
[0631] 2.“用搅拌加工”样品的制备,批量结晶开始后16天:
[0632] 制剂缓冲液制备
[0633] 首先,制备50mL 0.5M磷酸盐贮备溶液。3.9磷酸二氢钠二水合物溶于约40mL纯水中,pH值用氢氧化钠调节至7.2。体积调节到50mL。360g PEG 4,000、40mL贮备溶液和0.2g Pluronic F 68用纯水溶解到2000mL。
[0634] 晶体产率的测定
[0635] 产生的MAK195F结晶批量的浓度通过OD280测定。150μL等份试样在14,000rpm离心20分钟。100μL的上清液用1900μL的蒸馏水稀释,相对于蒸馏水来测量。
[0636] 上清液I:A=0.158
[0637] 上清液II:A=0.154 c=2.3mg/mL晶体产率54%
[0638] 浓缩和缓冲液交换/填充
[0639] 所有离心步骤在约500到2,000rpm的速度下进行,这样,形成的团粒是容易重悬浮的,在上清液中没有残余的固体。晶体浆液等分到10个无菌的50mL聚丙烯试管中并离心。弃去上清液,团粒分别重悬浮在20mL的18%PEG 4,000缓冲液中,所有试管集中到四个50mL聚丙烯试管中。试管在此离心机,弃去上清液,在分别在20mL 18%PEG 4,000缓冲液中重悬浮团粒之后,晶体浆液集中到2个试管中并离心。洗涤和离心再进行一次,在弃去缓冲液之后,浓度用新鲜的缓冲液调节到50mg/ml。等份试样的浓度通过OD280测定(10μL在1990μL水中)。
[0640] A=0.345/0.358/0.356,c=51.5mg/mL
[0641] 这种浆液装填到两个无菌的15mL聚丙烯试管中,装填体积2和3mL。其余的浆液通过离心浓缩到200mg/ml。等份试样的浓度通过OD280测定(5μL在1995μL水中)。
[0642] A=0.656/0.659/0.652,c=191.4mg/mL.
[0643] 这种浆液填充到无菌的2mL Eppendorf反应管中。
[0644] 组成
[0645] MAK195F 51.5/191.4mg/mL
[0646] PEG 4,000 18%m/v
[0647] Piuronic F68 0.1mg/mL
[0648] 磷酸二氢钠二水合物 1.56mg/mL
[0649] 氢氧化钠 pH调节至7.2
[0650] 3.“无搅拌加工”样品的制备,批量结晶开始后31天:
[0651] 缓冲液制备(具有PEG的缓冲液MAK195F)
[0652] 首先,制备50mL 0.5M磷酸盐贮备溶液。3.9g磷酸二氢钠二水合物溶于约40mL纯水中,pH值用氢氧化钠调节至7.2。体积调节到50mL。
[0653] 360g PEG 4,000、40mL贮备溶液和0.2g Pluronic F 68用纯水溶解到2000mL。
[0654] 晶体产率的测定
[0655] 产生的MAK195F结晶批量的浓度通过OD280测定。150μL等份试样在14,000rpm离心20分钟。100μL的上清液用1900μL的蒸馏水稀释,相对于蒸馏水来测量。
[0656] 上清液I:A=0.192
[0657] 上清液II:A=0.193 c=2.8mg/mL晶体产率44%
[0658] 浓缩和缓冲液交换/填充
[0659] 所有离心步骤在约500到2,000rpm的速度下进行,这样,形成的团粒是容易重悬浮的,在上清液中没有残余的固体。晶体浆液等分到9个无菌的50mL聚丙烯试管中并离心。弃去上清液,团粒分别重悬浮在20mL的18%PEG 4,000缓冲液中,所有试管集中到四个50mL聚丙烯试管中。试管在此离心机,弃去上清液,在分别在20mL 18%PEG 4,000缓冲液中重悬浮团粒之后,晶体浆液集中到2个试管中并离心。洗涤和离心再进行一次,在弃去缓冲液之后,浓度用新缓冲液调节到200mg/ml。等份试样的浓度通过OD280测定(5μL在1995μL水中)。
[0660] A=0.685/0.652/0.651,c=193.5mg/mL
[0661] 这种浆液填充到无菌的2mL Eppendorf反应管中。
[0662] 组成
[0663] MAK195F 193.5mg/mL
[0664] PEG 4,000 18%m/v
[0665] Pluronic F 68 0.1mg/mL
[0666] 磷酸二氢钠二水合物 1.56mg/mL
[0667] 氢氧化钠 pH调节至7.2
[0668] SE-HPLC数据
[0669] 样品的SE-HPLC分析揭示了所有四个样品含有超过97.5%的单体物质。
[0670] 实 施 例 59:在 雄 性Sprague-Dawley 大 鼠 中 在 单 次 皮 下 施 用 之 后MAK195F(Afelimomab)晶体的局部耐受性和毒性的定向研究
[0671] 1.实验数据
[0672] 这项研究的目的是检查在新型的制剂中,针对TNFa的抗体MAK195F(afelimomab)的局部耐受性。进一步,关于制剂的全身性毒性和毒性动力学的其他信息也在该项研究中研究了。在雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Laboratories,69592 L’Arbresle,France)中,在不同的MAK195F(afelimomab)制剂的单次皮下注射后,在不同的观察时期(参见表6和7),研究了MAK195F(afelimomab)的局部耐受性和毒性学和病理学作用。施用的剂量体积是1mL/kg体重。
[0673] 表6:实验组
[0674] 实验组
[0675] 01 对照(载体)
[0676] 02 50mg/ml Afelimomab,液体,标准制剂
[0677] 03 50mg/ml Afelimomab,晶体,搅拌加工的
[0678] 04 200mg/ml Afelimomab,晶体,搅拌加工的
[0679] 05 200mg/ml Afelimomab,晶体,无搅拌加工的
[0680] A组 观察期2天
[0681] B组 观察期7天
[0682] C组 观察期14天
[0683] 表7:分组和大鼠鉴定(每组N=1)
[0684]
[0685] 在第一天施用后15分钟、1、3、5和24小时,以及在此后每天至少一次地,观察动物的临床征象和死亡率。如果可行,在给药(第1天)和尸检(分别第3、15或21天)的当天和每周两次测量体重。用于药物分析的血液样品在第1天(施用后4小时)和在可行的第2、3、5、8和15天采集。在尸检之前,采集血液,评估血液学和临床化学参数。在尸检之前制备每个动物的血涂片。在尸检时,进行体腔的肉眼检查。对肝脏、肾脏、胸腺、脾脏和淋巴结进行器官重量测量。在注射位点和在肝脏、肾脏、胸腺、脾脏和淋巴结进行初步病理解剖。所有动物在研究中存活直到预定的尸检时。没有观察到对体重的测试物相关的影响。血液学和临床化学值是高度变化的。在血液学或临床化学中没有鉴定出明显测试物相关的改变。在尿分析中没有注意到测试物相关的改变。器官重量的测量产生了高变异性,在器官重量方面没有明显地测试物相关的改变。所有其他的改变属于在这个品系和年龄的Sprague-Dawley大鼠中一般所见的自发的发现的范围。
[0686] 显微镜发现是:
[0687] ●在组01、02中没有发现
[0688] ●在组03和05中轻度到中度的弥散的皮下炎症
[0689] ●在组03(第8和15天)和05(第3天)中最小到轻微的皮下的水肿
[0690] ●在组06中除了最小的混合性细胞浸润(第15天)外没有发现
[0691] 在局部反应时pan-T、抑制剂/细胞毒性T细胞/天然杀伤细胞、pan-B细胞和pan-巨噬细胞标志物的初步免疫组织化学结果表明,在皮下的炎症/浸润中主要涉及巨噬细胞和天然杀伤细胞。因而,对于针对使用的制剂的局部免疫原性反应,不存在提示。所有其他的改变属于在这个品系和年龄的Sprague-Dawley大鼠中一般所见的自发的发现的范围。
[0692] 在所有测试的样品中Afelimomab的绝对水平是低的。在样品之间观察到大的变异性,可能是由于有限的采样频率和使用很低的动物数量。在大多数样品中,在5-8天后在血清中检测不到Afelimomab。对于液体和晶体制剂观察到类似的PK分布,晶体加工(有或者没有搅拌)对PK分布没有影响。大多数样品的观察到的T1/2处于1-2天的范围内。细节在表8中呈现。
[0693] 表8:MAK195F的血浆暴露水平
[0694]
[0695]
[0696]
[0697]
[0698] LLOQ=低于定量极限
[0699] 在不同的制剂中MAK195F(Afelimomab)的皮下施用之后,没有观察到死亡或测试物相关的临床征象。显微镜检查没有注意到对测试物制剂的局部反应。血液学、临床化学和器官重量产生高度变化的值,与测试物没有明确的关系。宏观检查鉴定出的在施用位点处的局部炎症反应的严重度,与没有搅拌产生的晶体制剂(更大的针晶)和标准制品相比,对于两种浓度下搅拌产生的晶体制剂(更小的针晶)是更高的。
[0700] 通过引用合并
[0701] 在本申请中被引用的所有引证的参考文献(包括,参考书目、专利、专利申请和网站)的内容,通过引用明确地合并在此。除非另有陈述,本发明的实践将采用小规模和大规模蛋白质结晶和纯化的常规技术,这是本领域公知的。
[0702] 等同分案
[0703] 本发明可以被包括在其他特定的形式中而不背离其精神和基本特征。因而上述实施方式被认为是在所有方面是说明性的而不是限制在此描述的发明。因而本发明的范围由附随的权利要求而不是由以上的描述来表明,因此,处于权利要求的含义和等价范围内的所有变化被涵盖在此。
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